高効率遺伝子ターゲッティングベクターおよび上皮細胞株に対する遺伝子ターゲッティング法
ＺＯ−１遺伝子のノックアウトマウスを作製する過程で、相同組換えが９０％以上の高い確率で起こる遺伝子ターゲッティングベクターを開発した。また、該ターゲッティングベクターを用いて上皮細胞に対するエレクトロポレーションの至適条件の検討を行った結果、上皮細胞株であるマウスＥｐＨ４に対して効率的な遺伝子ターゲッティングが可能なエレクトロポレーションの至適条件の決定に成功した。本発明のベクターを利用することにより、ＥＳ細胞に対して外来遺伝子をＺＯ−１のアリルに容易に導入することが可能となる。また、ゲノム構造の影響を考慮しなくも良いため、従来のトランスジェニックマウス作製法や細胞の安定なトランスフォーマント作製時の欠点が解決できることが期待される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、高効率で遺伝子ターゲッティング可能なベクターに関する。また本発明は、上皮細胞株、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する効率的な遺伝子ターゲッティング方法に関する。
【背景技術】
遺伝子ターゲッティング（ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；非特許文献１／Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ著、「Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」、オックスフォード大学出版（ＯＸＦＯＲＤ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）参照）とは、外来性のＤＮＡ断片を哺乳類の細胞に導入し、内在性のＤＮＡシーケンスとの間に相同組換えを起こさせる遺伝子破壊法もしくは遺伝子導入法である。この方法は特にマウスの胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）において、多くの遺伝子に様々な変異を作り出すこと、または外来性遺伝子を発現させることに広く用いられている。このＥＳ細胞をマウスに戻すことにより、目的遺伝子が欠失したマウス、または外来性遺伝子を発現させたマウスを作製することができる。これらのマウスの表現型を個体内で解析することにより、目的遺伝子の生体内における機能を類推することができる。しかし、一般的にこの相同遺伝子組換えの頻度は、外来遺伝子が導入された細胞の１〜０．１％という非常に低い頻度でしか起こらない。この効率が上がれば、遺伝子を自由に改変することが容易に可能になり、様々な医療、研究分野での応用が期待できる。しかしながら、これまでのところ、高効率で遺伝子ターゲッティングが可能なベクターは知られていなかった。
上皮細胞とは、体表面、管腔面等を覆い細胞自身の中に明確な細胞極性を形成して特殊化することにより、それぞれの器官を環境の異なる閉じた空間に分ける機能を果たす一層もしくは数層の細胞シートのことをいう。ヒトの悪性腫瘍の９０％以上は上皮細胞に由来することも明らかとなっており、上皮細胞の形成機構、維持機能を解析することは医学的にも重要である。しかし、上皮細胞の形成、機能に重要な遺伝子のノックアウトマウスにおいては発生初期から上皮細胞は形成されるため、詳細な解析は出来ない場合が多い。
従来、遺伝子相同組換えを応用した遺伝子ターゲッティング法（上記非特許文献１参照）は主にマウスＥＳ細胞で行われているが、分化した体細胞における相同組換えの効率は０．０１〜０．００１％であり、非常に低いことが知られている（非特許文献２／Ｓｅｄｉｖｙ ＪＭおよびＤｕｔｒｉａｕｘ Ａ著、「Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ−ａ ｒｅｂｉｒｔｈ ｏｒ ａ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ？」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１９９９年、Ｖｏｌ．１５、ｐ．８８−９０参照）。
従って、上皮細胞に対する遺伝子ターゲッティングは極めて困難であり、これまでのところ、上皮細胞を対象とする効率的な遺伝子ターゲッティング方法は知られていなかった。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高効率な遺伝子ターゲッティングベクターを提供することである。また、上皮細胞株、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する効率的な遺伝子ターゲッティング方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者は、上皮細胞においてタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の裏打ちタンパク質として局在するＺＯ−１遺伝子のノックアウトマウスを作製する過程で、相同組換えが９０％以上の高い確率で起こるターゲッティングベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）を開発した。そして、該ベクターを用いて上皮細胞に対するエレクトロポレーションの至適条件の検討を行った。その結果、上皮細胞株であるマウスＥｐＨ４に対して効率的な遺伝子ターゲッティングが可能なエレクトロポレーションの至適条件を決定し、本発明を完成させた。
本発明のベクターを利用することにより、ＥＳ細胞に対して外来遺伝子をＺＯ−１のアリル（ａｌｌｅｌｅ）に容易に導入することが可能となる。本発明のターゲッティングベクターによって得られたシングルノックアウトＥＳ細胞、および、このシングルノックアウトＥＳ細胞をマウスに戻して作製された、ヘテロマウスにおいては何ら表現型が見いだされないことから、ＺＯ−１の一方のアリルに外来遺伝子を導入することは細胞の機能には影響がないと考えられる。このことは外来遺伝子を発現させる場合、ゲノム構造の影響を考慮しなくても良い利点がある。すなわち、従来のトランスジェニックマウス作成法や細胞の安定なトランスフォーマント（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）作成時の欠点が解決出来ることが予測される。
また、これまでは体細胞での遺伝子ターゲッティング効率は非常に低いとされていたが（外来遺伝子が導入された細胞の０．０１〜０．００１％）、本発明による遺伝子導入条件の至適化により、上皮細胞株ＥｐＨ４においても外来遺伝子が導入された細胞の約１０％で相同組換えが起こることが示された。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法を用いることにより、上皮細胞において発現している遺伝子の機能を効率的に解析できるものと期待される。また、悪性腫瘍形成に関わる遺伝子を破壊する、もしくは該遺伝子の変異体をノックインによりゲノム上に導入することができるため、遺伝子改変を行った上皮細胞における薬剤スクリーニング系の開発が可能になるものと考えられる。
また現在、いくつかの細胞株しか相同組換えによる遺伝子ターゲッティングは成功していないが、薬剤スクリーニングや病態の解析に適した細胞株に対し、このベクターを用いて遺伝子ターゲッティングの条件検討を行うことにより、遺伝子破壊された細胞株を作製できる応用性も期待される。
上記の如く本発明者は、外来遺伝子導入動物を作製する際に、該動物におけるＺＯ−１遺伝子を、外来遺伝子を導入するターゲット部位とすることにより、高効率に遺伝子ターゲッティングが可能であることを見出した。即ち、ＺＯ−１遺伝子をターゲット部位とするベクターは、高効率に外来遺伝子を導入できること、さらに該ベクターを用いた上皮細胞、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する遺伝子ターゲッティング方法を初めて見出し、本発明を完成させた。
本発明は、高効率遺伝子ターゲッティングベクター、および該ベクターを利用した上皮細胞、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する遺伝子ターゲッティング方法に関し、より具体的には、
〔１〕 非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター、
〔２〕 外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、〔１〕に記載のベクター、
〔３〕 ＺＯ−１遺伝子の部分領域が、該遺伝子の第二エクソンまたは第二エクソンの一部を含む領域である、〔２〕に記載のベクター、
〔４〕 下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片が外来遺伝子の両脇にそれぞれ配置された構造を有する、〔３〕に記載のベクター、
（ａ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片、および第二エクソンの下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ｂ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む５．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片、および第二エクソンの下流の３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片
〔５〕 非ヒト動物のＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−２もしくは該Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター、
〔６〕 外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、〔５〕に記載のベクター、
〔７〕 外来遺伝子発現非ヒト動物または外来遺伝子発現非ヒト動物細胞の作製用ベクターである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター、
〔８〕 外来遺伝子の上流に該遺伝子を転写し得るプロモーターを備えた、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のベクター、
〔９〕 さらにマーカー遺伝子発現カセットを含む、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のベクター、
〔１０〕 マーカー遺伝子発現カセットの下流に外来遺伝子が隣接して配置された構造を有する、〔９〕に記載のベクター、
〔１１〕 外来遺伝子がマーカー遺伝子発現カセットである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター、
〔１２〕 マーカー遺伝子発現カセットが薬剤耐性遺伝子発現カセットである、〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のベクター、
〔１３〕 薬剤耐性遺伝子発現カセットがβ−ｇｅｏを含むＤＮＡ断片である、〔１２〕に記載のベクター、
〔１４〕 非ヒト動物がマウスである、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載のベクター、
〔１５〕 上皮細胞に対する遺伝子ターゲッティング方法であって、電圧０．４〜０．５ｋＶおよびコンデンサー容量１２５〜２５０μＦの条件によるエレクトロポレーションにより、ターゲッティングベクターを該細胞へ導入することを特徴とする、ターゲッティング方法、
〔１６〕 エレクトロポレーションへ供される細胞調製液中のカルシウム濃度が５μＭ以下である、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕 ターゲッティングベクターが、細胞の染色体上のＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子を標的とするものである、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法、
〔１８〕 ターゲッティングベクターが、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載のベクターである、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法、
〔１９〕 上皮細胞が高等動物細胞由来である、〔１５〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法、
〔２０〕 高等動物がマウスである、〔１９〕に記載の方法、
〔２１〕 細胞がマウス上皮細胞株ＥｐＨ４である、〔２０〕に記載の方法、
〔２２〕 〔１５〕〜〔２１〕のいずれかに記載のターゲッティング方法によってターゲッティングベクターを上皮細胞株へ導入することを特徴とする染色体が人為的に改変された上皮細胞株の製造方法、
を提供するものである。
本発明は、外来遺伝子を高効率に導入可能な遺伝子ターゲッティングベクターに関する。
本発明は、非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域、ＺＯ−２遺伝子領域、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域を、外来遺伝子挿入のための標的部位とすることを特徴とする、ターゲッティングベクターを提供する。
本発明は、非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域、ＺＯ−２遺伝子領域、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクター（単に、「ベクター」と記載する場合あり）を提供する。本発明のベクターは、外来遺伝子発現非ヒト動物または外来遺伝子発現非ヒト動物細胞の作製に有用である。
ＺＯ−１遺伝子の塩基配列は既に知られており、当業者においては、ＺＯ−１遺伝子の塩基配列についての情報を公共の遺伝子バンクから容易に取得することが可能である。例えば、マウスＺＯ−１遺伝子の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＭ＿００９３８６により取得することができる。また、ＺＯ−２遺伝子の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＭ＿０１１５９７、Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２３１１８より取得することができる。ＺＯ−１遺伝子の塩基配列の一例として、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＭ＿００９３８６により取得されるマウスＺＯ−１遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。
本発明のベクターは、外来遺伝子、およびＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子領域、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするターゲッティングベクターである。本発明のベクターを利用することにより、外来遺伝子が染色体へ挿入された外来遺伝子導入動物を作製することが可能である。
「遺伝子ターゲッティング」とは、同じ塩基配列を有するＤＮＡ分子間で起こる相同組換えという現象を利用して、人為的に染色体上の遺伝子を改変することを言う。この「改変」には、遺伝子破壊もしくは遺伝子挿入が含まれる。つまり、染色体上の標的配列と相同的な配列を有するベクターを細胞へ導入することにより、相同部分で組換えが起こり、ベクター（もしくは、その一部）が染色体へ挿入される。
本発明の好ましい態様においては、外来遺伝子が挿入される染色体部位（標的部位）の両脇のＤＮＡ領域と相同な塩基配列からなるＤＮＡ断片が、該外来遺伝子の両脇に配置された構造を持つベクターである。本発明の上記ベクターを細胞へ導入すると、外来遺伝子の両脇の相同ＤＮＡ領域と、標的部位の両脇のＤＮＡ領域との間で、相同組換えが起こり、外来遺伝子が染色体上の標的部位へ挿入される。
本発明において外来遺伝子の挿入の標的となり得る染色体上のＤＮＡ部位は、ＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子上であれば特に制限されず、エクソン、イントロン、またはプロモーター等の遺伝子発現制御領域であってもよい。従って本発明のベクターの好ましい態様としては、外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくはこれら遺伝子の部分領域が配置された構造を有する。
また、外来遺伝子はＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子上であれば任意の領域へ挿入することが可能である。
例えば、ＺＯ−１遺伝子の場合には、好ましくは、ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンまたは第二エクソンの一部を含むＤＮＡ領域へ挿入される。従って、本発明のベクターに含まれるＺＯ−１遺伝子の領域としては、例えば、ＺＯ−１遺伝子の第二エクソン全体もしくは第二エクソンの一部を含むようなＺＯ−１遺伝子上のＤＮＡ領域であることが好ましい。上記の第二エクソンの一部を含むＤＮＡ領域の具体例としては、例えば、（ａ）第二エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片、および第二エクソンの下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片、あるいは、（ｂ）第二エクソンの一部およびその上流を含む５．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片、および第二エクソンの下流の３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片を挙げることができるが、これに限定されない。
本発明のベクターとしては、例えば、上記の２つの断片がそれぞれ、外来遺伝子の上流部または下流部に配置された構造を有するベクターを示すことができる。
また本発明は、上皮細胞に対して効率的に遺伝子ターゲッティングを行うことが可能な方法を提供する。該ベクターの細胞への導入は、種々の方法が知られているが、最も一般的な方法としては、エレクトロポレーション法を挙げることができる。エレクトロポレーション法は、当業者においては一般的に市販されている機材を利用して、適宜、実施することができる。
本発明の方法は、エレクトロポレーションによってターゲッティングベクターを上皮細胞へ導入する工程を含む遺伝子ターゲッティング方法である。
本発明の方法においてエレクトロポレーションは、バイオ・ラッド社のジーンパルサーシステムＩＩ（パルスコントローラーＰＬＵＳ使用）を用いて好ましくは電圧０．４〜０．５ｋＶ、コンデンサー容量１２５〜２５０μＦ、更に好ましくは電圧０．４５ｋｖもしくはその近辺、コンデンサー容量１２５μＦもしくはその近辺の条件で行う。これらのエレクトロポレーションの条件は、上皮細胞に対して高効率に遺伝子ターゲッティングを行うことが可能な条件として、本発明者らによって初めて決定されたものである。
また、エレクトロポレーションに供される細胞（培養液）の調製方法もまた、当業者においては一般的に公知の種々の方法によって適宜実施することができる。例えば、エレクトロポレーションに供される細胞は、カルシウムを添加することによって調製することができる。細胞間接着が強固な細胞の場合、細胞調製時にカルシウム濃度を下げてエレクトロポレーションを行うことにより、遺伝子導入効率が上昇することが本発明者らの研究により明らかとなった（後述の実施例２参照）。従って、細胞調製時の細胞培養液中に含まれる最終カルシウム濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは５μＭ以下である。
本発明の上記方法に使用されるターゲッティングベクターとしては、例えば、上述のベクターを好適に示すことができる。即ち、本発明の好ましい態様としては、上述の上皮細胞の染色体上のＺＯ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００９３８６）、ＺＯ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１１５９７）、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２３１１８）を標的とするものであるが、これらに特に制限されるものではなく、上皮細胞の染色体上の任意のＤＮＡ領域を標的とするように構築することができる。
また、本発明の上記方法に用いられるターゲッティングベクターは、上皮細胞の染色体上の標的となる遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するものである。本発明の上記方法に用いられるターゲッティングベクターとして、例えば、前述の外来遺伝子およびＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するベクター（「ＺＯ−１ベクター」と記載する場合あり）を挙げることができる。
また、本発明のベクターの一例として、ＺＯ−２遺伝子を標的とするターゲッティングベクター（ＺＯ−２ベクター）を挙げることができる。ＺＯ−２ベクターは、外来遺伝子および／またはＺＯ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するベクターであり、より具体的には、該ＺＯ−２ベクターは、ＺＯ−２遺伝子の第３エクソンを欠損するように該遺伝子領域を含むベクターである。該ベクターは、例えば、第３エクソンの上流の６．６−ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および第３エクソン下流の２．６−ｋｂのＳｃａＩ−ＳｐｅＩ断片を用いて作製される。
また、本発明のベクターとして、例えば、Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子を標的とするターゲッティングベクター（Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２ベクター）を挙げることができる。Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２ベクターは、例えば、外来遺伝子および／またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するベクターである。より具体的には、該Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の第３エクソンを欠損するように該遺伝子領域を含むベクターである。該ベクターは、例えば、第３エクソンの上流および下流それぞれ３．９−ｋｂの断片を上皮細胞株ＥｐＨ４のゲノムＤＮＡを鋳型としたゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＰＣＲにより取得することができる。その際、上流断片の３’側にＥｃｏＲＶサイトを導入し、この新たに導入したサイトを利用することにより、サザンブロットを行うことが可能である。
本発明の上記外来遺伝子は、必ずしも制限されるものではないが、通常、タンパク質を発現し得る（タンパク質をコードする）遺伝子である。上記したベクターによって発現させるタンパク質としては、天然または人工タンパク質であるかを問わず、所望のタンパク質を挙げることができる。天然のタンパク質としては例えば、分泌タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、酵素、ペプチド等が挙げられる。人工タンパク質としては、例えば、キメラ毒素などの融合タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子等が挙げられる。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加したタンパク質であってもよい。また、アンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイム等を発現させることにより、細胞における発現が望ましくない遺伝子について、その発現を抑制する、または遺伝子産物の機能を抑制することもできる。
本発明の上記外来遺伝子は、該遺伝子が転写し得るようにプロモーターと機能的に結合した構造、所謂「発現カセット」であることが好ましい。上記「機能的に結合した」とは、プロモーターの転写の活性化に伴い、下流の遺伝子の発現が誘導されるようにプロモーターと下流の遺伝子が結合していることを言う。
上記プロモーターとしては、遺伝子自体に本来備わっているプロモーターを挙げることができるが、これ以外にも、発現させたい外来遺伝子の種類、および外来遺伝子を導入する細胞の種類等を考慮して、当業者においては公知のプロモーターから適宜選択して使用することができる。具体的には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、βアクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス由来（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＴＫプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＲαプロモーター等を例示することができるが、特にこれらに制限されない。
上記ベクターに含まれる標的となる遺伝子領域と相同なＤＮＡ（単に、「相同ＤＮＡ」と記載する場合あり）の長さは、相同組換えが生じ得る長さであれば特に制限されない。一般的に、相同領域は長いほど相同組換えの効率が高いことが知られていることから、本発明のベクターに含まれる標的となる遺伝子領域と相同なＤＮＡ領域も長いことが好ましい。通常、哺乳動物細胞、例えばマウスＥＳ細胞の相同組換えには、外来遺伝子両脇の「相同ＤＮＡ」の合計が５−ｋｂ以上、少なくとも片側の長さは０．５〜２−ｋｂ以上が好ましいとされている。従って、ベクターに含まれる「相同ＤＮＡ」の長さは、通常、合計５−ｋｂ以上であり、外来遺伝子両脇に位置する「相同ＤＮＡ」の長さは、片側において好ましくは０．５−ｋｂ以上、より好ましくは２−ｋｂ以上である。
また、染色体へ外来遺伝子が導入された細胞を選択するため、または外来遺伝子が導入されたことを確認するために、本発明におけるベクターは、マーカー遺伝子発現カセットを含むことが好ましい。「マーカー遺伝子発現カセット」とは、マーカー遺伝子が発現するように構成されたカセットを指し、通常、マーカー遺伝子がプロモーター、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）またはＳＡ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｅｒ）の一つあるいは複数と機能的に結合した構造を有するＤＮＡ断片である。
上記「マーカー遺伝子」としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）等の薬剤耐性遺伝子を利用することができる。薬剤耐性遺伝子を挿入した場合には、薬剤を含む培地で培養することにより相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。具体的には、マーカー遺伝子として、β−ｇｅｏ（順に、ＬａｃＺ，ｎｅｏ，ｐｏｌｙＡ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン等を好適に使用することができる。
また、上記ベクターが上記マーカー遺伝子発現カセットを含む場合、該ベクターは、該発現カセットの下流（３’側）に外来遺伝子が隣接して配置された構造であることが好ましいが、必ずしもこの構造に制限されるものではない。また、本発明の「外来遺伝子」が上記マーカー遺伝子発現カセットであってもよい。
また本発明のターゲッティングベクターには、標的となる遺伝子の全領域もしくは部分領域を有し、外来遺伝子を含まないベクターも含まれる。例えば本発明には、ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有し、外来遺伝子を含まない遺伝子ターゲッティング用ベクターも包含される。即ち、前記ベクターが提供されれば、適当なベクター上の部位へ、外来遺伝子、加えてマーカー遺伝子発現カセットをクローニングすることは、当業者においては通常行い得ることである。前記ベクターは、外来遺伝子、および必要に応じてマーカー遺伝子発現カセットを容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。該クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。これにより、該制限酵素部位に外来遺伝子、および必要に応じてマーカー遺伝子発現カセットを挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。これらのクローニングサイトの設計および構築は、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて行うことが可能である。
さらに上記ベクターは、細胞へ導入された際にベクターを含む細胞を選択するために、必要に応じて上記マーカー遺伝子とは異なる種類の複数のマーカー遺伝子を備えたものであってもよい。
本発明に用いられるターゲッティングベクターの基本骨格は、特に制限はなく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ ｖｅｃｔｏｒ（製造元プロメガ株式会社）、ｐＵＣ ｖｅｃｔｏｒ（製造元タカラバイオ株式会社）等の市販のベクターを適宜利用することができる。当業者においては、例えば、市販のベクターを利用して、一般的な遺伝子工学技術によりターゲッティングベクターの構築が可能である。
本発明のベクターを利用して染色体へ外来遺伝子を導入することが可能な動物は、好ましくは、マウスを挙げることができるが、ＺＯ−１遺伝子または該遺伝子のホモログを有する非ヒト動物であれば、特に制限されない。マウスＺＯ−１遺伝子のホモログとしてイヌＺＯ−１遺伝子が知られているが、基本的には、全哺乳類においてＺＯ−１遺伝子は発現していると考えられるため、本発明のベクターは全哺乳類に有用であると考えられる。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法に供される細胞としては、例えば、高等動物細胞を好適に示すことができる。高等動物細胞としては、例えば、マウス、ペットや家畜、実験動物などで利用されているイヌ、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、ヒツジ、ヤギ、ネコ等の細胞を挙げることができる。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法に供される細胞の具体例としては、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｅ．，Ｂａｌｌ，Ｒ．，Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｆｒｉｉｓ，Ｒ．Ｒ．Ｎｅｗ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｉｎ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９；１０８：１１２７−１１３８）、ＭＴＤ−１Ａ株（Ｅｎａｍｉ，Ｊ．，Ｓ．Ｅｎａｍｉ，ａｎｄ Ｍ．Ｋｏｇａ．１９８４．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｅａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ａ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ，ｄｏｍｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ．Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１９８４；２６：２２３−２３４）、ＣＳＧ２１１株（Ｗｉｇｌｅｙ ＣＢ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｓ ＬＭ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１９７６；２０：１４９−１６５）等を示すことができるが、最も好ましくはマウス上皮細胞株ＥｐＨ４である。または、これらの細胞に由来する細胞もまた好適に使用することができる。
本発明の方法の好ましい態様においては、通常、本発明のターゲッティングベクターを上記の条件のエレクトロポレーションによって上皮細胞へ導入した後、該細胞の培養を行う。次いで、相同組換えによって外来遺伝子が染色体へ挿入された細胞を、適宜マーカー等を利用して選択する。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法は、例えば、外来遺伝子導入細胞の作製に利用することができる。
外来遺伝子が染色体へ挿入され、該遺伝子を発現する細胞は、当業者においては、本発明のベクターを用いることにより、公知の方法によって容易に作製することができる。
また、本発明のベクターを用いた遺伝子導入非ヒト動物の作製は、例えば、マウスにおいては以下のようにして行うことができるが、この方法に制限されず、当業者においては、マウス以外の非ヒト動物においても一般的な遺伝子工学技術により、本発明のベクターを利用して遺伝子導入非ヒト動物を作製することができる。まず、任意の外来遺伝子を含む本発明のベクターを、エレクトロポレーション法等によりマウスのＥＳ細胞株へ導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、外来遺伝子がマウス染色体のＺＯ−１遺伝子対の一方へ導入されたマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、外来遺伝子がマウス染色体のＺＯ−１遺伝子対の双方へ導入されたマウスを取得することができる。
本発明のベクターを利用した方法、あるいは本発明の上記方法によって染色体へ挿入された外来遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎ ｓｉｔｕでも行うことが可能である。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。さらに、遺伝子導入の検出を容易にするため、発現させるタンパク質にタグを付加したり、外来遺伝子に加えてレポーター遺伝子を発現するようにベクターを構築することも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに特に制限されず、当業者においては、細胞の種類等を考慮し、適当なレポーター遺伝子を適宜選択することができる。
本発明は、本発明のターゲッティング方法によってターゲッティングベクターを上皮細胞株へ導入することを特徴とする、染色体が人為的に改変された上皮細胞株の製造方法を提供する。本発明のターゲッティング方法によって導入されたターゲッティングベクターは、上皮細胞株へ導入された後、通常、上皮細胞染色体との間で相同組換えにより該ベクターもしくは該ベクターの一部が染色体へ挿入される。上記「染色体が人為的に改変された上皮細胞株」には、外来遺伝子が染色体へ挿入された上皮細胞株、あるいは内因性の遺伝子が改変された上皮細胞株等が含まれる。この改変とは、例えば、ＤＮＡの挿入、付加、欠失、置換等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＺＯ−１遺伝子座および遺伝子ターゲッティングベクターを模式的に示す図である。開始コドンは第１エクソンに存在する。
β−ｇｅｏ（ＬａｃＺ／ｎｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第２エクソンの一部を除く形で作られている。サザンブロッティングに用いた３’側プローブを黒線で示した。
図２は、ＺＯ−１シングルノックアウト細胞の作製結果を示す写真である。ＰｖｕＩＩ消化したＺＯ−１遺伝子座を３’側プローブでサザンブロッティングした結果、野生型遺伝子座から得られる６．３−ｋｂのバンドと遺伝子破壊後の遺伝子座から得られる４．７−ｋｂのバンドが得られた（レーン１３，１５，１７を除くすべてのレーン）。レーン１３，１５，１７はターゲッティングされなかったクローンである。１７６個のＧ４１８耐性コロニーの中で、相同組換えが一度起こっていたクローンは１６７個であった。
図３は、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４におけるＺＯ−１遺伝子の遺伝子ターゲッティングについて、マウスＺＯ−１遺伝子座、ターゲッティングベクター、遺伝子破壊後の制限酵素地図を示す。
開始コドンは第１エクソンに存在する。ネオマイシンカセット（ＬａｃＺ／β−ｇｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第２エクソンの一部を除く形で作られている。サザンブロッティングに用いられた５’側プローブを黒線で示した。
図４は、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４におけるＺＯ−２遺伝子の遺伝子ターゲッティングについて、マウスＺＯ−２遺伝子座、ターゲッティングベクター、遺伝子破壊後の制限酵素地図を示す図である。ネオマイシンカセット（ＩＲＥＳ／β−ｇｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第３エクソンを除く形で作られている。サザンブロッティングに用いられた３’側プローブを黒線で示した。
図５は、図４で示されるプロープを用いた際のサザンブロッティング解析の結果を示す写真である。
図６は、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４におけるＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の遺伝子ターゲッティングについて、マウスＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子座、ターゲッティングベクター、遺伝子破壊後の制限酵素地図を示す図である。ネオマイシンカセット（ＩＲＥＳ／β−ｇｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第３エクソンを除く形で作られている。サザンブロッティングに用いられた５’側プローブを黒線で示した。
図７は、図６で示されるプローブを用いた際のサザンブロッティング解析の結果を示す写真である。
図８は、エレクトロポレーションにおける電圧、コンデンサー容量がＧ４１８耐性コロニーの数に及ぼす影響を示すグラフである。
ＺＯ−１に対するターゲッティングベクターを様々な電圧、コンデンサー容量で遺伝子導入を行い、Ｇ４１８で選抜し、コロニー形成後その数を計数した。電圧、コンデンサー容量が大きいほどコロニー数が多いことがわかる。
図９は、ＺＯ−１シングルノックアウトＥｐＨ４細胞における遺伝子導入結果を確認するためのサザンブロッティング解析の電気泳動写真である。
ＥｃｏＲＩ消化したＺＯ−１遺伝子座を５’側プローブでサザンブロッティングした結果、野生型遺伝子座から得られる２０．９−ｋｂのバンドと遺伝子破壊後の遺伝子座から得られる５．３−ｋｂのバンドが得られた（レーン１、２、１１、１２）。１４２個のＧ４１８耐性コロニーの中で、相同組換えが一度起こっていたクローンは１６個であった。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 各種高効率ターゲッティングベクターの作製
（１）ＺＯ−１ターゲッティングベクターの作製
ＺＯ−１がコードされたゲノムを得る為に、λファージ１２９／Ｓｖマウスジェノミックライブラリーに対して、マウスＺＯ−１ ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、４つの重複するゲノム断片を得た。制限酵素によるマッピングとＤＮＡシーケンスにより、マウスＺＯ−１のｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｕｓを決定した（図１）。取得したＺＯ−１遺伝子を含むゲノム断片は４個のエクソンからなり、エクソン１に開始コドンが存在していた。
ＺＯ−１ターゲッティングベクターは第２エクソンの一部を除く形で設計した。このベクターはカセットとして、β−ｇｅｏ（順にＬａｃＺ，ｎｅｏ，ｐｏｌｙ Ａ）を含んでいる。第２エクソンの一部およびその上流を含む５．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片と、第２エクソン下流の３．９−ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片を、上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図１）。このターゲッティングベクターにより、相同組換えがターゲッティングベクターとＺＯ−１遺伝子の間に起こると、エクソン２の一部を含む領域が除かれ、β−ｇｅｏが挿入される。
また、上記ターゲッティングベクターはカセットとして、ネオマイシンカセット（順にＬａｃＺ，ｎｅｏ，ｐｏｌｙ Ａ）を含んでいてもよく、その場合、第２エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片と、第２エクソン下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を、上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図３）。
（２）ＺＯ−２ターゲッティングベクターは、第３エクソンを除く形で設計した。このベクターは、カセットとしてネオマイシンカセット（順にｌｏｘＰ，Ｅｎ−２，ＳＡ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｅｒ），ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ），β−ｇｅｏ，ｐｏｌｙＡ，ｌｏｘＰ）を含んでいる。なお、Ｅｎ−２はｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２遺伝子のイントロンおよびｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｅｒを含む配列であり、ｓｐｌｉｃｉｎｇの効果を高めていると考えられている。第３エクソンの上流の６．６−ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および第３エクソン下流の２．６−ｋｂのＳｃａＩ−ＳｐｅＩ断片を、上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図４および５）。このターゲッティングベクターにより、相同組換えがターゲッティングベクターとＺＯ−２遺伝子の間に起こると、第３エクソンを含む領域が除かれる。
（３）Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２ターゲッティングベクターは、第３エクソンを除く形で設計した。このベクターは、ＺＯ−２と同様にカセットとしてネオマイシンカセット（順にｌｏｘＰ，ＳＡ，ＩＲＥＳ，β−ｇｅｏ，ｌｏｘＰ，ｐｏｌｙＡ）を含んでいる。第３エクソンの上流および下流それぞれ３．９−ｋｂの断片を上皮細胞株ＥｐＨ４のゲノムＤＮＡを鋳型としたゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＰＣＲにより取得し、それぞれ上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図６および７）。その際、上流断片の３’側にＥｃｏＲＶサイトを導入し、この新たに導入したサイトを利用することにより、サザンブロット解析を行った。このターゲッティングベクターにより、相同組換えがターゲッティングベクターとＤｉａｂｌｅｄ−２遺伝子の間に起こると、第３エクソンを含む領域が除かれる。
〔実施例２〕 遺伝子ターゲッティング
ＺＯ−１ターゲッティングベクターは５’相同領域断片の５’側に存在するｕｎｉｑｕｅサイトのＳａｃＩＩで直線化（ｌｉｎｅａｌｉｚｅ）した。その後、７〜８回ｐａｓｓａｇｅしたＥＳ細胞へＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてエレクトロポレーションを行い、遺伝子導入した。これらのＥＳ細胞は通常培地中で、ｆｅｅｄｅｒ細胞の上で３６〜４８時間培養した。次に１７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中を含む培地中で７〜１３日培養した。Ｇ４１８耐性コロニーを分離し、３’側相同領域断片の外側に対するゲノム断片（２９０ｂｐ）を用いたサザンブロットによりスクリーニングを行った。正しく相同組換えが起こったクローンはゲノムをＰｖｕＩＩで消化すると、野生型では、６．３−ｋｂの断片が、相同組換えが起こったアリル（ａｌｌｅｌｅ）では４．７−ｋｂの断片が認められた（図２）。１７６個のＧ４１８耐性コロニーの中で、相同組換えが一度起こっていたクローンは１６７個であった。すなわち約９５％の効率でターゲッティングが起こることが確認された。このことはこのターゲッティングベクターが通常に比べ、高い相同組換え効率があることを示している。
既に本発明では、他の細胞株Ｆ９ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌにおいても、高効率に相同組換えによるＺＯ−１遺伝子の遺伝子ターゲッティングが起こることも確認している。
〔実施例３〕 遺伝子ターゲッティングのためのエレクトロポレーションの条件検討
マウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する遺伝子ターゲッティング法を開発する為に、実施例１に記載の高効率ＺＯ−１ターゲッティングベクター（１．５ｋおよび８．５ｋの断片を含むターゲッティングベクター）を用いてエレクトロポレーションの条件検討を行った。
マウスＺＯ−１に対するターゲッティングベクターは３’相同領域断片の３’側に存在するｕｎｉｑｕｅサイトのＸｈｏＩで直線化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅ）した（図３）。このＤＮＡ（１０μｇ）を１２時間、低Ｃａ２＋培地（５μＭ）で培養したマウス上皮細胞株ＥｐＨ４（１ｘ１０７ ｃｅｌｌｓ）に対してバイオ・ラッド社のジーンパルサーＩＩシステム（パルスコントローラーＰＬＵＳ使用）を用いて、電圧、コンデンサー容量等の様々な条件でエレクトロポレーションを行い遺伝子導入した。導入後、通常培地中で、４８時間培養後、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中で１４日培養し、選抜をした。その結果、各条件に応じてＧ４１８耐性コロニーの数に違いが認められた（図８）。このことは条件に応じてターゲッティングベクターの導入効率が異なることを示している。
次に各条件に応じたＧ４１８耐性コロニーを分離し増やしたものからゲノムを抽出し、５’側相同領域断片の外側に対するゲノム断片（２８０ｂｐ）を用いたサザンブロットを行った。その結果、最も良く相同組変えが起こっていた条件は、０．４５ｋＶ、１２５μＦであった（表１）。
この条件はＥＳ細胞における至適条件とは異なっていた。
この条件で再度ＺＯ−１遺伝子座に対して遺伝子ターゲッティングを行った所、１４２クローン中１６クローンで（１１．２％）相同組換えが確認された。正しく相同組換えが起こったクローンはＺＯ−１においては、ゲノムをＥｃｏＲＩで消化すると、野生型の２０．９−ｋｂのバンドに加え新たに５．３−ｋｂのバンドが現れた（図９）。
【産業上の利用の可能性】
本発明のベクターを利用することにより、ＥＳ細胞に対して外来遺伝子をＺＯ−１のアリルに容易に導入することが可能となる。本発明のターゲッティングベクターによって得られたシングルノックアウトＥＳ細胞、およびこのシングルノックアウトＥＳ細胞をマウスに戻して作製されたヘテロマウスにおいては、何ら表現型が見いだされないことから、ＺＯ−１の一方のアリルに外来遺伝子を導入することは細胞の機能には影響がないと考えられる。このことは外来遺伝子を発現させる場合、ゲノム構造の影響を考慮しなくても良い利点がある。すなわち、従来のトランスジェニックマウス作製法や細胞の安定なトランスフォーマント作製時の欠点が解決出来ることが期待される。
また、本発明の遺伝子ターゲッティング方法を用いることにより、上皮細胞において発現している遺伝子の機能を解析することが可能である。また、悪性腫瘍形成に関わる遺伝子を破壊もしくはその変異体をノックインにより効率的にゲノム上に導入することができるため、遺伝子改変を行った上皮細胞を利用した薬剤スクリーニング系の開発が可能になるものと考えられる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【技術分野】
本発明は、高効率で遺伝子ターゲッティング可能なベクターに関する。また本発明は、上皮細胞株、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する効率的な遺伝子ターゲッティング方法に関する。
【背景技術】
遺伝子ターゲッティング（ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ；非特許文献１／Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ著、「Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」、オックスフォード大学出版（ＯＸＦＯＲＤ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）参照）とは、外来性のＤＮＡ断片を哺乳類の細胞に導入し、内在性のＤＮＡシーケンスとの間に相同組換えを起こさせる遺伝子破壊法もしくは遺伝子導入法である。この方法は特にマウスの胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）において、多くの遺伝子に様々な変異を作り出すこと、または外来性遺伝子を発現させることに広く用いられている。このＥＳ細胞をマウスに戻すことにより、目的遺伝子が欠失したマウス、または外来性遺伝子を発現させたマウスを作製することができる。これらのマウスの表現型を個体内で解析することにより、目的遺伝子の生体内における機能を類推することができる。しかし、一般的にこの相同遺伝子組換えの頻度は、外来遺伝子が導入された細胞の１〜０．１％という非常に低い頻度でしか起こらない。この効率が上がれば、遺伝子を自由に改変することが容易に可能になり、様々な医療、研究分野での応用が期待できる。しかしながら、これまでのところ、高効率で遺伝子ターゲッティングが可能なベクターは知られていなかった。
上皮細胞とは、体表面、管腔面等を覆い細胞自身の中に明確な細胞極性を形成して特殊化することにより、それぞれの器官を環境の異なる閉じた空間に分ける機能を果たす一層もしくは数層の細胞シートのことをいう。ヒトの悪性腫瘍の９０％以上は上皮細胞に由来することも明らかとなっており、上皮細胞の形成機構、維持機能を解析することは医学的にも重要である。しかし、上皮細胞の形成、機能に重要な遺伝子のノックアウトマウスにおいては発生初期から上皮細胞は形成されるため、詳細な解析は出来ない場合が多い。
従来、遺伝子相同組換えを応用した遺伝子ターゲッティング法（上記非特許文献１参照）は主にマウスＥＳ細胞で行われているが、分化した体細胞における相同組換えの効率は０．０１〜０．００１％であり、非常に低いことが知られている（非特許文献２／Ｓｅｄｉｖｙ ＪＭおよびＤｕｔｒｉａｕｘ Ａ著、「Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ−ａ ｒｅｂｉｒｔｈ ｏｒ ａ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ？」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、１９９９年、Ｖｏｌ．１５、ｐ．８８−９０参照）。
従って、上皮細胞に対する遺伝子ターゲッティングは極めて困難であり、これまでのところ、上皮細胞を対象とする効率的な遺伝子ターゲッティング方法は知られていなかった。
【発明の開示】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高効率な遺伝子ターゲッティングベクターを提供することである。また、上皮細胞株、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する効率的な遺伝子ターゲッティング方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。本発明者は、上皮細胞においてタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）の裏打ちタンパク質として局在するＺＯ−１遺伝子のノックアウトマウスを作製する過程で、相同組換えが９０％以上の高い確率で起こるターゲッティングベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）を開発した。そして、該ベクターを用いて上皮細胞に対するエレクトロポレーションの至適条件の検討を行った。その結果、上皮細胞株であるマウスＥｐＨ４に対して効率的な遺伝子ターゲッティングが可能なエレクトロポレーションの至適条件を決定し、本発明を完成させた。
本発明のベクターを利用することにより、ＥＳ細胞に対して外来遺伝子をＺＯ−１のアリル（ａｌｌｅｌｅ）に容易に導入することが可能となる。本発明のターゲッティングベクターによって得られたシングルノックアウトＥＳ細胞、および、このシングルノックアウトＥＳ細胞をマウスに戻して作製された、ヘテロマウスにおいては何ら表現型が見いだされないことから、ＺＯ−１の一方のアリルに外来遺伝子を導入することは細胞の機能には影響がないと考えられる。このことは外来遺伝子を発現させる場合、ゲノム構造の影響を考慮しなくても良い利点がある。すなわち、従来のトランスジェニックマウス作成法や細胞の安定なトランスフォーマント（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）作成時の欠点が解決出来ることが予測される。
また、これまでは体細胞での遺伝子ターゲッティング効率は非常に低いとされていたが（外来遺伝子が導入された細胞の０．０１〜０．００１％）、本発明による遺伝子導入条件の至適化により、上皮細胞株ＥｐＨ４においても外来遺伝子が導入された細胞の約１０％で相同組換えが起こることが示された。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法を用いることにより、上皮細胞において発現している遺伝子の機能を効率的に解析できるものと期待される。また、悪性腫瘍形成に関わる遺伝子を破壊する、もしくは該遺伝子の変異体をノックインによりゲノム上に導入することができるため、遺伝子改変を行った上皮細胞における薬剤スクリーニング系の開発が可能になるものと考えられる。
また現在、いくつかの細胞株しか相同組換えによる遺伝子ターゲッティングは成功していないが、薬剤スクリーニングや病態の解析に適した細胞株に対し、このベクターを用いて遺伝子ターゲッティングの条件検討を行うことにより、遺伝子破壊された細胞株を作製できる応用性も期待される。
上記の如く本発明者は、外来遺伝子導入動物を作製する際に、該動物におけるＺＯ−１遺伝子を、外来遺伝子を導入するターゲット部位とすることにより、高効率に遺伝子ターゲッティングが可能であることを見出した。即ち、ＺＯ−１遺伝子をターゲット部位とするベクターは、高効率に外来遺伝子を導入できること、さらに該ベクターを用いた上皮細胞、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する遺伝子ターゲッティング方法を初めて見出し、本発明を完成させた。
本発明は、高効率遺伝子ターゲッティングベクター、および該ベクターを利用した上皮細胞、特にマウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する遺伝子ターゲッティング方法に関し、より具体的には、
〔１〕 非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター、
〔２〕 外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、〔１〕に記載のベクター、
〔３〕 ＺＯ−１遺伝子の部分領域が、該遺伝子の第二エクソンまたは第二エクソンの一部を含む領域である、〔２〕に記載のベクター、
〔４〕 下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片が外来遺伝子の両脇にそれぞれ配置された構造を有する、〔３〕に記載のベクター、
（ａ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片、および第二エクソンの下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ｂ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む５．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片、および第二エクソンの下流の３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片
〔５〕 非ヒト動物のＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−２もしくは該Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター、
〔６〕 外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、〔５〕に記載のベクター、
〔７〕 外来遺伝子発現非ヒト動物または外来遺伝子発現非ヒト動物細胞の作製用ベクターである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター、
〔８〕 外来遺伝子の上流に該遺伝子を転写し得るプロモーターを備えた、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のベクター、
〔９〕 さらにマーカー遺伝子発現カセットを含む、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載のベクター、
〔１０〕 マーカー遺伝子発現カセットの下流に外来遺伝子が隣接して配置された構造を有する、〔９〕に記載のベクター、
〔１１〕 外来遺伝子がマーカー遺伝子発現カセットである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のベクター、
〔１２〕 マーカー遺伝子発現カセットが薬剤耐性遺伝子発現カセットである、〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載のベクター、
〔１３〕 薬剤耐性遺伝子発現カセットがβ−ｇｅｏを含むＤＮＡ断片である、〔１２〕に記載のベクター、
〔１４〕 非ヒト動物がマウスである、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載のベクター、
〔１５〕 上皮細胞に対する遺伝子ターゲッティング方法であって、電圧０．４〜０．５ｋＶおよびコンデンサー容量１２５〜２５０μＦの条件によるエレクトロポレーションにより、ターゲッティングベクターを該細胞へ導入することを特徴とする、ターゲッティング方法、
〔１６〕 エレクトロポレーションへ供される細胞調製液中のカルシウム濃度が５μＭ以下である、〔１５〕に記載の方法、
〔１７〕 ターゲッティングベクターが、細胞の染色体上のＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子を標的とするものである、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法、
〔１８〕 ターゲッティングベクターが、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載のベクターである、〔１５〕または〔１６〕に記載の方法、
〔１９〕 上皮細胞が高等動物細胞由来である、〔１５〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法、
〔２０〕 高等動物がマウスである、〔１９〕に記載の方法、
〔２１〕 細胞がマウス上皮細胞株ＥｐＨ４である、〔２０〕に記載の方法、
〔２２〕 〔１５〕〜〔２１〕のいずれかに記載のターゲッティング方法によってターゲッティングベクターを上皮細胞株へ導入することを特徴とする染色体が人為的に改変された上皮細胞株の製造方法、
を提供するものである。
本発明は、外来遺伝子を高効率に導入可能な遺伝子ターゲッティングベクターに関する。
本発明は、非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域、ＺＯ−２遺伝子領域、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域を、外来遺伝子挿入のための標的部位とすることを特徴とする、ターゲッティングベクターを提供する。
本発明は、非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域、ＺＯ−２遺伝子領域、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクター（単に、「ベクター」と記載する場合あり）を提供する。本発明のベクターは、外来遺伝子発現非ヒト動物または外来遺伝子発現非ヒト動物細胞の作製に有用である。
ＺＯ−１遺伝子の塩基配列は既に知られており、当業者においては、ＺＯ−１遺伝子の塩基配列についての情報を公共の遺伝子バンクから容易に取得することが可能である。例えば、マウスＺＯ−１遺伝子の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＭ＿００９３８６により取得することができる。また、ＺＯ−２遺伝子の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＭ＿０１１５９７、Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の塩基配列についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２３１１８より取得することができる。ＺＯ−１遺伝子の塩基配列の一例として、ＧｅｎＢａｎｋからアクセッション番号ＮＭ＿００９３８６により取得されるマウスＺＯ−１遺伝子の塩基配列を配列番号：１に示す。
本発明のベクターは、外来遺伝子、およびＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子領域、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするターゲッティングベクターである。本発明のベクターを利用することにより、外来遺伝子が染色体へ挿入された外来遺伝子導入動物を作製することが可能である。
「遺伝子ターゲッティング」とは、同じ塩基配列を有するＤＮＡ分子間で起こる相同組換えという現象を利用して、人為的に染色体上の遺伝子を改変することを言う。この「改変」には、遺伝子破壊もしくは遺伝子挿入が含まれる。つまり、染色体上の標的配列と相同的な配列を有するベクターを細胞へ導入することにより、相同部分で組換えが起こり、ベクター（もしくは、その一部）が染色体へ挿入される。
本発明の好ましい態様においては、外来遺伝子が挿入される染色体部位（標的部位）の両脇のＤＮＡ領域と相同な塩基配列からなるＤＮＡ断片が、該外来遺伝子の両脇に配置された構造を持つベクターである。本発明の上記ベクターを細胞へ導入すると、外来遺伝子の両脇の相同ＤＮＡ領域と、標的部位の両脇のＤＮＡ領域との間で、相同組換えが起こり、外来遺伝子が染色体上の標的部位へ挿入される。
本発明において外来遺伝子の挿入の標的となり得る染色体上のＤＮＡ部位は、ＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子上であれば特に制限されず、エクソン、イントロン、またはプロモーター等の遺伝子発現制御領域であってもよい。従って本発明のベクターの好ましい態様としては、外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくはこれら遺伝子の部分領域が配置された構造を有する。
また、外来遺伝子はＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子上であれば任意の領域へ挿入することが可能である。
例えば、ＺＯ−１遺伝子の場合には、好ましくは、ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンまたは第二エクソンの一部を含むＤＮＡ領域へ挿入される。従って、本発明のベクターに含まれるＺＯ−１遺伝子の領域としては、例えば、ＺＯ−１遺伝子の第二エクソン全体もしくは第二エクソンの一部を含むようなＺＯ−１遺伝子上のＤＮＡ領域であることが好ましい。上記の第二エクソンの一部を含むＤＮＡ領域の具体例としては、例えば、（ａ）第二エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片、および第二エクソンの下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片、あるいは、（ｂ）第二エクソンの一部およびその上流を含む５．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片、および第二エクソンの下流の３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片を挙げることができるが、これに限定されない。
本発明のベクターとしては、例えば、上記の２つの断片がそれぞれ、外来遺伝子の上流部または下流部に配置された構造を有するベクターを示すことができる。
また本発明は、上皮細胞に対して効率的に遺伝子ターゲッティングを行うことが可能な方法を提供する。該ベクターの細胞への導入は、種々の方法が知られているが、最も一般的な方法としては、エレクトロポレーション法を挙げることができる。エレクトロポレーション法は、当業者においては一般的に市販されている機材を利用して、適宜、実施することができる。
本発明の方法は、エレクトロポレーションによってターゲッティングベクターを上皮細胞へ導入する工程を含む遺伝子ターゲッティング方法である。
本発明の方法においてエレクトロポレーションは、バイオ・ラッド社のジーンパルサーシステムＩＩ（パルスコントローラーＰＬＵＳ使用）を用いて好ましくは電圧０．４〜０．５ｋＶ、コンデンサー容量１２５〜２５０μＦ、更に好ましくは電圧０．４５ｋｖもしくはその近辺、コンデンサー容量１２５μＦもしくはその近辺の条件で行う。これらのエレクトロポレーションの条件は、上皮細胞に対して高効率に遺伝子ターゲッティングを行うことが可能な条件として、本発明者らによって初めて決定されたものである。
また、エレクトロポレーションに供される細胞（培養液）の調製方法もまた、当業者においては一般的に公知の種々の方法によって適宜実施することができる。例えば、エレクトロポレーションに供される細胞は、カルシウムを添加することによって調製することができる。細胞間接着が強固な細胞の場合、細胞調製時にカルシウム濃度を下げてエレクトロポレーションを行うことにより、遺伝子導入効率が上昇することが本発明者らの研究により明らかとなった（後述の実施例２参照）。従って、細胞調製時の細胞培養液中に含まれる最終カルシウム濃度は、特に限定されるものではないが、好ましくは５μＭ以下である。
本発明の上記方法に使用されるターゲッティングベクターとしては、例えば、上述のベクターを好適に示すことができる。即ち、本発明の好ましい態様としては、上述の上皮細胞の染色体上のＺＯ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００９３８６）、ＺＯ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１１５９７）、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２３１１８）を標的とするものであるが、これらに特に制限されるものではなく、上皮細胞の染色体上の任意のＤＮＡ領域を標的とするように構築することができる。
また、本発明の上記方法に用いられるターゲッティングベクターは、上皮細胞の染色体上の標的となる遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するものである。本発明の上記方法に用いられるターゲッティングベクターとして、例えば、前述の外来遺伝子およびＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するベクター（「ＺＯ−１ベクター」と記載する場合あり）を挙げることができる。
また、本発明のベクターの一例として、ＺＯ−２遺伝子を標的とするターゲッティングベクター（ＺＯ−２ベクター）を挙げることができる。ＺＯ−２ベクターは、外来遺伝子および／またはＺＯ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するベクターであり、より具体的には、該ＺＯ−２ベクターは、ＺＯ−２遺伝子の第３エクソンを欠損するように該遺伝子領域を含むベクターである。該ベクターは、例えば、第３エクソンの上流の６．６−ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および第３エクソン下流の２．６−ｋｂのＳｃａＩ−ＳｐｅＩ断片を用いて作製される。
また、本発明のベクターとして、例えば、Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子を標的とするターゲッティングベクター（Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２ベクター）を挙げることができる。Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２ベクターは、例えば、外来遺伝子および／またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有するベクターである。より具体的には、該Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の第３エクソンを欠損するように該遺伝子領域を含むベクターである。該ベクターは、例えば、第３エクソンの上流および下流それぞれ３．９−ｋｂの断片を上皮細胞株ＥｐＨ４のゲノムＤＮＡを鋳型としたゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＰＣＲにより取得することができる。その際、上流断片の３’側にＥｃｏＲＶサイトを導入し、この新たに導入したサイトを利用することにより、サザンブロットを行うことが可能である。
本発明の上記外来遺伝子は、必ずしも制限されるものではないが、通常、タンパク質を発現し得る（タンパク質をコードする）遺伝子である。上記したベクターによって発現させるタンパク質としては、天然または人工タンパク質であるかを問わず、所望のタンパク質を挙げることができる。天然のタンパク質としては例えば、分泌タンパク質、膜タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、受容体、酵素、ペプチド等が挙げられる。人工タンパク質としては、例えば、キメラ毒素などの融合タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質（受容体の可溶性分子または膜結合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分子等が挙げられる。また、分泌シグナルや膜局在化シグナル、核移行シグナル等を付加したタンパク質であってもよい。また、アンチセンスＲＮＡ分子またはＲＮＡ切断型リボザイム等を発現させることにより、細胞における発現が望ましくない遺伝子について、その発現を抑制する、または遺伝子産物の機能を抑制することもできる。
本発明の上記外来遺伝子は、該遺伝子が転写し得るようにプロモーターと機能的に結合した構造、所謂「発現カセット」であることが好ましい。上記「機能的に結合した」とは、プロモーターの転写の活性化に伴い、下流の遺伝子の発現が誘導されるようにプロモーターと下流の遺伝子が結合していることを言う。
上記プロモーターとしては、遺伝子自体に本来備わっているプロモーターを挙げることができるが、これ以外にも、発現させたい外来遺伝子の種類、および外来遺伝子を導入する細胞の種類等を考慮して、当業者においては公知のプロモーターから適宜選択して使用することができる。具体的には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、βアクチンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス由来（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＴＫプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＲαプロモーター等を例示することができるが、特にこれらに制限されない。
上記ベクターに含まれる標的となる遺伝子領域と相同なＤＮＡ（単に、「相同ＤＮＡ」と記載する場合あり）の長さは、相同組換えが生じ得る長さであれば特に制限されない。一般的に、相同領域は長いほど相同組換えの効率が高いことが知られていることから、本発明のベクターに含まれる標的となる遺伝子領域と相同なＤＮＡ領域も長いことが好ましい。通常、哺乳動物細胞、例えばマウスＥＳ細胞の相同組換えには、外来遺伝子両脇の「相同ＤＮＡ」の合計が５−ｋｂ以上、少なくとも片側の長さは０．５〜２−ｋｂ以上が好ましいとされている。従って、ベクターに含まれる「相同ＤＮＡ」の長さは、通常、合計５−ｋｂ以上であり、外来遺伝子両脇に位置する「相同ＤＮＡ」の長さは、片側において好ましくは０．５−ｋｂ以上、より好ましくは２−ｋｂ以上である。
また、染色体へ外来遺伝子が導入された細胞を選択するため、または外来遺伝子が導入されたことを確認するために、本発明におけるベクターは、マーカー遺伝子発現カセットを含むことが好ましい。「マーカー遺伝子発現カセット」とは、マーカー遺伝子が発現するように構成されたカセットを指し、通常、マーカー遺伝子がプロモーター、ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）またはＳＡ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｅｒ）の一つあるいは複数と機能的に結合した構造を有するＤＮＡ断片である。
上記「マーカー遺伝子」としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）等の薬剤耐性遺伝子を利用することができる。薬剤耐性遺伝子を挿入した場合には、薬剤を含む培地で培養することにより相同組換えを生じた細胞株を選抜することができる。具体的には、マーカー遺伝子として、β−ｇｅｏ（順に、ＬａｃＺ，ｎｅｏ，ｐｏｌｙＡ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン等を好適に使用することができる。
また、上記ベクターが上記マーカー遺伝子発現カセットを含む場合、該ベクターは、該発現カセットの下流（３’側）に外来遺伝子が隣接して配置された構造であることが好ましいが、必ずしもこの構造に制限されるものではない。また、本発明の「外来遺伝子」が上記マーカー遺伝子発現カセットであってもよい。
また本発明のターゲッティングベクターには、標的となる遺伝子の全領域もしくは部分領域を有し、外来遺伝子を含まないベクターも含まれる。例えば本発明には、ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有し、外来遺伝子を含まない遺伝子ターゲッティング用ベクターも包含される。即ち、前記ベクターが提供されれば、適当なベクター上の部位へ、外来遺伝子、加えてマーカー遺伝子発現カセットをクローニングすることは、当業者においては通常行い得ることである。前記ベクターは、外来遺伝子、および必要に応じてマーカー遺伝子発現カセットを容易に挿入できるようにするために、挿入部位にクローニングサイトを設計することができる。該クローニングサイトは、例えば制限酵素の認識配列とすることができる。これにより、該制限酵素部位に外来遺伝子、および必要に応じてマーカー遺伝子発現カセットを挿入することができる。クローニングサイトは、複数の制限酵素認識配列を有する、いわゆるマルチクローニングサイトとしてもよい。これらのクローニングサイトの設計および構築は、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術を用いて行うことが可能である。
さらに上記ベクターは、細胞へ導入された際にベクターを含む細胞を選択するために、必要に応じて上記マーカー遺伝子とは異なる種類の複数のマーカー遺伝子を備えたものであってもよい。
本発明に用いられるターゲッティングベクターの基本骨格は、特に制限はなく、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ ｖｅｃｔｏｒ（製造元プロメガ株式会社）、ｐＵＣ ｖｅｃｔｏｒ（製造元タカラバイオ株式会社）等の市販のベクターを適宜利用することができる。当業者においては、例えば、市販のベクターを利用して、一般的な遺伝子工学技術によりターゲッティングベクターの構築が可能である。
本発明のベクターを利用して染色体へ外来遺伝子を導入することが可能な動物は、好ましくは、マウスを挙げることができるが、ＺＯ−１遺伝子または該遺伝子のホモログを有する非ヒト動物であれば、特に制限されない。マウスＺＯ−１遺伝子のホモログとしてイヌＺＯ−１遺伝子が知られているが、基本的には、全哺乳類においてＺＯ−１遺伝子は発現していると考えられるため、本発明のベクターは全哺乳類に有用であると考えられる。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法に供される細胞としては、例えば、高等動物細胞を好適に示すことができる。高等動物細胞としては、例えば、マウス、ペットや家畜、実験動物などで利用されているイヌ、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、ヒツジ、ヤギ、ネコ等の細胞を挙げることができる。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法に供される細胞の具体例としては、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｅ．，Ｂａｌｌ，Ｒ．，Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｆｒｉｉｓ，Ｒ．Ｒ．Ｎｅｗ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｉｎ ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８９；１０８：１１２７−１１３８）、ＭＴＤ−１Ａ株（Ｅｎａｍｉ，Ｊ．，Ｓ．Ｅｎａｍｉ，ａｎｄ Ｍ．Ｋｏｇａ．１９８４．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｅａｄｉｐｏｓｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ａ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ，ｄｏｍｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ．Ｄｅｖ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．１９８４；２６：２２３−２３４）、ＣＳＧ２１１株（Ｗｉｇｌｅｙ ＣＢ ａｎｄ Ｆｒａｎｋｓ ＬＭ．Ｓａｌｉｖａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１９７６；２０：１４９−１６５）等を示すことができるが、最も好ましくはマウス上皮細胞株ＥｐＨ４である。または、これらの細胞に由来する細胞もまた好適に使用することができる。
本発明の方法の好ましい態様においては、通常、本発明のターゲッティングベクターを上記の条件のエレクトロポレーションによって上皮細胞へ導入した後、該細胞の培養を行う。次いで、相同組換えによって外来遺伝子が染色体へ挿入された細胞を、適宜マーカー等を利用して選択する。
本発明の遺伝子ターゲッティング方法は、例えば、外来遺伝子導入細胞の作製に利用することができる。
外来遺伝子が染色体へ挿入され、該遺伝子を発現する細胞は、当業者においては、本発明のベクターを用いることにより、公知の方法によって容易に作製することができる。
また、本発明のベクターを用いた遺伝子導入非ヒト動物の作製は、例えば、マウスにおいては以下のようにして行うことができるが、この方法に制限されず、当業者においては、マウス以外の非ヒト動物においても一般的な遺伝子工学技術により、本発明のベクターを利用して遺伝子導入非ヒト動物を作製することができる。まず、任意の外来遺伝子を含む本発明のベクターを、エレクトロポレーション法等によりマウスのＥＳ細胞株へ導入し、相同組換えを生じた細胞株を選抜する。得られたＥＳ細胞株をマウス胚盤葉にインジェクションしキメラマウスを得ることができる。このキメラマウスを交配させることで、外来遺伝子がマウス染色体のＺＯ−１遺伝子対の一方へ導入されたマウスを得ることができる。さらに、このマウスを交配させることで、外来遺伝子がマウス染色体のＺＯ−１遺伝子対の双方へ導入されたマウスを取得することができる。
本発明のベクターを利用した方法、あるいは本発明の上記方法によって染色体へ挿入された外来遺伝子の発現量は、当業者に公知の方法によりアッセイすることが可能である。遺伝子の転写産物は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡプロテクションアッセイ等により検出することができる。ノーザンハイブリダイゼーションやＲＴ−ＰＣＲ等による検出はｉｎ ｓｉｔｕでも行うことが可能である。また、翻訳産物を検出するには、抗体を用いたウェスタンブロット、免疫沈降、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ等により行うことができる。さらに、遺伝子導入の検出を容易にするため、発現させるタンパク質にタグを付加したり、外来遺伝子に加えてレポーター遺伝子を発現するようにベクターを構築することも可能である。レポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、またはＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子等が挙げられるがこれらに特に制限されず、当業者においては、細胞の種類等を考慮し、適当なレポーター遺伝子を適宜選択することができる。
本発明は、本発明のターゲッティング方法によってターゲッティングベクターを上皮細胞株へ導入することを特徴とする、染色体が人為的に改変された上皮細胞株の製造方法を提供する。本発明のターゲッティング方法によって導入されたターゲッティングベクターは、上皮細胞株へ導入された後、通常、上皮細胞染色体との間で相同組換えにより該ベクターもしくは該ベクターの一部が染色体へ挿入される。上記「染色体が人為的に改変された上皮細胞株」には、外来遺伝子が染色体へ挿入された上皮細胞株、あるいは内因性の遺伝子が改変された上皮細胞株等が含まれる。この改変とは、例えば、ＤＮＡの挿入、付加、欠失、置換等が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＺＯ−１遺伝子座および遺伝子ターゲッティングベクターを模式的に示す図である。開始コドンは第１エクソンに存在する。
β−ｇｅｏ（ＬａｃＺ／ｎｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第２エクソンの一部を除く形で作られている。サザンブロッティングに用いた３’側プローブを黒線で示した。
図２は、ＺＯ−１シングルノックアウト細胞の作製結果を示す写真である。ＰｖｕＩＩ消化したＺＯ−１遺伝子座を３’側プローブでサザンブロッティングした結果、野生型遺伝子座から得られる６．３−ｋｂのバンドと遺伝子破壊後の遺伝子座から得られる４．７−ｋｂのバンドが得られた（レーン１３，１５，１７を除くすべてのレーン）。レーン１３，１５，１７はターゲッティングされなかったクローンである。１７６個のＧ４１８耐性コロニーの中で、相同組換えが一度起こっていたクローンは１６７個であった。
図３は、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４におけるＺＯ−１遺伝子の遺伝子ターゲッティングについて、マウスＺＯ−１遺伝子座、ターゲッティングベクター、遺伝子破壊後の制限酵素地図を示す。
開始コドンは第１エクソンに存在する。ネオマイシンカセット（ＬａｃＺ／β−ｇｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第２エクソンの一部を除く形で作られている。サザンブロッティングに用いられた５’側プローブを黒線で示した。
図４は、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４におけるＺＯ−２遺伝子の遺伝子ターゲッティングについて、マウスＺＯ−２遺伝子座、ターゲッティングベクター、遺伝子破壊後の制限酵素地図を示す図である。ネオマイシンカセット（ＩＲＥＳ／β−ｇｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第３エクソンを除く形で作られている。サザンブロッティングに用いられた３’側プローブを黒線で示した。
図５は、図４で示されるプロープを用いた際のサザンブロッティング解析の結果を示す写真である。
図６は、マウス上皮細胞株ＥｐＨ４におけるＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の遺伝子ターゲッティングについて、マウスＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子座、ターゲッティングベクター、遺伝子破壊後の制限酵素地図を示す図である。ネオマイシンカセット（ＩＲＥＳ／β−ｇｅｏ／ｐｏｌｙＡ）を中央に含むターゲッティングベクターは第３エクソンを除く形で作られている。サザンブロッティングに用いられた５’側プローブを黒線で示した。
図７は、図６で示されるプローブを用いた際のサザンブロッティング解析の結果を示す写真である。
図８は、エレクトロポレーションにおける電圧、コンデンサー容量がＧ４１８耐性コロニーの数に及ぼす影響を示すグラフである。
ＺＯ−１に対するターゲッティングベクターを様々な電圧、コンデンサー容量で遺伝子導入を行い、Ｇ４１８で選抜し、コロニー形成後その数を計数した。電圧、コンデンサー容量が大きいほどコロニー数が多いことがわかる。
図９は、ＺＯ−１シングルノックアウトＥｐＨ４細胞における遺伝子導入結果を確認するためのサザンブロッティング解析の電気泳動写真である。
ＥｃｏＲＩ消化したＺＯ−１遺伝子座を５’側プローブでサザンブロッティングした結果、野生型遺伝子座から得られる２０．９−ｋｂのバンドと遺伝子破壊後の遺伝子座から得られる５．３−ｋｂのバンドが得られた（レーン１、２、１１、１２）。１４２個のＧ４１８耐性コロニーの中で、相同組換えが一度起こっていたクローンは１６個であった。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 各種高効率ターゲッティングベクターの作製
（１）ＺＯ−１ターゲッティングベクターの作製
ＺＯ−１がコードされたゲノムを得る為に、λファージ１２９／Ｓｖマウスジェノミックライブラリーに対して、マウスＺＯ−１ ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングし、４つの重複するゲノム断片を得た。制限酵素によるマッピングとＤＮＡシーケンスにより、マウスＺＯ−１のｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｕｓを決定した（図１）。取得したＺＯ−１遺伝子を含むゲノム断片は４個のエクソンからなり、エクソン１に開始コドンが存在していた。
ＺＯ−１ターゲッティングベクターは第２エクソンの一部を除く形で設計した。このベクターはカセットとして、β−ｇｅｏ（順にＬａｃＺ，ｎｅｏ，ｐｏｌｙ Ａ）を含んでいる。第２エクソンの一部およびその上流を含む５．１−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片と、第２エクソン下流の３．９−ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片を、上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図１）。このターゲッティングベクターにより、相同組換えがターゲッティングベクターとＺＯ−１遺伝子の間に起こると、エクソン２の一部を含む領域が除かれ、β−ｇｅｏが挿入される。
また、上記ターゲッティングベクターはカセットとして、ネオマイシンカセット（順にＬａｃＺ，ｎｅｏ，ｐｏｌｙ Ａ）を含んでいてもよく、その場合、第２エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片と、第２エクソン下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を、上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図３）。
（２）ＺＯ−２ターゲッティングベクターは、第３エクソンを除く形で設計した。このベクターは、カセットとしてネオマイシンカセット（順にｌｏｘＰ，Ｅｎ−２，ＳＡ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｅｒ），ＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ），β−ｇｅｏ，ｐｏｌｙＡ，ｌｏｘＰ）を含んでいる。なお、Ｅｎ−２はｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２遺伝子のイントロンおよびｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｃｃｅｐｔｅｒを含む配列であり、ｓｐｌｉｃｉｎｇの効果を高めていると考えられている。第３エクソンの上流の６．６−ｋｂのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、および第３エクソン下流の２．６−ｋｂのＳｃａＩ−ＳｐｅＩ断片を、上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図４および５）。このターゲッティングベクターにより、相同組換えがターゲッティングベクターとＺＯ−２遺伝子の間に起こると、第３エクソンを含む領域が除かれる。
（３）Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２ターゲッティングベクターは、第３エクソンを除く形で設計した。このベクターは、ＺＯ−２と同様にカセットとしてネオマイシンカセット（順にｌｏｘＰ，ＳＡ，ＩＲＥＳ，β−ｇｅｏ，ｌｏｘＰ，ｐｏｌｙＡ）を含んでいる。第３エクソンの上流および下流それぞれ３．９−ｋｂの断片を上皮細胞株ＥｐＨ４のゲノムＤＮＡを鋳型としたゲノミック（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＰＣＲにより取得し、それぞれ上記カセットの上流部、下流部にそれぞれライゲーションした（図６および７）。その際、上流断片の３’側にＥｃｏＲＶサイトを導入し、この新たに導入したサイトを利用することにより、サザンブロット解析を行った。このターゲッティングベクターにより、相同組換えがターゲッティングベクターとＤｉａｂｌｅｄ−２遺伝子の間に起こると、第３エクソンを含む領域が除かれる。
〔実施例２〕 遺伝子ターゲッティング
ＺＯ−１ターゲッティングベクターは５’相同領域断片の５’側に存在するｕｎｉｑｕｅサイトのＳａｃＩＩで直線化（ｌｉｎｅａｌｉｚｅ）した。その後、７〜８回ｐａｓｓａｇｅしたＥＳ細胞へＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてエレクトロポレーションを行い、遺伝子導入した。これらのＥＳ細胞は通常培地中で、ｆｅｅｄｅｒ細胞の上で３６〜４８時間培養した。次に１７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８中を含む培地中で７〜１３日培養した。Ｇ４１８耐性コロニーを分離し、３’側相同領域断片の外側に対するゲノム断片（２９０ｂｐ）を用いたサザンブロットによりスクリーニングを行った。正しく相同組換えが起こったクローンはゲノムをＰｖｕＩＩで消化すると、野生型では、６．３−ｋｂの断片が、相同組換えが起こったアリル（ａｌｌｅｌｅ）では４．７−ｋｂの断片が認められた（図２）。１７６個のＧ４１８耐性コロニーの中で、相同組換えが一度起こっていたクローンは１６７個であった。すなわち約９５％の効率でターゲッティングが起こることが確認された。このことはこのターゲッティングベクターが通常に比べ、高い相同組換え効率があることを示している。
既に本発明では、他の細胞株Ｆ９ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌにおいても、高効率に相同組換えによるＺＯ−１遺伝子の遺伝子ターゲッティングが起こることも確認している。
〔実施例３〕 遺伝子ターゲッティングのためのエレクトロポレーションの条件検討
マウス上皮細胞株ＥｐＨ４に対する遺伝子ターゲッティング法を開発する為に、実施例１に記載の高効率ＺＯ−１ターゲッティングベクター（１．５ｋおよび８．５ｋの断片を含むターゲッティングベクター）を用いてエレクトロポレーションの条件検討を行った。
マウスＺＯ−１に対するターゲッティングベクターは３’相同領域断片の３’側に存在するｕｎｉｑｕｅサイトのＸｈｏＩで直線化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅ）した（図３）。このＤＮＡ（１０μｇ）を１２時間、低Ｃａ２＋培地（５μＭ）で培養したマウス上皮細胞株ＥｐＨ４（１ｘ１０７ ｃｅｌｌｓ）に対してバイオ・ラッド社のジーンパルサーＩＩシステム（パルスコントローラーＰＬＵＳ使用）を用いて、電圧、コンデンサー容量等の様々な条件でエレクトロポレーションを行い遺伝子導入した。導入後、通常培地中で、４８時間培養後、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地中で１４日培養し、選抜をした。その結果、各条件に応じてＧ４１８耐性コロニーの数に違いが認められた（図８）。このことは条件に応じてターゲッティングベクターの導入効率が異なることを示している。
次に各条件に応じたＧ４１８耐性コロニーを分離し増やしたものからゲノムを抽出し、５’側相同領域断片の外側に対するゲノム断片（２８０ｂｐ）を用いたサザンブロットを行った。その結果、最も良く相同組変えが起こっていた条件は、０．４５ｋＶ、１２５μＦであった（表１）。
この条件はＥＳ細胞における至適条件とは異なっていた。
この条件で再度ＺＯ−１遺伝子座に対して遺伝子ターゲッティングを行った所、１４２クローン中１６クローンで（１１．２％）相同組換えが確認された。正しく相同組換えが起こったクローンはＺＯ−１においては、ゲノムをＥｃｏＲＩで消化すると、野生型の２０．９−ｋｂのバンドに加え新たに５．３−ｋｂのバンドが現れた（図９）。
【産業上の利用の可能性】
本発明のベクターを利用することにより、ＥＳ細胞に対して外来遺伝子をＺＯ−１のアリルに容易に導入することが可能となる。本発明のターゲッティングベクターによって得られたシングルノックアウトＥＳ細胞、およびこのシングルノックアウトＥＳ細胞をマウスに戻して作製されたヘテロマウスにおいては、何ら表現型が見いだされないことから、ＺＯ−１の一方のアリルに外来遺伝子を導入することは細胞の機能には影響がないと考えられる。このことは外来遺伝子を発現させる場合、ゲノム構造の影響を考慮しなくても良い利点がある。すなわち、従来のトランスジェニックマウス作製法や細胞の安定なトランスフォーマント作製時の欠点が解決出来ることが期待される。
また、本発明の遺伝子ターゲッティング方法を用いることにより、上皮細胞において発現している遺伝子の機能を解析することが可能である。また、悪性腫瘍形成に関わる遺伝子を破壊もしくはその変異体をノックインにより効率的にゲノム上に導入することができるため、遺伝子改変を行った上皮細胞を利用した薬剤スクリーニング系の開発が可能になるものと考えられる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター。
【請求項２】
外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ＺＯ−１遺伝子の部分領域が、該遺伝子の第二エクソンまたは第二エクソンの一部を含む領域である、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片が外来遺伝子の両脇にそれぞれ配置された構造を有する、請求項３に記載のベクター。
（ａ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片、および第二エクソンの下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ｂ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む５．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片、および第二エクソンの下流の３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片
【請求項５】
非ヒト動物のＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−２もしくは該Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター。
【請求項６】
外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
外来遺伝子発現非ヒト動物または外来遺伝子発現非ヒト動物細胞の作製用ベクターである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
外来遺伝子の上流に該遺伝子を転写し得るプロモーターを備えた、請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
さらにマーカー遺伝子発現カセットを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
マーカー遺伝子発現カセットの下流に外来遺伝子が隣接して配置された構造を有する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
外来遺伝子がマーカー遺伝子発現カセットである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
マーカー遺伝子発現カセットが薬剤耐性遺伝子発現カセットである、請求項９〜１１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３】
薬剤耐性遺伝子発現カセットがβ−ｇｅｏを含むＤＮＡ断片である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
非ヒト動物がマウスである、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクター。
【請求項１５】
上皮細胞に対する遺伝子ターゲッティング方法であって、電圧０．４〜０．５ｋＶおよびコンデンサー容量１２５〜２５０μＦの条件によるエレクトロポレーションにより、ターゲッティングベクターを該細胞へ導入することを特徴とする、ターゲッティング方法。
【請求項１６】
エレクトロポレーションへ供される細胞調製液中のカルシウム濃度が５μＭ以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ターゲッティングベクターが、細胞の染色体上のＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子を標的とするものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ターゲッティングベクターが、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
上皮細胞が高等動物細胞由来である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
高等動物がマウスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞がマウス上皮細胞株ＥｐＨ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれかに記載のターゲッティング方法によってターゲッティングベクターを上皮細胞株へ導入することを特徴とする、染色体が人為的に改変された上皮細胞株の製造方法。
【請求項１】
非ヒト動物のＺＯ−１遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター。
【請求項２】
外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−１遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ＺＯ−１遺伝子の部分領域が、該遺伝子の第二エクソンまたは第二エクソンの一部を含む領域である、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片が外来遺伝子の両脇にそれぞれ配置された構造を有する、請求項３に記載のベクター。
（ａ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む１．５−ｋｂのＢｓｐ１２８６Ｉ−Ｂｓｐ１２８６Ｉ断片、および第二エクソンの下流の８．５−ｋｂのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片
（ｂ）ＺＯ−１遺伝子の第二エクソンの一部およびその上流を含む５．１ｋｂのＰｓｔＩ−ＢｓｒＤＩ断片、および第二エクソンの下流の３．９ｋｂのＰｓｔＩ−ＳｐｈＩ断片
【請求項５】
非ヒト動物のＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子領域へ外来遺伝子を導入するための遺伝子ターゲッティングベクターであって、該外来遺伝子、および該ＺＯ−２もしくは該Ｄｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域を有することを特徴とするベクター。
【請求項６】
外来遺伝子の上流および／または下流に、ＺＯ−２遺伝子もしくはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子の全領域もしくは部分領域が配置された構造を有する、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
外来遺伝子発現非ヒト動物または外来遺伝子発現非ヒト動物細胞の作製用ベクターである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
外来遺伝子の上流に該遺伝子を転写し得るプロモーターを備えた、請求項１〜７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
さらにマーカー遺伝子発現カセットを含む、請求項１〜８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
マーカー遺伝子発現カセットの下流に外来遺伝子が隣接して配置された構造を有する、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
外来遺伝子がマーカー遺伝子発現カセットである、請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
マーカー遺伝子発現カセットが薬剤耐性遺伝子発現カセットである、請求項９〜１１のいずれかに記載のベクター。
【請求項１３】
薬剤耐性遺伝子発現カセットがβ−ｇｅｏを含むＤＮＡ断片である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
非ヒト動物がマウスである、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクター。
【請求項１５】
上皮細胞に対する遺伝子ターゲッティング方法であって、電圧０．４〜０．５ｋＶおよびコンデンサー容量１２５〜２５０μＦの条件によるエレクトロポレーションにより、ターゲッティングベクターを該細胞へ導入することを特徴とする、ターゲッティング方法。
【請求項１６】
エレクトロポレーションへ供される細胞調製液中のカルシウム濃度が５μＭ以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ターゲッティングベクターが、細胞の染色体上のＺＯ−１遺伝子、ＺＯ−２遺伝子、またはＤｉｓａｂｌｅｄ−２遺伝子を標的とするものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ターゲッティングベクターが、請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
上皮細胞が高等動物細胞由来である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
高等動物がマウスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞がマウス上皮細胞株ＥｐＨ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれかに記載のターゲッティング方法によってターゲッティングベクターを上皮細胞株へ導入することを特徴とする、染色体が人為的に改変された上皮細胞株の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９８１
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０９７４６（Ｐ２００５−５０９７４６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６５４９
【国際出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（００００００２１７）エーザイ株式会社 (102)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【発行日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１６５４９
【国際出願日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（００００００２１７）エーザイ株式会社 (102)
【Ｆターム（参考）】
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