説明

高圧凍結装置用の標本ホルダ

【課題】少なくとも試料材料が試料容器内へ取り入れられ、次いで該試料容器が耐圧密封され、引き続き凍結剤を用いて冷却される、試料容器内へ封入され含水性であり凍結保存される試料を製造するための方法、並びにこの方法を実行するための装置を、凍結中の圧力が確実に維持され、試料において所望の使用可能な範囲が確実に得られるように改善する。
【解決手段】前記容器が時間的且つ場所的に順序をもって冷却され、先ず最初に容器内容物の犠牲範囲が凝固し、その後に初めて残りの容器内容物が凝固すること。ここで有利に使用される試料容器(1a)は、チューブ形状であり、両方の端部で密封されていて、実質的にU字形状に形成されている。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、少なくとも試料材料が試料容器内へ取り入れられ、次いで該試料容器が耐圧密封され、引き続き凍結剤(クライオジェン)を用いて冷却される、試料容器内へ封入され含水性であり凍結保存される試料を製造するための方法に関する。
【0002】
更に本発明は、前記方法を実行するための試料容器に関する。
【背景技術】
【0003】
この種の方法並びに装置は、本出願人による特許文献1から知られるようになった。この文献から読み取れるように、生物試料においては標本を高圧条件下で凍結する試みが成され、この際、凍結剤としては例えば液体窒素が使用される。それらの試料は含水性であるので、氷への凍結時に水が膨張するため、試料が冷却時に封入されていてその膨張が防止されるのであれば相当な圧力が得られることになる。この圧力は、前記文献で詳細に説明されているように、所望のものであり、その理由は、それにより高圧凍結が高い機器費用と高い冷却剤消費とを伴わずに達成されるためである。その公知の方法では、大気圧時に凍結された又は衝撃凍結された試料とは異なり、試料内の水においてガラス化又は少なくとも微結晶化が進行することが目指されている。凍結過程のより良い熱条件を達成するために、試料容器が実際の凍結過程前にも、例えば、273Kと251Kの間の温度に設定されているエタノール−又はエタノール/メタノール−混合物内で事前冷却され得る。好ましい値は、水・Eis Ih・Eis III の温度三重点の僅か上方にある(251K)。もしも試料が熱平衡にあるのであれば、次いで実際の凍結過程が凍結剤を用いて実行される。
【0004】
凍結過程の後、試料容器は開かれ又は切断され、試料が取り出され、次いで他の処理、例えば、アセトンを用い、-80℃から-40℃の、典型的には183Kより高い温度における凍結置換に供される。他方で試料は、周知の形式のミクロトームを用い、切断又は研磨もされ得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】AT 505427 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献1で公開された方法は、生物試料の凍結保存の分野において本質的な改善をもたらすものであるが、例えば、端部が押し潰しなどの圧着により密封されている試料チューブにおいては、2000barを超えて発生する高圧時、それらの端部には密封性がなくなり、それにより試料が使用不能になることがある。他方では使用可能な即ちガラス状/微結晶状に凍結される試料範囲は、多くの場合、六方晶系の Eis I の大きな結晶を有し且つそのために使用不能である試料範囲の真ん中にある。一般的には、どの試料範囲が使用可能でありどの試料範囲が使用不能であるかは予測することができない。
【0007】
経験上、全試料ができるだけ同時に冷却されればその非密封性の割合は減少され得る。そのために試料チューブは、例えば、沈入(ないし浸漬)の間、凍結剤の表面と平行に方向付けられる。しかしこの場合、使用可能な即ちガラス状/微結晶状に凍結される試料範囲は、多くの場合、六方晶系の Eis I の大きな結晶を有し且つそのために使用不能である試料範囲の真ん中にある。一般的には、どの試料範囲が使用可能でありどの試料範囲が使用不能であるかは予測することができない。
【0008】
本発明の課題は、前記の公知の方法、並びにその方法を実行するための前記の公知の装置を、凍結中の圧力が確実に維持され、試料において所望の使用可能な範囲が確実に得られるように改善することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
前記の課題は、本発明の一視点に従い、冒頭に掲げた形式の方法において、容器が時間的且つ場所的に順序をもって冷却され、この際、先ず最初に容器内容物の犠牲範囲が凝固し、その後に初めて残りの容器内容物が凝固すること(基本形態:形態1)により解決される。
【0010】
従って本発明の基本的な思想は、試料を有する試料容器を、この試料を例えば液体窒素のような凍結剤内へ完全に沈める又は投げ入れることによりできるだけ迅速に冷却するということではなく、多くの場合は利用されない容器内容物の「犠牲範囲」(捨てて用いない部分 Opferbereich)が凝固する容器の範囲を先ず冷却し、その次に初めて全容器内容物の更なる凝固を始めさせることを考慮するということにある。
【発明を実施するための形態】
【0011】
発明の実施の基本形態は、前述のとおりである。以下、この基本形態に付加的な各々の形態について説明する。尚、これらの形態は、特許請求の範囲における従属請求項の対象でもある。また、特許請求の範囲で付記されている図面の符号は本発明の理解を容易にするためのものであり本発明を実施例の形式に限定するものではないことを付言する。
【0012】
密封と冷却の前に前記容器の犠牲範囲が、凝固時に膨張する物質で満たされると目的に適い得る(形態2)。その際、犠牲範囲の凝固は、最初にまだ凝固されていない試料部分内の圧力上昇を導き、この圧力上昇は、試料の最終の凝固中に好ましくない結晶の形成を防止する。この際、前記物質は、好ましくは少なくとも部分的に水から成り得る(形態3)。
【0013】
有利であり、僅かな試料量にとっても適しているバリエーションでは、両方の端部が密封されているチューブ形状の試料容器が、先ず少なくとも1つの端部で凍結剤を用いて冷却される(形態4)。しかしこのバリエーションでは、さしあたり冷却されない端部の密閉が更に技術的に必要となるが、この要求は、以下に開示される実施の形態により巧みに回避され得る。
【0014】
時間的且つ空間的に制御される冷却のための好ましい可能性は、両方の端部で密封されているチューブ形状の試料容器であって、それらの両端部の間の範囲内で、周辺部に対して熱伝導率の減少された接続状態(熱的結合 Kupplung)を保証する手段を備えた試料容器が、凍結剤を用いて冷却されることにある(形態5)。この際、前記手段は、前記容器に外側に装着されている絶縁部であり得る(形態6)。
【0015】
本発明を実行するための簡単に構成された試料容器は、この試料容器が、チューブ形状であり、両方の端部で密封されていて、実質的にU字形状に形成されていることにより特徴付けられる(形態7)。
【0016】
試料容器の別の目的に適うバリエーションでは、この試料容器が、チューブ形状であり、両方の端部で密封されていて、それらの両端部の間の範囲内に絶縁部を備えていることが意図され得る(形態8)。
【0017】
利用範囲内の絶縁部は、試料容器に係合する保持装置の少なくとも一部分が絶縁部として形成されていることでも簡単に実現され得る(形態9)。
【0018】
幾つかの場合には、試料容器が互いに分離可能な2つの部分から成ると有利であり得る(形態10)。
【0019】
この際、前記のそれらの部分の結合のために、それらの2つの両方の部分が互いに密閉するようにネジ固定可能であることが意図され得る(形態11)。
【0020】
しかし、事情によっては中でも試料容器が小さい場合に難儀なネジ固定を回避するために、前記の両方の部分が締付装置内で共に押圧可能であってもよい(形態12)。
【0021】
[発明の効果]
本発明に従う方法、並びにこの方法を実行するための試料容器により、凍結中の圧力が確実に維持され、試料において定められた使用可能な範囲が確実に得られるという効果が得られる。また、時間的且つ空間的に制御される冷却に基づき、容器内容物の犠牲範囲の凝固時の膨張により、まだ凝固されていない試料部分内の所望の圧力上昇を得ることができる。
【0022】
以下、他の長所ともども、例として具現化した図面に基づき、本発明の実施例を詳細に説明する。なお、以下の実施例は、本発明の理解の容易化のためのものであって、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲において当業者により実施可能な付加や置換等を排除することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】両方の端部が圧着閉鎖された試料チューブを示す図であり、この試料チューブ内には試料材料が封入されている。
【図2】図1による試料チューブを示す図であるが、ここではその外側面が断熱材で包囲されている。
【図3】凍結剤内への沈入時の、U形状に形成されている試料チューブを示す図である。
【図4】2部材式でネジ固定可能な(ネジ込み式)試料容器を示す図であり、ここではこの試料容器が、一方の部分において比較的大きな犠牲範囲を有し、他方の部分において実際の試料材料を有している。
【図5】図4と同様に2部材式の試料容器を示す図であるが、ここではこの試料容器が締付装置によって締付固定されている。
【実施例1】
【0024】
図1は、チューブ形状の試料容器1を示していて、この試料容器1は、例えば、個々の細胞や、線虫類のような小生物のために用いられ、毛細管(キャピラリーチューブ)から成形されている。一例としてそのような試料容器の1つの実施形は、外径が0.6mmであり、内径が0.3mmであり、16mmの長さである。含水性の生物試料を試料容器に満たした後、その生物試料は容器内容物2を形成し、例えば銅(などの可塑性金属シート)から成るこの試料容器はその両方の端部3において、例えばペンチを用いてほぼ1mmの長さに渡って押し潰す方式で固定密封される。図示のとおり、両端部において容器壁は互いに近接し、圧着(密着)端部で終端する。
【0025】
その後、試料容器は、先ずその両方の端部(圧着端部)3が冷却され、次いで試料容器の残りの部分も冷却され、その結果、全容器内容物2が凝固する。容器壁部の熱伝導率に基づき、ここでは明確な移行部分が存在しないのは明らかであるが、この場合、特に、押し潰された端部(圧着端部)を有するチューブ形状の試料容器1の場合、チューブの端部範囲内の容器内容物が最初に凝固するという長所が達成される。端部範囲が早期に凝固するため、容器端部は、凝固した試料材料により保護されるため、もはや開口してしまうことはない。同時に、この場合に犠牲範囲として用いられる試料端部の凝固が所望の圧力上昇を引き起こす。
【0026】
最初に凝固し且つ必ずしも試料材料を含む必要のない容器内容物の1つの範囲(又は複数の範囲)は(以降の段落で更に説明するが)本発明との関連において「犠牲範囲」と呼ぶこととし、その理由は一般的にはそのような範囲が試料獲得のためには使用されないためである。図1による試料容器1では、例えば容器内容物2の完全な凍結後に試料容器1の両方の端部範囲が、点線で示唆された箇所において切り離され、その結果、2つの犠牲範囲4と1つの利用範囲5が得られることになる。この利用範囲5は、既知の上述の方式で更に使用される試料材料を含んでいる。
【0027】
本発明に従う方法を実際に実行するためには、様々な行程或いは容器構成が考えられ得る。例えば、凍結が最初に両方の端部に生じることを可能とするためには、両方の端部で密封されているチューブ形状の試料容器が、それらの端部の間の(中央部)範囲内で、周辺部に対して熱伝導率の減少された接続状態(ないし熱的結合 Kupplung)を保証する手段を有するように本方法を構成することができる。
【実施例2】
【0028】
つまり図2は、図1の試料容器1を示しているが、この試料容器1は、その外壁部に施され、例えばプラスチックのような適切な材料から成る絶縁部6を備えている。図1のように充填されたこのような試料容器1は、その後、全体として凍結剤内へ沈入され得て、その際には絶縁部6があるため、利用範囲5は犠牲範囲4の後に初めて凝固される。
【0029】
空間的に且つ時間的に制御された冷却を実現するための他の可能性は、試料容器に異なる壁厚を設けること、即ち壁厚を利用範囲の回りでは犠牲範囲の回りよりも大きく選択することにある。この実施形態は、特に有利であり、熱伝導率の僅かな容器材料を用いて実現される。
【実施例3】
【0030】
簡単であるが効果的な方式で本発明に従う方法の実行を容易にする容器形状が図3に示されている。ここでは試料容器1aがチューブ形状で且つ実質的にU字形状に構成されている。両方の端部は、図1及び図2による実施形のように、圧着閉鎖により密封されていて、この際、ここでは、両方の端部が当然のことながら、別の方式、例えば円錐形のように適切に成形された詰め物(プラグ)によっても密封され得ることを指摘しておく。凍結のために、例えば湾曲されたベース部分(中央部分)で保持装置7により保持される試料容器1aは、例えば液体窒素のような凍結剤8で満たされているデューア瓶9内へ沈められ、つまり図示されているように、先ず両方の端部範囲3が沈入し、その後、完全に沈み込むようにされる。それらの端部範囲内では容器内容物2が必然的に最初に凍結或いは凝固し、それにより密封箇所は密閉され、圧力上昇が容器内容物2の流出をもたらすことはない。
【0031】
図3から見てとれる保持装置7との関連において、そのような保持装置の試料容器を包囲係合する部分は、図2による絶縁部6の意味における絶縁部としても機能し得ることを指摘しておく。
【0032】
本発明の枠内で使用される試料容器は、必ずしもチューブ形状として或いは1部材式として構成される必要はなく、次にこのことを他の2つの実施例に基づいて説明する。
【実施例4】
【0033】
図4は、ねじ山10の設けられている2つの容器部分11o及び11uから成る試料容器1bを示していて、それらの容器部分は密閉するように互いにネジ固定(螺着)可能である。両方の容器部分11o及び11uの各々は内部空間を有し、図示されている例では、図面で下側の容器部分11uが上側の容器部分11oよりも大きな容積を有している。図4による実施例に基づき、容器内容物2が均質な状態ではない試料材料から構成されているという本発明に従う方法の1つのバリエーションが説明される。つまり犠牲範囲4、ここでは下側の容器部分11uの内部空間が、凝固時に著しく膨張する物質、特に少なくとも部分的に水から成る物質、又は純粋な水で満たされる。上側の容器部分11oの比較的小さい内部空間内、即ち利用範囲5内には、それに対し、実際の試料材料が含まれている。このようなバリエーションは、必要な圧力上昇を、試料材料が極めて僅かな場合か、又は試料材料自体がその特性に基づいて十分に圧力を上昇し得ない場合にも確実なものとする。図4による試料容器1bは、本発明の基本的解決原理のとおり、空間的に且つ時間的に制御され、この試料容器1bが、犠牲範囲4(ここでは水など)を含む容器部分11uを用いて最初に凍結剤内へ沈められ、その後に初めて完全に沈入されるように冷却され得る。最初に凝固時に膨張する水、又は別の適切な物質は、それにより、所望の圧力を実際の試料材料に対し、既にその凝固前に施し、その結果、この試料材料は、冒頭で論じられた所望の構造を得ることになる。
【0034】
2部材式の試料容器の一変形例として、全内部空間が両方の容器部分の一方に形成されていて、他方の容器部分が蓋だけであるということも可能である。
【実施例5】
【0035】
図5には、同様に2部材式の試料容器1cが示されているが、この試料容器1cの両方の容器部分12o及び12uはネジ固定されているのではなく、上下に載置されているだけである。上側の利用範囲5と下側の犠牲範囲4から成る全容器内容物の密閉を容器内部の圧力上昇時にも確実にするために、この試料容器1cは締付装置13によって締付固定される。そのような締付装置13は、基本的に任意に構成され得るが、図5によるこの実施例では、軸14の回りに旋回可能な2本のアーム15o及び15uが設けられていて、これらのアームが、ネジ山17を介して図面で下側のアーム15uと連携作用(螺合)する締付ネジ16を用い、これらのアームの自由端部において、両方の容器部分12o及び12uを密閉するように互いに押し付けている。
【0036】
図5による試料容器1cでは、図4による試料容器1bと類似する、犠牲範囲4と利用範囲5の分割が提供されていて、冷却も図4との関連で説明したように行われる。
【0037】
尚、本発明の全開示事項の範囲内において、本発明の基本的技術思想に基づき、開示された各実施形態、実施例を、当業者の理解と技能に基づき一部修正、変更し、更に開示された各要素を、その目的に応じて組み替えて用いることは、特に明記がない場合においても、本発明の枠内に属するものである。
【符号の説明】
【0038】
1 試料容器(1a、1b、1c)
2 容器内容物
3 試料容器の端部
4 犠牲範囲
5 利用範囲
6 絶縁部
7 保持装置
8 凍結剤
9 デューア瓶
10 ネジ山
11o 容器部分
11u 容器部分
12o 容器部分
12u 容器部分
13 締付装置
14 軸
15o アーム
15u アーム
16 締付ネジ
17 ネジ山

【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも試料材料が試料容器内へ取り入れられ、次いで該試料容器が耐圧密封され、引き続き凍結剤を用いて冷却される、試料容器内へ封入され含水性であり凍結保存される試料を製造するための方法において、
前記容器(1、1a、1b、1c)が時間的且つ場所的に順序をもって冷却されて、先ず最初に容器内容物(2)の犠牲範囲(4)が凝固し、その後に初めて残りの容器内容物が凝固すること
を特徴とする方法。
【請求項2】
密封と冷却の前に前記容器(1b、1c)の犠牲範囲(4)が、凝固時に膨張する物質で満たされること
を特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記物質は、少なくとも部分的に水から成ること
を特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
両方の端部が密封されているチューブ形状の試料容器(1、1a)が、先ず少なくとも1つの端部で凍結剤(8)を用いて冷却されること
を特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
両方の端部で密封されているチューブ形状の試料容器(1)であって、それらの両端部の間の範囲内で、周辺部に対して熱伝導率の減少された接続状態を保証する手段(6)を備えた試料容器が、凍結剤を用いて冷却されること
を特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記手段は、前記容器に外側に装着されている絶縁部(6)であること
を特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項7】
請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法を実行するための試料容器において、
この試料容器(1a)が、チューブ形状であり、両方の端部で密封されていて、実質的にU字形状に形成されていること
を特徴とする試料容器。
【請求項8】
請求項1〜3及び6のいずれか一項に記載の方法を実行するための試料容器において、
この試料容器(1)が、チューブ形状であり、両方の端部で密封されていて、それらの両端部の間の範囲内に絶縁部(6)を備えていること
を特徴とする試料容器。
【請求項9】
請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法を実行するための試料容器において、
この試料容器(1a)に係合する保持装置(7)の少なくとも一部分が絶縁部として形成されていること
を特徴とする試料容器。
【請求項10】
請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法を実行するための試料容器において、
この試料容器(1b、1c)が、互いに分離可能な2つの部分(11o、11u;12o、12u)から成ること
を特徴とする試料容器。
【請求項11】
前記の2つの部分(11o、11u)が、互いに密閉するようにネジ固定可能であること
を特徴とする、請求項10に記載の試料容器。
【請求項12】
前記の2つの部分(12o、12u)が、締付装置(13)内で共に押圧可能であること
を特徴とする、請求項10に記載の試料容器。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【公開番号】特開2011−12061(P2011−12061A)
【公開日】平成23年1月20日(2011.1.20)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−148872(P2010−148872)
【出願日】平成22年6月30日(2010.6.30)
【出願人】(501129941)ライカ ミクロジュステーメ ゲーエムベーハー (8)
【Fターム(参考)】