高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法
【目的】 煩雑な分画分離操作の不要な簡便な高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）中のコレステロールの定量法を提供する。
【構成】 高密度リポ蛋白とジメチル−β−シクロデキストリンとを水性液中で混合して濁りを生成させ、該混合液の濁度を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法。
【構成】 高密度リポ蛋白とジメチル−β−シクロデキストリンとを水性液中で混合して濁りを生成させ、該混合液の濁度を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）に含まれるコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールという）の定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤＬを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかしながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点がある。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）、オクタロニー法などがあるが、これらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法によりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合には、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存在するアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成させ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤＬコレステロールを定量する（臨床検査法提要、第２９版、金井泉著、金原出版、４７１頁、１９８３年）。この方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向きである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、煩雑な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、リポ蛋白含有試料とジメチル−β−シクロデキストリン（ＤＭ−β−ＣｙＤ）とを水性液中適当な条件下で混合することによりＤＭ−β−ＣｙＤと試料中のＨＤＬとが特異的に作用して濁りを形成し、このときの該混合液の濁度がＨＤＬコレステロール濃度とよい相関性を示すことを見い出し、本発明に至った。
【０００５】本発明は、ＨＤＬとＤＭ−β−ＣｙＤとを水性液中で混合して濁りを生成させ、該混合液の濁度を測定することを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量法に関する。次に、本発明の定量法について説明する。本発明を実施するに際しては、まず、ＤＭ−β−ＣｙＤを適当な緩衝液、例えば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解して試薬を調製する。ＤＭ−β−ＣｙＤの濃度は、試料と共存した場合に例えば１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭの濃度になるように調整する。次いで、試料そのものもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈した試料を上記試薬で、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で１〜３０分間処理する。その後、混合液の濁度を３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、例えば３４０ｎｍでの吸光度により測定し、吸光度の値からＨＤＬコレステロール量を算出する。
【０００６】試料として血清から超遠心により分画されたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭの各フラクションを使用し、上記定量法に従って吸光度を測定した。５ｍＭの各種糖化合物含有試薬を調製して測定した結果を図１に示す。（図中、ＣｙＤはシクロデキストリンを表し、ＨＥはヒドロキシエチルを表し、ＨＰはヒドロキシプロピルを表し、ＤＭはジメチルを表し、ＴＭはトリメチルを表し、ＣＭはカルボキシメチルを表し、Ｇｌｕはグルコシルを表し、Ｍａｌはマルトシルを表し、ＰＭはパーシャリーメチルを表す）
図１に示すように、糖化合物としてＤＭ−β−ＣｙＤを用いた場合にＨＤＬの存在下でのみ濁りが形成されることが確認された。
【０００７】次に、実施例によって本発明の態様を説明する。
【０００８】
【実施例】
実施例１ＤＭ−β−ＣｙＤ（５ｍＭ）および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）からなる試薬を調製した。血清から超遠心で分画し各種濃度に希釈したＨＤＬのサンプル５０μｌ（ＨＤＬコレステロール濃度は酵素法により別途測定）を上記試薬３ｍｌで３７℃で１５分間処理し、得られた溶液の吸光度を測定した。
【０００９】その結果を第２図に示す。第２図は、ＨＤＬコレステロール濃度と吸光度との相関関係を示すもので、ＨＤＬコレステロール濃度は吸光度とよい相関を示した。
【００１０】実施例２血清から超遠心で分画し各種濃度に希釈したＨＤＬのサンプルの代わりに血清サンプルを用いる以外は実施例１と同様の操作を行って吸光度を測定し、第１図を基準に血清サンプル中のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法として、リンタングステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法〔デタミナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈殿〕（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９８７年）を用いて、血清サンプル中のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。
【００１１】その結果、本発明の方法による結果は沈殿法による結果と良好な相関を示した〔本発明の方法での平均値（ｙ）＝４９．８ｍｇ／ｄｌ、沈殿法での平均値（ｘ）＝４８．１ｍｇ／ｄｌ、相関係数ｒ＝０．８５０６、回帰式ｙ＝１．００６ｘ＋１．４０６（ｎ＝６２）〕。
【００１２】
【発明の効果】本発明により、煩雑な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各リポ蛋白分画と各種ＣｙＤとを共存させたときの吸光度を示すものである。
【図２】ＨＤＬコレステロール濃度と本発明の方法により測定された吸光度との相関関係を示すものである。
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）に含まれるコレステロール（以下、ＨＤＬコレステロールという）の定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＤＬは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知に有用な指針となることが知られている。従来のＨＤＬコレステロールの定量法は、大きく分けて分画操作とコレステロール定量操作の２段階からなる。分画操作法には、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法などがある。超遠心法を用いる場合には、分離用超遠心器で比重の差によってＨＤＬを分離し、そのコレステロール量を測定する。しかしながら、定量性、簡便性、経済性などの面で欠点がある。免疫化学的方法には、免疫電気泳動法、一元免疫拡散法（ＳＲＩＤ法）、オクタロニー法などがあるが、これらの方法を用いる場合にはアポ蛋白を認識しており、正確にはリポ蛋白を認識していないという問題がある。電気泳動法を用いる場合には、セルロースアセテート膜やアガロースゲルなどを支持体として分離し、酵素法によりコレステロールを定量する。この方法は、簡便性、経済性などの面で問題がある。沈殿法を用いる場合には、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）およびカイロミクロン（ＣＭ）の表面に存在するアポ蛋白Ｂにポリエチレングリコール、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などのポリアニオンと２価の陽イオンを結合させ、不溶性沈殿物を形成させ、これを遠心分離操作によって除去し、上清中のＨＤＬコレステロールを定量する（臨床検査法提要、第２９版、金井泉著、金原出版、４７１頁、１９８３年）。この方法は最も簡便であるが、遠心分離器による遠心分離操作を行うため、多数検体処理、迅速測定および臨床検査の分野で多く使用されている自動分析装置には不向きである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、煩雑な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、リポ蛋白含有試料とジメチル−β−シクロデキストリン（ＤＭ−β−ＣｙＤ）とを水性液中適当な条件下で混合することによりＤＭ−β−ＣｙＤと試料中のＨＤＬとが特異的に作用して濁りを形成し、このときの該混合液の濁度がＨＤＬコレステロール濃度とよい相関性を示すことを見い出し、本発明に至った。
【０００５】本発明は、ＨＤＬとＤＭ−β−ＣｙＤとを水性液中で混合して濁りを生成させ、該混合液の濁度を測定することを特徴とするＨＤＬコレステロールの定量法に関する。次に、本発明の定量法について説明する。本発明を実施するに際しては、まず、ＤＭ−β−ＣｙＤを適当な緩衝液、例えば５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解して試薬を調製する。ＤＭ−β−ＣｙＤの濃度は、試料と共存した場合に例えば１０ｍＭ未満、好ましくは５ｍＭの濃度になるように調整する。次いで、試料そのものもしくは必要に応じて水あるいは生理食塩水で希釈した試料を上記試薬で、１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で１〜３０分間処理する。その後、混合液の濁度を３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜４００ｎｍ、例えば３４０ｎｍでの吸光度により測定し、吸光度の値からＨＤＬコレステロール量を算出する。
【０００６】試料として血清から超遠心により分画されたＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬおよびＣＭの各フラクションを使用し、上記定量法に従って吸光度を測定した。５ｍＭの各種糖化合物含有試薬を調製して測定した結果を図１に示す。（図中、ＣｙＤはシクロデキストリンを表し、ＨＥはヒドロキシエチルを表し、ＨＰはヒドロキシプロピルを表し、ＤＭはジメチルを表し、ＴＭはトリメチルを表し、ＣＭはカルボキシメチルを表し、Ｇｌｕはグルコシルを表し、Ｍａｌはマルトシルを表し、ＰＭはパーシャリーメチルを表す）
図１に示すように、糖化合物としてＤＭ−β−ＣｙＤを用いた場合にＨＤＬの存在下でのみ濁りが形成されることが確認された。
【０００７】次に、実施例によって本発明の態様を説明する。
【０００８】
【実施例】
実施例１ＤＭ−β−ＣｙＤ（５ｍＭ）および５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）からなる試薬を調製した。血清から超遠心で分画し各種濃度に希釈したＨＤＬのサンプル５０μｌ（ＨＤＬコレステロール濃度は酵素法により別途測定）を上記試薬３ｍｌで３７℃で１５分間処理し、得られた溶液の吸光度を測定した。
【０００９】その結果を第２図に示す。第２図は、ＨＤＬコレステロール濃度と吸光度との相関関係を示すもので、ＨＤＬコレステロール濃度は吸光度とよい相関を示した。
【００１０】実施例２血清から超遠心で分画し各種濃度に希釈したＨＤＬのサンプルの代わりに血清サンプルを用いる以外は実施例１と同様の操作を行って吸光度を測定し、第１図を基準に血清サンプル中のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。対照法として、リンタングステン酸−デキストラン硫酸−Ｍｇ沈殿法〔デタミナーＨＤＬ（協和メデックス社製）で沈殿〕（臨床化学、初版、荻三男著、医典社、１１０頁、１９８７年）を用いて、血清サンプル中のＨＤＬコレステロール濃度を求めた。
【００１１】その結果、本発明の方法による結果は沈殿法による結果と良好な相関を示した〔本発明の方法での平均値（ｙ）＝４９．８ｍｇ／ｄｌ、沈殿法での平均値（ｘ）＝４８．１ｍｇ／ｄｌ、相関係数ｒ＝０．８５０６、回帰式ｙ＝１．００６ｘ＋１．４０６（ｎ＝６２）〕。
【００１２】
【発明の効果】本発明により、煩雑な分画分離操作の不要な簡便なＨＤＬコレステロールの定量法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】各リポ蛋白分画と各種ＣｙＤとを共存させたときの吸光度を示すものである。
【図２】ＨＤＬコレステロール濃度と本発明の方法により測定された吸光度との相関関係を示すものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 高密度リポ蛋白とジメチル−β−シクロデキストリンとを水性液中で混合して濁りを生成させ、該混合液の濁度を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法。
【請求項１】 高密度リポ蛋白とジメチル−β−シクロデキストリンとを水性液中で混合して濁りを生成させ、該混合液の濁度を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開平８−６８７９５
【公開日】平成８年（１９９６）３月１２日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平６−２０６８２９
【出願日】平成６年（１９９４）８月３１日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成６年３月５日、日本薬学会第１１４年会組織委員会発行の「日本薬学会第１１４年会講演要旨集４」に発表
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
【公開日】平成８年（１９９６）３月１２日
【国際特許分類】
【出願日】平成６年（１９９４）８月３１日
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成６年３月５日、日本薬学会第１１４年会組織委員会発行の「日本薬学会第１１４年会講演要旨集４」に発表
【出願人】（０００１６２４７８）協和メデックス株式会社 (42)
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