説明

高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬

検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法およびそれに用いる試薬。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、検体中の高密度リポ蛋白(以下、HDLと略記する)中のコレステロールの測定方法、測定用試薬、測定用キット、新規胆汁酸誘導体および新規胆汁酸誘導体の製造方法に関する。
【背景技術】
生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白(HDL)、低密度リポ蛋白(以下、LDLと略記する)、超低密度リポ蛋白(以下、VLDLと略記する)、カイロミクロン(以下、CMと略記する)に分類されており、それぞれ主にアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっており、脂質組成もさまざまである。その中で、HDLは、動脈壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るために細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子であり、その血中レベルは動脈硬化性疾患の発症予知の有用な指針となることが知られている。
従来のHDL中のコレステロール(以下、HDLコレステロールと略記する)の測定法は、超遠心法、免疫化学的方法、電気泳動法、沈殿法等による分画操作とコレステロール定量操作の2段階からなる。しかしながら、分画操作は、操作が煩雑であり、長時間を要するものであり、また、安全性の点でも問題があった。従って、これらの分離操作を伴う測定法は極めて効率が悪く、実用化に適さない方法であった。
近年、上記の問題を解決するための種々の測定法が開発されている。例えば、HDL以外のリポ蛋白を凝集させる測定法として、デキストラン硫酸等のHDL以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、2価の金属塩、および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法(特開平8−131197号公報)、ポリアニオン等のHDL以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法(特開平8−201393号公報)、デキストラン硫酸等のポリアニオン、2価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法(特開平9−285298号公報)等が知られている。また、血清または血漿を、リポ蛋白分画剤(デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の2価陽イオンとの組み合わせ)を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体および液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤(アルキルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体)の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のHDLコレステロールを測定する方法(特開平8−116996号公報)も知られている。
しかしながら、これらのHDL以外のリポ蛋白を凝集させるHDLコレステロール測定法においては、従来の基準法と良好な相関性があるものの、反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷という問題がある。
また、HDL以外のリポ蛋白を凝集させない測定法として、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりHDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、HDLコレステロールを酵素的に測定する方法(特開平9−299号公報)、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、コール酸等の胆汁酸とを、アルブミンが存在する条件下で接触させ、HDLコレステロールと当該酵素との反応により消費される化合物または生成される化合物を測定することを特徴とするHDLコレステロールの測定方法(国際公開第97/40376号パンフレット)等が知られている。
しかしながら、これらのHDL以外のリポ蛋白を凝集させないHDLコレステロール測定法においては、HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールの不完全な消去や、HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールに対する非特異反応に起因する測定値の不正確性が問題となる場合がある。
胆汁酸類を用いるHDLコレステロール測定法としては、前記の特開平8−116996号公報や国際公開第97/40376号パンフレットに記載された方法の他に、例えば血清または血漿を、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、および、胆汁酸塩もしくは胆汁酸誘導体もしくはジオクチルスルホサクシネートを含有する緩衝液中で当該酵素と反応させ、VLDLおよびLDL中のコレステロールをHDLコレステロールに先駆けて反応させ、生成した過酸化水素を測定した後、非イオン系のポリオキシエチレンオキシド基含有界面活性剤を反応液に添加し、HDLコレステロールと当該酵素とを反応させ、HDLコレステロールを特異的に分別定量する方法(特開昭62−69999号公報)、血清を、特定のpHおよび特定の温度の下、膵臓由来のコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、胆汁酸群の界面活性剤、および、非イオン系界面活性剤を含有する緩衝液中で当該酵素と反応させることによりHDLコレステロールを測定する方法(特開昭63−126498号公報)、生体試料を、アルブミンおよび胆汁酸もしくはその塩の存在下に、膵臓由来のコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼに接触させ、HDLコレステロールを当該酵素と反応させた後、処理された生体試料を微生物由来のコレステロールエステラーゼと接触させ、LDLコレステロールを当該酵素(微生物由来のコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼ)と反応させることにより、HDLコレステロールおよびLDLコレステロールを測定する方法(特開平11−9300号公報)、リポ蛋白を含有する試料を、胆汁酸誘導体および/または両性界面活性剤の存在下に酵素(コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ)と反応させ、HDLコレステロールを選択的に反応させた後、ポリオキシエチレン鎖を有する非イオン性界面活性剤を反応液に添加し、HDLコレステロールを選択的に反応させることにより、HDLコレステロールおよび/またはLDLコレステロールを測定する方法(特開2000−325097号公報)等が知られている。しかしながら、これらの測定法は、測定に長時間を要する場合があり、また、必ずしも、HDLコレステロールに特異的な測定法ではなかった。
オキシエチレン基をエステル部分に有するコール酸のエステルは公知であるが(特開平5−221941号公報)、当該エステルを用いたHDLコレステロールの測定法は知られていない。
エステル化合物の合成方法としては、一般的に、カルボン酸とアルコールとの縮合反応により合成する方法が簡便であり、特に酸触媒を用いる共沸エステル化法がよく利用されている。しかしながら、嵩高い置換基や水溶性基もつ化合物では収率が低いことがある(シー・ケー・インゴールド(C.K.Ingold)著,「ストラクチャー・アンド・メカニズム・イン・オーガニック・ケミストリー(Structure and Mechanism in Organic Chemistry)」(英国),第2版,ベル(Bell)1969年,15章,p.1128−1178)。例えば、前記の特開平5−221941号公報には、酸触媒としてp−トルエンスルホン酸を用いたコール酸とジエチレングリコールモノメチルエーテルとの反応によるコール酸エステルの合成方法が記載されているが、72時間という長時間の加熱還流を行っても、コール酸エステルの収率は23%と極めて低く、また、後処理操作も複雑で煩雑である。
また、分子内に水酸基をもつようなカルボン酸では自己エステル化も進行するため、分子内の水酸基を保護してアルコールとのエステル化を行う方法も用いられている。例えば、ウルソデコール酸と2−ヒドロキシエチルオキシグルコシドとを用いたウルソデコール酸エステルの合成方法が知られているが(特開平11−199598号公報)、本方法は、1)ウルソデコール酸の水酸基をTBDMS(t−ブチルジメチルシリル)基で保護する工程、2)エステル化工程、および、3)脱保護(TBDMS基の除去)工程を含有する方法であるため簡便な合成法とは言い難い。
【発明の開示】
本発明の目的は、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ正確に測定するための方法、ならびに、その方法に使用する測定試薬および測定キットを提供することにある。
本発明は、下記[1]〜[42]に関する。
[1] 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法。
[2] 水性媒体が、さらに、アルブミンを含有する[1]記載の方法。
[3] コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[1]または[2]記載の方法。
[4] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[3]記載の方法。
[5] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[3]記載の方法。
[6] 胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7] 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である[6]記載の方法。
[8] 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[9] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物である[8]記載の方法。
[10] 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[1]〜[5]のいずれかに記載の方法。
[11] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す)で表される化合物、または、一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物である[10]記載の方法。
[12] コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[13] コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
[14] さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する[13]記載の試薬。
[15] さらに、アルブミンを含有する[12]〜[14]のいずれかに記載の試薬。
[16] コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[12]〜[15]のいずれかに記載の試薬。
[17] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[16]記載の試薬。
[18] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[16]記載の試薬。
[19] 胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[12]〜[18]のいずれかに記載の試薬。
[20] 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である[19]記載の試薬。
[21] 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[12]〜[18]のいずれかに記載の試薬。
[22] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物である[21]記載の試薬。
[23] 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[12]〜[18]のいずれかに記載の試薬。
[24] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す)で表される化合物、または、一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物である[23]記載の試薬。
[25] コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[26] 胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[27] 過酸化水素測定用試薬を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[28] コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[29] 胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
[30] さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する[28]または[29]記載のキット。
[31] さらに、アルブミンを、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する[25]〜[30]のいずれかに記載のキット。
[32] コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[25]〜[31]のいずれかに記載のキット。
[33] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[32]記載のキット。
[34] 化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である[32]記載のキット。
[35] 胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[25]〜[34]のいずれかに記載のキット。
[36] 陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である[35]記載のキット。
[37] 胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[25]〜[34]のいずれかに記載のキット。
[38] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物である[37]記載のキット。
[39] 胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である[25]〜[34]のいずれかに記載のキット。
[40] 非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す)で表される化合物、または、一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物である[39]記載のキット。
[41] 一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物。
[42] 一般式(V)

[式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表す]で表される化合物と、一般式(VI)

(式中、W’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、または、置換もしくは非置換のアリール基を表し、nは、3〜400の整数を表す)で表される化合物、または、一般式(VII)

(式中、Tは、置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、nは、3〜400の整数を表す)で表される化合物とを、縮合剤の存在下に反応させることを特徴とする一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物の製造方法。
本発明のHDLコレステロールの測定方法は、HDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去することなく、HDLコレステロールを測定する方法である。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等があげられるが、血漿および血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Amano”2(CHE2;天野エンザイム社製)、コレステロールエステラーゼ“Amano”3(CHE3;天野エンザイム社製)、リポプロテインリパーゼ(LPL311;東洋紡製社製)、リポプロテインリパーゼ“Amano”6(LPL6;天野エンザイム社製)、コレステロールエステラーゼ[COE313(化学的に修飾されたコレステロールエステラーゼ);東洋紡績社製]等があげられる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾において当該酵素を修飾する基(化学修飾基)としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等があげられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等があげられる。
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬(化学修飾剤)としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持つ化合物等があげられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基(N−ヒドロキシサクシンイミド基等)、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、1,3−プロパンスルトン、1,4−ブタンスルトン等があげられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造としては、例えばアミノ基等があげられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル(α−ヨードエステル等)等があげられる。
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とN−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトVFM−4101、サンブライトMEAC−50HS、サンブライトMEC−50HS(いずれも日本油脂社製)、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトAKMシリーズ(例えば、サンブライトAKM−1510等)、サンブライトADMシリーズ、サンブライトACMシリーズ(いずれも日本油脂社製)、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するEPOX−3400、M−EPOX−5000(いずれもSheawater Polymers社製)、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−N,N,N’,N’,N’’−ペンタ無水酢酸(DTPA anhydride;同仁化学社製)等があげられる。
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をpH8.0以上の緩衝液(例えばHEPES緩衝液)に溶解し、0〜55℃で0.01〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、5分間〜5時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.01〜200U/mLの濃度であることが好ましく、0.02〜100U/mLであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Amano”1(CHOD1;天野エンザイム社製)、コレステロールオキシダーゼ(CO−PE;キッコーマン社製)、コレステロールオキシダーゼ(COO321;東洋紡績社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.01〜200U/mLの濃度であることが好ましく、0.02〜100U/mLの濃度であることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano”5(CHDH5;天野エンザイム社製)等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、2種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で0.01〜200U/mLの濃度であることが好ましく、0.02〜100U/mLの濃度であることがより好ましい。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いた測定法においては、酸化型補酵素が使用される。酸化型補酵素としては、例えばNAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADP等があげられる。
本発明において用いられるアルブミンとしては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等があげられるが、ウシ血清アルブミン(BSA)が好ましくあげられる。また、遺伝子工学的な手法により製造されるアルブミンも使用することができる。本発明においては、由来の異なる2種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のHDLコレステロールの測定におけるアルブミンの濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が0.001〜10%であることが好ましく、0.01〜1%がより好ましい。
本発明における胆汁酸誘導体としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする胆汁酸誘導体であれば特に制限はないが、例えば陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体等があげられる。
本発明の胆汁酸誘導体としては、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素およびコレステロールエステル加水分解酵素等のコレステロール測定酵素を用いたHDLコレステロールの測定の正確性もしくは再現性の点、またはコレステロール測定酵素の保存安定性の点等で特に好ましい。
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩等があげられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等があげられる。陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が0.001〜30%であることが好ましく、0.01〜3%がより好ましい。
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物[以下、化合物(I)という]等があげられる。以下、Rが水素原子である化合物(I)をCHAPSと、Rが水酸基である化合物(I)をCHAPSOとよぶ。両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が0.001〜30%であることが好ましく、0.01〜3%がより好ましい。
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル、または、置換もしくは非置換のアルカノイルを表す)で表される化合物[以下、化合物(II)という]等があげられる。化合物(II)におけるアルキル基、アルカノイル基に共通のアルキルとしては、直鎖または分枝状の炭素数1〜10の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等があげられる。化合物(II)中の置換アルキル基および置換アルカノイル基における置換基としては、例えば水酸基、ハロゲン原子等があげられる。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。化合物(II)のうち、RおよびRが共に、

(以下、置換基Aという)である化合物が好ましい。以下、X、RおよびRがそれぞれ、水素原子、置換基Aおよび置換基Aである化合物をdeoxy−BIGCHAP、水酸基、置換基Aおよび置換基Aである化合物をBIGCHAPという。
また、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基[以下、置換基(IV)という]を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物[以下、化合物(III)という]もあげることができる。
化合物(III)は、例えば一般式(V)

[式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表す]で表される化合物[以下、化合物(V)という]と、一般式(VI)

(式中、W’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、または、置換もしくは非置換のアリール基を表し、nは、3〜400の整数を表す)で表される化合物[以下、化合物(VI)という]、または、一般式(VII)

(式中、Tは、置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、nは、3〜400の整数を表す)で表される化合物[以下、化合物(VII)という]とを、縮合剤の存在下、溶媒中で反応させることにより製造(合成)することができる。本反応においては、必要に応じて塩基を共存させることもできる。
X,YおよびZは水素原子、水酸基またはオキソ基を表すが、X,Y,Zのうち少なくとも1つは水酸基であることが好ましい。X’,Y’およびZ’は水素原子、水酸基またはオキソ基を表すが、X’,Y’,Z’のうち少なくとも1つは水酸基であることが好ましい。
化合物(III)および化合物(VI)におけるアルキル基、アルカノイル基に共通のアルキル基としては、直鎖または分岐状の炭素数1〜18の、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基、オクチル基、イソオクチル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基、イソデシル基、ウンデシル基、イソウンデシル基、ドデシル基、イソドデシル基、トリデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、イソテトラデシル基、ペンタデシル基、イソペンタデシル基、ヘキサデカシル基、イソヘキサデカシル基、ヘプタデシル基、イソヘプタデシル基、オクタデカシル基、イソオクタデカシル基等があげられ、メチル基、エチル基、プロピル基、ノニル基、ドデシル基等が好ましい。
化合物(III)および化合物(VI)におけるアルケニル基、アルケノイル基に共通のアルケニル基としては、直鎖または分岐状の炭素数2〜8の、例えばビニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、アリル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等があげられる。
化合物(III)および化合物(VI)におけるアルキニル基、アルキノイル基に共通のアルキニル基としては、直鎖または分岐状の炭素数2〜8の、例えばエチニル基、プロピニル基、プロパルギル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基等があげられる。
化合物(III)および化合物(VI)におけるシクロアルキル基としては、炭素数3〜8の、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等があげられる。
化合物(III)および化合物(VI)におけるシクロアルケニル基としては、炭素数4〜8の、例えばシクロプロペニル基、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘプテニル基、シクロオクテニル基等があげられる。
化合物(III)および化合物(VI)におけるアリール基としては、炭素数6〜15の、例えばフェニル基、ナフチル基、アントリル基、フェナントリル基、ビフェニル基等があげられる。化合物(III)における置換アリール基の置換基としては、例えばアルキル基等があげられる。該アルキル基としては、例えば前述のアルキル基が挙げられる。
化合物(III)および化合物(VII)における置換アミノアルキル基としては、例えばN−一置換アミノアルキル基、N,N−二置換アミノアルキル基等が挙げられる。N,N−二置換アミノアルキル基における窒素原子上の2つの置換基は同じでも異なっていてもよい。N−一置換アミノアルキル基およびN,N−二置換アミノアルキル基における窒素原子上の置換基としては、例えば前述のアルキル基等が挙げられる。N−一置換アミノアルキル基としては、例えば2−(N−メチルアミノ)エチル基、2−(N−エチルアミノ)エチル基、2−(N−プロピルアミノ)エチル基、2−(N−ブチルアミノ)エチル基、3−(N−メチルアミノ)プロピル基、3−(N−エチルアミノ)プロピル基、3−(N−プロピルアミノ)プロピル基、3−(N−ブチルアミノ)プロピル基、4−(N−メチルアミノ)ブチル基、4−(N−エチルアミノ)ブチル基、4−(N−プロピルアミノ)ブチル基、4−(N−ブチルアミノ)ブチル基等を具体的に挙げることができる。N,N−二置換アミノアルキル基としては、例えば2−(N,N−ジメチルアミノ)エチル基、3−(N,N−ジメチルアミノ)プロピル基、4−(N,N−ジメチルアミノ)ブチル基等を具体的に挙げることができる。化合物(III)および化合物(VII)における非置換アミノアルキル基としては、2−アミノエチル基、3−アミノプロピル基、4−アミノブチル基等を具体的に挙げることができる。
nは、エステル部分におけるオキシエチレン基の平均重合度を表す。平均重合度は、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする範囲であれば特に制限はないが、3〜400が好ましく、8〜300がより好ましく、15〜200が特に好ましい。
化合物(V)としては、例えばコール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、7−オキソリトコール酸、12−オキソリトコール酸、12−オキソケノデオキシコール酸、7−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸等があげられる。
Wが、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基および置換もしくは非置換のアミノアルキル基からなる群より選ばれる基である化合物(III)[以下、化合物(IIIa)という]を合成する場合には、化合物(VI)または化合物(VII)の化合物(V)に対する当量比は、0.5〜1.5が好ましく、1〜1.2がより好ましい。Wが、一般式(IV)で表される基である化合物(III)[以下、化合物(IIIb)という]を合成する場合には、化合物(V)の化合物(VI)または化合物(VII)に対する当量比は、1.3〜4.1が好ましく、1.7〜2.2がより好ましい。
化合物(III)を合成する際の反応温度としては、10〜40℃が好ましく、20〜35℃がより好ましい。化合物(III)を合成する際の反応溶媒としては、化合物(V)と化合物(VI)との縮合反応を妨げないような溶媒であれば特に制限はないが、例えば有機溶媒があげられる。該有機溶媒としては、例えばトルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、酢酸エチル等の脂肪族エステル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒等があげられる。
化合物(III)を合成する際に使用する縮合剤としては、化合物(V)と化合物(VI)または化合物(VII)との縮合反応を進行させるものであれば特に制限はないが、例えばカルボジイミド類、ピリジニウム塩、(ベンゾ)チアゾリウム塩、(ベンゾ)オキサゾリウム塩、イソシアナート類、カルボニル試薬等があげられるが、カルボジイミド類が好ましい。カルボジイミド類としては、例えば1,3−ジシクロヘキシルカルボジミド、1,3−ジ(tert−ブチル)カルボジミド、1,3−ジイソプロピルカルボジミド、水溶性カルボジイミド等があげられるが、水洗浄除去の簡便さから、特に水溶性カルボジミドが好ましい。水溶性カルボジミドとしては、例えば1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドまたはその塩等があげられる。該塩としては、例えば塩酸塩、沃化メチル塩等があげられる。ピリジニウム塩としては、例えば2−クロロメチルピリジニウムヨード塩、2−ブルモメチルピリジニウムヨード塩等があげられる。(ベンゾ)オキサゾリウム塩としては、例えば2−クロロベンゾオキサゾリウムフッ化ホウ素塩等があげられる。(ベンゾ)チアゾリウム塩としては、例えば2−クロロベンゾチアゾリウムフッ化ホウ素塩等があげられる。イソシアナート類としては、例えばクロロスルホニルイソシアナート等があげられる。カルボニル試薬としては、例えば1,1−カルボニルジイミダゾール等があげられる。
縮合反応における縮合剤の当量数としては、化合物(IIIa)を合成する場合には、化合物(V)に対して1.0〜5.0当量が好ましく、1.1〜2.5当量がより好ましく、化合物(IIIb)を合成する場合には、化合物(VI)または化合物(VII)に対して1.0〜5.0当量が好ましく、1.1〜2.5当量がより好ましい。
化合物(III)を合成する際に必要に応じて使用する塩基としては、例えばピリジン類縁体があげられる。該ピリジン類縁体としては、例えばピリジン、2−ピコリン、3−ピコリン、4−ピコリン、2−エチルピリジン、3−エチルピリジン、4−エチルピリジン、2−プロピルピリジン、3−プロピルピリジン、4−プロピルピリジン、2,6−ルチジン、2,3−ルチジン、2,4−ルチジシ、2,5−ルチジン、3,4−ルチジン、3,5−ルチジン、2,4,6−コリジン、2,3,5−コリジン、2−ジメチルアミノピリジン、4−ジメチルアミノピリジン、4−ピロリジノピリジン、4−ピペリジノピリジン等があげられ、特に4−ジメチルアミノピリジン、4−ピロリジノピリジン、4−ピペリジノピリジンが好ましい。ピリジン類縁体の当量としては、化合物(V)に対して0.01〜2.5当量が好ましく、0.7〜1.2当量がより好ましい。
化合物(V)と化合物(VI)または化合物(VII)との縮合反応の後処理としては、例えば水または水と有機溶媒との混合溶媒を反応溶液に加え、生成した反応混合物から化合物(III)[化合物(IIIa)または化合物(IIIb)]を有機溶媒で抽出し、抽出した溶液に含まれる水を乾燥剤で除去した後、該乾燥剤をろ過し、得られたろ液中の溶媒を常圧下または減圧下で留去する、という一連の操作があげられる。また、化合物(III)を含有する抽出溶液を酸で洗浄し、該抽出溶液中の塩基性物質(縮合剤、縮合剤由来物質、塩基)を除去してもよい。酸で洗浄された抽出溶液は、さらに水または食塩水で洗浄されることが好ましい。反応溶液中に加えられる有機溶媒は、反応に使用される有機溶媒と同じでも異なってもよいが、同じであることが好ましい。また、反応溶液中に加えられる有機溶媒と抽出に使用される有機溶媒とは同じでも異なってもよい。反応溶液中に加えられる有機溶媒や抽出に使用される有機溶媒としては、例えば前述の有機溶媒があげられ、中でもジクロロメタン、酢酸エチル等が好ましい。
化合物(V)と化合物(VI)または化合物(VII)との縮合反応の後処理により得られる化合物(III)を含有する反応混合物は、そのままでもHDLコレステロールの測定に使用できるが、適宜、分離・精製操作により精製されたものも使用することもできる。該分離・精製方法としては、例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、HPLC、蒸留、分留、再結晶等があげられる。
非イオン性界面活性を有する胆汁酸誘導体の濃度としては、本発明のHDLコレステロールの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が0.001〜30%であることが好ましく、0.01〜3%がより好ましい。
本発明のHDLコレステロール測定法において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。グッドの緩衝剤としては、例えば2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、N−(2−アセトアミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、2−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、3−〔N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕−2−ヒドロキシ−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパンスルホン酸)(POPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、3−〔4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔(H)EPPS〕、N−〔トリス(ヒドロキシメチル)メチル〕グリシン(Tricine)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−3−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸(CHES)、N−シクロヘキシル−3−アミノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、N−シクロヘキシル−3−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等があげられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、0.001〜2.0mol/Lが好ましく、0.005〜1.0mol/Lがより好ましい。
以下に、本発明のHDLコレステロールの測定方法、測定用試薬および測定用キットを具体的に説明する。
(HDLコレステロールの測定方法)
本発明のHDLコレステロールの測定方法としては、例えば以下の態様の方法があげられる。
測定方法1
(1)検体と、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、
(2)生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のHDLコレステロール濃度を算出することにより、検体中のHDLコレステロールを測定することができる。
測定方法2
(1)検体と、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、
(2)生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のHDLコレステロール濃度を算出することにより、検体中のHDLコレステロールを測定することができる。
測定方法3
(1)検体と、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、
(2)生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検最線とから、検体中のHDLコレステロール濃度を算出することにより、検体中のHDLコレステロールを測定することができる。
測定方法4
(1)検体と、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、
(2)生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、検体中のHDLコレステロール濃度を算出することにより、検体中のHDLコレステロールを測定することができる。
本測定法においては、(1)の反応は、例えば10〜50℃で、好ましくは20〜40℃で、1〜60分間、好ましくは2〜30分間反応を行う。
生成した過酸化水素の量は、例えば過酸化水素測定用試薬により測定することができる。過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、発光等があげられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体があげられる。検出可能な物質が発光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等があげられる。
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を定量することにより、過酸化水素を定量することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応してフォトンを生じ、生じたフォトンを定量することにより、過酸化水素を定量することができる。
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等があげられる。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、10−N−カルボキシメチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(CCAP)、10−N−メチルカルバモイル−3,7−ビス(ジメチルアミノ)−10H−フェノチアジン(MCDP)、N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム塩(DA−64)、4,4’−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミン、ビス〔3−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等があげられる。
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、2つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば4−アミノアンチピリン(4−AA)、3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン(MAOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン(TOPS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N,N−ジメチル−3−メチルアニリン、N,N−ジ(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、N−エチル−N−(3−スルホプロピル)−3,5−ジメチルアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)アニリン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシニルエチレンジアミン(EMSE)、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−4−フルオロ−3,5−ジメトキシアニリン(F−DAOS)等があげられる。フェノール類としては、フェノール、4−クロロフェノール、3−メチルフェノール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等があげられる。
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、1〜100kU/Lが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、0.01〜10g/Lが好ましい。
還元型補酵素の測定方法としては、例えば生成した還元型補酵素の吸光度を測定する方法、還元型補酵素測定用試薬を用いる方法等があげられる。還元型補酵素の吸光度を測定する方法における吸光度としては、300〜500nmが好ましく、330〜400nmがより好ましく、340nm付近が特に好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等があげられる。検出可能な物質が色素の場合の還元型補酵素測定用試薬としては、例えばジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬があげられる。電子キャリアーとしては、例えば1−メトキシ−5−メチルフェナジウムメチルサルフェート等があげられる。還元型補酵素測定用試薬として、ジアホラーゼ、電子キャリアーおよび還元発色型色原体を含有する試薬を用いる場合には、還元発色型色原体が変換されて生成した色素を定量することにより、還元型補酵素を定量することができる。
還元発色型色原体としては、例えば3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド(MTT)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウムモノナトリウム塩(WST−1)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウムモノナトリウム塩(WST−3)等があげられる。
(HDLコレステロニル測定用試薬)
本発明のHDLコレステロール測定用試薬としては、例えば以下の態様の試薬があげられる。
試薬1
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬2
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬3
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬4
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬5
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬6
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬7
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬8
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬9
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬10
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび酸化型補酵素を含有する試薬。
試薬11
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬12
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
本発明のHDLコレステロール測定用試薬においては、前述の本発明のHDLコレステロールの測定方法においてあげられたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、過酸化水素測定用試薬、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
(HDLコレステロール測定用キット)
本発明のHDLコレステロール測定用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されてもよい。キットの形態としては、特に制限はなく、2試薬系、3試薬系等のいずれであってもよいが、2試薬系が好ましい。
第一試薬と第二試薬とからなる2試薬系のHDLコレステロール測定用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素と、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素とは、第一試薬と第二試薬に別々に含有されても、第二試薬に一緒に含有されてもよいが、第一試薬と第二試薬に別々に含有される場合には、コレステロールエステル加水分解酵素が第一試薬に、コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素が第二試薬に含有される態様が好ましい。胆汁酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。コレステロール脱水素酵素を用いた測定法において使用される酸化型補酵素は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。過酸化水素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよいが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は別々の試薬に含有される態様が好ましい。還元型補酵素測定用試薬は、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。また、アルブミンは、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有されてもよい。
具体的には、例えば以下の態様のキットがあげられる。
キット1
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット2
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット3
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット4
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体、アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール酸化酵素および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット5
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット6
第一試薬
アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット7
第一試薬
過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット8
第一試薬
アルブミンおよび過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
キット9
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット10
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット11
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット12
第一試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット13
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット14
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット15
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素および胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット16
第一試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット17
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット18
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット19
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット20
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット21
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット22
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素および酸化型補酵素を含有する試薬。
キット23
第一試薬
胆汁酸誘導体を含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
キット24
第一試薬
胆汁酸誘導体およびアルブミンを含有する試薬。
第二試薬
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
本発明のHDLコレステロール測定用キットにおいては、前述の本発明のHDLコレステロールの測定方法においてあげられたコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体、アルブミン、過酸化水素測定用試薬、酸化型補酵素、還元型補酵素測定用試薬を用いることができる。
本発明のHDLコレステロール測定用試薬および測定用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等があげられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム等があげられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等があげられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類といったものがあげられる。本発明のHDLコレステロール測定用試薬および測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のHDLコレステロールを測定する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のHDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、コレステロール脱水素酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.01〜800U/mLとなる含量が好ましく、0.02〜400U/mLとなる含量がより好ましい。本発明のHDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおける胆汁酸誘導体の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜30%となる含量が好ましく、0.01〜10%となる含量がより好ましい。本発明のHDLコレステロール測定用試薬および測定用キットにおけるアルブミンの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が0.001〜10%となる含量が好ましく、0.01〜5%となる含量がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記の試薬および酵素を使用した。
HEPES(BDH Laboratory社製)、EMSE(ダイトーケミックス社製)、ウシ血清アルブミン(BSA;オリエンタル社製)、4−アミノアンチピリン(埼京化成社製)、ペルオキシダーゼ(東洋紡績社製)、LPL311(コレステロールエステル加水分解酵素;東洋紡績社製)、LPL6(コレステロールエステル加水分解酵素;天野エンザイム社製)、CHE2(コレステロールエステル加水分解酵素;天野エンザイム社製)、COE313(化学修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素;東洋紡績社製)、COO321(コレステロールオキシダーゼ;東洋紡績社製)、コール酸ナトリウム(ACROS社製)、タウロコール酸ナトリウム(東京化成社製)、BIGCHAP(同仁化学社製)、CHAPS(同仁化学社製)、デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万;ファルマシア社製)。
また、本実施例において、胆汁酸誘導体の同定に際して、下記の分析機器を用いて各種データを取得した。
核磁気共鳴スペクトル(H−NMR,13C−NMR):JEOL GSX−400(日本電子社製)
H−NMRスペクトル測定においては、テトラメチルシランを内部標準として用い、テトラメチルシランを基準とした化学シフト(δ)を表す。13C−NMRスペクトル測定においては、CDCl由来の3本のピークの中心のピークを77.0ppmとした時の各ピークの化学シフト(δ)を表す。
赤外吸収スペクトル(IR):Nicolet NEXUS470(ニコレー社製)
ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC):
システム:TOSOH HLC−8120GPC(東ソー社製)
GPCカラム:TSKgel Super H−RC(低分子分析用)(東ソー社製)2本を直列接続した。
カラム保持温度:40℃
展開溶媒:テトラヒドロフラン
流速:0.5mL/分
検出器:RI(屈折率)
検量線作成用標準物質:ポリエチレングリコール
【発明を実施するための最良の形態】
参考例1 化学修飾LPL311(化学的に修飾されたLPL311)の調製
HEPES緩衝液(pH8.5,0.15mol/L)に、LPL311を33g/Lとなるように加え5℃に冷却した後、サンブライトVFM−4101またはサンブライトAKM−1510またはサンブライトMEAC−50HS(いずれも日本油脂社製)を330g/Lとなるように加え、さらに3時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾LPL311として使用した。
参考例2 化学修飾CHE2(化学的に修飾されたCHE2)の調製
HEPES緩衝液(pH8.5,0.15mol/L)に、CHE2を50g/Lとなるように加え5℃に冷却した後、サンブライトVFM−4101(日本油脂社製)を200g/Lとなるように加え、さらに3時間反応させた。得られた修飾酵素溶液を精製分離せずそのまま化学修飾CHE2として使用した。
実施例1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例2 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例3 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
タウロコール酸ナトリウム 7.0g/L
実施例4 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
タウロコール酸ナトリウム 7.0g/L
実施例5 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
実施例6 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
実施例7 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
CHAPS 6.0/L
実施例8 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
比較例1 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
比較例2 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
実施例9 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0/L
実施例10 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例11 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05U/L
COO321 3.0kU/L
タウロコール酸ナトリウム 7.0g/L
実施例12 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
タウロコール酸ナトリウム 7.0g/L
実施例13 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
実施例14 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
実施例15 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
実施例16 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
CHAPS 6.0g/L
比較例3 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
比較例4 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
LPL6 0.05kU/L
COO321 3.0kU/L
実施例17 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾CHE2(VFM−4101で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例18 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(MEAC−50HSで修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例19 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(AKM−1510で修飾したもの)
0.2kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例20 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
COE313 1.0kU/L
COO321 3.0kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
実施例21 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットを用いて、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
(1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水(HDLコレステロール濃度:0.0mg/dL)および血清(HDLコレステロール濃度:60.0mg/dL)を、キットとして実施例1のキットを用いて、日立7170型自動分析装置により、HDLコレステロール濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された2つの吸光度(E1およびE2)を基に、E2からE1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液(3μL)と第一試薬(0.24mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定し、次いで、この反応液に第二試薬(0.08mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定した。
(2)ヒト血清検体と実施例1のキットとの反応による当該検体における「吸光度」の算出
(1)の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は、(1)の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体における「吸光度」を算出した。
(3)ヒト血清検体中のHDLコレステロール濃度の測定
(2)で算出した「吸光度」と、(1)で作成した検量線とから、各検体中のHDLコレステロール濃度を測定した。
実施例22 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例2のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例23 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例3のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例24 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例4のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例25 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例5のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例26 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例6のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例27 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例7のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例28 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例8のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例5 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例1のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例6 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例2のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例29 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例9のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例30 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例10のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例31 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例11のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例32 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例12のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例33 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例13のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例34 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例14のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例35 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例15のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例36 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例16のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例7 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例3のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例8 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例4のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例37 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例17のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例38 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例18のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例39 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例19のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例40 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例20のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清30検体中のHDLコレステロールを測定した。
一方、実施例21〜40および比較例5〜8の測定において用いたヒト血清30検体を用いて、クリニカルケミストリー第45巻、10号(1999年)に記載されたDCM法(Designated Comparison Method)により当該検体中のHDLコレステロールを測定し、各測定法と比較した。
実施例21〜40および比較例5〜8それぞれの測定法と、DCM法による測定法との相関係数を表1に示す。

実施例21〜28の結果から明らかなように、コレステロールエステル加水分解酵素として化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた場合には、アルブミンの有無にかかわらず、コール酸、タウロコール酸、BIGCHAP、CHAPSのいずれの胆汁酸誘導体の存在下でも、DCM法による測定との間に良い相関が認められたが、比較例5および6に示されているように、胆汁酸誘導体の非存在下では、アルブミンの有無にかかわらず、DCM法による測定との間に良い相関が認められなかった。
一方、実施例29と実施例30、実施例31と実施例32、実施例33と実施例34、実施例35と実施例36との比較から、コレステロールエステル加水分解酵素として無修飾の酵素を用いた場合には、胆汁酸誘導体としてコール酸またはタウロコール酸を存在させた条件下では、アルブミンを添加した方がDCM法による測定との間の相関が良好であったが、胆汁酸誘導体としてBIGCHAPまたはCHAPSを存在させた条件下では、アルブミンの有無にかかわらず、DCM法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。
また、実施例21と実施例37との比較より、化学修飾LPL311以外の化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた測定においても、DCM法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。さらに、実施例21と実施例38との比較、および、実施例21と実施例39との比較より、化学修飾剤として、VFM−4101以外の修飾剤を用いて調製した化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素を用いた場合においても、DCM法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。また、実施例21と実施例40との比較より、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として市販品を用いた場合においても、DCM法による測定との間に良い相関が得られることが判明した。
実施例41 コール酸エステル[化合物(IIIa−1)]の合成
滴下装置、攪拌装置、温度計、冷却管および窒素ガス導入管を備えたフラスコ内に、ポリエチレングリコール メチル エーテル(平均分子量2000、アルドリッチ社製)110g(55mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)6.7g(55mmol)およびジクロロメタン100mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸(ミクニ化学産業社製)20.4g(50mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)10.5g(55mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン200mL、水300mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸200mLにて洗浄し、10%食塩水300mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル500mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−1)115g(収率96%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.69(s,3H),0.90(s,3H),0.98(d,J=6.0Hz,3H),0.98−2.40(m,27H),3.38(s,3H),3.64(bs,179H),3.97(s,2H),4.22(m,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.3,22.5,23.2,26.4,27.5,28.3,30.4,30.8,31.1,34.7,35.2,35.3,39.5,39.6,41.5,41.7,46.4,47.0,59.0,63.4,68.2,69.1,70.5,70.9,71.7,71.9,72.9,174.2.IR(KBr Disk,cm−1):2887,1734,1468,1343,1149,1111,1060,963,842.GPC(平均分子量):Mw2390(Mw/Mn 1.05).
実施例42 コール酸エステル[化合物(IIIa−2)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール メチル エーテル(平均分子量400、日本油脂社製ユニオックスM−400)4.8g(12mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.46g(12mmol)およびジクロロメタン30mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸(ミクニ化学産業社製)4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン20mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル100mLを加え、10%食塩水100mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−2)7.8g(収率95%)を無色油状物質として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,3H),0.89(s,3H),0.98(d,J=6.0Hz,3H),0.98−2.31(m,27H),3.38(s,3H),3.45(bs,1H),3.55(bs,2H),3.65(bs,32H),3.85(bs,1H),3.96(bs,1H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.3,22.5,23.2,26.3,27.5,28.2,30.4,30.9,31.2,34.7,34.8,35.3,39.5,41.5,41.6,46.4,47.0,59.0,63.4,68.4,69.2,70.6,71.8,71.9,73.0,174.3.IR(KBr Disk,cm−1):2931,2868,1734,1451,1375,1299,1251,1110,1111,1045,950,856.GPC(平均分子量):Mw820(Mw/Mn 1.04).
実施例43 コール酸エステル[化合物(IIIa−3)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール メチル エーテル(平均分子量1000、日本油脂社製ユニオックスM−1000)12g(12mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.46g(12mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸(ミクニ化学産業社製)4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン30mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水200mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ロータリーエバポレーターを用いて、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−3)13.2g(収率95%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,3H),0.89(s,3H),0.98(d,J=6.2Hz,3H),0.98−2.45(m,27H),3.38(s,3H),3.46(bs,1H),3.55(bs,2H),3.64(bs,84H),3.84(bs,1H),3.96(bs,1H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.3,22.5,23.2,26.4,27.5,28.3,30.4,30.8,31.2,34.8,35.3,39.5,41.5,41.7,46.4,47.0,59.0,63.4,68.3,69.1,70.5,70.9,71.8,71.9,72.9,174.2.IR(KBr Disk,cm−1):2870,1732,1466,1345,1112,950,844.GPC(平均分子量):Mw1430(Mw/Mn 1.04).
実施例44 コール酸エステル[化合物(IIIa−4)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール メチル エーテル(平均分子量5000、アルドリッチ社製)55g(約11mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.46g(12mmol)およびジクロロメタン100mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸(ミクニ化学産業社製)4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル300mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−4)48.5g(収率90%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.69(s,3H),0.90(s,3H),0.98(d,J=6.2Hz,3H),0.98−2.43(m,27H),3.45(s,3H),3.56(bs,473H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.2,22.5,23.1,26.4,27.4,28.3,30.4,30.8,31.0,34.6,34.7,35.1,35.3,39.5,39.6,41.5,41.6,46.3,46.8,58.9,59.0,61.4,63.3,67.9,69.0,69.6,70.2,70.5,70.7,71.0,71.3,71.5,71.8,72.5,174,0.IR(KBr Disk,cm−1):2888,1734,1468,1343,1281,1112,963,842.GPC(平均分子量):Mw5370(Mw/Mn 1.04).
実施例45 デオキシコール酸エステル[化合物(IIIa−5)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール メチル エーテル(平均分子量2000、アルドリッチ社製)22g(11mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.34g(11mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にデオキシコール酸3.93g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−5)24.2g(収率99%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,3H),0.91(s,3H),0.98(d,J=6.3Hz,3H),0.98−2.45(m,28H),3.38(s,3H),3.47(bs,1H),3.65(bs,178H),3.80(bs,1H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.7,17.3,23.2,26.1,27.1,27.4,28.7,30.4,30.8,31.1,33.6,34.1,35.1,35.3,36.0,37.0,42.0,46.4,47.2,48.2,59.0,61.6,63.4,69.1,70.3,70.5,70.9,71.2,71.9,72.6,72.9,174.1.IR(KBr Disk,cm−1):2889,1735,1468,1343,1281,1112,963,842.GPC(平均分子量):Mw2510(Mw/Mn 1.08).
実施例46 ウルソデオキシコール酸エステル[化合物(IIIa−6)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコールメチル エーテル(平均分子量2000、アルドリッチ社製)22g(11mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.34g(11mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にウルソデオキシコール酸3.93g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−6)23.7g(収率99%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,3H),0.92(d,J=6.3Hz,3H),0.95(s,3H),0.96−2.45(m,28H),3.38(s,3H),3.65(bs,180H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.1,18.4,23.4,26.9,28.5,30.3,30.9,31.1,34.0,35.0,35.2,37.1,37.3,39.1,40.1,42.4,43.7,54.9,55.8,59.0,61.6,63.3,69.1,70.3,70.5,70.8,71.0,71.1,71.9,72.5,174.0.IR(KBr Disk,cm−1):2889,1736,1468,1343,1281,1112,963,842.GPC(平均分子量):Mw2530(Mw/Mn 1.08).
実施例47 ケノデオキシコール酸エステル[化合物(IIIa−7)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール メチル エーテル(平均分子量2000、アルドリッチ社製)22g(11mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.34g(11mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にケノデオキシコール酸3.93g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−7)23.2g(収率97%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.66(s,3H),0.91(s,3H),0.92(d,J=6.3Hz,3H),0.92−2.43(m,28H),3.38(s,3H),3.64(bs,180H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):11.8,18.3,22.8,23.6,28.1,30.6,30.9,31.0,32.8,34.7,35.0,35.3,35.4,39.4,39.6,39.8,41.5,42.6,50.4,55.7,59.0,61.6,63.3,68.2,69.1,69.6,70.3,70.5,70.8,71.4,71.7,71.9,72.6,174.1.IR(KBr Disk,cm−1):2889,1736,1468,1343,1281,1111,963,842.GPC(平均分子量):Mw2560(Mw/Mn 1.09).
実施例48 リトコール酸エステル[化合物(IIIa−8)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコールメチル エーテル(平均分子量2000、アルドリッチ社製)22g(11mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.34g(11mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にリトコール酸3.77g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−8)23.3g(収率98%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.64(s,3H),0.91(d,J=6.3Hz,3H),0.92(s,3H),0.92−2.41(m,29H),3.38(s,3H),3.64(bs,179H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.0,18.3,20.8,23.4,24.2,26.4,27.2,28.1,30.5,30.9,31.1,34.5,35.3,35.4,35.8,36.4,40.1,40.4,42.0,42.7,55.9,56.4,59.0,61.6,63.3,69.1,69.7,70.3,70.5,70.6,70.7,70.8,71.1,71.5,71.9,72.6,174.1.IR(KBr Disk,cm−1):2888,1736,1468,1343,1281,1111,963,842.GPC(平均分子量):Mw2640(Mw/Mn 1.06).
実施例49 両末端コール酸エステル[化合物(IIIb−1)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール(第一工業製薬社製、PEG 2000)10g(5mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)2.68g(22mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)4.6g(24mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIb−1)13.2g(収率94%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,6H),0.90(s,6H),0.99(d,J=6.1Hz,6H),0.92−2.67(m,54H),3.65(bs,180H),3.96(bs,2H),4.22(bs,4H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.3,22.4,23.2,26.3,27.5,28.2,30.3,30.8,31.2,34.7,35.3,39.5,41.5,41.6,46.4,46.5,46.9,61.6,63.4,68.3,69.1,69.7,70.2,70.4,70.5,70.6,70.8,71.3,71.7,72.6,72.9,174.2.IR(KBr Disk,cm−1):2885,1734,1468,1345,1281,1113,964,842GPC(平均分子量):Mw2940(Mw/Mn 1.05).
実施例50 コール酸エステル[化合物(IIIa−9)]の合成
フラスコ内に、ポリエチレングリコール(第一工業製薬社製、PEG 600)12g(20mmol)、ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.5g(12mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−9)7.7g(収率90%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,3H),0.90(s,3H),0.98(d,J=6.1Hz,3H),0.92−2.50(m,27H),3.15(bs,1H),3.44(bs,1H),3.66(bs,54H),3.84(bs,1H),3.96(bs,1H),4.23(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.3,22.5,23.2,26.3,27.5,28.2,30.3,30.8,31.2,34.7,34.8,35.3,35.4,39.5,41.5,46.4,47.0,61.5,63.4,68.3,69.1,69.7,70.2,70.5,71.8,72.6,73.0,174.3.IR(KBr Disk,cm−1):3404,2929,2868,1732,1453,1352,1251,1103,951.GPC(平均分子量):Mw1050(Mw/Mn 1.05).
実施例51 コール酸アミド[化合物(IIIb−2)]の合成
フラスコ内に、ポリオキシエチレンジアミン(平均分子量2000、川研ファインケミカル社製PEOアミン#2000)10g(5mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)2.56g(21mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸(ミクニ化学産業社製)4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)4.6g(24mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。有機層を0.2mol/Lの塩酸50mLにて洗浄し、10%食塩水50mLで2回洗浄した。その後、分離した有機層に酢酸エチル200mLを加え、10%食塩水300mLで3回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去して、ろ液を濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIb−2)12.4g(収率88%)を白色のロウ状固体として得た。

H−NNR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,6H),0.89(s,6H),0.99(d,J=6.1Hz,6H),1.12−2.28(m,48H),2.72(bs,6H),3.31(bs,2H),3.34(bs,4H),3.65(m,176H),3.96(bs,4H),4.22(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.4,22.5,23.3,26.3,27.6,28.1,29.1,30.3,31.7,33.2,34.8,35.4,37.5,39.4,41.5,46.3,46.5,68.3,69.7,70.1,70.2,70.5,70.8,71.7,73.0,174.1.IR(KBr Disk,cm−1):3442,2912,2871,1648,1456,1352,1251,1107,952.GPC(平均分子量):Mw2990(Mw/Mn 1.07).
実施例52 コール酸アミド[化合物(IIIa−10)]の合成
フラスコ内に、ポリオキシエチレンジアミン(平均分子量1000、川研ファインケミカル社製PEOアミン#1000)15g(15mmol)、4−ジメチルアミノピリジン(広栄化学工業社製)1.46g(12mmol)およびジクロロメタン50mLを加え、溶解した。その溶解液にコール酸(ミクニ化学産業社製)4.08g(10mmol)、次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジミドの塩酸塩(アイバイツ社製)2.3g(12mmol)を加えた。窒素雰囲気下で12時間室温攪拌し、ジクロロメタン50mL、水50mLを加え、抽出した。分離した有機層に1mol/L塩酸22mLおよび水50mLを加えて洗浄し、さらに、10%食塩水50mLで2回洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、乾燥剤をろ過除去し、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。さらに、真空ポンプを用いて80℃で2時間減圧乾燥し、化合物(IIIa−10)11.9g(収率86%)を薄黄色の粘稠な液体として得た。

H−NMR(CDCl,δppm,400MHz):0.68(s,3H),0.89(s,3H),0.99(d,J=7.7Hz,3H),0.98−2.28(m,24H),2.89(bs,3H),3.29(bt,J=6.0Hz,2H),3.31(bt,J=6.0Hz,2H),3.53(bs,1H),3.64(bs,84H),3.83(bs,2H),3.96(bs,2H),4.22(s,2H),7.28(bs,1H),7.85(bs,2H).13C−NMR(CDCl,δppm,100MHz):12.5,17.3,17.4,22.4,23.3,26.3,26.5,27.6,28.1,29.1,30.3,31.7,33.1,34.7,34.8,35.4,37.3,39.2,39.5,41.6,46.3,46.5,68.2,69.3,69.4,69.6,70.0,70.1,70.2,70.3,70.4,,70.8,71.7,73.0,174.1.IR(KBr Neat,cm−1):3372,2867,1648,1464,1350,1298,1251,1110,950.GPC(平均分子量):Mw1400(Mw/Mn 1.06).
実施例53 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−1) 6.0g/L
実施例54 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
化合物(IIIa−2) 0.15g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
実施例55 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−3) 1.5g/L
実施例56 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIb−2) 1.0g/L
実施例57 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
化合物(IIIa−5) 0.5g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
実施例58 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−1) 6.0g/L
実施例59 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−1) 6.0g/L
実施例60 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIb−2) 1.0g/L
実施例61 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
化合物(IIIa−2) 0.15g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
実施例62 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−3) 1.5g/L
実施例63 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−1) 6.0g/L
実施例64 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIb−2) 1.0g/L
実施例65 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
化合物(IIIa−3) 1.5g/L
比較例9 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
比較例10 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
比較例11 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
比較例12 HDLコレステロール測定用キット
以下の第一試薬および第二試薬からなるHDLコレステロール測定用キットを調製した。
第一試薬
HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L
BSA 2.0g/L
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万) 1.0g/L
第二試薬
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
化学修飾LPL311(VFM−4101で修飾)
0.2kU/L
COO321 5.0kU/L
実施例66 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例53のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例67 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例54のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例68 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例55のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例69 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例56のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例70 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例57のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例71 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例58のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例72 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例59のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例73 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例60のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例74 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例61のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例75 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例62のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例76 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例63のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例77 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例64のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
実施例78 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに実施例65のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例13 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例9のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例14 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例10のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例15 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例11のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。
比較例16 HDLコレステロールの測定
実施例1のキットの代わりに比較例12のキットを用いる以外は実施例21の測定法と同様にして、日立7170型自動分析装置によりヒト血清35検体中のHDLコレステロールを測定した。一方、実施例66〜78および比較例13〜16の測定において用いたヒト血清35検体を用いて、DCM法により当該検体中のHDLコレステロールを測定し、各測定法と比較した。実施例66〜78および比較例13〜16それぞれの測定法と、DCM法による測定法との相関係数を表2に示す。

実施例66〜70と比較例13より、胆汁酸誘導体として胆汁酸エステル類または胆汁酸アミド類を用いた場合において、DCM法による測定との間に良好な相関が得られた。また、実施例71と比較例14、実施例72〜75と比較例15、実施例76〜78と比較例16との対比から、BSAまたはデキストラン硫酸を添加した条件下、もしくは両化合物を添加した条件下においても、胆汁酸誘導体として胆汁酸エステル類または胆汁酸アミド類を用いた場合においてDCM法による測定との間に良好な相関係数が得られることが判明した。
試験例1 各種胆汁酸誘導体(陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤)がコレステロール測定酵素の安定性へ及ぼす影響
HDLコレステロール測定用キットの第二試薬として使用される下記組成1〜8からなる試薬を調製し、それぞれ40℃にて48時間(2日)、120時間(5日)保存した。調製直後の組成1〜8からなる各試薬、40℃にて2日間保存した各試薬および40℃にて5日間保存した各試薬におけるコレステロールエステル加水分解酵素(LPL311)およびコレステロール酸化酵素(COO321)それぞれの酵素活性を測定し、調製直後の各試薬における酵素活性に対する保存後の各試薬における酵素活性の比率(酵素活性残存率)(%)を求めた。
酵素活性は以下の方法により求めた。
(1)コレステロールエステル加水分解酵素活性測定法
測定試薬
0.15mol/Lリン酸カリウムバッファー(pH7.2)
トリトンX−100 2g/L
フェノール 0.15g/L
パーオキシダーゼ 20kU/L
コレステロール酸化酵素 5kU/L
4−アミノアンチピリン 0.2g/L
測定基質溶液
コレステロールリノレート イソプロパノール溶液(6g/L)
操作法
測定試薬3mLを石英セルに添加し、調製直後の組成1〜8からなる各試薬をそれぞれ0.05mL添加する。37℃にて5分加温後、反応液に測定基質溶液を0.1mL添加し、さらに37℃にて加温する。測定基質溶液を添加して5分後および6分後のそれぞれの反応液の500nmにおける吸光度を測定し、当該両吸光度から、組成1〜8からなる各試薬における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)を算出する。一方、組成1〜8からなる各試薬の代わりに精製水を用いて同様の測定を行い、精製水における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)を算出する。組成1〜8からなる各試薬における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)から精製水における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)を差し引いて算出された値(ΔΔAbs/min)を、コレステロール加水分解酵素の安定化の指標とする。
同様の一連の操作を、調製直後の組成1〜8からなる各試薬の代わりに、組成1〜8からなる各試薬を40℃にて2日間保存した各試薬、および、組成1〜8からなる各試薬を40℃にて5日間保存した各試薬を用いて測定を行い、各試薬における吸光度変化量(ΔΔAbs/min)を算出する。
(2)コレステロール酸化酵素活性測定法
測定試薬
0.15mol/Lリン酸カリウムバッファー(pH7.2)
トリトンX−100 2g/L
フェノール 0.15g/L
パーオキシダーゼ 20kU/L
4−アミノアンチピリン 0.2g/L
測定基質溶液
コレステロール イソプロパノール溶液(5g/L)
操作法
測定試薬3mLを石英セルに添加し、調製直後の組成1〜8からなる各試薬を精製水で6倍希釈した溶液をそれぞれ0.05mL添加する。37℃にて5分加温後、反応液に測定基質溶液を0.1mL添加し、さらに37℃にて加温する。測定基質溶液を添加して5分後および6分後のそれぞれの反応液の500nmにおける吸光度を測定し、当該両吸光度から、組成1〜8からなる各試薬における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)を算出する。一方、組成1〜8からなる試薬の代わりに精製水を用いて同様の測定を行い、精製水における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)を算出する。組成1〜8からなる各試薬における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)から精製水における500nmでの1分間当たりの吸光度変化量(ΔAbs/min)を差し引いて算出された値(ΔΔAbs/min)を、コレステロール酸化酵素の安定化の指標とする。
同様の一連の操作を、調製直後の組成1〜8からなる各試薬の代わりに、組成1〜8からなる各試薬を40℃にて2日間保存した各試薬、および、組成1〜8からなる各試薬を40℃にて5日間保存した各試薬を用いて測定を行い、各試薬における吸光度変化量(ΔΔAbs/min)を算出する。
組成1
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
組成2
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
コール酸ナトリウム 6.0g/L
組成3
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
CHAPS 6.0g/L
組成4
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
BIGCHAP 4.5g/L
組成5
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
化合物(IIIa−1) 6.0g/L
組成6
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
化合物(IIIa−2) 0.45g/L
組成7
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
化合物(IIIa−3) 4.5g/L
組成8
HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.3g/L
ペルオキシダーゼ 20kU/L
塩化カルシウム二水和物 0.1g/L
化学修飾LPL311(VFM4101で修飾) 0.2kU/L
化合物(IIIb−2) 1.0g/L
測定結果を表3に示す。

表3から明らかなように、胆汁酸誘導体として、陰イオン性型胆汁酸誘導体(具体的には、コール酸)および両性型胆汁酸誘導体(具体的には、CHAPS)を含有する試薬に比較して、非イオン性型胆汁酸誘導体[具体的には、BIGCHAP、化合物(IIIa−1)、化合物(IIIa−2)、化合物(IIIa−3)および化合物(IIIb−2)]を含有する試薬の方が、コレステロール測定用酵素(具体的には、LPL311およびCOO321)の安定性が良好であった。一般に、酵素等の40℃等の高温での保存安定性は、4℃または室温等の保存安定性を反映することが知られている。従って、本発明の高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬もしくはキットにおいて、胆汁酸誘導体として、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体を用いることにより、長期間保存された試薬を用いた場合であっても、また、保存温度が40℃に晒されたおそれの有る試薬を用いた場合であっても、より正確に高密度リポ蛋白中のコレステロールが測定できることがわかる。
【産業上の利用可能性】
本発明により、検体中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを簡便かつ正確に測定する方法およびその方法に使用する試薬、ならびに、長期間の保存においても酵素活性が安定に保持される高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するための試薬およびキットが提供される。

【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素、または、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素とを、胆汁酸誘導体を含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を測定することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する方法。
【請求項2】
水性媒体が、さらに、アルブミンを含有する請求項1記載の方法。
【請求項3】
コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項1または2記載の方法。
【請求項4】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項3記載の方法。
【請求項5】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項3記載の方法。
【請求項6】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項6記載の方法。
【請求項8】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物である請求項8記載の方法。
【請求項10】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す)で表される化合物、または、一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物である請求項10記載の方法。
【請求項12】
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項13】
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
【請求項14】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を含有する請求項13記載の試薬。
【請求項15】
さらに、アルブミンを含有する請求項12〜14のいずれかに記載の試薬。
【請求項16】
コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項12〜15のいずれかに記載の試薬。
【請求項17】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項16記載の試薬。
【請求項18】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項16記載の試薬。
【請求項19】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項12〜18のいずれかに記載の試薬。
【請求項20】
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項19記載の試薬。
【請求項21】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項12〜18のいずれかに記載の試薬。
【請求項22】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物である請求項21記載の試薬。
【請求項23】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項12〜18のいずれかに記載の試薬。
【請求項24】
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す)で表される化合物、または、一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物である請求項23記載の試薬。
【請求項25】
コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項26】
胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項27】
過酸化水素測定用試薬を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項28】
コレステロールエステル加水分解酵素を含有する第一試薬と、コレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、胆汁酸誘導体および酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項29】
胆汁酸誘導体を含有する第一試薬と、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第二試薬とを含有し、酸化型補酵素を第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有することを特徴とする高密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
【請求項30】
さらに、還元型補酵素測定用試薬を、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項28または29記載のキット。
【請求項31】
さらに、アルブミンを、第一試薬、第二試薬のいずれかまたは両方に含有する請求項25〜30のいずれかに記載のキット。
【請求項32】
コレステロールエステル加水分解酵素が、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項25〜31のいずれかに記載のキット。
【請求項33】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、および、キレート機能を有する基からなる群より選ばれる基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項32記載のキット。
【請求項34】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素が、ポリエチレングリコールを主成分とする基により修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素である請求項32記載のキット。
【請求項35】
胆汁酸誘導体が、陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項25〜34のいずれかに記載のキット。
【請求項36】
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デオキシコール酸もしくはその塩、ケノデオキシコール酸もしくはその塩、ウルソデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソリトコール酸もしくはその塩、12−オキソケノデオキシコール酸もしくはその塩、7−オキソデオキシコール酸もしくはその塩、ヒオコール酸もしくはその塩、ヒオデオキシコール酸もしくはその塩、および、デヒドロコール酸もしくはその塩からなる群より選ばれる胆汁酸誘導体である請求項35記載のキット。
【請求項37】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項25〜34のいずれかに記載のキット。
【請求項38】
両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(I)

[式中、Rは、3−(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ基であり、Rは、水素原子または水酸基である]で表される化合物である請求項37記載のキット。
【請求項39】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体である請求項25〜34のいずれかに記載のキット。
【請求項40】
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体が、一般式(II)

(Xは、水素原子または水酸基を表し、RおよびRは、同一または異なって、置換もしくは非置換のアルキル基、または、置換もしくは非置換のアルカノイル基を表す)で表される化合物、または、一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物である請求項39記載のキット。
【請求項41】
一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物。
【請求項42】
一般式(V)

[式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表す]で表される化合物と、一般式(VI)

(式中、W’は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、または、置換もしくは非置換のアリール基を表し、nは、3〜400の整数を表す)で表される化合物、または、一般式(VII)

(式中、Tは、置換もしくは非置換のアミノアルキル基を表し、nは、3〜400の整数を表す)で表される化合物とを、縮合剤の存在下に反応させることを特徴とする一般式(III)

{式中、X、YおよびZは、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、Qは、酸素原子またはNHを表し、Wは、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アルカノイル基、アルケノイル基、アルキノイル基、置換もしくは非置換のアリール基、置換もしくは非置換のアミノアルキル基、または、一般式(IV)

[式中、X’、Y’およびZ’は、同一または異なって、水素原子、水酸基またはオキソ(=O)基を表し、mは、0または1を表す]で表される基を表し、nは、3〜400の整数を表す}で表される化合物の製造方法。

【国際公開番号】WO2004/035817
【国際公開日】平成16年4月29日(2004.4.29)
【発行日】平成18年2月16日(2006.2.16)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2004−544972(P2004−544972)
【国際出願番号】PCT/JP2003/013259
【国際出願日】平成15年10月16日(2003.10.16)
【出願人】(000162478)協和メデックス株式会社 (42)
【Fターム(参考)】