高度にリン酸化された活性なヒトリソソームスルファターゼ酵素の製造およびそれの使用
本発明は、高度にリン酸化された活性なリソソームスルファターゼ酵素の組成物、それらの薬学的組成物、そのようなリソソームスルファターゼ酵素および組成物を生産ならびに精製する方法、ならびに疾患および病状（特に、リソソームスルファターゼ酵素における欠乏によって引き起こされるか、またはそれに関連付けられる、リソソーム蓄積症を含む）の診断、予防、または処置におけるそれらの使用を提供する。一実施形態において、ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体において生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体が提供され、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体において生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現し、そしてここで、該組換え型リソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体は、高レベルの活性化および高レベルのリン酸化を有する、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項２】
前記組換え型リソソームスルファターゼ酵素が、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、請求項１に記載の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項３】
ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現し、そしてここで、該組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、高レベルの活性化および高レベルのリン酸化を有する、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項４】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項１から３の何れか一項に記載の酵素。
【請求項５】
高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を生産するための方法であって、該方法は：
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；
（ｂ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｃ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｄ）該第一のおよび第二の発現ベクターを用いて該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；
（ｅ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタントの選択およびクローニングをする工程；ならびに
（ｆ）該高度にリン酸化された組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養の作業方法を最適化する工程、
を包含し、ここで該組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において同時にトランスフェクトされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において連続してトランスフェクトされる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項５から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項５から８の何れか一項に記載の方法によって生産される、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項１０】
請求項９に記載のリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体またはそれの改変体を生産するための方法であって、該方法は：
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；
（ｂ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体に適した、該高度にリン酸化された活性な組換え型ＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｃ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体に適した、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｄ）該第一のおよび第二の発現ベクターを用いて該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；
（ｅ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタントの選択およびクローニングをする工程；ならびに
（ｆ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養の作業方法を最適化する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において同時にトランスフェクトされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において連続してトランスフェクトされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項１１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１から１４の何れか一項に記載の方法によって生産される、高度にリン酸化された高度に活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および、一つもしくは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）における欠乏によって引き起こされるか、またはそれに関連付けられるリソソーム蓄積症に罹患した被験体を処置するために有用である、組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで該ＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される、
組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項１８】
前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群である、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項１９】
前記リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症である、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項２０】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項２１】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンドから本質的になる、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項２２】
リソソームスルファターゼ酵素の欠乏を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、該リソソームスルファターゼ酵素を必要としている該被験体に、該リソソームスルファターゼ酵素の治療上有効な量を投与することを包含し、ここで、該リソソームスルファターゼ酵素は、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体である、方法。
【請求項２３】
前記リソソームスルファターゼ酵素欠乏は、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ムコ多糖体症ＶＩ型（ＭＰＳ ＶＩ）またはマロトー−ラミー症候群、ムコ多糖体症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）またはハンター症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群、およびムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リソソームスルファターゼ酵素欠乏は、ＭＰＳ ＩＶａまたはモルキオＡ症候群である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏と関連付けられるリソソーム蓄積症を処置する方法であって、該方法は、該一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏を有する被験体に、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって産生される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体の治療上有効な量を投与することを包含する、方法。
【請求項２６】
前記リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項２２から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群、または多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、精製された、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここで、該ＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される、
方法。
【請求項２９】
前記被験体は、ＭＰＳ ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体は、ＭＳＤに罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンドから本質的になる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
Ｇ７１またはそれの誘導体に由来するＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は：
（ａ）組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のための発現ベクター；および
（ｂ）組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素のための発現ベクターを含み、ここで、該組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、Ｇ７１またはそれの誘導体に由来するＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３４】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のための前記発現ベクターを含む、請求項３３に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３５】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを発現および分泌する、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３６】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローン４、クローン５、クローンＣ６、クローンＣ２、クローンＣ５、クローンＣ７、クローンＣ１０、クローンＣ１１およびクローンＣ３０からなる群より選択される、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３７】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローンＣ２である、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３８】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、懸濁物中での増殖に適合させられている、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３９】
天然の基質を分解する、組換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）該リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積する条件下で、該リソソーム酵素が不足している、単離されたヒト細胞を培養すること；
（ｂ）該細胞を該リソソーム酵素と接触させること；
（ｃ）該細胞を溶解すること；
（ｄ）該細胞溶解産物に、（ｉ）天然の基質に対し特異的であり、かつ（ｉｉ）該天然の基質から低分子オリゴ糖を切断する酵素を添加すること；
（ｅ）検出可能部分で該低分子オリゴ糖を標識すること；
（ｆ）該標識された低分子オリゴ糖を必要に応じて分離すること；
（ｇ）該標識された低分子オリゴ糖を検出すること；および
（ｈ）（ｉ）該リソソーム酵素と接触させられた細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量と（ｉｉ）該リソソーム酵素と接触させられていない細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量とを比較することによって、天然の基質を分解する該リソソーム酵素の活性を決定すること、
を包含し、ここで、（ｈ）（ｉｉ）と比較したときの（ｈ）（ｉ）における減少は、天然の基質を分解する該リソソーム酵素の活性を示す、方法。
【請求項４０】
前記リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択されるリソソームスルファターゼ酵素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リソソームスルファターゼ酵素は、ＧＡＬＮＳである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項１】
ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体において生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現し、そしてここで、該組換え型リソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体は、高レベルの活性化および高レベルのリン酸化を有する、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項２】
前記組換え型リソソームスルファターゼ酵素が、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、請求項１に記載の組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項３】
ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）を発現し、そしてここで、該組換え型ヒトＧＡＬＮＳは、高レベルの活性化および高レベルのリン酸化を有する、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項４】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項１から３の何れか一項に記載の酵素。
【請求項５】
高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を生産するための方法であって、該方法は：
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；
（ｂ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｃ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体において、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｄ）該第一のおよび第二の発現ベクターを用いて該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；
（ｅ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタントの選択およびクローニングをする工程；ならびに
（ｆ）該高度にリン酸化された組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養の作業方法を最適化する工程、
を包含し、ここで該組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、方法。
【請求項６】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において同時にトランスフェクトされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において連続してトランスフェクトされる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項５から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項５から８の何れか一項に記載の方法によって生産される、高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項１０】
請求項９に記載のリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および、一つもしくはそれより多い薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体またはそれの改変体を生産するための方法であって、該方法は：
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）に由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体を培養する工程；
（ｂ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体に適した、該高度にリン酸化された活性な組換え型ＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第一の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｃ）該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体に適した、組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現することができる第二の哺乳動物発現ベクターを調製する工程；
（ｄ）該第一のおよび第二の発現ベクターを用いて該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体をトランスフェクトする工程；
（ｅ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を発現する、該ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体のトランスフェクタントの選択およびクローニングをする工程；ならびに
（ｆ）該高度にリン酸化された活性な組換え型ヒトＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体を製造するための細胞培養の作業方法を最適化する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において同時にトランスフェクトされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のおよび第二の発現ベクターは、前記ＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体中に、工程（ｄ）において連続してトランスフェクトされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項１１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１から１４の何れか一項に記載の方法によって生産される、高度にリン酸化された高度に活性な組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体、および、一つもしくは薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１７】
Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）における欠乏によって引き起こされるか、またはそれに関連付けられるリソソーム蓄積症に罹患した被験体を処置するために有用である、組換え型ヒトＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体であって、ここで該ＧＡＬＮＳ酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される、
組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体。
【請求項１８】
前記リソソーム蓄積症は、ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群である、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項１９】
前記リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症である、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項２０】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項２１】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンドから本質的になる、請求項１７に記載のＧＡＬＮＳ酵素。
【請求項２２】
リソソームスルファターゼ酵素の欠乏を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、該リソソームスルファターゼ酵素を必要としている該被験体に、該リソソームスルファターゼ酵素の治療上有効な量を投与することを包含し、ここで、該リソソームスルファターゼ酵素は、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって生産される、組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体である、方法。
【請求項２３】
前記リソソームスルファターゼ酵素欠乏は、異染性白質萎縮症（ＭＬＤ）、ムコ多糖体症ＶＩ型（ＭＰＳ ＶＩ）またはマロトー−ラミー症候群、ムコ多糖体症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）またはハンター症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩａ型（ＭＰＳ ＩＩＩａ）またはサンフィリポＡ症候群、ムコ多糖体症ＩＩＩｄ型（ＭＰＳ ＩＩＩｄ）またはサンフィリポＤ症候群、およびムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ ＩＶａ）またはモルキオＡ症候群からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リソソームスルファターゼ酵素欠乏は、ＭＰＳ ＩＶａまたはモルキオＡ症候群である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏と関連付けられるリソソーム蓄積症を処置する方法であって、該方法は、該一つまたはそれより多いリソソームスルファターゼ酵素における欠乏を有する被験体に、ＣＨＯに由来するＥＮＤ３相補群細胞またはそれの誘導体によって産生される、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な断片、変異体、改変体もしくは誘導体の治療上有効な量を投与することを包含する、方法。
【請求項２６】
前記リソソーム蓄積症は、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞またはそれの誘導体は、Ｇ７１細胞株またはＧ７１誘導体である、請求項２２から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ムコ多糖体症ＩＶａ型（ＭＰＳ ＩＶａ）もしくはモルキオＡ症候群、または多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）に罹患した被験体を処置する方法であって、該方法は、該被験体に、精製された、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）酵素またはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここで、該ＧＡＬＮＳまたはそれの生物学的に活性な変異体、改変体もしくは誘導体は：
（ａ）非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、少なくとも約９０％の純度を有し；
（ｂ）Ｃα−ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への、位置５３のシステイン残基の少なくとも約９０％の変換を有し；かつ
（ｃ）位置１７８および３９７のアスパラギン残基がＮ結合型グリコシル化され、ここで、位置１７８の該アスパラギン残基に付加されたオリゴマンノース鎖の少なくとも約５０％がビスリン酸化される、
方法。
【請求項２９】
前記被験体は、ＭＰＳ ＩＶａまたはモルキオＡ症候群に罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体は、ＭＳＤに罹患している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、目に見えるタンパク質の少なくとも約７５％である、約５５〜６０ｋＤａの主要なバンドからなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＧＡＬＮＳ酵素は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけられた場合、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ染色によって決定されるとき、約５５〜６０ｋＤａの単一のバンドから本質的になる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
Ｇ７１またはそれの誘導体に由来するＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株であって、ここで、該ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は：
（ａ）組換え型ヒトスルファターゼ調節因子１（ＳＵＭＦ１）のための発現ベクター；および
（ｂ）組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素のための発現ベクターを含み、ここで、該組換え型ヒトリソソームスルファターゼ酵素は、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択される、Ｇ７１またはそれの誘導体に由来するＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３４】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）のための前記発現ベクターを含む、請求項３３に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３５】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、組換え型ヒトＧＡＬＮＳを発現および分泌する、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３６】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローン４、クローン５、クローンＣ６、クローンＣ２、クローンＣ５、クローンＣ７、クローンＣ１０、クローンＣ１１およびクローンＣ３０からなる群より選択される、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３７】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、クローンＣ２である、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３８】
前記ＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株は、懸濁物中での増殖に適合させられている、請求項３４に記載のＥＮＤ３相補群ＣＨＯ細胞株。
【請求項３９】
天然の基質を分解する、組換え型ヒトリソソーム酵素の活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）該リソソーム酵素に対する天然の基質が蓄積する条件下で、該リソソーム酵素が不足している、単離されたヒト細胞を培養すること；
（ｂ）該細胞を該リソソーム酵素と接触させること；
（ｃ）該細胞を溶解すること；
（ｄ）該細胞溶解産物に、（ｉ）天然の基質に対し特異的であり、かつ（ｉｉ）該天然の基質から低分子オリゴ糖を切断する酵素を添加すること；
（ｅ）検出可能部分で該低分子オリゴ糖を標識すること；
（ｆ）該標識された低分子オリゴ糖を必要に応じて分離すること；
（ｇ）該標識された低分子オリゴ糖を検出すること；および
（ｈ）（ｉ）該リソソーム酵素と接触させられた細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量と（ｉｉ）該リソソーム酵素と接触させられていない細胞由来の標識された低分子オリゴ糖の量とを比較することによって、天然の基質を分解する該リソソーム酵素の活性を決定すること、
を包含し、ここで、（ｈ）（ｉｉ）と比較したときの（ｈ）（ｉ）における減少は、天然の基質を分解する該リソソーム酵素の活性を示す、方法。
【請求項４０】
前記リソソーム酵素は、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、スルファミダーゼ／ヘパリン−Ｎ−スルファターゼ（ＳＧＳＨ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−スルファターゼ（Ｇ６Ｓ）およびＮ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）からなる群より選択されるリソソームスルファターゼ酵素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リソソームスルファターゼ酵素は、ＧＡＬＮＳである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記リソソーム酵素は、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵ）である、請求項３９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１１−５０９６７４（Ｐ２０１１−５０９６７４Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４３２７８（Ｐ２０１０−５４３２７８）
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１２７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９１９９４
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５０６１３６４８３）バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月１６日（２００９．１．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１２７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９１９９４
【国際公開日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【出願人】（５０６１３６４８３）バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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