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高毒性髄膜炎菌系統に対する広範な防御のためのポリペプチド−ワクチン
説明

高毒性髄膜炎菌系統に対する広範な防御のためのポリペプチド−ワクチン

【課題】髄膜炎菌性疾患および/または髄膜炎菌性感染に対する免疫を提供するためのさらなる組成物を提供すること。
【解決手段】少数の規定抗原は、髄膜炎菌感染に対し広範な防御を提供し得、そして本発明は、被験体に投与後、この被験体における抗体応答を誘導し得る組成物を提供するのであって、ここでこの抗体応答は、高毒性系統A4、高毒性系統ET5、およびN.meningitidis血清群Bの系統3のうちの二つまたは三つに対し殺菌性である。この組成物は、単一抗原からなるよりむしろ、10以下の精製抗原の混合物を含有し、外膜小胞のような抗原複合体または未決定の抗原混合物を含有すべきでない。5つのタンパク質抗原が特に使用される:(1)「NadA」タンパク質;(2)「741」タンパク質;(3)「936」タンパク質;(4)「953」タンパク質;および(5)「287」タンパク質。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【0002】
(技術分野)
本発明は、免疫学とワクチン学の分野にある。特に、本発明は、Neisseria meningitidis(髄膜炎菌)由来の抗原、および免疫化における抗原の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
N.meningitidisは、非運動性のグラム陰性のヒト病原体であり、咽頭にコロニー形成し、そして髄膜炎(および、時折、髄膜炎のない敗血症)を引き起こす。これは、風土病および流行病との両方を引き起こす。Haemophilus influenzaeに対する結合体化ワクチンを導入後、N.meningitidisは、米国において細菌性髄膜炎の主な原因である。
【0004】
生物体の莢膜多糖に基づき、N.meningitidisの種々の血清群が同定されている。血清群Aは、サハラ以南のアフリカにおける流行病に最も頻繁に関係する病原体である。血清群Bおよび血清群Cは、米国およびほとんどの先進国における症例の大部分の原因である。血清群W135および血清群Yは、米国および先進国における症例の残りの原因である。分類は、血清群の後に、血清型、血清亜型、およびその後に免疫型を含み、そしてこの標準的な命名法は、血清群、血清型、血清亜型および免疫型を列挙し、それぞれが、コロンによって分けられる(例えば、B:4:P1.15:L3,7,9)。血清群B内では、いくつかの系統は、しばしば(高侵襲性)疾患を引き起こし、いくつかの系統は、他の(高毒性)疾患よりもより重い形態の疾患を引き起こし、そして他の系統は、多少なりともまれに疾患を引き起こす。7つの高毒性系統が認知される(すなわち、亜群I、亜群III、および亜群IV−1、ET−5複合体、ET−37複合体、A4クラスター、ならびに系統3)。これらは、多座酵素電気泳動(MLEE)により決定されるが、多座配列タイピング(MLST)もまた、髄膜炎菌を分類するために用いられる[参考文献1]。
【0005】
血清群A、血清群C、血清群W135、および血清群Yに対する多糖ワクチンは、長年公知であるが[2、3]、血清群Bに対するワクチンは理解しにくいと証明されている。外膜小胞に基づくワクチンは試験されているが[例えば、参考文献4を参照のこと]、これらのワクチンによって生じる防御は、代表的に、ワクチン作製に使用される株に制限される。従って、広範に有効な血清群Bワクチンの必要性が依然として残る。
【0006】
髄膜炎菌性の血清群A[5]および血清群B[6、7]についてのゲノム配列が報告されており、この血清群Bの配列は、ワクチン抗原を同定するために研究されている[例えば、参考文献8〜13]。候補抗原は、異種発現を改善するために操作されている[参考文献14〜16]。
【0007】
髄膜炎菌性疾患および/または髄膜炎菌性感染に対する免疫を提供するためのさらなる組成物、および改善された組成物、ならびに、特に、血清群B髄膜炎菌に対する広範な免疫を提供するためのさらなる組成物、および改善された組成物を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明は、以下の項目を提供する。
(項目1)
被験体に投与後、該被験体において抗体応答を誘導し得る組成物であって、ここで該抗体応答は、N.meningitidis血清群Bの高毒性系統A4、ET−5および系統3のうち二つ以上に対して殺菌性である、組成物。
(項目2)
それぞれ異なるアミノ酸配列を有する、2〜10のポリペプチドを含有する、項目1に記載の組成物。
(項目3)
項目1または項目2に記載の組成物であって、ここで前記殺菌性の抗体応答を起こす該組成物は、組換え発現により得られる、組成物。
(項目4)
以下の5個の髄膜炎菌性抗原を含有する組成物であって:(1)「NadA」タンパク質;(2)「741」タンパク質;(3)「936」タンパク質;(4)「953」タンパク質;および(5)「287」タンパク質、を含有する組成物。
(項目5)
項目4に記載の組成物であって、ここで前記NadAタンパク質は、配列番号2に対して85%以上の同一性を有する、組成物。
(項目6)
項目5に記載の組成物であって、ここで前記NadAタンパク質は、配列番号2を含む、組成物。
(項目7)
項目4〜6のいずれか一項に記載の組成物であって、ここで前記741タンパク質は、配列番号3に対して85%以上の同一性を有する、組成物。
(項目8)
項目7に記載の組成物であって、ここで前記741タンパク質は、配列番号3を含む、組成物。
(項目9)
項目4〜8に記載のいずれか一つの組成物であって、ここで前記936タンパク質は、配列番号4に対して85%以上の同一性を有する、組成物。
(項目10)
項目9に記載の組成物であって、ここで前記936タンパク質は、配列番号4を含む、組成物。
(項目11)
項目4〜10に記載のいずれか一つの組成物であって、ここで前記953タンパク質は、配列番号5に対して85%以上の同一性を有する、組成物。
(項目12)
項目11に記載の組成物であって、ここで前記953タンパク質は、配列番号5を含む、組成物。
(項目13)
項目4〜12に記載のいずれか一つの組成物であって、ここで前記287タンパク質は、配列番号6に対して85%以上の同一性を有する、組成物。
(項目14)
項目13に記載の組成物であって、ここで前記287タンパク質は、配列番号6を含む、組成物。
(項目15)
項目4〜14に記載のいずれか一つの組成物であって、ここで前記抗原(1)〜(5)の少なくとも二つは、単一ポリペプチド鎖として発現される、組成物。
(項目16)
項目1〜15のいずれか一項に記載の組成物であって、ここで該組成物は、単一ポリペプチド鎖内に、以下:NadAおよび741;NadAおよび936;NadAおよび953;NadAおよび287;741および936;741および953;741および287;936および953;936および287;953および287、からなる群から選択される抗原一対を含むポリペプチドを含有する、組成物。
(項目17)
項目1〜16のいずれか一項に記載の組成物であって、該組成物は、式NH−A−[−X−L−]−B−COOHのポリペプチドを含有し、ここで:Xは、5つの抗原(1)〜(5)の一つのアミノ酸配列であり;Lは任意のリンカーアミノ酸配列であり;Aは任意のN末端のアミノ酸配列であり;Bは任意のC末端アミノ酸配列であり;そしてnは2、3、4または5である、組成物。
(項目18)
項目17に記載の組成物であって、ここでnは2であり、Xは936タンパク質であり、そしてXは741タンパク質である、組成物。
(項目19)
項目17に記載の組成物であって、ここでnは2であり、Xは287タンパク質であり、そしてXは953タンパク質である、組成物。
(項目20)
配列番号7を含むタンパク質を含有する、項目1〜19のいずれか一項に記載の組成物。(項目21)
配列番号8を含むタンパク質を含有する、項目1〜20のいずれか一項に記載の組成物。(項目22)
髄膜炎菌血清群Y、髄膜炎菌血清群W135、髄膜炎菌血清群Cおよび(必要に応じて)髄膜炎菌血清群A由来の糖抗原をさらに含有する、項目1〜21のいずれか一項に記載の組成物。
(項目23)
Haemophilus influenzaeB型由来の糖抗原をさらに含有する、項目1〜22のいずれか一項に記載の組成物。
(項目24)
項目22または項目23に記載の組成物であって、ここで前記糖抗原は、以下:ジフテリアトキソイド、破傷風(tetatnus)トキソイド、CRM197またはH.influenzaeタンパク質Dから選択されるキャリアに結合される、組成物。
(項目25)
Streptococcus pneumoniae由来の抗原をさらに含有する、項目1〜24のいずれか一項に記載の組成物。
(項目26)
医薬として使用のための、項目1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
(項目27)
Neisseriaによって引き起こされる疾患の予防および/または処置のための医薬の製造における、項目1〜26のいずれか一項に記載の組成物の使用。
(項目28)
項目1〜26のいずれか一つに記載の組成物の有効量を投与する工程を包含する、哺乳動物において抗体応答を生じるための方法。
(項目29)
配列番号1〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
(項目30)
限外濾過による濃縮工程および緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程;陰イオンカラムクロマトグラフィー工程;疎水性カラムクロマトグラフィー工程;ヒドロキシルアパタイトセラミックカラムクロマトグラフィー工程;緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程;および濾過滅菌工程、を包含する、培養培地から可溶性NadAを精製するプロセス。
(項目31)
以下の工程:均一化工程;遠心分離工程;陽イオンカラムクロマトグラフィー工程;陰イオンカラムクロマトグラフィー工程;疎水性カラムクロマトグラフィー工程;緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程;および濾過滅菌工程、を包含する、細菌から936−ΔG741ハイブリッドタンパク質を精製するプロセス。
(発明の開示)
B型肝炎ウイルス、ジフテリアおよび破傷風のような病原体に対するワクチンは、単一のタンパク質抗原(例えば、HBV表面抗原、または破傷風トキソイド)を含む。対照的に、無細胞性百日咳ワクチンは、代表的に、少なくとも三つのB.pertussisタンパク質を含み、そしてPrevenarTM肺炎球菌ワクチンは、7つの別個の結合体化糖抗原を含む。細胞性百日咳ワクチン、はしかワクチン、不活性化ポリオワクチン(IPV)、および髄膜炎菌性OMVワクチンのような他のワクチンは、まさにこれらの性質により、多数の抗原混合物を形成する。
【0009】
従って、対防御が、単一抗原、少数の規定抗原、または複雑な未規定抗原混合物により誘発され得るかどうかは、問題となる病原体に依存する。本発明は、少数の規定抗原が、髄膜炎菌感染に対する広範な防御を提供し得るという本発見に基づき、そして本発明は、被験体に投与後、この被験体における抗体応答を誘導し得る組成物を提供するのであって、ここでこの抗体応答は、N.meningitidis血清群Bの高毒性系統A4、ET−5および系統3のうちの2以上(例えば、2または3)に対して殺菌性である。
【0010】
本発明の組成物は、単一抗原からなるよりむしろ、10以下(例えば、9、8、7、6、5、4、3、2)の精製された抗原の混合物を含有することが好ましく、この組成物は、抗原複合体および未規定の抗原混合物を含有しないことが、特に好ましく、例えば、この組成物に外膜小胞を含有しないことが好ましい。
【0011】
血清群B髄膜炎菌について、5つの規定タンパク質抗原の混合物は、優れた防御性免疫応答を誘発することが見出されている。従って、本発明は、以下の5つの髄膜炎菌性タンパク質抗原を含む組成物を提供する:(1)「NadA」タンパク質;(2)「741」タンパク質;(3)「936」タンパク質;(4)「953」タンパク質;および(5)「287」タンパク質。これら抗原は、「5つの基本抗原」として、本明細書中に言及される。
【0012】
(NadAタンパク質)
N.meningitidisの血清群B由来の「NadA」(ナイセリア付着因子A)は、参考文献10(配列番号2943および2944)におけるタンパク質「961」として、ならびに参考文献6(GenBank登録番号:11352904および7227256もまた参照のこと)における「NMB1994」として開示される。このタンパク質の詳細な説明は参考文献17において見出され得る。血清群Aにおいて一致するタンパク質はない[5、17]。
【0013】
本発明に従って使用される場合、NadAは、種々の形態をとり得る。NadAの好ましい形態は、参考文献14〜16において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、C末端膜アンカーなしのNadAは好ましく(例えば、株2996について残基351〜405の欠失[配列番号1])、これは、時折、本明細書中で、「C」の上付き添え字の使用(例えば、NadA(C))により区別される。E.coliにおける膜アンカードメインなしのNadA(例えば、配列番号1)の発現は、この23マーのリーダーペプチドの随伴性除去(例えば、株2996について327マーを残すこと[配列番号2])を伴って、培養上清内へこのタンパク質の分泌をもたらす。リーダーペプチドのないポリペプチドは、時折、本明細書中で、「NL」の上付き添え字の使用(例えば、NadA(NL)またはNadA(C)(NL))により区別される。
【0014】
好ましいNadA配列は、配列番号2に対して50%以上の同一性(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)を有する。これはNadA変異体(例えば、対立遺伝子変異体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など)を含む。NadAの対立遺伝子形態は参考文献18の図9において示される。
【0015】
他の好ましいNadA配列は、配列番号1由来の少なくともnの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでnは7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である。好ましいフラグメントは、NadA由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号1のC末端および/またはN末端(例えば、NadA(C)、NadA(NL)、NadA(C)(NL))由来の1以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)を欠失する。N末端残基が欠失する場合、この欠失が、NadAがヒト上皮細胞に接着する能力を失わせないことが好ましい。配列番号1の好ましいフラグメントは、配列番号2である。
【0016】
分泌されたNadAは、好都合なことに、以下の工程を包含するプロセスによって培養培地から、高度に純粋な形態で調製され得る:限外濾過による緩衝液に対する濃縮工程およびダイアフィルトレーション工程;陰イオンカラムクロマトグラフィー工程;疎水性カラムクロマトグラフィー工程;ヒドロキシルアパタイトセラミックカラムクロマトグラフィー工程;緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程;および濾過滅菌工程。このプロセスのさらなる詳細は、実施例において示される。
【0017】
好ましくは、NadAはオリゴマー形態(例えば、3量体形態)において使用される。
【0018】
(741タンパク質)
血清群B由来の「741」タンパク質は、参考文献10(配列番号2535および2536)において開示され、そして参考文献6(GenBank登録番号GI:7227128もまた参照のこと)における「NMB1870」として開示される。血清群A[5]において一致するタンパク質は、GenBank登録番号7379322を有する。741は、天然にリポタンパク質である。
【0019】
本発明に従って使用される場合、741タンパク質は種々の形態をとり得る。741の好ましい形態は、参考文献14〜16において開示される改変体のような、切断改変体または欠損改変体である。特に、741のN末端は、このポリグリシン配列まで欠失され得(例えば、株MC58について残基1〜72の欠失[配列番号3])、これは、時折本明細書中で、「ΔG」の接頭語の使用により区別される。この欠失は発現を上昇させ得る。この欠失はまた、741の脂質付加部位を除去する。
【0020】
好ましい741配列は、配列番号3に対して50%以上の同一性(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)を有する。これは741改変体(例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など)を含む。741の対立遺伝子形態は、参考文献16の配列番号1〜22において見出され得、そして参考文献19の配列番号1〜23において見出され得る。参考文献20の配列番号1〜299は、さらなる741配列を示す。
【0021】
他の好ましい741配列は、配列番号3由来の少なくともnの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでnは7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である。好ましいフラグメントは、741由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号3のC末端および/またはN末端からの一以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)を欠失する。
【0022】
タンパク質741は、抗髄膜炎菌性抗体応答の誘発にとって、極めて有効な抗原であり、全ての髄膜炎菌性血清群にわたり発現される。系統発生解析は、このタンパク質は2つの群に分かれ、そしてこれらのうち1つはさらに分かれ、合計で3つの改変体を生じる[21]ことを示し、そして、ある改変体に対して産生される血清は、同一の改変体群内に対して殺菌性である一方で、この血清は、この他の2つの変異体のうちの1つを発現する株に対して活性でない(すなわち、改変体内の交差防御はあるが、改変体間の交差防御はない)。従って、最大の交差株の効力のためには、組成物は、タンパク質741の1つの変異体より多くの変異体を含有することが好ましい。各改変体由来の例示配列は、本明細書中の配列番号10、配列番号11、および配列番号12において示され、これは、脂質が741のリポタンパク質形態に共有結合的に付着されるN末端のシステイン残基で始まる。
【0023】
従って、この組成物は、以下のうちの少なくとも2つを含有することが好ましい:(1)配列番号10に対して少なくともa%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして/または配列番号10由来の少なくともxの連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第一のタンパク質;(2)配列番号11に対して少なくともb%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして/または配列番号11由来の少なくともyの連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第二のタンパク質;および(3)配列番号12に対して少なくともc%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして/または配列番号12由来の少なくともzの連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第三のタンパク質。
【0024】
aの値は少なくとも85(例えば、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5以上)である。bの値は少なくとも85(例えば、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5以上)である。cの値は少なくとも85(例えば、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5以上)である。a、b、およびcの値は、互いに本質的に関連しない。
【0025】
xの値は少なくとも7(例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)である。yの値は少なくとも7(例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)である。zの値は少なくとも7(例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)である。x、y、およびzの値は、内因的に、相互に関連しない。
【0026】
任意の所定の741アミノ酸配列は、カテゴリー(1)、(2)、および(3)のうちの一より多くに該当しないことが好ましい。従って、任意の所定の741アミノ酸配列は、カテゴリー(1)、(2)、および(3)のうちの一つだけに該当する。従って、以下であることが好ましい:タンパク質(1)はタンパク質(2)に対してi%未満の配列同一性を有する;タンパク質(1)はタンパク質(3)に対してj%未満の配列同一性を有する;そしてタンパク質(2)はタンパク質(3)に対してk%未満の配列同一性を有する。iの値は60以上(例えば、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90など)であり、そして大きくてもaである。jの値は60以上(例えば、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90など)であり、そして大きくてもbである。kの値は60以上(例えば、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90など)であり、そして大きくてもcである。i、j、およびkの値は、内因的に、相互に関連しない。
【0027】
(「936」タンパク質)
血清群B由来の「936」タンパク質は、参考文献10(配列番号2883および2884)において開示され、参考文献6(GenBank登録番号GI:7227353もまた参考のこと)において「NMB2091」として開示される。血清群A[5]に一致する遺伝子は、GenBank登録番号7379093を有する。
【0028】
本発明に従って使用される場合、936タンパク質は種々の形態をとり得る。936の好ましい形態は、参考文献14〜16において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、936のN末端リーダーペプチドは、欠失され得(すなわち、株MC58における残基1〜23の欠失[配列番号4])、936(NL)を生じさせる。
【0029】
好ましい936配列は、配列番号4に対して、50%以上の同一性(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)を有する。これは改変体(例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など)を含む。
【0030】
他の好ましい936配列は、配列番号4由来の少なくともnの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでnは7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である。好ましいフラグメントは、936由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号4のC末端および/またはN末端からの一以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)を欠失する。
【0031】
(953タンパク質)
血清群B由来の「953」タンパク質は、参考文献10(配列番号2917および2918)において開示され、参考文献6(GenBank登録番号GI:7226269もまた参照のこと)において「NMB1030」として開示される。血清群A[5]に一致するタンパク質は、GenBank登録番号7380108を有する。
【0032】
本発明に従って使用される場合、953タンパク質は種々の形態をとり得る。953の好ましい形態は、参考文献14〜16において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、953のN末端リーダーペプチドは、欠失され得(すなわち、株MC58について残基1〜19の欠失[配列番号5])、953(NL)を生じさせる。
【0033】
好ましい953配列は、配列番号5に対して、50%以上の同一性(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)を有する。これは、953改変体(例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、改変体など)を含む。953の対立遺伝子変異体は、参考文献12の図19において見られ得る。
【0034】
他の好ましい953配列は、配列番号5由来の少なくともnの連続するアミノ酸を含むのであって、ここでnは7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である。好ましいフラグメントは、953由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号5のC末端および/またはNからの一以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)を欠失する。
【0035】
(287タンパク質)
血清群B由来の「287」タンパク質は、参考文献10(配列番号3103および3104)において開示され、参考文献6において「NMB2132」として開示され、そして参考文献13(GenBank登録番号GI:7227388もまた参照のこと)において「GNA2132」として開示される。血清群A[5]に一致するタンパク質は、GenBank登録番号7379057を有する。
【0036】
本発明に従って使用される場合、287タンパク質は種々の形態をとり得る。287の好ましい形態は、参考文献14〜16において開示される改変体のような、切断改変体または欠失改変体である。特に、287のN末端は、このポリグリシン配列まで欠失され得(例えば、株MC58における残基1〜24の欠失[配列番号6])、これは、時折本明細書中で、「ΔG」の接頭語の使用により区別される。この欠失は発現を上昇させ得る。
【0037】
好ましい287配列は、配列番号6に対して、50%以上の同一性(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)を有する。これは、287改変体(例えば、対立遺伝子変異体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など)を含む。287の対立遺伝子形態は、参考文献12の図5および図15において見られ得、そして参考文献10(配列番号3179〜3184)の実施例13および図21において見られ得る。
【0038】
他の好ましい287配列は、配列番号6由来の少なくともnの連続するアミノ酸を含み、ここでnは7以上(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)である。好ましいフラグメントは、287由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号6のC末端および/またはN末端由来の一以上のアミノ酸(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25以上)を欠失する。
【0039】
(融合タンパク質)
5つの抗原は、5つの別個のタンパク質として組成物内に存在し得るが、この抗原のうちの少なくとも二つが単一ポリペプチド鎖(「ハイブリッド」タンパク質(参考文献14〜16))として発現され、その結果、例えば、5つの抗原が5未満のポリペプチドを形成することが好ましい。ハイブリッドタンパク質は、二つの主要な利点を提供する:第一に、そのままでは、不安定または不十分に発現され得るタンパク質は、適したハイブリッドパートナーを付加することによって補助され得、この問題を克服する;第二に、営業生産は、たった一つの発現として単純化され、そして精製は、二つの別個に有用なタンパク質を作製するために用いられることが必要である。
【0040】
本発明の組成物に含有されるハイブリッドタンパク質は、5つの基本抗原のうちの二つ以上(すなわち、2、3、4または5)を含み得る。5つの基本抗原のうちの二つからなるハイブリッドが好ましい。
【0041】
5つの基本抗原の組合わせ内で、抗原は、一より多いハイブリッドタンパク質内に存在し得、そして/または非ハイブリッドタンパク質として存在し得る。しかしながら、抗原は、ハイブリッドとしてかまたは非ハイブリッドとしてのいずれかで示され、その両方では示されないことが好ましいが、一方で抗原は、ハイブリッド抗原として、および非ハイブリッド(好ましくは、リポタンパク質)抗原としての両方で、タンパク質741を含むことが有用であり得、その際、特に、741のうちの一より多くの改変体が使用される。
【0042】
本発明における使用について、二抗原ハイブリッドは以下のものを含む:NadAおよび741;NadAおよび936;NadAおよび953;NadAおよび287;741および936;741および953;741および287;936および953;936および287;953および287。好ましい二抗原ハイブリッドは以下のものを含む:741および936;953および287。
【0043】
ハイブリッドタンパク質は、式NH−A−[−X−L−]−B−COOHにより表され得るのであって、ここで:Xは5つの基本抗原のうちの一つのアミノ酸配列であり;Lは任意のリンカーアミノ酸配列であり;Aは任意のN末端アミノ酸配列であり;Bは任意のC末端アミノ酸配列であり;そしてnは2、3、4、または5である。
【0044】
−X−部分が、野生型形態において、リーダーペプチド配列を有する場合、これはハイブリッドタンパク質において含まれ得るか、または除かれ得る。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のN末端に位置する−X−部分のリーダーペプチドを除いて、欠失される(すなわち、Xのリーダーペプチドは保持されるが、X〜Xのリーダーペプチドは除かれる)。これは、全てのリーダーペプチドの欠失に相当し、そしてXのリーダーペプチドを部分−A−としての使用に相当する。
【0045】
[−X−L−]の各nの場合、リンカーアミノ酸配列−L−は、存在し得るかまたは非存在であり得る。例えば、n=2の場合、ハイブリッドは、NH−X−L−X−L−COOH、NH−X−X−COOH、NH−X−L−X−COOH、NH−X−X−L−COOHなどである。リンカーアミノ酸配列−L−は、代表的に短い(例えば、20以下のアミノ酸、すなわち、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。実施例は、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー(すなわち、n=2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のGlyを含むこと)、およびヒスチジンタグ(すなわち、n=3、4、5、6、7、8、9、10以上のHis)を含む。他の適したリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、GSGGGG(配列番号9)であり、Gly−SerジペプチドがBamHI制限酵素認識部位から形成され、従ってクローニングと操作を補助し、そして(Gly)テトラペプチドは代表的なポリグリシンリンカーである。Xn+1がΔGタンパク質であり、Lがグリシンリンカーである場合、これは、Xn+1がΔGタンパク質なく、Lは欠失していることに相当する。
【0046】
−A−は任意のN末端アミノ酸配列である。これは代表的に短い(例えば、40以下のアミノ酸、すなわち、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。実施例は、タンパク質輸送を方向付けるための配列、またはクローニングおよび精製を容易にする短いペプチド配列(例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、n=3、4、5、6、7、8、9、10以上のHis)を含む。他の適したN末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Xがそれ自体のN末端のメチオニンを欠失している場合、好ましくは、−A−は、(例えば、1つの、2つの、3つの、4つの、5つの、6つの、7つの、または8つのアミノ酸を有する)オリゴペプチドであり、N末端のメチオニンを提供する。
【0047】
−B−は任意のC末端アミノ酸配列である。これは代表的に短い(例えば、40以下のアミノ酸、すなわち、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。実施例は、タンパク質輸送を方向付けるための配列、クローニングおよび精製を容易にする短いペプチド配列(例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、n=3、4、5、6、7、8、9、10以上の場合のHis)、またはタンパク質安定性を増強する配列を含む。他の適したC末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【0048】
最も好ましくは、nは2である。この型の二つの好ましいタンパク質は以下である:Xは936であり、Xは741である;Xは287であり、Xは953である。
【0049】
本発明の二つの特に好ましいハイブリッドタンパク質は、以下である:
【0050】
【表1】

これら二つのタンパク質は、NadAとの(特に、配列番号2との)組合わせで使用され得る。
【0051】
好都合なことに、936−ΔG741ハイブリッドは、以下の工程を包含するプロセスによって、E.coliでの発現から、高純度で調製され得る:均質化工程;遠心分離工程;陽イオンカラムクロマトグラフィー工程;陰イオンカラムクロマトグラフィー工程;疎水性カラムクロマトグラフィー工程;緩衝液に対するダイアフィルトレーション工程;および濾過滅菌工程。このプロセスのさらなる詳細は、実施例において示される。
【0052】
(配列)
本発明は、配列番号1〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。本発明はまた、配列番号1〜8からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。上記に記載されるように、好ましくは、配列同一性の程度は、50%より大きい(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)。
【0053】
本発明はまた、N.meningitidisのNadA配列のフラグメントを含むポリペプチドを提供するのであって、ここで上記フラグメントは、NadAがヒト上皮細胞に接着する能力を保持する。従って、全長NadAのアミノ酸24〜87を保持するフラグメントは好ましい。好ましいフラグメントは、上記NadAのN末端リーダーペプチドおよび/または上記NadAのC末端膜アンカードメインを欠失する。本発明は、この範囲において、先行技術(例えば、参考文献6〜18)において開示される、いかなるNadAフラグメントをも含まない。全長NadA[17]に関して、配列番号1は、膜アンカードメインを欠失し、そして配列番号2はリーダーペプチドを欠失する。
【0054】
本発明はまた、このようなポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、この核酸に対して、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下で(例えば、65℃、0.1xSSC、0.5%SDS溶液で)、ハイブリダイズし得る核酸を提供する。
【0055】
本発明のポリペプチドは、種々の手段(例えば、組換え発現手段、細胞培養からの精製手段、化学合成(少なくとも部分的に)手段など)で調製され得、そして種々の形態(例えば、天然の形態、融合形態、非グリコシル化形態、脂質付加形態など)で調製され得る。好ましくは、これらは、実質的に純粋形態で調製される(すなわち、実質的に、他のN.meningitidisまたは宿主細胞タンパク質と無関係)。
【0056】
本発明に従う核酸は、多くの方法(例えば、化学合成による方法(少なくとも部分的に)、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーによる方法、生物体それ自身からの方法など)で調製され得、種々の形態(例えば、一本鎖形態、二本鎖形態、ベクター形態、プローブ形態など)をとり得る。好ましくは、これらは、実質的に純粋な形態で調製される(すなわち、実質的に、他のN.meningitidisまたは宿主細胞核酸と無関係)。
【0057】
用語「核酸」は、DNAおよびRNA、これらの類似体(修飾された骨格(例えば、ホスホロチオネートなど)、およびペプチド核酸(PNA)も含む類似体など)を含む。本発明は、上記に記載される(例えば、アンチセンスまたは探索目的のための)核酸に対して相補的な配列を含む核酸を含む。
【0058】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを作製するためのプロセスを提供し、ポリペプチド発現を誘導する条件下で、本発明の核酸を用いて形質転換された宿主細胞を培養する工程を包含する。
【0059】
本発明は、本発明のポリペプチドを作製するためのプロセスを提供し、化学的手段によってポリペプチドの少なくとも一つを合成する工程を包含する。
【0060】
本発明は、本発明の核酸を作製するためのプロセスを提供し、プライマーに基づく増幅方法(例えば、PCR)を用いて、核酸を増幅する工程を包含する。
【0061】
本発明は、本発明の核酸を作製するためのプロセスを提供し、化学的手段によって核酸の少なくとも一部を合成する工程を包含する。
【0062】
(株)
本発明の好ましいタンパク質は、N.meningitidis血清群Bにおいて見られるアミノ酸配列を含む。血清群B内の好ましい株は、2996、MC58、95N477、および394/98である。394/98は、ニュージーランド株であることから、時折、本明細書中で「NZ」として言及される。
【0063】
タンパク質287は、好ましくは、株2996由来であり、または、より好ましくは、株394/98由来である。
【0064】
タンパク質741は、好ましくは、血清群B株MC58、血清群B株2996、血清群B株394/98、または血清群B株95N477由来であり、あるいは血清群C株90/18311由来である。株MC58はより好ましい。
【0065】
好ましくは、タンパク質936、タンパク質953、およびタンパク質NadAは、株2996由来である。
【0066】
株は、下付き添え字として示され得、例えば、741MC58は、株MC58由来のタンパク質741である。別段記載されない限り、本明細書中で言及されるタンパク質(例えば、下付き添え字のないタンパク質)は、N.meningitidis株2996由来であり、「参照」株としてみなされ得る。しかしながら、本発明は、概して、株によって限定されないことは、理解される。上記に記載されるように、タンパク質(例えば、「287」、「919」など)に対する一般的参照は、任意の株由来のタンパク質を含むと捉えられる。これは、代表的に、2996に対して、90%以上(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列同一性を有する。
【0067】
組成物が特定のタンパク質抗原(例えば、741または287)を含有する場合、この組成物は、一より多い変異体形態(例えば、同一タンパク質)内の抗原を含有し得るが、一より多くの株由来の抗原を含有し得る。これらのタンパク質は、直列型タンパク質または分離型タンパク質として含まれ得る。
【0068】
ハイブリッドタンパク質が使用される場合、ハイブリッド内の個々の抗原(すなわち、個々の−X−部分)は、一以上の株由来であり得る。例えば、n=2の場合、Xは、Xと同一の株由来であり得るか、または異なる株由来であり得る。n=3の場合、株は(i)X=X=X(ii)X=X≠X(iii)X≠X=X(iv)X≠X≠Xまたは(v)X=X≠Xなどであり得る。
【0069】
(高毒性系統および殺菌性抗体応答)
概して、本発明の組成物は、被験体に投与後、血清殺菌性抗体応答を誘導し得る。好都合なことに、これらの応答は、マウスにおいて測定され、ワクチン効力の標準指標である[例えば、参考文献13の巻末の注14を参照のこと]。血清殺菌性活性(SBA)は、補体によって仲介される細菌殺傷を測定し、ヒト補体または子ウサギ補体を使用してアッセイされ得る。WHO標準は、90%より多くのレシピエントにおけるSBAにおいて、少なくとも4倍の上昇を誘導するワクチンを必要とする。
【0070】
狭い範囲の防御の提供よりむしろ、本発明の組成物は、血清群Bの一より多くの高毒性系統に対して、殺菌性抗体応答を誘導し得る。特に、これら組成物は、以下の三つの高毒性系統のうちの二つまたは三つに対して殺菌性抗体応答を誘導し得る:(i)クラスターA4;(ii)ET5複合体;および(iii)系統3。さらに、これら組成物は、一以上の高毒性系統血清群I、血清群III、血清群IV−1、またはET−37複合体に対して殺菌性抗体応答を誘導し得、そして他の系統(例えば、高侵襲性系統)に対して殺菌性抗体応答を誘導し得る。
【0071】
これは、必ずしも、この組成物が、これら高毒性系統内の血清群B髄膜炎菌の各株およびあらゆる株に対し、殺菌性抗体を誘導し得ることを意味するのではなく、例えば、特定の高毒性系統内の血清群B髄膜炎菌のより多くの株うち所望の四つの群について、この組成物によって誘導される抗体は、この群のうちの少なくとも50%(例えば、60%、70%、80%、90%以上)に対して殺菌性である。株の好ましい群は、以下の国うちの少なくとも四つにおいて単離される株を含む:GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR、およびCU。好ましくは、血清は、少なくとも1024の殺菌性力価(例えば、210、211、212、213、214、215、216、217、218以上、好ましくは、少なくとも214)を有する(すなわち、この血清は、参考文献13に記載されるように、1/1024に希釈される場合、特定の株の試験細菌のうちの少なくとも50%を殺傷し得る)。
【0072】
好ましい組成物は、血清群B髄膜炎菌の以下の株に対して殺菌性応答を誘導し得る:(i)クラスターA4由来の株961−5945(B:2b:P1.21,16)および/または株G2136(B:−);(ii)ET−5複合体由来の株MC58(B:15:P1.7,16b)および/または株44/76(B:15:P1.7,16);(iii)系統3由来の株394/98(B:4:P1.4)および/または株BZ198(B:NT:−)。より好ましい組成物は、株961−5945、株44/76、および株394/98に対し、殺菌性応答を誘導し得る。
【0073】
株961−5945および株G2136は、ともにNeisseria MLST参照株[参考文献22におけるid 638および1002]である。株MC58は広く入手可能であり(例えば、ATCC BAA−335)、参考文献6において配列決定された株であった。株44/76は広く使用され、そして特徴付けられており(例えば、参考文献23)、これは、Neisseria MLST参考株の一つである[参考文献22におけるid 237;参考文献1における表2の32行目]。株394/98は、もともとは1998年にニュージーランドにおいて単離され、この株を使用したいくつかの発表された研究(例えば、参考文献24および25)がある。株BZ198は、別のMLST参考株である[参考文献22におけるid 409;参考文献1における表2の41行目]。
【0074】
さらに組成物は、ET−37複合体由来の血清群W135株LNP17592(W135:2a:P1.5,2)に対して殺傷性応答を誘導し得る。これは、2000年にフランスで単離されたHaji株である。
【0075】
(異種宿主)
本発明のタンパク質の発現はNeisseriaにおいて起こり得るが、本発明は、好ましくは、異種宿主を利用する。この異種宿主は、原核生物(例えば、細菌)または真核生物であり得る。それは、好ましくは、E.coliであるが、他の適した宿主は、Bacillus subtilis、Vibrio cholerae、Salmonella typhi、Salmonella typhimurium、Neisseria lactamica、Neisseria cinerea、Mycobacteria(例えば、M.tuberculosis)、酵母などを含む。
【0076】
従って、本発明は、被験体に投与後、この被験体内において抗体応答を誘導し得る組成物を提供する。この抗体応答は、N.meningitidis血清群Bの高毒性系統A4、ET−5および系統3のうちの2以上(例えば、2または3)に対して殺菌性であって、この抗体応答を起こす組成物の免疫原は、非ナイセリア宿主における組換え発現によって得られる。従って、本発明の組成物における免疫原は、好ましくは、組換え免疫原である。従って、OMV調製物を含有しない組成物が好ましくあり得る。
【0077】
(免疫原性組成物および免疫原性医薬)
本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明に従ったワクチンは、予防的(すなわち、感染を防ぐため)、または治療的(すなわち、感染の処置のため)のいずれかであり得るが、代表的には予防的である。
【0078】
この組成物のpHは、好ましくは6と8との間であり、好ましくは約7である。安定なpHは緩衝液の使用によって維持され得る。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい[26]。この組成物は滅菌されていても発熱物質を含有しなくてもよい。本発明の組成物は、ヒトに対して等張性であり得る。
【0079】
組成物は、バイアルで提供され得るか、または事前充填シリンジで提供され得る。このシリンジは、針ありか、または針なしで提供され得る。シリンジは、この組成物の単回用量を含むのに対して、バイアルは単回用量または複数回用量を含み得る。注射用の組成物は、通常、液体溶液または懸濁液である。あるいは、それらは、注射前に、溶液または液体溶媒における懸濁液のために、固形形態(例えば、凍結乾燥)で提供され得る。
【0080】
本発明の組成物は、単回用量形態で、または複数回用量形態でパッケージされ得る。複数回用量形態については、事前充填シリンジよりバイアルが好ましい。有効的投薬量は、慣例的に確立され得るが、注入するための組成物の代表的なヒトの用量は、0.5mlの量である。
【0081】
本発明の組成物が、使用前に、準備なしで調製され(例えば、成分が、凍結乾燥形態で提供される場合)、そしてキットとして提供される場合、このキットは二つのバイアルを含み得るか、または、キットは、シリンジの内容物が、注入前にバイアルの内容物を再活性化するために使用されるようにして、一つの事前充填シリンジおよび一つのバイアルを含み得る。
【0082】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の組成物を提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を起こし得(すなわち、それは、免疫原性組成物)、より好ましくは、ワクチンである。
【0083】
本発明はまた、哺乳動物で免疫応答を起こすための医薬の製造における本発明の組成物の使用を提供する。本発明はまた、哺乳動物で免疫応答を起こすための医薬の製造における「NadA」タンパク質、「741」タンパク質、「936」タンパク質、「953」タンパク質、および「287」タンパク質(および他の任意の抗原)の使用を提供する。この医薬は、好ましくは、ワクチンである。
【0084】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を起こすための方法を提供し、この方法は、本発明の組成物の有効量を投与する工程を包含する。免疫応答は、好ましくは、防御性であり、そして好ましくは、抗体を含む。この方法は、追加免疫応答を起こし得る。
【0085】
哺乳動物は、好ましくは、ヒトである。ワクチンが予防的使用である場合、ヒトは、好ましくは、子供である(例えば、幼児または乳児);ワクチンが治療的使用である場合、ヒトは、好ましくは成人である。子供を対象としたワクチンは、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、成人に投与され得る。
【0086】
これらの使用および方法は、好ましくは、Neisseria(例えば、髄膜炎、敗血症、菌血症、淋病など)によって引き起こされる疾患の予防および/または処置のためである。細菌性髄膜炎または髄膜炎菌性髄膜炎の予防および/または処置が好ましい。
【0087】
治療的処置の効力を調べる一つの方法は、本発明の組成物を投与後、ナイセリア感染のモニタリングを含む。予防的処置の効力を調べる一つの方法は、組成物を投与後、5つの基本抗原に対する免疫応答のモニタリングを含む。本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体(例えば、子供12ヵ月〜16ヵ月、または動物モデル[27])にそれらを投与すること、次いで、全抗莢膜IgGおよび高結合性抗莢膜IgGの血清殺菌性抗体(SBA)およびELISA力価(GMT)を含める標準パラメータを決定することによって決定され得る。概して、これらの免疫応答は、組成物の投与後、約4週で決定され、この組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも4倍または8倍のSBA上昇が好ましい。一より多い用量の組成物が投与される場合、一より多い次の投与の決定がなされ得る。
【0088】
本発明の好ましい組成物は、容認できる割合のヒト被験体について、各抗原性成分に対する血清防御(seroprotection)の判定基準より優る患者に抗体力価を与え得る。宿主が抗原に対して血清変換されるとみなされる、上記の関連した抗体力価を有する抗原は周知であり、このような力価はWHOのような組織によって公開される。好ましくは、被験体の統計学的に有意性のあるサンプルのうちの80%より多くが血清変換され、より好ましくは、90%より多くが血清変換され、さらにより好ましくは、93%より多くが血清変換され、そして最も好ましくは96%〜100%が血清変換される。
【0089】
概して、本発明の組成物は、患者に直接投与される。直接送達は、非経口的注射(例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、または組織内腔への注射)によって成し遂げられ得るか、または経直腸投与、経口投与、経膣投与、局所的投与、経皮投与、鼻腔内投与、経眼投与、経耳投与、肺投与、または他の粘膜投与によって成し遂げられ得る。大腿または上腕への筋肉内注射が好ましい。注射は針(例えば、皮下注射針)を介し得るが、あるいは針なし注射も使用され得る。代表的な筋肉内注射用量は0.5mlである。
【0090】
本発明は全身免疫および/または粘膜免疫を誘発するために使用され得る。
【0091】
投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回用量は、一次免疫スケジュールおよび/または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。一次免疫用量スケジュールの後に追加免疫用量スケジュールが行われ得る。初回抗原刺激用量の間の適した期間(例えば、4〜16週間)、および初回抗原刺激と追加免疫の間の適した期間は、慣例的に決定され得る。
【0092】
Neisseriaの感染は身体の種々の領域に影響を及ぼす。そのため、本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能なように調製され得る。注射前に、液体ビヒクルにおける溶液または懸濁液に適した固形形態もまた、調製され得る(例えば、凍結乾燥組成物)。この組成物は、局所的投与のために、例えば、軟膏として、クリームとして、または粉末として、調製され得る。この組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤として、カプセルとして、または(必要に応じて、味のついた)シロップとして調製され得る。この組成物は、肺投与のために、例えば、微粉末または噴霧を利用しての吸入剤として、調製され得る。この組成物は、坐薬または腟坐薬として調製され得る。この組成物は、経鼻投与、経耳投与、経眼投与のために、例えば、噴霧、滴下、ゲル、粉末として調製され得る[例えば、参考文献28および29]。肺炎球菌の糖[30、31]、肺炎球菌のポリペプチド[32]、Hib糖[33]、MenC糖[34]、およびHIb糖およびMenC糖結合体[35]の混合物の経鼻投与についての成功が報告されている。
【0093】
ワクチンとして使用される免疫原性の組成物は、抗原、および必要に応じて、任意の他の成分の免疫学的有効量を含有する。「免疫学的有効量」によって、単回用量、または一連の用量の一部としてのいずれかにおいて、個体へのこの有効量の投与は、処置または予防において有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康状態と身体状態、年齢、処置される個体の分類群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、抗体を合成する個体の免疫系能力、要求される防御の程度、ワクチンの処方物、処置する医師による医学的状態評価、および他の関連要因次第で変動する。この量は、慣習的試行を通じて決定され得る比較的広い範囲に集合し、一用量当たりの代表的な各髄膜炎菌性糖抗原量は、1μgと20μgの間(例えば、約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg、または約10μg(糖として表示))であることが期待される。
【0094】
(組成物のさらなる非抗原成分)
本発明の組成物は、上記で言及される成分に加え、代表的に、一以上の「薬学的に許容可能なキャリア」を含有し、このキャリアは、それ自体が、この組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生を誘導しない、任意のキャリアを含有する。適したキャリアは、代表的には、大きく、ゆっくりと代謝される高分子(例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、ショ糖[36]、トレハロース[37]、ラクトース、および脂質凝集体(油滴またはリポソームなど))である。このようなキャリアは、当業者に周知である。ワクチンはまた、例えば、水、生理食塩水、グリセロールなどの希釈剤を含有する。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などのような補助物質が示され得る。滅菌の発熱物質を含まないリン酸緩衝化生理食塩水は、代表的なキャリアである。薬学的に許容可能な賦形剤の詳細な議論は、参考文献38において入手可能である。
【0095】
特に、複数回用量型式でパッケージされる場合、本発明の組成物は、抗菌剤を含有し得る。
【0096】
本発明の組成物は、界面活性剤(例えば、Tween 80のようなTween(ポリソルベート))を含有し得る。界面活性剤は、概して、低レベル(例えば、<0.01%)で存在する。
【0097】
本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩(例えば、塩化ナトリウム)を含有し得る。10±2mg/mlのNaCl濃度が代表的である。
【0098】
本発明の組成物は、概して、緩衝液を含有する。リン酸緩衝液が代表的である。
【0099】
本発明の組成物は、特に、この組成物が、凍結乾燥されている場合、または、凍結乾燥物質から再構成されている物質を含む場合、糖アルコール(例えば、マンニトール)または二糖(例えば、ショ糖またはトレハロース)を、例えば、約15〜30mg/ml(例えば、25mg/ml)で含有し得る。凍結乾燥のための組成物のpHは、凍結乾燥前に、約6.1に調整され得る。
【0100】
本発明のワクチンは、他の免疫調節性薬剤とともに投与され得る。特に、組成物は、通常、アジュバントを含有する。本発明の組成物に使用され得るアジュバントは、以下のものがあげられるが、これらに限定されない。
【0101】
(A.ミネラル含有組成物)
本発明においてアジュバントの使用に適したミネラル含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩のようなミネラル塩を含有する。本発明は、水酸化物(例えば、オキシヒドロキシド)、ホスフェート(例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート)、硫酸塩などのようなミネラル塩[例えば、参考文献39の第8章および第9章を参照のこと]、または異なるミネラル化合物の混合物を、この化合物が任意の適した形態(例えば、ゲル形態、結晶性形態、無定形形態など)をとる状態、および吸着が好ましい状態で含む。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る[40]。
【0102】
アルミニウムホスフェートは、特に、H.influenzae糖抗原を含有する組成物において、好ましく、そして代表的なアジュバントは、0.84と0.92の間のPO/Alのモル比で、かつ0.6mg Al3+/mlで含有される無定形なアルミニウムヒドロキシホスフェートである。アルミニウムホスフェートの低用量での吸着が使用され得る(例えば、一用量当たり一結合体当たり、50μgと100μgの間のAl3+)。組成物において一より多くの結合体がある場合、全ての結合体が、吸着に必要とは限らない。
【0103】
(B.油乳濁液)
本発明において、アジュバントとしての使用に適した油乳濁液組成物は、MF59[参考文献39の第10章;参考文献41も参照のこと](5%スクアレン、0.5%のTween 80、および0.5%のSpan 85をマイクロフリューダイザを使用して、μm未満の粒子に処方されるもの)のようなスクアレン−水乳濁液を含有する。完全フロイトアジュバント(CFA)および不完全フロイトアジュバント(IFA)もまた、使用され得る。
【0104】
(C.サポニン処方物[参考文献39の第22章])
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、ステロールグリコシド、およびトリテルペノイドグリコシドの異種な群であり、これは、広範な植物種の樹皮、葉、幹、根および花においてさえ、見出される。Quillaia saponaria Molina treeの樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Smilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)、およびSaponaria officianalis(soap root)から市販されている。サポニンアジュバント処方物は、精製された処方物(QS21など)および脂質処方物(例えば、ISCOM)を含有する。QS21は、StimulonTMとして市販される。
【0105】
サポニン組成物は、HPLCおよびRP−HPLCを利用して精製されている。これらの技術を利用して、特定の精製された画分は、同定されており、これらは、QS7、QS17、QS18、QS21、QH−A、QH−B、およびQH−Cを含める。好ましくは、サポニンはQS21である。QS21の作製方法は、参考文献42において開示される。サポニン処方物はまた、コレステロールのようなステロールを含有し得る[43]。
【0106】
サポニンとコレステロールの組合わせは、免疫賦活性複合体(ISCOM)と呼ばれる独特の粒子を形成するために使用され得る[参考文献39の第23章]。ISCOMはまた、代表的にホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質を含む。任意の公知のサポニンは、ISCOMにおいて使用され得る。好ましくは、ISCOMは、一以上のQuilA、QHAおよびQHCを含む。ISCOMは、さらに、参考文献43〜45において記載される。必要に応じて、ISCOMは、さらなる界面活性剤を含まない[46]。
【0107】
サポニンに基づくアジュバントの開発の概説は、参考文献47および48において見出され得る。
【0108】
(D.ビロゾームおよびウイルス様粒子)
ビロゾームおよびウイルス様粒子(VLP)はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、概して、必要に応じて、リン脂質とともに併用されるかまたは処方されるウイルス由来の一以上のタンパク質を含む。それらは、概して、非病原性、非複製性であり、概して、いかなる天然のウイルスゲノムを含まない。ウイルスのタンパク質は、組換え的に、全体のウイルスから精製され得、単離され得る。ビロゾームまたはVLPにおける使用に適したこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス(HAまたはNAなど)、B型肝炎ウイルス(例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNA−ファージ、Qβ−ファージ(コートタンパク質など)、GA−ファージ、fr−ファージ、AP205ファージ、およびTy(レトロトランスポゾンTyタンパク質p1など)由来のタンパク質を含む。VLPは、さらに参考文献49〜54において議論される。ビロゾームは、さらに、例えば、参考文献55において議論される。
【0109】
(E.細菌性派生体または微生物派生体)
本発明における使用に適したアジュバントは、細菌性派生体または微生物派生体(腸内細菌性リポ多糖(LPS)の無毒性派生体、脂質A派生体、免疫賦活性オリゴヌクレオチド毒素およびADP−リボシル化毒素、およびこの解毒性派生体など)を含む。
【0110】
LPSの無毒性派生体は、モノホスホリル脂質A(MPL)および3−O−脱アシル化MPL(3dMPL)を含む。3dMPLは、4アシル化鎖、5アシル化鎖または6アシル化鎖を有する3 脱O−アシル化モノホスホリル脂質Aの混合物である。3 脱O−アシル化モノホスホリル脂質Aの好ましい「小粒子」形態は参考文献56において開示される。このような3dMPLの「小粒子」は、十分に小さく、0.22μm膜を介して濾過滅菌され得る[56]。他の無毒性LPS派生体は、モノホスホリル脂質A擬態(アミノアルキルグルコサミニドホスフェート派生体など、例えば、RC−529)を含む[57、58]。
【0111】
脂質A派生体は、Escherichia coli(OM−174など)由来の脂質Aの派生体を含める。OM−174は、例えば、参考文献59および60に記載される。
【0112】
本発明におけるアジュバントとして使用に適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ(グアノシンへのリン酸結合により連結される非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列)を含むヌクレオチド配列を含む。回文構造配列またはポリ(dG)配列を含む二本鎖RNAおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫賦活性であることが示されている。
【0113】
CpG’は、ヌクレオチド修飾/類似物(ホスホロチオネート型修飾など)を含み得、そして二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献61、62および63は、可能な類似物置換(例えば、2’−デオキシ−7−デアザグアノシンでのグアノシンの置換)を開示する。CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、さらに、参考文献64〜69において議論される。
【0114】
CpG配列(モチーフGTCGTTまたはモチーフTTCGTTなど)はTLR9に結合され得る[70]。CpG配列は、Th1免疫応答(CpG−A ODNなど)の誘導に対し特異的であり得、またはB細胞応答(CpG−B ODN)の誘導に対し、より特異的であり得る。CpG−A ODNおよびCpG−B ODNは、参考文献71〜73において議論される。好ましくは、このCpGはCpG−A ODNである。
【0115】
好ましくは、CpGオリゴヌクレオチドは、5’末端が、受容体認識に接近できるように構築される。必要に応じて、二つのCpGオリゴヌクレオチド配列は、3’末端に付加され、「immunomer」を形成し得る。例えば、参考文献70および74〜76を参照のこと。
【0116】
細菌性ADP−リボシル化毒素およびこの解毒性派生体は、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質はE.coli(E.coli熱不安定性エンテロトキシン「LT」)、コレラ(「CT」)、または百日咳(「PT」)由来である。粘膜アジュバントとしての解毒性ADP−リボシル化毒素の使用は、参考文献77に記載され、非経口的アジュバントとしての使用は、参考文献78に記載される。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ホロ毒素の形態において、AサブユニットとBサブユニットの両方を含む。好ましくは、Aサブユニットは、解毒する変異を含む;好ましくは、Bサブユニットは、変異されてない。好ましくは、このアジュバントは、解毒されるLT変異(LT−K63、LT−R72、およびLT−G192など)である。アジュバントとしてのADP−リボシル化毒素およびこの解毒性派生体、特にLT−K63およびLT−R72の使用は、参考文献79〜86において見出され得る。数的なアミノ酸置換の参考は、好ましくは、参考文献87に示されるADP−リボシル化毒素のAサブユニットおよびBサブユニットの整列化に基づく(この全体が、本明細書中で参考として特に援用される)。
【0117】
(F.ヒト免疫調節物質)
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン(インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12[88]など[89])、インターフェロン(例えば、インターフェロン−γ)、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子など)が挙げられる。
【0118】
(G.生体付着剤および粘膜付着剤)
生体付着剤および粘膜付着剤もまた、本発明において、アジュバントとして使用され得る。適した生体付着剤としては、エステル化ヒアルロン酸微粒子[90]、または粘膜付着剤(ポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖体およびカルボキシメチルセルロースの交差結合性派生体など)が挙げられる。キトサンおよびこの派生体もまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る[91]。
【0119】
(H.微粒子)
微粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。ポリ(ラクチド共グリコリド)を有する生分解性でありかつ無毒性の物質(例えば、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど)から形成された微粒子(すなわち、直径が約100nm〜約150nmの粒子、より好ましくは、直径が約200〜約30μmの粒子、最も好ましくは、直径が約500nmから約10μmの粒子)が好ましく、必要に応じて、負電荷を帯びた表面を有するように(例えば、SDSで)処理されるか、または正電荷を帯びた表面を有するように(例えば、CTABのようなカチオン性界面活性剤で)処置される。
【0120】
(I.リポソーム(参考文献39の第13章および第14章))
アジュバントとしての使用に適したリポソームの処方物の例は、参考文献92〜94において記載される。
【0121】
(J.ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物)
本発明における使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる[95]。このような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性物質[96]、およびオクトキシノールのような少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性物質と組合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性物質またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性物質[97]が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される:ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(laureth 9)、ポリオキシエチレン−9−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−8−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−4−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−35−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−23−ラウリルエーテル。
【0122】
(K.ポリホスファゼン(PCPP))
PCPP処方物は、例えば、参考文献98および99に記載される。
【0123】
(L.ムラミルペプチド)
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ムラミル−L−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(nor−MDP)、およびN−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミンMTP−PE)が挙げられる。
【0124】
(M.イミダゾキノロン化合物)
本発明におけるアジュバントとしての使用に適したイミダゾキノロン化合物の例は、Imiquamodおよびこの類似体(例えば、「Resiquimod 3M」)を含み、さらに、参考文献100および101に記載される。
【0125】
本発明はまた、上記で確認された一以上のアジュバントの局面の組合わせを含む。例えば、以下のアジュバント組成物は、本発明で使用され得る:(1)サポニンおよび水中油乳濁液[102];(2)サポニン(例えば、QS21)+無毒性LPS派生体(例えば、3dMPL)[103];(3)サポニン(例えば、QS21)+無毒性LPS派生体(例えば、3dMPL)+コレステロール;(4)サポニン(例えば、QS21)+3dMPL+IL−12(必要に応じて+ステロール)[104];(5)例えば、QS21および/または水中油乳濁液との3dMPLの組合わせ[105];(6)10%のスクアラン、0.4%のTween 80TM、5%のプルロニック−ブロックポリマーL121、およびthr−MDPを含有し、μm未満の乳濁液へのマイクロ流動化されるか、またはより大きい粒子サイズの乳濁液を生成するためにボルテックスされるかいずれかによるSAF;(7)2%のスクアレン、0.2%のTween 80、およびモノホスホリ脂質(monophosphorylipid)A(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群由来の一以上の細菌性細胞壁成分を含むRibiTMアジュバントシステム(RAS)、(Ribi Immunochem)、好ましくはMPL+CWS(DetoxTM);および(8)一以上のミネラル塩(アルミニウム塩など)+LPSの無毒性派生体(3dMPLなど)。
【0126】
免疫賦活性薬剤として機能する他の物質は参考文献39の第7章において開示される。
【0127】
水酸化アルミニウムアジュバントの使用またはリン酸化アルミニウムアジュバントの使用が、特に好ましく、そして抗原は、概して、これらの塩に吸着される。この組成物がHib抗原を含有する場合、水酸化アルミニウムは、好ましくは、アジュバントとして回避される。アジュバントにリン酸化アルミニウムが使用され、かつ抗原がアジュバントに吸着しないことが望まれる場合、これは、溶液中に遊離型のリン酸イオンを含むことにより(例えば、リン酸緩衝液の使用により)支持される。吸着の防止はまた、抗原/アジュバントの混合する間、正しいpHを選択すること、アジュバントを、適切な電荷ゼロの点を有するアジュバントを選択すること、および組成物内の異なる抗原にとって適切な混合順序を選択することによって、成し遂げられ得る[106]。
【0128】
リン酸化カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。
【0129】
(さらなる抗原)
本発明の組成物は、5つの基本髄膜炎菌性タンパク質抗原を含有する。これらの組成物はまた、5つの基本抗原以外の髄膜炎菌性タンパク質抗原は含有し得ないにもかかわらず、さらなる抗原を含有し得る。封入用のさらなる抗原は、例えば、以下のものであり得る:
Haemophilus influenzae B由来の糖抗原。
【0130】
N.meningitidis血清群A、N.meningitidis血清群C、N.meningitidis血清群W135ならびに/またはN.meningitidis血清群Y由来の糖抗原(参考文献107に開示される血清群C由来のオリゴ糖または参考文献108のオリゴ糖など)。
【0131】
Streptococcus pneumoniae由来の糖抗原[例えば、155、156 157]。
【0132】
A型肝炎ウイルス由来の抗原(不活性化ウイルスなど)[例えば、109、110]。
【0133】
B型肝炎ウイルス由来の抗原(表面抗原および/またはコア抗原など)[例えば、110、111]。
【0134】
ジフテリア抗原(ジフテリアトキソイドなど)[例えば、参考文献112の第3章](例えば、CRM197変異体[例えば、113])。
【0135】
破傷風抗原(破傷風トキソイドなど[例えば、参考文献112の第4章])。
【0136】
必要に応じて、またパータクチン(pertactin)および/または凝集原2および凝集原3との組合わせで、Bordetella pertussis由来の抗原(B.pertussis由来の百日咳ハロ毒素(PT)および線維状赤血球凝集素(FHA))[例えば、参考文献114および115]。細胞性百日咳抗原は使用され得る。
【0137】
N.meningitidis血清群B由来の外膜小胞(OMV)調製物(参考文献4、参考文献116、参考文献117、参考文献118などに開示される調製物など)
ポリオ抗原[例えば、119、120」(OPVまたは、好ましくはIPVなど)。
【0138】
この組成物は、一以上のこれらさらなる抗原を含有し得る。抗原は、毎回、代表的に、少なくとも1μg/mlの濃度で示される。概して、あらゆる特定の抗原のこの濃度は、十分であり、この抗原に対する免疫応答を誘発する。実際の免疫原性(例えば、ELISA力価)は減少し得るにもかかわらず、個々の糖抗原の防御効果が、これらの結合によって除去されないことが好ましい。
【0139】
ジフテリア抗原がこの組成物に含有される場合、破傷風抗原および百日咳抗原を含有することもまた、好ましい。同様に、破傷風抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含有することもまた、好ましい。同様に、百日咳抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含有することもまた、好ましい。このようなDTP組合わせは、凍結乾燥された結合体の再構成に使用され得る。
【0140】
糖抗原または炭水化物抗原が使用される場合、この抗原は、好ましくは、免疫原性を増強するためにキャリアタンパク質に結合される(以下を参照のこと)。
【0141】
有毒性タンパク質抗原は、必要に応じて、解毒され得る(例えば、化学的手法および/または遺伝子的手法による百日咳毒素の解毒[115])。
【0142】
本発明の組成物において、タンパク質抗原を使用する別の方法として、この抗原をコードする核酸が使用され得る[例えば、参考文献121〜129]。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、このタンパク質をコードする核酸(好ましくは、DNA、例えば、プラスミド形態のDNA)によって取って代わり得る。同様に、本発明の組成物は、糖抗原を模倣するタンパク質(例えば、ミモトープ(mimotope)[130]または抗イディオタイプ抗体)を含有し得る。これらは、個々の糖成分を取って代わり得るか、または個々の糖成分を追加し得る。例として、ワクチンは、糖それ自体の代わりに、MenC[131]莢膜多糖のペプチド擬態、またはMenA[132]莢膜多糖のペプチド擬態を含み得る。
【0143】
特に好ましい本発明の組成物は、以下の一つ、二つ、または三つを含有する:(a)髄膜炎菌血清群Y、髄膜炎菌血清群W135、髄膜炎菌血清群C、および(必要に応じて)髄膜炎菌血清群A由来の糖抗原;(b)Haemophilus influenzae
B型由来の糖抗原;ならびに/または(c)Streptococcus pneumoniae由来の抗原。血清群B抗原およびHib結合体を含有する組成物は、特に好ましい。
【0144】
(髄膜炎菌血清群Y、髄膜炎菌血清群W135、髄膜炎菌血清群Cおよび(必要に応じて)髄膜炎菌血清群A)
上記のように、血清群A、血清群C、血清群W135および血清群Yに対する多糖ワクチン、長年知られてきた。これらのワクチン(MENCEVAX ACWYTMおよびMENOMUNETM)は、生物の莢膜多糖に基づき、青年および成人において有効であるにもかかわらず、そしてそれらは、乏しい免疫応答および短期間防御を生じさせ、そしてそれらは、乳児において使用され得ない。
【0145】
これらのワクチンにおいて、結合されていない多糖抗原とは対照的に、最近認可された血清群Cワクチン(MenjugateTM[133、107]、MeningitecTMおよびNeisVac−CTM)は結合された糖を含有する。MenjugateTMおよびMeningitecTMは、CRM197キャリアに結合されたオリゴ糖抗原を有し、一方で、NeisVac−CTMは、破傷風トキソイドキャリアに結合された完全な多糖(脱O−アセチル化多糖)を使用する。
【0146】
本発明の組成物は、好ましくは、一以上の髄膜炎菌血清群Y、髄膜炎菌血清群W135、髄膜炎菌血清群Cおよび(必要に応じて)髄膜炎菌血清群A由来の莢膜糖抗原を含有する。ここでこの抗原はキャリアタンパク質に結合されるか、そして/または、オリゴ糖である。
【0147】
一用量当たりの各髄膜炎菌性糖の代表的量は、1μgと20μgの間(例えば、約1μg、約2.5μg、約4μg、約5μg、または約10μg(糖として表示))である。
【0148】
混合物が、血清群Aおよび血清群Cの両方由来の莢膜糖を含む場合、MenA糖:MenC糖の比(w/w)は、1より大きく(例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1以上)あり得る。混合物が、血清群Yならびに血清群Cおよび血清群W135の一方、あるいは両方の血清群Cおよび血清群W135に由来する莢膜糖を含む場合、MenY糖:MenW135糖の比(w/w)は、1より大きく(例えば、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1以上)あり得、そして/または、MenY糖:MenC糖の比(w/w)は、1より小さく(例えば、1:2、1:3、1:4、1:5未満)あり得る。血清群A由来の糖:血清群C由来の糖:血清群W135由来の糖:血清群Y由来の糖についての好ましい比(w/w)は、以下である:1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;および2:2:2:1。血清群C由来の糖:血清群W135由来の糖:血清群Y由来の糖についての好ましい比(w/w)は、以下である:1:1:1;1:1:2;1:1:1;2:1:1;4:2:1;2:1:2;4:1:2;2:2:1;および2:1:1。実質的に各糖の同等の質量を使用することが好ましい。
【0149】
莢膜糖は、概して、オリゴ糖形態で使用される。これらは、精製された莢膜多糖のフラグメント化によって(例えば、加水分解によって)、都合よく形成され、その後に、通常、所望のサイズのフラグメントの精製が続く。
【0150】
多糖のフラグメント化は、好ましくは、30より小さい(例えば、血清群Aについて10と20の間、好ましくは、約10;血清群W135および血清群Yについて15と25の間;好ましくは約15〜20;血清群Cについて12と22の間など)オリゴ糖において、最終的な平均重合度(DP)を生じさせることによって成し遂げられる。DPは、イオン交換クロマトグラフィーによってかまたは比色アッセイによって、都合よく測定され得る[134]。
【0151】
加水分解が行われる場合、この加水分解産物は、概して、短い長さのオリゴ糖を除去するために大きさで選別され(be sized)得る[135]。これは、種々の方法(限外濾過引き続くイオン交換クロマトグラフィーなど)において、成し遂げられ得る。好ましくは、血清群Aについて、約6以下の重合度を有するオリゴ糖は除去され、そして好ましくは、血清群W135および血清群Yについて、約4より少ない重合度を有するオリゴ糖は除去される。
【0152】
好ましいMenC糖抗原は、MenjugateTMにおいて使用されたように、参考文献133に開示される。
【0153】
この糖抗原は、化学的に修飾され得る。これは、特に、血清群Aの加水分解の減少に有用である[136;以下を参照のこと]。髄膜炎菌性糖の脱O−アセチル化が、行われ得る。修飾は、オリゴ糖については、脱重合の前または脱重合の後に起こり得る。
【0154】
本発明の組成物が、MenA糖抗原を含有する場合、この抗原は、好ましくは、修飾された糖であって、この修飾された糖はネイティブ糖の一以上のヒドロキシル基が、保護基によって置換されている[136]。この修飾は、加水分解に対する抵抗を改善し、血清群A抗原は、凍結乾燥を必要とするよりむしろ、液剤で、貯蔵および使用され得ることを意味する。
【0155】
保護基を有する単糖単位の数は、変動し得る。例えば、全単糖単位または実質的な全単糖単位は、保護基を有し得る。あるいは、単糖ユニットのうち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%は保護基を有し得る。少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30の単糖単位は、保護基を有し得る。
【0156】
同様に、単糖単位上の保護基の数は、変動し得る。例えば、単糖単位上の保護基の数は、1または2であり得る。この保護基は、概して、単糖単位の4位および/または3位である。
【0157】
末端の単糖単位は、天然のヒドロキシル基のあるいは保護基を有するかもしれないし、有さないかもしれない。さらなる反応(例えば、結合体化)のための柄を提供するため、末端の単糖単位上に遊離型アノマーのヒドロキシル基を保持することが好ましい。アノマーのヒドロキシル基は、還元的アミノ化(例えば、NaBHCN/NHClを使用する)によって、アミノ基(−NHまたは−NH−E、ここでEは窒素保護基である)に変換され得、次いで、他のヒドロキシル基が保護基に変換された後に、アノマーのヒドロキシル基は、再生され得る。
【0158】
ヒドロキシル基を置換する保護基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して(すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を別の基に置換することによって)、直接接触可能であり得る。保護基として働くヒドロキシル基の適した誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カルボネート、エステル、エーテル(例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル)、およびアセタールである。このような保護基のいくつかの特定の例は、アリル、Aloc、ベンジル、BOM、t−ブチル、トリチル、TBS、TBDPS、TES、TMS、TIPS、PMB、MEM、MOM、MTM、THPなどである。直接接触可能でなく、かつ完全にヒドロキシル基を置換する他の保護基は、C1−12アルキル、C3−12アルキル、C5−12アリール、C5−12アリール−C1−6アルキル、NR(RおよびRは以下の段落で規定される)、H、F、Cl、Br、COH、CO(C1−6アルキル)、CN、CF、CClなどを含む。好ましい保護基は電子吸引性基である。
【0159】
好ましい保護基は、式:−O−X−Yまたは−ORのものであって、ここで:XはC(O)、S(O)、またはSOであり;YはC1−12アルキル、C1−12アルコキシ、C3−12シクロアルキル、C5−12アリール、またはC5−12アリール−C1−6アルキルであり、これらの各々は、必要に応じて、F、Cl、Br、COH、CO(C1−6アルキル)、CN、CF、またはCClから独立的に選択される1つ、2つ、または3つの基で置換され得るか;あるいは、YはNRであり;RおよびRは、H、C1−12アルキル、C3−12シクロアルキル、C5−12アリール、C5−12アリール−C1−6アルキルから独立的に選択されるか;あるいはRおよびRは結合され、C3−12飽和複素環式基を形成し得;RはC1−12アルキルまたはC3−12シクロアルキルであり、これらのそれぞれは、必要に応じて、F、Cl、Br、CO(C1−6アルキル)、CN、CF、またはCClから独立的に選択される1つ、2つ、または3つの基で置換され得るか;あるいはRは、C5−12アリールまたはC5−12アリール−C1−6アルキルであり、これらのそれぞれが、必要に応じて、F、Cl、Br、COH、CO(C1−6アルキル)、CN、CFまたはCClから選択される1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの基で置換され得る。RがC1−12アルキルまたはC3−12シクロアルキルである場合、それは代表的に、上記で規定されるような1つ、2つ、または3つの基で置換される。RおよびRが結合され、C3−12飽和複素環式基を形成する場合、それは、窒素原子とともに、RおよびRが、3と12の間の任意の数の炭素原子(例えば、C、C、C、C、C、C、C、C10、C11、C12)を含む飽和複素環式基を形成することを意味する。この複素環式基は、上記窒素原子以外の1つまたは2つのヘテロ原子(N、O、またはSなど)を含み得る。C3−12飽和複素環式基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニル、およびアジリジニルである。
【0160】
保護基−O−X−Yおよび−ORは、標準的な誘導体化手順(ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化スルホニルなどとのヒドロキシル基の反応など)によって、−OH基から調製され得る。従って、−O−X−Yにおける酸素原子は、好ましくは、ヒドロキシル基の酸素原子であり、一方、−O−X−Yにおける−X−Y基は、好ましくは、ヒドロキシル基の水素原子を置換する。
【0161】
あるいは、この保護基は、置換反応(ミツノブ(Mitsonobu)型置換など)を介して、直接接触可能であり得る。ヒドロキシル基から保護基を調製する、これらの方法および他の方法は周知である。
【0162】
より好ましくは、保護基は、−OC(O)CF[137]、またはカルバメート基−OC(O)NRであって、ここでRおよびRは、C1−6アルキルから独立に選択される。より好ましくは、RおよびRは両方ともメチルである(すなわち、保護基は−OC(O)NMeである)。カルバメート保護基は、グリコシド結合に対して安定化効果を有し、穏やかな条件下で調製され得る。
【0163】
好ましい、修飾されるMenA糖は、n個の単糖単位を含み、単糖単位のうちの少なくともh%は3位および4位の両方に−OH基を有さない。hの値は24以上(例えば、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、99、または100)であり、好ましくは、50以上である。非存在の−OH基は、好ましくは、上記で規定されるような保護基である。
【0164】
他の好ましい修飾されるMenA糖は、単糖単位を含むのであって、ここで単糖単位のうちの少なくともsは、3位に−OHを有さず、そして4位にも−OHを有さない。sの値は、少なくとも1(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90)である。非存在の−OH基は、好ましくは、上記で規定されるように、保護基である。
【0165】
本発明の使用に適した修飾されるMenA糖は、以下の式を有する:
【0166】
【化1】

nは1〜100の整数(好ましくは、15〜25の整数)であり;
Tは式(A)または式(B)であって:
【0167】
【化2】

ここで各Z基は、独立して、上記で規定されるようなOHまたは保護基から選択され;そして
各Q基は、独立して、上記で規定されるようなOHまたは保護基から選択され;
Yは、OHまたは上記で規定されるような保護基から選択され;
Eは、Hまたは窒素保護基であり;
そして、ここでQ基のうち約7%よい多く(例えば、8%、9%、10%以上)は保護基である。
【0168】
各n+2のZ基は、相互に同一または異なり得る。同様に、各n+2のQ基は、相互に同一または異なり得る。全てのZ基はOHであり得る。あるいは、Z基のうち少なくとも、10%、20%、30%、40%、50%または60%はOAcであり得る。好ましくは、Z基の約70%はOAcであり、Z基の残部は上記で規定されるようなOHまたは保護基である。Q基のうち少なくとも約7%は保護基である。好ましくは、Q基のうち、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%でさえ、保護基である。
【0169】
好ましい本発明の組成物は、37℃で28日間にわたり貯蔵され得、そしてこの期間後、結合されるMenA糖の初期全体量のうちのf%未満は非結合体であって、ここでfは、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5であるか、またはそれより小さい。
【0170】
髄膜炎菌性莢膜多糖は、代表的に、(例えば、陽イオン性界面活性剤を用いた)多糖沈殿、エタノール分画、(タンパク除去のための)冷フェノール抽出、および(LPS除去のための)超遠心の工程を包含するプロセスによって調製される[例えば、参考文献138]。しかしながら、より好ましいプロセス[108]は、多糖沈殿後に続く低級アルコールを用いる沈殿した多糖の可溶化を包含する。沈殿は、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩(例えば、臭化塩)、または臭化ヘキサジメチリン塩およびミリスチルトリメチルアンモニウム塩のような陽イオン性界面活性剤を使用して成し遂げられ得る。臭化セチルトリメチルアンモニウム(「CTAB」)は特に好ましい[139]。沈殿した物質の可溶化は、低級アルコール(メタノール、プロパン−1−オール、プロパン−2−オール、ブタン−1−オール、ブタン−2−オール、2−メチル−プロパン−1−オール、2−メチル−プロパン−2−オール、ジオールなど)の使用により成し遂げられ得るが、しかし、エタノールは、CTAB−多糖複合体の可溶化に特に適している。エタノールは、好ましくは、50%と95%の間の終濃度(エタノールおよび水の全体量をベースとして)を与えるように、沈殿した多糖に加えられる。
【0171】
再可溶化後、この多糖はさらに、夾雑物を除去するためにさらに処理され得る。これは、微量な夾雑物ですら、許容されない状況(例えば、ヒトワクチン作製のため)において、特に重要である。これは、代表的に、濾過(例えば、デプス濾過、活性炭を通じた濾過、サイズ濾過および/または限外濾過)の一以上の工程を包含する。一旦夾雑物を除去するために濾過されると、多糖は、さらなる処理、および/またはプロセスのために沈殿され得る。これは、好都合なことに、陽イオン交換(例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加)によって成し遂げられ得る。
【0172】
精製に代わる手段として、本発明の莢膜糖は、全合成または部分合成によって得られ得る(例えば、Hib合成は参考文献140において開示され、MenA合成は参考文献141において開示される)。
【0173】
本発明の組成物は、N.meningitidisの少なくとも二つの血清群由来の莢膜糖を含有する。糖は、好ましくは、(任意の断片化、結合、修飾などを含めて)別々に調製され、次いで本発明の組成物を生じさせるために混合される。
【0174】
しかしながら、この組成物が、血清群A由来の莢膜糖を含有する場合、加水分解の可能性を最小限に抑えるために、血清群Aの糖は、使用直前まで、この他の糖に混合されないことが好ましい。これは、好都合なことに、使用準備が整った場合、液体成分が、この凍結乾燥MenA成分を再構成することに使用されるようにして、血清群A成分(代表的には適切な賦形剤とともに)を凍結乾燥形態にさせ、そして他の血清群成分(これもまた適切な賦形剤とともに)を液体形態にさせることによって、成し遂げられ得る。アルミニウム塩アジュバントが使用される場合、液体ワクチンを含むバイアル内にアジュバントを含むこと、およびMenA成分をアジュバントなしで凍結乾燥させることが好ましい。
【0175】
従って、本発明の組成物は、以下のものを含むキットから調製され得る:(a)凍結乾燥形態の、N.meningitidis血清群A由来の莢膜糖;および(b)液体形態の、この組成物由来のさらなる抗原。本発明はまた、本発明の組成物を調製する方法を提供するのであって、この方法は凍結乾燥されたN.meningitidis血清群A由来の莢膜糖をさらなる抗原と混合する工程を含み、ここで前記のさらなる抗原は液体形態である。
【0176】
本発明はまた、以下を含めるキットを提供する:(a)全ての凍結乾燥形態の、2以上のN.meningitidis血清群C、N.meningitidis血清群W135、およびN.meningitidis血清群Y由来の莢膜糖を含む第一の容器;ならびに(b)液体形態の(i)被験体に投与後、被験体内で抗体応答を誘導し得る組成物であって、この抗体応答は、高毒性系統A4、ET−5およびN.meningitidis血清群B系統3のうちの2以上(例えば2または3)に対して殺菌性である組成物、(ii)N.meningitidis血清群C、W135およびYのうち一つもないか、または一つ由来の莢膜糖、ならびに必要に応じて(iii)髄膜炎菌性莢膜糖を含まないさらなる抗原(以下を参照のこと)である、さらなる抗原、を含む第二の容器、ここで容器(b)の内容物による容器(a)の内容物の再構築は、本発明の組成物を提供する。
【0177】
各用量内で、個々の糖抗原の量は、概して、(糖の質量として測定して)1〜50μgの間になり、各抗原の約2.5μg、5μgまたは10μgが好ましい。従って、1:1:1:1;1:1:1:2;2:1:1:1;4:2:1:1;8:4:2:1;4:2:1:2;8:4:1:2;4:2:2:1;2:2:1:1;4:4:2:1;2:2:1:2;4:4:1:2;および2:2:2:1であるA:C:W135:Yの重量比で、図1によって表される量は、好ましくは、約2.5μg、5μgまたは10μgである。従って、1:1:1:1比のA:C:W:Yの組成物および一つの糖当たり10μgについては、40μgの糖が、一用量当たり投与される。好ましい組成物は、一用量当たり、およそ、以下のμgの糖を有する:
【0178】
【表2】

好ましい本発明の組成物は、一用量当たり、50μg未満の髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦40μgの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦30μgの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦25μgの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦20μgの髄膜炎菌性糖を含有する。他の好ましい組成物は、一用量当たり≦10μgの髄膜炎菌性糖を含有するが、しかし、理想的には、本発明の組成物は、一用量当たり少なくとも10μgの髄膜炎菌性糖を含有する。
【0179】
MenjugateTMおよびNeisVacTMのMenC結合体は、水酸化物アジュバントを使用し、一方MeningitecTMはリン酸塩を使用する。本発明の組成物内に、水酸化アルミニウムにいくつかの抗原を吸着する可能性はあるが、リン酸化アルミニウムに関連する他の抗原を有する可能性もある。例えば、四価の血清群の組合わせについては、以下の順列が利用可能である:
【0180】
【表3】

四価のN.meningitidis血清群の組合わせについては、以下の順列が利用可能である:
【0181】
【表4】

(Haemophilus influenzaeB型)
この組成物が、H.influenzaeB型抗原を含有する場合、それは、代表的に、Hib莢膜糖抗原である。H.influenzae b由来の糖抗原は周知である。
【0182】
有利に、Hib糖は、この免疫原性を増強するため、とりわけ子供において、キャリアタンパク質に共有結合される。概して、多糖結合体の調製、および特にHib莢膜多糖の調製は、よく実証される[例えば、参考文献142〜150など]。本発明は、任意のHib結合体を使用し得る。適したキャリアタンパク質は、以下に記載され、Hib糖にとっての好ましいキャリアはCRM197(「HbOC」)、破傷風トキソイド(「PRP−T」)およびN.meningitidisの外膜複合体(「PRP−OMP」)である。
【0183】
この結合体の糖部分は多糖であり得る(例えば、全長ポリリボシルリビトールホスフェート(PRP))が、しかしオリゴ糖(例えば、分子量約1〜約5kDa)を形成するために多糖を加水分解することは好ましい。
【0184】
好ましい結合体は、アジピン酸リンカーを介してCRM197に共役結合したHibオリゴ糖を含む[151、152]。破傷風トキソイドはまた、好ましいキャリアである。
【0185】
Hib抗原の投与は、好ましくは≧0.15μg/ml、およびより好ましくは≧1μg/mlの濃度の抗PRP抗体を生じる。
【0186】
本発明の組成物は、一より多くのHib抗原を含み得る。
【0187】
組成物が、Hib糖抗原を含有する場合、この組成物は水酸化アルミニウムアジュバントも含有しないことが好ましい。この組成物が、リン酸化アルミニウムアジュバントを含有する場合、Hib抗原はアジュバントに吸着され得るか[153]、またはHib抗原は吸着されなくてもよい[154]。
【0188】
Hib抗原は、(例えば、髄膜炎菌性抗原とともに)凍結乾燥され得る。
【0189】
(Streptococcus pneumoniae)
この組成物が、S.pneumoniae抗原を含有する場合、これは、代表的に、好ましくは、キャリアタンパク質に結合される莢膜糖抗原である[例えば、参考文献155〜177]。一より多くのS.pneumoniaeの血清型由来の糖を含有することが好ましい。例えば、23の異なる血清型由来の多糖混合物は広く使用される。なぜなら、5と11との間の異なる血清群由来の多糖との結合体化ワクチンであるからである[158]。例えば、PrevNarTM[159]は、各糖が還元的アミノ化によりCRM197に個々に結合される状態で、各糖が0.5mlの用量当たり2μg(4μgの血清型6B)で、かつ、結合体がリン酸化アルミニウムアジュバントに吸着される状態で、7つの血清型(4、6B、9V、14、18C、19Fおよび23F)由来の抗原を含む。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型6B、14、19Fおよび23Fを含有する。結合体は、リン酸化アルミニウム上に吸着され得る。
【0190】
肺炎球菌由来の糖抗原の使用に代わる手段として、この組成物は、一以上のポリペプチド抗原を含有し得る。肺炎球菌のいくつかの株のゲノム配列は入手可能であり[160、161]、ワクチン学を覆す対象となり[162〜165]、適したポリペプチド抗原を同定し得る[166、167]。例えば、この組成物は、以下の抗原のうち一以上を含有し得る:参考文献168で規定されるような、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp130。この組成物は、一より多く(例えば、2、3、4、5、6、7、8、910、11、12、13、または14)のこれら抗原を含み得る。
【0191】
いくつかの実施形態において、この組成物は、肺炎球菌由来の糖抗原およびポリペプチド抗原の両方を含有し得る。これらは、単純な混合で使用され得るか、または肺炎球菌の糖抗原は、肺炎球菌のタンパク質に結合され得る。このような実施形態にとって適したキャリアタンパク質は、前の段落において収載される抗原を含む[168]。
【0192】
肺炎球菌抗原は(例えば、肺炎球菌抗原および/またはHib抗原とともに)凍結乾燥され得る。
【0193】
(共有結合的結合)
本発明の組成物における莢膜糖は、通常、キャリアタンパク質に結合される。結合は、糖をT非依存性抗原からT依存性高原へ転換し、よって、免疫学的記憶のための初回抗原刺激を可能とすることから、一般に、結合は、糖の免疫原性を増強する。結合は、小児科ワクチンにとって特に有用であり、周知の技術である[例えば、参考文献169および142〜150で概説される]。
【0194】
好ましいキャリアタンパク質は、細菌性毒素または細菌性トキソイド(ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド)である。CRM197ジフテリアトキソイド[170〜172]は特に好ましい。他の適したキャリアタンパク質としては、N.meningitidis外膜タンパク質[173]、合成ペプチド[174、175]、熱ショックタンパク質[176、177]、百日咳タンパク質[178、179]、サイトカイン[180]、リンホカイン[180]、ホルモン[180]、増殖因子[180]、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトCD4T細胞エピトープを含む人工タンパク質[181]、H.influenzae由来のタンパク質D[182、183]、肺炎球菌の表面タンパク質PspA[184]、鉄取り込みタンパク質[185]、C.difficile由来の毒素A、または毒素B[186]などが挙げられる。好ましいキャリアは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、H.influenzaeタンパク質D、およびCRM197である。
【0195】
本発明の組成物内で、(例えば、キャリア抑制の危険を減少させるため)一より多くのキャリアタンパク質を使用することが好ましい。従って、異なるキャリアタンパク質は、異なる血清群に使用され得る(例えば、血清群Aの糖はCRM197に結合され得、一方で血清群Cの糖は破傷風トキソイドに結合され得る)。特定の糖抗原に一より多くのタンパク質を使用することもまた可能である(例えば、血清群Aの糖は、いくつかの糖がCRM197に結合され、他の糖が破傷風トキソイドに結合されるような二つの群であり得る)。しかしながら、概して、同一のキャリアタンパク質を全ての糖に使用することが好ましい。
【0196】
単一キャリアタンパク質は一より多くの糖抗原を保有し得る[187]。例えば、単一キャリアタンパク質は、そのキャリアタンパク質に結合された血清群Aおよび血清群C由来の糖を有し得る。この目的を成し遂げるため、糖は結合反応の前に混合され得る。しかしながら、概して、各血清群のための別個の結合体を有することが好ましい。
【0197】
1:5(すなわち、過剰のタンパク質)と5:1(すなわち、過剰の糖)の間の糖:タンパク質の比(w/w)での結合が好ましい。1:2と5:1の間の比が好ましく、1:1.25と1:2.5の比はより好ましい。過剰のキャリアタンパク質は、MenAおよびMenCについて好ましくあり得る。
【0198】
結合体は、遊離のキャリアタンパク質との結合において使用され得る[188]。ある所定のキャリアタンパク質が、本発明の組成物中に遊離型形態および結合体化形態の両方おいて存在する場合、非結合体化形態は、好ましくは、全体として、その組成物中のキャリアタンパク質の総量の5%以下であり、より好ましくは、2重量%以下で与える。
【0199】
任意の適した結合反応は、必要な場合、任意の適したリンカーとともに使用され得る。
【0200】
糖は、典型的に、結合の前に活性化されるか、または官能化される。例えば、活性化は、CDAP(例えば、1−シアノ−4−ジメチルアミノピリジウムテトラフルオロボレート[189、190など])のようなシアン化試薬を含む。他の適した技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、p−ニトロ安息香酸、N−ヒドロキシスクシンイミド、S−NHS、EDC、TSTUを使用する;参考文献148への序論をまた参照のこと)。
【0201】
リンカー基を介した連結は、任意の公知のプロセス(例えば、参考文献191および192に記載された手順)を利用して作られ得る。一つの型の連結は、多糖の還元的アミノ化、アジピン酸リンカー基の一端と、結果として生じるアミノ基とのカップリング、およびその後、アジピン酸リンカー基の他の一端へのタンパク質のカップリングを含む[146、193、194]。他のリンカーは、B−プロピオンアミド[195]、ニトロフェニル−エチルアミン[196]、ハロゲン化ハロアシル[197]、グリコシド結合[198]、6−アミノカプロン酸[199]、ADH[200]、C〜C12部分[201]などを含む。リンカーの使用に代わる手段として、直接的結合が使用され得る。そのタンパク質への直接的結合は、例えば、参考文献202および参考文献203に記載されるような多糖の酸化とその後のタンパク質との還元的アミノ化を含み得る。
【0202】
糖へのアミノ基の導入(例えば、−NHで末端=O基の交換による導入)およびその後のアジピン酸ジエステル(例えば、アジピン酸N−ヒドロキシスクシンイミドジエステル)での誘導化、ならびにキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスは、好ましい。別の好ましい反応は、プロテインDキャリア(例えば、MenAまたはMenCのためのキャリア)でのCDAP活性化を使用する。
【0203】
結合後、遊離型糖および結合体化糖は、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを包含する多くの適した方法がある[参考文献204および205などをまた参照のこと]。
【0204】
本発明の組成物が結合されたオリゴ糖を含有する場合、オリゴ糖の調製は結合に先行することが好ましい。
【0205】
(さらなるかつ代わりの血清群Bポリペプチド抗原)
本発明は、被験体に投与後、その被験体内において抗体反応を誘導し得る組成物であって、ここでその抗体反応は、高病原性系統A4、ET−5およびN.meningitidisの系統3のうちの二または三に対して殺菌性である組成物を提供する。
【0206】
NadA、741、936、953、および287は、この広範な防御を成し遂げるための好ましい抗原であるが、本発明の組成物(必要に応じて5つの基本抗原のうちの一以上との組合わせでの組成物)内に含有され得る他のMenBポリペプチド抗原は、以下のアミノ酸配列のうちの一つを含むものを含む:参考文献8由来の配列番号650;参考文献8由来の配列番号878;参考文献8由来の配列番号884;参考文献9由来の配列番号4;参考文献10由来の配列番号598;参考文献10由来の配列番号818;参考文献10由来の配列番号864;参考文献10由来の配列番号866;参考文献10由来の配列番号1196;参考文献10由来の配列番号1272;参考文献10由来の配列番号1274;参考文献10由来の配列番号1640;参考文献10由来の配列番号1788;参考文献10由来の配列番号2288;参考文献10由来の配列番号2466;参考文献10由来の配列番号2554;参考文献10由来の配列番号2576;参考文献10由来の配列番号2606;参考文献10由来の配列番号2608;参考文献10由来の配列番号2616;参考文献10由来の配列番号2668;参考文献10由来の配列番号2780;参考文献10由来の配列番号2932;参考文献10由来の配列番号2958;参考文献10由来の配列番号2970;参考文献10由来の配列番号2988、または(a)上記の配列に対して50%以上の同一性(例えば、60%、70%、80%、90%、95%、99%以上)を有する;そして/または(b)上記配列由来の少なくともnの継続的アミノ酸のフラグメントを含むのであって、ここでnは7より大きい(例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250以上)のアミノ酸配列を含むポリペプチド。(b)のための好ましいフラグメントは、関連する配列由来のエピトープを含む。これらのポリペプチドのうちの一より多く(例えば、2、3、4、5、6)が含まれ得る。
【0207】
(一般)
用語「「含む(comprising)」は、「含有する、含む(including)」および「構成する(consisting)」を意味し、例えば、Xを「含む」組成物は、もっぱらXから構成されるか、またはさらなる何か(例えば、X+Y)を含有し得る。
【0208】
数値xに関する用語「約(about)」は、例えば、x±10%を意味する。
【0209】
単語「実質的に(substantially)」は、「完全に(completely)」を除外せず、例えば、Yを「実質的に含まない(substantially free)」の組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、その単語「実質的に(substantially)」は、本発明の規定から除外され得る。
【0210】
二つのアミノ酸配列間の配列同一性割合の言及は、整列化された場合のアミノ酸のその割合が二つの配列を比較した際、同一であるアミノ酸の割合を意味する。この整列化および相同性パーセントまたは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェア・プログラム(例えば、参考文献206の第7.7.18章に記載されるソフトウェア・プログラム)を使用して決定され得る。好ましい整列化は、12のギャップオープンペナルティおよび2のギャップ伸長ペナルティを有するアフィンギャップ検索(62のBLOSUMマトリクス)を利用したSmith−Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。Smith−Waterman相同性検索アルゴリズムは、参考文献207において教示される。
【0211】
用語「アルキル」は、直鎖状形態および分枝状形態の両方のアルキル基に言及する。そのアルキル基は、−O−、−NH−または−S−から選択される1つ、2つ、または3つのヘテロ原子で割り込まれ得る。そのアルキル基はまた、1つ、2つ、または3つの二重結合または1つ、2つ、または3つの三重結合で割り込まれ得る。しかしながら、用語「アルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込み、あるいは二重結合または三重結合の割り込みを有さないアルキル基に言及する。言及がC1−12アルキルにされる場合、それは、アルキル基が1〜12の間の任意の数の炭素原子(例えば、C、C、C、C、C、C、C、C、C、C10、C11、C12)を含み得ることを意味する。同様に、言及がC1−6アルキルにされる場合、そのアルキル基は、1〜6の間の任意の数の炭素原子(例えば、C、C、C、C、C、C)を含み得ることを意味する。
【0212】
用語「シクロアルキル(cycloalkyl)」は、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、およびシクロアルケニル基、ならびにアルキル基とのこれらの組合わせ(シクロアルキルアルキル基など)を含む。そのシクロアルキル基は、−O−、−NH−または−S−から選択される1つ、2つ、3つのヘテロ原子で割り込まれ得る。しかしながら、用語「シクロアルキル」は、通常、ヘテロ原子の割り込みを有さないシクロアルキル基に言及する。シクロアルキル基の例は、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキシルメチル基、およびアダマンチル基を含む。言及がC3−12シクロアルキルにされる場合、それは、そのシクロアルキル基が、3〜12の間の任意の数の炭素原子(例えば、C、C、C、C、C、C、C、C10、C11、C12)を含み得ることを意味する。
【0213】
用語「アリール」は、芳香族基(フェニル、ナフチルなど)に言及する。言及がC5−12アリールにされる場合、それは、そのアリール基が、5〜12の間の任意の数の炭素原子(例えば、C、C、C、C、C、C10、C11、C12)を含み得ることを意味する。
【0214】
用語「C5−12アリール−C1−6アルキル」は、ベンジル、フェニルエチルおよびナフチルメチルのような基に言及する。
【0215】
窒素保護基は、シリル基(TMS、TES、TBS、TIPSなど)、アシル誘導体(フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、t−ブトキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(ZまたはCbz)、9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル(Troc))、スルホニル誘導体(β−トリメチルシリルエタンスルホニル(SES))、スルフェニル誘導体、C1−12アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、9−フェニルフルオレニルなどを含む。好ましい窒素保護基はFmocである。
【0216】
クローニングまたは精製などを容易にするための含まれる配列は、必ずしも、本発明に寄与せず、省略されるかまたは除かれる。
【0217】
糖環は、開いた形態および閉じた形態で存在し得ることは理解され、閉形態は本明細書中で構造式において示され、一方で開形態もまた、本発明により含まれる。
【発明を実施するための形態】
【0218】
(発明を実施するための形態)
(ΔG287−953ハイブリッドタンパク質)
髄膜炎菌性血清群B菌株394/98由来のタンパク質287をコードするDNA、および髄膜炎菌性血清群B菌株2996由来のタンパク質953をコードするDNAを消化し、そして短いリンカー配列とともに結合させ、配列番号7のアミノ酸配列をコードするプラスミドを生じさせた。そのプラスミドをE.coliへトランスフェクトし、細菌をそのタンパク質を発現させるために培養した。
【0219】
適切な増殖後、細菌を収集し、そのタンパク質を精製した。培養により提供される細菌を遠心し、そのペレットを、50mMの酢酸緩衝液(pH5)の存在下で1:8のペレット:緩衝液の体積比でホモジェナイズした。高圧ホモジナイザー(AVESTIN、14000psiで4サイクル)を使用し溶解を行った。溶解後、尿素を終濃度5Mで加え、続いて、1時間にわたり室温で撹拌した。そのpHを、200mM酢酸緩衝液(pH 4)+5M尿素を用いて6から5に下げた。その混合物を2〜8℃で60分にわたり16800gで遠心した。その上清を収集し、SARTOBRAN P(0.45〜0.22μm SARTORIUS)により濾過した。
【0220】
濾過された上清中のタンパク質は、−20℃で30日以上、および2〜8℃で15日以上安定であった。
【0221】
タンパク質を、陽イオン交換カラム(SPFF、Amersham Biosciences)で、350mM NaCl+50mM酢酸塩+5M尿素pH5.00を用いた溶出でさらに精製した。不純物の大多数は、元通りに存在する。より低いNaCl濃度(180mM)を使用した前溶出洗浄により、二つの夾雑するE.coliタンパク質は有利に除去された。
【0222】
溶出された物質をpH8に調整し(200mM TRIS/HCl+5M尿素pH9を用いて)、QセファロースHPカラム(Amersham)で、5M尿素中150mM NaCl+20mM TRIS/HCl pH8.00を用いた溶出でさらに精製した。再び、減少した塩(90mM)での溶出前洗浄は、不純物の除去に有用であった。
【0223】
QHPカラムから濾過され、溶出された物質を、PBS pH7.00(150mM NaCl+10mMリン酸カリウム、pH 7.00)を用いて1:2で希釈し、次いで、タンジェント限外濾過により10容量のPBS pH7.00に対してダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションの終わりに、その物質を約1.2mg/mlの全タンパク質まで1.6倍濃縮した。30,000Daカットオフ膜(再生セルロース膜50cm、Millipore PLCTK 30)を使用して、約90%の収率でこの物質を透析することは可能であった。
【0224】
(936−ΔG741ハイブリッドタンパク質)
髄膜炎菌性血清群B菌株2996由来のタンパク質936をコードするDNA、および髄膜炎菌性血清群B菌株MC58由来のタンパク質741をコードするDNAを消化し、そして短いリンカー配列とともに連結し、配列番号8のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。そのプラスミドをE.coliへトランスフェクトし、細菌をそのタンパク質を発現させるために培養した。組換えタンパク質は分泌されず、細菌内で可溶性のままであった。
【0225】
適切な増殖後、細菌を遠心分離し、湿性のペーストを生じさせ、そして以下のとおり処理した:
−20mMリン酸ナトリウムpH 7.00存在下において高圧システムによる均質化。
【0226】
−直交濾過(orthogonal filtration)による遠心分離および清澄化。
【0227】
−20mMリン酸ナトリウムpH7.00中の150mM NaClにより溶出するカチオン性カラムクロマトグラフィー(SPセファロース Fast Flow)。
【0228】
−素通り収集するアニオンカラムクロマトグラフィー(QセファロースXL)。
【0229】
−20mMリン酸ナトリウム、pH7.00により溶出する疎水性カラムクロマトグラフィー(フェニルセファロース6 Fast Flow High Sub)。
【0230】
−10KdカットオフでPBS pH7.4に対するダイアフィルトレーション。
【0231】
−最後の滅菌濾過および−20℃での貯蔵。
【0232】
最終材料におけるタンパク質は、−20℃および2〜8℃のいずれでも少なくとも3ヵ月にわたり安定であった。
【0233】
(NadA(NL)(C)タンパク質)
髄膜炎菌性血清群B菌株2996由来のNadAタンパク質をコードするDNAを、そのC末端をコードする配列を除去するため消化し、配列番号1のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。このプラスミドをE.coliへトランスフェクトし、細菌をそのタンパク質を発現させるために培養した。その組換えタンパク質は、培養培地中に分泌され、そしてそのリーダーペプチドは分泌されたタンパク質(配列番号2)には存在しなかった。その上清を以下のとおり処理した:
−7X濃縮およびクロスフローUF(カットオフ30Kd)により、20mM TRIS/HCl pH7.6の緩衝液に対するダイアフィルトレーション。
【0234】
−20mM TRIS/HCl pH7.6中の400mM NaClにより溶出する陰イオンカラムクロマトグラフィー(QセファロースXL)。
【0235】
−TRIS/HCl pH 7.6中の50mM NaClにより溶出する疎水性カラムクロマトグラフィー工程(フェニルセファロース6 Fast Flow High Sub)。
【0236】
−200mMリン酸ナトリウムpH 7.4により溶出するヒドロキシアパタイトセラミックカラムクロマトグラフィー(HA Macro.Prep)。
【0237】
−PBS pH 7.4に対するダイアフィルトレーション(カットオフ30Kd)。
【0238】
−最後の滅菌濾過および−20℃における貯蔵。
【0239】
最終材料におけるタンパク質は、−20℃および2〜8℃のいずれでも少なくとも6ヵ月にわたり安定であった。
【0240】
NadAタンパク質は、分解を受けやすく、NadAの先欠け形態はウェスタンブロットにより、または10kDaまでの分子量損失を指し示す質量分析法(例えば、MALDI−TOF)により検出され得る。分解産物は、ゲル濾過(例えば、カラムTSK 300SWXL、プレカラムTSKSWXL、TOSOHAASを用いて)によりネイティブのNadAから分離され得る。このような濾過は、三つのピークを生じさせる:(i)保持時間12.637分および見かけ分子量885.036Daを有する第一のピーク;(ii)保持時間13.871分および見かけ分子量530.388Daを有する第二のピーク;(iii)保持時間13.871分および見かけ分子量530.388Daを有する第三のピーク。三つのピークの光散乱分析は、(i)208500Da、(ii)98460Da、(iii)78760Daの実際の分子量値を示す。従って、第一ピークは、NadA凝集体を含み、そして第三のピークは、分解産物を含む。
【0241】
NadA(NL)(C)の推定分子量は34.113Daであることから、ピーク(ii)は三量体タンパク質を含み、これは所望の抗原である。
【0242】
(抗原の組合わせ)
三つのタンパク質および水酸化アルミニウムアジュバントを含有する組成物でマウスを免疫した。比較目的のため、三つのタンパク質を、単独でも試験した。一グループ当たり10匹のマウスを使用した。その混合物は種々の菌株に対し高殺菌性力価を誘導し得た:
【0243】
【表5】

個々のマウスから判断すると、三重の混合物が、個々の抗原の由来となる三つの血清群B菌株に対し高殺菌性力価および一貫した殺菌性力価を誘導した。
【0244】
【表6】

(OMVとの組合わせおよび比較)
さらなる実験では、アジュバント抗原(一用量当たり20μgの各抗原)を、菌株H44/76(ノルウェー)または菌株394/98(ニュージーランド)のいずれから調製された10μgのOMVと組合わせて投与した。ポジティブコントロールは、血清群Bについては抗莢膜SEAM−3モノクローナル抗体、または他の菌株についてはCRM197結合莢膜糖であった。結果(殺菌性力価)は、表1に示される。その混合物は、ほとんどの場合、単一のOMVより優れた力価を生じ、その上、OMVへの混合物の添加は、ほとんどの場合、そのOMVの効力を有意に増強する。さらに、多くの場合、抗原混合物は、ポジティブコントロールで観察される応答に一致するか、またはその応答を上回る。
【0245】
(高病原性系統試験)
以下の抗原を、種々の高病原性系統由来の種々の血清群Bの菌株に対し試験した:
(a)NadA(NL)(C)
(b)ΔG287−953
(c)936−ΔG741
(d)(a)、(b)および(c)の混合物
(e)菌株H44/76(ノルウェー)から調製したOMV
(f)菌株394/98(ニュージーランド)から調製したOMV
(g)ΔG287および(e)の混合物)
(h)(d)および(e)の混合物
(i)(d)および(f)の混合物
SEAM−3をポジティブコントロールとして使用した。
【0246】
結果は、以下のとおり、指し示された高病原性系統において、血清殺菌性力価が1024を上回った場合の、菌株の割合として表された。
【0247】
【表7】

特定の参考菌株に対して殺菌性力価は以下のとおりであった。
【0248】
【表8】

従って、組成物(d)、(h)および(i)は、高病原性系統A4、ET−5および系統3の中から血清群B髄膜炎菌の多種多様の菌株に対する殺菌性抗体応答を誘導する。組成物(h)および(i)を使用した力価は、概して、(d)での力価より高いが、高病原性系統A4、ET−5および系統3内の菌株の適用範囲は、変わりなかった。
【0249】
非分類の菌株の適用範囲はまた、組成物(d)、(h)、および(i)で高かった。
【0250】
(NadAのN末端ドメインの分析)
精製されたN.meningitidisのNadAタンパク質がヒト上皮細胞(例えば、Chang細胞、HeLa細胞、Hep−2細胞)に結合することは公知であり[17]、組換えE.coliは付着性の表現型を示す[18]。これらのE.coliはまた、上皮細胞を侵襲し得、そして細胞内NadA+VEE.coliは、免疫蛍光(膜透過処理後)により、および電子顕微鏡検査により、Chang細胞において検出され得る。従って、NadAは、上皮細胞にとって付着因子および侵襲として機能すると考えられる。
【0251】
二次構造分析に基づき、成熟したNadAは、以下の三つの推定ドメインに細区画した:N末端の球状ドメイン(aa 24〜87)、高いコイルドコイル性向を有するαヘリックス内部領域(aa 88〜350)、およびC末端の膜アンカー(aa 351〜405)。宿主細胞相互作用におけるN末端の球状ドメインの役割を研究した。
【0252】
アミノ酸30〜87を欠くタンパク質をコードする、先欠けのnadA遺伝子をpET−21ベクターにクローン化し(pET−NadAΔ30〜87)、そしてE.coli
BL21(DE3)菌株において発現させた。リーダーペプチドのプロセシングおよびタンパク質の正確な成熟を可能とするために、アミノ酸24〜29を保持した。ウェスタンブロットおよびFACS解析により、NadAΔ30〜87が、E.coli細胞表面において、オリゴマーを発現かつ形成することを確認した(すなわち、N末端ドメインの欠損は、NadAの発現、輸送、および膜局在化を妨害しない)。しかしながら、その組換えE.coli菌株は、完全に、Chang上皮細胞への付着能力を失った。従って、そのN末端ドメインは、付着因子活性に関与している。
【0253】
N末端ドメインのいずれの部分がその相互作用に関与するのかをさらに調査するため、その領域をさらに、以下の三つの推定のサブドメインに分けた:アミノ酸24〜42(疎水性残基を有する推定のαヘリックス領域を含む);アミノ酸43〜70(推定の規定された二次構造なしの内部の部分);およびアミノ酸71〜87(他の推定のαヘリックス構造を含む)。(単一のサブドメインが欠失したタンパク質を各々コードする)三つの構築物を生成し、次いでE.coli BL21(DE3)に導入し,以下の菌株を得た:BL21(DE3)/pET−NadAΔ24〜42、BL21(DE3)/pET−NadAΔ43〜70およびBL21(DE3)/pET−NadAΔ71〜87。オリゴマーの表面局在化を、ウェスタンブロットおよびFACS解析により確認したが、Chang上皮細胞への付着は、コントロールBL21(DE3)/pET E.coli菌株と変わりなかった。これらの結果はまた、免疫蛍光顕微鏡解析を用いて確認されたが、このことは、全体のNadAの球体N末端ドメインがヒト細胞との相互作用において重要であることを示す。
【0254】
(髄膜炎菌性結合体およびHib結合体との組合わせ)
三重のMenB組成物は、血清群C、W135およびYについてオリゴ糖結合体の混合物と組合わされ、以下の抗原を含むワクチンを生じる。
【0255】
【表9】

同様のワクチンが調製され、MenA結合体(10μg糖+12.5〜33μgCRM197)および/またはHbOC Hib結合体(10μg糖+2〜5μgCRM197)を含む。
【0256】
(修飾されたMenA糖の使用)
莢膜多糖をMenAから精製し、そして加水分解し、MenAオリゴ糖を得た。多糖(2g)を、50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.75中で、50℃で、約4時間にわたり、10mg/mLの多糖濃度で加水分解した[135]。加水分解後、その溶液を、ロータリーエバポレーションにより乾燥させた。
【0257】
このオリゴ糖を、以下の反応スキームを利用し活性化させた:
【0258】
【化3】

このオリゴ糖をDMSOに溶解し、10mg/mLの糖濃度を得た。1:20であるオリゴ糖:CDIのモル比に従って、21.262gのCDIを次いで加え、反応混合物を16時間にわたり、室温で撹拌した。結果として生じるMenA−CDI化合物を、80:20(v/v)のアセトン:DMSOの混合物中で、選択的沈殿により精製し、続いて遠心分離した。活性化反応の効率は、結合したイミダゾールに対する遊離のイミダゾールの比を決定することにより約67.9%と計算された。
【0259】
第二の反応工程では、MenA−CDIオリゴ糖を、DMSO中で、約10mg/mLの糖濃度で可溶化した。MenA−CDI単位:DMAのモル比1:100に従って、36.288gの99%塩酸ジメチルアミン(すなわち、RおよびR=Me)を加え、その反応混合物を、室温で16時間にわたり撹拌した。その反応生成物を、凍結乾燥し、10mg/mLの水溶液中で可溶化した。
【0260】
低分子量反応試薬(特に、ジメチルアミン(DMA))をオリゴ糖調製物から取り除くため、透析工程を、3.5kDa MWCO膜(Spectra/PorTM)を通して行った。四つの透析工程を行った:(i)2Lの1M塩化ナトリウムに対し16時間にわたる透析工程(透析率1:20)、(ii)2Lの0.5M塩化ナトリウムに対し16時間にわたる透析工程(透析率1:20)、(iii)および(iv)2LのWFIに対し16時間にわたる透析工程(透析率1:20)。精製を向上させるため、ダイアフィルトレーション工程もまた、1kDa MWCO膜(CentriconTM)を通して行った。
【0261】
精製されたMenA−CDI−DMA生成物を、25mM L−ヒスチジン(FlukaTM)中で、pH 6.5にて緩衝化した。
【0262】
改変されたMenA糖の結合体(MenA−CDI−DMA)の調製については、全プロセスは以下のとおりであった:
オリゴ糖断片を生じさせるための多糖の加水分解
オリゴ糖断片の大きさ分類の処理
大きさ分類されたオリゴ糖上の末端アルデヒド基の還元的アミノ化
CDI反応前の、Fmoc基による末端−NH基の保護
DMA反応の際の−NH基の内因的脱保護
SIEDA(N−ヒドロキシスクシンイミドアジピン酸)による末端−NH基の活性化
CRM197タンパク質への共有結合的付着。
【0263】
改変されたMenAオリゴ糖結合体は、高温での加水分解に対して、その天然の対応物より、かなり抵抗性である。例えば、37℃で28日後、遊離した糖の割合は、改変されたオリゴ糖については6.4%であるのに対し、天然抗原については23.5%である。さらに、改変されたオリゴ糖により誘導される力価は、天然の糖構造を用いて得られた力価より有意には低くない。
【0264】
改変されたMenA結合体は、非改変のオリゴ糖の結合体の代わりとして、MenC結合体、MenW135結合体、およびMenY結合体と合わされる。この四価の混合物は、三つのMenBポリペプチドと混合され、単回用量においてN.meningitidisの血清群A、血清群B、血清群C、血清群W135および血清群Yに対して有効なワクチンを生じさせる。
【0265】
(肺炎球菌の組合わせ)
三つの合わされたMenBタンパク質は、肺炎球菌の糖結合体とともに混合され、最終濃度2μg/各肺炎球菌血清型1用量(血清型6Bについては二倍)を生じさせる。従って、その再構成されたワクチンは、以下の抗原を含む:
【0266】
【表10】

本発明は、例示として記載されているにすぎずないことが理解され、本発明の範囲と精神を保持しつつ、改変がなされ得る。
【0267】
【表11】

(参考文献(これらの内容は、本明細書中に参考として援用される))
【0268】
【表12】

【0269】
【表13】

【0270】
【表14】

【0271】
【表15】

【0272】
【表16】

配列表
【表17−1】

【表17−2】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載された発明。

【公開番号】特開2013−6868(P2013−6868A)
【公開日】平成25年1月10日(2013.1.10)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2012−207826(P2012−207826)
【出願日】平成24年9月21日(2012.9.21)
【分割の表示】特願2010−89061(P2010−89061)の分割
【原出願日】平成15年10月2日(2003.10.2)
【出願人】(592243793)ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Fターム(参考)】