高温で使用するためのGDF−5を含む液体タンパク質製剤
高温で長期間使用するための骨形成タンパク質の液体製剤を提供する。より具体的には、本発明は、体温以下の温度で、少なくとも30日間、タンパク質に安定性を提供する、rhGDF−5、トレハロース、及び1種又はそれ以上の生体適合性賦形剤、を含む液体製剤に関する。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、高温で長期間用いるための、骨形成タンパク質の液体製剤に関する。より具体的には、本発明は、37℃以下の温度で、30日間以上安定である製剤を提供するための、rhGDF−5、トレハロース、及び、1種又はそれ以上の生体適合性賦形剤を含む液体製剤に関する。
【0002】
〔背景技術〕
GDF−5は、タンパク質のTGF−βスーパーファミリーのサブクラスである、骨形成タンパク質(BMP)のメンバーである。GDF−5は、リー(Lee)(米国特許第5,801,014号)により、最初にマウスから単離されたmGDF−5を含む、数種の変異体、及び突然変異体を含む。他の変異体としては、hGDF−5、及びLAP−4としても知られている(トリアントフィロー(Triantfilo)ら、Nature Immunology 2,338〜345(2001))、GDF−5のヒト型である、MP52(国際公開第95/04819号);また、hGDF−5の対立遺伝子タンパク質変異体である、CDMP−1(国際公開第96/14335号);また、細菌で製造される組み換えヒト型である、rhGDF−5(欧州特許第0955313号);また、rhGDF−5の単量体変異体である、rhGDF−5−Ala83;hGDF−5/CDMP−1様タンパク質の総称である、BMP−14;また、世界保健機関により指定された国際名である、ラドテルミン(Radotermin);また、MP52の高分子量タンパク質変異体である、HMW MP52’s;また、分子間架橋に関与するシステイン残基がアラニンで置換されている単量体バージョンである、C465A;また、N445T、L441P、R438L、及びR438Kを含む、他の活性単一アミノ酸置換突然変異体が挙げられる。本出願の目的のために、用語「GDF−5」は、タンパク質の全ての変異体及び突然変異体を含むことを意味し、rhGDF−5は、119個のアミノ酸を有する代表的なメンバーである。
【0003】
BMPファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端活性ドメインを含む共通構造特性を共有し、3つの分子内ジスルフィド結合と1つの分子間ジスルフィド結合を作製するシステイン残基の高度に保存されたパターンを共有する。活性型は、単一ファミリーメンバーのジスルフィド結合したホモ二量体、又は2種の異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれであってもよい(マサック(Massague)ら、Annual Review of Cell Biology 6:957 (1990);サンパス(Sampath)ら、Journal of Biological Chemistry 265:13198(1990);セレステ(Celeste)ら、PNAS 87:9843〜47(1990);米国特許第5,011,691号、及び米国特許第5,266,683号を参照のこと)。タンパク質の適切な折り畳み、及びこれらのジスルフィド結合の形成は、生物学的機能に必須であり、誤った折り畳みは不活性凝集体、及び断片の切断を導く。
【0004】
タンパク質の分解及び安定化は、広く文献に記載されており、抗凍結剤及び浸透圧調節剤としてのデキストラン、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、及びトレハロースのような賦形剤の使用は詳細に記録されている(例えば、アラカワ(Arakawa)ら、Advanced Drug Delivery Reviews,46,307〜326(2001)、ワン(Wang)ら、International Journal of Pharmaceutics 185,129〜188(1999)による、及びトレハロースについてはクロー(Crowe)ら、Cryobiology 43,89〜105(2001)による、タンパク質の安定性に関する総説を参照のこと)。GDF−5の凍結乾燥製剤を保護するための賦形剤の使用はまた、イチカワ(Ichikawa)らによる米国特許出願公開第20040132653号、チョウ(Zhou)らによる米国特許出願公開第20060286171号、及びガリガパティ(Garigapati)らによる米国特許出願第60/870,032号にも記載されている。凍結乾燥は、一般的に用いられているプロセスであり、サンプルをフリーズドライして、水を取り除き、保管用の固体ケーキを得ることを含み、このケーキは後の使用時に再水和することができる。GDF−5のようなタンパク質の場合、凍結、乾燥、及び水による再水和は全て、タンパク質の構造、及び一体性に対して別々の傷害及び問題を表す。
【0005】
タンパク質トロポニンの溶液を安定化させるための製剤中における充填剤としてのトレハロースの使用は、フラー(Flaa)らにより、米国特許第6,165,981号に記載されている。トレハロースを用いる抗体の安定化もまた、ラム(Lam)らにより、米国特許第6,171,586号、及び同第6,991,790号等に記載されている。これらのタンパク質は、GDF−5と構造的類似性をほとんど共有せず、他のタンパク質に対して適応する製剤の使用は、GDF−5の安定化における使用では必ずしも予測可能ではない。
【0006】
対照的に、室温又は更には体温のような高温で長期間安定であるGDF−5の液体溶液の調製は、凍結乾燥及び再構成するとき、凍結、乾燥及び再水和とははっきり異なる別々の1組の問題を提示する。水の除去、賦形剤の結晶化、並びにタンパク質鎖、その水素及びスルフィド結合、及び三次構造の局所的微環境における変化に由来する、タンパク質構造に対する生化学的傷害はもはや問題ではなく、むしろ問題は熱力学的運動の増加に由来する。これは、酸化、脱アミド、加水分解、及び主に不活性化機構としてのタンパク質のアミノ酸の切断の速度上昇を導き、小断片及び、凍結乾燥プロセスで一般的に観察される凝集体より少ない量の凝集体を有する、不活性親分子を生成する。逆相高速液体クロマトグラフィー(rp−HPLC)及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、電気泳動のような他の方法より、タンパク質の純度及び安定性のより信頼できる指標であると思われる。
【0007】
したがって、室温又はそれ以上の温度で、液体溶液のためのGDF−5のようなタンパク質を安定化するために必要な戦略及び化学は、凍結乾燥のためのものとは異なる処方を必要とする場合がある。GDF−5は、2〜8℃にて長期間溶液中で安定ではなく、典型的には−60〜−80℃の温度で保管される。GDF−5は、中性pHで可溶性ではなく、典型的には、酸性溶液中で可溶化され、それにより酸加水分解の可能性が高まる。
【0008】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
長期間保管及び高温での使用のための、安定なGDF−5液体製剤の調製における、上述の制限及び複雑な問題を考慮して、新規及び有効な製剤が必要とされている。
【0009】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は液体タンパク質製剤である。製剤は、BMP、トレハロースの少なくとも50w/v%溶液、並びに、37℃以下の温度で少なくとも30日間保存するため、クロマトグラフィーのメインピークの少なくとも80%を保持することにより証明されるように、BMPを安定化するのに十分な量の、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を含む。
【0010】
別の実施形態では、本発明は、BMP、トレハロースの少なくとも50w/v%溶液、並びにアミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を有するBMP溶液を安定化する方法である。
【0011】
本発明のタンパク質製剤は、骨形成タンパク質の保管及び使用が望ましい全ての用途で用いることができる。室温又は体温での骨形成タンパク質の保管及び使用は、これらの製剤の有用な用途を提示する。表1は、試験した異なる製剤及び結果の概要を示す。
【0012】
【表1−1】
【表1−2】
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】37℃で30日及び60日後のrp−HPLCによる、また37℃で30日後のSECによる、製剤番号18、19、21、23及び37の比較安定性。
【図2】37℃で30日後の、rp−HPLCによる製剤18の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、94%であると示される。
【図3】37℃で30日後の、rp−HPLCによる製剤37の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、93%であると示される。
【図4】37℃で30日後の、rp−HPLCによる製剤35の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、分解を示す更なるピークの存在により、59%であると示される。
【図5】37℃で60日後の、rp−HPLCによる製剤21の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、91%であると示される。
【図6】37℃で60日後の、rp−HPLCによる製剤29の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、分解を示す追加のピークの存在により、53%であると示される。
【図7】37℃で12日後の、SECによる製剤12の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、わずかな分解を示す小さな更なるピークの存在により、82%であると示される。
【図8】37℃で30日後の、SECによる製剤18の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、98%であると示される。
【図9】37℃で14日後の、rp−HPLCによる、60w/v%のトレハロースのみを含むGDF−5サンプルの安定性。タンパク質の保存は、主なピークと、分解を示す追加のピークの存在により、75%であると示される。
【図10】GDF−5の参照標準(製剤ではない)のクロマトグラフ。
【図11】新たに調製したGDF−5標準溶液、新たに調製した製剤番号18の溶液、及び37℃に60日間曝露した後の製剤番号18の溶液の活性間の相関。タンパク質の活性の保存は、曲線の比較類似性により示される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明で用いてよい骨形成タンパク質としては、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、BMP12及びBMP−14、並びにその全ての変異体及び突然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいBMPは、MP52としても知られているrhGDF−5である。
【0015】
本明細書では、長期間高温で水溶液中のBMP分子の安定性を提供する組成物として有用な数種の製剤が提供される。本発明の目的のために、用語「室温」及び「周囲温度」は、互換的であると理解され、およそ18〜25℃の温度を有する通常のオフィス又は研究室の温度を意味し;用語「体温」は、およそ37℃の温度である、ヒトの正常な体温を意味し;「冷却温度」とは、およそ2〜8℃の温度を意味し;用語「凍結」はおよそ−4℃〜−20℃の温度を意味する。
【0016】
BMPの安定性は、rp−HPLC及びSECのような種々の分析方法により示され、BMP分子の化学的純度、及びひいては製剤の性能を決定するためのあいまいな生物学的アッセイに依らない。本発明の目的のために、用語「安定性」及び「純度」は互換的であり、rp−HPLC又はSECクロマトグラフィーによりBMPの特徴を記載することを意味し、親分子の保存の測定値としてのメインピークの曲線下面積を指す。生物学的アッセイは、また、安定性を、BMPの生物学的活性と相互に関係させるために実施される(図11を参照のこと)。
【0017】
本発明の製剤は、BMP、酸性溶液中のトレハロースの少なくとも50w/v%溶液、並びにアミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を含む。トレハロースは、溶液及び凍結乾燥製剤中のタンパク質に安定性を提供する周知の賦形剤であるが、それ自体で体温でのGDF−5の液体溶液に長期間の安定性を与えるには不十分である。これは、図10に示す標準クロマトグラフと比較したとき、37℃の温度で14日間の保存後の、図9のrp−HPLCクロマトグラフではメインピークが減少し、追加のピークが現れたことにより証明される。
【0018】
トレハロースの溶解度は、68.9g/100gH2O(ヒガシヤマ((Higashiyama)、Pure Appl.Chem.74,1263〜1269(2002)であると報告されている。50w/v%および60w/v%のトレハロース溶液を用い、数種の賦形剤及びその組み合わせを詳細に調べて、37℃以下の温度で30日以上保管した後、rp−HPLC又はSECクロマトグラフ中のメインピークにより証明されるように、タンパク質の純度が少なくとも80%保持される、安定な液体BMP溶液を提供する製剤が見出された。多くの実験の後、この目的を満たすのに価値がある賦形剤の特定の組み合わせが見出されている。また、種々の製剤のpHを上昇させて、タンパク質の酸加水分解及び切断の可能性を最小限に抑えることが試みられた。所望のpH範囲は、約2.5〜約7.0であり、より好ましくは約4.0〜約6.0である。pH値がより低いと、より速い速度でタンパク質の酸加水分解を導く傾向があり、pH値がより高いと、タンパク質の不溶解性をもたらす傾向がある。その生体適合性のために、塩酸が好ましく、0.5〜約3ミリモルの値が好ましいが、約10ミリモルまでのより高い値のHClは許容可能である。本発明の製剤中で他の生体適合性酸を用いてもよいことが、当業者には明らかであろう。
【0019】
トレハロースに加えて、トリメチルアンモニウムN−オキシド二水和物(TMAO)を種々の濃度で試験したところ、広くタンパク質の安定性に対して有害な影響が見られた。0.1w/v%のTMAOの添加は、メインピークの許容可能な86%の保持率を提供したが、TMAO濃度の上昇はタンパク質の安定性の低下を導いた(製剤1〜4)。ともに0.5w/v%のβ−アラニン含量を有する製剤15と17との比較では、0.1w/v%のTMAOの添加は、タンパク質の安定性を89%から84%に低下させた。ラフィノース及びミオイノシトールを含む他の製剤では、TMAOの添加はまた、タンパク質の安定性に有害な影響を示した。3%のラフィノース及び1%のミオイノシトールの製剤は満足のいく性能を有していたが、添加するTMAOの量を増加させると、タンパク質の安定性に更に有害な影響を与えた(製剤10〜13を参照のこと)。
【0020】
熱ショックタンパク質は当該技術分野において既知であり、熱応力によりいくつかの生物系を安定化することができる(例えば、ナカモト(Nakamoto)ら、Cell Mol Life Sci.2月;64(3):294〜306(2007)を参照のこと)。熱ショックタンパク質70を、GDF−5を含む60%のトレハロース溶液中の0.1及び0.2w/v%の濃度で試験したところ、それぞれメインピークを92%及び91%保持する許容可能な結果を示した。
【0021】
トリメチルアンモニウムヒドロクロリド(TMA)は周知の賦形剤であり、種々の濃度で数種の製剤中のトレハロースと併用して、またβ−アラニンと併用して試験した。TMAは、50%トレハロース溶液を有していた製剤36を除いて、試験した全ての製剤で満足のいく結果を残した。TMAの望ましくない強い臭気のために、トリエチルアンモニウムヒドロクロリド(TEA)の、TMAの好適な代替物としての可能性を調べた。製剤18と21との直接比較では、TEAは実際TMAの好適な代替物であり、図2及び5により証明されるように、優れたタンパク質の安定性を提供することを示す。実際に、図5は、TEAを含む製剤21が、37℃で60日後、メインピークの保持率が91%であるという、試験した全ての製剤の中で最良の全体的な長期性能を提供した。
【0022】
ベタインは、アンモニウムイオン又はホスホニウムイオンのような、正荷電カチオン官能基を有し、またカルボキシル基のような負荷電官能基を有する、任意の中性化学化合物である。これらの化合物は双極性イオンとして存在し、生物系で有機浸透圧調節物質として機能し、有用な賦形剤である。歴史的に、用語ベタインは、テンサイで発見されて以来、化合物トリメチルグリシンのために確保されている。トリメチルグリシンヒドロクロリドは、本発明の代表的なベタインであり、トレハロース及び他の賦形剤と併用して、0.5w/v%の濃度で数種の製剤において許容可能な性能を示した(製剤23、24、28及び32を参照のこと)。
【0023】
アミノ酸は、緩衝能を提供することが既知であり、本発明の賦形剤として用いることが想到される。好適なアミノ酸の例としては、緩衝剤として有用な代表的なアミノ酸として、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、アルギニン、及びヒスチジンの異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸は個々に又は組み合わせて用いられ、緩衝能を提供できる。β−アラニンを数種の製剤においてアミノ酸緩衝剤として試験したところ、広く有益な性質を有することが見出された。トレハロース、及びβ−アラニンを含む製剤は、0.25〜2w/v%(製剤14、15及び34)であるが、1%及び5%溶液(製剤33及び35)ではないβ−アラニン濃度で許容可能な結果をもたらした。0.5%のβ−アラニン、及び0.1%のタウリン、を含む製剤19では優れた結果が得られ、rp−HPLC及びSECの両方で37℃にて30日後、90%を超える安定性を示し、60日後88%の安定性を示した。0.5%のベタイン、1%のTEA及び0.5%のL−プロリン及びアスパラギン酸カリウムをそれぞれ含む製剤23では、37℃にて30日後、優れた結果が得られ、90%を超える安定性を示したが、60日後の安定性は78%であった。許容可能な結果が得られたL−プロリン及びアスパラギン酸カリウムを利用する他の製剤としては、37℃で30日後、それぞれ82%及び83%であった、製剤24及び28が挙げられる。
【0024】
rp−HPLCのメインピークにより示されるタンパク質の安定性と、GDF−5タンパク質の生物活性との間の相関を確認するために、製剤を60日間37℃に曝露した後、製剤18を標準GDF−5タンパク質溶液と比較し、また時間0の製剤とも比較した。GDF−5の生物活性を、骨髄間質細胞株W−20−17上で様々な濃度のGDF−5を用いて測定した。比色分析により測定したとき、GDF−5の量が増加すると、W−20−17中のアルカリホスファターゼ(ALP)が増加した。図11では、時間0及び37℃で60日後の製剤番号18のALPバイオアッセイを、新たに調製した賦形剤を含まない標準GDF−5溶液と比較した。3本の曲線は全て類似の特性を示し、製剤は時間0では活性を低下させず、37℃で60日後活性タンパク質を提供することを示す。
【0025】
1つの実施形態では、本発明は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、及び約0.1〜約5w/v%の濃度で存在するトリアルキルアンモニウム塩の製剤を含む。好ましい実施形態では、トリアルキルアンモニウム塩は、トリメチルアンモニウムヒドロクロリド、トリエチルアンモニウムヒドロクロリド、又はこれらの組み合わせであってよいが、当業者は、本発明の均等物であると考えられるアルキル基、塩又はアルキル基及び塩、又は両方の軽微な置換又は修正を理解するであろう。
【0026】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、及び約0.25〜約5w/v%の量で存在する少なくとも1種のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、少なくとも1種のアミノ酸は、β−アラニンであり、約0.5w/v%の量で存在する。別の実施形態では、少なくとも1種のアミノ酸は、グリシン及びβ−アラニンの組み合わせであり、それぞれ約0.1〜約2.5w/v%の量で存在する。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.25%の量で存在し、グリシンは約0.25w/v%の量で存在する。別の実施形態では、アミノ酸はL−グリシン、L−プロリン及びL−アラニンの組み合わせであり、それぞれ約0.1〜約2.5w/v%の量で存在する。
【0027】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、及び約0.1〜約0.2w/v%の量で存在する熱ショックタンパク質を含む。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質70であり、約0.1w/v%の量で存在する。
【0028】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び約0.01〜約1w/v%量で存在するタウリンを含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.5w/v%の量で存在し、タウリンは約0.1w/v%の量で存在する。
【0029】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び約0.1〜約5w/v%量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.5w/v%の量で存在し、トリアルキルアンモニウム塩はトリエチルアンモニウムヒドロクロリドであり、約0.1w/v%の量で存在する。
【0030】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約1〜約5w/v%の量で存在するラフィノース、及び約0.1〜約3w/v%量で存在するミオイノシトールを含む。好ましい実施形態では、ラフィノースは約3w/v%の量で存在し、ミオイノシトールは約1w/v%の量で存在する。
【0031】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニン、約0.1〜約5w/v%の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリド、約0.1〜約3w/v%の量で存在するL−プロリン、及び約0.1〜約3w/v%の量で存在するアスパラギン酸カリウムを含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.5w/v%の量で存在し、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドは約1w/v%の量で存在し、L−プロリンは約0.5w/v%の量で存在し、アスパラギン酸カリウムは約0.5w/v%の量で存在する。
【0032】
以下の実施例は、いくつかの種々の実施形態及び本発明の効果を例示するが、当業者は、本発明の範囲及び目的から逸脱することなく、他の類似の実施形態を作製できることを理解するであろう。
【実施例】
【0033】
実施例1:バルクトレハロース60w/v%溶液の調製:165.78gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、250mLの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を250mLにし、全ての結晶を完全に溶解させ、次いで溶液を0.2μmのフィルタを通して濾過した。この溶液を、製剤の調製に用いた。類似の方法で、50%トレハロース溶液を用いて、製剤32及び36の50w/v%溶液を作製した。
【0034】
実施例2:本発明の組成物の調製の非限定的な例は以下の通りである(製剤番号19):165.78gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、きれいな250mLの溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、60w/v%溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を0.22μmのフィルタを通して濾過した。10mLの60%トレハロース溶液に、51mgのβ−アラニン、及び10mgのタウリンを添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の1000μg(1mg)のrhGDF−5を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【0035】
実施例3:好ましい実施形態では、本発明の製剤を以下のように調製した(製剤番号21):165.78gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、250mLの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、60w/v%溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を0.22μmのフィルタを通して濾過した。10mLの60%トレハロース溶液に、50mgのβ−アラニン、及び10mgのトリエチルアンモニウムヒドロクロリド(TEA)を添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の1000μg(1mg)のrhGDF−5を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【0036】
実施例4:好ましい実施形態では、本発明の製剤を以下のように調製した(製剤番号32):55.27gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、100mLの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、50w/v%溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を0.22μmのフィルタを通して濾過した。10mLの50%トレハロース溶液に、50mgのベタインを添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の1000μg(1mg)のrhGDF−5を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【0037】
用いた材料及び設備
1.1 トレハロース二水和物、フェロ−ファンスチエール(Ferro-Pfanstiehl)#T−104−1−MC
1.2 グリシン、超高純度等級、J.T.ベーカー(Baker)#4059−00
1.3 β−アラニン、99%、アルドリッチ(Aldrich)#239720
1.4 12M HCl、EMサイエンス(EM Science)#HX0603P/5(濃縮貯蔵試薬)
1.5 トリメチルアミンN−オキシド二水和物(TMAO)、シグマ(Sigma)#T0514
1.6 トリメチルアンモニウムヒドロクロリド(TMA)、98%、アルドリッチ(Aldrich)#T72761
1.7 トリエチルアンモニウムヒドロクロリド(TEA)、フルカ(Fluka)#90350
1.8 タウリン、99%、シグマ(Sigma)#T0625
1.9 ベタイン、シグマ(Sigma)#B3501
1.10 ミオイノシトール、99%、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)#15125
1.11 D−(+)−ラフィノース五水和物、98%、シグマ(Sigma)#R0250
1.12 HSP70、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)#H7283−1MG
1.13 濾過ユニット、250mL、0.22マイクロメートル膜、ナルジーン(Nalgene)#568−0020
1.14 無菌、250mL、正方形PETG媒質瓶、ナルジーン(Nalgene)#2019−0250
1.15 UV−VIS分光光度計、ベックマン−カウンター(Beckman-Coulter)DU800、ID#494203
1.16 rhGDF−5:使用前に2〜8℃で解凍する
1.17 注入用の水、バクスター(Baxter)#2B0306
1.18 rp−HPLC:ウォーターズ(Waters)モデル2596、バイダック(Vydac)218TP52、C18カラム、0.3mL/分にて水中の0.15%(v/v)TFA及びアセトニトリル中の0.15%(v/v)TFAで溶出された。溶出されたピークは、214nmでモニタした。
1.19 SEC:ウォーターズ(Waters)モデル2596、トーソー・バイオサイエンス(TOSOH Bioscience)カタログ番号08540、0.5mL/分にて水中の0.1%(v/v)TFA及び45%(v/v)アセトニトリルで溶出タンパク質のピークは280nmでモニタした。
【0038】
上記実施例で記載した方法に類似の方法で、表1に列挙した製剤を調製した。製剤は、rp−HPLCにより、またいくつかの選択サンプルではSECにより特徴付けたとき、高温で長期間にわたってrhGDF−5タンパク質分子を安定化する能力について評価した。
【0039】
〔実施態様〕
(1) 酸性溶液中のGDF−5と、60w/v%のトレハロースと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤と、を含む、組成物。
(2) 前記アミノ酸が、β−アラニン、L−グリシン、及びL−プロリンからなる群から選択される、実施態様1に記載の組成物。
(3) 前記アミノ酸が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニンを含む、実施態様2に記載の組成物。
(4) 前記β−アラニンが0.5w/v%の量で存在する、実施態様3に記載の組成物。
(5) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、実施態様1に記載の組成物。
(6) 前記トリアルキルアンモニウム塩が、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドである、実施態様5に記載の組成物。
(7) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するアミノ酸、及び、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、実施態様1に記載の組成物。
(8) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリドを含む、実施態様7に記載の組成物。
(9) 前記熱ショックタンパク質が、約0.1〜約0.2w/v%の量で存在するHSP70である、実施態様1に記載の組成物。
(10) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するタウリンを含む、実施態様1に記載の組成物。
(11) 前記追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するベタインである、実施態様1に記載の組成物。
(12) 酸性溶液中のGDF−5を提供することと、ある量のトレハロースを添加して、60w/v%のトレハロース溶液を提供することと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を添加することと、を含む、GDF−5溶液を安定化する方法であって、前記GDF−5溶液は、クロマトグラフィーによる、タンパク質のメインピークの少なくとも80%の保存により証明されるように、37℃以下の温度で少なくとも30日間安定化される、方法。
【開示の内容】
【0001】
〔技術分野〕
本発明は、高温で長期間用いるための、骨形成タンパク質の液体製剤に関する。より具体的には、本発明は、37℃以下の温度で、30日間以上安定である製剤を提供するための、rhGDF−5、トレハロース、及び、1種又はそれ以上の生体適合性賦形剤を含む液体製剤に関する。
【0002】
〔背景技術〕
GDF−5は、タンパク質のTGF−βスーパーファミリーのサブクラスである、骨形成タンパク質(BMP)のメンバーである。GDF−5は、リー(Lee)(米国特許第5,801,014号)により、最初にマウスから単離されたmGDF−5を含む、数種の変異体、及び突然変異体を含む。他の変異体としては、hGDF−5、及びLAP−4としても知られている(トリアントフィロー(Triantfilo)ら、Nature Immunology 2,338〜345(2001))、GDF−5のヒト型である、MP52(国際公開第95/04819号);また、hGDF−5の対立遺伝子タンパク質変異体である、CDMP−1(国際公開第96/14335号);また、細菌で製造される組み換えヒト型である、rhGDF−5(欧州特許第0955313号);また、rhGDF−5の単量体変異体である、rhGDF−5−Ala83;hGDF−5/CDMP−1様タンパク質の総称である、BMP−14;また、世界保健機関により指定された国際名である、ラドテルミン(Radotermin);また、MP52の高分子量タンパク質変異体である、HMW MP52’s;また、分子間架橋に関与するシステイン残基がアラニンで置換されている単量体バージョンである、C465A;また、N445T、L441P、R438L、及びR438Kを含む、他の活性単一アミノ酸置換突然変異体が挙げられる。本出願の目的のために、用語「GDF−5」は、タンパク質の全ての変異体及び突然変異体を含むことを意味し、rhGDF−5は、119個のアミノ酸を有する代表的なメンバーである。
【0003】
BMPファミリーの全てのメンバーは、カルボキシ末端活性ドメインを含む共通構造特性を共有し、3つの分子内ジスルフィド結合と1つの分子間ジスルフィド結合を作製するシステイン残基の高度に保存されたパターンを共有する。活性型は、単一ファミリーメンバーのジスルフィド結合したホモ二量体、又は2種の異なるメンバーのヘテロ二量体のいずれであってもよい(マサック(Massague)ら、Annual Review of Cell Biology 6:957 (1990);サンパス(Sampath)ら、Journal of Biological Chemistry 265:13198(1990);セレステ(Celeste)ら、PNAS 87:9843〜47(1990);米国特許第5,011,691号、及び米国特許第5,266,683号を参照のこと)。タンパク質の適切な折り畳み、及びこれらのジスルフィド結合の形成は、生物学的機能に必須であり、誤った折り畳みは不活性凝集体、及び断片の切断を導く。
【0004】
タンパク質の分解及び安定化は、広く文献に記載されており、抗凍結剤及び浸透圧調節剤としてのデキストラン、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、及びトレハロースのような賦形剤の使用は詳細に記録されている(例えば、アラカワ(Arakawa)ら、Advanced Drug Delivery Reviews,46,307〜326(2001)、ワン(Wang)ら、International Journal of Pharmaceutics 185,129〜188(1999)による、及びトレハロースについてはクロー(Crowe)ら、Cryobiology 43,89〜105(2001)による、タンパク質の安定性に関する総説を参照のこと)。GDF−5の凍結乾燥製剤を保護するための賦形剤の使用はまた、イチカワ(Ichikawa)らによる米国特許出願公開第20040132653号、チョウ(Zhou)らによる米国特許出願公開第20060286171号、及びガリガパティ(Garigapati)らによる米国特許出願第60/870,032号にも記載されている。凍結乾燥は、一般的に用いられているプロセスであり、サンプルをフリーズドライして、水を取り除き、保管用の固体ケーキを得ることを含み、このケーキは後の使用時に再水和することができる。GDF−5のようなタンパク質の場合、凍結、乾燥、及び水による再水和は全て、タンパク質の構造、及び一体性に対して別々の傷害及び問題を表す。
【0005】
タンパク質トロポニンの溶液を安定化させるための製剤中における充填剤としてのトレハロースの使用は、フラー(Flaa)らにより、米国特許第6,165,981号に記載されている。トレハロースを用いる抗体の安定化もまた、ラム(Lam)らにより、米国特許第6,171,586号、及び同第6,991,790号等に記載されている。これらのタンパク質は、GDF−5と構造的類似性をほとんど共有せず、他のタンパク質に対して適応する製剤の使用は、GDF−5の安定化における使用では必ずしも予測可能ではない。
【0006】
対照的に、室温又は更には体温のような高温で長期間安定であるGDF−5の液体溶液の調製は、凍結乾燥及び再構成するとき、凍結、乾燥及び再水和とははっきり異なる別々の1組の問題を提示する。水の除去、賦形剤の結晶化、並びにタンパク質鎖、その水素及びスルフィド結合、及び三次構造の局所的微環境における変化に由来する、タンパク質構造に対する生化学的傷害はもはや問題ではなく、むしろ問題は熱力学的運動の増加に由来する。これは、酸化、脱アミド、加水分解、及び主に不活性化機構としてのタンパク質のアミノ酸の切断の速度上昇を導き、小断片及び、凍結乾燥プロセスで一般的に観察される凝集体より少ない量の凝集体を有する、不活性親分子を生成する。逆相高速液体クロマトグラフィー(rp−HPLC)及びサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、電気泳動のような他の方法より、タンパク質の純度及び安定性のより信頼できる指標であると思われる。
【0007】
したがって、室温又はそれ以上の温度で、液体溶液のためのGDF−5のようなタンパク質を安定化するために必要な戦略及び化学は、凍結乾燥のためのものとは異なる処方を必要とする場合がある。GDF−5は、2〜8℃にて長期間溶液中で安定ではなく、典型的には−60〜−80℃の温度で保管される。GDF−5は、中性pHで可溶性ではなく、典型的には、酸性溶液中で可溶化され、それにより酸加水分解の可能性が高まる。
【0008】
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
長期間保管及び高温での使用のための、安定なGDF−5液体製剤の調製における、上述の制限及び複雑な問題を考慮して、新規及び有効な製剤が必要とされている。
【0009】
〔課題を解決するための手段〕
本発明は液体タンパク質製剤である。製剤は、BMP、トレハロースの少なくとも50w/v%溶液、並びに、37℃以下の温度で少なくとも30日間保存するため、クロマトグラフィーのメインピークの少なくとも80%を保持することにより証明されるように、BMPを安定化するのに十分な量の、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を含む。
【0010】
別の実施形態では、本発明は、BMP、トレハロースの少なくとも50w/v%溶液、並びにアミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を有するBMP溶液を安定化する方法である。
【0011】
本発明のタンパク質製剤は、骨形成タンパク質の保管及び使用が望ましい全ての用途で用いることができる。室温又は体温での骨形成タンパク質の保管及び使用は、これらの製剤の有用な用途を提示する。表1は、試験した異なる製剤及び結果の概要を示す。
【0012】
【表1−1】
【表1−2】
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】37℃で30日及び60日後のrp−HPLCによる、また37℃で30日後のSECによる、製剤番号18、19、21、23及び37の比較安定性。
【図2】37℃で30日後の、rp−HPLCによる製剤18の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、94%であると示される。
【図3】37℃で30日後の、rp−HPLCによる製剤37の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、93%であると示される。
【図4】37℃で30日後の、rp−HPLCによる製剤35の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、分解を示す更なるピークの存在により、59%であると示される。
【図5】37℃で60日後の、rp−HPLCによる製剤21の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、91%であると示される。
【図6】37℃で60日後の、rp−HPLCによる製剤29の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、分解を示す追加のピークの存在により、53%であると示される。
【図7】37℃で12日後の、SECによる製剤12の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、わずかな分解を示す小さな更なるピークの存在により、82%であると示される。
【図8】37℃で30日後の、SECによる製剤18の安定性。タンパク質の保存は、メインピークと、更なるピークが存在しないことにより、98%であると示される。
【図9】37℃で14日後の、rp−HPLCによる、60w/v%のトレハロースのみを含むGDF−5サンプルの安定性。タンパク質の保存は、主なピークと、分解を示す追加のピークの存在により、75%であると示される。
【図10】GDF−5の参照標準(製剤ではない)のクロマトグラフ。
【図11】新たに調製したGDF−5標準溶液、新たに調製した製剤番号18の溶液、及び37℃に60日間曝露した後の製剤番号18の溶液の活性間の相関。タンパク質の活性の保存は、曲線の比較類似性により示される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明で用いてよい骨形成タンパク質としては、BMP−2、BMP−4、BMP−6、BMP−7、BMP12及びBMP−14、並びにその全ての変異体及び突然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいBMPは、MP52としても知られているrhGDF−5である。
【0015】
本明細書では、長期間高温で水溶液中のBMP分子の安定性を提供する組成物として有用な数種の製剤が提供される。本発明の目的のために、用語「室温」及び「周囲温度」は、互換的であると理解され、およそ18〜25℃の温度を有する通常のオフィス又は研究室の温度を意味し;用語「体温」は、およそ37℃の温度である、ヒトの正常な体温を意味し;「冷却温度」とは、およそ2〜8℃の温度を意味し;用語「凍結」はおよそ−4℃〜−20℃の温度を意味する。
【0016】
BMPの安定性は、rp−HPLC及びSECのような種々の分析方法により示され、BMP分子の化学的純度、及びひいては製剤の性能を決定するためのあいまいな生物学的アッセイに依らない。本発明の目的のために、用語「安定性」及び「純度」は互換的であり、rp−HPLC又はSECクロマトグラフィーによりBMPの特徴を記載することを意味し、親分子の保存の測定値としてのメインピークの曲線下面積を指す。生物学的アッセイは、また、安定性を、BMPの生物学的活性と相互に関係させるために実施される(図11を参照のこと)。
【0017】
本発明の製剤は、BMP、酸性溶液中のトレハロースの少なくとも50w/v%溶液、並びにアミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール、及びアスパラギン酸カリウムから成る群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を含む。トレハロースは、溶液及び凍結乾燥製剤中のタンパク質に安定性を提供する周知の賦形剤であるが、それ自体で体温でのGDF−5の液体溶液に長期間の安定性を与えるには不十分である。これは、図10に示す標準クロマトグラフと比較したとき、37℃の温度で14日間の保存後の、図9のrp−HPLCクロマトグラフではメインピークが減少し、追加のピークが現れたことにより証明される。
【0018】
トレハロースの溶解度は、68.9g/100gH2O(ヒガシヤマ((Higashiyama)、Pure Appl.Chem.74,1263〜1269(2002)であると報告されている。50w/v%および60w/v%のトレハロース溶液を用い、数種の賦形剤及びその組み合わせを詳細に調べて、37℃以下の温度で30日以上保管した後、rp−HPLC又はSECクロマトグラフ中のメインピークにより証明されるように、タンパク質の純度が少なくとも80%保持される、安定な液体BMP溶液を提供する製剤が見出された。多くの実験の後、この目的を満たすのに価値がある賦形剤の特定の組み合わせが見出されている。また、種々の製剤のpHを上昇させて、タンパク質の酸加水分解及び切断の可能性を最小限に抑えることが試みられた。所望のpH範囲は、約2.5〜約7.0であり、より好ましくは約4.0〜約6.0である。pH値がより低いと、より速い速度でタンパク質の酸加水分解を導く傾向があり、pH値がより高いと、タンパク質の不溶解性をもたらす傾向がある。その生体適合性のために、塩酸が好ましく、0.5〜約3ミリモルの値が好ましいが、約10ミリモルまでのより高い値のHClは許容可能である。本発明の製剤中で他の生体適合性酸を用いてもよいことが、当業者には明らかであろう。
【0019】
トレハロースに加えて、トリメチルアンモニウムN−オキシド二水和物(TMAO)を種々の濃度で試験したところ、広くタンパク質の安定性に対して有害な影響が見られた。0.1w/v%のTMAOの添加は、メインピークの許容可能な86%の保持率を提供したが、TMAO濃度の上昇はタンパク質の安定性の低下を導いた(製剤1〜4)。ともに0.5w/v%のβ−アラニン含量を有する製剤15と17との比較では、0.1w/v%のTMAOの添加は、タンパク質の安定性を89%から84%に低下させた。ラフィノース及びミオイノシトールを含む他の製剤では、TMAOの添加はまた、タンパク質の安定性に有害な影響を示した。3%のラフィノース及び1%のミオイノシトールの製剤は満足のいく性能を有していたが、添加するTMAOの量を増加させると、タンパク質の安定性に更に有害な影響を与えた(製剤10〜13を参照のこと)。
【0020】
熱ショックタンパク質は当該技術分野において既知であり、熱応力によりいくつかの生物系を安定化することができる(例えば、ナカモト(Nakamoto)ら、Cell Mol Life Sci.2月;64(3):294〜306(2007)を参照のこと)。熱ショックタンパク質70を、GDF−5を含む60%のトレハロース溶液中の0.1及び0.2w/v%の濃度で試験したところ、それぞれメインピークを92%及び91%保持する許容可能な結果を示した。
【0021】
トリメチルアンモニウムヒドロクロリド(TMA)は周知の賦形剤であり、種々の濃度で数種の製剤中のトレハロースと併用して、またβ−アラニンと併用して試験した。TMAは、50%トレハロース溶液を有していた製剤36を除いて、試験した全ての製剤で満足のいく結果を残した。TMAの望ましくない強い臭気のために、トリエチルアンモニウムヒドロクロリド(TEA)の、TMAの好適な代替物としての可能性を調べた。製剤18と21との直接比較では、TEAは実際TMAの好適な代替物であり、図2及び5により証明されるように、優れたタンパク質の安定性を提供することを示す。実際に、図5は、TEAを含む製剤21が、37℃で60日後、メインピークの保持率が91%であるという、試験した全ての製剤の中で最良の全体的な長期性能を提供した。
【0022】
ベタインは、アンモニウムイオン又はホスホニウムイオンのような、正荷電カチオン官能基を有し、またカルボキシル基のような負荷電官能基を有する、任意の中性化学化合物である。これらの化合物は双極性イオンとして存在し、生物系で有機浸透圧調節物質として機能し、有用な賦形剤である。歴史的に、用語ベタインは、テンサイで発見されて以来、化合物トリメチルグリシンのために確保されている。トリメチルグリシンヒドロクロリドは、本発明の代表的なベタインであり、トレハロース及び他の賦形剤と併用して、0.5w/v%の濃度で数種の製剤において許容可能な性能を示した(製剤23、24、28及び32を参照のこと)。
【0023】
アミノ酸は、緩衝能を提供することが既知であり、本発明の賦形剤として用いることが想到される。好適なアミノ酸の例としては、緩衝剤として有用な代表的なアミノ酸として、アラニン、グリシン、プロリン、リジン、アルギニン、及びヒスチジンの異性体が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸は個々に又は組み合わせて用いられ、緩衝能を提供できる。β−アラニンを数種の製剤においてアミノ酸緩衝剤として試験したところ、広く有益な性質を有することが見出された。トレハロース、及びβ−アラニンを含む製剤は、0.25〜2w/v%(製剤14、15及び34)であるが、1%及び5%溶液(製剤33及び35)ではないβ−アラニン濃度で許容可能な結果をもたらした。0.5%のβ−アラニン、及び0.1%のタウリン、を含む製剤19では優れた結果が得られ、rp−HPLC及びSECの両方で37℃にて30日後、90%を超える安定性を示し、60日後88%の安定性を示した。0.5%のベタイン、1%のTEA及び0.5%のL−プロリン及びアスパラギン酸カリウムをそれぞれ含む製剤23では、37℃にて30日後、優れた結果が得られ、90%を超える安定性を示したが、60日後の安定性は78%であった。許容可能な結果が得られたL−プロリン及びアスパラギン酸カリウムを利用する他の製剤としては、37℃で30日後、それぞれ82%及び83%であった、製剤24及び28が挙げられる。
【0024】
rp−HPLCのメインピークにより示されるタンパク質の安定性と、GDF−5タンパク質の生物活性との間の相関を確認するために、製剤を60日間37℃に曝露した後、製剤18を標準GDF−5タンパク質溶液と比較し、また時間0の製剤とも比較した。GDF−5の生物活性を、骨髄間質細胞株W−20−17上で様々な濃度のGDF−5を用いて測定した。比色分析により測定したとき、GDF−5の量が増加すると、W−20−17中のアルカリホスファターゼ(ALP)が増加した。図11では、時間0及び37℃で60日後の製剤番号18のALPバイオアッセイを、新たに調製した賦形剤を含まない標準GDF−5溶液と比較した。3本の曲線は全て類似の特性を示し、製剤は時間0では活性を低下させず、37℃で60日後活性タンパク質を提供することを示す。
【0025】
1つの実施形態では、本発明は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、及び約0.1〜約5w/v%の濃度で存在するトリアルキルアンモニウム塩の製剤を含む。好ましい実施形態では、トリアルキルアンモニウム塩は、トリメチルアンモニウムヒドロクロリド、トリエチルアンモニウムヒドロクロリド、又はこれらの組み合わせであってよいが、当業者は、本発明の均等物であると考えられるアルキル基、塩又はアルキル基及び塩、又は両方の軽微な置換又は修正を理解するであろう。
【0026】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、及び約0.25〜約5w/v%の量で存在する少なくとも1種のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、少なくとも1種のアミノ酸は、β−アラニンであり、約0.5w/v%の量で存在する。別の実施形態では、少なくとも1種のアミノ酸は、グリシン及びβ−アラニンの組み合わせであり、それぞれ約0.1〜約2.5w/v%の量で存在する。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.25%の量で存在し、グリシンは約0.25w/v%の量で存在する。別の実施形態では、アミノ酸はL−グリシン、L−プロリン及びL−アラニンの組み合わせであり、それぞれ約0.1〜約2.5w/v%の量で存在する。
【0027】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、及び約0.1〜約0.2w/v%の量で存在する熱ショックタンパク質を含む。好ましい実施形態では、熱ショックタンパク質は、熱ショックタンパク質70であり、約0.1w/v%の量で存在する。
【0028】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び約0.01〜約1w/v%量で存在するタウリンを含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.5w/v%の量で存在し、タウリンは約0.1w/v%の量で存在する。
【0029】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び約0.1〜約5w/v%量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.5w/v%の量で存在し、トリアルキルアンモニウム塩はトリエチルアンモニウムヒドロクロリドであり、約0.1w/v%の量で存在する。
【0030】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約1〜約5w/v%の量で存在するラフィノース、及び約0.1〜約3w/v%量で存在するミオイノシトールを含む。好ましい実施形態では、ラフィノースは約3w/v%の量で存在し、ミオイノシトールは約1w/v%の量で存在する。
【0031】
別の実施形態では、製剤は、酸性溶液中の少なくとも50w/v%のトレハロース、BMP、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニン、約0.1〜約5w/v%の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリド、約0.1〜約3w/v%の量で存在するL−プロリン、及び約0.1〜約3w/v%の量で存在するアスパラギン酸カリウムを含む。好ましい実施形態では、β−アラニンは約0.5w/v%の量で存在し、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドは約1w/v%の量で存在し、L−プロリンは約0.5w/v%の量で存在し、アスパラギン酸カリウムは約0.5w/v%の量で存在する。
【0032】
以下の実施例は、いくつかの種々の実施形態及び本発明の効果を例示するが、当業者は、本発明の範囲及び目的から逸脱することなく、他の類似の実施形態を作製できることを理解するであろう。
【実施例】
【0033】
実施例1:バルクトレハロース60w/v%溶液の調製:165.78gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、250mLの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を250mLにし、全ての結晶を完全に溶解させ、次いで溶液を0.2μmのフィルタを通して濾過した。この溶液を、製剤の調製に用いた。類似の方法で、50%トレハロース溶液を用いて、製剤32及び36の50w/v%溶液を作製した。
【0034】
実施例2:本発明の組成物の調製の非限定的な例は以下の通りである(製剤番号19):165.78gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、きれいな250mLの溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、60w/v%溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を0.22μmのフィルタを通して濾過した。10mLの60%トレハロース溶液に、51mgのβ−アラニン、及び10mgのタウリンを添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の1000μg(1mg)のrhGDF−5を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【0035】
実施例3:好ましい実施形態では、本発明の製剤を以下のように調製した(製剤番号21):165.78gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、250mLの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、60w/v%溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を0.22μmのフィルタを通して濾過した。10mLの60%トレハロース溶液に、50mgのβ−アラニン、及び10mgのトリエチルアンモニウムヒドロクロリド(TEA)を添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の1000μg(1mg)のrhGDF−5を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【0036】
実施例4:好ましい実施形態では、本発明の製剤を以下のように調製した(製剤番号32):55.27gのトレハロース二水和物(MW 378.34)を注意深く計量し、100mLの大きさのきれいな溶液測定用フラスコに移し、それに1mmolのHClを、印のすぐ下までゆっくりと添加して、50w/v%溶液を作製した。混合物を振盪により十分混合し、60℃の温水中で加温した。更に1mmolのHClを添加することにより容積を印まで増やし、トレハロースの結晶を全て完全に溶解させ、次いで溶液を0.22μmのフィルタを通して濾過した。10mLの50%トレハロース溶液に、50mgのベタインを添加した。混合物をかき混ぜ、それに、溶液中の1000μg(1mg)のrhGDF−5を添加した。製剤のタンパク質濃度を紫外線により測定し、所望の濃度が達成されていることを保証し、必要に応じて溶媒又はタンパク質を添加することにより調整した。
【0037】
用いた材料及び設備
1.1 トレハロース二水和物、フェロ−ファンスチエール(Ferro-Pfanstiehl)#T−104−1−MC
1.2 グリシン、超高純度等級、J.T.ベーカー(Baker)#4059−00
1.3 β−アラニン、99%、アルドリッチ(Aldrich)#239720
1.4 12M HCl、EMサイエンス(EM Science)#HX0603P/5(濃縮貯蔵試薬)
1.5 トリメチルアミンN−オキシド二水和物(TMAO)、シグマ(Sigma)#T0514
1.6 トリメチルアンモニウムヒドロクロリド(TMA)、98%、アルドリッチ(Aldrich)#T72761
1.7 トリエチルアンモニウムヒドロクロリド(TEA)、フルカ(Fluka)#90350
1.8 タウリン、99%、シグマ(Sigma)#T0625
1.9 ベタイン、シグマ(Sigma)#B3501
1.10 ミオイノシトール、99%、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)#15125
1.11 D−(+)−ラフィノース五水和物、98%、シグマ(Sigma)#R0250
1.12 HSP70、シグマ・アルドリッチ(Sigma-Aldrich)#H7283−1MG
1.13 濾過ユニット、250mL、0.22マイクロメートル膜、ナルジーン(Nalgene)#568−0020
1.14 無菌、250mL、正方形PETG媒質瓶、ナルジーン(Nalgene)#2019−0250
1.15 UV−VIS分光光度計、ベックマン−カウンター(Beckman-Coulter)DU800、ID#494203
1.16 rhGDF−5:使用前に2〜8℃で解凍する
1.17 注入用の水、バクスター(Baxter)#2B0306
1.18 rp−HPLC:ウォーターズ(Waters)モデル2596、バイダック(Vydac)218TP52、C18カラム、0.3mL/分にて水中の0.15%(v/v)TFA及びアセトニトリル中の0.15%(v/v)TFAで溶出された。溶出されたピークは、214nmでモニタした。
1.19 SEC:ウォーターズ(Waters)モデル2596、トーソー・バイオサイエンス(TOSOH Bioscience)カタログ番号08540、0.5mL/分にて水中の0.1%(v/v)TFA及び45%(v/v)アセトニトリルで溶出タンパク質のピークは280nmでモニタした。
【0038】
上記実施例で記載した方法に類似の方法で、表1に列挙した製剤を調製した。製剤は、rp−HPLCにより、またいくつかの選択サンプルではSECにより特徴付けたとき、高温で長期間にわたってrhGDF−5タンパク質分子を安定化する能力について評価した。
【0039】
〔実施態様〕
(1) 酸性溶液中のGDF−5と、60w/v%のトレハロースと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤と、を含む、組成物。
(2) 前記アミノ酸が、β−アラニン、L−グリシン、及びL−プロリンからなる群から選択される、実施態様1に記載の組成物。
(3) 前記アミノ酸が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニンを含む、実施態様2に記載の組成物。
(4) 前記β−アラニンが0.5w/v%の量で存在する、実施態様3に記載の組成物。
(5) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、実施態様1に記載の組成物。
(6) 前記トリアルキルアンモニウム塩が、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドである、実施態様5に記載の組成物。
(7) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するアミノ酸、及び、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、実施態様1に記載の組成物。
(8) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリドを含む、実施態様7に記載の組成物。
(9) 前記熱ショックタンパク質が、約0.1〜約0.2w/v%の量で存在するHSP70である、実施態様1に記載の組成物。
(10) 前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するタウリンを含む、実施態様1に記載の組成物。
(11) 前記追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するベタインである、実施態様1に記載の組成物。
(12) 酸性溶液中のGDF−5を提供することと、ある量のトレハロースを添加して、60w/v%のトレハロース溶液を提供することと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を添加することと、を含む、GDF−5溶液を安定化する方法であって、前記GDF−5溶液は、クロマトグラフィーによる、タンパク質のメインピークの少なくとも80%の保存により証明されるように、37℃以下の温度で少なくとも30日間安定化される、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
酸性溶液中のGDF−5と、60w/v%のトレハロースと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤と、を含む、組成物。
【請求項2】
前記アミノ酸が、β−アラニン、L−グリシン、及びL−プロリンからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
前記アミノ酸が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニンを含む、請求項2に記載の組成物。
【請求項4】
前記β−アラニンが0.5w/v%の量で存在する、請求項3に記載の組成物。
【請求項5】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項6】
前記トリアルキルアンモニウム塩が、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドである、請求項5に記載の組成物。
【請求項7】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するアミノ酸、及び、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項8】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリドを含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項9】
前記熱ショックタンパク質が、約0.1〜約0.2w/v%の量で存在するHSP70である、請求項1に記載の組成物。
【請求項10】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するタウリンを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項11】
前記追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するベタインである、請求項1に記載の組成物。
【請求項12】
酸性溶液中のGDF−5を提供することと、ある量のトレハロースを添加して、60w/v%のトレハロース溶液を提供することと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を添加することと、を含む、GDF−5溶液を安定化する方法であって、前記GDF−5溶液は、クロマトグラフィーによる、タンパク質のメインピークの少なくとも80%の保存により証明されるように、37℃以下の温度で少なくとも30日間安定化される、方法。
【請求項1】
酸性溶液中のGDF−5と、60w/v%のトレハロースと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤と、を含む、組成物。
【請求項2】
前記アミノ酸が、β−アラニン、L−グリシン、及びL−プロリンからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
前記アミノ酸が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するβ−アラニンを含む、請求項2に記載の組成物。
【請求項4】
前記β−アラニンが0.5w/v%の量で存在する、請求項3に記載の組成物。
【請求項5】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項6】
前記トリアルキルアンモニウム塩が、トリエチルアンモニウムヒドロクロリドである、請求項5に記載の組成物。
【請求項7】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.25〜約5w/v%の量で存在するアミノ酸、及び、約0.1〜約3w/v%の量で存在するトリアルキルアンモニウム塩を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項8】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するトリエチルアンモニウムヒドロクロリドを含む、請求項7に記載の組成物。
【請求項9】
前記熱ショックタンパク質が、約0.1〜約0.2w/v%の量で存在するHSP70である、請求項1に記載の組成物。
【請求項10】
前記少なくとも1種の追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するβ−アラニン、及び、約0.1w/v%の量で存在するタウリンを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項11】
前記追加の賦形剤が、約0.5w/v%の量で存在するベタインである、請求項1に記載の組成物。
【請求項12】
酸性溶液中のGDF−5を提供することと、ある量のトレハロースを添加して、60w/v%のトレハロース溶液を提供することと、アミノ酸、トリアルキルアンモニウム塩、熱ショックタンパク質、ベタイン、タウリン、ラフィノース、ミオイノシトール及びアスパラギン酸カリウムからなる群から選択される少なくとも1種の追加の賦形剤を添加することと、を含む、GDF−5溶液を安定化する方法であって、前記GDF−5溶液は、クロマトグラフィーによる、タンパク質のメインピークの少なくとも80%の保存により証明されるように、37℃以下の温度で少なくとも30日間安定化される、方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【公表番号】特表2010−532368(P2010−532368A)
【公表日】平成22年10月7日(2010.10.7)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−515029(P2010−515029)
【出願日】平成20年6月24日(2008.6.24)
【国際出願番号】PCT/US2008/068007
【国際公開番号】WO2009/006097
【国際公開日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【出願人】(509263146)アドバンスト・テクノロジーズ・アンド・リジェネレイティブ・メディスン・エルエルシー (17)
【氏名又は名称原語表記】Advanced Technologies and Regenerative Medicine, LLC
【住所又は居所原語表記】325 Paramount Drive, Raynham, MA 02767, United States of America
【Fターム(参考)】
【公表日】平成22年10月7日(2010.10.7)
【国際特許分類】
【出願日】平成20年6月24日(2008.6.24)
【国際出願番号】PCT/US2008/068007
【国際公開番号】WO2009/006097
【国際公開日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【出願人】(509263146)アドバンスト・テクノロジーズ・アンド・リジェネレイティブ・メディスン・エルエルシー (17)
【氏名又は名称原語表記】Advanced Technologies and Regenerative Medicine, LLC
【住所又は居所原語表記】325 Paramount Drive, Raynham, MA 02767, United States of America
【Fターム(参考)】
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