高発現組換え細胞系の選択方法
本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを用いた高生産性クローンの選択方法に関する。本発明によれば、既存の細胞系選択方法より少なくとも１０倍少ない数の細胞集団から高生産性細胞クローンの選択が可能である。特に、ＭＴＸの量を増加させながらの数回の増幅工程を含む一般的な段階的遺伝子増幅ストラテジーと比較して、低濃度のＭＴＸを使用して、高生産性クローンを選択することができる。したがって、細胞系の発達期間を短縮でき、かつ高生産性クローンの選択にかかる手間及び費用を減らすことができ、それによって、ＭＴＸ以外の一般的な選択マーカー遺伝子を使用するときでも、さらに効率的な蛋白質の生産が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的蛋白質の高発現のための細胞系（本明細書では「高生産性クローン」と称する）の選択方法に関し、さらに具体的には、（ｉ）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを用いた高生産性クローンの選択方法及びその発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学分野または医学分野において生産しようとする目的蛋白質は、目的蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、前記蛋白質を生産する細胞系に形質移入し、得られた細胞系を大量に培養し、これを適切な方法で前記培養された細胞系から分離及び精製する工程を経て収得される。
【０００３】
このために、産業的に使われる方法の一例としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovary））ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ（dihydrofolatereductase））（−）、ＣＨＯ Ｋ１、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞（Baby Hamster Kidney））、ＮＳ０、ＳＰ２／０及びヒト細胞系等を用いた方法が含まれる（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００４】
目的とする外来（heterologous）遺伝子を発現する安定した哺乳動物細胞系作成のために、外来遺伝子は、一般的に、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）と共に、所望の細胞系に形質移入によって挿入される。外来遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一ベクターまたは同時に形質移入される別個のベクターによって発現され得る。形質移入の２、３日後、選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を使用する場合、細胞をＧ４１８のような選択薬剤を含有する培地に移し、それらの選択条件下で数週間培養する。次に、出現する耐性細胞を単離でき、目的遺伝子産物の発現を調べる。宿主細胞ゲノムへのランダムであって非定方向的な組込みの結果として、完全に異なる割合で外来遺伝子を発現する細胞集団を収得する。これらはまた、選択マーカーを発現するが、目的とする遺伝子を発現しない非発現細胞を含むことが可能である。従って、目的とする外来遺伝子の発現が非常に高い細胞クローンを同定するためには、多数のクローンを調べて試験する必要があり、これは、時間消耗的であり、また多くの手間と費用とがかかる。
【０００５】
遺伝子増幅は、組換え蛋白質の製造に使われる動物細胞培養において普遍化された技術である。遺伝子増幅は、多数の哺乳動物細胞系が有する相対的に低い生産性を顕著に改善させる。当該分野で広範囲に使われる１つの増幅技術は、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）系の遺伝子増幅システムであり、このｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞が頻繁に使われる。
【０００６】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞系が、産業的に好まれる理由としては、次のような点を挙げることができる。（１）蛋白質の翻訳後修正（posttranslational modification）、すなわち、グリコシル化（glycosylation)過程やリン酸化(phosphorylation)が、他の細胞類よりもさらにヒト細胞類と類似している。（２）付着培養だけではなく、浮遊培養が可能である。（３）これらの細胞類は、無血清培地で、他の細胞類に比べて相対的に高濃度での培養が可能である。（４）微生物類に比べて、顕著に低い目的蛋白質の生産性を、ｄｈｆｒ／ＭＴＸ（メトトレキサート（methotrexate））遺伝子増幅システムを利用して増加させることができる。（５）これらの細胞類は安定性が検証され、ＦＤＡのような監督機関から許可を容易に受けることができる。前記のような理由で、目的蛋白質を生産する組換え細胞系を作成するために、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞系が産業的に広く使われている。
【０００７】
しかし、目的蛋白質をコードする遺伝子をｄｆｈｒ欠損ＣＨＯ細胞系に形質移入した後、細胞をＭＴＸの濃度を段階的に上昇させて処理することによって、目的蛋白質の生産性を顕著に高めることができる従来法のｄｈｆｒ／ＭＴＸ遺伝子増幅システムを利用する場合にさえも、ＭＴＸの濃度を段階的に高めて細胞を処理する工程で長時間かかり、かつこの工程でスクリーニングされる細胞集団の数が５００〜４，０００群を超えるために、高い生産性を有する細胞集団の選択工程が労働集約的であり、時間消費的及び費用消耗的になってしまう。従って、このような選択段階を簡素化するための努力が、多角的に試みられている。
【０００８】
例えば、当該技術分野の研究者は、以下の方法等を利用して選択工程を簡素化させるべく努力した。（１）開始コドン近傍を改変させることにより選択マーカー遺伝子の発現を低下させる方法（特許文献１）。（２）遺伝子の変異により選択マーカー遺伝子の機能を損なわせる方法（非特許文献４及び非特許文献５）。（３）開始コドン自体を改変させ、改変開始コドンに発現しようとする遺伝子を連結させて、それにより前記遺伝子の発現レベルを上昇させる方法（非特許文献６）。（４）選択マーカー遺伝子をイントロンと連結させて、前記遺伝子を発現する方法（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5733799号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ogata，et al．，Appl．Microbiol．Biotechnol．，1993，38(4)，520-525
【非特許文献２】Kratje，et al．，Biotechnol．Prog．，1994，10(4)，410-20
【非特許文献３】Peakman，et al．，Hum．Antibodies Hybridomas，1994，5(1-2)，65-74
【非特許文献４】Niwa et al．，Gene 108，193-200，1991
【非特許文献５】Sauter and Enenkel，Biotechnol．Bioeng．89，530-538，2005
【非特許文献６】van Blokland et al．，J of Biotechnology 128，237-245，2007
【非特許文献７】Lucas et al．，Nucleic Acids Res．24，1774-1779，1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用する高生産性クローンの選択方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記選択方法に使用される発現ベクターを提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記発現ベクターが形質移入された真核宿主細胞系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記のような目的を達成するために、本発明は、（ｉ）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを使用する高生産性クローンの選択方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、前記発現ベクターで形質移入された真核宿主細胞系を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、既存の細胞系選択方法より少なくとも１０倍少ない数の細胞集団から高生産性細胞クローンの選択が可能である。特に、ＭＴＸの量を増加させながらの数回の増幅工程を含む一般的な段階的遺伝子増幅ストラテジーと比較して、低濃度のＭＴＸを使用して、高生産性クローンを選択することができる。結果的に、細胞系の発達期間が短縮され、かつ高生産性クローンの選択にかかる手間及び費用を減らすことによって、さらに効率的な組換え蛋白質の生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＣＴ１０７発現ベクターの開裂地図である。地図上に表示された制限酵素Ｐｍｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ及びＲｓｒ ＩＩは、ｐＣＴ１０７発現ベクターによってコードされる抗体の重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子、及びＤＨＦＲ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動しないようにｐＣＴ１０７ベクターを切断させる部位を示している。
【図２】対照群（Ａ）、実験群（Ｂ）、実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ）の発現ベクターでそれぞれ形質移入されたＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ抗体の発現力価（titer）を測定した結果である。図２中、対照群（Ａ）は、制限酵素で処理していない環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、 実験群（Ｂ）は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターであり、 実験群（Ｃ）は、Ｐｍｅ Ｉで処理して重鎖遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターであり、実験群（Ｄ）は、Ｃｌａ Ｉで処理して軽鎖遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。試料中に重鎖や軽鎖を含まない場合（実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ））では、ＥＬＩＳＡの特性によりＩｇＧ抗体の力価が測定されていない。実験は全て５回行われ、誤差範囲は標準誤差で示した。
【図３】９６−ウェルプレートスケールでのｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａの有無に依存して細胞クローンを選択する工程において見出された力価の比較を示すグラフである。図３中、未切断は、正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図４】２４−ウェルプレートスケールでのｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａの有無に依存して細胞クローンを選択する工程において見出された力価の比較を示すグラフである。図４中、未切断は、正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図５】６−ウェルプレートスケールでのｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａの有無に依存して細胞クローンを選択する工程において見出された力価の比較を示すグラフである。図５中、未切断は、正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図６】シェークフラスコを用いた回分式培養（batch culture）状態における対照群と実験群から６個のｐ−ｃｌｏｎｅの生産性を比較した結果を示すグラフであり、ここでｐ−ｃｌｏｎｅは対照群と実験群についてｐｏｌｙ Ａの有無によって高い力価を示すものを選択したものである。図６中、未切断は正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図７】ｐＣＴ１３０ベクターの発現ベクタークローニング工程を示す模式図である。
【図８】ｐＣＴ１２９ベクターの発現ベクタークローニング工程を示す模式図である。
【図９】９６−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフであり、図９中、ｐＣＴ１２９（ｐｏｌｙ Ａを有する）はｐｏｌｙ Ａ活性を有する対照群、ｐＣＴ１３０（ｐｏｌｙ Ａを有しない）はｐｏｌｙ Ａ欠損実験群を示す。
【図１０】２４−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフであり、図１０中、ｐＣＴ１２９（ｐｏｌｙ Ａを有する）はｐｏｌｙ Ａ活性を有する対照群、ｐＣＴ１３０（ｐｏｌｙ Ａを有しない）はｐｏｌｙ Ａ欠損実験群を示す。
【図１１】６−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフであり、図１１中、ｐＣＴ１２９（ｐｏｌｙ Ａを有する）はｐｏｌｙ Ａ活性を有する対照群、ｐＣＴ１３０（ｐｏｌｙ Ａを有しない）はｐｏｌｙ Ａ欠損実験群を示す。
【図１２】６−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフである。
【図１３】シェークフラスコを用いた回分式培養において、対照群と実験群とで生産性を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
略語
ｄｈｆｒ：ジヒドロ葉酸リダクターゼ（dihydrofolate reductase）
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary）
ｐｏｌｙ Ａ：ポリアデニル化シグナル（polyadenylation signal）
ｐ−ｃｌｏｎｅ：単一細胞由来クローンではない予備クローン（preliminary clone）
ＭＴＸ：メトトレキサート（methotrexate）
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay）
【００２０】
以下、本明細書中で使われる用語を定義する。
本明細書中の用語「選択マーカー遺伝子（selection marker gene）」とは、目的蛋白質の遺伝子と連結されて発現ベクターに挿入されたマーカー遺伝子であり、それによって、目的遺伝子が正常に発現される細胞を確認することができる。また、選択マーカー遺伝子によってコードされる蛋白質の抑制剤を培地に添加すれば、選択マーカー遺伝子のコピー数を増加させたり、あるいは増加した選択マーカー遺伝子に連結されている目的蛋白質の遺伝子のコピー数をともに増加させることができる。選択マーカーとしては、ｄｈｆｒ遺伝子、グルタミンシンテターゼ（glutamine synthetase）遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neomycinephosphotransferase）遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（hygromycin Ｂ phosphotransferase）遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ、puromycin−Ｎ−acetyltransferase）遺伝子またはストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｈ、Streptoalloteichus hindustanus）ｂｌｅ遺伝子などがある。
【００２１】
本明細書中の用語「ｐｏｌｙ Ａ」とは、真核細胞ｍＲＮＡの３’末端の特定部位を切断させ、切断された３’末端に、約１００〜２００個のアデニンヌクレオチド（ｐｏｌｙ Ａ tail）配列を翻訳後に導入するシグナル配列のことである。当該ポリアデニル化シグナル（polyadenylationsignal）配列は、切断部位の約１０〜３０ヌクレオチド上流に位置したコンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡ及び下流に位置した配列をいう。ｔｋ ｐｏｌｙ Ａ、ＳＶ４０ late及びearly ｐｏｌｙ Ａ、又は、ＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａのようなさまざまなｐｏｌｙ Ａシグナルが公知である。
【００２２】
本明細書中の用語「作動可能に連結された（operably linked）」とは、１の核酸フラグメントが第２の核酸フラグメントと連結し、その機能又は発現が、第２の核酸フラグメントによって影響を受けることをいう。また、「作動可能に連結された」とは、例えば、遺伝子配列の転写が作動可能に連結されたプロモーター配列によって指示され、又は、遺伝子配列の翻訳が作動可能に連結された翻訳調節配列によって指示され、または遺伝子配列の翻訳後のプロセッシングが作動可能に連結されたプロセッシング配列によって指示されるような、遺伝子配列、及びプロモーター、又は他の調節配列及びプロセッシング配列との連結を意味するのに使われる。用語「作動不能に連結された」は、用語「作動可能に連結された」と反対の意味であり、一般に、当業者に公知の切断、欠失、点突然変異及びアミノ酸置換のような方法による人為的な操作によって作動不能になる連結を含む意図である。
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者らは、高生産性クローンを選択する新規な方法について研究し、その結果、ｐｏｌｙ ＡがｍＲＮＡの転写と安定性に大きく影響を及ぼし、そして、ｐｏｌｙ Ａの長さは時間の経過と共に幾分短くなった場合、ｍＲＮＡが分解され始め、そしてこの理由のため、ｐｏｌｙ Ａが正常に作動しなければ、ｍＲＮＡの半減期は正常ｍＲＮＡに比べてはるかに短い。この知見に基づき、ｐｏｌｙ Ａに注目して新規な選択方法を開発するための研究を行った。
【００２４】
例えば、発現ベクター内の選択マーカー遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａを作動不能に操作した後、これを宿主細胞内に形質移入し、選択マーカー遺伝子によってコードされる蛋白質の抑制剤が存在する選択条件下で培養する場合には、ｐｏｌｙ Ａが正常に作動していない選択マーカー遺伝子は、安定的にｍＲＮＡを生産することができないので、前記選択条件下では、大部分の細胞が死滅するものであり、そのうち、多くのコピー数のベクターが形質移入された細胞だけ生存できる。このとき、形質移入に使用された発現ベクターには、選択マーカー遺伝子と、目的組換え蛋白質をコードする遺伝子とが共に含まれているので、選択マーカー遺伝子のコピー数と比例して、目的蛋白質をコードする遺伝子もまた、多くのコピー数で存在する。
【００２５】
本発明における、高生産性クローンを選択するための新規な方法として選択マーカー遺伝子に連結したｐｏｌｙ Ａの作動可能性を適用できることを証明するために、ｐＣＴ１０７ベクター（図１参照）上の選択マーカー遺伝子であるｄｈｆｒ遺伝子の３’末端に連結されたｐｏｌｙ Ａを、適当な制限酵素で切断し、ｐｏｌｙ Ａが作動しないように操作した。続いて、得られたベクターをＣＨＯ ＤＧ４４細胞系（実験群）に形質移入し、そして、前記細胞系からの高生産性クローンの選択工程を、制限酵素を処理していないｐＣＴ１０７ベクターを形質移入したＣＨＯ ＤＧ４４細胞系（対照群）と比較した。その結果、実験群中で、組換え蛋白質生産細胞株候補群の数字が、対照群に比較したとき、実験群において、プレート当たりの細胞が増殖したウェル数が、対照群と比較して７．６倍ほど少ないことを示し、そして、増殖細胞比率は、（１／２６２６４）：（１／８１４８１５）であり、実験群における増殖細胞比率が対照群と比較して３１倍が低いということを示す（表２参照）。
【００２６】
次に、対照群と実験群との間での増殖細胞の生産性を比較するために、各群で最上位の生産性を示す６個の細胞系を選択し、それらの生産性を調べた。対照群の場合、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち１個のｐ−ｃｌｏｎｅだけが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示し、一方、実験群の場合には、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち４個のｐ−ｃｌｏｎｅが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示すことを確認した（図６参照）。
【００２７】
また、上述した本発明の選択方法が、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞でのｄｈｆｒ選択マーカーを用いたシステム以外の他のシステムにも適用されるか否かを確認するために、ＣＨＯ Ｋ１細胞でのｐａｃ選択マーカーでのシステムを使用して実験した。この目的のため、ｐＣＴ１１２ベクター（図７及び図８参照）上のｄｈｆｒ転写ユニット（プロモーター−ｄｈｆｒ−ｐｏｌｙ Ａ）を除去し、そして、前記ベクターにＳＶ４０プロモーター及びｐａｃ遺伝子を挿入し、それにより実験ベクター（ｐＣＴ１３０ベクター、図７参照）を構築した。さらに、ＳＶ４０プロモーター、ｐａｃ遺伝子及びｐｏｌｙ Ａ（ｐａｃ転写ユニット）を前記ベクターに挿入し対照ベクター（ｐＣＴ１２９ベクター、図８参照）を構築した。次に、構築したベクター夫々をＣＨＯ Ｋ１細胞に形質移入し、そして、対照細胞系と実験細胞系とを選択し、続いて選択した細胞系の生産性を調べた。図９ないし図１３から理解できるように、対照群（ｐＣＴ１２９ベクター）に由来するクローンに比べて、実験群（ｐＣＴ１３０ベクター）に由来するクローンの生産性が高かった。特に、前記ウェルプレートに基づく選択工程で取得されたものと比較してより実質的な生産性を示すシェークフラスコ回分式培養（batch culture）では、実験群からの単一細胞由来クローンの生産性（６７〜７２μｇ／ｍｌ）が、対照群からの単一細胞由来クローンの生産性（２〜１０μｇ／ｍｌ）よりはるかに高いということが判明した。
【００２８】
これらの結果に基づき、本発明者らは、本発明の一実施の形態による選択方法が、様々な選択マーカーの使用を介した高生産性クローンの選択において、コスト及び時間を節減するのに有用であるということを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【００２９】
一の側面おいて、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを使用する高生産性クローンの選択方法を提供する。
【００３０】
本発明の一実施の形態において、前記発現ベクターは、（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットの代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含むことができる。
【００３１】
他の実施の形態において、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセットを含み、それにより遺伝子発現カセット（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動しないように前記発現ベクターを線形化させる工程を含む、高生産性クローンの選択方法を提供する。
【００３２】
本発明の一実施の形態において、前記選択マーカー遺伝子の例として、非限定的に、ｄｈｆｒ遺伝子、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子、及びストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｈ）ｂｌｅ遺伝子を含む。これらのマーカー遺伝子に加えて、当業者に公知の選択マーカー遺伝子であるならば、いずれも本発明で利用可能である。
【００３３】
本発明の一実施の形態において、前記目的組換え蛋白質は、非限定的に、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３４】
本発明の一実施の形態において、前記宿主細胞の例として、非限定的に、真核宿主細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、又はＦ２Ｎ細胞を含むヒト宿主細胞、を含む。これらの細胞に加えて、組換え蛋白質産生細胞として当業者に公知の何れの細胞系を、本発明で使用することができる。
【００３５】
更なる側面において、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを提供する。
【００３６】
本発明の一実施の形態において、前記発現ベクターは、ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む前記遺伝子発現カセット（ｉ）の代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含むことができる。
【００３７】
本発明の一実施の形態において、前記発現ベクターは、ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット（ｉｉ）の代わりに、前記目的組換え蛋白質をコードする遺伝子の導入のためのマルチクローニングサイトを含むことができる。
【００３８】
本発明の一実施の形態において、前記選択マーカー遺伝子は、非限定的に、増幅可能な選択マーカー遺伝子、好ましくは、ｄｈｆｒ遺伝子又はグルタミンシンテターゼ遺伝子である。
【００３９】
本発明の一実施の形態において、前記選択マーカー遺伝子は、非限定的に、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｐａｃ遺伝子、又はＳｈ ｂｌｅ遺伝子である。
【００４０】
本発明の一実施の形態において、前記目的組換え蛋白質は、非限定的に、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００４１】
更なる側面において、本発明は、前記発現ベクターで形質移入された真核宿主細胞系を提供する。
【００４２】
本発明の一実施の形態において、前記宿主細胞は、動物細胞であることが好ましい。本発明の実施例では、ＣＨＯ細胞系を用いたが、本発明において、これに限定されるものではなく宿主細胞を使用することができる。ハイブリドーマ細胞またはＦ２Ｎ細胞を含む、当業者に公知の組換え蛋白質生産細胞系を本発明で使用することができる。形質移入は、当業者に公知の方法を利用することが好ましい。
【００４３】
以下、実施例を介して、本発明について詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１．作動不能なｐｏｌｙ Ａの誘導
ｐｏｌｙ Ａの有無による遺伝子の発現程度を調べるための最初の段階として、ＩｇＧ抗体発現ベクターであるｐＣＴ１０７ベクター（図１）内の３つの転写ユニットであるｄｈｆｒ遺伝子、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の３’末端に作動可能に連結されたｐｏｌｙ Ａを作動不能な状態にするために、前記ｐＣＴ１０７ベクターを、それぞれＲｓｒ ＩＩ、Ｐｍｅ Ｉ及びＣｌａ Ｉ制限酵素を用いて切断した。前記制限酵素Ｒｓｒ ＩＩ、Ｐｍｅ Ｉ及びＣｌａ Ｉは、それぞれｄｈｆｒ遺伝子、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の３’末端と対応するｐｏｌｙ Ａ間に存在する一定配列を特異的に認識して切断することによって、ＩｇＧ抗体発現ベクターを線形化（linearization）させる酵素である。
【００４５】
制限酵素処理方法は、下記の方式で実施される。３個のチューブを準備した後、各チューブに、（ｉ）ｐＣＴ１０７ベクターＤＮＡ ３０μｇ及びＲｓｒ ＩＩ（Ｒ０５０１Ｓ、ＮＥＢ）１０Ｕ、（ｉｉ）ｐＣＴ１０７ベクターＤＮＡ ３０μｇ及びＰｍｅ Ｉ（Ｒ０５６０Ｓ、ＮＥＢ）１０Ｕ、及び（ｉｉｉ）ｐＣＴ１０７ベクターＤＮＡ ３０μｇ並びにＣｌａ Ｉ（Ｒ１０９７Ｓ、ＮＥＢ）１０Ｕを添加し混合し、３７℃で４時間インキュベートした。次に、総試料体積の０．１倍容積のＮａＯＡＣと、３倍容積の１００％エタノール（ＥｔＯＨ）とを各チューブの総試料に添加し撹拌した後、−７０℃で３０分間放置し、ＤＮＡペレットを沈殿させた。次に、各チューブの内容物を、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させ、チューブ底にＤＮＡペレットを沈殿させて、各チューブに残っているエタノールを除去した。続いて、同一体積の７０％エタノールでペレットを洗浄した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、チューブに残っているエタノールを除去した。そして、ＤＮＡペレットを１０分間空気中で乾燥させた。乾燥させたペレットに蒸留水を添加し、常温で１０分間放置した。次に、ピペットを用いてＤＮＡペレットが完全に蒸留水に溶解されるように再懸濁させた。ナノドロップ（Nanodrop１０００、Thermo scientific）を使用してＤＮＡ濃度を測定した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ベクターＤＮＡが、それぞれＲｓｒ ＩＩ、Ｐｍｅ ＩまたはＣｌａ Ｉによって線形化されたか否かを確認した。発現ベクターの線形化は、ｐＣＴ１０７ベクター中の３つの転写ユニット（重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子）に連結されたｐｏｌｙ Ａがいずれも作動不能になったことを意味する。
【００４６】
実施例２．ＣＨＯ細胞系への形質移入
実施例１によって線形化されたベクターを、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞系に同量で形質移入した。次の表１に示すように対照群と実験群への形質移入を行った。
【００４７】
【表１】
【００４８】
形質移入は、下記の方法で行った。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、１０％ＦＢＳ（１２１０５、Sigma）を補充したＭＥＭα培地（１１４００７６、Invitrogen）を用いて、６−ウェルプレート（well plate）に０．５×１０６細胞／ウェルの密度で接種し、２４時間後に、ＦＢＳを含まないＭＥＭα培地に培地を置換した。３０分経過後、各ウェルに、対照群（Ａ）、実験群（Ｂ）、実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ）の各ベクターＤＮＡ２．５μｇと、Ｏｐｔｉ−ＳＦＭ培地（１２３０９−０５０、Invitrogen）５００μｌとを添加して十分に混合した後、ＬＴＸ（１５３３８−１００、Invitrogen）６．２５μｌｇを添加し、ボルテックスミキサーを利用して十分に撹拌した。得られた混合物を常温で３０分間放置した後、各ウェルに５００μｌずつ添加した。４時間後に、血清が含まれたＭＥＭα培地に再び培地を置換した。
【００４９】
実施例３．ＥＬＩＳＡを用いたＩｇＧ抗体遺伝子の発現確認
ＩｇＧ抗体遺伝子の発現有無を確認するために、形質移入３日後に、ＥＬＩＳＡを行った。まず、ヤギの抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃγ）（１０９−００６−０９８、Jackson ImmunoReserarch）を、９６−ウェル・マイクロタイタープレート（４４９８２４、Ｎｕｎｃ）上に吸着させた。前記プレートを１％ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（phospate-buffered saline、ＰＢＳ）で処理してブロッキングした後、連続希釈した試料を各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間放置した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトカッパー抗体（peroxidase-labeled goat anti-human κ antibody）（Ｉ１５１４、Sigma）で検出のため処理した。室温で１時間放置した後、前記試料をテトラメチルベンジジン（tetramethyl benzidine、ＴＭＢ）と反応させ、１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。スタンダードとしては、骨髄種プラズマから精製したヒトＩｇＧ１ カッパー（human ＩｇＧ１ kappa purified myeloma plasma）（Ａ７１６４、Sigma）を２５０ｎｇ／ｍｌの濃度から用いた。プレートリーダー（Spectramax plus ３８４、Molecular Device）を使用し、４５０／６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５０】
図２から確認することができるように、対照群（Ａ）と実験群（Ｂ）とでは、ＩｇＧが正常に発現したが、実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ）の場合には、ＩｇＧが正常に発現しなかった。このことは、前記対応遺伝子の３’末端に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動しないように操作した遺伝子発現カセットの場合、当該遺伝子がコードする蛋白質が正常に発現していないことが分かった（実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ））。
【００５１】
また、少なくとも選択薬剤を使用せずに培養する一過性形質移入では、選択マーカー遺伝子がコードする蛋白質（ＤＨＦＲ蛋白質）の発現有無が、発現ベクター中の前記対応遺伝子によってコードされる蛋白質（特に、抗体）の発現レベルに影響を及ぼさないということを確認することができた。
【００５２】
実施例４．ｐｏｌｙ Ａが作動しないｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を用いた細胞クローンの選択
選択マーカー遺伝子であるｄｈｆｒ遺伝子の３’末端に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動しないように操作するために、前記実施例１と同じ処理条件下で、ｐＣＴ１０７ベクターをＲｓｒ ＩＩ制限酵素（Ｒ０５０１、ＮＥＢ）で処理し、それにより実験群（Ｅ）を得た。得られたベクターをＣＨＯ ＤＧ４４細胞系に形質移入した。対照群としては、制限酵素で処理していないｐＣＴ１０７ベクター（対照群（Ａ））を用いた。前記実施例１と同じ方法で、形質移入を行った。対照群（Ａ）のベクターと実験群（Ｅ）のベクターとを細胞系に導入し、３日後に測定したＩｇＧ抗体の発現レベルは、それぞれ３．９μｇ／ｍｌ及び３．８μｇ／ｍｌであった。形質移入に続く培養開始後の３日目、対照群（Ａ）細胞及び実験群（Ｅ）細胞をそれぞれの細胞を９６−ウェルプレートに移し、続いて、２％ウシ胎児血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）及び１００ｎＭ ＭＴＸ（８１３６３０、Bedford Labs）を含んだＳＦＭ４ＣＨＯ（商標）培地（ＳＨ３０５４９．０２、HyClone）中で培養した。対照群（Ａ）の場合、０．５×１０６細胞／９６−ウェルプレートを接種して培養し、そして、実験群（Ｅ）の場合、２×１０６細胞／９６−ウェルプレートを接種して培養した。
【００５３】
培養後、増殖細胞が存在するウェルの数を調べた。その結果、対照群（Ａ）の場合、総２，５９２個のウェル中５１４個のウェル（１９．８％）で細胞増殖が見られ、実験群（Ｅ）の場合、総２，１１２個のウェル中５４個のウェル（２．５％）で細胞増殖が見られた。言い換えれば、前記対照群（Ａ）の場合、増殖細胞が９６−ウェルプレート当たり１９ウェルに存在し、実験群の場合、増殖細胞が９６−ウェルプレート当たり２．５ウェルに存在した。前記結果を基にして、細胞増殖を示すそれぞれのウェルで増殖する細胞が、１つの細胞から由来したと仮定したとき、前記各群間での増殖細胞比率は、３１：１（対照群（Ａ）：実験群（Ｅ））であって、さらに大きい違いがあるということを確認することができた（下記表２、図３〜図５）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
次に、増殖細胞を有するウェル中で、高い力価を示すウェルを選択した。その結果、対照群（Ａ）の場合、５１４個のウェル中から１５７個のウェルが選択され、実験群（Ｅ）の場合、５４個のウェル中から２８個のウェルが選択された。この後、前記選択されたウェル内の細胞を２４−ウェルプレートに移し、培養スケールを増加させ、３日後に、前記２４−ウェルプレートで高い力価を示す６の細胞集団を、対照群（Ａ）及び実験群（Ｅ）夫々から選択し、６−ウェルプレートに接種して培養した。対照群（Ａ）と実験群（Ｅ）夫々から選択された６の細胞集団をｐ−ｃｌｏｎｅと命名し、そして、ＦＢＳとＭＴＸを含まない培地を用いて、エルレンマイヤーフラスコ中に接種して撹拌条件下で培養した。対照群（Ａ）と実験群（Ｅ）との生産性を比較した。
【００５６】
その結果、対照群（Ａ）において、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち１個のｐ−ｃｌｏｎｅだけが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示したが、一方、実験群（Ｅ）の場合、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち４個のｐ−ｃｌｏｎｅが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示した（図６）。
【００５７】
実施例５．選択マーカー遺伝子の利用のための細胞増殖条件
さまざまな細胞系で、遺伝子増幅に関与しない一般的な選択マーカー遺伝子の利用性を調べるために、各選択マーカー遺伝子に作用する薬剤を、表３に記述した条件下で各細胞系に適用し、細胞増殖の抑制を測定した。
【００５８】
本実験において用いられた細胞系は、ＣＨＯ Ｋ１とＦ２Ｎ７８（ヒト細胞系）とであり、各細胞系は、ＣＤ Ｏｐｔｉ ＣＨＯ培地（１２６８１、Invitrogen）とＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３ 無血清培地（１４５７１ｃ、Sigma）中で培養したものであり、本実施例でも同じ培地で培養した。各細胞系５ｍｌを、５×１０４細胞／ｍｌと１５×１０４細胞／ｍｌの細胞密度で６−ウェルプレートの各ウェルに添加した。これは、１×１０６細胞／９６−ウェルプレート（２０ｍｌ）及び３×１０６細胞／９６−ウェルプレート（２０ｍｌ）の細胞密度に該当する。前記１×１０６細胞／９６−ウェルプレート及び３×１０６細胞／９６−ウェルプレートの細胞密度は、実施例６のｐｏｌｙ Ａ欠損選択マーカーを用いた選択方法で用いられる細胞密度であった。２種の薬剤濃度を各細胞系に用い、３日ごとに各ウェルの半分の培地（２．５ｍｌ）を除去し、同一量の新しい培地で置換した。本実施例で用いた薬剤の種類及び詳細は、下記表４に明示した。このとき、新しい培地は、常に指定された濃度の薬剤を含んでいた。
【００５９】
２週後、トリパンブルーでの細胞染色方法を介して、あらゆる薬剤処理条件（表２）において、形質移入をしていないＣＨＯ Ｋ１細胞とＦ２Ｎ細胞の増殖が観察されなかったことが見出された。すなわち、形質移入後、薬剤処理条件下での培養における、増殖の存在は、形質移入された選択マーカー遺伝子によって処理された薬剤が不活性化されることを示し、それにより、細胞が成長するものであることを意味する。
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
実施例６．ｐｏｌｙ Ａを含まないｐａｃ選択マーカー遺伝子を用いた蛋白質−生産性細胞系の確立
先に確認したとおり、ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結されたｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を用いた選択方法が、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞系での高生産性クローン選択において、費用及び時間を低減する観点から、非常に効率的である。このような選択方法が、ｄｈｆｒ遺伝子以外の選択マーカーとＣＨＯ ＤＧ４４細胞系以外の細胞系でも適用されるか否かを調べるために、本実験において、ｐｏｌｙ Ａが完全に欠損したｐａｃ選択マーカー遺伝子を用いた選択方法をＣＨＯ Ｋ１細胞株に適用して、その効能を検討した。
【００６３】
ｐｏｌｙ Ａの機能を完全に除去するために、本実施例では、免疫グロブリン発現ベクター（ｐＣＴ１１２ベクター）からｄｈｆｒ転写ユニット（プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ｐｏｌｙ Ａ）を完全に除去し、プロモーター−ｐａｃ遺伝子またはプロモーター−ｐａｃ遺伝子−ｐｏｌｙ Ａを挿入することによって、ｐＣＴ１３０ベクターとｐＣＴ１２９ベクターとを構築した（図７及び図８）。ベクター構築方法は、下記の通りである。ｐａｃ遺伝子含有ｐＰＵＲベクター（６３１６０１、Clontech）からＰｖｕ ＩＩ（１０−６４２−６９０−００１４、Roche）とＸｂａ Ｉ（Ｒ０１４５Ｓ、ＮＥＢ）制限酵素を用いて、ＳＶ４０プロモーター及びｐａｃ遺伝子のコーディング配列を単離し、Ｎｒｕ Ｉ（Ｒ０１９２Ｌ、ＮＥＢ）制限酵素とＸｂａ Ｉ制限酵素を用いてｄｈｆｒ転写単位を除去したｐＣＴ１１２ベクターにクローニングし、それにより、ｐＣＴ１３０ベクター（図７）を構築した。また、これに対する比較群のために、ｐＰＲＵベクターからＰｖｕ ＩＩとＢａｍＨ Ｉ（Ｒ０１３６Ｓ、ＮＥＢ）制限酵素とを用いてＳＶ４０プロモーター、ｐａｃ遺伝子及びｐｏｌｙ Ａを単離し、ｄｈｆｒ転写ユニットを除去したｐＣＴ１１２ベクターにクローニングし、それにより、ｐＣＴ１２９ベクター（図８）を構築した。
【００６４】
ＣＨＯ Ｋ１細胞株を、ｐＣＴ１２９ベクター及びｐＣＴ１３０ベクターで形質移入し、そして２日後に、９６−ウェルプレートに、下記表５のような様々な濃度のピューロマイシン（puromycin）が添加された培地を用いて細胞を接種した。本実施例で用いた培地は、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地であり、ＦＢＳは添加されなかった。ｐＣＴ１２９ベクターを形質移入した対照群では、０．３×１０６細胞／プレートの接種密度と、６μｇ／ｍｌピューロマイシンの選択条件が適切であり、ｐＣＴ１３０ベクターを形質移入された実験群では、３×１０６細胞／プレートの接種密度と、６μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いた選択条件が適切であった。特に、本実施例では、何回もの形質移入実験を介して、ｐｏｌｙ Ａを有する選択マーカーを含む対照群と、ｐｏｌｙ Ａを有しない選択マーカーを含む実験群から、類似した数のｐ−ｃｌｏｎｅを選択し、そして、ｐ−ｃｌｏｎｅにおける免疫グロブリンの発現レベルをそれぞれ比較した。
【００６５】
【表５】
【００６６】
前記表５の選択条件下で増殖する細胞が存在するウェルの抗体生産を、ＥＬＩＳＡで測定し、９６−ウェルプレートから抗体生産性の高いｐ−ｃｌｏｎｅを選択し（図９）、２４−ウェルプレートに移した。続いて、さらに抗体の生産性を測定するために、各クローン試料を２倍段階希釈（2-fold serial dilution）し、ＥＬＩＳＡにより分析した（図１０）。前記ｐ−ｃｌｏｎｅのうち、抗体生産性の高い４１個のｐ−ｃｌｏｎｅを６−ウェルプレートに移した後、さらにそれらの抗体生産性を測定した（図１１）。図９〜図１１から分かるように、抗体生産性の高いｐ−ｃｌｏｎｅを選択するための２つの工程（９６−ウェルプレートと２４−ウェルプレートとでの選択工程）で、ｐｏｌｙ Ａを含むｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来のｐ−ｃｌｏｎｅより、ｐｏｌｙ Ａを含まないｐＣＴ１３０ベクター（実験群）由来のｐ−ｃｌｏｎｅの方から、抗体生産性の高いｐ−ｃｌｏｎｅがさらに多く選択されたということが理解される。
【００６７】
また各群から、高い生産性を有するｐ−ｃｌｏｎｅ １２９−４及び１３０−３５を選択し、制限希釈クローニング（limiting dilution cloning、ＬＤＣ）を行った。それらを９６−ウェルプレートで培養するときは、選択したｐ−ｃｌｏｎｅを２μｇ／ｍｌピューロマイシンを処理し、一方、２４−ウェルプレート及び６−ウェルプレートで前記クローンを培養するときは、ピューロマイシンを添加しなかった。９６−ウェルプレート、２４−ウェルプレート及び６−ウェルプレートスケールでの選択工程を経て、生産性の高い単一細胞クローン５個ずつ各群から選択し、６−ウェルプレートでの生産性（図１２）、及びシェークフラスコ（shake flask）状態での生産性（図１３）を調べた。シェークフラスコでの生産性は、同じ条件下での回分式培養（batch culture）を行うことにより重複で行った。
【００６８】
図１２から分かるように、ｐＣＴ１３０ベクターに由来する前記クローンの生産性（２５〜３２μｇ／ｍｌ／３日）は、ｐＣＴ１２９ベクターに由来する前記クローンの生産性（７〜１８μｇ／ｍｌ／３日）よりも、約２倍高かった。これは、高い生産性のクローンが、選択マーカーにおいてｐｏｌｙ Ａを含まないから構築され得ることを示す。また、生産性をさらに実質的な側面から検討することができるシェークフラスコを用いた回分式培養条件では、図１３から分かるように、選択マーカーにおいてｐｏｌｙ Ａを含まないｐＣＴ１３０ベクター（実験群）由来のクローンは、６２〜７２μｇ／ｍｌの生産性を示し、一方、選択マーカーにおいてｐｏｌｙ Ａを含むｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来のクローンは、２〜１０μｇ／ｍｌの生産性を示す。これらの細胞増殖条件において、細胞増殖率は２つの群で類似しているが、ｐＣＴ１３０ベクター（実験群）に由来する前記クローンが、ｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来の前記クローンよりも６倍以上の生産性を示す。このような顕著な差は、ｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来のクローンにおいて、選択条件不在下では、ＩｇＧ遺伝子の発現が容易に抑制されるか、あるいはＩｇＧ遺伝子が容易に欠失するという現象に起因すると考えることができる。
【００６９】
以上の結果から、ｐｏｌｙ Ａを有する選択マーカーを含む発現ベクターで形質移入された細胞系よりも、むしろ本発明の一実施の形態によるｐｏｌｙ Ａを有しない選択マーカーを含む発現ベクターで形質移入された細胞系が、抗体発現レベルの高い細胞系を獲得できる方法であることが分かる。よって、本発明の一実施の形態による選択方法は、ＭＴＸの量を増加させながら数回増幅工程を実施することを含む従来の段階的遺伝子増幅戦略と比較して、高生産性細胞クローンを選択するための時間を短縮させることができる。これにより、高生産性を有する細胞クローン開発のための手間及び費用を低減させることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的蛋白質の高発現のための細胞系（本明細書では「高生産性クローン」と称する）の選択方法に関し、さらに具体的には、（ｉ）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを用いた高生産性クローンの選択方法及びその発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学分野または医学分野において生産しようとする目的蛋白質は、目的蛋白質の遺伝子を発現ベクターに挿入し、前記蛋白質を生産する細胞系に形質移入し、得られた細胞系を大量に培養し、これを適切な方法で前記培養された細胞系から分離及び精製する工程を経て収得される。
【０００３】
このために、産業的に使われる方法の一例としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovary））ｄｈｆｒ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ（dihydrofolatereductase））（−）、ＣＨＯ Ｋ１、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞（Baby Hamster Kidney））、ＮＳ０、ＳＰ２／０及びヒト細胞系等を用いた方法が含まれる（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３）。
【０００４】
目的とする外来（heterologous）遺伝子を発現する安定した哺乳動物細胞系作成のために、外来遺伝子は、一般的に、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）と共に、所望の細胞系に形質移入によって挿入される。外来遺伝子及び選択マーカー遺伝子は、単一ベクターまたは同時に形質移入される別個のベクターによって発現され得る。形質移入の２、３日後、選択マーカーとしてネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を使用する場合、細胞をＧ４１８のような選択薬剤を含有する培地に移し、それらの選択条件下で数週間培養する。次に、出現する耐性細胞を単離でき、目的遺伝子産物の発現を調べる。宿主細胞ゲノムへのランダムであって非定方向的な組込みの結果として、完全に異なる割合で外来遺伝子を発現する細胞集団を収得する。これらはまた、選択マーカーを発現するが、目的とする遺伝子を発現しない非発現細胞を含むことが可能である。従って、目的とする外来遺伝子の発現が非常に高い細胞クローンを同定するためには、多数のクローンを調べて試験する必要があり、これは、時間消耗的であり、また多くの手間と費用とがかかる。
【０００５】
遺伝子増幅は、組換え蛋白質の製造に使われる動物細胞培養において普遍化された技術である。遺伝子増幅は、多数の哺乳動物細胞系が有する相対的に低い生産性を顕著に改善させる。当該分野で広範囲に使われる１つの増幅技術は、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄｈｆｒ）系の遺伝子増幅システムであり、このｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞が頻繁に使われる。
【０００６】
ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞系が、産業的に好まれる理由としては、次のような点を挙げることができる。（１）蛋白質の翻訳後修正（posttranslational modification）、すなわち、グリコシル化（glycosylation)過程やリン酸化(phosphorylation)が、他の細胞類よりもさらにヒト細胞類と類似している。（２）付着培養だけではなく、浮遊培養が可能である。（３）これらの細胞類は、無血清培地で、他の細胞類に比べて相対的に高濃度での培養が可能である。（４）微生物類に比べて、顕著に低い目的蛋白質の生産性を、ｄｈｆｒ／ＭＴＸ（メトトレキサート（methotrexate））遺伝子増幅システムを利用して増加させることができる。（５）これらの細胞類は安定性が検証され、ＦＤＡのような監督機関から許可を容易に受けることができる。前記のような理由で、目的蛋白質を生産する組換え細胞系を作成するために、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞系が産業的に広く使われている。
【０００７】
しかし、目的蛋白質をコードする遺伝子をｄｆｈｒ欠損ＣＨＯ細胞系に形質移入した後、細胞をＭＴＸの濃度を段階的に上昇させて処理することによって、目的蛋白質の生産性を顕著に高めることができる従来法のｄｈｆｒ／ＭＴＸ遺伝子増幅システムを利用する場合にさえも、ＭＴＸの濃度を段階的に高めて細胞を処理する工程で長時間かかり、かつこの工程でスクリーニングされる細胞集団の数が５００〜４，０００群を超えるために、高い生産性を有する細胞集団の選択工程が労働集約的であり、時間消費的及び費用消耗的になってしまう。従って、このような選択段階を簡素化するための努力が、多角的に試みられている。
【０００８】
例えば、当該技術分野の研究者は、以下の方法等を利用して選択工程を簡素化させるべく努力した。（１）開始コドン近傍を改変させることにより選択マーカー遺伝子の発現を低下させる方法（特許文献１）。（２）遺伝子の変異により選択マーカー遺伝子の機能を損なわせる方法（非特許文献４及び非特許文献５）。（３）開始コドン自体を改変させ、改変開始コドンに発現しようとする遺伝子を連結させて、それにより前記遺伝子の発現レベルを上昇させる方法（非特許文献６）。（４）選択マーカー遺伝子をイントロンと連結させて、前記遺伝子を発現する方法（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第5733799号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ogata，et al．，Appl．Microbiol．Biotechnol．，1993，38(4)，520-525
【非特許文献２】Kratje，et al．，Biotechnol．Prog．，1994，10(4)，410-20
【非特許文献３】Peakman，et al．，Hum．Antibodies Hybridomas，1994，5(1-2)，65-74
【非特許文献４】Niwa et al．，Gene 108，193-200，1991
【非特許文献５】Sauter and Enenkel，Biotechnol．Bioeng．89，530-538，2005
【非特許文献６】van Blokland et al．，J of Biotechnology 128，237-245，2007
【非特許文献７】Lucas et al．，Nucleic Acids Res．24，1774-1779，1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用する高生産性クローンの選択方法を提供することである。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記選択方法に使用される発現ベクターを提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記発現ベクターが形質移入された真核宿主細胞系を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記のような目的を達成するために、本発明は、（ｉ）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを使用する高生産性クローンの選択方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、前記発現ベクターで形質移入された真核宿主細胞系を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、既存の細胞系選択方法より少なくとも１０倍少ない数の細胞集団から高生産性細胞クローンの選択が可能である。特に、ＭＴＸの量を増加させながらの数回の増幅工程を含む一般的な段階的遺伝子増幅ストラテジーと比較して、低濃度のＭＴＸを使用して、高生産性クローンを選択することができる。結果的に、細胞系の発達期間が短縮され、かつ高生産性クローンの選択にかかる手間及び費用を減らすことによって、さらに効率的な組換え蛋白質の生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＣＴ１０７発現ベクターの開裂地図である。地図上に表示された制限酵素Ｐｍｅ Ｉ、Ｃｌａ Ｉ及びＲｓｒ ＩＩは、ｐＣＴ１０７発現ベクターによってコードされる抗体の重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子、及びＤＨＦＲ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動しないようにｐＣＴ１０７ベクターを切断させる部位を示している。
【図２】対照群（Ａ）、実験群（Ｂ）、実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ）の発現ベクターでそれぞれ形質移入されたＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ抗体の発現力価（titer）を測定した結果である。図２中、対照群（Ａ）は、制限酵素で処理していない環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、 実験群（Ｂ）は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターであり、 実験群（Ｃ）は、Ｐｍｅ Ｉで処理して重鎖遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターであり、実験群（Ｄ）は、Ｃｌａ Ｉで処理して軽鎖遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。試料中に重鎖や軽鎖を含まない場合（実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ））では、ＥＬＩＳＡの特性によりＩｇＧ抗体の力価が測定されていない。実験は全て５回行われ、誤差範囲は標準誤差で示した。
【図３】９６−ウェルプレートスケールでのｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａの有無に依存して細胞クローンを選択する工程において見出された力価の比較を示すグラフである。図３中、未切断は、正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図４】２４−ウェルプレートスケールでのｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａの有無に依存して細胞クローンを選択する工程において見出された力価の比較を示すグラフである。図４中、未切断は、正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図５】６−ウェルプレートスケールでのｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａの有無に依存して細胞クローンを選択する工程において見出された力価の比較を示すグラフである。図５中、未切断は、正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図６】シェークフラスコを用いた回分式培養（batch culture）状態における対照群と実験群から６個のｐ−ｃｌｏｎｅの生産性を比較した結果を示すグラフであり、ここでｐ−ｃｌｏｎｅは対照群と実験群についてｐｏｌｙ Ａの有無によって高い力価を示すものを選択したものである。図６中、未切断は正常な環形ｐＣＴ１０７ベクターであり、ＲｓｒＩＩ 切断は、Ｒｓｒ ＩＩで処理してｄｈｆｒ遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動不能に操作された線形ｐＣＴ１０７ベクターである。
【図７】ｐＣＴ１３０ベクターの発現ベクタークローニング工程を示す模式図である。
【図８】ｐＣＴ１２９ベクターの発現ベクタークローニング工程を示す模式図である。
【図９】９６−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフであり、図９中、ｐＣＴ１２９（ｐｏｌｙ Ａを有する）はｐｏｌｙ Ａ活性を有する対照群、ｐＣＴ１３０（ｐｏｌｙ Ａを有しない）はｐｏｌｙ Ａ欠損実験群を示す。
【図１０】２４−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフであり、図１０中、ｐＣＴ１２９（ｐｏｌｙ Ａを有する）はｐｏｌｙ Ａ活性を有する対照群、ｐＣＴ１３０（ｐｏｌｙ Ａを有しない）はｐｏｌｙ Ａ欠損実験群を示す。
【図１１】６−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフであり、図１１中、ｐＣＴ１２９（ｐｏｌｙ Ａを有する）はｐｏｌｙ Ａ活性を有する対照群、ｐＣＴ１３０（ｐｏｌｙ Ａを有しない）はｐｏｌｙ Ａ欠損実験群を示す。
【図１２】６−ウェルプレートスケールでの対照群と実験群との生産性を比較した結果を示すグラフである。
【図１３】シェークフラスコを用いた回分式培養において、対照群と実験群とで生産性を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
略語
ｄｈｆｒ：ジヒドロ葉酸リダクターゼ（dihydrofolate reductase）
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary）
ｐｏｌｙ Ａ：ポリアデニル化シグナル（polyadenylation signal）
ｐ−ｃｌｏｎｅ：単一細胞由来クローンではない予備クローン（preliminary clone）
ＭＴＸ：メトトレキサート（methotrexate）
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法（enzyme-linked immunosorbent assay）
【００２０】
以下、本明細書中で使われる用語を定義する。
本明細書中の用語「選択マーカー遺伝子（selection marker gene）」とは、目的蛋白質の遺伝子と連結されて発現ベクターに挿入されたマーカー遺伝子であり、それによって、目的遺伝子が正常に発現される細胞を確認することができる。また、選択マーカー遺伝子によってコードされる蛋白質の抑制剤を培地に添加すれば、選択マーカー遺伝子のコピー数を増加させたり、あるいは増加した選択マーカー遺伝子に連結されている目的蛋白質の遺伝子のコピー数をともに増加させることができる。選択マーカーとしては、ｄｈｆｒ遺伝子、グルタミンシンテターゼ（glutamine synthetase）遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neomycinephosphotransferase）遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（hygromycin Ｂ phosphotransferase）遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ、puromycin−Ｎ−acetyltransferase）遺伝子またはストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｈ、Streptoalloteichus hindustanus）ｂｌｅ遺伝子などがある。
【００２１】
本明細書中の用語「ｐｏｌｙ Ａ」とは、真核細胞ｍＲＮＡの３’末端の特定部位を切断させ、切断された３’末端に、約１００〜２００個のアデニンヌクレオチド（ｐｏｌｙ Ａ tail）配列を翻訳後に導入するシグナル配列のことである。当該ポリアデニル化シグナル（polyadenylationsignal）配列は、切断部位の約１０〜３０ヌクレオチド上流に位置したコンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡ及び下流に位置した配列をいう。ｔｋ ｐｏｌｙ Ａ、ＳＶ４０ late及びearly ｐｏｌｙ Ａ、又は、ＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａのようなさまざまなｐｏｌｙ Ａシグナルが公知である。
【００２２】
本明細書中の用語「作動可能に連結された（operably linked）」とは、１の核酸フラグメントが第２の核酸フラグメントと連結し、その機能又は発現が、第２の核酸フラグメントによって影響を受けることをいう。また、「作動可能に連結された」とは、例えば、遺伝子配列の転写が作動可能に連結されたプロモーター配列によって指示され、又は、遺伝子配列の翻訳が作動可能に連結された翻訳調節配列によって指示され、または遺伝子配列の翻訳後のプロセッシングが作動可能に連結されたプロセッシング配列によって指示されるような、遺伝子配列、及びプロモーター、又は他の調節配列及びプロセッシング配列との連結を意味するのに使われる。用語「作動不能に連結された」は、用語「作動可能に連結された」と反対の意味であり、一般に、当業者に公知の切断、欠失、点突然変異及びアミノ酸置換のような方法による人為的な操作によって作動不能になる連結を含む意図である。
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者らは、高生産性クローンを選択する新規な方法について研究し、その結果、ｐｏｌｙ ＡがｍＲＮＡの転写と安定性に大きく影響を及ぼし、そして、ｐｏｌｙ Ａの長さは時間の経過と共に幾分短くなった場合、ｍＲＮＡが分解され始め、そしてこの理由のため、ｐｏｌｙ Ａが正常に作動しなければ、ｍＲＮＡの半減期は正常ｍＲＮＡに比べてはるかに短い。この知見に基づき、ｐｏｌｙ Ａに注目して新規な選択方法を開発するための研究を行った。
【００２４】
例えば、発現ベクター内の選択マーカー遺伝子に連結されたｐｏｌｙ Ａを作動不能に操作した後、これを宿主細胞内に形質移入し、選択マーカー遺伝子によってコードされる蛋白質の抑制剤が存在する選択条件下で培養する場合には、ｐｏｌｙ Ａが正常に作動していない選択マーカー遺伝子は、安定的にｍＲＮＡを生産することができないので、前記選択条件下では、大部分の細胞が死滅するものであり、そのうち、多くのコピー数のベクターが形質移入された細胞だけ生存できる。このとき、形質移入に使用された発現ベクターには、選択マーカー遺伝子と、目的組換え蛋白質をコードする遺伝子とが共に含まれているので、選択マーカー遺伝子のコピー数と比例して、目的蛋白質をコードする遺伝子もまた、多くのコピー数で存在する。
【００２５】
本発明における、高生産性クローンを選択するための新規な方法として選択マーカー遺伝子に連結したｐｏｌｙ Ａの作動可能性を適用できることを証明するために、ｐＣＴ１０７ベクター（図１参照）上の選択マーカー遺伝子であるｄｈｆｒ遺伝子の３’末端に連結されたｐｏｌｙ Ａを、適当な制限酵素で切断し、ｐｏｌｙ Ａが作動しないように操作した。続いて、得られたベクターをＣＨＯ ＤＧ４４細胞系（実験群）に形質移入し、そして、前記細胞系からの高生産性クローンの選択工程を、制限酵素を処理していないｐＣＴ１０７ベクターを形質移入したＣＨＯ ＤＧ４４細胞系（対照群）と比較した。その結果、実験群中で、組換え蛋白質生産細胞株候補群の数字が、対照群に比較したとき、実験群において、プレート当たりの細胞が増殖したウェル数が、対照群と比較して７．６倍ほど少ないことを示し、そして、増殖細胞比率は、（１／２６２６４）：（１／８１４８１５）であり、実験群における増殖細胞比率が対照群と比較して３１倍が低いということを示す（表２参照）。
【００２６】
次に、対照群と実験群との間での増殖細胞の生産性を比較するために、各群で最上位の生産性を示す６個の細胞系を選択し、それらの生産性を調べた。対照群の場合、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち１個のｐ−ｃｌｏｎｅだけが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示し、一方、実験群の場合には、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち４個のｐ−ｃｌｏｎｅが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示すことを確認した（図６参照）。
【００２７】
また、上述した本発明の選択方法が、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞でのｄｈｆｒ選択マーカーを用いたシステム以外の他のシステムにも適用されるか否かを確認するために、ＣＨＯ Ｋ１細胞でのｐａｃ選択マーカーでのシステムを使用して実験した。この目的のため、ｐＣＴ１１２ベクター（図７及び図８参照）上のｄｈｆｒ転写ユニット（プロモーター−ｄｈｆｒ−ｐｏｌｙ Ａ）を除去し、そして、前記ベクターにＳＶ４０プロモーター及びｐａｃ遺伝子を挿入し、それにより実験ベクター（ｐＣＴ１３０ベクター、図７参照）を構築した。さらに、ＳＶ４０プロモーター、ｐａｃ遺伝子及びｐｏｌｙ Ａ（ｐａｃ転写ユニット）を前記ベクターに挿入し対照ベクター（ｐＣＴ１２９ベクター、図８参照）を構築した。次に、構築したベクター夫々をＣＨＯ Ｋ１細胞に形質移入し、そして、対照細胞系と実験細胞系とを選択し、続いて選択した細胞系の生産性を調べた。図９ないし図１３から理解できるように、対照群（ｐＣＴ１２９ベクター）に由来するクローンに比べて、実験群（ｐＣＴ１３０ベクター）に由来するクローンの生産性が高かった。特に、前記ウェルプレートに基づく選択工程で取得されたものと比較してより実質的な生産性を示すシェークフラスコ回分式培養（batch culture）では、実験群からの単一細胞由来クローンの生産性（６７〜７２μｇ／ｍｌ）が、対照群からの単一細胞由来クローンの生産性（２〜１０μｇ／ｍｌ）よりはるかに高いということが判明した。
【００２８】
これらの結果に基づき、本発明者らは、本発明の一実施の形態による選択方法が、様々な選択マーカーの使用を介した高生産性クローンの選択において、コスト及び時間を節減するのに有用であるということを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【００２９】
一の側面おいて、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを使用する高生産性クローンの選択方法を提供する。
【００３０】
本発明の一実施の形態において、前記発現ベクターは、（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットの代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含むことができる。
【００３１】
他の実施の形態において、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセットを含み、それにより遺伝子発現カセット（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動しないように前記発現ベクターを線形化させる工程を含む、高生産性クローンの選択方法を提供する。
【００３２】
本発明の一実施の形態において、前記選択マーカー遺伝子の例として、非限定的に、ｄｈｆｒ遺伝子、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子、及びストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｈ）ｂｌｅ遺伝子を含む。これらのマーカー遺伝子に加えて、当業者に公知の選択マーカー遺伝子であるならば、いずれも本発明で利用可能である。
【００３３】
本発明の一実施の形態において、前記目的組換え蛋白質は、非限定的に、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３４】
本発明の一実施の形態において、前記宿主細胞の例として、非限定的に、真核宿主細胞、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、又はＦ２Ｎ細胞を含むヒト宿主細胞、を含む。これらの細胞に加えて、組換え蛋白質産生細胞として当業者に公知の何れの細胞系を、本発明で使用することができる。
【００３５】
更なる側面において、本発明は、（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットと、（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを提供する。
【００３６】
本発明の一実施の形態において、前記発現ベクターは、ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む前記遺伝子発現カセット（ｉ）の代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含むことができる。
【００３７】
本発明の一実施の形態において、前記発現ベクターは、ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット（ｉｉ）の代わりに、前記目的組換え蛋白質をコードする遺伝子の導入のためのマルチクローニングサイトを含むことができる。
【００３８】
本発明の一実施の形態において、前記選択マーカー遺伝子は、非限定的に、増幅可能な選択マーカー遺伝子、好ましくは、ｄｈｆｒ遺伝子又はグルタミンシンテターゼ遺伝子である。
【００３９】
本発明の一実施の形態において、前記選択マーカー遺伝子は、非限定的に、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｐａｃ遺伝子、又はＳｈ ｂｌｅ遺伝子である。
【００４０】
本発明の一実施の形態において、前記目的組換え蛋白質は、非限定的に、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００４１】
更なる側面において、本発明は、前記発現ベクターで形質移入された真核宿主細胞系を提供する。
【００４２】
本発明の一実施の形態において、前記宿主細胞は、動物細胞であることが好ましい。本発明の実施例では、ＣＨＯ細胞系を用いたが、本発明において、これに限定されるものではなく宿主細胞を使用することができる。ハイブリドーマ細胞またはＦ２Ｎ細胞を含む、当業者に公知の組換え蛋白質生産細胞系を本発明で使用することができる。形質移入は、当業者に公知の方法を利用することが好ましい。
【００４３】
以下、実施例を介して、本発明について詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１．作動不能なｐｏｌｙ Ａの誘導
ｐｏｌｙ Ａの有無による遺伝子の発現程度を調べるための最初の段階として、ＩｇＧ抗体発現ベクターであるｐＣＴ１０７ベクター（図１）内の３つの転写ユニットであるｄｈｆｒ遺伝子、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の３’末端に作動可能に連結されたｐｏｌｙ Ａを作動不能な状態にするために、前記ｐＣＴ１０７ベクターを、それぞれＲｓｒ ＩＩ、Ｐｍｅ Ｉ及びＣｌａ Ｉ制限酵素を用いて切断した。前記制限酵素Ｒｓｒ ＩＩ、Ｐｍｅ Ｉ及びＣｌａ Ｉは、それぞれｄｈｆｒ遺伝子、重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の３’末端と対応するｐｏｌｙ Ａ間に存在する一定配列を特異的に認識して切断することによって、ＩｇＧ抗体発現ベクターを線形化（linearization）させる酵素である。
【００４５】
制限酵素処理方法は、下記の方式で実施される。３個のチューブを準備した後、各チューブに、（ｉ）ｐＣＴ１０７ベクターＤＮＡ ３０μｇ及びＲｓｒ ＩＩ（Ｒ０５０１Ｓ、ＮＥＢ）１０Ｕ、（ｉｉ）ｐＣＴ１０７ベクターＤＮＡ ３０μｇ及びＰｍｅ Ｉ（Ｒ０５６０Ｓ、ＮＥＢ）１０Ｕ、及び（ｉｉｉ）ｐＣＴ１０７ベクターＤＮＡ ３０μｇ並びにＣｌａ Ｉ（Ｒ１０９７Ｓ、ＮＥＢ）１０Ｕを添加し混合し、３７℃で４時間インキュベートした。次に、総試料体積の０．１倍容積のＮａＯＡＣと、３倍容積の１００％エタノール（ＥｔＯＨ）とを各チューブの総試料に添加し撹拌した後、−７０℃で３０分間放置し、ＤＮＡペレットを沈殿させた。次に、各チューブの内容物を、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させ、チューブ底にＤＮＡペレットを沈殿させて、各チューブに残っているエタノールを除去した。続いて、同一体積の７０％エタノールでペレットを洗浄した後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、チューブに残っているエタノールを除去した。そして、ＤＮＡペレットを１０分間空気中で乾燥させた。乾燥させたペレットに蒸留水を添加し、常温で１０分間放置した。次に、ピペットを用いてＤＮＡペレットが完全に蒸留水に溶解されるように再懸濁させた。ナノドロップ（Nanodrop１０００、Thermo scientific）を使用してＤＮＡ濃度を測定した後、アガロースゲル電気泳動を行い、ベクターＤＮＡが、それぞれＲｓｒ ＩＩ、Ｐｍｅ ＩまたはＣｌａ Ｉによって線形化されたか否かを確認した。発現ベクターの線形化は、ｐＣＴ１０７ベクター中の３つの転写ユニット（重鎖遺伝子、軽鎖遺伝子及びｄｈｆｒ遺伝子）に連結されたｐｏｌｙ Ａがいずれも作動不能になったことを意味する。
【００４６】
実施例２．ＣＨＯ細胞系への形質移入
実施例１によって線形化されたベクターを、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞系に同量で形質移入した。次の表１に示すように対照群と実験群への形質移入を行った。
【００４７】
【表１】
【００４８】
形質移入は、下記の方法で行った。ＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、１０％ＦＢＳ（１２１０５、Sigma）を補充したＭＥＭα培地（１１４００７６、Invitrogen）を用いて、６−ウェルプレート（well plate）に０．５×１０６細胞／ウェルの密度で接種し、２４時間後に、ＦＢＳを含まないＭＥＭα培地に培地を置換した。３０分経過後、各ウェルに、対照群（Ａ）、実験群（Ｂ）、実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ）の各ベクターＤＮＡ２．５μｇと、Ｏｐｔｉ−ＳＦＭ培地（１２３０９−０５０、Invitrogen）５００μｌとを添加して十分に混合した後、ＬＴＸ（１５３３８−１００、Invitrogen）６．２５μｌｇを添加し、ボルテックスミキサーを利用して十分に撹拌した。得られた混合物を常温で３０分間放置した後、各ウェルに５００μｌずつ添加した。４時間後に、血清が含まれたＭＥＭα培地に再び培地を置換した。
【００４９】
実施例３．ＥＬＩＳＡを用いたＩｇＧ抗体遺伝子の発現確認
ＩｇＧ抗体遺伝子の発現有無を確認するために、形質移入３日後に、ＥＬＩＳＡを行った。まず、ヤギの抗ヒト免疫グロブリンＧ（Ｆｃγ）（１０９−００６−０９８、Jackson ImmunoReserarch）を、９６−ウェル・マイクロタイタープレート（４４９８２４、Ｎｕｎｃ）上に吸着させた。前記プレートを１％ウシ血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（phospate-buffered saline、ＰＢＳ）で処理してブロッキングした後、連続希釈した試料を各ウェルに添加した。プレートを室温で２時間放置した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトカッパー抗体（peroxidase-labeled goat anti-human κ antibody）（Ｉ１５１４、Sigma）で検出のため処理した。室温で１時間放置した後、前記試料をテトラメチルベンジジン（tetramethyl benzidine、ＴＭＢ）と反応させ、１Ｎ ＨＣｌを加えて反応を停止させた。スタンダードとしては、骨髄種プラズマから精製したヒトＩｇＧ１ カッパー（human ＩｇＧ１ kappa purified myeloma plasma）（Ａ７１６４、Sigma）を２５０ｎｇ／ｍｌの濃度から用いた。プレートリーダー（Spectramax plus ３８４、Molecular Device）を使用し、４５０／６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５０】
図２から確認することができるように、対照群（Ａ）と実験群（Ｂ）とでは、ＩｇＧが正常に発現したが、実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ）の場合には、ＩｇＧが正常に発現しなかった。このことは、前記対応遺伝子の３’末端に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動しないように操作した遺伝子発現カセットの場合、当該遺伝子がコードする蛋白質が正常に発現していないことが分かった（実験群（Ｃ）及び実験群（Ｄ））。
【００５１】
また、少なくとも選択薬剤を使用せずに培養する一過性形質移入では、選択マーカー遺伝子がコードする蛋白質（ＤＨＦＲ蛋白質）の発現有無が、発現ベクター中の前記対応遺伝子によってコードされる蛋白質（特に、抗体）の発現レベルに影響を及ぼさないということを確認することができた。
【００５２】
実施例４．ｐｏｌｙ Ａが作動しないｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を用いた細胞クローンの選択
選択マーカー遺伝子であるｄｈｆｒ遺伝子の３’末端に連結されたｐｏｌｙ Ａが作動しないように操作するために、前記実施例１と同じ処理条件下で、ｐＣＴ１０７ベクターをＲｓｒ ＩＩ制限酵素（Ｒ０５０１、ＮＥＢ）で処理し、それにより実験群（Ｅ）を得た。得られたベクターをＣＨＯ ＤＧ４４細胞系に形質移入した。対照群としては、制限酵素で処理していないｐＣＴ１０７ベクター（対照群（Ａ））を用いた。前記実施例１と同じ方法で、形質移入を行った。対照群（Ａ）のベクターと実験群（Ｅ）のベクターとを細胞系に導入し、３日後に測定したＩｇＧ抗体の発現レベルは、それぞれ３．９μｇ／ｍｌ及び３．８μｇ／ｍｌであった。形質移入に続く培養開始後の３日目、対照群（Ａ）細胞及び実験群（Ｅ）細胞をそれぞれの細胞を９６−ウェルプレートに移し、続いて、２％ウシ胎児血清（fetal bovine serum、ＦＢＳ）及び１００ｎＭ ＭＴＸ（８１３６３０、Bedford Labs）を含んだＳＦＭ４ＣＨＯ（商標）培地（ＳＨ３０５４９．０２、HyClone）中で培養した。対照群（Ａ）の場合、０．５×１０６細胞／９６−ウェルプレートを接種して培養し、そして、実験群（Ｅ）の場合、２×１０６細胞／９６−ウェルプレートを接種して培養した。
【００５３】
培養後、増殖細胞が存在するウェルの数を調べた。その結果、対照群（Ａ）の場合、総２，５９２個のウェル中５１４個のウェル（１９．８％）で細胞増殖が見られ、実験群（Ｅ）の場合、総２，１１２個のウェル中５４個のウェル（２．５％）で細胞増殖が見られた。言い換えれば、前記対照群（Ａ）の場合、増殖細胞が９６−ウェルプレート当たり１９ウェルに存在し、実験群の場合、増殖細胞が９６−ウェルプレート当たり２．５ウェルに存在した。前記結果を基にして、細胞増殖を示すそれぞれのウェルで増殖する細胞が、１つの細胞から由来したと仮定したとき、前記各群間での増殖細胞比率は、３１：１（対照群（Ａ）：実験群（Ｅ））であって、さらに大きい違いがあるということを確認することができた（下記表２、図３〜図５）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
次に、増殖細胞を有するウェル中で、高い力価を示すウェルを選択した。その結果、対照群（Ａ）の場合、５１４個のウェル中から１５７個のウェルが選択され、実験群（Ｅ）の場合、５４個のウェル中から２８個のウェルが選択された。この後、前記選択されたウェル内の細胞を２４−ウェルプレートに移し、培養スケールを増加させ、３日後に、前記２４−ウェルプレートで高い力価を示す６の細胞集団を、対照群（Ａ）及び実験群（Ｅ）夫々から選択し、６−ウェルプレートに接種して培養した。対照群（Ａ）と実験群（Ｅ）夫々から選択された６の細胞集団をｐ−ｃｌｏｎｅと命名し、そして、ＦＢＳとＭＴＸを含まない培地を用いて、エルレンマイヤーフラスコ中に接種して撹拌条件下で培養した。対照群（Ａ）と実験群（Ｅ）との生産性を比較した。
【００５６】
その結果、対照群（Ａ）において、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち１個のｐ−ｃｌｏｎｅだけが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示したが、一方、実験群（Ｅ）の場合、６個のｐ−ｃｌｏｎｅのうち４個のｐ−ｃｌｏｎｅが、約１００μｇ／ｍｌ／３日の生産性を示した（図６）。
【００５７】
実施例５．選択マーカー遺伝子の利用のための細胞増殖条件
さまざまな細胞系で、遺伝子増幅に関与しない一般的な選択マーカー遺伝子の利用性を調べるために、各選択マーカー遺伝子に作用する薬剤を、表３に記述した条件下で各細胞系に適用し、細胞増殖の抑制を測定した。
【００５８】
本実験において用いられた細胞系は、ＣＨＯ Ｋ１とＦ２Ｎ７８（ヒト細胞系）とであり、各細胞系は、ＣＤ Ｏｐｔｉ ＣＨＯ培地（１２６８１、Invitrogen）とＥＸ−ＣＥＬＬ ２９３ 無血清培地（１４５７１ｃ、Sigma）中で培養したものであり、本実施例でも同じ培地で培養した。各細胞系５ｍｌを、５×１０４細胞／ｍｌと１５×１０４細胞／ｍｌの細胞密度で６−ウェルプレートの各ウェルに添加した。これは、１×１０６細胞／９６−ウェルプレート（２０ｍｌ）及び３×１０６細胞／９６−ウェルプレート（２０ｍｌ）の細胞密度に該当する。前記１×１０６細胞／９６−ウェルプレート及び３×１０６細胞／９６−ウェルプレートの細胞密度は、実施例６のｐｏｌｙ Ａ欠損選択マーカーを用いた選択方法で用いられる細胞密度であった。２種の薬剤濃度を各細胞系に用い、３日ごとに各ウェルの半分の培地（２．５ｍｌ）を除去し、同一量の新しい培地で置換した。本実施例で用いた薬剤の種類及び詳細は、下記表４に明示した。このとき、新しい培地は、常に指定された濃度の薬剤を含んでいた。
【００５９】
２週後、トリパンブルーでの細胞染色方法を介して、あらゆる薬剤処理条件（表２）において、形質移入をしていないＣＨＯ Ｋ１細胞とＦ２Ｎ細胞の増殖が観察されなかったことが見出された。すなわち、形質移入後、薬剤処理条件下での培養における、増殖の存在は、形質移入された選択マーカー遺伝子によって処理された薬剤が不活性化されることを示し、それにより、細胞が成長するものであることを意味する。
【００６０】
【表３】
【００６１】
【表４】
【００６２】
実施例６．ｐｏｌｙ Ａを含まないｐａｃ選択マーカー遺伝子を用いた蛋白質−生産性細胞系の確立
先に確認したとおり、ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結されたｄｈｆｒ選択マーカー遺伝子を用いた選択方法が、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞系での高生産性クローン選択において、費用及び時間を低減する観点から、非常に効率的である。このような選択方法が、ｄｈｆｒ遺伝子以外の選択マーカーとＣＨＯ ＤＧ４４細胞系以外の細胞系でも適用されるか否かを調べるために、本実験において、ｐｏｌｙ Ａが完全に欠損したｐａｃ選択マーカー遺伝子を用いた選択方法をＣＨＯ Ｋ１細胞株に適用して、その効能を検討した。
【００６３】
ｐｏｌｙ Ａの機能を完全に除去するために、本実施例では、免疫グロブリン発現ベクター（ｐＣＴ１１２ベクター）からｄｈｆｒ転写ユニット（プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ｐｏｌｙ Ａ）を完全に除去し、プロモーター−ｐａｃ遺伝子またはプロモーター−ｐａｃ遺伝子−ｐｏｌｙ Ａを挿入することによって、ｐＣＴ１３０ベクターとｐＣＴ１２９ベクターとを構築した（図７及び図８）。ベクター構築方法は、下記の通りである。ｐａｃ遺伝子含有ｐＰＵＲベクター（６３１６０１、Clontech）からＰｖｕ ＩＩ（１０−６４２−６９０−００１４、Roche）とＸｂａ Ｉ（Ｒ０１４５Ｓ、ＮＥＢ）制限酵素を用いて、ＳＶ４０プロモーター及びｐａｃ遺伝子のコーディング配列を単離し、Ｎｒｕ Ｉ（Ｒ０１９２Ｌ、ＮＥＢ）制限酵素とＸｂａ Ｉ制限酵素を用いてｄｈｆｒ転写単位を除去したｐＣＴ１１２ベクターにクローニングし、それにより、ｐＣＴ１３０ベクター（図７）を構築した。また、これに対する比較群のために、ｐＰＲＵベクターからＰｖｕ ＩＩとＢａｍＨ Ｉ（Ｒ０１３６Ｓ、ＮＥＢ）制限酵素とを用いてＳＶ４０プロモーター、ｐａｃ遺伝子及びｐｏｌｙ Ａを単離し、ｄｈｆｒ転写ユニットを除去したｐＣＴ１１２ベクターにクローニングし、それにより、ｐＣＴ１２９ベクター（図８）を構築した。
【００６４】
ＣＨＯ Ｋ１細胞株を、ｐＣＴ１２９ベクター及びｐＣＴ１３０ベクターで形質移入し、そして２日後に、９６−ウェルプレートに、下記表５のような様々な濃度のピューロマイシン（puromycin）が添加された培地を用いて細胞を接種した。本実施例で用いた培地は、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ培地であり、ＦＢＳは添加されなかった。ｐＣＴ１２９ベクターを形質移入した対照群では、０．３×１０６細胞／プレートの接種密度と、６μｇ／ｍｌピューロマイシンの選択条件が適切であり、ｐＣＴ１３０ベクターを形質移入された実験群では、３×１０６細胞／プレートの接種密度と、６μｇ／ｍｌピューロマイシンを用いた選択条件が適切であった。特に、本実施例では、何回もの形質移入実験を介して、ｐｏｌｙ Ａを有する選択マーカーを含む対照群と、ｐｏｌｙ Ａを有しない選択マーカーを含む実験群から、類似した数のｐ−ｃｌｏｎｅを選択し、そして、ｐ−ｃｌｏｎｅにおける免疫グロブリンの発現レベルをそれぞれ比較した。
【００６５】
【表５】
【００６６】
前記表５の選択条件下で増殖する細胞が存在するウェルの抗体生産を、ＥＬＩＳＡで測定し、９６−ウェルプレートから抗体生産性の高いｐ−ｃｌｏｎｅを選択し（図９）、２４−ウェルプレートに移した。続いて、さらに抗体の生産性を測定するために、各クローン試料を２倍段階希釈（2-fold serial dilution）し、ＥＬＩＳＡにより分析した（図１０）。前記ｐ−ｃｌｏｎｅのうち、抗体生産性の高い４１個のｐ−ｃｌｏｎｅを６−ウェルプレートに移した後、さらにそれらの抗体生産性を測定した（図１１）。図９〜図１１から分かるように、抗体生産性の高いｐ−ｃｌｏｎｅを選択するための２つの工程（９６−ウェルプレートと２４−ウェルプレートとでの選択工程）で、ｐｏｌｙ Ａを含むｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来のｐ−ｃｌｏｎｅより、ｐｏｌｙ Ａを含まないｐＣＴ１３０ベクター（実験群）由来のｐ−ｃｌｏｎｅの方から、抗体生産性の高いｐ−ｃｌｏｎｅがさらに多く選択されたということが理解される。
【００６７】
また各群から、高い生産性を有するｐ−ｃｌｏｎｅ １２９−４及び１３０−３５を選択し、制限希釈クローニング（limiting dilution cloning、ＬＤＣ）を行った。それらを９６−ウェルプレートで培養するときは、選択したｐ−ｃｌｏｎｅを２μｇ／ｍｌピューロマイシンを処理し、一方、２４−ウェルプレート及び６−ウェルプレートで前記クローンを培養するときは、ピューロマイシンを添加しなかった。９６−ウェルプレート、２４−ウェルプレート及び６−ウェルプレートスケールでの選択工程を経て、生産性の高い単一細胞クローン５個ずつ各群から選択し、６−ウェルプレートでの生産性（図１２）、及びシェークフラスコ（shake flask）状態での生産性（図１３）を調べた。シェークフラスコでの生産性は、同じ条件下での回分式培養（batch culture）を行うことにより重複で行った。
【００６８】
図１２から分かるように、ｐＣＴ１３０ベクターに由来する前記クローンの生産性（２５〜３２μｇ／ｍｌ／３日）は、ｐＣＴ１２９ベクターに由来する前記クローンの生産性（７〜１８μｇ／ｍｌ／３日）よりも、約２倍高かった。これは、高い生産性のクローンが、選択マーカーにおいてｐｏｌｙ Ａを含まないから構築され得ることを示す。また、生産性をさらに実質的な側面から検討することができるシェークフラスコを用いた回分式培養条件では、図１３から分かるように、選択マーカーにおいてｐｏｌｙ Ａを含まないｐＣＴ１３０ベクター（実験群）由来のクローンは、６２〜７２μｇ／ｍｌの生産性を示し、一方、選択マーカーにおいてｐｏｌｙ Ａを含むｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来のクローンは、２〜１０μｇ／ｍｌの生産性を示す。これらの細胞増殖条件において、細胞増殖率は２つの群で類似しているが、ｐＣＴ１３０ベクター（実験群）に由来する前記クローンが、ｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来の前記クローンよりも６倍以上の生産性を示す。このような顕著な差は、ｐＣＴ１２９ベクター（対照群）由来のクローンにおいて、選択条件不在下では、ＩｇＧ遺伝子の発現が容易に抑制されるか、あるいはＩｇＧ遺伝子が容易に欠失するという現象に起因すると考えることができる。
【００６９】
以上の結果から、ｐｏｌｙ Ａを有する選択マーカーを含む発現ベクターで形質移入された細胞系よりも、むしろ本発明の一実施の形態によるｐｏｌｙ Ａを有しない選択マーカーを含む発現ベクターで形質移入された細胞系が、抗体発現レベルの高い細胞系を獲得できる方法であることが分かる。よって、本発明の一実施の形態による選択方法は、ＭＴＸの量を増加させながら数回増幅工程を実施することを含む従来の段階的遺伝子増幅戦略と比較して、高生産性細胞クローンを選択するための時間を短縮させることができる。これにより、高生産性を有する細胞クローン開発のための手間及び費用を低減させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセット、及び、
（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを用いた高生産性クローンの選択方法。
【請求項２】
前記発現ベクターが、前記（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットの代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセット、及び、
（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを制限酵素で切断し、前記（ｉ）の遺伝子発現カセットのｐｏｌｙ Ａが作動しないように前記発現ベクターを線形化させる工程、を含む高生産性クローンの選択方法。
【請求項４】
前記選択マーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子、又はストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｈ）ｂｌｅ遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記目的組換え蛋白質が、モノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、真核宿主細胞である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記真核宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、又はＦ２Ｎ細胞を含むヒト宿主細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセット、及び、
（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクター。
【請求項９】
前記（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットの代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記（ｉｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセットの代わりに、目的蛋白質をコードする遺伝子の導入のためのマルチクローニングサイトを含む請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記選択マーカー遺伝子が、増幅可能な選択マーカー遺伝子である請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記増幅可能な選択マーカー遺伝子が、ｄｈｆｒ遺伝子またはグルタミンシンテターゼ遺伝子である請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記選択マーカー遺伝子が、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｐａｃ遺伝子、又はＳｈ ｂｌｅ遺伝子である請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記目的組換え蛋白質が、モノクローナル抗体である請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクターで形質移入された真核宿主細胞。
【請求項１６】
前記真核宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、又はＦ２Ｎ細胞を含むヒト宿主細胞である請求項１５に記載の真核宿主細胞。
【請求項１】
（ｉ）ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙ Ａ）が作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセット、及び、
（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを用いた高生産性クローンの選択方法。
【請求項２】
前記発現ベクターが、前記（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットの代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセット、及び、
（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクターを制限酵素で切断し、前記（ｉ）の遺伝子発現カセットのｐｏｌｙ Ａが作動しないように前記発現ベクターを線形化させる工程、を含む高生産性クローンの選択方法。
【請求項４】
前記選択マーカー遺伝子が、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子、又はストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス（Ｓｈ）ｂｌｅ遺伝子である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記目的組換え蛋白質が、モノクローナル抗体である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞が、真核宿主細胞である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記真核宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、又はＦ２Ｎ細胞を含むヒト宿主細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセット、及び、
（ｉｉ）ｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセット、を含む発現ベクター。
【請求項９】
前記（ｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動不能に連結された選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットの代わりに、ｐｏｌｙ Ａを除去した選択マーカー遺伝子を含む遺伝子発現カセットを含む請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記（ｉｉ）のｐｏｌｙ Ａが作動可能に連結された目的組換え蛋白質をコードする遺伝子発現カセットの代わりに、目的蛋白質をコードする遺伝子の導入のためのマルチクローニングサイトを含む請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記選択マーカー遺伝子が、増幅可能な選択マーカー遺伝子である請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記増幅可能な選択マーカー遺伝子が、ｄｈｆｒ遺伝子またはグルタミンシンテターゼ遺伝子である請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記選択マーカー遺伝子が、グルタミンシンテターゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ｐａｃ遺伝子、又はＳｈ ｂｌｅ遺伝子である請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記目的組換え蛋白質が、モノクローナル抗体である請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
請求項８〜１０の何れか一項に記載の発現ベクターで形質移入された真核宿主細胞。
【請求項１６】
前記真核宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ハイブリドーマ細胞、又はＦ２Ｎ細胞を含むヒト宿主細胞である請求項１５に記載の真核宿主細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５２１７７９（Ｐ２０１２−５２１７７９Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３３１６（Ｐ２０１２−５０３３１６）
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１９１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１４２７０
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１２３７６８９）セルトリオン・インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３０日（２０１０．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１９１２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１４２７０
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１２３７６８９）セルトリオン・インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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