高速向流クロマトグラフィーによる低分子有用成分の分離方法
【課題】コーヒー、紅茶、お茶、ココア等から簡便な方法で純度の高い低分子有用成分、例えばクロロゲン酸異性体を分離精製する技術の開発。
【解決手段】
前記原料から得た抽出液をブタノール／水／酢酸からなる組成の溶液を用いて固定相と移動層を作成し高速向流クロマトグラフィーにて分離精製する。
【解決手段】
前記原料から得た抽出液をブタノール／水／酢酸からなる組成の溶液を用いて固定相と移動層を作成し高速向流クロマトグラフィーにて分離精製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高速向流クロマトグラフィーを用いたコーヒー、紅茶、お茶、ココア等の抽出物からの一段階操作による低分子有用成分の分離精製に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまでガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析計等の開発の発展に伴って、有機化合物や天然物質、たんぱく質類の分析および定性定量技術はめまぐるしく進歩してきた。しかしながら高精度に分析された物質についての大量分離方法の技術は遅れていた。現実は全く進歩していない。このため前記成分を分離するためには多くの分離方法を組み合わせて分離を行なっていた。
とくに、コーヒー、紅茶、お茶、ココア類は、クロロゲン酸、カフェイン、トリゴネリン等をはじめとする多くの低分子有用成分が数百種類以上含まれている。しかしながら、これらの有用成分を簡便に高度に純度の高い状態で製造する分離方法はこれまで知られていなかった。
例えば大多和等（特開２００８−７４５０、特開２００８−３１１５０）によってコーヒー生豆からのクロロゲン酸の簡便な製造方法が報告されているが、それはカフェインを含まないクロロゲン酸の精製方法であって、純度の高いクロロゲン酸の簡便な製造方法とはいえない。さらにクロロゲン酸には３−カフェオイルキニン酸、４−カフェオイルキニン酸、５カフェオイルキニン酸等の多くの異性体が共存している。これらの異性体の大量分離は非常に困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、コーヒー、紅茶、お茶、ココア等から簡便な方法で純度の高い低分子有用成分、例えばクロロゲン酸の各異性体を分離する精製技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は上記課題を解決するため様々な試みを行なった。その結果、岡田（ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ， Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．１（２０１０））によって開発された高速向流クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＳＣＣＣ）を利用して、分離条件を検討して、精製分離を行なうことによって一段階の操作で純度の高いクロロゲン酸異性体の単離を行うことができた。さらに当然に本分離方法を用いることによってクロロゲン酸以外の有用低分子化合物を単離することができた。
さらに具体的にはコーヒー豆、お茶の葉、カカオ種子等から水ないしアルコール抽出を行い、固形不純物をフィルターで除去した後に、ＨＳＣＣＣに充填して分離し純度分析を行なって単離を確認した。
【発明の効果】
【０００５】
コーヒー、紅茶、お茶、ココア等から簡便な方法で医薬原料にも使えるほどに純度の高い低分子有用成分、例えばクロロゲン酸異性体の単離を行なうことが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の好ましい形態として、コーヒー豆は焙煎、生豆のいずれでも良く、種類はアラビカ種、ロブスタ種、リベリカ種のいずれでも良く、種類および産地を問わない、お茶も生茶葉、蒸した葉いずれでもよく、カカオ種子も生種子あるいは加工をおこなったものいずれでも良い。前記原料を水またはアルコールまたはこれらの混合溶液等で抽出、好ましくは減圧下で５０から２００度、さらに好ましくは８０から１５０度に加熱して抽出処理を行なうとよい。
抽出後、固形不純物をフィルター、好ましくは０．４５μｍのフィルター、または珪藻土等からなるフィルターで除去する。
【０００７】
ＨＳＣＣＣのための固定相および移動相を形成するための溶液の組成は、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール等の有機アルコール類のいずれか１種類の６から２０容、好ましくは８からと１２容と、水の５から１５容、好ましくは６から１１容と、酢酸、蟻酸，酪酸等の有機酸のいずれか１種類の０．５から５容、好ましくは１．３から１．７容からなる。
ＨＳＣＣＣの回転数は容量に応じて適時変更する。
分離後、各分画を分取してＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＡＳさらにＮＭＲによって純度解析を行なった。
【実施例１】
【０００８】
以下に本発明の実施例を述べるが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【０００９】
コーヒー生豆（インドネシア産ロブスタ種ＡＰ−１）の１００ｇをアイボトルに入れ、純粋８７５ｍｌを加える。温度１２０〜１６０度で、圧力０．１５から０．３ＭＰａで２０分間抽出する。
続いてアドバンテックフィルターでろ過する。エバポレーターで濃縮して後、０．４５μｍのミリポアーフィルターでろ過して固形不純物を完全に除去して試料とした。
ブタノール／水／酢酸１０００ｍｌ／８００ｍｌ／２００ｍｌの組成からなる溶液を用いて、固定相／移動相を高速向流クロマトグラフィー上に作成し前記試料を充填した。高速向流クロマトグラフィーの回転速度は９００ｒｐｍで流速は２．００ｍｌ／ｍｉｎで、前記試料の充填量は１０．０ｍｌであった。
図１にＨＳＣＣＣによるコーヒー豆抽出物有用成分の２８０ｎｍによる波長に基づく分離パターンを示す。６ｍｌずつ分取し、分画１７から２０までをＨＰＬＣで純度分析を行なった（図２）。
分画１９と２０において７０％以上の純粋なクロロゲン酸を得ることができた。
【実施例２】
【００１０】
コーヒー生豆（インドネシア産ロブスタ種ＡＰ−１）の５０ｇをアイボトルに入れ、純粋５００ｍＬを加える。温度１２０〜１６０度で、圧力０．１５から０．３ＭＰａで２０分間抽出する。
続いてアドバンテックフィルターでろ過する。エバポレーターで濃縮して後、０．４５μｍのミリポアーフィルターでろ過して固形不純物を完全に除去して試料とした。
ブタノール／水／酢酸１１０ｍｌ／１０００ｍｌ／８９０ｍｌの組成からなる溶液を用いて、固定相／移動相を高速向流クロマトグラフィー上に作成し前記試料を充填した。高速向流クロマトグラフィーの回転速度は９００ｒｐｍで流速は２．５／ｍｉｎで、前記試料の充填量は５ｍｌであった。
【００１１】
図３にＨＳＣＣＣによるコーヒー豆抽出物有用成分の２７５ｎｍ（ ）の波長に基づく分離
フェイン並びに各種クロロゲン酸の異性体が単離された。それぞれの分離された分画Ｆ１からＦ９について、ＬＣ−ＭＡＳＭＡＳによる解析、ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ−７００）による解析並びに文献による各クロロゲン酸の存在比率のデータからの解析を行なった。その結果、Ｆ１からＦ７までの分画について単一成分であることが判明した。Ｆ８とＦ９は幾つかの成分の混合物であった。Ｆ１は５−カフェオイルキニン酸、Ｆ２は３−カフェオイルキニン酸、Ｆ３はカフェイン、Ｆ４は４−カフェオイルキニン酸、Ｆ５は５−フェルロイルキニン酸そしてＦ６は恐らく３−フェロイルキニン酸、Ｆ７も恐らく４−フェロイルキニン酸であった。いずれも純度は整理番号：ＢＲａ０００２
９０％以上であった。このように一回のＨＳＣＣＣ分離操作で純度の高いクロロゲン酸異性体を単離することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】コーヒー生豆抽出物のＨＳＣＣＣパターン１
【図２】ＨＳＣＣＣで分離した分画１７〜２０までのＨＰＬＣによる純度分析
【図３】コーヒー生豆抽出物のＨＳＣＣＣパターン２
【産業上の利用可能性】
【００１３】
コーヒー、お茶、紅茶、ココア由来の抽出物から様々なクロロゲン酸異性体を初めとする低分子有用成分の分離精製が可能となる。分離された有用成分は純度が高いので医薬原料としての使用も可能となる。また不純物の影響が排除されるので食品原料、工業原料としても多くの用途が開ける。
【技術分野】
【０００１】
本発明は高速向流クロマトグラフィーを用いたコーヒー、紅茶、お茶、ココア等の抽出物からの一段階操作による低分子有用成分の分離精製に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまでガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析計等の開発の発展に伴って、有機化合物や天然物質、たんぱく質類の分析および定性定量技術はめまぐるしく進歩してきた。しかしながら高精度に分析された物質についての大量分離方法の技術は遅れていた。現実は全く進歩していない。このため前記成分を分離するためには多くの分離方法を組み合わせて分離を行なっていた。
とくに、コーヒー、紅茶、お茶、ココア類は、クロロゲン酸、カフェイン、トリゴネリン等をはじめとする多くの低分子有用成分が数百種類以上含まれている。しかしながら、これらの有用成分を簡便に高度に純度の高い状態で製造する分離方法はこれまで知られていなかった。
例えば大多和等（特開２００８−７４５０、特開２００８−３１１５０）によってコーヒー生豆からのクロロゲン酸の簡便な製造方法が報告されているが、それはカフェインを含まないクロロゲン酸の精製方法であって、純度の高いクロロゲン酸の簡便な製造方法とはいえない。さらにクロロゲン酸には３−カフェオイルキニン酸、４−カフェオイルキニン酸、５カフェオイルキニン酸等の多くの異性体が共存している。これらの異性体の大量分離は非常に困難であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者は、コーヒー、紅茶、お茶、ココア等から簡便な方法で純度の高い低分子有用成分、例えばクロロゲン酸の各異性体を分離する精製技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は上記課題を解決するため様々な試みを行なった。その結果、岡田（ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ， Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．１（２０１０））によって開発された高速向流クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＨＳＣＣＣ）を利用して、分離条件を検討して、精製分離を行なうことによって一段階の操作で純度の高いクロロゲン酸異性体の単離を行うことができた。さらに当然に本分離方法を用いることによってクロロゲン酸以外の有用低分子化合物を単離することができた。
さらに具体的にはコーヒー豆、お茶の葉、カカオ種子等から水ないしアルコール抽出を行い、固形不純物をフィルターで除去した後に、ＨＳＣＣＣに充填して分離し純度分析を行なって単離を確認した。
【発明の効果】
【０００５】
コーヒー、紅茶、お茶、ココア等から簡便な方法で医薬原料にも使えるほどに純度の高い低分子有用成分、例えばクロロゲン酸異性体の単離を行なうことが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の好ましい形態として、コーヒー豆は焙煎、生豆のいずれでも良く、種類はアラビカ種、ロブスタ種、リベリカ種のいずれでも良く、種類および産地を問わない、お茶も生茶葉、蒸した葉いずれでもよく、カカオ種子も生種子あるいは加工をおこなったものいずれでも良い。前記原料を水またはアルコールまたはこれらの混合溶液等で抽出、好ましくは減圧下で５０から２００度、さらに好ましくは８０から１５０度に加熱して抽出処理を行なうとよい。
抽出後、固形不純物をフィルター、好ましくは０．４５μｍのフィルター、または珪藻土等からなるフィルターで除去する。
【０００７】
ＨＳＣＣＣのための固定相および移動相を形成するための溶液の組成は、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール等の有機アルコール類のいずれか１種類の６から２０容、好ましくは８からと１２容と、水の５から１５容、好ましくは６から１１容と、酢酸、蟻酸，酪酸等の有機酸のいずれか１種類の０．５から５容、好ましくは１．３から１．７容からなる。
ＨＳＣＣＣの回転数は容量に応じて適時変更する。
分離後、各分画を分取してＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＡＳさらにＮＭＲによって純度解析を行なった。
【実施例１】
【０００８】
以下に本発明の実施例を述べるが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【０００９】
コーヒー生豆（インドネシア産ロブスタ種ＡＰ−１）の１００ｇをアイボトルに入れ、純粋８７５ｍｌを加える。温度１２０〜１６０度で、圧力０．１５から０．３ＭＰａで２０分間抽出する。
続いてアドバンテックフィルターでろ過する。エバポレーターで濃縮して後、０．４５μｍのミリポアーフィルターでろ過して固形不純物を完全に除去して試料とした。
ブタノール／水／酢酸１０００ｍｌ／８００ｍｌ／２００ｍｌの組成からなる溶液を用いて、固定相／移動相を高速向流クロマトグラフィー上に作成し前記試料を充填した。高速向流クロマトグラフィーの回転速度は９００ｒｐｍで流速は２．００ｍｌ／ｍｉｎで、前記試料の充填量は１０．０ｍｌであった。
図１にＨＳＣＣＣによるコーヒー豆抽出物有用成分の２８０ｎｍによる波長に基づく分離パターンを示す。６ｍｌずつ分取し、分画１７から２０までをＨＰＬＣで純度分析を行なった（図２）。
分画１９と２０において７０％以上の純粋なクロロゲン酸を得ることができた。
【実施例２】
【００１０】
コーヒー生豆（インドネシア産ロブスタ種ＡＰ−１）の５０ｇをアイボトルに入れ、純粋５００ｍＬを加える。温度１２０〜１６０度で、圧力０．１５から０．３ＭＰａで２０分間抽出する。
続いてアドバンテックフィルターでろ過する。エバポレーターで濃縮して後、０．４５μｍのミリポアーフィルターでろ過して固形不純物を完全に除去して試料とした。
ブタノール／水／酢酸１１０ｍｌ／１０００ｍｌ／８９０ｍｌの組成からなる溶液を用いて、固定相／移動相を高速向流クロマトグラフィー上に作成し前記試料を充填した。高速向流クロマトグラフィーの回転速度は９００ｒｐｍで流速は２．５／ｍｉｎで、前記試料の充填量は５ｍｌであった。
【００１１】
図３にＨＳＣＣＣによるコーヒー豆抽出物有用成分の２７５ｎｍ（ ）の波長に基づく分離
フェイン並びに各種クロロゲン酸の異性体が単離された。それぞれの分離された分画Ｆ１からＦ９について、ＬＣ−ＭＡＳＭＡＳによる解析、ＮＭＲ（Ｖａｒｉａｎ−７００）による解析並びに文献による各クロロゲン酸の存在比率のデータからの解析を行なった。その結果、Ｆ１からＦ７までの分画について単一成分であることが判明した。Ｆ８とＦ９は幾つかの成分の混合物であった。Ｆ１は５−カフェオイルキニン酸、Ｆ２は３−カフェオイルキニン酸、Ｆ３はカフェイン、Ｆ４は４−カフェオイルキニン酸、Ｆ５は５−フェルロイルキニン酸そしてＦ６は恐らく３−フェロイルキニン酸、Ｆ７も恐らく４−フェロイルキニン酸であった。いずれも純度は整理番号：ＢＲａ０００２
９０％以上であった。このように一回のＨＳＣＣＣ分離操作で純度の高いクロロゲン酸異性体を単離することができた。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】コーヒー生豆抽出物のＨＳＣＣＣパターン１
【図２】ＨＳＣＣＣで分離した分画１７〜２０までのＨＰＬＣによる純度分析
【図３】コーヒー生豆抽出物のＨＳＣＣＣパターン２
【産業上の利用可能性】
【００１３】
コーヒー、お茶、紅茶、ココア由来の抽出物から様々なクロロゲン酸異性体を初めとする低分子有用成分の分離精製が可能となる。分離された有用成分は純度が高いので医薬原料としての使用も可能となる。また不純物の影響が排除されるので食品原料、工業原料としても多くの用途が開ける。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速向流クロマトグラフィーを用いた、コーヒー、お茶、紅茶、ココア由来の抽出物からの低分子有用成分の新規分離精製方法と分離された低分子有用成分。
【請求項２】
［請求項１］記載の高速向流クロマトグラフィーにおいて固定相と移動相を形成する溶液がブタノール／水／酢酸からなる請求項１記載の新規分離精製方法。
【請求項３】
［請求項１］記載の抽出方法が水抽出である有用成分の新規分離精製方法と分離された低分子有用成分。
【請求項４】
［請求項１］記載の低分子有用成分がクロロゲン酸であるクロロゲン酸の新規分離精製方法と分離されたクロロゲン酸。
【請求項５】
［請求項１］記載の由来の抽出物が生コーヒー豆である低分子有用成分の新規分離精製方法と分離された低分子有用成分。
【請求項６】
［請求項１］記載の低分子有用成分がクロロゲン酸異性体である新規分離方法と分離されたクロロゲン酸異性体。
【請求項１】
高速向流クロマトグラフィーを用いた、コーヒー、お茶、紅茶、ココア由来の抽出物からの低分子有用成分の新規分離精製方法と分離された低分子有用成分。
【請求項２】
［請求項１］記載の高速向流クロマトグラフィーにおいて固定相と移動相を形成する溶液がブタノール／水／酢酸からなる請求項１記載の新規分離精製方法。
【請求項３】
［請求項１］記載の抽出方法が水抽出である有用成分の新規分離精製方法と分離された低分子有用成分。
【請求項４】
［請求項１］記載の低分子有用成分がクロロゲン酸であるクロロゲン酸の新規分離精製方法と分離されたクロロゲン酸。
【請求項５】
［請求項１］記載の由来の抽出物が生コーヒー豆である低分子有用成分の新規分離精製方法と分離された低分子有用成分。
【請求項６】
［請求項１］記載の低分子有用成分がクロロゲン酸異性体である新規分離方法と分離されたクロロゲン酸異性体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１５８５８４（Ｐ２０１２−１５８５８４Ａ）
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２９０７４５（Ｐ２０１１−２９０７４５）
【出願日】平成２３年１２月２９日（２０１１．１２．２９）
【出願人】（５０２１６３７８６）株式会社ブルックスホールディングス (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１２月２９日（２０１１．１２．２９）
【出願人】（５０２１６３７８６）株式会社ブルックスホールディングス (3)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]