高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物
本発明は高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。本組成物は、インビトロおよびインビボで細胞をトランスフェクトするのに用いられてもよく、特に粘膜上皮の細胞をトランスフェクトするのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、２００９年３月３１日に出願された米国特許出願第６１／１６５，４４２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物、ならびにその生成方法と使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
キトサンはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルコサミンの非毒性のカチオン性コポリマーである。キトサンは核酸と複合体を形成することができ、細胞をトランスフェクトするためのＤＮＡ送達ビヒクルとして使われている。
【０００４】
キトサンの多くの生物学的用途は、大きなキトサンポリマーの使用に関連している。およそ数百キロダルトンから数千キロダルトンの大きなキトサンポリマーは、酸性溶液だけに溶解する。稀酢酸は、この大きなキトサン用の溶媒として使用されることが多い。
【０００５】
およそ数十キロダルトン以下の低分子量のキトサンは、当初、効果的にパッケージングし、ＤＮＡを保護して、ＤＮＡ送達ビヒクルとして役立たせるにはあまりに小さいと考えられた。しかし、最近になっていくつかのグループは、低分子量のキトサンを用いて、効果的にパッケージングし、ＤＮＡを保護して、ＤＮＡ送達ビヒクルとして役立たせることができることを確立した。低分子キトサンはＤＮＡ送達ビヒクルとしての使用に望ましいと見なされてきた。低分子キトサンが生理的ｐＨで高い溶解度を示し、かつ低いｐＨ環境では核酸の分解を促進すると理解されているからである。
【０００６】
高濃度の核酸は多くの目的にとって望ましいが、高濃度の均一に分散した、安定のキトサン−核酸複合体を生成することは困難である。混合液中のキトサンおよび核酸の濃度が増加すると、凝集、不安定性、粒子の大きさの変動、および沈殿の原因となる。
【０００７】
ＤＮＡおよび縮合剤（たとえばポリカオチン性炭化水素）を含む粒子を生成するために同時流動混合を使用することが記載されている（米国特許第６，５３７，８１３号）。このような粒子を生成するために、ＤＮＡ溶液および縮合剤溶液は、同時にかつ別々に、ミキシングおよび粒子形成を備える静的ミキサーまたは動的ミキサーを含む流入ミキサーに導入され得る。導入および濃縮の全プロセスを通してＤＮＡおよび縮合剤の適当なモル比を維持することが重要であり、かつ電荷的中性からの有意な逸脱は、プロセスにおいて不完全な縮合または粒子凝集のいずれかをもたらし得ることを当業者は教示する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、キトサンを可溶化するのに通常に用いられよりはるかに下回るｐＨを有する、高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物が、生理的ｐＨにより近いポリプレックス組成物よりも高い粘膜上皮のインビボトランスフェクション効率を示すことを見出した。本組成物は、４．５未満のｐＨを有するが、核酸の完全性の安定性と維持、および粘膜上皮送達の適合性の両方を示す。逆説的に、高分子量キトサンより酸性度に低いｐＨでのその溶解性のために一つには開発された低分子量のキトサンは、本発明での使用に特に適切である。
【０００９】
本発明者らは、安定した濃縮した高酸性キトサン−ポリプレックスを生成するために、ポリプレックス凝集および沈殿の問題も克服した。さらに、本発明者らは、等張である濃縮製剤を生成することができた。これは医薬用途および治療用途にとって極めて望ましい。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明はキトサン−核酸ポリプレックスを含む高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。
【００１１】
好ましい実施形態では、主題の組成物は、４．５未満のｐＨ、より好ましくは４．２未満、さらに好ましくは４．０未満、さらに好ましくは３．８未満のｐＨを有する。
【００１２】
好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、治療用核酸を含む。一実施形態では、治療用核酸は、治療用ＲＮＡである。別の実施形態では、治療用核酸は、治療用タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトである。
【００１３】
好ましい実施形態では、対象組成物は等張性である。
【００１４】
好ましい実施形態では、対象組成物は安定している。
【００１５】
好ましい実施形態では、対象組成物は均一である。好ましい実施形態では、対象組成物は、０．５未満、より好ましくは０．４未満、さらに好ましくは０．３未満、最も好ましくは０．２未満の平均多分散指数（「ＰＤＩ」）を有する。
【００１６】
好ましい実施形態では、対象組成物は、沈降したポリプレックスを含まない。
【００１７】
好ましい実施形態では、対象組成物は０．５ｍｇ／ｍＬを超える核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。より好ましくは、対象組成物は少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．７５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも１．２ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。
【００１８】
好ましい実施形態では、対象組成物は、凝集阻害剤をさらに含む。好ましい実施形態において、凝集阻害剤は、糖（好ましくはショ糖）である。
【００１９】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、平均３０００未満。より好ましくは２０００未満、さらに好ましくは１５００未満、さらに好ましくは１０００未満、さらに好ましくは５００未満、さらに好ましくは３００未満、さらに好ましくは１５０未満、さらに好ましくは１００未満、さらに好ましくは５０未満、最も好ましくは３０未満のグルコサミン単量体ユニットを有するキトサン分子を含む。
【００２０】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、少なくとも２：１、より好ましくは少なくとも５：１、さらに好ましくは少なくとも１０：１、さらに好ましくは１５：１、最も好ましくは２０：１のＮ：Ｓ比を有する。
【００２１】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、５００ｋＤａ未満、より好ましくは３００ｋＤａ未満、さらに好ましくは２５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは１５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは１００ｋＤａ未満、さらに好ましくは５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは２５ｋＤａ未満、さらに好ましくは１６ｋＤａ未満、さらに好ましくは８ｋＤａ未満、最も好ましくは５ｋＤａ未満の平均分子量を有するキトサンを含む。
【００２２】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、７５０ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、さらに好ましくは２５０ｎｍ未満、さらに好ましくは２００ｎｍ未満、最も好ましくは１５０ｎｍ未満の平均径を有する。
【００２３】
好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスおよび凝集阻害剤からなる。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスからなる。
【００２５】
一態様では、本発明は、本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態では、医薬組成物は等張である。別の実施形態では、医薬組成物は高張、または低張であり得る。
【００２７】
一態様では、本発明は、粘膜上皮細胞を本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物と接触させることを含む、粘膜上皮細胞をトランスフェクトする方法を提供する。
【００２８】
好ましい実施形態では、粘膜上皮は、消化管組織、気道組織、肺組織、副鼻腔組織、口腔組織、尿路組織、膀胱組織、膣組織、子宮組織、頸部組織、眼組織、食道組織、唾液腺組織、鼻喉頭組織、腎臓組織、および喉頭／咽頭組織からなる群から選択される組織内に存在する。
【００２９】
一態様では、本発明は、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置する方法を提供する。対象医薬組成物は、好ましくは粘膜上皮に局所投与される。
【００３０】
好ましい実施形態では、対象医薬組成物は、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトを含む。一実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＴＮＦα阻害剤である。別の実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１０である。
【００３１】
好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、間質性膀胱炎である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、喘息である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｇＷＩＺ−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡを含むｃ１５０キトサン−核酸粒子の投与に応答して検出されたブタ血漿ＳＥＡＰのグラフである。ｐＨ４の場合の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．０であった。ｐＨ４．８の場合の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．８であった。
【図２】１Ｌのインライン混合バッチおよびＴＦＦ濃縮＞ダイアフィルトレーション＞濃縮の代表的なプロセスブロック図である。
【図３】小規模のインライン混合模式図である。シリンジは、ラテックスフリーポリプロピレン（ＰＰ）であり、それぞれ最高６０ｍＬまでスケールアップされ得る。２台の高精度のシリンジポンプが、シリンジを駆動する。チューブは、１／１６”のＰｔ硬化シリコーンである。示される混合ジャンクションは、Ｙ字形である。構造体の混合ジャンクションの材料は、ＰＰである。
【図４】１０Ｌ用の中規模インライン混合の模式図である。表示された模式図は、１０Ｌバッチ用である。すべての容器は、より少ないまたはより大きいバッチの大きさによって、縮小、拡大される。Ｐｔ硬化チューブの径は、０．４８ｃｍ（３／１６”）である。ポンンプの流速は、２：１のＤＮＡ：キトサンの量の混合比で示される。
【図５】ＴＴＦＦ濃縮およびダイアフィルトレ−ションの模式図。ＴＦＦダイアフィルトレーションの模式図を示す。ＴＦＦ濃縮の間、透析バッファラインは保持液容器から分離されて、大気ベントフィルターと交換される。
【図６】ＴＦＦ濃縮間のｐＨの推移のモデル化グラフである。各点は、ポリプレックスの相対的な量の倍減少（＝ＤＮＡ濃度の増加）を示す。たとえば、２×標識の点は、ほぼｃ１２００である。
【図７】第２のＴＦＦ濃縮ステップ後のポリプレックスの安定性を示すグラフである。無希釈のＴＦＦ後の試料を、２５℃でインキュベートし、２時間ごとに粒径をモニターした。
【図８】インプロセスｐＨデータのグラフである。Ｘ軸の上のＴＦＦ画分コードは、次の通りである：Ｃ１：ＴＦＦ濃縮第１のステップ；Ｄ；ＴＦＦダイアフィルトレーション（洗浄量（Ｗ／Ｖ）の回数で示される）；Ｃ２：ＴＦＦ濃縮第２のステップ。
【図９】マウス膀胱のインビボトランスフェクションに関するグラフである。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＦ１ａ−ＳＥＡＰまたは対照ビヒクルを担持するキトサン−ＤＮＡポリプレックスＣ（２４，９８）−ｃ１０００−ｐＨ４を送達した。２日後に、マウスを屠殺して、組織を収集した。ナイーブマウス（非形質移入）を超える、処置されたマウスの膀胱組織におけるＳＥＡＰ ｍＲＮＡの相対的な増加を示す。
【図１０】ＥＧ−１０（ｈＩＬ−１０）高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物の慢性ＩＢＤマウスの体重への効果に関するグラフである。高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物の各投与を、７日間隔で投与した。これらのマウスの体重を、実験全期間を通して毎週モニターした。各毎週の処置後、ＥＧ−１０処置された群に関連して体重増加の有意な改善が観察された。
【図１１】ＥＧ−１０（ｈＩＬ−１０）高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物の３種類の炎症性サイトカインへの効果に関するグラフである。最後の処置から５日後に、両群からのマウスを屠殺して、結腸を摘出し、炎症性サイトカインのレベルを測定した。ＳＥＡＰ処置したマウスと比較すると、ＥＧ−１０処置したマウスは、ＩＬ−６，ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α ｍＲＮＡのレベルの減少がもたらされた。
【図１２】−８０℃で３６０日後の中規模製造からのポリプレックス最終生成物の２つのバッチ（ＤＰ０−００８９およびＤＰ−００９０）に対するアガロースゲル電気泳動を示す画像である。ポリプレックスおよびＤＮＡ（高次コイルおよびニックの入った）の位置を示す。製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ１０−ｃ１０００−Ａｃ７０−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．０であった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
「キトサン−核酸ポリプレックス」、「キトサン−核酸ポリプレックス粒子」、「キトサン−核酸複合体」、「ポリプレックス」または文法的に同様ななものによって、複数のキトサン分子および複数の核酸分子を含む複合体を意味する。キトサン単量体には、リガンドが付着したキトサンを含む誘導体が含まれる。「誘導体」とは、共有結合的に修飾されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよび／またはＤ−グルコサミユニット、ならびに他のユニットを組み込んでいる、または他の残基に付着したキトサン系ポリマー類を含む、キトサン系ポリマーの幅広いカテゴリーが挙げられると理解される。誘導体は、ヒドロキシル基またはグルコサミンのアミン基の修飾に基づくことが多い。キトサン誘導体の例としては、トリメチル化キトサン、ペグ化キトサン、チオラート化キトサン、ガラクトシル化キトサン、アルキル化キトサン、ＰＥＩを組み込んだキトサン、アルギニン修飾されたキトサン、ウロン酸修飾されたキトサン等が挙げられるがこれらに限定されない。キトサン誘導体についての更なる教示としては、たとえば、”Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｋ Ｔａｉｒａ， Ｋ Ｋａｔａｏｋａ， Ｔ Ｎｉｉｄｏｍｅ （ｅｄｉｔｏｒｓ）， ｐｐ．６３−７４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｔｏｋｙｏ， ２００５， ＩＳＢＮ ４−４３１−２５１２２−７；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７， ｖｏｌ ５２ （２３）， ｐｐ ３２０７−３２１５， 国際公開第２００８／０８２２８２号、およびＶａｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５５（２００４） ７７−９３を参照されたい。これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００３４】
分散系は、分散相として知られており、連続培地全体にわたり分布された粒子状物質からなる。キトサン−核酸ポリプレックスの「分散」は、水和キトサン−核酸ポリプレックスを含む組成物であり、ポリプレックスが培地全体にわたり分布されている。
【００３５】
本明細書で使用するとき、キトサンポリマーの「平均重量」は、平均分子量の重量をいう。
【００３６】
「対アニオン」とは、その位置で荷電したキトサンアミンまたは他カチオンと静電相互作用ができるアニオンを意味する。好ましい対アニオンは、酢酸塩イオンおよび塩化物イオンを含む。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「予備濃縮」分散は、本明細書に記載するように濃縮分散液を形成するための濃縮プロセスをまだ受けていないものをいう。
【００３８】
本明細書で使用するとき、ポリプレックス沈殿物を「含まない」とは、目視検査で観察され得る粒子が組成物には基本的ないことを意味する。
【００３９】
２００７年３月３０日に出願された米国特許出願第１１／６９４，８５２号に開示されるように、キトサンは調製されてもよい。この出願はその全体を参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００４０】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物。
【００４１】
一態様では、本発明は、キトサン−核酸ポリプレックスを含む高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。キトサン−核酸ポリプレックスの核酸成分は、キトサン−核酸ポリプレックスにカプセル封入される。好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、組成物中で均一で安定である。
【００４２】
「均一である」複数のキトサン−核酸ポリプレックスを含む組成物は、ポリプレックスサイズの分布が狭い組成物をいう。ポリプレックスサイズのこの狭い分布は、たとえば、組成物の「多分散指数」（ＰＤＩ）によって測定されることができる。対象組成物のための好ましいＰＤＩは、０．５未満、より好ましくは０．４未満、さらに好ましくは０．３未満、最も好ましくは０．２未満である。
【００４３】
「安定な」複数のキトサン−核酸ポリプレックスを含む組成物は、ポリプレックスが安定したサイズを保つ、すなわち、時間とともにサイズまたは凝集体が増加する傾向がない組成物をいう。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、室温で少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の間に、平均径が１００％未満、より好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満増加するポリプレックスを含む。
【００４４】
対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、冷却条件下で安定であるのが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、２〜８℃で少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の間に、平均径が１００％未満、より好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満増加するポリプレックスを含む。
【００４５】
対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、凍結融解条件下で安定であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、−２０〜−８０℃での凍結から融解の後に、室温で少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の間に、平均径が１００％未満、より好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満増加するポリプレックスを含む。
【００４６】
本発明のキトサン−核酸ポリプレックス内の核酸のカプセル封入は、たとえば、ゲル電気泳動での核酸の遅滞によって示されることができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、対象組成物は、４．５以下のｐＨ、より好ましくは４．２以下、さらに好ましくは４．０以下、さらに好ましくは３．８以下のｐＨ値を有する。
【００４８】
一実施形態では、対象組成物は、３．５〜４．５の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、対象組成物は、３．６〜４．２の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、対象組成物は、３．８〜４．２の範囲のｐＨを有する。
【００４９】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、３０００未満、より好ましくは２０００未満、さらに好ましくは１５００未満、さらに好ましくは１０００未満、さらに好ましくは５００、さらに好ましくは３００未満、さらに好ましくは１５０、さらに好ましくは１００未満、さらに好ましくは５０、最も好ましくは３０未満のグルコサミン単量体ユニットを有するキトサン分子を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、５００ｋＤａ未満、より好ましくは３００ｋＤａ未満、さらに好ましくは２５０ｋＤａ、さらに好ましくは１５０ｋＤａ、さらに好ましくは１００ｋＤａ、さらに好ましくは５０ｋＤａ、さらに好ましくは２５ｋＤａ、さらに好ましくは１６ｋＤａ、さらに好ましくは８ｋＤａ、最も好ましくは５ｋＤａの平均分子量を有するキトサンを含む。
【００５１】
好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン成分は、３ｋＤａ〜２５０ｋＤａの平均分子量を有する。
【００５２】
一実施形態では、対象組成物のキトサン成分は、２５０ｋＤａ以上の平均分子量を有する。
【００５３】
一実施形態では、対象組成物のキトサン成分は、３ｋＤａ以下の平均分子量を持つ。
【００５４】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、７５０ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、さらに好ましくは２５０ｎｍ未満、さらに好ましくは２００ｎｍ未満、最も好ましくは１５０ｎｍ未満の平均径を有する。
【００５５】
一実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、１００ｎｍを超える平均径を有する。
【００５６】
一実施例では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、２：１〜１００：１、より好ましくは５：１〜９０：１、さらに好ましくは１０：１〜９０：１、最も好ましくは２０：１〜９０：１でＮ：Ｐ比を有する。
【００５７】
好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、＋２０ｍＶと＋６０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。
【００５８】
一実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、＋２０ｍＶ以下の平均ゼータ電位を有する。
【００５９】
一実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、＋６０ｍＶ以上の平均ゼータ電位を有する。
【００６０】
好ましい実施形態では、ポリプレックスのキトサン分子は、７０％を超える、より好ましくは７５％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらに好ましくは８５％を超える、さらに好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える、最も好ましくは９８％を超える程度の脱アセチル化を有する。
【００６１】
一実施形態では、ポリプレックスのキトサン分子は、７０％以下の程度の脱アセチル化を有する。
【００６２】
好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスおよび凝集阻害剤からなる。対象ポリプレックスおよび凝集阻害剤に加えて、このような組成物は、対アニオンと他の賦形剤とを含み得るが、対象組成物の活性に実質的に影響を及ぼす他の物質を除外する。
【００６３】
好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスからなる。対象ポリプレックスに加えて、このような組成物は、対アニオンと他の賦形剤とを含み得るが、対象組成物の活性に実質的に影響を及ぼす他の物質を除外する。
【００６４】
好ましい実施形態では、対象組成物は、パラベンを含まない。これは、組成物が０．５ｍｇ／ｍＬを超える核酸濃度を有する場合に特に望ましい。
【００６５】
好ましい実施形態では、対象組成物は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの対アニオン濃度、極めて好まれる６０〜１００ｍＭの対アニオン濃度を有する。好ましい実施形態では、対アニオンは、アセテートである。
【００６６】
好ましい実施形態では、対象組成物は０．５ｍｇ／ｍＬを超える核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。より好ましくは、組成物は少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１．２ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。好ましい実施形態では、組成は水和物である。好ましい実施形態では、組成物は非複合型の核酸を実質的に含まない。
【００６７】
好ましい実施形態では、キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、さらに凝集阻害剤を含む。凝集阻害剤は、ポリプレックス凝集体および／または沈殿物を部分的にまたは完全に減少させ、かつ、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を用いる濃縮方法によってキトサン−核酸ポリプレックスを濃縮することを提供する薬剤である。極めて好ましい凝集阻害剤は、ショ糖であるが、他の凝集阻害剤、たとえば、ポリプレックス沈殿を減少させることができ、かつキトサン−核酸ポリプレックスを濃縮することを提供する他の糖質類を用いてもよい。他の凝集阻害剤の例としては、トレハロース、グリセロール、フルクトース、グルコースおよび他の還元糖類および非還元糖類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
好ましい実施形態では、使用される凝集阻害剤は、ショ糖である。キトサン−核酸ポリプレックス分散におけるショ糖の濃度は、好ましくは約３重量％〜２０重量％である。最も好ましくは、ショ糖の濃縮は、等張性組成物を与える。
【００６９】
好ましい実施形態では、高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、等張である。ポリプレックス安定性を維持しつつ、等張性を達成することは医薬組成物を製剤化する際に極めて望ましく、かつこれらの好ましい組成物は医薬製剤応用および治療応用に適切である。
【００７０】
別の実施形態では、組成物は高張性または低張性であり得る。
【００７１】
核酸
【００７２】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、核酸成分およびキトサン成分を含む。本発明の核酸は通常、ホスホジエステル結合を含むが、しかし一部の場合、種々の目的のいずれか、たとえば安定性および保護等のために組み込んだ交互骨格または他の修飾または残基を有し得る核酸類似体が含まれる。考えられる他の類似体核酸は、非リボース骨格を持つものを含む。核酸は一本鎖もしくは二本鎖であることもあり得、または二本鎖および一本鎖の両配列の部分を含むこともある。核酸にはＤＮＡと、ＲＮＡと、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドのいずれかの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含むいずれかの塩基の組み合わせを核酸が含有するハイブリッドが挙げられるがこれらに限定されない。核酸には、三本鎖、二本鎖または一本鎖、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、キメラ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびそれらの誘導体を含む、いずれかの形のＤＮＡ、いずれかの形のＲＮＡが含まれる。
【００７３】
実施形態では、核酸成分およびキトサン成分を治療用核酸を含む。治療用核酸は、治療用ＲＮＡを含む。これは、哺乳類細胞において治療効果を及ぼすことができるＲＮＡ分子である。治療用ＲＮＡには、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および酵素的ＲＮＡが含まれる。治療用核酸には、三重鎖分子、タンパク質結合核酸、リボザイム、デオキシリボザイム、およびヌクレオチド低分子を形成する核酸が含まれる。
【００７４】
治療用核酸も、治療用タンパク質をコードする核酸を含む。
【００７５】
好ましい実施形態では、核酸成分は、治療用核酸コンストラクトを含む。治療用核酸コンストラクトは、治療効果を及ぼすことができる核酸コンストラクトである。治療用核酸コンストラクトは、好ましくは治療用タンパク質をコードする核酸を含むが、治療用ＲＮＡである転写物を代わりに生成することができる。治療用核酸を用いて、治療目的の生成物をコードすることによって、欠陥遺伝子の代替もしくは増強として使用することによる遺伝子療法を行う、または特定の遺伝子生成物の欠如を代償することも可能である。治療用核酸は、内在性遺伝子の発現を阻害することも可能である。治療用核酸は、翻訳生成物のすべてまたは一部をコードすることも可能であり、かつ細胞内にすでに存在するＤＮＡと組み合わせ、それによって欠陥遺伝子もしくはその部分を置き換えることによって機能することも可能である。治療用核酸は、タンパク質の一部をコードし得る。治療用タンパク質は、遺伝子生成物を阻害することによって、その効果を及ぼし得る。好ましい実施形態では、治療用核酸は米国特許出願第１１／６９４，８５２号に開示されるものから選択される。この出願は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。また、国際公開第２００８０２０３１８号を参照されたい。この公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【００７６】
本発明での使用が考えられる治療用タンパク質としては、ホルモン類、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗体、増殖因子、分化因子、血塊形成に影響する因子、血糖値に影響する因子、糖代謝に影響する因子、脂質代謝に影響づる因子、血液コレステロール値に影響する因子、血液ＬＤＬ値またはＨＤＬ値に影響する因子、細胞アポトーシスに影響する因子、食物摂取に影響する因子、エネルギー消費に影響する因子、食欲に影響する因子、栄養の吸収に影響する因子、炎症に影響する因子、および骨形成に影響する因子が挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましいのは、インスリン、レプチン、グルカゴン拮抗剤、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２、Ｇｈｒｅｈｎ、コレシストキニン、成長ホルモン、凝固因子、ＰＹＹエリスロポイエチン、炎症の阻害剤、ＩＬ−１０拮抗剤、ＩＬ−１７拮抗剤、ＴＮＦα拮抗剤、ＩＬ−１拮抗剤、成長ホルモン放出ホルモン、または副甲状腺ホルモンをコードする治療用核酸である。
【００７７】
本発明で考えられる特に好ましい治療用タンパク質は、抗炎症性タンパク質である。本発明での使用が考えられる抗炎症性タンパク質には、抗炎症性サイトカイン、ならびにたとえば炎症誘発性サイトカイン等の炎症誘発性分子が挙げられるがこれらに限定されない。
代表的な抗炎症性タンパク質としては、ＩＬ−１０（たとえば、Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｄｅｃ；１１９（６）：１４７３−８２．； Ｗｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ Ｍａｒ １５；６２（６）：３６２５−３２）；ＩＬ−ＩＲａ（たとえば、Ａｒｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８；１６：２７−５５； Ｍａｋａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｊａｎ ９；９３（１）：４０２−６）；ＩＬ−ＩＴａ−Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＩＬ−４（たとえば、Ｈｏｇａｂｏａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７ Ｄｅｃ １；１００（１１）：２７６６−７６）；ＩＬ−１７可溶性受容体（たとえば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ｌｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． ２００６ Ｍａｙ；１２（５）：３８２−８； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅ １９４， Ｎｕｍｂｅｒ ４， Ａｕｇｕｓｔ ２０， ２００１ ５１９−５２８）；ＩＬ−６（たとえば、Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊａｎ １５；１０１（２）：３１１−２０）；ＩＬ−１１（たとえば、Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｄｅｃ １；１５９（１１）：５６６１−７０）；ＩＬ−１３（たとえば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｏｃｔ １；１５９（７）：３４８３−９； Ｍｕｃｈａｍｕｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｍａｒ １５；１５８（６）：２８９８−９０３）；ＩＬ−１８可溶性受容体（たとえば、Ａｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９９ Ｆｅｂ ２６；４４５（２−３）：３３８−４２）；ＴＮＦ−α可溶性受容体（たとえば、Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ；６６（６）：１００５−１３）；ＴＮＦ−α受容体Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＴＧＦ−β（たとえば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊｕｎ １５；１０１（１２）：２６１５−２１； Ｇｉｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）；ＩＬ−１２（たとえば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ Ｆｅｂ；２８（２）：４１３−２３）；ＩＦＮ−α（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ａｕｇ １０；１０（１２）：１９０５−１４）；ＩＬ−４可溶性受容体（たとえば、Ｓｔｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２００１ ；２（２）：６６−７０． Ｅｐｕｂ ２００１ Ｆｅｂ １９）が挙げられる。
【００７８】
特に本発明で用いる好ましい抗炎症性タンパク質としては、ＩＬ−１０，ＴＮＦαタンパク質拮抗剤、およびＩＬ−１のタンパク質拮抗剤が挙げられる。
【００７９】
発現調節領域
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明のポリプレックスは治療用核酸を含む。これはコード領域に作用可能に連結される発現調節領域を含む、治療用コンストラクトである。治療用コンストラクトは、治療用核酸を生成する。これはそのままで治療用であり得、または治療用タンパク質をコードし得る。
【００８１】
一部の実施形態では、治療用コンストラクトの発現調節領域には、恒常的活性がある。いくつかの好ましい実施形態では、治療用コンストラクトの発現調節領域には、恒常的活性がない。このため、治療用核酸の動的な発現もたらす。「動的な」発現とは、時間とともに変化する発現を意味する。動的な発現には、検出可能な発現の期間によって分離される低発現期間もしくは発現の非存在の期間等いくつかの期間を含むことがある。いくつかの好ましい実施形態では、治療用核酸は、調節可能なプロモーターに作用可能に連結される。このため、治療用核酸の調節可能な発現をもたらす。
【００８２】
発現調節領域は、調節ポリヌクレオチド（本明細書では要素と呼ぶこともある）、たとえば、作用可能に連結された治療用核酸に影響するプロモーターおよびエンハンサーを含む。
【００８３】
本明細書に含まれる発現制御要素は、細菌、酵母、植物、または動物（哺乳類もしくは非哺乳類）に由来することが可能である。発現調節領域は、たとえば天然のプロモーター等の完全長プロモーター配列およびエンハンサー要素、ならびに完全長のすべてもしくは部分、または非変異機能を保持する（たとえば、一部の栄養調節または細胞／組織−特異的発現を保持する）サブシークエンスまたはポリヌクレオチド変異体を含む。本明細書で使用するとき、用語「機能の」およびその文法的変異体とは、核酸配列、配列もしくは断片を参照で用いる場合、配列が天然の核酸の配列（たとえば非変異配列もしくは未修飾配列）のうちの１つまたは複数の機能を有することを意味する。本明細書で使用するとき、用語「変異体」とは、配列置換、欠失、もしくは付加、または他の修飾（たとえば、ヌクレアーゼに耐性である修飾形態等の化学誘導体）を意味する。
【００８４】
本明細書で使用するとき、用語「作用可能な連結」とは、構成成分がそれらの意図された方法で機能することができるように記載されている、構成成分の物理的並列をいう。核酸との作用可能な連結での発現制御要素の例では、この関係は、制御要素が核酸の発現を調節することである。一般的に、転写を調節する発現調節領域は、転写された核酸の５’末端（すなわち「上流の」）近くに並置される。発現調節領域は、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流の」）で、または、転写物内（たとえば、イントロン内に）に位置することもできる。発現制御要素は、転写された配列から離れた距離（たとえば核酸からの１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００またはそれ以上のヌクレオチド）に位置することもあり得る。発現制御要素の具体的な例はプロモーターであり、これは通常、転写された配列の５’末端に位置する。発現制御要素の別の例は、エンハンサーであり、これは転写された配列の５’もしくは３’末端、または転写された配列内に位置することもあり得る。
【００８５】
一部の発現調節領域は、作用可能に連結された治療用核酸に、調節可能な発現を与える。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、この発現調節領域に作用可能に連結された治療用核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるこの発現調節領域は、誘導性と呼ばれることが多い。シグナルに応答して発現を減少させるこの発現調節領域は、抑制性と呼ばれることが多い。一般的に、そのような要素で与えられる増加量または減少量は、シグナルが示す量と比例し、シグナル量が大きくなればなるほど、発現の増加または減少もより大きくなる。
【００８６】
多数の調節可能なプロモーターが当該技術分野で既知である。好ましい誘導性発現調節領域は、小分子化学物質で刺激される誘導性プロモーターを有するものを含む。一実施形態では、発現調節領域は経口的に送達可能である化学物質に応答するが、食物では通常見つからない。特定の例は、たとえば、米国特許第５，９８９，９１０号；第５，９３５，９３４号；第６，０１５，７０９号；および第６，００４，９４１号に見出すことができる。
【００８７】
一実施形態では、治療用コンストラクトは、組込み配列をさら含む。一実施形態では、治療用コンストラクトは、単一の組込み配列を含む。別の実施例では、治療用コンストラクトは、治療用核酸またはその一部を標的細胞のゲノムに組み込むための第１のおよび第２の組込み配列を含む。好ましい実施形態では、１つまたは複数の組込み配列は、マリナー、スリーピングビューティー、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、φＣ３１、Ｒ，λからなる群から選択される組込み手段、ならびにＡＡＶ、レトロウイルス、および抗ウイルス等の組込みウイルスからの組込み手段と組み合わせて機能する。
【００８８】
一実施例では、対象組成物は、治療用コンストラクトに加えて非治療用コンストラクトをさらに含む。ここで非治療用コンストラクトは、第２の発現調節領域に作用可能に連結した組込みのための手段をコードする核酸配列を含む。この第２の発現調節領域および治療用核酸に作用可能に連結した発現調節領域は、同一であっても、または別であってもよい。組込みのためのコードした手段は、好ましくは、マリナー、スリーピングビューティー、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、φＣ３１、Ｒ，λからなる群から選択され、かつＡＡＶ、レトロウイルス、および抗ウイルス等の組込みウイルスからの組込み手段から選択される。
【００８９】
さらなる教示のために、国際公開第２００８０２０３１８号を参照されたい。その全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９０】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を調製する方法
【００９１】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックスの組成物は、他の方法、たとえば核酸溶液またはキトサン溶液をもう一方の溶液に滴下することによって混合溶液を形成する等の他の方法も用いることも可能であるが、好ましくはインライン混合によって調製される。しかし、インライン混合は、好ましくは０．５未満の、より好ましくは０．４未満の、より好ましくは０．３未満の、最も好ましくは０．２未満の平均ＰＤＩを有するキトサン−核酸ポリプレックスを大容量で均一に調製することをもたらす。好ましい実施形態では、分散液は３．５〜５．５のｐＨ値を有する。
【００９２】
インライン混合は、周知のプロセスであり、それによって２種類の（またはそれ以上の）流体ストリームが１つのストリームにまとめられる。インライン混合の付加的な説明およびキトサン−核酸ポリプレックスの濃縮については、２００８年９月２６日に出願された国際出願第ＰＣT/ＣＡ２００８／００１７１４号、国際公開第２００９／０３９６５７号として公開される）に見出される。公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。インライン混合についてのさらなる開示については、たとえば米国特許第６，２６１，５９９号および同第６，５３７，８１３号を参照されたい。これらのそれぞれは参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９３】
この組成物は、所望の低ｐＨ値で複合体に形成され得る、またはより高いｐＨ値で複合体に形成され、複合体形成後にｐＨを調整して、所望の高酸性分散液を形成してもよい。
【００９４】
静的ミキサーおよび動的なミキサー等のミキサーを使用してもよい。この装置は、本方法によって形成される複合体のＰＤＩの増加をもたらす。したがって、本発明の好ましい実施形態では、インライン混合は、このようなミキサーを用いずに行われる。
【００９５】
好ましい実施形態では、本発明の高酸性高濃度キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液を濃縮することによって生成される。一実施形態では、予備濃縮分散液は、４．８以下のｐＨ値、好ましくは３．５〜４．５のｐＨ値を有する。別の実施形態では、予備濃縮分散液は、４．５を超えるｐＨ値を有する。濃縮生成物は、４．５以下のｐＨ値にｐＨを調整されてもよい。予備濃縮分散液は、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度を有する。
【００９６】
本発明では、タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ」）は、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液を濃縮するための好ましい方法である。ＴＦＦ操作において、一部の液体を膜を通させるために膜に向かって加圧される間に、キトサン−核酸ポリプレックス分散液は、半透性膜の表面を越えてポンピングされる。膜孔より小さい分子は、膜孔を通って輸送され、透過するにつれて、収集される。透過溶質には、塩類、イオン類、糖類、および微生物防腐剤が挙げられるがこれらに限定されない。キトサン−核酸ポリプレックスを含む、膜孔を通過するには大きすぎる分子実体は、ストリーム内に保持されて、保持液として再循環する。ＴＦＦ濃縮操作において、透過液は取り出され、他方保持液は気圧に開放され、保持液量が減少することになる。ＴＦＦを用いることで、ポリプレックス濃度は数倍も増加し、高濃縮ポリプレックス分散液がもたらされ得る。好ましい実施形態では、高濃縮ポリプレックス分散液は等張性である。
【００９７】
好ましい実施形態では、この濃縮プロセスは、１つまたは複数のダイアフィルトレーション操作をさらに含む。４．８より高いｐＨ値を有する組成物を用いることもあり得るが、４．８以下のｐＨ値を有する予備濃縮キトサン−核酸ポリプレックス組成物を用いる場合、ダイアフィルトレーションは特に好まれる。
【００９８】
ＴＦＦダイアフィルトレーション操作では、新しいバッファを保持液に加えることによって透過液は常に補充され、保持液中のバッファの交換をもたらす。ＴＦＦダイアフィルトレーションを用いることで、ポリプレックス濃度を維持しつつ、ポリプレックスはバッファ交換されることが可能であり、新しいバッファを有するポリプレックス分散液がもたらされる。
【００９９】
一実施例では、濃縮ポリプレックス分散液へのＴＦＦ濃縮を行う前に、ＴＦＦダイアフィルトレーション操作は、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液で行われる。好ましい実施形態では、濃縮ポリプレックス分散液へのＴＦＦ濃縮を行ってから、ＴＦＦダイアフィルトレーション操作は、キトサン−核酸ポリプレックスの濃縮分散液で行われる。極めて好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーション操作は、ＴＦＦ濃縮操作の間に行われる。この操作中に、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液は、ＴＦＦ濃縮によって一部濃縮され、次いでＴＦＦダイアフィルトレーションに掛けられ、次いでＴＦＦ濃縮によってさらに濃縮される。これにより、新しいバッファを有する濃縮ポリプレックス分散液がもたらされ、キトサン−核酸ポリプレックスの安定性がさらに促進される。
【０１００】
一実施例では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは４０未満である。好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは２０未満である。より好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは１０未満である。きわめて好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは６未満である。
【０１０１】
一実施形態では、濃縮操作中に行われるＴＦＦダイアフィルトレーション操作の回数は５未満であり、かつ１を超える。好ましい実施形態では、行われるＴＦＦダイアフィルトレーション操作の回数は、１である。
【０１０２】
好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションバッファは、キトサンを含む。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションバッファは、キトサンおよび対アニオン（好ましくはアセテート）を含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションバッファは、キトサン、対アニオン（好ましくはアセテート）、および凝集阻害剤（好ましくはショ糖）を含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、濃縮キトサン−核酸ポリプレックス分散液のｐＨは、ｐＨ調整バッファを追加することによって、より低いｐＨ値に調整される。
【０１０６】
好ましい実施形態では、ｐＨ調整バッファは、キトサンを含む。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ｐＨ調整バッファは、キトサンおよび対アニオン（好ましくはアセテート）を含む。
【０１０８】
好ましい実施形態では、ｐＨ調整バッファは、濃縮キトサン−核酸ポリプレックスをわずかに（好ましくは５％未満）希釈する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＴＦＦ濃縮操作の完了後１時間以内に、ｐＨ調整バッファは、濃縮キトサン−核酸ポリプレックスに加えられる。
【０１１０】
好ましい実施形態では、予備濃縮キトサン−核酸ポリプレックス分散液は、糖（好ましくはショ糖）を含む。後述のとおり、ショ糖が濃縮プロセスの間に粒子の凝集を防止する凝集阻害剤であることが判明した。
【０１１１】
使用方法
【０１１２】
一態様では、本発明は粘膜上皮の細胞をトランスフェクトする方法を提供する。これらの方法は、粘膜上皮の細胞を本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物と接触させることを含む。一実施形態では、トランスフェクションはインビトロで行われる。別の実施形態では、トランスフェクションはインビボで行われる。対象組成物は、組成物の高酸性にもかかわらず、粘膜上皮の投与に適しており、かつ粘膜上皮細胞の高いトランスフェクション効率を示す。
【０１１３】
好ましい実施形態では、粘膜上皮は、消化管組織、気道組織、肺組織、副鼻腔組織、口腔組織、尿路組織、膀胱組織、膣組織、子宮組織、頸部組織、眼組織、食道組織、唾液腺組織、鼻喉頭組織、腎臓組織、および喉頭／咽頭組織からなる群から選択される組織内に存在する。
【０１１４】
一態様では、本発明は粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置する方法を提供する。これらの方法は、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。対象医薬組成物は、好ましくは粘膜上皮に局所投与される。対象医薬組成物は、抗炎症性活性がある治療用核酸を含む。
【０１１５】
好ましい実施形態では、対象医薬組成物は、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトを含む。一実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＴＮＦα阻害剤である。別の実施形態では、抗炎症性タンパク質はＩＬ−１阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質はＩＬ−１０である。
【０１１６】
一実施例では、治療用核酸は、炎症性サイトカインに向けられる治療用ＲＮＡである炎症性サイトカインに向けられるｓｉＲＮＡが特に好まれる。
【０１１７】
好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、ＩＢＤである。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、間質性膀胱炎である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、喘息である。
【０１１８】
対象組成物は、粘膜上皮細胞のトランスフェクションによって処置可能である疾患または状態の処置に用いるのに適切である。この疾患には、粘膜上皮組織に関わる疾患が含まれるがこれらに限定されない。対象組成物を用いて、組成物が投与され得る、粘膜上皮組織に関わらない疾患および状態を処置することもできる。このような状態および疾患は、それにもかかわらず、粘膜上皮組織のこのようなトランスフェクションを介して治療的に到達可能である。たとえば、国際公開第２００８０２０３１８号を参照されたい。この公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。たとえば、対象組成物を腸の粘膜上皮に投与することで、コードした治療用タンパク質を全身に送達し得る。
【０１１９】
治療用核酸を用いて、治療目的の生成物をコードすることによって、欠陥遺伝子の代替もしくは増強として使用することによる遺伝子療法を行う、または特定の遺伝子生成物の欠如を代償することも可能である。治療用核酸も、内在性遺伝子の発現を阻害し得る。治療用核酸は、翻訳生成物のすべてまたは一部をコードすることも可能であり、かつ細胞内にすでに存在するＤＮＡと組み合わせ、それによって欠陥遺伝子もしくはその部分を置き換えることによって機能することも可能である。治療用核酸も、タンパク質の一部ををコードし得る。治療用タンパク質は遺伝子生成物を阻害することによってその効果を及ぼし得る。
【０１２０】
処置され得る疾患または状態としては、糖尿病、肥満症、ホルモン欠乏症、炎症性大腸疾患、下痢、過敏性腸症候群、消化管感染症、消化性潰瘍、胃食道逆流症、胃不全麻痺、痔核、栄養吸収障害、膵臓炎、ヘモクロマトーシス、小児脂肪便病、黄斑変性症、加齢性黄斑変性、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、虹彩炎、強膜炎、緑内障、角膜炎、網膜症、眼感染症（たとえば、角膜真菌症）、感染症、子宮内膜症、子宮頸管炎、泌尿器疼痛、ポリープ、フィブロイド、子宮内膜増殖症、尿失禁、膀胱および尿路感染症、過活動膀胱、勃起障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、膜性腎症、高血圧、食物アレルギー、喘息、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎、異脂肪血症／高コレステロール血症、メタボリックシンドローム、乾癬、ざ瘡、酒さ、肉芽腫性皮膚炎、しわ、色素脱失、慢性閉塞性肺疾患、気道感染症、嚢胞性線維症、肺血管疾患、線維症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経障害、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症および炎症が挙げられるがこれらに限定されない。方法は、本発明の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
【０１２１】
本発明の治療用タンパク質は、このような治療用タンパク質をコードする治療用核酸を含む対象組成物によって生成され得る。後述する治療用タンパク質の使用は、このような治療用タンパク質の使用を達成するために、対象組成物の使用をいう。
【０１２２】
本発明で用いるために考えられる治療用タンパク質は、種々の活性を有し、かつ種々の障害の処置での使用が見出される。治療用タンパク質、および本発明の治療用タンパク質で処置可能な徴候についての以下の説明は、例示的であって、網羅的であることを意図するものではない。用語「被験者」とは、好ましい哺乳類および特に好ましいヒトを含む動物をいう。治療用タンパク質が標的タンパク質の拮抗剤である実施形態において、代替治療実施形態は、同じ標的タンパク質を標的とする治療用ＲＮＡを使用することもある。
【０１２３】
治療用タンパク質および標的疾患の一部のリストを以下の表に示す。
【表１】
【０１２４】
炎症性疾患
【０１２５】
好ましい実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、炎症を調節する。たとえば、治療用ポリペプチドは、炎症反応に関与する細胞の増殖および分化を抑制し得る。れらの分子を用いて、炎症性状態（慢性および急性の両状態）を処置することがでる。かかる炎症性状態には、感染症（たとえば、敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））に関連する炎症、虚血再灌流障害、致死性内毒素、関節炎、膵炎、補体媒介性超急性拒絶反応、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘発肺損傷、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性膀胱炎、クローン病、または炎症性サイトカイン（たとえばＴＮＦαおよびＩＬ−１）の過剰産生に起因する他の疾患が含まれる。
【０１２６】
特に好ましい実施形態では、本発明は粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置するための方法を提供する。方法は、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。対象医薬組成物は、粘膜上皮に好ましくは局所投与される。一実施形態では、対象医薬組成物は、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトを含む。本発明で用いることが考えられる抗炎症性タンパク質としては、抗炎症性サイトカインならびにたとえば炎症性サイトカイン等の炎症性分子のタンパク質拮抗剤が挙げられるが、これらに限定されない。
代表的な抗炎症性タンパク質としては、ＩＬ−１０（たとえば、Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｄｅｃ； １１９（６）：１４７３−８２．； Ｗｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ Ｍａｒ １５；１６２（６）：３６２５−３２）をはじめとして、ＩＬ−１Ｒａ（たとえば、Ａｒｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８； １６：２７−５５； Ｍａｋａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｊａｎ ９；９３（１）：４０２−６）；ＩＬ−１Ｒａ−Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＩＬ−４（たとえば、Ｈｏｇａｂｏａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７ Ｄｅｃ １ ；１００（１１）：２７６６−７６）；ＩＬ−１７可溶性受容体（たとえば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ｌｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． ２００６ Ｍａｙ；１２（５）：３８２−８； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅ １９４， Ｎｕｍｂｅｒ ４， Ａｕｇｕｓｔ ２０， ２００１ ５１９−５２８）；ＩＬ−６（たとえば、Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊａｎ １５；１０１（２）：３１１−２０）；ＩＬ−１１（たとえば、Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｄｅｃ １ ；１５９（１１）：５６６１−７０）；ＩＬ−１３（たとえば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｏｃｔ １ ；１５９（７）：３４８３−９； Ｍｕｃｈａｍｕｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｍａｒ １５；１５８（６）：２８９８−９０３）；ＩＬ−１８可溶性受容体（たとえば、Ａｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９９ Ｆｅｂ ２６；４４５（２−３）：３３８−４２）；ＴＮＦ−α可溶性受容体（たとえば、Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ；６６（６）：１００５−１３）；ＴＮＦ−α受容体Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＴＧＦ−β（たとえば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊｕｎ １５；１０１ （１２）：２６１５−２１； Ｇｉｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）；ＩＬ−１２（たとえば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ Ｆｅｂ；２８（２）：４１３−２３）；ＩＦＮ−γ（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ａｕｇ １０；１０（１２）：１９０５−１４）；ＩＬ−４可溶性受容体（たとえば、Ｓｔｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２００１ ；２（２）：６６−７０． Ｅｐｕｂ ２００１ Ｆｅｂ １９）がある。
【０１２７】
好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＴＮＦα阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１０である。
【０１２８】
好ましい実施形態において、粘膜上皮の炎症を含んでいる疾患は、ＩＢＤである。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、間質性膀胱炎である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、喘息である。
【０１２９】
高血糖症と体重
【０１３０】
治療用タンパク質はインスリンおよびインスリン類似体を含む。糖尿病は、膵臓β−細胞からのインスリン産生が存在しない（１型）または不十分な（２型）ことに起因する消耗性の代謝疾患である（Ｕｎｇｅｒ Ｒ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９９８）に基づく）。β細胞は、食後のインスリン放出に備えて産生し貯蔵する専門の内分泌細胞である（Ｒｈｏｄｅｓ，らＪ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０５ １４５（１９８７））。インスリンは、それを必要とする組織に血液からグルコースの移動を促進するホルモンである。糖尿病患者は血糖値をしばしばモニターしなければならなく、多くの患者は生存するために毎日複数回のインスリン注射を必要とする。しかし、かかる患者が、インスリン注射によって理想的なグルコースレベルに達成するのはまれである（Ｔｕｒｎｅｒ， Ｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ ２８１ ２００５（１９９９））。その上、インスリンレベルの上昇が長期間にわたると、有害な副作用、たとえば低血糖ショックおよびインスリンに対する身体反応の低下等をもたらすこともあり得る。したがって、糖尿病患者は、長期的合併症、たとえば心血管疾患、腎臓疾患、失明、神経損傷および創傷治癒障害等を依然として発症する（ＵＫ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ） Ｇｒｏｕｐ， Ｌａｎｃｅｔ ３５２， ８３７（１９９８））。
【０１３１】
本発明の方法によって処置可能な障害としては、高血糖状態、たとえば、インスリン依存性（１型）糖尿病またはインスリン非依存性（２型）糖尿病、ならびに高血糖状態と関連するまたは高血糖状態に起因する生理的状態もしくは障害がある。このように、本発明の方法によって処置可能な高血糖状態は、慢性または急性の高血糖症（たとえば糖尿病）と関連する病理組織学的変化を含む。特定の例としては、膵臓の変性（β−細胞崩壊）、腎尿細管石灰化、眼損傷（糖尿病性網膜症）、糖尿病性足病変、口および歯茎等の粘膜潰瘍、過度の出血、血液凝固または創傷治癒の遅延、ならびに冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、脂質異常症、高血圧症および肥満症のリスクの増加が挙げられる。
【０１３２】
対象組成物は、グルコースの低下、グルコース耐性の改善、高血糖状態（たとえば糖尿病）の処置、または高血糖状態と関連するまたは高血糖状態に起因する生理障害の処置にとって有用である。かかる障害としては、たとえば、糖尿病性神経障害（自律神経性）、腎症（腎障害）、皮膚感染症および他の皮膚疾患、損傷もしくは創傷の治癒の低下または遅延（たとえば糖尿病性のカルブンケルをもたらす）、失明にいたる眼損傷（網膜症、白内障）、糖尿病性足病変、および歯周炎の加速化が挙げられる。このような障害には、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、脂質異常症、高血圧症および肥満症のリスクの増加も挙げられる
【０１３３】
本明細書で使用するとき、被験者の状態に関して使われるとき、用語「高血糖性」または「高血糖症」とは、被験者の血液中に存在する一過性または慢性的に異常に高いレベルのグルコースを意味する。この状態は、グルコース代謝または吸収の遅延によって引き起こされ得る。その結果被験者がグルコース不耐性または健常被験者において通常は見られないグルコースが上昇した状態を示す（たとえば、糖尿病を発症するリスクがあるグルコース不耐性のサブ糖尿病被験者において、または糖尿病被験者において）。空腹時血糖値（ＦＰＧ）レベルは、正常血糖の場合は約１１０ｍｇ／ｄＬ未満であり、グルコース代謝障害の場合は約１１０〜１２６ｍｇ／ｄＬであり、糖尿病の場合は、約１２６ｍｇ／ｄＬを超える。
【０１３４】
腸粘膜組織でのタンパク質産生による処置可能な障害には、肥満または望ましくない体重も含まれる。レプチン、コレシストキニン、ＰＹＹおよびＧＬＰ−１は、空腹感を減少させ、エネルギー消費を増加させ、体重減少を誘発し、または正常なグルコース恒常性を維持する。このように、種々の実施形態では、肥満もしくは望ましくない体重、または高血糖症を処置する本発明の方法は、レプチン、コレシストキニン、ＰＹＹまたはＧＬＰ−１をコードする治療用核酸の使用を含む。処置可能な障害としては、通常肥満と関連するもの、たとえば異常に高い血清／血漿ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、コレステロール、血管の狭窄もしくは閉塞を引き起こすプラーク形成、高血圧症／脳卒中、冠動脈心疾患等のリスク増加も挙げられる。グレリンは食欲および空腹感を増加させる。このように、種々の実施形態では、肥満もしくは望ましくない体重、または高血糖症を処置する本発明の方法は、グレリンの拮抗剤の使用を含む。一実施形態では、拮抗剤はグレリンを目標とする治療用ＲＮＡである。
【０１３５】
本明細書で使用するとき、用語「肥満の」または「肥満」とは、年齢および性別が対応した健常被験者と比較すると、少なくとも３０％の体重増加を有する被験者をいう。「望ましくない体重」とは、対応する健常な被験者よりも１％〜２９％多い体重を有する被験者、ならびに体重に関しては正常であるが、その体重を減少させたい、または増加を防止したいと願う被験者をいう。
【０１３６】
一実施例では、本発明の治療用タンパク質は、グルカゴン拮抗剤である。グルカゴンは、膵島のα細胞によって産生されるペプチドホルモンであり、かつグルコース代謝の主要な制御因子である（Ｒ Ｈ ＆ Ｏｒｃｉ Ｌ Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３０４ １５１８（１９８１）， Ｕｎｇｅｒ Ｒ Ｈ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２５ １３６ （１９７６）に基づく）。インスンと同様に、血中グルコース濃度は、グルカゴン分泌を媒介する。しかし、インスリンと対照的に、グルカゴンは血中グルコースの低下に応答して分泌される。したがって、グルカゴンの循環する濃度は、絶食期間に最も高く、食事の間に最も低い。グルカゴンレベルは増加して、グルコース貯蔵を促進することからインスリンを抑え、かつ肝臓を刺激してグリコースを血中に放出させる。グルカゴン拮抗剤の具体的な例は、［ｄｅｓ−Ｈｉｓ1、ｄｅｓ−Ｐｈｅ6、Ｇｌｕ9］グルカゴン−ＮＨ2である。ストレプトゾトシン糖尿病ラットにおいて、血中グルコースは、このグルカゴン拮抗剤の静脈内ボーラス（０．７５μｇ／ｇ体重）から１５分以内に３７％低下した（Ｖａｎ Ｔｉｎｅ Ｂ．Ａ．ら Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３３１６（１９９６））。さらに、種々の実施形態では、糖尿病すなわち高血糖症を処置するための本発明の方法は、膵臓からのグルカゴン産生のレベルを低下させるために、治療用ＲＮＡの使用を含む。
【０１３７】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置することに有用な本発明の治療用タンパク質または、グカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である。ＧＬＰ−１は、食事中、腸内のＬ−細胞から放出されるホルモンであり、膵臓β細胞を刺激してインスリン分泌を増加させる。ＧＬＰ−１は、さらなる活性を有し、そのため肥満および糖尿病を処置する治療薬として興味あるものになる。たとえば、ＧＬＰ−１は胃内容排出を減少させ、食欲を抑制し、グルカゴン濃度を低下させ、β細胞質量を増加させ、グルコース依存様式でインスリンの生合成および分泌を刺激し、インスリンに対する組織感受性をおそらく高める（Ｋｉｅｆｆｅｒ Ｔ．Ｊ．， Ｈａｂｅｎｅｒ Ｊ．Ｆ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ Ｒｅｖ ２０ ８７６（２０００））。したがって、食事と同時起こる腸内でのＧＬＰ−１の調節放出は、高血糖状態または望ましくない体重に対して治療効果をもたらすことができる。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）に耐性があるＧＬＰ−１類似体は、より長い作用時間および治療効果をもたらす。したがって、ＧＬＰ−１類似体は好ましい治療用ポリペプチドである。さらに、種々の実施形態では、糖尿病すなわち高血糖症を処置するための本発明の方法は、ＤＰＰ ＩＶ拮抗剤の使用を含む。一実施形態では、拮抗剤は、ＤＰＰ ＩＶをを標的とする治療用ＲＮＡである。
【０１３８】
別の実施形態では、高血糖状態を処置することに有用な本発明の治療用タンパク質は、ホルモンレジスチンに対する拮抗剤である。レジスチンは、食事性肥満および遺伝型肥満においてその発現が上昇する脂肪細胞由来因子である。循環するレジスチンを中和することで、肥満マウスにおいて血中グルコースおよびインスリン作用が改善される。逆に、正常なマウスにレジスチンを投与すると、グルコース耐性およびインスリン作用が損なわれる（Ｓｔｅｐｐａｎ ＣＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９；３０７（２００１））。したがって、腸でレジスチンの生物学的効果を拮抗するタンパク質が産生されると、肥満に連結したインスリン耐性および高血糖状態に対する有効な治療をもたらすことができる。さらに、種々の実施形態では、糖尿病すなわち高血糖を処置するための本発明の方法は、治療用ＲＮＡを用いて、脂肪組織でレジスチン発現のレベルを低下させることを含む。
【０１３９】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置することに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、レプチンである。主として脂肪細胞によって産生されるが、レプチンは胃でも食事依存様式でより少ない量でに産生される。レプチンは、脂肪細胞代謝および体重についての情報を脳内の食欲中枢にリレーし、脳は食物摂取を減少させるシグナルを送って（満腹感を促進する）、身体エネルギー消費を増加させる。
【０１４０】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置するのに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、脂肪細胞の補体関連のタンパク質（Ａｃｒｐ３０）のＣ末端の球状ヘッドドメインである。Ａｃｒｐ３０は、分化した脂肪細胞によって産生されるタンパク質である。マウスに対する球状ヘッドドメインからなるＡｃｒｐ３０のタンパク質分解切断生成物をマウスに投与すると、有意な体重減少がもたらされる（Ｆｒｕｅｂｉｓ Ｊ らＰｒｏｃ ＮａｔＬ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８ ２００５ （２００１））。
【０１４１】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置することに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、コレシストキニン（ＣＣＫ）である。ＣＣＫは、腸内で特定の栄養分に応答して腸から分泌される消化管ペプチドである。ＣＣＫ放出は、消費される食物の量と比例し、脳に食事を終了するシグナルを送ると考えられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０４；６６１−７１（２０００））。したがって、ＣＣＫｎｏ上昇は食事量を減らすことができ、体重減少または体重安定化を促進することができる（すなわち、体重増加の上昇を防止する、または阻害する）。
【０１４２】
ＰＹＹに関しては、たとえばＩｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ ２００５ Ｍａｙ，６４（２）２１３−６を参照されたい。
【０１４３】
免疫障害
【０１４４】
一実施例では、本発明の治療用タンパク質は、免疫調節性活性を備えている。たとえば、本発明の治療用ポリペプチドは、免疫細胞の増殖、分化または動員（化学走性）を活性化する、または阻害することによって、免疫系の不全および障害を処置するのに有用であり得る。免疫細胞は血球新生のプロセスを通じて発現し、多能性幹細胞から骨髄系細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）ならびにリンパ球系細胞（Ｂリンパ球細胞およびＴリンパ球細胞）を産生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝子性、体細胞性、感染性、またはその他であり得る。
【０１４５】
本発明の治療用ポリペプチドは、造血細胞の不全または障害を処置することに有用であり得る。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、いくつかの（または多く）の造血細胞の種類の減少に係る造血細胞障害を処置する目的で、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化または増殖を増加させることが可能である。、免疫不全症候群の例としては、血液タンパク質質障害（たとえば、無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調症、分類不能型免疫不全症、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染症、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染症、白血球粘着不全症候群、リンパ球減少症、貪食殺菌機能障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ障害、貧血症、血小板減少症、またはヘモグロビン尿症が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４６】
本発明の治療用ポリペプチドは、自己免疫障害を処置することにも有用であり得る。多くの自己免疫不全は、免疫細胞が自己を異物として不適当に認識することから生じる。この不適当な認識は、宿主組織の破壊をもたらすことになる免疫応答に起因する。したがって、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または化学走性を阻害する本発明の治療用ポリペプチドを投与することは、自己免疫障害を防止する有効な治療になり得る。
【０１４７】
本発明によって治療されることができる自己免疫不全の例としては、Ａｄｄｉｓｏｎ病、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、Ｇｒａｖｅｓ病、多発性硬化症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡 、天疱瘡、多腺性内分泌障害 、紫斑病、Ｒｅｉｔｅｒ病、全身硬直症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫肺炎症、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、インシュリン依存性糖尿病、Ｃｒｏｈｎ病、潰瘍性大腸炎、および自己免疫性炎症性眼病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４８】
同様に、アレルギー性反応および状態、たとえば喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害は、本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る。さらに、これらの分子を用いて、アナフィラキシ、抗原分子に対する過敏症または血液型不適合を処置することができる。
【０１４９】
本発明の治療用ポリペプチドは、臓器拒絶反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するおよび／または阻止することもある。臓器拒絶反応は、免疫応答を通して移植組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにも関与しているが、この場合は、異質移植された免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答を阻害する、特にＴ細胞の増殖、分化または化学走性を阻害する本発明の治療用ポリペプチドを投与することで、臓器拒絶反応またはＧＶＨＤを阻止するのに有効な治療になり得る。
【０１５０】
凝固障害
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、止血活性（出血の阻止）または血栓溶解活性（凝固形成）を調節することも可能である。たとえば、止血活性または血栓溶解活性を増加させることによって、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、血液凝固障害（たとえば、無フィブリノゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（たとえば、血小板減少症）、または外傷、手術、もしくは他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血栓溶解活性を減少させることができる、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、凝固を阻害するまたは溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、脳卒中または瘢痕の処置において重要であり得る。一実施例では、本発明の治療用ポリペプチドは凝固因子であり、血友病または他の凝固／凝固障害（たとえば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第Ｘ因子）の処置に有用である。
【０１５２】
感染症
【０１５３】
一実施例では、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、感染症を処置することができる。たとえば、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させて、免疫応答を増加させることによって、感染症は処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を強化するか、または新しい免疫応答を開始することによって増加し得る。あるいは、必ずしも免疫応答を誘発することなく、本発明の治療用ポリペプチドは、感染病原体を直接阻害することも可能である。
【０１５４】
本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る疾患または症状を引き起こし得る感染病原体の一例はウイルスである。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルス系統群が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビマウイルス科、ビニヤウイルス科、カリチウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科（たとえば、サイトメガロウイルス属、単純ヘルペス、帯状ヘルペス）、モノネガウイルス（たとえば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラプドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（たとえば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（たとえば、天然痘またはワクシニア）、レオウイルス科（たとえば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（たとえば、ルビウイルス属）。これらの系統群に含まれるウイルスは、関節炎、細気管支炎、脳炎、眼感染症（たとえば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、髄膜炎、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ）、肺炎、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ 、狂犬病、感冒、小児麻痺、風疹、性感染病、皮膚病（たとえば、カポジ、いぼ）、およびウイルス血症が挙げられる。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置することができる。
【０１５５】
同様に、疾患または症状を引き起す可能性があり、かつ本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る、または検出され得る、細菌病原体または真菌病原体としては、以下のグラム陰性菌およびグラム陽性菌の系統群ならびに真菌類が挙げられるがこれらに限定されない：放線菌目（たとえば、コリネバクテリウム、マイコバクテリア、放射菌）、アスペルギルス、バチルス科（たとえば、炭疽菌、クロストリジウム）、バクテロイド科、ブラストミセス、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ、カンジダ、カンピロバクター、コクシジオイデス症、クリプトコッカス、皮膚真菌症、腸内細菌科（クレブシエラ属、サルモネラ菌、セラチア属、エルシニア属）、エリジペロスリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア属、マイコプラズマ目、ナイセリア科（たとえば、アシネトバクター属、ゴノレア、髄膜炎菌）、パスツレラ科感染症（たとえば、アクチノバシラス属、ヘモフィルス属、パスツレラ属）、シュードモナス属、リケッチア科、クラミジア科、梅毒、およびブドウ球菌。これらの細菌または真菌の系統群は、以下の疾患または症状の原因になり得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核症、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ関連の感染症）、爪周囲炎、人工器官関連の感染症、Ｒｅｉｔｅｒ病、気道感染症（たとえば、百日咳または膿胸）、敗血症、ライム病、ネコ引っかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、らい、パラ結核、結核、ループス、ボツリヌス症、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（たとえば、蜂巣炎、皮膚真菌症）、毒素血症、尿路感染症、創傷感染。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置し得る。
【０１５６】
さらに、本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る疾患または症状を引き起こす寄生虫病原体としては以下の系統群が挙げられるが、これらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外寄生生物、ジアルジア症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリバノソーマ症、およびトリコモナス。これらの寄生虫は、疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（たとえば、赤痢、ジアルジア症）、肺疾患、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ関連感染症）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症を含む種々の疾患または症状を引き起こし得る。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置し得る。
【０１５７】
再生
【０１５８】
本発明の治療用ポリペプチドを用いて、組織の再生を育成する細胞を分化、増殖、誘引させることができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６；５９−８７（１９９７）を参照されたい）。組織の再生を用いて、先天欠損、外傷（創傷、火傷、切開、もしくは潰瘍）、加齢、疾患（たとえば、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周疾患）、美容形成術を含む外科手術、線維症、再灌流障害、または全身性サイトカイン損傷によって損傷をうけた組織の修復、置換、または保護することができる。
【０１５９】
本発明の治療用タンパク質の寄与により再生し得る組織としては、器官（たとえば、膵臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、血管（血管内皮を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）組織を含む。再生は、わずかな瘢痕を伴う、または瘢痕を伴わずに生じることが好ましい。再生は血管形成を含んでもよい。
【０１６０】
さらに、本発明の治療用ポリペプチドは、治癒しにくい組織の再生を増大させることができる。たとえば、腱／靭帯の再生が増大すると、損傷の後の回復時間を速める。本発明の治療用ポリペプチドは損傷を回避する目的で、予防的にも使用され得る。処置され得る具体的な疾患としては、腱炎、（手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。難治性創傷の組織再生のさらなる例としては褥瘡、血行不全、手術創、および外傷に付随した潰瘍を含む。
【０１６１】
同様に、神経および脳組織も、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、神経細胞を増殖、分化させることによって、再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢および末梢神経系疾患、神経障害、または機械性障害および外傷性障害（たとえば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および脳卒中）が挙げられる。具体的には、末梢神経損傷に付随する疾患、末梢神経障害、限局性神経障害、および中枢神経系疾患（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイドレーガー症候群）はすべて、本発明の治療用タンパク質を用いて処置され得る。ＣＮＳ障害に関して、当該技術分野では脳組織へ治療アクセスを容易にするための方法、たとえば、血液脳関門を破壊するための方法と、ＣＮＳへの輸送を提供する部分に治療薬を結合させる方法とを含むいくつがが知られている。一実施形態では、治療用核酸は、融合タンパク質をコードするように設計され、融合タンパク質は輸送部分および治療用タンパク質を含む。
【０１６２】
走化性
【０１６３】
一実施例では、本発明の治療用ポリペプチドは、走化活性を有する。走化性分子は、体内の特定の部位、たとえば炎症または感染の部位に、細胞（たとえば単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を誘引するまたは動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常を移動性を持つ細胞は、それから特定の外傷または異常物を撃退する、および／または治癒する。
【０１６４】
本発明の治療用ポリペプチドは、特定の細胞の走化活性を増大させ得る。次いで、これらの走化性分子を用いて、体内の特定の部位を標的とする細胞の数を増加させることによって、炎症、感染症、またはいずれかの免疫系障害を処置することができる。たとえば、走化性分子を用いて、免疫細胞を損傷部位へ誘引することによって、組織への創傷および他の外傷を処置することができる。本発明の走化性分子は、線維芽細胞も誘引することができ、この線維芽細胞を用いて創傷を処置することができる。
【０１６５】
本発明の治療用ポリペプチドが走化活性を阻害し得ることも考えられる。これらの分子を用いて、様々な障害を処置することもできる。このように、本発明の治療用ポリペプチドは、走化性の阻害剤として使用し得る。
【０１６６】
標的組織の近傍で活性化されるプロ治療用タンパク質の使用が特に好まれる。
【０１６７】
使用が考えられるさらなる治療用ポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：成長障害または消耗症症候群を処置するための成長因子（たとえば、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、血小板由来成長因子、上皮増殖因子、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β等）；および外来抗原もしくは外来病原体（たとえばピロリ菌）から被験者を保護する、もしくは受動免疫を与えるため、または関節炎もしくは循環器疾患の処置を提供するための抗体（たとえばヒトまたはヒト化抗体）；サイトカイン、インターフェロン（たとえば、インターフェロン（ＩＮＦ）、ＩＮＦ−α２ｂおよびＩＮＦ−α２ａ、ＩＮＦ−αＮ１、ＩＮＦ−β１ｂ、ＩＮＦ−γ）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、ケモカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ポリペプチドホルモン、抗菌ポリペプチド（たとえば抗菌の、抗真菌の、抗ウイルスの、および／または、抗寄生虫のポリペプチド）、酵素（たとえば、アデノシンデアミナーゼ）、ゴナドトロピン、ケモタクチン、脂質結合タンパク質、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ヘモグロビン、エリスロポイエチン、インシュリノトロピン、イミグルセラーゼ、サルグラモスチム、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アデノシンデアミダーゼ、カタラーゼカルシトニン、エンドセリン、Ｌ−アスパラギナーゼペプシン、ウリカーゼトリプシン、キモトリプシンエラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ内因子、カルシトニン副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）様ホルモン、可溶性ＣＤ４、ならびに抗体および／またはその抗原結合性フラグメント（たとえばＦＡｂ）（たとえば、オルソクローンＯＫＴ−ｅ（抗ＣＤ３）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩａモノクローナル抗体）。
【０１６８】
ワクチン接種
【０１６９】
一実施形態では、本発明は患者にワクチン接種をするための方法を提供する。方法は、所望のエピトープを生成することができる本発明の組成物を投与することを含む。好ましい実施形態では、組成物は、エピトープを含むタンパク質を発現することができる治療用核酸コンストラクトを含む。
【０１７０】
化粧品応用
【０１７１】
一実施形態では、本発明は、化粧品使用のための組成物を提供する。化粧品は、化粧品使用に適した製剤中に、本発明のキトサン−核酸ポリプレックス組成物を含む。
【０１７２】
粉末製剤
【０１７３】
本発明のキトサン−核酸ポリプレックス組成物は散剤を含む。好ましい実施形態では、本発明は乾燥散剤キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。好ましい実施形態では、乾燥散剤キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、本発明のキトサン−核酸ポリプレックス分散液を脱水させることで生成される。凍結乾燥方法には、凍結乾燥および噴霧乾燥が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７４】
一実施形態では、濃縮分散液は脱水され、次いで続いて、必要に応じて再水和した後、ｐＨが調整される。たとえば、一実施形態では、最初に、４．５を超えるｐＨ値を有する濃縮分散液が脱水され、次いで再水和後、ｐＨ値は３．５〜４．５で調整される。別の実施形態では、ｐＨ調整は必要とされず、再水和された組成物は４．５未満のｐＨ値を有する。
【０１７５】
医薬製剤
【０１７６】
本発明も、本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を含む「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」製剤を提供する。この製剤は、治療法を施すために、被験者にインビボで投与され得る。
【０１７７】
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」とは、好ましくは過剰な有害副作用（たとえば、嘔気、腹痛、頭痛等）を引き起こすことなく、被験者に投与されることができる担体、希釈剤、賦形剤をいう。投与のためのこの製剤は、無菌の水溶液剤または非水溶液剤、懸濁液剤、および乳濁液剤を含む。
【０１７８】
医薬製剤は、被験者への投与に適合した、担体、希釈剤、賦形剤、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことができる。かかる製剤は、錠剤（被覆型もしくは非被覆型）、カプセル（ハードタイプもしくはソフトタイプ）、ミクロビーズ、乳剤、粉末、顆粒、結晶、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤に含有され得る。他の添加剤のなかで、補助活性化合物および剤防腐剤も、たとえば抗菌物質、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等で含まれてもよい。
【０１７９】
医薬製剤は、その意図される投与経路に適合するように製剤化され得る。対象組成物は、粘膜上皮組織のトランスフェクションに適切である。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、粘膜上皮組織への投与に適した製剤である。
【０１８０】
経口投与の場合、組成物を賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ、またはカプセル（たとえばゼラチンカプセル）の形状で用いることができる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバンド材を経口製剤に含有させることもできる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分、または類似の自然の化合物のいずれかを含有することができる：結合剤、たとえば結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、たとえばデンプンもしくはラクトース；崩壊剤、たとえばアルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウムもしくはステロート；滑剤、たとえばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、たとえばショ糖もしくはサッカリン；または香味剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくは調味料。
【０１８１】
製剤は、体内から組成物を急速に分解または除去することから保護する担体、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル型送達系を含む徐放製剤も含むことができる。たとえば、モノステアリン酸グリセリンもしくは単体のステアリン酸グリセリル等、またはワックスと組み合わせて時間遅延材料を用いてもよい。
【０１８２】
坐薬および他の直腸投与型製剤（たとえば、浣腸で投与可能なもの）も考えられる。さらに直腸送達に関しては、たとえば以下を参照されたい：Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｃｏｓａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ， ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．， ２１：１９５−２５６， ２００４， Ｗｅａｒｌｅｙ， Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｒｏｕｔｅｓ， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．， ８：３３１−３９４， １９９１。
【０１８３】
投与に適したさらなるな医薬製剤は、当該技術分野で知られており、本発明の方法および組成物に適用できる（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９０） １８ｔｈ ｅｄ ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．； Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ （１９９６） １２ｔｈ ｅｄ ， Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ， Ｎ．Ｊ．，およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ｌｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｐａ．，（１９９３）を参照されたい）。
【０１８４】
投与
【０１８５】
いくつかの投与経路のうちのいずれかが可能であり、特定の経路を選択することは、標的組織に一部依存することになる。上皮組織への投与が好まれる。特に好ましい投与は、消化管、気道、肺、副鼻洞空洞、口腔、尿路、膀胱、膣、子宮、頸部、眼、食道、唾液腺、鼻喉頭組織、腎臓、喉頭／咽頭、および皮膚からなる群から選択される上皮組織への投与のである。
【０１８６】
シリンジ、内視鏡、カニューレ、挿管チューブ、浣腸キット、カテーテル、ネブライザー、吸入器および他の物品が、投与のために使用され得る。
【０１８７】
被験者を処置するための「有効量」の用量は、障害もしくは状態、または症状の進行もしくは悪化を防止するまたは阻害することが満足のいく結果であるが、好ましくは、状態の症状のうちの１つ、いくつかもしくはすべてを、測定可能な程度または検出可能な程度まで、回復させるのに十分な量である。このように、標的組織において治療用核酸を発現させることによって処置可能な状態または障害の場合、本発明の方法によて処置可能な状態を回復させるために生成される治療用タンパク質の量は、状態および所望の結果に依存し、当業者によって容易に確認され得る適切な量は、治療される上体、所望の治療効果、ならびに個々の被験者（たとえば、被験者内のビオアベイラビリティ、性別、年齢等）に依存することになる。有効量は、関連する生理的効果を測定することによって確認されることができる。
【０１８８】
獣医臨床への応用は、本発明によっても考えられる。したがって、一実施形態では、本発明は非ヒト哺乳類を処置する方法を提供する。方法は、処置を必要とする非ヒト哺乳類に本発明の組成物を投与することを含む。
【０１８９】
経口投与
【０１９０】
本発明の化合物は、経口投与されてもよい。経口投与は嚥下を含むこともあり、そのため化合物は消化管に入る。本発明の組成物は、直接消化管に投与されることもある。
【０１９１】
経口投与に適した製剤としては、錠剤などの固形剤、微粒子剤を含有するカプセル剤、液剤、または散剤、トローチ剤（液剤を充填したものを含む）、咀嚼剤、多微粒子剤およびナノ微粒子剤、ゲル剤、フィルム剤、オビュール剤、および噴霧剤が挙げられる。
【０１９２】
液剤は、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。液剤は、固形剤の再構成によって調製され得る。
【０１９３】
錠剤は、通常、崩壊剤を含む。崩壊剤の例としては、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、線維素グリコール酸カルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、結晶セルロース、低アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプンおよびアルギン酸ナトリウムを含む。通常、崩壊剤は、剤形の１重量％〜２５重量％、好ましくは５重量％〜２０重量％で含まれる。
【０１９４】
結合剤は、凝集性品質を錠剤に与えるのに通常用いられる。適切な結合剤としては、結晶セルロース、ゼラチン、糖類、ポリエチレングリコール、天然および合成のゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。錠剤は、希釈剤、たとえばラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物等）、マンニトール、キシリトール、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、結晶セルロース、デンプンおよびリン酸水素カルシウム二水和物を含み得る。
【０１９５】
錠剤は、また、界面活性剤（たとえば、硫酸ラウリルナトリウムおよびポリソルベート８０）と、滑剤（たとえば、二酸化ケイ素およびタルク）とを任意に含み得る。存在する場合、界面活性剤は、錠剤の０．２重量％〜５重量％、および滑剤は、錠剤の０．２重量％〜１重量％を含み得る。
【０１９６】
錠剤は通常、潤滑剤、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、フマル酸ステアリルナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物も含む。潤滑剤は通常、錠剤の０．２５重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜３重量％を含む。
【０１９７】
他の可能な成分としては、抗酸化剤、着色剤、香味料および調味料、防腐剤、唾液刺激剤、冷却剤、共溶媒（油を含む）、皮膚軟化剤、増量剤、消泡剤、表面活性物質および矯味剤が挙げられる。
【０１９８】
錠剤混合物を、直接、またはローラーで圧縮して、錠剤を形成し得る。あるいは錠剤混合物または混合物の部分は、錠剤化の前に、湿式顆粒化、乾式顆粒化、もしくは溶融顆粒化、溶融凝固、または押出しを行われ得る。最終的な製剤は１層または複数層を含こともあり、かつコーティングまたは非コーティングされることもある。最終的な製剤は、カプセル化されることさえあり得る。
【０１９９】
錠剤の剤形は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｖｏｌ． １， ｂｙ Ｈ． Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ． Ｌａｃｈｍａｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０）に記載されている。
【０２００】
ヒトまたは動物での使用のための消滅する経口フィルム剤は、通常は、成形しやすい水溶性もしくは水膨張性の薄膜剤形であり、急速に溶けるか、または粘膜付着性であり得、かつ通常は、フィルム形成ポリマー、結合剤、溶媒、湿潤剤、可塑剤、安定剤または乳化剤、粘度調節剤および溶媒を含む。製剤の一部の構成要素は、複数の機能を実行し得る。
【０２０１】
本発明では、本発明の組成物を含む多微粒子ビーズも含まれる。
【０２０２】
本発明によるフィルム剤は、通常、剥離可能な裏打ち支持体または紙上に被覆された薄い水性フィルム剤の蒸発乾燥によって調製される。これは、乾燥オーブンもしくはトンネル、通常は複合型コータードライヤー、または凍結乾燥もしくは真空化によって行われ得る
【０２０３】
経口投与のための固形剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型の製剤が含まれる。
【０２０４】
高エネルギー分散ならびに浸透粒子および被覆粒子等の他の適切な放出技術が知られている。
【０２０５】
非経口投与
【０２０６】
非経口投与のための適切な方法としては、静脈、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、皮下への投与挙げられる。非経口投与の適切な装置は、針（マイクロニードルを含む）注射器、針のない注射器、および注入技法を含む。
【０２０７】
非経口製剤は通常、塩類、炭化水素および緩衝剤等の賦形剤を含み得る水溶液剤である。しかし、一部の適用では、非経口製剤は、無菌の非水溶液剤として、または発熱物質を含まない無菌の水等の適切な溶媒と組み合わせて使用される乾燥形状として、より適切に製剤化され得る。
【０２０８】
無菌条件下での、たとえば、濾過除菌法による非経口製剤の調製は、当業者にとって周知の標準的な製薬技法を用いて、容易に達成され得る。
【０２０９】
点滴製剤の調製で用いられる化合物の溶解性は、適当な製剤技法、たとえば溶解性増強剤を組み入れることで増大させてもよい。
【０２１０】
非経口投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。このように、本発明の化合物は、活性化合物の調節放出を提供する埋め込み型デポーとして投与のための固形剤、半固形剤、またはチキソトロピー液剤として製剤化され得る。
【０２１１】
局所投与
【０２１２】
本発明の化合物は、皮膚または粘膜に局所的に、すなわち真皮的に、または経皮的に投与されてもよい。この目的のための典型的製剤は、ゲル剤、ヒドロゲル剤、ローション剤、溶液、クリーム剤、軟膏、散布剤、包帯剤、フォーム剤、フィルム剤、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、繊維、包帯およびマイクロエマルジョン剤を含む。
【０２１３】
局所投与の他の方法は、電気穿孔法、イオントフォレーシス、フォノフォレシス、ソノフォレーシスおよびマイクロニードルまたは無針注射（たとえば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）等）による送達を含む。
【０２１４】
局所投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。
【０２１５】
吸入投与／鼻腔内投与
【０２１６】
また、本発明の化合物は、通常、乾燥散剤（単体、または混合剤（たとえば、ラクトースとの乾性混合で、または混合成分粒子として）のいずれか）の形状で、適切な噴霧剤を使用した、または使用しない、乾燥散剤吸入器から、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザ、もしくはネブライザーからのエアゾールスプレーとして、鼻腔内にまたは吸入によって投与され得る。
【０２１７】
吸入器または散布器に使用するカプセル、ブリスターおよびカートリッジは、本発明の化合物の混合粉末、適切な散剤基剤（たとえばラクトースまたはデンプン）、および性能修飾因子（たとえばｌ−ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウム）を含有するように製剤化され得る。
【０２１８】
吸入投与／鼻腔内投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。
【０２１９】
直腸投与／膣内投与
【０２２０】
本発明の化合物は直腸に、または、膣内に、たとえば坐薬、ペッサリー、または浣腸の形で投与され得る。カカオバターは従来からの座薬基剤であるが、必要に応じて種々の代替物が使われ得る。
【０２２１】
直投与／膣内投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。
【０２２２】
眼内投与／耳内投与
【０２２３】
本発明の化合物は、通常は、滴下剤の形で、直接、眼または耳にも投与され得る。眼内および耳内の投与に適した他の製剤としては、軟膏、生分解性の（たとえば、吸収されるゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性の（たとえばシリコーン）インプラント系、ウエハー系、レンズ系、および微粒子系が挙げられる。製剤は、イオントフォレーシスによって届けられる可能性もある。
【０２２４】
眼内投与／耳内投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、または計画放出型が含まれる。
【０２２５】
実験
【表２】
【０２２６】
ポリプレックス組成物のインライン混合および濃縮のための材料および方法についてのさらなる記載は、国際公開第２００９／０３９６５７号を参照されたい。公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２２７】
ポリプレックス製剤の命名規則
【表３】
【０２２８】
１Ｌバッチの製造、それに続くＴＦＦ濃縮の一般的なプロセスブロック図を図２に示す。
【０２２９】
小規模のインライン混合
【０２３０】
簡単な小規模のインライン混合装置を、シリンジポンプ、内径１／１６インチのシリコーンチューブ；および内径３／３２インチのＹ字構造体のポリプロピレンジャンクションを用いてテストした。３ｍＬ容量のシリンジおよびＹ字ジャンクションを用いる配置の模式図を図３に示す。この配置の場合、シリンジの最大容量が６０ｍＬであることに留意されたい。このプロセスを使用して、２４ｍｅｒ／９８％ＤＤＡキトサンを用いて、ＮＰ比２０で１５０μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度のポリプレックスを作製した。ＤＮＡおよびキトサンの原料を、体積比２：１で混合して、均一なポリプレックス製剤を生成した。
【０２３１】
中規模のインライン混合
【０２３２】
簡単な中規模のインライン混合装置を、蠕動ポンプ、内径３／１６インチのシリコーンチューブ；および内径３／１６インチのＹ字構造体のポリプロピレンジャンクションを用いてテストした。Ｙ字ジャンクションを用いる配置の模式図を図４に示す。この配置の場合、最大生成量は原料容器の容量によってのみ限定されることに留意されたい。このプロセスを使用して、２４ｍｅｒ／９８％ＤＤＡキトサンを用いて、ＮＰ比２０で、１５０μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度のポリプレックスを作製した。ＤＮＡおよびキトサンの原料を、体積比２：１で混合して、均一なポリプレックス製剤を生成した。
【０２３３】
ＴＦＦプロセス（濃縮）
【０２３４】
ＴＦＦ試験を行う前に、製造業者の説明書に従ってホローファイバーフィルターを洗浄して、清浄した。
【０２３５】
ＴＦＦ濃縮＃１
【０２３６】
濃縮を実行するために、ＴＦＦ系を概略図（図５）に示すように設定して、残留水を取り除いた。透過バルブを閉め、次いで背圧バルブを完全に開けた後、ＤＮＡ−キトサンポリプレックスを生成物リザーバへ加えた。ポンプの電源をオンにして濃縮を開始し、完全に透過バルブを開け、その後、目標のフィルタ入口側圧力へと背圧バルブを調節した。濃縮工程中、回収された透過液の質量を秤で測定し、そして目標ＤＮＡ濃度が達成された時点を決定するために使用した。ポンプの電源を入れて、濃縮を開始し、透過バルブを全開し（次いで任意のポンプを作動させ）てから、背圧バルブを対象フィルタの入口圧力に調節した。濃縮プロセスの間に、収集した透過液の量を秤の上でモニターして、それを用いて、目標のＤＮＡ濃度が達成された時点を決定した。目標の体積減少が達成された後、透過バルブを閉じて、背圧バルブを完全に開いて、この濃縮プロセスを停止した。下記の式を参照されたい：
【数１】
【０２３７】
ＴＦＦダイアフィルトレーション
【０２３８】
一部のバッチでは、ダイアフィルトレーションステップ（緩衝交換）を、濃縮プロセスに挿入した。たとえば、０．１５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから開始し、ポリプレックスを０．６０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで０．６０ｍｇ／ｍＬ濃度を維持しながら、ある程度の洗浄量をダイアフィルタで濾過し、次いでさらに１．２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０２３９】
ダイアフィルトレーションを実行するために、透過液出口ラインを、新しいタールを塗った収集溶液に変え、次いでバッファラインをベントポートを経て保持液容器に接続させた。これにより、大気の通気がない、密封された系を作製する。次に、透過バルブを開き、および／または透過ポンプを始動させた（上記と同じ流速）。これにより、透過液が引き出されにつれて、入れ替わりに透析バッファが保持液容器に引き入れて、保持液容器内が真空状態になる。このように、透過液が放出されるにつれて、保持液は連続的に補充されることによって一定のレベルに維持される。これは、透析プロセスである。場合によっては（系内の大気の漏れが原因で真空が不十分になったとき）、透析バッファを透過液と同じ速度で、保持液にポンプで注入した。ダイアフィルトレーションを、洗浄量（１洗浄量＝保持液の量）の目標数に対して実行した。透析を停止するために、透過液を閉じ（バルブを閉じて透過ポンプを停止させる）、次いで保持液容器を大気に開放し、バッファラインを閉じた。
【０２４０】
第２のＴＦＦ濃縮
【０２４１】
ダイアフィルトレーションの後、ＴＦＦ濃縮を再開した。目標の減少量が達成された後、透過バルブを閉じ、次いで背圧バルブを完全に開いて、濃縮プロセスを停止させた。保持液の流体ラインを一掃してから、最終生成物を収集し、このＴＦＦ後の生成物を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによる分析試験およびＤＮＡ濃度決定にかけた。残りを、直ちに−８０℃で貯蔵し、あるいは分析試験が完了するまで４℃で貯蔵し、その後速やかに使用するか、あるは貯蔵のために凍結させた。
【０２４２】
ＴＦＦ後のｐＨ調整
【０２４３】
別段の記載がなければ、最終ＴＦＦ後の生成物のｐＨは、ｐＨ調整バッファを加えることによって速やかにｐＨ値を調整した。バッファ組成物は、通常、ショ糖の溶液中に、酢酸および／またはキトサンを含んだ。この溶液を、４．５：９５．５の体積比でそれぞれ最終ＴＦＦ生成物に加えた。この追加の量は、ＴＦＦ後の生成物の濃度を４．５％低下させた。
【０２４４】
分析試験
【０２４５】
粒子サイズ測定
【０２４６】
粒子サイズ測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒのナノ光散乱機器を使用して行われる。記載した場合を除いて、試料は１０ｍＭのＮａＣｌ（最低０．４ｍＬ）で２０倍に希釈して、ディスポーザブルキュベットに充填した。３連での３分間の測定に先立ち、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムして、試料を２５℃で３分間インキュベートした。Ｚ−平均および多分散（ＰＤＩ）を標準偏差（ｎ＝３）を用いて報告した。希釈した試料に対しては、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムして、１０ｍＭのＮａＣｌの粘性および屈折率を用いた。
【０２４７】
ゼータ電位
【０２４８】
ゼータ電位測定を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒナノ光散乱機器を用いて行った。通常、無希釈の試料は、折り返しキャピラリーセルＺｅｔａｓｉｚｅｒ（最低０．８ｍＬ）に充填した。複製測定（複製の回数はＺｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアによって自動的に決定された）に先立ち、試料を２５℃で３分間インキュベートｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムして、試料を２５℃で３分間インキュベートした。ゼータ電位値は、標準偏差（ｎ＝３）を用いて報告した。また、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒは、粘性および誘電率に関して試料の最終組成物を説明するようにプログラムされた。
【０２４９】
凍結による短期間の安定性
【０２５０】
短期安定性試験のため、ポリプレックスの最終生成物を、適当な温度（−２０℃、−３０℃または−８０℃）で一晩冷凍、貯蔵された。場合によっては、試料はドライアイス／エタノール浴槽で急速に冷凍させ、次いで適当な温度で貯蔵された。記載するように、適当な時間で試料を室温まで解凍して、分析した。
【０２５１】
キトサナーゼ消化
【０２５２】
５０μＬのポリプレックスを、５０μＬの４．４４Ｕ／ｍＬキトサナーゼを用いて３７℃で２時間消化させた。（ストックのキトサナーゼの濃度は、６２Ｕ／ｍＬであり、３７℃で、冷たい５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５で希釈した。）Ｃ（２４，９８）−Ｎ４０−ｃ７５粒子の場合、０．９０９〜１．８１８ｍＭのキトサンを消化させて、すべてのＤＮＡを放出させることが最善であり、そのため粒子を１５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５中、３７℃で１：１０および１：５に希釈した。
【０２５３】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによるＤＮＡの定量化
【０２５４】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いてのＤＮＡ測定に先立ち、キトサナーゼによってポリプレックスから全ＤＮＡを放出しなければならない。放出に続いて、スーパーコイルＤＮＡプラスミドを線形化するために、ＤＮＡを適切な制限酵素によるＤＮＡ消化にかける。
【０２５５】
ＥｃｏＲ１消化
【０２５６】
インキュベーション後、キトサナーゼで消化した試料のうちのＸｕＬを５ｕＬのＥｃｏＲ１と、５ｕＬのＥｃｏＲ１バッファにに加え、次いでＭｉＩＩｉＱ水で最終５０ｕＬ最終的な量にした。（最終的なＤＮＡ濃度が４ｎｇ／μＬになるように、試料の量、ＸμＬを調節した。）次いで、ＥｃｏＲ１試料を３７℃で３０分間、インキュベートした。
【０２５７】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ
【０２５８】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ Ｑｉａｎｔ−ｉＴ ｄｓ ＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙキットに、２つのバッファ（ＡおよびＢ）ならびに２つの標準（１および２）を供給した。バッファＡを１：２０でバッファＢに希釈して、溶液「Ａ／Ｂ」を作製した。標準１および２を溶液Ａ／Ｂで２０倍に希釈した（１０μＬを２００μＬに）。標準１および２の最終濃度は、それぞれ０および１０ｎｇ／μＬであった。
【０２５９】
１０〜２０μＬのＥｃｏＲ１消化試料を溶液Ａ／Ｂを用いて２００μＬの最終的な量にして、短時間ボルテックスを行い、室温で２分間インキュベートし、次いでＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ上で、製造者の説明書によって測定した。
【０２６０】
ゲル電気泳動
【０２６１】
ポリプレックスへのＤＮＡ捕獲の確認のために、試料をゲル電気泳動にかけた。
１〜５μＬ（８００ｎｇ ＤＮＡの目標）の試料アリコートと、２μＬのＴｒａｃｋｉｔ添加バッファとを組み合わせて、水を加えて最終１０μＬの量にした。標準レーンをＳｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ＤＮＡラダーにロードした。臭化エチジウム（５０μｇ／ｍＬ）を含有する０．８％アガロースゲル上で、１２０Ｖで４５分間、試料を分解させた。
Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いてゲルを撮像した。
【０２６２】
ＳＥＡＰアッセイ
【０２６３】
ＳＥＡＰ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙキットを用いてＳＥＡＰアッセイを行った。使用に先立ち、アッセイ用のすべての試薬を２５℃で３０分間、平衡化した。アッセイ用の標準は、０．１％ウシ血清アルブミンおよび５０％のグリセロールを添加したキットからの１×希釈バッファに胎盤性アルカリフォスファターゼを１ｍｇ／ｍＬまで溶解させ、次いでＤＭＥＭを用いて１０倍段階希釈によっ０．０１ｐｇ／μＬまで希釈することによって、調製した。次いで、標準および解凍した試料を、希釈バッファで１：４に希釈し、６５℃で３０分間、熱失活させて、氷上で２分間インキュベートしてから、遠心（１６１００×ｒｃｆ、室温で２分間）させて、その上清を新しい管に移した。２５℃で５分間，平衡化してから、５０μＬの試料および標準を、２連のＭｉｃｒｏｌｉｔｅ−１プレートの各ウェルに加えた。次いで、失活バッファ（５０μＬ）を各ウェルに加えてから、静かに上下にピペッティングすることにより、気泡を作らぬように混合させて、５分間インキュベートした。基質とエンハンサーを１：１９の比で５分間インキュベートして、基質／エンハンサー試薬を調製した。次いで、この基質／エンハンサーを各ウェルに加えて、２０分間インキュベートして、プレートをルミノメータで１秒間の積分時間で読み込んだ。
【０２６４】
ニンヒドリンアッセイ（全キトサン）
【０２６５】
ポリプレックス中の全キトサン濃度を、ニンヒドリンアッセイを使用して決定した。簡単に言えば、ポリプレックスを、１〜２ｍＭグルコサミンを含有するよう、酢酸ソーダで希釈し、１５０ｍＭ、ｐＨ５．５の最終濃度にした。同じ鎖長のキトサンから調製される標準曲線は、７０ｍＭの酢酸ソーダ、ｐＨ５．５を用いて０．５〜７．５ｍＭのグルコサミン濃度に希釈する。次いで、希釈したポリプレックスおよび標準を、５０ｍＭ酢酸ソーダ、ｐＨ５．５、中の等量の５μ／ｍＬキトサナーゼ（ｐＨ ５）を用いて３７℃で２時間消化さでる。２時間のインキュベーションの後、次いで消化した１００μＬのポリプレックスおよび標準を、４００μＬの７０ｍＭ酢酸ソーダが入っているガラス管に加える。次いで、ニンヒドリン試薬（２５０μＬ）を、各試料に加えて、ガラス管を短時間ボルテックスして１０分間沸騰させる。室温で１５分間冷却した後、エタノールを２５ｍＬ加えて、５５０ｎｍで吸光度値を測定する。ポリプレックス中のキトサン濃度を、線形標準曲線の勾配とｙ切片から算出して、最初の希釈係数で調節する。
【０２６６】
実施例１：ダイフィルトレーションの第１の小規模試験
【０２６７】
ダイアフィルトレーション試験のバッチパラメータを表２に記載する。出発原料としてｃ１５０−ｐＨ４．０製剤を用いた。充填および終了の前に最終ステップとして、ｐＨ／アセテート調節ステップを追加した。
【０２６８】
表２．パラメータおよび結果
【表４】
【０２６９】
実施例２：ダイアフィルトレーションの第２の小規模試験
【０２７０】
ダイアフィルトレーションの２回目の試験（表３）では、バッチの大きさが３倍大きく、出発原料としてｃ1５０−ｐＨ４．０製剤を使用した。充填および終了の前に最終ステップとして、ｐＨ／アセテート調節ステップを追加した。
【０２７１】
表３．パラメータおよび結果
【表５】
【０２７２】
実施例３：小規模のバッチ
【０２７３】
ダイアフィルトレーションの第３試験（表４．）を実施した。このバッチも、出発原料としてｃ１５０−ｐＨ４．０製剤を用いた。
【０２７４】
表４．パラメータおよび結果
【表６】
【０２７５】
実施例４：中規模バッチ
【０２７６】
表５．パラメータおよび結果
【表７】
【０２７７】
ＴＦＦ濃縮ステップ間のｐＨ推移
【０２７８】
ＴＦＦ濃縮プロセスを使用したいくつかのバッチでは、ｐＨが通常、０．２から０．５単位上昇することに注目した。これは、ＴＦＦが進行するにつれて、製剤中の全アセテート対全キトサンの相対濃度の変化による、すなわち、ｐＨが［キトサン］：［アセテート］の関数である。これをモデル化した。ＤＮＡが０．６０ｍｇ／ｍＬから２．０ｍｇ／ｍＬに増加したので、ダイアフィルトレーションのステップの後、ｐＨを念入りにモニターした。このモデルに関して、以下の仮定がなされた：
【０２７９】
透析の後、［アセテート］が１０ｍＭで一定であると仮定する
【０２８０】
濃縮ステップのスタート時、任意の［キトサン］を１ｍＭと仮定する
【０２８１】
［キトサン］が減少量とともに比例して増大すると仮定する
【０２８２】
製剤のｐＨがヘンダーソン・ハッセルバッハ緩衝作用の理論を基づくと仮定する
【０２８３】
このｐＨ推移をモデル化するため、ｐＨ対Ｌｏｇ（［キトサン］／［アセテート］をプトットして、得られた曲線を決定した：
【０２８４】
ｐＨ＝０．６６６４×Ｌｏｇ（[キトサン]／[アセテート]）＋４．７２０８
【０２８５】
図６．ＴＦＦ濃縮の間のｐＨ推移のモデル化。各点は、ポリプレックスの相対的量−倍減少（＝ＤＮＡ濃度の増大）を示す。たとえば、２×の標識の付いた点は、およそｃ１２００である。
【０２８６】
ｃ１２００製剤にアセテートを添加して８０ｍＭにした後、このモデルを用いて、ｃ１２００のｐＨを予想することができる。ｃ１２００中のキトサンは２×（すなわち、２×１ｍＭ＝２ｍＭ）であると推定する。
全アセテートが８０ｍＭであると推定すると、ｐＨ＝０．６６６４×Ｌｏｇ（２／８０）＋４．７２０８＝３．６５。この結果は、実験による結果の３．７に極めて近い。
【０２８７】
８０ｍＭの最終的な所望のキトサン濃度で４．０のｐＨ値を達成するために、キトサン濃度はこのバッチの出発量よりも６．６倍多いはずであることもこのモデルは示している。したがって、キトサンを含まないバッファでダイアフィルトレーションを実行する場合、これは遊離キトサンのほぼ全てを取り除くことになり、その上ｐＨ（４．０）およびアセテート（８０ｍＭ）の同時目標を達成することができない。したがって、ダイアフィルトレーションは、キトサンを含むバッファで行われることが好ましい。
【０２８８】
ＴＦＦ後の安定性
【０２８９】
重要なプロセスパラメータは、第２のＴＦＦ濃縮ステップの完了後である。他の前のステップと異なり、ポリプレックスはｃ１１００への濃縮後は安定でなく、かつＴＦＦ停止から１時間以内に低いｐＨ値に調節しなけれなばらない。一旦ｐＨを調節すると、粒子は室温で安定になる。
【０２９０】
図７．第２のＴＦＦ濃縮ステップ後のポリプレックスの安定性。無希釈のＴＦＦ後の試料を、２５℃でインキュベートし、２時間ごとに、粒子径をモニターした。
【０２９１】
実施例５：キトサン含有バッファを用いるダイアフィルトレーションのための中規模試験
【０２９２】
表６．パラメータ
【表８】
【０２９３】
表７．分析結果
【表９】
【０２９４】
図８．インプロセスｐＨデータ。Ｘ軸の上のＴＦＦ画分コードは、以下の通りである：Ｃ１：ＴＦＦ濃縮ステップ＃１；Ｄ：（洗浄量（ＷＶ）の＃で示したＴＦＦダイアフィルトレーション；Ｃ２：ＴＦＦ濃縮ステップ＃２。
【０２９５】
実施例６：ｐＨ４透析バッファによる小規模バッチ
【０２９６】
ＴＦＦの間、生成物のｐＨをより良く制御するために、ダイアフィルトレーションバッファを低いｐＨに修正した。以下の表に実験および結果の概略を述べる。
【０２９７】
表８．パラメータ
【表１０】
【０２９８】
表９．分析結果
【表１１】
【０２９９】
実施例７：ｐＨ４透析バッファによる中規模バッチ
【０３００】
中規模バッチを３タイプ生成した。以下の表に、実験および結果の概略を述べる。
【０３０１】
表１０．パラメータ
【表１２】
【０３０２】
表１１．分析結果
【表１３】
結果は、３タイプのバッチの平均である。
【０３０３】
４．０の最終ｐＨ値を有するｃ１０００ポリプレックスを製造するために、ＤＮＡとキトサンのインライン混合、ＴＦＦ濃縮、ＴＦＦダイアフィルトレーションおよびｐＨ調節を行った。最終製剤も、７０〜８０ｍＭアセテートの緩衝能を有し、かつ生理的に等張であった。加えて、ナノ粒子分散は、−８０℃凍結の間、室温解凍、解凍後少なくとも８時間の間安定であった。
【０３０４】
実施例８：−８０℃での長期安定性
【０３０５】
−８０℃での１年の貯蔵後、中規模製造からの最終生成物は光学的に半透明であり、かつ可視微粒子が含まれていなかった（データ図示せず）。
【０３０６】
中規模バッチに由来するキトサン−ＤＮＡナノ粒子は、−８０℃で最高１年の間物理的に安定であった。粒子径、多分散および由来する計数率の変化は、ごくわずであった（表１２）。小規模のバッチも、４ヵ月までの短期間試験の間は安定であった。
【０３０７】
表１２．−８０℃での安定性：粒径、ＰＤＩ、およびＤＣＲ
【表１４】
【０３０８】
中規模バッチに由来するキトサン−ＤＮＡナノ粒子は、−８０℃で１年の間は、電気的に安定であった。導電率およびｐＨの変化は、ごくわずかであり分析誤差内であった（表１３）。
ゼータ電位は１年間にわたり１５〜３０％増加したように思われるが、１０％の変動はこのアッセイの場合正常と思われる（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ ＭＲＫ１０３１−０１）。それにもかかわらず、１年後の電気特性は、依然として製品リリース仕様の範囲内であった。小規模のバッチは、４ヵ月のた短期間試験の間は安定であった。
【０３０９】
表１３．−８０℃での安定性： 導電率およびｐＨ
【表１５】
【０３１０】
ＤＮＡプラスミドの被包が維持されたことは、アガロースゲル電気泳動法によって示された。−８０℃での１年間の貯蔵後のポリプレックスの２つの中規模バッチを、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。ＤＮＡはポリプレックス中で被包された状態のままであり、かつ試料ウエル中に保持されており、カソードの方へ移動してなかった（図１２）。
【０３１１】
実施例９：ブタの十二指腸への製剤送達
【０３１２】
製剤は、終夜絶食させたブタの十二指腸に内視鏡を介して送達された。簡単に言えば、内視鏡の先端が十二指腸への幽門括約筋を過ぎて入口に到達するまで、大腸内視鏡は麻酔下のブタの口に挿入した。０．３ｍｇ／ｋｇのＢｕｓｃｏｐａｎ（ぜん動を低下させるために）のＩＶ投与の後、内視鏡を総胆管を越えてさらに２０ｃｍ挿入した。この時点で、特注の二重バルーンカテーテルを内視鏡の送達チャネルを介して十二指腸内に進め、次いで、遠位および近位のバルーンを１５〜２０ｍＬの生理食塩水で膨らませつつ、近位バルーンが総胆管の少なくとも５ｃｍ遠位にあることを確実にした。次いで、両バルーン間の中間組織にカテーテル内の送達ポートを介して後から送達した流体を満たして、排出させることによって十二指腸を洗浄した。流体洗浄の順は、４５ｍＬの生理食塩水での洗浄を３回、続いて生理食塩水中０．５％のＭｕｃｏｍｙｓｔでの洗浄を１回、続いて７．５％ショ糖中の２５ｍＭ酢酸ソーダバッファ、ｐＨ５．５、での洗浄を１回であった。中間の十二指腸部が完全に空になったことを確実にしてから、製剤（高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物）をカテーテル送達ポートを介して十二指腸部に送達して、６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、遠位および近位のバルーンを収縮させ、次いで内視鏡とカテーテルを取り除いた。
【０３１３】
ブタ血漿収集
【０３１４】
ブタ血漿を、以下の手順で収集した。鎮静状態にある動物の耳静脈、伏在静脈または頚静脈から約５ｍＬの血液を、５０μＬのアプロチニン（４．７単位／ｍｇタンパク質、６．６単位／ｍＬ）を前もって添加したバキュテナーに採取して、直ちに氷上に配置し、試験のために研究室に送った。この血液試料を１０００×ｇで１０分間回転させて、その上清を収集することで血漿を収集した。分析準備が整うまで、収集した血漿を−８０℃で保存した。
【０３１５】
結果
【０３１６】
ブタ血漿ＳＥＡＰは、ｇＷＩＺ−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡを含有するｃ１５０キトサン−核酸粒子の投与に応答させて検出した。ｐＨ４の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．０であった。ｐＨ４．８の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．８であった。
【０３１７】
血漿中での高レベルのＳＥＡＰによって証明されたように、４．０のｐＨ値の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、インビボでｐＨ４．８組成物よりも実質的に高いトランスフェクション効率を示した。（図１）。
【０３１８】
実施例１０：マウス膀胱のインビボトランスフェクション
【０３１９】
ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＦＩａ−ＳＥＡＰまたは対照ビヒクルを担持するキトサン−ＤＮＡポリプレックスＣ（２４，９８）−ｃ１０００−ｐＨ４を投与した。２日後に、マウスを屠殺して、組織を収集した。ナイーブマウス（非形質移入）を超える、処置されたマウスの膀胱組織内のＳＥＡＰ ｍＲＮＡでの相対的な増加を図９に示す。
【０３２０】
方法
【０３２１】
開腹術による外科的切開をＣ５７ＢＬ／６雌マウスの腹部において行い、膀胱を露出させて、分離した。ＥＦ１ａ−ＳＥＡＰまたは対照ビヒクルを担持する、ｐＨ４のｃ１０００Ｃ（２４，９８）キトサンポリプレックスを１００μＬ送達した後に、尿を取り出した。送達から２日後に、ＲＮＡ抽出続いてＳＥＡＰ ｍＲＮＡ発現分析のためのＲＴ−ｑＰＣＲのために、膀胱組織を採取した。
【０３２２】
結果
【０３２３】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、インビボで膀胱の細胞に効率的にトランスフェクトすることができた。
【０３２４】
実施例１１：慢性ＩＢＤモデルにおける繰り返し投与の有効性
【０３２５】
自然に慢性大腸炎を発症したＩＬ−１０欠損マウスを用いて、繰り返し投与試験を開始した。これらのマウスについて、大腸炎の発症の症状を毎週モニターした。大腸炎の発症を確認した（たとえば、軟便および血便）後、これらのマウスにＥＧ−１０またはＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子の３投与を浣腸を介して投与した。ナノ粒子の各投与を７日間隔で投与した。実験期間中これらのマウスの体重を毎週モニターして、毎週の処置の後に、ＥＧ−１０処置群と関連して体重増加において有意な改善が観察された（図１０）最後の処置から５日後に、両群からのマウスを屠殺して、それらの結腸を摘出して、炎症性サイトカインのレベルを測定した。ＳＥＡＰ処置したマウスと比較すると、ＥＧ−１０処置したマウスは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−α ｍＲＮＡのレベルの減少が生じた（図１１）。これらのデータを組み合わせると、複数回の投与の可能性を明瞭に示し、慢性マウスＩＢＤモデルにおいてＥＧ−１０の治療効果が改善した。
【０３２６】
図１０：慢性ＩＢＤマウスの体重へのＥＧ−１０（ｈｌＬ−１０）の効果。自然に発症した大腸炎（およそ３０週齢で）を有するＩＬ−１０欠損マウスに、ＥＧ−１０またはＳＥＡＰナノ粒子（対照）を浣腸によって、７日間隔で３回投与することで処置した。各マウスの体重を毎週測定して、初回処置前のそれ自体の体重と比較した（％重量変化で表した）。両方のナノ粒子の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ１０ｃ１０００−Ａｃ７０−Ｓｕｃ９−ｐｈ４．０であった。ＥＧ−１０ナノ粒子は、伸長因子１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、ヒトインターロイキン−１０遺伝子（ｈｌＬ−１０）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。ＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子は、伸長因１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。
【０３２７】
図１１：ＥＧ−１０（ｈｌＬ−１０）ナノ粒子の３種類の炎症性サイトカインへの効果。自然に発症した大腸炎（およそ３０週齢で）を有するＩＬ−１０欠損マウスに、ＥＧ−１０またはＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子を浣腸によって、７日間隔で３回投与することで処置した。最後の処置から５日後に、炎症性サイトカインレベルを、屠殺したマウスの結腸内のＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで測定した。両方のナノ粒子の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ１−ｃ１０００−Ａｃ７０−Ｓｕｃ９−ｐｈ４．０であった。ＥＧ−１０ナノ粒子は、伸長因子１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、ヒトインターロイキン−１０遺伝子（ｈｌＬ−１０）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。ＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子は、伸長因１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。
【０３２８】
実施例１２：ＣＯＰＤまたは喘息を処置するためのインビボマウストランスフェクション：肺へのポリプレックスの送達
【０３２９】
マウスＣＯＰＤを確立するために、マウスをたばこの煙に４〜５日間曝して亜急性曝露を、または６ヵ月間曝して慢性曝露を確立する。曝露は以前に記載されているように鼻のみの曝露システムを通してまたは煙チャンバーを介してのいずれかで行う。（たとえば、Ｆｏｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ａ ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ａｇａｉｎｓｔ ＰＤＥ４ ａｎｄ ＰＤＥ７ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｍｏｋｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ ２００９ Ｍａｙ ２０；１０：３９； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９ Ｊａｎ １；１８２（１）６８４−９１；Ｂｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００６ Ｍａｙ，２９０（５）；Ｌ１０３６−４３． Ｅｐｕｂ ２００５ Ｄｅｃ ９； Ｂｒｕｓｓｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＣＯＰＤ． Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６，１９（３）；１５５−６５ Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｕｇ ３；および Ｄ’ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００５， Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２００５ Ａｕｇ；２６（２）：２０４−１）。
マウスＣＯＰＤも、以前に記載されているように、ブタ脾臓エラスターゼに気道を４〜５週間曝すことによって確立し得る（たとえば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９， Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ｉｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ ｍｉｃｅ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２００９ Ｎｏｖ ２３；１０：１１５．；およびＰａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８， Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ ＩＣＡＭ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ／ｅｍｐｈｙｓｅｍａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ２００８ Ｎｏｖ；７６（１１）： ４９５９−６７． Ｅｐｕｂ ２００８ Ｓｅｐ １５，を参照されたい）。
【０３３０】
マウス喘息モデルを確立するために、マウスに水酸化アルミニウムを混合したトリ卵白アルブミンを腹腔内注射する。最初の注射から数日後、前述のようにマウスに卵白アルブミンを鼻腔内投与する（Ｂｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６， 上記を参照；およびＢｏｕｌａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｅ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−１ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｌｕｎｇ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｓｔｈｍａ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． ２８， ｐｐ．３２２−３２９）。
【０３３１】
ＣＯＰＤまたは喘息モデルを処置するために、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸を含む高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物を用いる。抗炎症性タンパク質は当該技術分野で周知である。代表的な抗炎症性タンパク質は、表１４の参考文献に記載する。すべての参考文献は、その全てが参照により本明細書に明示的に組み込まれる。高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物を肺に、鼻腔内にまたは麻酔下で気管内に投与する（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９， ｉｎｆｒａ；およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８，後述、を参照されたい）。
々の時点で、マウスを屠殺し、それらの肺組織を収集して、導入遺伝子ｍＲＮＡ発現および種々のサイトカインの発現のために処理する（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ｉｎｆｒａ；およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８，後述、を参照されたい）。ＤＮＡ単体を対照として単体で注射する。高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物の鼻腔内／気管内送達は、インビボで肺細胞での抗炎症性遺伝子ｍＲＮＡの発現の有意な増大をもたらし、かつ炎症性サイトカインプロフィールの減少を媒介する。
【０３３２】
実施例１３：インビボマウストランスフェクション：膀胱炎を処置するための膀胱へのポリプレックス送達
【０３３３】
膀胱炎モデルを確立するために、マウスまたはラットを用いることもある。たとえば、マウスを麻酔下で配置して、尿道にポリエチレンカテーテルでカニューレ処置する。尿の吸引の後で、前述のように膀胱に酸を滴下注入して膀胱炎を誘発させる（たとえば、ＫｉｆＩｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７， Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｐｌａｔａｓｔ ｔｏｓｉｌａｔｅ （ＩＰＤ−１１５１Ｔ） ｉｎ ａ ｒａｔ ｃｙｓｔｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ＢＪＵ ｌｎｔ ２００７ Ｏｃｔ， １００（４） ９３５−９ Ｅｐｕｂ ２００７ Ａｕｇ ２０；および、Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｐａｉｎ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｃＤＮＡ Ｊ Ｕｒｏｌ ２００３ Ｎｏｖ， １７０（５） ２０４４−８）。
【０３３４】
膀胱炎を処置するために、マウスを麻酔して、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸を含む高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物を尿道カテーテルを介して膀胱に小胞内投与する（たとえば、Ｋｉｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７，前述、およびＣｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３、前述、を参照されたい）。代表的な抗炎症性タンパク質は、表１４の参考文献に記載する。すべての参考文献は、その全てが参照により本明細書に明示的に組み込まれる。種々の時点で、マウスを屠殺し、それらの膀胱組織を収集して、組織学的検査および導入遺伝子ｍＲＮＡ発現ために処理する。加えて、種々のサイトカインの発現を調べる。ＤＮＡ単体を対照として単体で注射する。高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物の小胞内送達は、インビボで膀胱細胞での抗炎症性遺伝子ｍＲＮＡの発現の有意な増大をもたらし、かつ炎症性サイトカインプロフィールの減少を媒介する。
【０３３５】
表１４：代表的な抗炎症性タンパク質
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【０３３６】
すべての引用は、その全てが、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、２００９年３月３１日に出願された米国特許出願第６１／１６５，４４２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物、ならびにその生成方法と使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
キトサンはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルコサミンの非毒性のカチオン性コポリマーである。キトサンは核酸と複合体を形成することができ、細胞をトランスフェクトするためのＤＮＡ送達ビヒクルとして使われている。
【０００４】
キトサンの多くの生物学的用途は、大きなキトサンポリマーの使用に関連している。およそ数百キロダルトンから数千キロダルトンの大きなキトサンポリマーは、酸性溶液だけに溶解する。稀酢酸は、この大きなキトサン用の溶媒として使用されることが多い。
【０００５】
およそ数十キロダルトン以下の低分子量のキトサンは、当初、効果的にパッケージングし、ＤＮＡを保護して、ＤＮＡ送達ビヒクルとして役立たせるにはあまりに小さいと考えられた。しかし、最近になっていくつかのグループは、低分子量のキトサンを用いて、効果的にパッケージングし、ＤＮＡを保護して、ＤＮＡ送達ビヒクルとして役立たせることができることを確立した。低分子キトサンはＤＮＡ送達ビヒクルとしての使用に望ましいと見なされてきた。低分子キトサンが生理的ｐＨで高い溶解度を示し、かつ低いｐＨ環境では核酸の分解を促進すると理解されているからである。
【０００６】
高濃度の核酸は多くの目的にとって望ましいが、高濃度の均一に分散した、安定のキトサン−核酸複合体を生成することは困難である。混合液中のキトサンおよび核酸の濃度が増加すると、凝集、不安定性、粒子の大きさの変動、および沈殿の原因となる。
【０００７】
ＤＮＡおよび縮合剤（たとえばポリカオチン性炭化水素）を含む粒子を生成するために同時流動混合を使用することが記載されている（米国特許第６，５３７，８１３号）。このような粒子を生成するために、ＤＮＡ溶液および縮合剤溶液は、同時にかつ別々に、ミキシングおよび粒子形成を備える静的ミキサーまたは動的ミキサーを含む流入ミキサーに導入され得る。導入および濃縮の全プロセスを通してＤＮＡおよび縮合剤の適当なモル比を維持することが重要であり、かつ電荷的中性からの有意な逸脱は、プロセスにおいて不完全な縮合または粒子凝集のいずれかをもたらし得ることを当業者は教示する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、キトサンを可溶化するのに通常に用いられよりはるかに下回るｐＨを有する、高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物が、生理的ｐＨにより近いポリプレックス組成物よりも高い粘膜上皮のインビボトランスフェクション効率を示すことを見出した。本組成物は、４．５未満のｐＨを有するが、核酸の完全性の安定性と維持、および粘膜上皮送達の適合性の両方を示す。逆説的に、高分子量キトサンより酸性度に低いｐＨでのその溶解性のために一つには開発された低分子量のキトサンは、本発明での使用に特に適切である。
【０００９】
本発明者らは、安定した濃縮した高酸性キトサン−ポリプレックスを生成するために、ポリプレックス凝集および沈殿の問題も克服した。さらに、本発明者らは、等張である濃縮製剤を生成することができた。これは医薬用途および治療用途にとって極めて望ましい。
【００１０】
したがって、一態様では、本発明はキトサン−核酸ポリプレックスを含む高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。
【００１１】
好ましい実施形態では、主題の組成物は、４．５未満のｐＨ、より好ましくは４．２未満、さらに好ましくは４．０未満、さらに好ましくは３．８未満のｐＨを有する。
【００１２】
好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、治療用核酸を含む。一実施形態では、治療用核酸は、治療用ＲＮＡである。別の実施形態では、治療用核酸は、治療用タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトである。
【００１３】
好ましい実施形態では、対象組成物は等張性である。
【００１４】
好ましい実施形態では、対象組成物は安定している。
【００１５】
好ましい実施形態では、対象組成物は均一である。好ましい実施形態では、対象組成物は、０．５未満、より好ましくは０．４未満、さらに好ましくは０．３未満、最も好ましくは０．２未満の平均多分散指数（「ＰＤＩ」）を有する。
【００１６】
好ましい実施形態では、対象組成物は、沈降したポリプレックスを含まない。
【００１７】
好ましい実施形態では、対象組成物は０．５ｍｇ／ｍＬを超える核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。より好ましくは、対象組成物は少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．７５ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも１．２ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。
【００１８】
好ましい実施形態では、対象組成物は、凝集阻害剤をさらに含む。好ましい実施形態において、凝集阻害剤は、糖（好ましくはショ糖）である。
【００１９】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、平均３０００未満。より好ましくは２０００未満、さらに好ましくは１５００未満、さらに好ましくは１０００未満、さらに好ましくは５００未満、さらに好ましくは３００未満、さらに好ましくは１５０未満、さらに好ましくは１００未満、さらに好ましくは５０未満、最も好ましくは３０未満のグルコサミン単量体ユニットを有するキトサン分子を含む。
【００２０】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、少なくとも２：１、より好ましくは少なくとも５：１、さらに好ましくは少なくとも１０：１、さらに好ましくは１５：１、最も好ましくは２０：１のＮ：Ｓ比を有する。
【００２１】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、５００ｋＤａ未満、より好ましくは３００ｋＤａ未満、さらに好ましくは２５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは１５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは１００ｋＤａ未満、さらに好ましくは５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは２５ｋＤａ未満、さらに好ましくは１６ｋＤａ未満、さらに好ましくは８ｋＤａ未満、最も好ましくは５ｋＤａ未満の平均分子量を有するキトサンを含む。
【００２２】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、７５０ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、さらに好ましくは２５０ｎｍ未満、さらに好ましくは２００ｎｍ未満、最も好ましくは１５０ｎｍ未満の平均径を有する。
【００２３】
好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスおよび凝集阻害剤からなる。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスからなる。
【００２５】
一態様では、本発明は、本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
好ましい実施形態では、医薬組成物は等張である。別の実施形態では、医薬組成物は高張、または低張であり得る。
【００２７】
一態様では、本発明は、粘膜上皮細胞を本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物と接触させることを含む、粘膜上皮細胞をトランスフェクトする方法を提供する。
【００２８】
好ましい実施形態では、粘膜上皮は、消化管組織、気道組織、肺組織、副鼻腔組織、口腔組織、尿路組織、膀胱組織、膣組織、子宮組織、頸部組織、眼組織、食道組織、唾液腺組織、鼻喉頭組織、腎臓組織、および喉頭／咽頭組織からなる群から選択される組織内に存在する。
【００２９】
一態様では、本発明は、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置する方法を提供する。対象医薬組成物は、好ましくは粘膜上皮に局所投与される。
【００３０】
好ましい実施形態では、対象医薬組成物は、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトを含む。一実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＴＮＦα阻害剤である。別の実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１０である。
【００３１】
好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、間質性膀胱炎である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、喘息である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｇＷＩＺ−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡを含むｃ１５０キトサン−核酸粒子の投与に応答して検出されたブタ血漿ＳＥＡＰのグラフである。ｐＨ４の場合の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．０であった。ｐＨ４．８の場合の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．８であった。
【図２】１Ｌのインライン混合バッチおよびＴＦＦ濃縮＞ダイアフィルトレーション＞濃縮の代表的なプロセスブロック図である。
【図３】小規模のインライン混合模式図である。シリンジは、ラテックスフリーポリプロピレン（ＰＰ）であり、それぞれ最高６０ｍＬまでスケールアップされ得る。２台の高精度のシリンジポンプが、シリンジを駆動する。チューブは、１／１６”のＰｔ硬化シリコーンである。示される混合ジャンクションは、Ｙ字形である。構造体の混合ジャンクションの材料は、ＰＰである。
【図４】１０Ｌ用の中規模インライン混合の模式図である。表示された模式図は、１０Ｌバッチ用である。すべての容器は、より少ないまたはより大きいバッチの大きさによって、縮小、拡大される。Ｐｔ硬化チューブの径は、０．４８ｃｍ（３／１６”）である。ポンンプの流速は、２：１のＤＮＡ：キトサンの量の混合比で示される。
【図５】ＴＴＦＦ濃縮およびダイアフィルトレ−ションの模式図。ＴＦＦダイアフィルトレーションの模式図を示す。ＴＦＦ濃縮の間、透析バッファラインは保持液容器から分離されて、大気ベントフィルターと交換される。
【図６】ＴＦＦ濃縮間のｐＨの推移のモデル化グラフである。各点は、ポリプレックスの相対的な量の倍減少（＝ＤＮＡ濃度の増加）を示す。たとえば、２×標識の点は、ほぼｃ１２００である。
【図７】第２のＴＦＦ濃縮ステップ後のポリプレックスの安定性を示すグラフである。無希釈のＴＦＦ後の試料を、２５℃でインキュベートし、２時間ごとに粒径をモニターした。
【図８】インプロセスｐＨデータのグラフである。Ｘ軸の上のＴＦＦ画分コードは、次の通りである：Ｃ１：ＴＦＦ濃縮第１のステップ；Ｄ；ＴＦＦダイアフィルトレーション（洗浄量（Ｗ／Ｖ）の回数で示される）；Ｃ２：ＴＦＦ濃縮第２のステップ。
【図９】マウス膀胱のインビボトランスフェクションに関するグラフである。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＦ１ａ−ＳＥＡＰまたは対照ビヒクルを担持するキトサン−ＤＮＡポリプレックスＣ（２４，９８）−ｃ１０００−ｐＨ４を送達した。２日後に、マウスを屠殺して、組織を収集した。ナイーブマウス（非形質移入）を超える、処置されたマウスの膀胱組織におけるＳＥＡＰ ｍＲＮＡの相対的な増加を示す。
【図１０】ＥＧ−１０（ｈＩＬ−１０）高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物の慢性ＩＢＤマウスの体重への効果に関するグラフである。高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物の各投与を、７日間隔で投与した。これらのマウスの体重を、実験全期間を通して毎週モニターした。各毎週の処置後、ＥＧ−１０処置された群に関連して体重増加の有意な改善が観察された。
【図１１】ＥＧ−１０（ｈＩＬ−１０）高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物の３種類の炎症性サイトカインへの効果に関するグラフである。最後の処置から５日後に、両群からのマウスを屠殺して、結腸を摘出し、炎症性サイトカインのレベルを測定した。ＳＥＡＰ処置したマウスと比較すると、ＥＧ−１０処置したマウスは、ＩＬ−６，ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α ｍＲＮＡのレベルの減少がもたらされた。
【図１２】−８０℃で３６０日後の中規模製造からのポリプレックス最終生成物の２つのバッチ（ＤＰ０−００８９およびＤＰ−００９０）に対するアガロースゲル電気泳動を示す画像である。ポリプレックスおよびＤＮＡ（高次コイルおよびニックの入った）の位置を示す。製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ１０−ｃ１０００−Ａｃ７０−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．０であった。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
「キトサン−核酸ポリプレックス」、「キトサン−核酸ポリプレックス粒子」、「キトサン−核酸複合体」、「ポリプレックス」または文法的に同様ななものによって、複数のキトサン分子および複数の核酸分子を含む複合体を意味する。キトサン単量体には、リガンドが付着したキトサンを含む誘導体が含まれる。「誘導体」とは、共有結合的に修飾されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよび／またはＤ−グルコサミユニット、ならびに他のユニットを組み込んでいる、または他の残基に付着したキトサン系ポリマー類を含む、キトサン系ポリマーの幅広いカテゴリーが挙げられると理解される。誘導体は、ヒドロキシル基またはグルコサミンのアミン基の修飾に基づくことが多い。キトサン誘導体の例としては、トリメチル化キトサン、ペグ化キトサン、チオラート化キトサン、ガラクトシル化キトサン、アルキル化キトサン、ＰＥＩを組み込んだキトサン、アルギニン修飾されたキトサン、ウロン酸修飾されたキトサン等が挙げられるがこれらに限定されない。キトサン誘導体についての更なる教示としては、たとえば、”Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｋ Ｔａｉｒａ， Ｋ Ｋａｔａｏｋａ， Ｔ Ｎｉｉｄｏｍｅ （ｅｄｉｔｏｒｓ）， ｐｐ．６３−７４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｔｏｋｙｏ， ２００５， ＩＳＢＮ ４−４３１−２５１２２−７；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７， ｖｏｌ ５２ （２３）， ｐｐ ３２０７−３２１５， 国際公開第２００８／０８２２８２号、およびＶａｒｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５５（２００４） ７７−９３を参照されたい。これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００３４】
分散系は、分散相として知られており、連続培地全体にわたり分布された粒子状物質からなる。キトサン−核酸ポリプレックスの「分散」は、水和キトサン−核酸ポリプレックスを含む組成物であり、ポリプレックスが培地全体にわたり分布されている。
【００３５】
本明細書で使用するとき、キトサンポリマーの「平均重量」は、平均分子量の重量をいう。
【００３６】
「対アニオン」とは、その位置で荷電したキトサンアミンまたは他カチオンと静電相互作用ができるアニオンを意味する。好ましい対アニオンは、酢酸塩イオンおよび塩化物イオンを含む。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「予備濃縮」分散は、本明細書に記載するように濃縮分散液を形成するための濃縮プロセスをまだ受けていないものをいう。
【００３８】
本明細書で使用するとき、ポリプレックス沈殿物を「含まない」とは、目視検査で観察され得る粒子が組成物には基本的ないことを意味する。
【００３９】
２００７年３月３０日に出願された米国特許出願第１１／６９４，８５２号に開示されるように、キトサンは調製されてもよい。この出願はその全体を参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００４０】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物。
【００４１】
一態様では、本発明は、キトサン−核酸ポリプレックスを含む高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。キトサン−核酸ポリプレックスの核酸成分は、キトサン−核酸ポリプレックスにカプセル封入される。好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、組成物中で均一で安定である。
【００４２】
「均一である」複数のキトサン−核酸ポリプレックスを含む組成物は、ポリプレックスサイズの分布が狭い組成物をいう。ポリプレックスサイズのこの狭い分布は、たとえば、組成物の「多分散指数」（ＰＤＩ）によって測定されることができる。対象組成物のための好ましいＰＤＩは、０．５未満、より好ましくは０．４未満、さらに好ましくは０．３未満、最も好ましくは０．２未満である。
【００４３】
「安定な」複数のキトサン−核酸ポリプレックスを含む組成物は、ポリプレックスが安定したサイズを保つ、すなわち、時間とともにサイズまたは凝集体が増加する傾向がない組成物をいう。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、室温で少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の間に、平均径が１００％未満、より好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満増加するポリプレックスを含む。
【００４４】
対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、冷却条件下で安定であるのが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、２〜８℃で少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の間に、平均径が１００％未満、より好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満増加するポリプレックスを含む。
【００４５】
対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、凍結融解条件下で安定であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、−２０〜−８０℃での凍結から融解の後に、室温で少なくとも６時間、より好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間、最も好ましくは少なくとも４８時間の間に、平均径が１００％未満、より好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満増加するポリプレックスを含む。
【００４６】
本発明のキトサン−核酸ポリプレックス内の核酸のカプセル封入は、たとえば、ゲル電気泳動での核酸の遅滞によって示されることができる。
【００４７】
好ましい実施形態では、対象組成物は、４．５以下のｐＨ、より好ましくは４．２以下、さらに好ましくは４．０以下、さらに好ましくは３．８以下のｐＨ値を有する。
【００４８】
一実施形態では、対象組成物は、３．５〜４．５の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、対象組成物は、３．６〜４．２の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、対象組成物は、３．８〜４．２の範囲のｐＨを有する。
【００４９】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、３０００未満、より好ましくは２０００未満、さらに好ましくは１５００未満、さらに好ましくは１０００未満、さらに好ましくは５００、さらに好ましくは３００未満、さらに好ましくは１５０、さらに好ましくは１００未満、さらに好ましくは５０、最も好ましくは３０未満のグルコサミン単量体ユニットを有するキトサン分子を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、５００ｋＤａ未満、より好ましくは３００ｋＤａ未満、さらに好ましくは２５０ｋＤａ、さらに好ましくは１５０ｋＤａ、さらに好ましくは１００ｋＤａ、さらに好ましくは５０ｋＤａ、さらに好ましくは２５ｋＤａ、さらに好ましくは１６ｋＤａ、さらに好ましくは８ｋＤａ、最も好ましくは５ｋＤａの平均分子量を有するキトサンを含む。
【００５１】
好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン成分は、３ｋＤａ〜２５０ｋＤａの平均分子量を有する。
【００５２】
一実施形態では、対象組成物のキトサン成分は、２５０ｋＤａ以上の平均分子量を有する。
【００５３】
一実施形態では、対象組成物のキトサン成分は、３ｋＤａ以下の平均分子量を持つ。
【００５４】
好ましい実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、７５０ｎｍ未満、より好ましくは５００ｎｍ未満、さらに好ましくは２５０ｎｍ未満、さらに好ましくは２００ｎｍ未満、最も好ましくは１５０ｎｍ未満の平均径を有する。
【００５５】
一実施形態では、対象組成物のポリプレックスは、１００ｎｍを超える平均径を有する。
【００５６】
一実施例では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、２：１〜１００：１、より好ましくは５：１〜９０：１、さらに好ましくは１０：１〜９０：１、最も好ましくは２０：１〜９０：１でＮ：Ｐ比を有する。
【００５７】
好ましい実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、＋２０ｍＶと＋６０ｍＶの間の平均ゼータ電位を有する。
【００５８】
一実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、＋２０ｍＶ以下の平均ゼータ電位を有する。
【００５９】
一実施形態では、対象組成物のキトサン−核酸ポリプレックスは、＋６０ｍＶ以上の平均ゼータ電位を有する。
【００６０】
好ましい実施形態では、ポリプレックスのキトサン分子は、７０％を超える、より好ましくは７５％を超える、より好ましくは８０％を超える、さらに好ましくは８５％を超える、さらに好ましくは９０％を超える、さらに好ましくは９５％を超える、最も好ましくは９８％を超える程度の脱アセチル化を有する。
【００６１】
一実施形態では、ポリプレックスのキトサン分子は、７０％以下の程度の脱アセチル化を有する。
【００６２】
好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスおよび凝集阻害剤からなる。対象ポリプレックスおよび凝集阻害剤に加えて、このような組成物は、対アニオンと他の賦形剤とを含み得るが、対象組成物の活性に実質的に影響を及ぼす他の物質を除外する。
【００６３】
好ましい実施形態では、対象組成物は、基本的にキトサン−核酸ポリプレックスからなる。対象ポリプレックスに加えて、このような組成物は、対アニオンと他の賦形剤とを含み得るが、対象組成物の活性に実質的に影響を及ぼす他の物質を除外する。
【００６４】
好ましい実施形態では、対象組成物は、パラベンを含まない。これは、組成物が０．５ｍｇ／ｍＬを超える核酸濃度を有する場合に特に望ましい。
【００６５】
好ましい実施形態では、対象組成物は、１０ｍＭ〜２００ｍＭの対アニオン濃度、極めて好まれる６０〜１００ｍＭの対アニオン濃度を有する。好ましい実施形態では、対アニオンは、アセテートである。
【００６６】
好ましい実施形態では、対象組成物は０．５ｍｇ／ｍＬを超える核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。より好ましくは、組成物は少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも０．７５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１．２ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有し、かつ沈殿したポリプレックスを含まない。好ましい実施形態では、組成は水和物である。好ましい実施形態では、組成物は非複合型の核酸を実質的に含まない。
【００６７】
好ましい実施形態では、キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、さらに凝集阻害剤を含む。凝集阻害剤は、ポリプレックス凝集体および／または沈殿物を部分的にまたは完全に減少させ、かつ、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を用いる濃縮方法によってキトサン−核酸ポリプレックスを濃縮することを提供する薬剤である。極めて好ましい凝集阻害剤は、ショ糖であるが、他の凝集阻害剤、たとえば、ポリプレックス沈殿を減少させることができ、かつキトサン−核酸ポリプレックスを濃縮することを提供する他の糖質類を用いてもよい。他の凝集阻害剤の例としては、トレハロース、グリセロール、フルクトース、グルコースおよび他の還元糖類および非還元糖類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
好ましい実施形態では、使用される凝集阻害剤は、ショ糖である。キトサン−核酸ポリプレックス分散におけるショ糖の濃度は、好ましくは約３重量％〜２０重量％である。最も好ましくは、ショ糖の濃縮は、等張性組成物を与える。
【００６９】
好ましい実施形態では、高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、等張である。ポリプレックス安定性を維持しつつ、等張性を達成することは医薬組成物を製剤化する際に極めて望ましく、かつこれらの好ましい組成物は医薬製剤応用および治療応用に適切である。
【００７０】
別の実施形態では、組成物は高張性または低張性であり得る。
【００７１】
核酸
【００７２】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、核酸成分およびキトサン成分を含む。本発明の核酸は通常、ホスホジエステル結合を含むが、しかし一部の場合、種々の目的のいずれか、たとえば安定性および保護等のために組み込んだ交互骨格または他の修飾または残基を有し得る核酸類似体が含まれる。考えられる他の類似体核酸は、非リボース骨格を持つものを含む。核酸は一本鎖もしくは二本鎖であることもあり得、または二本鎖および一本鎖の両配列の部分を含むこともある。核酸にはＤＮＡと、ＲＮＡと、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドのいずれかの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含むいずれかの塩基の組み合わせを核酸が含有するハイブリッドが挙げられるがこれらに限定されない。核酸には、三本鎖、二本鎖または一本鎖、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、キメラ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、およびそれらの誘導体を含む、いずれかの形のＤＮＡ、いずれかの形のＲＮＡが含まれる。
【００７３】
実施形態では、核酸成分およびキトサン成分を治療用核酸を含む。治療用核酸は、治療用ＲＮＡを含む。これは、哺乳類細胞において治療効果を及ぼすことができるＲＮＡ分子である。治療用ＲＮＡには、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および酵素的ＲＮＡが含まれる。治療用核酸には、三重鎖分子、タンパク質結合核酸、リボザイム、デオキシリボザイム、およびヌクレオチド低分子を形成する核酸が含まれる。
【００７４】
治療用核酸も、治療用タンパク質をコードする核酸を含む。
【００７５】
好ましい実施形態では、核酸成分は、治療用核酸コンストラクトを含む。治療用核酸コンストラクトは、治療効果を及ぼすことができる核酸コンストラクトである。治療用核酸コンストラクトは、好ましくは治療用タンパク質をコードする核酸を含むが、治療用ＲＮＡである転写物を代わりに生成することができる。治療用核酸を用いて、治療目的の生成物をコードすることによって、欠陥遺伝子の代替もしくは増強として使用することによる遺伝子療法を行う、または特定の遺伝子生成物の欠如を代償することも可能である。治療用核酸は、内在性遺伝子の発現を阻害することも可能である。治療用核酸は、翻訳生成物のすべてまたは一部をコードすることも可能であり、かつ細胞内にすでに存在するＤＮＡと組み合わせ、それによって欠陥遺伝子もしくはその部分を置き換えることによって機能することも可能である。治療用核酸は、タンパク質の一部をコードし得る。治療用タンパク質は、遺伝子生成物を阻害することによって、その効果を及ぼし得る。好ましい実施形態では、治療用核酸は米国特許出願第１１／６９４，８５２号に開示されるものから選択される。この出願は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。また、国際公開第２００８０２０３１８号を参照されたい。この公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【００７６】
本発明での使用が考えられる治療用タンパク質としては、ホルモン類、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗体、増殖因子、分化因子、血塊形成に影響する因子、血糖値に影響する因子、糖代謝に影響する因子、脂質代謝に影響づる因子、血液コレステロール値に影響する因子、血液ＬＤＬ値またはＨＤＬ値に影響する因子、細胞アポトーシスに影響する因子、食物摂取に影響する因子、エネルギー消費に影響する因子、食欲に影響する因子、栄養の吸収に影響する因子、炎症に影響する因子、および骨形成に影響する因子が挙げられるがこれらに限定されない。特に好ましいのは、インスリン、レプチン、グルカゴン拮抗剤、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＧＬＰ−２、Ｇｈｒｅｈｎ、コレシストキニン、成長ホルモン、凝固因子、ＰＹＹエリスロポイエチン、炎症の阻害剤、ＩＬ−１０拮抗剤、ＩＬ−１７拮抗剤、ＴＮＦα拮抗剤、ＩＬ−１拮抗剤、成長ホルモン放出ホルモン、または副甲状腺ホルモンをコードする治療用核酸である。
【００７７】
本発明で考えられる特に好ましい治療用タンパク質は、抗炎症性タンパク質である。本発明での使用が考えられる抗炎症性タンパク質には、抗炎症性サイトカイン、ならびにたとえば炎症誘発性サイトカイン等の炎症誘発性分子が挙げられるがこれらに限定されない。
代表的な抗炎症性タンパク質としては、ＩＬ−１０（たとえば、Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｄｅｃ；１１９（６）：１４７３−８２．； Ｗｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ Ｍａｒ １５；６２（６）：３６２５−３２）；ＩＬ−ＩＲａ（たとえば、Ａｒｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８；１６：２７−５５； Ｍａｋａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｊａｎ ９；９３（１）：４０２−６）；ＩＬ−ＩＴａ−Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＩＬ−４（たとえば、Ｈｏｇａｂｏａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７ Ｄｅｃ １；１００（１１）：２７６６−７６）；ＩＬ−１７可溶性受容体（たとえば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ｌｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． ２００６ Ｍａｙ；１２（５）：３８２−８； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅ １９４， Ｎｕｍｂｅｒ ４， Ａｕｇｕｓｔ ２０， ２００１ ５１９−５２８）；ＩＬ−６（たとえば、Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊａｎ １５；１０１（２）：３１１−２０）；ＩＬ−１１（たとえば、Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｄｅｃ １；１５９（１１）：５６６１−７０）；ＩＬ−１３（たとえば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｏｃｔ １；１５９（７）：３４８３−９； Ｍｕｃｈａｍｕｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｍａｒ １５；１５８（６）：２８９８−９０３）；ＩＬ−１８可溶性受容体（たとえば、Ａｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９９ Ｆｅｂ ２６；４４５（２−３）：３３８−４２）；ＴＮＦ−α可溶性受容体（たとえば、Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ；６６（６）：１００５−１３）；ＴＮＦ−α受容体Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＴＧＦ−β（たとえば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊｕｎ １５；１０１（１２）：２６１５−２１； Ｇｉｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）；ＩＬ−１２（たとえば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ Ｆｅｂ；２８（２）：４１３−２３）；ＩＦＮ−α（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ａｕｇ １０；１０（１２）：１９０５−１４）；ＩＬ−４可溶性受容体（たとえば、Ｓｔｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２００１ ；２（２）：６６−７０． Ｅｐｕｂ ２００１ Ｆｅｂ １９）が挙げられる。
【００７８】
特に本発明で用いる好ましい抗炎症性タンパク質としては、ＩＬ−１０，ＴＮＦαタンパク質拮抗剤、およびＩＬ−１のタンパク質拮抗剤が挙げられる。
【００７９】
発現調節領域
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明のポリプレックスは治療用核酸を含む。これはコード領域に作用可能に連結される発現調節領域を含む、治療用コンストラクトである。治療用コンストラクトは、治療用核酸を生成する。これはそのままで治療用であり得、または治療用タンパク質をコードし得る。
【００８１】
一部の実施形態では、治療用コンストラクトの発現調節領域には、恒常的活性がある。いくつかの好ましい実施形態では、治療用コンストラクトの発現調節領域には、恒常的活性がない。このため、治療用核酸の動的な発現もたらす。「動的な」発現とは、時間とともに変化する発現を意味する。動的な発現には、検出可能な発現の期間によって分離される低発現期間もしくは発現の非存在の期間等いくつかの期間を含むことがある。いくつかの好ましい実施形態では、治療用核酸は、調節可能なプロモーターに作用可能に連結される。このため、治療用核酸の調節可能な発現をもたらす。
【００８２】
発現調節領域は、調節ポリヌクレオチド（本明細書では要素と呼ぶこともある）、たとえば、作用可能に連結された治療用核酸に影響するプロモーターおよびエンハンサーを含む。
【００８３】
本明細書に含まれる発現制御要素は、細菌、酵母、植物、または動物（哺乳類もしくは非哺乳類）に由来することが可能である。発現調節領域は、たとえば天然のプロモーター等の完全長プロモーター配列およびエンハンサー要素、ならびに完全長のすべてもしくは部分、または非変異機能を保持する（たとえば、一部の栄養調節または細胞／組織−特異的発現を保持する）サブシークエンスまたはポリヌクレオチド変異体を含む。本明細書で使用するとき、用語「機能の」およびその文法的変異体とは、核酸配列、配列もしくは断片を参照で用いる場合、配列が天然の核酸の配列（たとえば非変異配列もしくは未修飾配列）のうちの１つまたは複数の機能を有することを意味する。本明細書で使用するとき、用語「変異体」とは、配列置換、欠失、もしくは付加、または他の修飾（たとえば、ヌクレアーゼに耐性である修飾形態等の化学誘導体）を意味する。
【００８４】
本明細書で使用するとき、用語「作用可能な連結」とは、構成成分がそれらの意図された方法で機能することができるように記載されている、構成成分の物理的並列をいう。核酸との作用可能な連結での発現制御要素の例では、この関係は、制御要素が核酸の発現を調節することである。一般的に、転写を調節する発現調節領域は、転写された核酸の５’末端（すなわち「上流の」）近くに並置される。発現調節領域は、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流の」）で、または、転写物内（たとえば、イントロン内に）に位置することもできる。発現制御要素は、転写された配列から離れた距離（たとえば核酸からの１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００またはそれ以上のヌクレオチド）に位置することもあり得る。発現制御要素の具体的な例はプロモーターであり、これは通常、転写された配列の５’末端に位置する。発現制御要素の別の例は、エンハンサーであり、これは転写された配列の５’もしくは３’末端、または転写された配列内に位置することもあり得る。
【００８５】
一部の発現調節領域は、作用可能に連結された治療用核酸に、調節可能な発現を与える。シグナル（刺激と呼ばれることもある）は、この発現調節領域に作用可能に連結された治療用核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるこの発現調節領域は、誘導性と呼ばれることが多い。シグナルに応答して発現を減少させるこの発現調節領域は、抑制性と呼ばれることが多い。一般的に、そのような要素で与えられる増加量または減少量は、シグナルが示す量と比例し、シグナル量が大きくなればなるほど、発現の増加または減少もより大きくなる。
【００８６】
多数の調節可能なプロモーターが当該技術分野で既知である。好ましい誘導性発現調節領域は、小分子化学物質で刺激される誘導性プロモーターを有するものを含む。一実施形態では、発現調節領域は経口的に送達可能である化学物質に応答するが、食物では通常見つからない。特定の例は、たとえば、米国特許第５，９８９，９１０号；第５，９３５，９３４号；第６，０１５，７０９号；および第６，００４，９４１号に見出すことができる。
【００８７】
一実施形態では、治療用コンストラクトは、組込み配列をさら含む。一実施形態では、治療用コンストラクトは、単一の組込み配列を含む。別の実施例では、治療用コンストラクトは、治療用核酸またはその一部を標的細胞のゲノムに組み込むための第１のおよび第２の組込み配列を含む。好ましい実施形態では、１つまたは複数の組込み配列は、マリナー、スリーピングビューティー、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、φＣ３１、Ｒ，λからなる群から選択される組込み手段、ならびにＡＡＶ、レトロウイルス、および抗ウイルス等の組込みウイルスからの組込み手段と組み合わせて機能する。
【００８８】
一実施例では、対象組成物は、治療用コンストラクトに加えて非治療用コンストラクトをさらに含む。ここで非治療用コンストラクトは、第２の発現調節領域に作用可能に連結した組込みのための手段をコードする核酸配列を含む。この第２の発現調節領域および治療用核酸に作用可能に連結した発現調節領域は、同一であっても、または別であってもよい。組込みのためのコードした手段は、好ましくは、マリナー、スリーピングビューティー、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、φＣ３１、Ｒ，λからなる群から選択され、かつＡＡＶ、レトロウイルス、および抗ウイルス等の組込みウイルスからの組込み手段から選択される。
【００８９】
さらなる教示のために、国際公開第２００８０２０３１８号を参照されたい。その全体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９０】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を調製する方法
【００９１】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックスの組成物は、他の方法、たとえば核酸溶液またはキトサン溶液をもう一方の溶液に滴下することによって混合溶液を形成する等の他の方法も用いることも可能であるが、好ましくはインライン混合によって調製される。しかし、インライン混合は、好ましくは０．５未満の、より好ましくは０．４未満の、より好ましくは０．３未満の、最も好ましくは０．２未満の平均ＰＤＩを有するキトサン−核酸ポリプレックスを大容量で均一に調製することをもたらす。好ましい実施形態では、分散液は３．５〜５．５のｐＨ値を有する。
【００９２】
インライン混合は、周知のプロセスであり、それによって２種類の（またはそれ以上の）流体ストリームが１つのストリームにまとめられる。インライン混合の付加的な説明およびキトサン−核酸ポリプレックスの濃縮については、２００８年９月２６日に出願された国際出願第ＰＣT/ＣＡ２００８／００１７１４号、国際公開第２００９／０３９６５７号として公開される）に見出される。公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。インライン混合についてのさらなる開示については、たとえば米国特許第６，２６１，５９９号および同第６，５３７，８１３号を参照されたい。これらのそれぞれは参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【００９３】
この組成物は、所望の低ｐＨ値で複合体に形成され得る、またはより高いｐＨ値で複合体に形成され、複合体形成後にｐＨを調整して、所望の高酸性分散液を形成してもよい。
【００９４】
静的ミキサーおよび動的なミキサー等のミキサーを使用してもよい。この装置は、本方法によって形成される複合体のＰＤＩの増加をもたらす。したがって、本発明の好ましい実施形態では、インライン混合は、このようなミキサーを用いずに行われる。
【００９５】
好ましい実施形態では、本発明の高酸性高濃度キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液を濃縮することによって生成される。一実施形態では、予備濃縮分散液は、４．８以下のｐＨ値、好ましくは３．５〜４．５のｐＨ値を有する。別の実施形態では、予備濃縮分散液は、４．５を超えるｐＨ値を有する。濃縮生成物は、４．５以下のｐＨ値にｐＨを調整されてもよい。予備濃縮分散液は、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度を有する。
【００９６】
本発明では、タンジェンシャルフローろ過（「ＴＦＦ」）は、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液を濃縮するための好ましい方法である。ＴＦＦ操作において、一部の液体を膜を通させるために膜に向かって加圧される間に、キトサン−核酸ポリプレックス分散液は、半透性膜の表面を越えてポンピングされる。膜孔より小さい分子は、膜孔を通って輸送され、透過するにつれて、収集される。透過溶質には、塩類、イオン類、糖類、および微生物防腐剤が挙げられるがこれらに限定されない。キトサン−核酸ポリプレックスを含む、膜孔を通過するには大きすぎる分子実体は、ストリーム内に保持されて、保持液として再循環する。ＴＦＦ濃縮操作において、透過液は取り出され、他方保持液は気圧に開放され、保持液量が減少することになる。ＴＦＦを用いることで、ポリプレックス濃度は数倍も増加し、高濃縮ポリプレックス分散液がもたらされ得る。好ましい実施形態では、高濃縮ポリプレックス分散液は等張性である。
【００９７】
好ましい実施形態では、この濃縮プロセスは、１つまたは複数のダイアフィルトレーション操作をさらに含む。４．８より高いｐＨ値を有する組成物を用いることもあり得るが、４．８以下のｐＨ値を有する予備濃縮キトサン−核酸ポリプレックス組成物を用いる場合、ダイアフィルトレーションは特に好まれる。
【００９８】
ＴＦＦダイアフィルトレーション操作では、新しいバッファを保持液に加えることによって透過液は常に補充され、保持液中のバッファの交換をもたらす。ＴＦＦダイアフィルトレーションを用いることで、ポリプレックス濃度を維持しつつ、ポリプレックスはバッファ交換されることが可能であり、新しいバッファを有するポリプレックス分散液がもたらされる。
【００９９】
一実施例では、濃縮ポリプレックス分散液へのＴＦＦ濃縮を行う前に、ＴＦＦダイアフィルトレーション操作は、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液で行われる。好ましい実施形態では、濃縮ポリプレックス分散液へのＴＦＦ濃縮を行ってから、ＴＦＦダイアフィルトレーション操作は、キトサン−核酸ポリプレックスの濃縮分散液で行われる。極めて好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーション操作は、ＴＦＦ濃縮操作の間に行われる。この操作中に、キトサン−核酸ポリプレックスの予備濃縮分散液は、ＴＦＦ濃縮によって一部濃縮され、次いでＴＦＦダイアフィルトレーションに掛けられ、次いでＴＦＦ濃縮によってさらに濃縮される。これにより、新しいバッファを有する濃縮ポリプレックス分散液がもたらされ、キトサン−核酸ポリプレックスの安定性がさらに促進される。
【０１００】
一実施例では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは４０未満である。好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは２０未満である。より好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは１０未満である。きわめて好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションのための洗浄量の数は、好ましくは６未満である。
【０１０１】
一実施形態では、濃縮操作中に行われるＴＦＦダイアフィルトレーション操作の回数は５未満であり、かつ１を超える。好ましい実施形態では、行われるＴＦＦダイアフィルトレーション操作の回数は、１である。
【０１０２】
好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションバッファは、キトサンを含む。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションバッファは、キトサンおよび対アニオン（好ましくはアセテート）を含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、ＴＦＦダイアフィルトレーションバッファは、キトサン、対アニオン（好ましくはアセテート）、および凝集阻害剤（好ましくはショ糖）を含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、濃縮キトサン−核酸ポリプレックス分散液のｐＨは、ｐＨ調整バッファを追加することによって、より低いｐＨ値に調整される。
【０１０６】
好ましい実施形態では、ｐＨ調整バッファは、キトサンを含む。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ｐＨ調整バッファは、キトサンおよび対アニオン（好ましくはアセテート）を含む。
【０１０８】
好ましい実施形態では、ｐＨ調整バッファは、濃縮キトサン−核酸ポリプレックスをわずかに（好ましくは５％未満）希釈する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＴＦＦ濃縮操作の完了後１時間以内に、ｐＨ調整バッファは、濃縮キトサン−核酸ポリプレックスに加えられる。
【０１１０】
好ましい実施形態では、予備濃縮キトサン−核酸ポリプレックス分散液は、糖（好ましくはショ糖）を含む。後述のとおり、ショ糖が濃縮プロセスの間に粒子の凝集を防止する凝集阻害剤であることが判明した。
【０１１１】
使用方法
【０１１２】
一態様では、本発明は粘膜上皮の細胞をトランスフェクトする方法を提供する。これらの方法は、粘膜上皮の細胞を本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物と接触させることを含む。一実施形態では、トランスフェクションはインビトロで行われる。別の実施形態では、トランスフェクションはインビボで行われる。対象組成物は、組成物の高酸性にもかかわらず、粘膜上皮の投与に適しており、かつ粘膜上皮細胞の高いトランスフェクション効率を示す。
【０１１３】
好ましい実施形態では、粘膜上皮は、消化管組織、気道組織、肺組織、副鼻腔組織、口腔組織、尿路組織、膀胱組織、膣組織、子宮組織、頸部組織、眼組織、食道組織、唾液腺組織、鼻喉頭組織、腎臓組織、および喉頭／咽頭組織からなる群から選択される組織内に存在する。
【０１１４】
一態様では、本発明は粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置する方法を提供する。これらの方法は、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することを含む。対象医薬組成物は、好ましくは粘膜上皮に局所投与される。対象医薬組成物は、抗炎症性活性がある治療用核酸を含む。
【０１１５】
好ましい実施形態では、対象医薬組成物は、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトを含む。一実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＴＮＦα阻害剤である。別の実施形態では、抗炎症性タンパク質はＩＬ−１阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質はＩＬ−１０である。
【０１１６】
一実施例では、治療用核酸は、炎症性サイトカインに向けられる治療用ＲＮＡである炎症性サイトカインに向けられるｓｉＲＮＡが特に好まれる。
【０１１７】
好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、ＩＢＤである。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、間質性膀胱炎である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、喘息である。
【０１１８】
対象組成物は、粘膜上皮細胞のトランスフェクションによって処置可能である疾患または状態の処置に用いるのに適切である。この疾患には、粘膜上皮組織に関わる疾患が含まれるがこれらに限定されない。対象組成物を用いて、組成物が投与され得る、粘膜上皮組織に関わらない疾患および状態を処置することもできる。このような状態および疾患は、それにもかかわらず、粘膜上皮組織のこのようなトランスフェクションを介して治療的に到達可能である。たとえば、国際公開第２００８０２０３１８号を参照されたい。この公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。たとえば、対象組成物を腸の粘膜上皮に投与することで、コードした治療用タンパク質を全身に送達し得る。
【０１１９】
治療用核酸を用いて、治療目的の生成物をコードすることによって、欠陥遺伝子の代替もしくは増強として使用することによる遺伝子療法を行う、または特定の遺伝子生成物の欠如を代償することも可能である。治療用核酸も、内在性遺伝子の発現を阻害し得る。治療用核酸は、翻訳生成物のすべてまたは一部をコードすることも可能であり、かつ細胞内にすでに存在するＤＮＡと組み合わせ、それによって欠陥遺伝子もしくはその部分を置き換えることによって機能することも可能である。治療用核酸も、タンパク質の一部ををコードし得る。治療用タンパク質は遺伝子生成物を阻害することによってその効果を及ぼし得る。
【０１２０】
処置され得る疾患または状態としては、糖尿病、肥満症、ホルモン欠乏症、炎症性大腸疾患、下痢、過敏性腸症候群、消化管感染症、消化性潰瘍、胃食道逆流症、胃不全麻痺、痔核、栄養吸収障害、膵臓炎、ヘモクロマトーシス、小児脂肪便病、黄斑変性症、加齢性黄斑変性、ブドウ膜炎、網膜色素変性症、虹彩炎、強膜炎、緑内障、角膜炎、網膜症、眼感染症（たとえば、角膜真菌症）、感染症、子宮内膜症、子宮頸管炎、泌尿器疼痛、ポリープ、フィブロイド、子宮内膜増殖症、尿失禁、膀胱および尿路感染症、過活動膀胱、勃起障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、膜性腎症、高血圧、食物アレルギー、喘息、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎、異脂肪血症／高コレステロール血症、メタボリックシンドローム、乾癬、ざ瘡、酒さ、肉芽腫性皮膚炎、しわ、色素脱失、慢性閉塞性肺疾患、気道感染症、嚢胞性線維症、肺血管疾患、線維症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経障害、自己免疫疾患、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症および炎症が挙げられるがこれらに限定されない。方法は、本発明の医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
【０１２１】
本発明の治療用タンパク質は、このような治療用タンパク質をコードする治療用核酸を含む対象組成物によって生成され得る。後述する治療用タンパク質の使用は、このような治療用タンパク質の使用を達成するために、対象組成物の使用をいう。
【０１２２】
本発明で用いるために考えられる治療用タンパク質は、種々の活性を有し、かつ種々の障害の処置での使用が見出される。治療用タンパク質、および本発明の治療用タンパク質で処置可能な徴候についての以下の説明は、例示的であって、網羅的であることを意図するものではない。用語「被験者」とは、好ましい哺乳類および特に好ましいヒトを含む動物をいう。治療用タンパク質が標的タンパク質の拮抗剤である実施形態において、代替治療実施形態は、同じ標的タンパク質を標的とする治療用ＲＮＡを使用することもある。
【０１２３】
治療用タンパク質および標的疾患の一部のリストを以下の表に示す。
【表１】
【０１２４】
炎症性疾患
【０１２５】
好ましい実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、炎症を調節する。たとえば、治療用ポリペプチドは、炎症反応に関与する細胞の増殖および分化を抑制し得る。れらの分子を用いて、炎症性状態（慢性および急性の両状態）を処置することがでる。かかる炎症性状態には、感染症（たとえば、敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））に関連する炎症、虚血再灌流障害、致死性内毒素、関節炎、膵炎、補体媒介性超急性拒絶反応、腎炎、サイトカインもしくはケモカイン誘発肺損傷、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性膀胱炎、クローン病、または炎症性サイトカイン（たとえばＴＮＦαおよびＩＬ−１）の過剰産生に起因する他の疾患が含まれる。
【０１２６】
特に好ましい実施形態では、本発明は粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置するための方法を提供する。方法は、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。対象医薬組成物は、粘膜上皮に好ましくは局所投与される。一実施形態では、対象医薬組成物は、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸コンストラクトを含む。本発明で用いることが考えられる抗炎症性タンパク質としては、抗炎症性サイトカインならびにたとえば炎症性サイトカイン等の炎症性分子のタンパク質拮抗剤が挙げられるが、これらに限定されない。
代表的な抗炎症性タンパク質としては、ＩＬ−１０（たとえば、Ｆｅｄｏｒａｋ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２０００ Ｄｅｃ； １１９（６）：１４７３−８２．； Ｗｈａｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９ Ｍａｒ １５；１６２（６）：３６２５−３２）をはじめとして、ＩＬ−１Ｒａ（たとえば、Ａｒｅｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８； １６：２７−５５； Ｍａｋａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６ Ｊａｎ ９；９３（１）：４０２−６）；ＩＬ−１Ｒａ−Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＩＬ−４（たとえば、Ｈｏｇａｂｏａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９７ Ｄｅｃ １ ；１００（１１）：２７６６−７６）；ＩＬ−１７可溶性受容体（たとえば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００６， ｌｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． ２００６ Ｍａｙ；１２（５）：３８２−８； Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｖｏｌｕｍｅ １９４， Ｎｕｍｂｅｒ ４， Ａｕｇｕｓｔ ２０， ２００１ ５１９−５２８）；ＩＬ−６（たとえば、Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊａｎ １５；１０１（２）：３１１−２０）；ＩＬ−１１（たとえば、Ｔｒｅｐｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｄｅｃ １ ；１５９（１１）：５６６１−７０）；ＩＬ−１３（たとえば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｏｃｔ １ ；１５９（７）：３４８３−９； Ｍｕｃｈａｍｕｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７ Ｍａｒ １５；１５８（６）：２８９８−９０３）；ＩＬ−１８可溶性受容体（たとえば、Ａｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９９ Ｆｅｂ ２６；４４５（２−３）：３３８−４２）；ＴＮＦ−α可溶性受容体（たとえば、Ｗａｔｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． １９９９ Ｄｅｃ；６６（６）：１００５−１３）；ＴＮＦ−α受容体Ｉｇ（たとえば、Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９８ Ａｐｒ １４；９５（８）：４６１３−８）；ＴＧＦ−β（たとえば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８ Ｊｕｎ １５；１０１ （１２）：２６１５−２１； Ｇｉｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４）；ＩＬ−１２（たとえば、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８ Ｆｅｂ；２８（２）：４１３−２３）；ＩＦＮ−γ（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９９ Ａｕｇ １０；１０（１２）：１９０５−１４）；ＩＬ−４可溶性受容体（たとえば、Ｓｔｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１ ， Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２００１ ；２（２）：６６−７０． Ｅｐｕｂ ２００１ Ｆｅｂ １９）がある。
【０１２７】
好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＴＮＦα阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１阻害剤である。別の好ましい実施形態では、抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−１０である。
【０１２８】
好ましい実施形態において、粘膜上皮の炎症を含んでいる疾患は、ＩＢＤである。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、間質性膀胱炎である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の好ましい実施形態では、粘膜上皮の炎症を伴う疾患は、喘息である。
【０１２９】
高血糖症と体重
【０１３０】
治療用タンパク質はインスリンおよびインスリン類似体を含む。糖尿病は、膵臓β−細胞からのインスリン産生が存在しない（１型）または不十分な（２型）ことに起因する消耗性の代謝疾患である（Ｕｎｇｅｒ Ｒ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９９８）に基づく）。β細胞は、食後のインスリン放出に備えて産生し貯蔵する専門の内分泌細胞である（Ｒｈｏｄｅｓ，らＪ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０５ １４５（１９８７））。インスリンは、それを必要とする組織に血液からグルコースの移動を促進するホルモンである。糖尿病患者は血糖値をしばしばモニターしなければならなく、多くの患者は生存するために毎日複数回のインスリン注射を必要とする。しかし、かかる患者が、インスリン注射によって理想的なグルコースレベルに達成するのはまれである（Ｔｕｒｎｅｒ， Ｒ Ｃ ｅｔ ａｌ．， ＪＡＭＡ ２８１ ２００５（１９９９））。その上、インスリンレベルの上昇が長期間にわたると、有害な副作用、たとえば低血糖ショックおよびインスリンに対する身体反応の低下等をもたらすこともあり得る。したがって、糖尿病患者は、長期的合併症、たとえば心血管疾患、腎臓疾患、失明、神経損傷および創傷治癒障害等を依然として発症する（ＵＫ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ） Ｇｒｏｕｐ， Ｌａｎｃｅｔ ３５２， ８３７（１９９８））。
【０１３１】
本発明の方法によって処置可能な障害としては、高血糖状態、たとえば、インスリン依存性（１型）糖尿病またはインスリン非依存性（２型）糖尿病、ならびに高血糖状態と関連するまたは高血糖状態に起因する生理的状態もしくは障害がある。このように、本発明の方法によって処置可能な高血糖状態は、慢性または急性の高血糖症（たとえば糖尿病）と関連する病理組織学的変化を含む。特定の例としては、膵臓の変性（β−細胞崩壊）、腎尿細管石灰化、眼損傷（糖尿病性網膜症）、糖尿病性足病変、口および歯茎等の粘膜潰瘍、過度の出血、血液凝固または創傷治癒の遅延、ならびに冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、脂質異常症、高血圧症および肥満症のリスクの増加が挙げられる。
【０１３２】
対象組成物は、グルコースの低下、グルコース耐性の改善、高血糖状態（たとえば糖尿病）の処置、または高血糖状態と関連するまたは高血糖状態に起因する生理障害の処置にとって有用である。かかる障害としては、たとえば、糖尿病性神経障害（自律神経性）、腎症（腎障害）、皮膚感染症および他の皮膚疾患、損傷もしくは創傷の治癒の低下または遅延（たとえば糖尿病性のカルブンケルをもたらす）、失明にいたる眼損傷（網膜症、白内障）、糖尿病性足病変、および歯周炎の加速化が挙げられる。このような障害には、冠動脈心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、脂質異常症、高血圧症および肥満症のリスクの増加も挙げられる
【０１３３】
本明細書で使用するとき、被験者の状態に関して使われるとき、用語「高血糖性」または「高血糖症」とは、被験者の血液中に存在する一過性または慢性的に異常に高いレベルのグルコースを意味する。この状態は、グルコース代謝または吸収の遅延によって引き起こされ得る。その結果被験者がグルコース不耐性または健常被験者において通常は見られないグルコースが上昇した状態を示す（たとえば、糖尿病を発症するリスクがあるグルコース不耐性のサブ糖尿病被験者において、または糖尿病被験者において）。空腹時血糖値（ＦＰＧ）レベルは、正常血糖の場合は約１１０ｍｇ／ｄＬ未満であり、グルコース代謝障害の場合は約１１０〜１２６ｍｇ／ｄＬであり、糖尿病の場合は、約１２６ｍｇ／ｄＬを超える。
【０１３４】
腸粘膜組織でのタンパク質産生による処置可能な障害には、肥満または望ましくない体重も含まれる。レプチン、コレシストキニン、ＰＹＹおよびＧＬＰ−１は、空腹感を減少させ、エネルギー消費を増加させ、体重減少を誘発し、または正常なグルコース恒常性を維持する。このように、種々の実施形態では、肥満もしくは望ましくない体重、または高血糖症を処置する本発明の方法は、レプチン、コレシストキニン、ＰＹＹまたはＧＬＰ−１をコードする治療用核酸の使用を含む。処置可能な障害としては、通常肥満と関連するもの、たとえば異常に高い血清／血漿ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、コレステロール、血管の狭窄もしくは閉塞を引き起こすプラーク形成、高血圧症／脳卒中、冠動脈心疾患等のリスク増加も挙げられる。グレリンは食欲および空腹感を増加させる。このように、種々の実施形態では、肥満もしくは望ましくない体重、または高血糖症を処置する本発明の方法は、グレリンの拮抗剤の使用を含む。一実施形態では、拮抗剤はグレリンを目標とする治療用ＲＮＡである。
【０１３５】
本明細書で使用するとき、用語「肥満の」または「肥満」とは、年齢および性別が対応した健常被験者と比較すると、少なくとも３０％の体重増加を有する被験者をいう。「望ましくない体重」とは、対応する健常な被験者よりも１％〜２９％多い体重を有する被験者、ならびに体重に関しては正常であるが、その体重を減少させたい、または増加を防止したいと願う被験者をいう。
【０１３６】
一実施例では、本発明の治療用タンパク質は、グルカゴン拮抗剤である。グルカゴンは、膵島のα細胞によって産生されるペプチドホルモンであり、かつグルコース代謝の主要な制御因子である（Ｒ Ｈ ＆ Ｏｒｃｉ Ｌ Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３０４ １５１８（１９８１）， Ｕｎｇｅｒ Ｒ Ｈ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２５ １３６ （１９７６）に基づく）。インスンと同様に、血中グルコース濃度は、グルカゴン分泌を媒介する。しかし、インスリンと対照的に、グルカゴンは血中グルコースの低下に応答して分泌される。したがって、グルカゴンの循環する濃度は、絶食期間に最も高く、食事の間に最も低い。グルカゴンレベルは増加して、グルコース貯蔵を促進することからインスリンを抑え、かつ肝臓を刺激してグリコースを血中に放出させる。グルカゴン拮抗剤の具体的な例は、［ｄｅｓ−Ｈｉｓ1、ｄｅｓ−Ｐｈｅ6、Ｇｌｕ9］グルカゴン−ＮＨ2である。ストレプトゾトシン糖尿病ラットにおいて、血中グルコースは、このグルカゴン拮抗剤の静脈内ボーラス（０．７５μｇ／ｇ体重）から１５分以内に３７％低下した（Ｖａｎ Ｔｉｎｅ Ｂ．Ａ．ら Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３３１６（１９９６））。さらに、種々の実施形態では、糖尿病すなわち高血糖症を処置するための本発明の方法は、膵臓からのグルカゴン産生のレベルを低下させるために、治療用ＲＮＡの使用を含む。
【０１３７】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置することに有用な本発明の治療用タンパク質または、グカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である。ＧＬＰ−１は、食事中、腸内のＬ−細胞から放出されるホルモンであり、膵臓β細胞を刺激してインスリン分泌を増加させる。ＧＬＰ−１は、さらなる活性を有し、そのため肥満および糖尿病を処置する治療薬として興味あるものになる。たとえば、ＧＬＰ−１は胃内容排出を減少させ、食欲を抑制し、グルカゴン濃度を低下させ、β細胞質量を増加させ、グルコース依存様式でインスリンの生合成および分泌を刺激し、インスリンに対する組織感受性をおそらく高める（Ｋｉｅｆｆｅｒ Ｔ．Ｊ．， Ｈａｂｅｎｅｒ Ｊ．Ｆ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ Ｒｅｖ ２０ ８７６（２０００））。したがって、食事と同時起こる腸内でのＧＬＰ−１の調節放出は、高血糖状態または望ましくない体重に対して治療効果をもたらすことができる。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）に耐性があるＧＬＰ−１類似体は、より長い作用時間および治療効果をもたらす。したがって、ＧＬＰ−１類似体は好ましい治療用ポリペプチドである。さらに、種々の実施形態では、糖尿病すなわち高血糖症を処置するための本発明の方法は、ＤＰＰ ＩＶ拮抗剤の使用を含む。一実施形態では、拮抗剤は、ＤＰＰ ＩＶをを標的とする治療用ＲＮＡである。
【０１３８】
別の実施形態では、高血糖状態を処置することに有用な本発明の治療用タンパク質は、ホルモンレジスチンに対する拮抗剤である。レジスチンは、食事性肥満および遺伝型肥満においてその発現が上昇する脂肪細胞由来因子である。循環するレジスチンを中和することで、肥満マウスにおいて血中グルコースおよびインスリン作用が改善される。逆に、正常なマウスにレジスチンを投与すると、グルコース耐性およびインスリン作用が損なわれる（Ｓｔｅｐｐａｎ ＣＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９；３０７（２００１））。したがって、腸でレジスチンの生物学的効果を拮抗するタンパク質が産生されると、肥満に連結したインスリン耐性および高血糖状態に対する有効な治療をもたらすことができる。さらに、種々の実施形態では、糖尿病すなわち高血糖を処置するための本発明の方法は、治療用ＲＮＡを用いて、脂肪組織でレジスチン発現のレベルを低下させることを含む。
【０１３９】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置することに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、レプチンである。主として脂肪細胞によって産生されるが、レプチンは胃でも食事依存様式でより少ない量でに産生される。レプチンは、脂肪細胞代謝および体重についての情報を脳内の食欲中枢にリレーし、脳は食物摂取を減少させるシグナルを送って（満腹感を促進する）、身体エネルギー消費を増加させる。
【０１４０】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置するのに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、脂肪細胞の補体関連のタンパク質（Ａｃｒｐ３０）のＣ末端の球状ヘッドドメインである。Ａｃｒｐ３０は、分化した脂肪細胞によって産生されるタンパク質である。マウスに対する球状ヘッドドメインからなるＡｃｒｐ３０のタンパク質分解切断生成物をマウスに投与すると、有意な体重減少がもたらされる（Ｆｒｕｅｂｉｓ Ｊ らＰｒｏｃ ＮａｔＬ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８ ２００５ （２００１））。
【０１４１】
別の実施形態では、高血糖状態または望ましくない体重（たとえば肥満）を処置することに有用な本発明の治療用ポリペプチドは、コレシストキニン（ＣＣＫ）である。ＣＣＫは、腸内で特定の栄養分に応答して腸から分泌される消化管ペプチドである。ＣＣＫ放出は、消費される食物の量と比例し、脳に食事を終了するシグナルを送ると考えられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｍ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０４；６６１−７１（２０００））。したがって、ＣＣＫｎｏ上昇は食事量を減らすことができ、体重減少または体重安定化を促進することができる（すなわち、体重増加の上昇を防止する、または阻害する）。
【０１４２】
ＰＹＹに関しては、たとえばＩｅ Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎｕｔｒ Ｓｏｃ ２００５ Ｍａｙ，６４（２）２１３−６を参照されたい。
【０１４３】
免疫障害
【０１４４】
一実施例では、本発明の治療用タンパク質は、免疫調節性活性を備えている。たとえば、本発明の治療用ポリペプチドは、免疫細胞の増殖、分化または動員（化学走性）を活性化する、または阻害することによって、免疫系の不全および障害を処置するのに有用であり得る。免疫細胞は血球新生のプロセスを通じて発現し、多能性幹細胞から骨髄系細胞（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）ならびにリンパ球系細胞（Ｂリンパ球細胞およびＴリンパ球細胞）を産生する。これらの免疫不全または障害の病因は、遺伝子性、体細胞性、感染性、またはその他であり得る。
【０１４５】
本発明の治療用ポリペプチドは、造血細胞の不全または障害を処置することに有用であり得る。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、いくつかの（または多く）の造血細胞の種類の減少に係る造血細胞障害を処置する目的で、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化または増殖を増加させることが可能である。、免疫不全症候群の例としては、血液タンパク質質障害（たとえば、無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調症、分類不能型免疫不全症、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染症、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染症、白血球粘着不全症候群、リンパ球減少症、貪食殺菌機能障害、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ障害、貧血症、血小板減少症、またはヘモグロビン尿症が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４６】
本発明の治療用ポリペプチドは、自己免疫障害を処置することにも有用であり得る。多くの自己免疫不全は、免疫細胞が自己を異物として不適当に認識することから生じる。この不適当な認識は、宿主組織の破壊をもたらすことになる免疫応答に起因する。したがって、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または化学走性を阻害する本発明の治療用ポリペプチドを投与することは、自己免疫障害を防止する有効な治療になり得る。
【０１４７】
本発明によって治療されることができる自己免疫不全の例としては、Ａｄｄｉｓｏｎ病、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群、Ｇｒａｖｅｓ病、多発性硬化症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡 、天疱瘡、多腺性内分泌障害 、紫斑病、Ｒｅｉｔｅｒ病、全身硬直症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫肺炎症、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群、インシュリン依存性糖尿病、Ｃｒｏｈｎ病、潰瘍性大腸炎、および自己免疫性炎症性眼病が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４８】
同様に、アレルギー性反応および状態、たとえば喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸障害は、本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る。さらに、これらの分子を用いて、アナフィラキシ、抗原分子に対する過敏症または血液型不適合を処置することができる。
【０１４９】
本発明の治療用ポリペプチドは、臓器拒絶反応または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置するおよび／または阻止することもある。臓器拒絶反応は、免疫応答を通して移植組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにも関与しているが、この場合は、異質移植された免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答を阻害する、特にＴ細胞の増殖、分化または化学走性を阻害する本発明の治療用ポリペプチドを投与することで、臓器拒絶反応またはＧＶＨＤを阻止するのに有効な治療になり得る。
【０１５０】
凝固障害
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、止血活性（出血の阻止）または血栓溶解活性（凝固形成）を調節することも可能である。たとえば、止血活性または血栓溶解活性を増加させることによって、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、血液凝固障害（たとえば、無フィブリノゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（たとえば、血小板減少症）、または外傷、手術、もしくは他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血活性または血栓溶解活性を減少させることができる、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、凝固を阻害するまたは溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、脳卒中または瘢痕の処置において重要であり得る。一実施例では、本発明の治療用ポリペプチドは凝固因子であり、血友病または他の凝固／凝固障害（たとえば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第Ｘ因子）の処置に有用である。
【０１５２】
感染症
【０１５３】
一実施例では、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、感染症を処置することができる。たとえば、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化を増加させて、免疫応答を増加させることによって、感染症は処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を強化するか、または新しい免疫応答を開始することによって増加し得る。あるいは、必ずしも免疫応答を誘発することなく、本発明の治療用ポリペプチドは、感染病原体を直接阻害することも可能である。
【０１５４】
本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る疾患または症状を引き起こし得る感染病原体の一例はウイルスである。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルス系統群が挙げられるがこれらに限定されない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビマウイルス科、ビニヤウイルス科、カリチウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科（たとえば、サイトメガロウイルス属、単純ヘルペス、帯状ヘルペス）、モノネガウイルス（たとえば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラプドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（たとえば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（たとえば、天然痘またはワクシニア）、レオウイルス科（たとえば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガウイルス科（たとえば、ルビウイルス属）。これらの系統群に含まれるウイルスは、関節炎、細気管支炎、脳炎、眼感染症（たとえば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、髄膜炎、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ）、肺炎、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ 、狂犬病、感冒、小児麻痺、風疹、性感染病、皮膚病（たとえば、カポジ、いぼ）、およびウイルス血症が挙げられる。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置することができる。
【０１５５】
同様に、疾患または症状を引き起す可能性があり、かつ本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る、または検出され得る、細菌病原体または真菌病原体としては、以下のグラム陰性菌およびグラム陽性菌の系統群ならびに真菌類が挙げられるがこれらに限定されない：放線菌目（たとえば、コリネバクテリウム、マイコバクテリア、放射菌）、アスペルギルス、バチルス科（たとえば、炭疽菌、クロストリジウム）、バクテロイド科、ブラストミセス、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ、カンジダ、カンピロバクター、コクシジオイデス症、クリプトコッカス、皮膚真菌症、腸内細菌科（クレブシエラ属、サルモネラ菌、セラチア属、エルシニア属）、エリジペロスリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア属、マイコプラズマ目、ナイセリア科（たとえば、アシネトバクター属、ゴノレア、髄膜炎菌）、パスツレラ科感染症（たとえば、アクチノバシラス属、ヘモフィルス属、パスツレラ属）、シュードモナス属、リケッチア科、クラミジア科、梅毒、およびブドウ球菌。これらの細菌または真菌の系統群は、以下の疾患または症状の原因になり得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核症、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ関連の感染症）、爪周囲炎、人工器官関連の感染症、Ｒｅｉｔｅｒ病、気道感染症（たとえば、百日咳または膿胸）、敗血症、ライム病、ネコ引っかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、らい、パラ結核、結核、ループス、ボツリヌス症、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（たとえば、蜂巣炎、皮膚真菌症）、毒素血症、尿路感染症、創傷感染。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置し得る。
【０１５６】
さらに、本発明の治療用ポリペプチドによって処置され得る疾患または症状を引き起こす寄生虫病原体としては以下の系統群が挙げられるが、これらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外寄生生物、ジアルジア症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリバノソーマ症、およびトリコモナス。これらの寄生虫は、疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（たとえば、赤痢、ジアルジア症）、肺疾患、日和見感染（たとえば、ＡＩＤＳ関連感染症）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症を含む種々の疾患または症状を引き起こし得る。本発明の治療用ポリペプチドを用いて、これらの症状または疾患のいずれかを処置し得る。
【０１５７】
再生
【０１５８】
本発明の治療用ポリペプチドを用いて、組織の再生を育成する細胞を分化、増殖、誘引させることができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６；５９−８７（１９９７）を参照されたい）。組織の再生を用いて、先天欠損、外傷（創傷、火傷、切開、もしくは潰瘍）、加齢、疾患（たとえば、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周疾患）、美容形成術を含む外科手術、線維症、再灌流障害、または全身性サイトカイン損傷によって損傷をうけた組織の修復、置換、または保護することができる。
【０１５９】
本発明の治療用タンパク質の寄与により再生し得る組織としては、器官（たとえば、膵臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、血管（血管内皮を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）組織を含む。再生は、わずかな瘢痕を伴う、または瘢痕を伴わずに生じることが好ましい。再生は血管形成を含んでもよい。
【０１６０】
さらに、本発明の治療用ポリペプチドは、治癒しにくい組織の再生を増大させることができる。たとえば、腱／靭帯の再生が増大すると、損傷の後の回復時間を速める。本発明の治療用ポリペプチドは損傷を回避する目的で、予防的にも使用され得る。処置され得る具体的な疾患としては、腱炎、（手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損を含む。難治性創傷の組織再生のさらなる例としては褥瘡、血行不全、手術創、および外傷に付随した潰瘍を含む。
【０１６１】
同様に、神経および脳組織も、本発明の治療用ポリペプチドを用いて、神経細胞を増殖、分化させることによって、再生され得る。本方法を用いて処置され得る疾患としては、中枢および末梢神経系疾患、神経障害、または機械性障害および外傷性障害（たとえば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および脳卒中）が挙げられる。具体的には、末梢神経損傷に付随する疾患、末梢神経障害、限局性神経障害、および中枢神経系疾患（たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイドレーガー症候群）はすべて、本発明の治療用タンパク質を用いて処置され得る。ＣＮＳ障害に関して、当該技術分野では脳組織へ治療アクセスを容易にするための方法、たとえば、血液脳関門を破壊するための方法と、ＣＮＳへの輸送を提供する部分に治療薬を結合させる方法とを含むいくつがが知られている。一実施形態では、治療用核酸は、融合タンパク質をコードするように設計され、融合タンパク質は輸送部分および治療用タンパク質を含む。
【０１６２】
走化性
【０１６３】
一実施例では、本発明の治療用ポリペプチドは、走化活性を有する。走化性分子は、体内の特定の部位、たとえば炎症または感染の部位に、細胞（たとえば単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞）を誘引するまたは動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常を移動性を持つ細胞は、それから特定の外傷または異常物を撃退する、および／または治癒する。
【０１６４】
本発明の治療用ポリペプチドは、特定の細胞の走化活性を増大させ得る。次いで、これらの走化性分子を用いて、体内の特定の部位を標的とする細胞の数を増加させることによって、炎症、感染症、またはいずれかの免疫系障害を処置することができる。たとえば、走化性分子を用いて、免疫細胞を損傷部位へ誘引することによって、組織への創傷および他の外傷を処置することができる。本発明の走化性分子は、線維芽細胞も誘引することができ、この線維芽細胞を用いて創傷を処置することができる。
【０１６５】
本発明の治療用ポリペプチドが走化活性を阻害し得ることも考えられる。これらの分子を用いて、様々な障害を処置することもできる。このように、本発明の治療用ポリペプチドは、走化性の阻害剤として使用し得る。
【０１６６】
標的組織の近傍で活性化されるプロ治療用タンパク質の使用が特に好まれる。
【０１６７】
使用が考えられるさらなる治療用ポリペプチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：成長障害または消耗症症候群を処置するための成長因子（たとえば、成長ホルモン、インスリン様成長因子１、血小板由来成長因子、上皮増殖因子、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−β等）；および外来抗原もしくは外来病原体（たとえばピロリ菌）から被験者を保護する、もしくは受動免疫を与えるため、または関節炎もしくは循環器疾患の処置を提供するための抗体（たとえばヒトまたはヒト化抗体）；サイトカイン、インターフェロン（たとえば、インターフェロン（ＩＮＦ）、ＩＮＦ−α２ｂおよびＩＮＦ−α２ａ、ＩＮＦ−αＮ１、ＩＮＦ−β１ｂ、ＩＮＦ−γ）、インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、ケモカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ポリペプチドホルモン、抗菌ポリペプチド（たとえば抗菌の、抗真菌の、抗ウイルスの、および／または、抗寄生虫のポリペプチド）、酵素（たとえば、アデノシンデアミナーゼ）、ゴナドトロピン、ケモタクチン、脂質結合タンパク質、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、ヘモグロビン、エリスロポイエチン、インシュリノトロピン、イミグルセラーゼ、サルグラモスチム、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アデノシンデアミダーゼ、カタラーゼカルシトニン、エンドセリン、Ｌ−アスパラギナーゼペプシン、ウリカーゼトリプシン、キモトリプシンエラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ内因子、カルシトニン副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）様ホルモン、可溶性ＣＤ４、ならびに抗体および／またはその抗原結合性フラグメント（たとえばＦＡｂ）（たとえば、オルソクローンＯＫＴ−ｅ（抗ＣＤ３）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩａモノクローナル抗体）。
【０１６８】
ワクチン接種
【０１６９】
一実施形態では、本発明は患者にワクチン接種をするための方法を提供する。方法は、所望のエピトープを生成することができる本発明の組成物を投与することを含む。好ましい実施形態では、組成物は、エピトープを含むタンパク質を発現することができる治療用核酸コンストラクトを含む。
【０１７０】
化粧品応用
【０１７１】
一実施形態では、本発明は、化粧品使用のための組成物を提供する。化粧品は、化粧品使用に適した製剤中に、本発明のキトサン−核酸ポリプレックス組成物を含む。
【０１７２】
粉末製剤
【０１７３】
本発明のキトサン−核酸ポリプレックス組成物は散剤を含む。好ましい実施形態では、本発明は乾燥散剤キトサン−核酸ポリプレックス組成物を提供する。好ましい実施形態では、乾燥散剤キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、本発明のキトサン−核酸ポリプレックス分散液を脱水させることで生成される。凍結乾燥方法には、凍結乾燥および噴霧乾燥が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７４】
一実施形態では、濃縮分散液は脱水され、次いで続いて、必要に応じて再水和した後、ｐＨが調整される。たとえば、一実施形態では、最初に、４．５を超えるｐＨ値を有する濃縮分散液が脱水され、次いで再水和後、ｐＨ値は３．５〜４．５で調整される。別の実施形態では、ｐＨ調整は必要とされず、再水和された組成物は４．５未満のｐＨ値を有する。
【０１７５】
医薬製剤
【０１７６】
本発明も、本発明の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物を含む「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」製剤を提供する。この製剤は、治療法を施すために、被験者にインビボで投与され得る。
【０１７７】
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される」および「生理学的に許容される」とは、好ましくは過剰な有害副作用（たとえば、嘔気、腹痛、頭痛等）を引き起こすことなく、被験者に投与されることができる担体、希釈剤、賦形剤をいう。投与のためのこの製剤は、無菌の水溶液剤または非水溶液剤、懸濁液剤、および乳濁液剤を含む。
【０１７８】
医薬製剤は、被験者への投与に適合した、担体、希釈剤、賦形剤、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことができる。かかる製剤は、錠剤（被覆型もしくは非被覆型）、カプセル（ハードタイプもしくはソフトタイプ）、ミクロビーズ、乳剤、粉末、顆粒、結晶、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤に含有され得る。他の添加剤のなかで、補助活性化合物および剤防腐剤も、たとえば抗菌物質、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等で含まれてもよい。
【０１７９】
医薬製剤は、その意図される投与経路に適合するように製剤化され得る。対象組成物は、粘膜上皮組織のトランスフェクションに適切である。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、粘膜上皮組織への投与に適した製剤である。
【０１８０】
経口投与の場合、組成物を賦形剤と組み合わせて、錠剤、トローチ、またはカプセル（たとえばゼラチンカプセル）の形状で用いることができる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバンド材を経口製剤に含有させることもできる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分、または類似の自然の化合物のいずれかを含有することができる：結合剤、たとえば結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、たとえばデンプンもしくはラクトース；崩壊剤、たとえばアルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；潤滑剤、たとえばステアリン酸マグネシウムもしくはステロート；滑剤、たとえばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、たとえばショ糖もしくはサッカリン；または香味剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくは調味料。
【０１８１】
製剤は、体内から組成物を急速に分解または除去することから保護する担体、たとえばインプラントおよびマイクロカプセル型送達系を含む徐放製剤も含むことができる。たとえば、モノステアリン酸グリセリンもしくは単体のステアリン酸グリセリル等、またはワックスと組み合わせて時間遅延材料を用いてもよい。
【０１８２】
坐薬および他の直腸投与型製剤（たとえば、浣腸で投与可能なもの）も考えられる。さらに直腸送達に関しては、たとえば以下を参照されたい：Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｃｏｓａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ， ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ， ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．， ２１：１９５−２５６， ２００４， Ｗｅａｒｌｅｙ， Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｒｏｕｔｅｓ， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．， ８：３３１−３９４， １９９１。
【０１８３】
投与に適したさらなるな医薬製剤は、当該技術分野で知られており、本発明の方法および組成物に適用できる（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９０） １８ｔｈ ｅｄ ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．； Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ （１９９６） １２ｔｈ ｅｄ ， Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ， Ｎ．Ｊ．，およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ｌｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， Ｐａ．，（１９９３）を参照されたい）。
【０１８４】
投与
【０１８５】
いくつかの投与経路のうちのいずれかが可能であり、特定の経路を選択することは、標的組織に一部依存することになる。上皮組織への投与が好まれる。特に好ましい投与は、消化管、気道、肺、副鼻洞空洞、口腔、尿路、膀胱、膣、子宮、頸部、眼、食道、唾液腺、鼻喉頭組織、腎臓、喉頭／咽頭、および皮膚からなる群から選択される上皮組織への投与のである。
【０１８６】
シリンジ、内視鏡、カニューレ、挿管チューブ、浣腸キット、カテーテル、ネブライザー、吸入器および他の物品が、投与のために使用され得る。
【０１８７】
被験者を処置するための「有効量」の用量は、障害もしくは状態、または症状の進行もしくは悪化を防止するまたは阻害することが満足のいく結果であるが、好ましくは、状態の症状のうちの１つ、いくつかもしくはすべてを、測定可能な程度または検出可能な程度まで、回復させるのに十分な量である。このように、標的組織において治療用核酸を発現させることによって処置可能な状態または障害の場合、本発明の方法によて処置可能な状態を回復させるために生成される治療用タンパク質の量は、状態および所望の結果に依存し、当業者によって容易に確認され得る適切な量は、治療される上体、所望の治療効果、ならびに個々の被験者（たとえば、被験者内のビオアベイラビリティ、性別、年齢等）に依存することになる。有効量は、関連する生理的効果を測定することによって確認されることができる。
【０１８８】
獣医臨床への応用は、本発明によっても考えられる。したがって、一実施形態では、本発明は非ヒト哺乳類を処置する方法を提供する。方法は、処置を必要とする非ヒト哺乳類に本発明の組成物を投与することを含む。
【０１８９】
経口投与
【０１９０】
本発明の化合物は、経口投与されてもよい。経口投与は嚥下を含むこともあり、そのため化合物は消化管に入る。本発明の組成物は、直接消化管に投与されることもある。
【０１９１】
経口投与に適した製剤としては、錠剤などの固形剤、微粒子剤を含有するカプセル剤、液剤、または散剤、トローチ剤（液剤を充填したものを含む）、咀嚼剤、多微粒子剤およびナノ微粒子剤、ゲル剤、フィルム剤、オビュール剤、および噴霧剤が挙げられる。
【０１９２】
液剤は、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。液剤は、固形剤の再構成によって調製され得る。
【０１９３】
錠剤は、通常、崩壊剤を含む。崩壊剤の例としては、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、線維素グリコール酸カルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、結晶セルロース、低アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプンおよびアルギン酸ナトリウムを含む。通常、崩壊剤は、剤形の１重量％〜２５重量％、好ましくは５重量％〜２０重量％で含まれる。
【０１９４】
結合剤は、凝集性品質を錠剤に与えるのに通常用いられる。適切な結合剤としては、結晶セルロース、ゼラチン、糖類、ポリエチレングリコール、天然および合成のゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。錠剤は、希釈剤、たとえばラクトース（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物等）、マンニトール、キシリトール、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、結晶セルロース、デンプンおよびリン酸水素カルシウム二水和物を含み得る。
【０１９５】
錠剤は、また、界面活性剤（たとえば、硫酸ラウリルナトリウムおよびポリソルベート８０）と、滑剤（たとえば、二酸化ケイ素およびタルク）とを任意に含み得る。存在する場合、界面活性剤は、錠剤の０．２重量％〜５重量％、および滑剤は、錠剤の０．２重量％〜１重量％を含み得る。
【０１９６】
錠剤は通常、潤滑剤、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、フマル酸ステアリルナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物も含む。潤滑剤は通常、錠剤の０．２５重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜３重量％を含む。
【０１９７】
他の可能な成分としては、抗酸化剤、着色剤、香味料および調味料、防腐剤、唾液刺激剤、冷却剤、共溶媒（油を含む）、皮膚軟化剤、増量剤、消泡剤、表面活性物質および矯味剤が挙げられる。
【０１９８】
錠剤混合物を、直接、またはローラーで圧縮して、錠剤を形成し得る。あるいは錠剤混合物または混合物の部分は、錠剤化の前に、湿式顆粒化、乾式顆粒化、もしくは溶融顆粒化、溶融凝固、または押出しを行われ得る。最終的な製剤は１層または複数層を含こともあり、かつコーティングまたは非コーティングされることもある。最終的な製剤は、カプセル化されることさえあり得る。
【０１９９】
錠剤の剤形は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ， Ｖｏｌ． １， ｂｙ Ｈ． Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｌ． Ｌａｃｈｍａｎ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８０）に記載されている。
【０２００】
ヒトまたは動物での使用のための消滅する経口フィルム剤は、通常は、成形しやすい水溶性もしくは水膨張性の薄膜剤形であり、急速に溶けるか、または粘膜付着性であり得、かつ通常は、フィルム形成ポリマー、結合剤、溶媒、湿潤剤、可塑剤、安定剤または乳化剤、粘度調節剤および溶媒を含む。製剤の一部の構成要素は、複数の機能を実行し得る。
【０２０１】
本発明では、本発明の組成物を含む多微粒子ビーズも含まれる。
【０２０２】
本発明によるフィルム剤は、通常、剥離可能な裏打ち支持体または紙上に被覆された薄い水性フィルム剤の蒸発乾燥によって調製される。これは、乾燥オーブンもしくはトンネル、通常は複合型コータードライヤー、または凍結乾燥もしくは真空化によって行われ得る
【０２０３】
経口投与のための固形剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節製剤には、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型の製剤が含まれる。
【０２０４】
高エネルギー分散ならびに浸透粒子および被覆粒子等の他の適切な放出技術が知られている。
【０２０５】
非経口投与
【０２０６】
非経口投与のための適切な方法としては、静脈、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、皮下への投与挙げられる。非経口投与の適切な装置は、針（マイクロニードルを含む）注射器、針のない注射器、および注入技法を含む。
【０２０７】
非経口製剤は通常、塩類、炭化水素および緩衝剤等の賦形剤を含み得る水溶液剤である。しかし、一部の適用では、非経口製剤は、無菌の非水溶液剤として、または発熱物質を含まない無菌の水等の適切な溶媒と組み合わせて使用される乾燥形状として、より適切に製剤化され得る。
【０２０８】
無菌条件下での、たとえば、濾過除菌法による非経口製剤の調製は、当業者にとって周知の標準的な製薬技法を用いて、容易に達成され得る。
【０２０９】
点滴製剤の調製で用いられる化合物の溶解性は、適当な製剤技法、たとえば溶解性増強剤を組み入れることで増大させてもよい。
【０２１０】
非経口投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。このように、本発明の化合物は、活性化合物の調節放出を提供する埋め込み型デポーとして投与のための固形剤、半固形剤、またはチキソトロピー液剤として製剤化され得る。
【０２１１】
局所投与
【０２１２】
本発明の化合物は、皮膚または粘膜に局所的に、すなわち真皮的に、または経皮的に投与されてもよい。この目的のための典型的製剤は、ゲル剤、ヒドロゲル剤、ローション剤、溶液、クリーム剤、軟膏、散布剤、包帯剤、フォーム剤、フィルム剤、皮膚パッチ、ウエハー、インプラント、スポンジ、繊維、包帯およびマイクロエマルジョン剤を含む。
【０２１３】
局所投与の他の方法は、電気穿孔法、イオントフォレーシス、フォノフォレシス、ソノフォレーシスおよびマイクロニードルまたは無針注射（たとえば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）等）による送達を含む。
【０２１４】
局所投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。
【０２１５】
吸入投与／鼻腔内投与
【０２１６】
また、本発明の化合物は、通常、乾燥散剤（単体、または混合剤（たとえば、ラクトースとの乾性混合で、または混合成分粒子として）のいずれか）の形状で、適切な噴霧剤を使用した、または使用しない、乾燥散剤吸入器から、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザ、もしくはネブライザーからのエアゾールスプレーとして、鼻腔内にまたは吸入によって投与され得る。
【０２１７】
吸入器または散布器に使用するカプセル、ブリスターおよびカートリッジは、本発明の化合物の混合粉末、適切な散剤基剤（たとえばラクトースまたはデンプン）、および性能修飾因子（たとえばｌ−ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウム）を含有するように製剤化され得る。
【０２１８】
吸入投与／鼻腔内投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。
【０２１９】
直腸投与／膣内投与
【０２２０】
本発明の化合物は直腸に、または、膣内に、たとえば坐薬、ペッサリー、または浣腸の形で投与され得る。カカオバターは従来からの座薬基剤であるが、必要に応じて種々の代替物が使われ得る。
【０２２１】
直投与／膣内投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、および計画放出型が含まれる。
【０２２２】
眼内投与／耳内投与
【０２２３】
本発明の化合物は、通常は、滴下剤の形で、直接、眼または耳にも投与され得る。眼内および耳内の投与に適した他の製剤としては、軟膏、生分解性の（たとえば、吸収されるゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性の（たとえばシリコーン）インプラント系、ウエハー系、レンズ系、および微粒子系が挙げられる。製剤は、イオントフォレーシスによって届けられる可能性もある。
【０２２４】
眼内投与／耳内投与のための製剤は、即放性および／または放出調節性になるよう製剤化され得る。放出調節性製剤としては、遅延放出、徐放、パルス放出、制御放出、標的放出、または計画放出型が含まれる。
【０２２５】
実験
【表２】
【０２２６】
ポリプレックス組成物のインライン混合および濃縮のための材料および方法についてのさらなる記載は、国際公開第２００９／０３９６５７号を参照されたい。公開は参照によりその全体を本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２２７】
ポリプレックス製剤の命名規則
【表３】
【０２２８】
１Ｌバッチの製造、それに続くＴＦＦ濃縮の一般的なプロセスブロック図を図２に示す。
【０２２９】
小規模のインライン混合
【０２３０】
簡単な小規模のインライン混合装置を、シリンジポンプ、内径１／１６インチのシリコーンチューブ；および内径３／３２インチのＹ字構造体のポリプロピレンジャンクションを用いてテストした。３ｍＬ容量のシリンジおよびＹ字ジャンクションを用いる配置の模式図を図３に示す。この配置の場合、シリンジの最大容量が６０ｍＬであることに留意されたい。このプロセスを使用して、２４ｍｅｒ／９８％ＤＤＡキトサンを用いて、ＮＰ比２０で１５０μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度のポリプレックスを作製した。ＤＮＡおよびキトサンの原料を、体積比２：１で混合して、均一なポリプレックス製剤を生成した。
【０２３１】
中規模のインライン混合
【０２３２】
簡単な中規模のインライン混合装置を、蠕動ポンプ、内径３／１６インチのシリコーンチューブ；および内径３／１６インチのＹ字構造体のポリプロピレンジャンクションを用いてテストした。Ｙ字ジャンクションを用いる配置の模式図を図４に示す。この配置の場合、最大生成量は原料容器の容量によってのみ限定されることに留意されたい。このプロセスを使用して、２４ｍｅｒ／９８％ＤＤＡキトサンを用いて、ＮＰ比２０で、１５０μｇ／ｍＬの最終ＤＮＡ濃度のポリプレックスを作製した。ＤＮＡおよびキトサンの原料を、体積比２：１で混合して、均一なポリプレックス製剤を生成した。
【０２３３】
ＴＦＦプロセス（濃縮）
【０２３４】
ＴＦＦ試験を行う前に、製造業者の説明書に従ってホローファイバーフィルターを洗浄して、清浄した。
【０２３５】
ＴＦＦ濃縮＃１
【０２３６】
濃縮を実行するために、ＴＦＦ系を概略図（図５）に示すように設定して、残留水を取り除いた。透過バルブを閉め、次いで背圧バルブを完全に開けた後、ＤＮＡ−キトサンポリプレックスを生成物リザーバへ加えた。ポンプの電源をオンにして濃縮を開始し、完全に透過バルブを開け、その後、目標のフィルタ入口側圧力へと背圧バルブを調節した。濃縮工程中、回収された透過液の質量を秤で測定し、そして目標ＤＮＡ濃度が達成された時点を決定するために使用した。ポンプの電源を入れて、濃縮を開始し、透過バルブを全開し（次いで任意のポンプを作動させ）てから、背圧バルブを対象フィルタの入口圧力に調節した。濃縮プロセスの間に、収集した透過液の量を秤の上でモニターして、それを用いて、目標のＤＮＡ濃度が達成された時点を決定した。目標の体積減少が達成された後、透過バルブを閉じて、背圧バルブを完全に開いて、この濃縮プロセスを停止した。下記の式を参照されたい：
【数１】
【０２３７】
ＴＦＦダイアフィルトレーション
【０２３８】
一部のバッチでは、ダイアフィルトレーションステップ（緩衝交換）を、濃縮プロセスに挿入した。たとえば、０．１５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡから開始し、ポリプレックスを０．６０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで０．６０ｍｇ／ｍＬ濃度を維持しながら、ある程度の洗浄量をダイアフィルタで濾過し、次いでさらに１．２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０２３９】
ダイアフィルトレーションを実行するために、透過液出口ラインを、新しいタールを塗った収集溶液に変え、次いでバッファラインをベントポートを経て保持液容器に接続させた。これにより、大気の通気がない、密封された系を作製する。次に、透過バルブを開き、および／または透過ポンプを始動させた（上記と同じ流速）。これにより、透過液が引き出されにつれて、入れ替わりに透析バッファが保持液容器に引き入れて、保持液容器内が真空状態になる。このように、透過液が放出されるにつれて、保持液は連続的に補充されることによって一定のレベルに維持される。これは、透析プロセスである。場合によっては（系内の大気の漏れが原因で真空が不十分になったとき）、透析バッファを透過液と同じ速度で、保持液にポンプで注入した。ダイアフィルトレーションを、洗浄量（１洗浄量＝保持液の量）の目標数に対して実行した。透析を停止するために、透過液を閉じ（バルブを閉じて透過ポンプを停止させる）、次いで保持液容器を大気に開放し、バッファラインを閉じた。
【０２４０】
第２のＴＦＦ濃縮
【０２４１】
ダイアフィルトレーションの後、ＴＦＦ濃縮を再開した。目標の減少量が達成された後、透過バルブを閉じ、次いで背圧バルブを完全に開いて、濃縮プロセスを停止させた。保持液の流体ラインを一掃してから、最終生成物を収集し、このＴＦＦ後の生成物を、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイによる分析試験およびＤＮＡ濃度決定にかけた。残りを、直ちに−８０℃で貯蔵し、あるいは分析試験が完了するまで４℃で貯蔵し、その後速やかに使用するか、あるは貯蔵のために凍結させた。
【０２４２】
ＴＦＦ後のｐＨ調整
【０２４３】
別段の記載がなければ、最終ＴＦＦ後の生成物のｐＨは、ｐＨ調整バッファを加えることによって速やかにｐＨ値を調整した。バッファ組成物は、通常、ショ糖の溶液中に、酢酸および／またはキトサンを含んだ。この溶液を、４．５：９５．５の体積比でそれぞれ最終ＴＦＦ生成物に加えた。この追加の量は、ＴＦＦ後の生成物の濃度を４．５％低下させた。
【０２４４】
分析試験
【０２４５】
粒子サイズ測定
【０２４６】
粒子サイズ測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒのナノ光散乱機器を使用して行われる。記載した場合を除いて、試料は１０ｍＭのＮａＣｌ（最低０．４ｍＬ）で２０倍に希釈して、ディスポーザブルキュベットに充填した。３連での３分間の測定に先立ち、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムして、試料を２５℃で３分間インキュベートした。Ｚ−平均および多分散（ＰＤＩ）を標準偏差（ｎ＝３）を用いて報告した。希釈した試料に対しては、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムして、１０ｍＭのＮａＣｌの粘性および屈折率を用いた。
【０２４７】
ゼータ電位
【０２４８】
ゼータ電位測定を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒナノ光散乱機器を用いて行った。通常、無希釈の試料は、折り返しキャピラリーセルＺｅｔａｓｉｚｅｒ（最低０．８ｍＬ）に充填した。複製測定（複製の回数はＺｅｔａｓｉｚｅｒソフトウェアによって自動的に決定された）に先立ち、試料を２５℃で３分間インキュベートｅｔａｓｉｚｅｒをプログラムして、試料を２５℃で３分間インキュベートした。ゼータ電位値は、標準偏差（ｎ＝３）を用いて報告した。また、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒは、粘性および誘電率に関して試料の最終組成物を説明するようにプログラムされた。
【０２４９】
凍結による短期間の安定性
【０２５０】
短期安定性試験のため、ポリプレックスの最終生成物を、適当な温度（−２０℃、−３０℃または−８０℃）で一晩冷凍、貯蔵された。場合によっては、試料はドライアイス／エタノール浴槽で急速に冷凍させ、次いで適当な温度で貯蔵された。記載するように、適当な時間で試料を室温まで解凍して、分析した。
【０２５１】
キトサナーゼ消化
【０２５２】
５０μＬのポリプレックスを、５０μＬの４．４４Ｕ／ｍＬキトサナーゼを用いて３７℃で２時間消化させた。（ストックのキトサナーゼの濃度は、６２Ｕ／ｍＬであり、３７℃で、冷たい５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５で希釈した。）Ｃ（２４，９８）−Ｎ４０−ｃ７５粒子の場合、０．９０９〜１．８１８ｍＭのキトサンを消化させて、すべてのＤＮＡを放出させることが最善であり、そのため粒子を１５０ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５中、３７℃で１：１０および１：５に希釈した。
【０２５３】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによるＤＮＡの定量化
【０２５４】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイを用いてのＤＮＡ測定に先立ち、キトサナーゼによってポリプレックスから全ＤＮＡを放出しなければならない。放出に続いて、スーパーコイルＤＮＡプラスミドを線形化するために、ＤＮＡを適切な制限酵素によるＤＮＡ消化にかける。
【０２５５】
ＥｃｏＲ１消化
【０２５６】
インキュベーション後、キトサナーゼで消化した試料のうちのＸｕＬを５ｕＬのＥｃｏＲ１と、５ｕＬのＥｃｏＲ１バッファにに加え、次いでＭｉＩＩｉＱ水で最終５０ｕＬ最終的な量にした。（最終的なＤＮＡ濃度が４ｎｇ／μＬになるように、試料の量、ＸμＬを調節した。）次いで、ＥｃｏＲ１試料を３７℃で３０分間、インキュベートした。
【０２５７】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ
【０２５８】
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ Ｑｉａｎｔ−ｉＴ ｄｓ ＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙキットに、２つのバッファ（ＡおよびＢ）ならびに２つの標準（１および２）を供給した。バッファＡを１：２０でバッファＢに希釈して、溶液「Ａ／Ｂ」を作製した。標準１および２を溶液Ａ／Ｂで２０倍に希釈した（１０μＬを２００μＬに）。標準１および２の最終濃度は、それぞれ０および１０ｎｇ／μＬであった。
【０２５９】
１０〜２０μＬのＥｃｏＲ１消化試料を溶液Ａ／Ｂを用いて２００μＬの最終的な量にして、短時間ボルテックスを行い、室温で２分間インキュベートし、次いでＱｕｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ上で、製造者の説明書によって測定した。
【０２６０】
ゲル電気泳動
【０２６１】
ポリプレックスへのＤＮＡ捕獲の確認のために、試料をゲル電気泳動にかけた。
１〜５μＬ（８００ｎｇ ＤＮＡの目標）の試料アリコートと、２μＬのＴｒａｃｋｉｔ添加バッファとを組み合わせて、水を加えて最終１０μＬの量にした。標準レーンをＳｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄ ＤＮＡラダーにロードした。臭化エチジウム（５０μｇ／ｍＬ）を含有する０．８％アガロースゲル上で、１２０Ｖで４５分間、試料を分解させた。
Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いてゲルを撮像した。
【０２６２】
ＳＥＡＰアッセイ
【０２６３】
ＳＥＡＰ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｓｓａｙキットを用いてＳＥＡＰアッセイを行った。使用に先立ち、アッセイ用のすべての試薬を２５℃で３０分間、平衡化した。アッセイ用の標準は、０．１％ウシ血清アルブミンおよび５０％のグリセロールを添加したキットからの１×希釈バッファに胎盤性アルカリフォスファターゼを１ｍｇ／ｍＬまで溶解させ、次いでＤＭＥＭを用いて１０倍段階希釈によっ０．０１ｐｇ／μＬまで希釈することによって、調製した。次いで、標準および解凍した試料を、希釈バッファで１：４に希釈し、６５℃で３０分間、熱失活させて、氷上で２分間インキュベートしてから、遠心（１６１００×ｒｃｆ、室温で２分間）させて、その上清を新しい管に移した。２５℃で５分間，平衡化してから、５０μＬの試料および標準を、２連のＭｉｃｒｏｌｉｔｅ−１プレートの各ウェルに加えた。次いで、失活バッファ（５０μＬ）を各ウェルに加えてから、静かに上下にピペッティングすることにより、気泡を作らぬように混合させて、５分間インキュベートした。基質とエンハンサーを１：１９の比で５分間インキュベートして、基質／エンハンサー試薬を調製した。次いで、この基質／エンハンサーを各ウェルに加えて、２０分間インキュベートして、プレートをルミノメータで１秒間の積分時間で読み込んだ。
【０２６４】
ニンヒドリンアッセイ（全キトサン）
【０２６５】
ポリプレックス中の全キトサン濃度を、ニンヒドリンアッセイを使用して決定した。簡単に言えば、ポリプレックスを、１〜２ｍＭグルコサミンを含有するよう、酢酸ソーダで希釈し、１５０ｍＭ、ｐＨ５．５の最終濃度にした。同じ鎖長のキトサンから調製される標準曲線は、７０ｍＭの酢酸ソーダ、ｐＨ５．５を用いて０．５〜７．５ｍＭのグルコサミン濃度に希釈する。次いで、希釈したポリプレックスおよび標準を、５０ｍＭ酢酸ソーダ、ｐＨ５．５、中の等量の５μ／ｍＬキトサナーゼ（ｐＨ ５）を用いて３７℃で２時間消化さでる。２時間のインキュベーションの後、次いで消化した１００μＬのポリプレックスおよび標準を、４００μＬの７０ｍＭ酢酸ソーダが入っているガラス管に加える。次いで、ニンヒドリン試薬（２５０μＬ）を、各試料に加えて、ガラス管を短時間ボルテックスして１０分間沸騰させる。室温で１５分間冷却した後、エタノールを２５ｍＬ加えて、５５０ｎｍで吸光度値を測定する。ポリプレックス中のキトサン濃度を、線形標準曲線の勾配とｙ切片から算出して、最初の希釈係数で調節する。
【０２６６】
実施例１：ダイフィルトレーションの第１の小規模試験
【０２６７】
ダイアフィルトレーション試験のバッチパラメータを表２に記載する。出発原料としてｃ１５０−ｐＨ４．０製剤を用いた。充填および終了の前に最終ステップとして、ｐＨ／アセテート調節ステップを追加した。
【０２６８】
表２．パラメータおよび結果
【表４】
【０２６９】
実施例２：ダイアフィルトレーションの第２の小規模試験
【０２７０】
ダイアフィルトレーションの２回目の試験（表３）では、バッチの大きさが３倍大きく、出発原料としてｃ1５０−ｐＨ４．０製剤を使用した。充填および終了の前に最終ステップとして、ｐＨ／アセテート調節ステップを追加した。
【０２７１】
表３．パラメータおよび結果
【表５】
【０２７２】
実施例３：小規模のバッチ
【０２７３】
ダイアフィルトレーションの第３試験（表４．）を実施した。このバッチも、出発原料としてｃ１５０−ｐＨ４．０製剤を用いた。
【０２７４】
表４．パラメータおよび結果
【表６】
【０２７５】
実施例４：中規模バッチ
【０２７６】
表５．パラメータおよび結果
【表７】
【０２７７】
ＴＦＦ濃縮ステップ間のｐＨ推移
【０２７８】
ＴＦＦ濃縮プロセスを使用したいくつかのバッチでは、ｐＨが通常、０．２から０．５単位上昇することに注目した。これは、ＴＦＦが進行するにつれて、製剤中の全アセテート対全キトサンの相対濃度の変化による、すなわち、ｐＨが［キトサン］：［アセテート］の関数である。これをモデル化した。ＤＮＡが０．６０ｍｇ／ｍＬから２．０ｍｇ／ｍＬに増加したので、ダイアフィルトレーションのステップの後、ｐＨを念入りにモニターした。このモデルに関して、以下の仮定がなされた：
【０２７９】
透析の後、［アセテート］が１０ｍＭで一定であると仮定する
【０２８０】
濃縮ステップのスタート時、任意の［キトサン］を１ｍＭと仮定する
【０２８１】
［キトサン］が減少量とともに比例して増大すると仮定する
【０２８２】
製剤のｐＨがヘンダーソン・ハッセルバッハ緩衝作用の理論を基づくと仮定する
【０２８３】
このｐＨ推移をモデル化するため、ｐＨ対Ｌｏｇ（［キトサン］／［アセテート］をプトットして、得られた曲線を決定した：
【０２８４】
ｐＨ＝０．６６６４×Ｌｏｇ（[キトサン]／[アセテート]）＋４．７２０８
【０２８５】
図６．ＴＦＦ濃縮の間のｐＨ推移のモデル化。各点は、ポリプレックスの相対的量−倍減少（＝ＤＮＡ濃度の増大）を示す。たとえば、２×の標識の付いた点は、およそｃ１２００である。
【０２８６】
ｃ１２００製剤にアセテートを添加して８０ｍＭにした後、このモデルを用いて、ｃ１２００のｐＨを予想することができる。ｃ１２００中のキトサンは２×（すなわち、２×１ｍＭ＝２ｍＭ）であると推定する。
全アセテートが８０ｍＭであると推定すると、ｐＨ＝０．６６６４×Ｌｏｇ（２／８０）＋４．７２０８＝３．６５。この結果は、実験による結果の３．７に極めて近い。
【０２８７】
８０ｍＭの最終的な所望のキトサン濃度で４．０のｐＨ値を達成するために、キトサン濃度はこのバッチの出発量よりも６．６倍多いはずであることもこのモデルは示している。したがって、キトサンを含まないバッファでダイアフィルトレーションを実行する場合、これは遊離キトサンのほぼ全てを取り除くことになり、その上ｐＨ（４．０）およびアセテート（８０ｍＭ）の同時目標を達成することができない。したがって、ダイアフィルトレーションは、キトサンを含むバッファで行われることが好ましい。
【０２８８】
ＴＦＦ後の安定性
【０２８９】
重要なプロセスパラメータは、第２のＴＦＦ濃縮ステップの完了後である。他の前のステップと異なり、ポリプレックスはｃ１１００への濃縮後は安定でなく、かつＴＦＦ停止から１時間以内に低いｐＨ値に調節しなけれなばらない。一旦ｐＨを調節すると、粒子は室温で安定になる。
【０２９０】
図７．第２のＴＦＦ濃縮ステップ後のポリプレックスの安定性。無希釈のＴＦＦ後の試料を、２５℃でインキュベートし、２時間ごとに、粒子径をモニターした。
【０２９１】
実施例５：キトサン含有バッファを用いるダイアフィルトレーションのための中規模試験
【０２９２】
表６．パラメータ
【表８】
【０２９３】
表７．分析結果
【表９】
【０２９４】
図８．インプロセスｐＨデータ。Ｘ軸の上のＴＦＦ画分コードは、以下の通りである：Ｃ１：ＴＦＦ濃縮ステップ＃１；Ｄ：（洗浄量（ＷＶ）の＃で示したＴＦＦダイアフィルトレーション；Ｃ２：ＴＦＦ濃縮ステップ＃２。
【０２９５】
実施例６：ｐＨ４透析バッファによる小規模バッチ
【０２９６】
ＴＦＦの間、生成物のｐＨをより良く制御するために、ダイアフィルトレーションバッファを低いｐＨに修正した。以下の表に実験および結果の概略を述べる。
【０２９７】
表８．パラメータ
【表１０】
【０２９８】
表９．分析結果
【表１１】
【０２９９】
実施例７：ｐＨ４透析バッファによる中規模バッチ
【０３００】
中規模バッチを３タイプ生成した。以下の表に、実験および結果の概略を述べる。
【０３０１】
表１０．パラメータ
【表１２】
【０３０２】
表１１．分析結果
【表１３】
結果は、３タイプのバッチの平均である。
【０３０３】
４．０の最終ｐＨ値を有するｃ１０００ポリプレックスを製造するために、ＤＮＡとキトサンのインライン混合、ＴＦＦ濃縮、ＴＦＦダイアフィルトレーションおよびｐＨ調節を行った。最終製剤も、７０〜８０ｍＭアセテートの緩衝能を有し、かつ生理的に等張であった。加えて、ナノ粒子分散は、−８０℃凍結の間、室温解凍、解凍後少なくとも８時間の間安定であった。
【０３０４】
実施例８：−８０℃での長期安定性
【０３０５】
−８０℃での１年の貯蔵後、中規模製造からの最終生成物は光学的に半透明であり、かつ可視微粒子が含まれていなかった（データ図示せず）。
【０３０６】
中規模バッチに由来するキトサン−ＤＮＡナノ粒子は、−８０℃で最高１年の間物理的に安定であった。粒子径、多分散および由来する計数率の変化は、ごくわずであった（表１２）。小規模のバッチも、４ヵ月までの短期間試験の間は安定であった。
【０３０７】
表１２．−８０℃での安定性：粒径、ＰＤＩ、およびＤＣＲ
【表１４】
【０３０８】
中規模バッチに由来するキトサン−ＤＮＡナノ粒子は、−８０℃で１年の間は、電気的に安定であった。導電率およびｐＨの変化は、ごくわずかであり分析誤差内であった（表１３）。
ゼータ電位は１年間にわたり１５〜３０％増加したように思われるが、１０％の変動はこのアッセイの場合正常と思われる（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ ＭＲＫ１０３１−０１）。それにもかかわらず、１年後の電気特性は、依然として製品リリース仕様の範囲内であった。小規模のバッチは、４ヵ月のた短期間試験の間は安定であった。
【０３０９】
表１３．−８０℃での安定性： 導電率およびｐＨ
【表１５】
【０３１０】
ＤＮＡプラスミドの被包が維持されたことは、アガロースゲル電気泳動法によって示された。−８０℃での１年間の貯蔵後のポリプレックスの２つの中規模バッチを、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。ＤＮＡはポリプレックス中で被包された状態のままであり、かつ試料ウエル中に保持されており、カソードの方へ移動してなかった（図１２）。
【０３１１】
実施例９：ブタの十二指腸への製剤送達
【０３１２】
製剤は、終夜絶食させたブタの十二指腸に内視鏡を介して送達された。簡単に言えば、内視鏡の先端が十二指腸への幽門括約筋を過ぎて入口に到達するまで、大腸内視鏡は麻酔下のブタの口に挿入した。０．３ｍｇ／ｋｇのＢｕｓｃｏｐａｎ（ぜん動を低下させるために）のＩＶ投与の後、内視鏡を総胆管を越えてさらに２０ｃｍ挿入した。この時点で、特注の二重バルーンカテーテルを内視鏡の送達チャネルを介して十二指腸内に進め、次いで、遠位および近位のバルーンを１５〜２０ｍＬの生理食塩水で膨らませつつ、近位バルーンが総胆管の少なくとも５ｃｍ遠位にあることを確実にした。次いで、両バルーン間の中間組織にカテーテル内の送達ポートを介して後から送達した流体を満たして、排出させることによって十二指腸を洗浄した。流体洗浄の順は、４５ｍＬの生理食塩水での洗浄を３回、続いて生理食塩水中０．５％のＭｕｃｏｍｙｓｔでの洗浄を１回、続いて７．５％ショ糖中の２５ｍＭ酢酸ソーダバッファ、ｐＨ５．５、での洗浄を１回であった。中間の十二指腸部が完全に空になったことを確実にしてから、製剤（高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物）をカテーテル送達ポートを介して十二指腸部に送達して、６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、遠位および近位のバルーンを収縮させ、次いで内視鏡とカテーテルを取り除いた。
【０３１３】
ブタ血漿収集
【０３１４】
ブタ血漿を、以下の手順で収集した。鎮静状態にある動物の耳静脈、伏在静脈または頚静脈から約５ｍＬの血液を、５０μＬのアプロチニン（４．７単位／ｍｇタンパク質、６．６単位／ｍＬ）を前もって添加したバキュテナーに採取して、直ちに氷上に配置し、試験のために研究室に送った。この血液試料を１０００×ｇで１０分間回転させて、その上清を収集することで血漿を収集した。分析準備が整うまで、収集した血漿を−８０℃で保存した。
【０３１５】
結果
【０３１６】
ブタ血漿ＳＥＡＰは、ｇＷＩＺ−ＳＥＡＰプラスミドＤＮＡを含有するｃ１５０キトサン−核酸粒子の投与に応答させて検出した。ｐＨ４の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．０であった。ｐＨ４．８の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ２０−ｃ１５０−Ａｃ２５−Ｓｕｃ９−ｐＨ４．８であった。
【０３１７】
血漿中での高レベルのＳＥＡＰによって証明されたように、４．０のｐＨ値の高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、インビボでｐＨ４．８組成物よりも実質的に高いトランスフェクション効率を示した。（図１）。
【０３１８】
実施例１０：マウス膀胱のインビボトランスフェクション
【０３１９】
ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＦＩａ−ＳＥＡＰまたは対照ビヒクルを担持するキトサン−ＤＮＡポリプレックスＣ（２４，９８）−ｃ１０００−ｐＨ４を投与した。２日後に、マウスを屠殺して、組織を収集した。ナイーブマウス（非形質移入）を超える、処置されたマウスの膀胱組織内のＳＥＡＰ ｍＲＮＡでの相対的な増加を図９に示す。
【０３２０】
方法
【０３２１】
開腹術による外科的切開をＣ５７ＢＬ／６雌マウスの腹部において行い、膀胱を露出させて、分離した。ＥＦ１ａ−ＳＥＡＰまたは対照ビヒクルを担持する、ｐＨ４のｃ１０００Ｃ（２４，９８）キトサンポリプレックスを１００μＬ送達した後に、尿を取り出した。送達から２日後に、ＲＮＡ抽出続いてＳＥＡＰ ｍＲＮＡ発現分析のためのＲＴ−ｑＰＣＲのために、膀胱組織を採取した。
【０３２２】
結果
【０３２３】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物は、インビボで膀胱の細胞に効率的にトランスフェクトすることができた。
【０３２４】
実施例１１：慢性ＩＢＤモデルにおける繰り返し投与の有効性
【０３２５】
自然に慢性大腸炎を発症したＩＬ−１０欠損マウスを用いて、繰り返し投与試験を開始した。これらのマウスについて、大腸炎の発症の症状を毎週モニターした。大腸炎の発症を確認した（たとえば、軟便および血便）後、これらのマウスにＥＧ−１０またはＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子の３投与を浣腸を介して投与した。ナノ粒子の各投与を７日間隔で投与した。実験期間中これらのマウスの体重を毎週モニターして、毎週の処置の後に、ＥＧ−１０処置群と関連して体重増加において有意な改善が観察された（図１０）最後の処置から５日後に、両群からのマウスを屠殺して、それらの結腸を摘出して、炎症性サイトカインのレベルを測定した。ＳＥＡＰ処置したマウスと比較すると、ＥＧ−１０処置したマウスは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−α ｍＲＮＡのレベルの減少が生じた（図１１）。これらのデータを組み合わせると、複数回の投与の可能性を明瞭に示し、慢性マウスＩＢＤモデルにおいてＥＧ−１０の治療効果が改善した。
【０３２６】
図１０：慢性ＩＢＤマウスの体重へのＥＧ−１０（ｈｌＬ−１０）の効果。自然に発症した大腸炎（およそ３０週齢で）を有するＩＬ−１０欠損マウスに、ＥＧ−１０またはＳＥＡＰナノ粒子（対照）を浣腸によって、７日間隔で３回投与することで処置した。各マウスの体重を毎週測定して、初回処置前のそれ自体の体重と比較した（％重量変化で表した）。両方のナノ粒子の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ１０ｃ１０００−Ａｃ７０−Ｓｕｃ９−ｐｈ４．０であった。ＥＧ−１０ナノ粒子は、伸長因子１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、ヒトインターロイキン−１０遺伝子（ｈｌＬ−１０）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。ＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子は、伸長因１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。
【０３２７】
図１１：ＥＧ−１０（ｈｌＬ−１０）ナノ粒子の３種類の炎症性サイトカインへの効果。自然に発症した大腸炎（およそ３０週齢で）を有するＩＬ−１０欠損マウスに、ＥＧ−１０またはＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子を浣腸によって、７日間隔で３回投与することで処置した。最後の処置から５日後に、炎症性サイトカインレベルを、屠殺したマウスの結腸内のＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βで測定した。両方のナノ粒子の製剤処方は、Ｃ（２４，９８）−Ｎ１−ｃ１０００−Ａｃ７０−Ｓｕｃ９−ｐｈ４．０であった。ＥＧ−１０ナノ粒子は、伸長因子１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、ヒトインターロイキン−１０遺伝子（ｈｌＬ−１０）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。ＳＥＡＰ（対照）ナノ粒子は、伸長因１−αプロモータ（ＥＦ１ａ）の制御下で、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＥＡＰ）とともにＤＮＡプラスミドを含んだ。
【０３２８】
実施例１２：ＣＯＰＤまたは喘息を処置するためのインビボマウストランスフェクション：肺へのポリプレックスの送達
【０３２９】
マウスＣＯＰＤを確立するために、マウスをたばこの煙に４〜５日間曝して亜急性曝露を、または６ヵ月間曝して慢性曝露を確立する。曝露は以前に記載されているように鼻のみの曝露システムを通してまたは煙チャンバーを介してのいずれかで行う。（たとえば、Ｆｏｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ａ ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ａｇａｉｎｓｔ ＰＤＥ４ ａｎｄ ＰＤＥ７ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｍｏｋｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｕｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ ２００９ Ｍａｙ ２０；１０：３９； Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ａｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９ Ｊａｎ １；１８２（１）６８４−９１；Ｂｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６， Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ａ２Ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００６ Ｍａｙ，２９０（５）；Ｌ１０３６−４３． Ｅｐｕｂ ２００５ Ｄｅｃ ９； Ｂｒｕｓｓｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ＣＯＰＤ． Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６，１９（３）；１５５−６５ Ｅｐｕｂ ２００５ Ａｕｇ ３；および Ｄ’ｈｕｌｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００５， Ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ ２００５ Ａｕｇ；２６（２）：２０４−１）。
マウスＣＯＰＤも、以前に記載されているように、ブタ脾臓エラスターゼに気道を４〜５週間曝すことによって確立し得る（たとえば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９， Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｅｌａｓｔａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ ｉｎ ｐｌａｃｅｎｔａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ ｍｉｃｅ． Ｒｅｓｐｉｒ Ｒｅｓ． ２００９ Ｎｏｖ ２３；１０：１１５．；およびＰａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８， Ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｄ ＩＣＡＭ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ／ｅｍｐｈｙｓｅｍａ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． ２００８ Ｎｏｖ；７６（１１）： ４９５９−６７． Ｅｐｕｂ ２００８ Ｓｅｐ １５，を参照されたい）。
【０３３０】
マウス喘息モデルを確立するために、マウスに水酸化アルミニウムを混合したトリ卵白アルブミンを腹腔内注射する。最初の注射から数日後、前述のようにマウスに卵白アルブミンを鼻腔内投与する（Ｂｏｎｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， ２００６， 上記を参照；およびＢｏｕｌａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｅ） Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−１ Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｌｕｎｇ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｓｔｈｍａ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ． ２８， ｐｐ．３２２−３２９）。
【０３３１】
ＣＯＰＤまたは喘息モデルを処置するために、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸を含む高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物を用いる。抗炎症性タンパク質は当該技術分野で周知である。代表的な抗炎症性タンパク質は、表１４の参考文献に記載する。すべての参考文献は、その全てが参照により本明細書に明示的に組み込まれる。高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物を肺に、鼻腔内にまたは麻酔下で気管内に投与する（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９， ｉｎｆｒａ；およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８，後述、を参照されたい）。
々の時点で、マウスを屠殺し、それらの肺組織を収集して、導入遺伝子ｍＲＮＡ発現および種々のサイトカインの発現のために処理する（たとえば、Ｄｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ｉｎｆｒａ；およびＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８，後述、を参照されたい）。ＤＮＡ単体を対照として単体で注射する。高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物の鼻腔内／気管内送達は、インビボで肺細胞での抗炎症性遺伝子ｍＲＮＡの発現の有意な増大をもたらし、かつ炎症性サイトカインプロフィールの減少を媒介する。
【０３３２】
実施例１３：インビボマウストランスフェクション：膀胱炎を処置するための膀胱へのポリプレックス送達
【０３３３】
膀胱炎モデルを確立するために、マウスまたはラットを用いることもある。たとえば、マウスを麻酔下で配置して、尿道にポリエチレンカテーテルでカニューレ処置する。尿の吸引の後で、前述のように膀胱に酸を滴下注入して膀胱炎を誘発させる（たとえば、ＫｉｆＩｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７， Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｕｐｌａｔａｓｔ ｔｏｓｉｌａｔｅ （ＩＰＤ−１１５１Ｔ） ｉｎ ａ ｒａｔ ｃｙｓｔｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ＢＪＵ ｌｎｔ ２００７ Ｏｃｔ， １００（４） ９３５−９ Ｅｐｕｂ ２００７ Ａｕｇ ２０；および、Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｂｌａｄｄｅｒ ｐａｉｎ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｃＤＮＡ Ｊ Ｕｒｏｌ ２００３ Ｎｏｖ， １７０（５） ２０４４−８）。
【０３３４】
膀胱炎を処置するために、マウスを麻酔して、抗炎症性タンパク質をコードする治療用核酸を含む高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物を尿道カテーテルを介して膀胱に小胞内投与する（たとえば、Ｋｉｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７，前述、およびＣｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００３、前述、を参照されたい）。代表的な抗炎症性タンパク質は、表１４の参考文献に記載する。すべての参考文献は、その全てが参照により本明細書に明示的に組み込まれる。種々の時点で、マウスを屠殺し、それらの膀胱組織を収集して、組織学的検査および導入遺伝子ｍＲＮＡ発現ために処理する。加えて、種々のサイトカインの発現を調べる。ＤＮＡ単体を対照として単体で注射する。高酸性キトサン−ＤＮＡポリプレックス組成物の小胞内送達は、インビボで膀胱細胞での抗炎症性遺伝子ｍＲＮＡの発現の有意な増大をもたらし、かつ炎症性サイトカインプロフィールの減少を媒介する。
【０３３５】
表１４：代表的な抗炎症性タンパク質
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【０３３６】
すべての引用は、その全てが、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物であって、安定なキトサン−核酸ポリプレックスを含み、前記組成物が４．５を下回るｐＨ値を有する組成物。
【請求項２】
前記組成物が４．２を下回るｐＨ値を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が４．０を下回るｐＨ値を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が３．８を下回るｐＨ値を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１０ｍＭ〜２００ｍＭの対アニオン濃度を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記対アニオンがアセテートである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物がポリプレックス沈殿物を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記キトサン−核酸ポリプレックスが治療用核酸コンストラクトを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
粘膜上皮の細胞をトランスフェクトする方法であって、粘膜上皮の前記細胞を請求項１による前記組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１３】
前記粘膜上皮が、消化管組織、気道組織、肺組織、副鼻腔組織、口腔組織、尿路組織、膀胱組織、膣組織、子宮組織、頸部組織、眼組織、食道組織、唾液腺組織、鼻喉頭組織、腎臓組織、および喉頭／咽頭組織からなる群から選択される組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記粘膜上皮が消化管組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記粘膜上皮が膀胱組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記粘膜上皮が肺組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
医薬組成物であって、請求項１３による組成物を含み、前記医薬組成物が４．５未満のｐＨ値を有する、医薬組成物。
【請求項１８】
前記医薬組成物が等張である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置するための方法であって、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に、請求項１７に記載の治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、前記治療用核酸コンストラクトが抗炎症性タンパク質をコードし、および前記医薬組成物が前記粘膜上皮に局所投与される、方法。
【請求項２０】
前記抗炎症性タンパク質が、ＴＦＮα阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、およびＩＬ−１０阻害剤からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗炎症性タンパク質がＩＬ−１０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患がＩＢＤである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が間質性膀胱炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患がＣＯＰＤである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が喘息である、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
高酸性キトサン−核酸ポリプレックス組成物であって、安定なキトサン−核酸ポリプレックスを含み、前記組成物が４．５を下回るｐＨ値を有する組成物。
【請求項２】
前記組成物が４．２を下回るｐＨ値を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が４．０を下回るｐＨ値を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が３．８を下回るｐＨ値を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１０ｍＭ〜２００ｍＭの対アニオン濃度を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記対アニオンがアセテートである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１．０ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物がポリプレックス沈殿物を含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記キトサン−核酸ポリプレックスが治療用核酸コンストラクトを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
粘膜上皮の細胞をトランスフェクトする方法であって、粘膜上皮の前記細胞を請求項１による前記組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１３】
前記粘膜上皮が、消化管組織、気道組織、肺組織、副鼻腔組織、口腔組織、尿路組織、膀胱組織、膣組織、子宮組織、頸部組織、眼組織、食道組織、唾液腺組織、鼻喉頭組織、腎臓組織、および喉頭／咽頭組織からなる群から選択される組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記粘膜上皮が消化管組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記粘膜上皮が膀胱組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記粘膜上皮が肺組織に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
医薬組成物であって、請求項１３による組成物を含み、前記医薬組成物が４．５未満のｐＨ値を有する、医薬組成物。
【請求項１８】
前記医薬組成物が等張である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
粘膜上皮の炎症を伴う疾患を処置するための方法であって、粘膜上皮の炎症を伴う疾患の患者に、請求項１７に記載の治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、前記治療用核酸コンストラクトが抗炎症性タンパク質をコードし、および前記医薬組成物が前記粘膜上皮に局所投与される、方法。
【請求項２０】
前記抗炎症性タンパク質が、ＴＦＮα阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、およびＩＬ−１０阻害剤からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗炎症性タンパク質がＩＬ−１０である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患がＩＢＤである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が間質性膀胱炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患がＣＯＰＤである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患が喘息である、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５２２０２０（Ｐ２０１２−５２２０２０Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２４０６（Ｐ２０１２−５０２４０６）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００５０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１７８７
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１００８２８６８）エンジーン，インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００５０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１７８７
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１００８２８６８）エンジーン，インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】
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