魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法
【課題】処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収できる魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法を提供する。
【解決手段】魚由来の原料をＸ線回折法において得られるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）の回折強度が粉砕前を基準とした減少率が所定範囲に収まるように微粉砕する。微粉砕した魚由来の原料を、３０℃〜７０℃の温度の水中において前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行う。前記所定範囲の下限値は、コラーゲンペプチドの回収率を７５％以上にする観点から定められ、前記所定範囲の上限値は、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持する観点から定められている。
【解決手段】魚由来の原料をＸ線回折法において得られるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）の回折強度が粉砕前を基準とした減少率が所定範囲に収まるように微粉砕する。微粉砕した魚由来の原料を、３０℃〜７０℃の温度の水中において前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行う。前記所定範囲の下限値は、コラーゲンペプチドの回収率を７５％以上にする観点から定められ、前記所定範囲の上限値は、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持する観点から定められている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは食品から医薬品・化粧品に至るまで幅広い分野で利用され、年間３００億円の市場があるといわれている。このコラーゲンは、従来は牛や豚などの哺乳動物由来のものが主であったが、牛海綿状脳症、口蹄疫が発生して以来、利用が敬遠されるようになっている。特に化粧品に使われるコラーゲンは、水生動物由来のものが大半を占めるようになっている。
コラーゲン及びこの変性物であるゼラチンは、体内や肌への吸収率向上や機能性を付与する目的で、酵素等により低分子化（加水分解）処理が行なわれる。なお、この処理を受けた試料をコラーゲンペプチドという。
【０００３】
水生動物からコラーゲンペプチドを抽出する方法として、未脱灰の魚鱗を粉砕処理することでコラーゲンの可溶化及び酵素との接触を促進し、コラーゲンペプチドを抽出する方法が知られている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−５７１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、当該抽出方法によってコラーゲン抽出を行なうには、堅い三重螺旋構造を持ったコラーゲン、特に内部コラーゲン線維を可溶化するため、粉砕処理をした魚鱗を酵素処理する前に、９０℃以上で２時間以上の加熱処理を行ないゼラチン化する処理を必要とする。このため、コラーゲン抽出処理と後の酵素による加水分解処理を別工程としなければならず、また両工程の間には冷却工程も必要となる。当該加熱処理は省略することもできるが、省略した場合にはコラーゲンペプチドの回収率が著しく減少する。また、当該抽出方法における粉砕処理は、魚鱗の嵩が増すため、一度に高濃度のコラーゲンペプチドが得られないという欠点もあり、さらなる改良が望まれる。
【０００６】
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収できる魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる目的を達成するために、本発明の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法は、魚由来の原料をＸ線回折法において得られるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）の粉砕前を基準とした回折強度の減少率が所定範囲に収まるように微粉砕する原料微粉砕工程と、３０℃〜７０℃の温度の水中において前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行うコラーゲンペプチド抽出工程を有し、前記所定範囲の下限値は、コラーゲンペプチドの回収率を７５％以上にする観点から定められ、前記所定範囲の上限値は、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持する観点から定められていることを特徴とする。
【０００８】
発明者は、魚由来の原料に対して、十分なメカノケミカル効果が与えられるように粉砕処理が実行されることにより、コラーゲンの抽出率を向上させうることを知見した。ここで「メカノケミカル効果」とは、粉砕過程で微粒子化した試料に機械的エネルギー（衝撃又は摩擦）を与えることにより、機械的エネルギーの一部が粒子内に蓄積され、結晶構造の歪み又は化学結合の切断等を引き起こす効果である。
【０００９】
また発明者は、メカノケミカル効果が発生する程度と、Ｘ線回折法によって測定できる魚由来の原料に含まれるヒドロキシアパタイト結晶のｃ軸に属する回折強度の減少の程度とが比例関係にあることを知見した。
【００１０】
具体的には、発明者は、魚由来の原料は、六方晶系に属するイオン結晶であるヒドロキシアパタイトと、当該結晶のｃ軸に沿って整列したコラーゲン繊維とからなるために機械的強度に優れた構造をしているのに対して、当該原料に与えられるメカノケミカル効果がが高くなるほど、当該結晶のｃ軸に属するミラー指数（００２）におけるＸ線回折法によって得られる回折強度が、粉砕前の回折強度と比較して低くなることを知見した。
【００１１】
この知見に基づくことにより、前記ｃ軸に属するミラー指数（００２）における回折強度が粉砕前の回折強度と比較して所定の割合以上減少するように原料を微粉砕する処理を実行しうる。
【００１２】
前記所定割合の下限値は、本来、工業上の要請としてコラーゲンペプチドの回収率は７５％以上必要とされていることから、この７５％を超えるように設定する。
【００１３】
一方、コラーゲンペプチドの回収率はほぼ１００％（９５％〜９８％）に到達する程度に微粉砕する処理を実行すれば十分であり、それ以上に回収率を上昇させるために処理工程を追加又は継続して実行することは、却って工業上の作業効率の点から無駄が生じる結果となる。したがって、前記所定範囲の上限値は、コラーゲンペプチドの回収率が９５％を超えないように、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持しうるように設定する。
【００１４】
また、発明者の実験によれば、本発明の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法では、前記所定の割合は１３．４％〜３７．２％に設定することが好ましい。
【００１５】
なお、このコラーゲンペプチドの回収率は、原料に含まれるコラーゲンペプチドを１００としたときの、回収したコラーゲンペプチドの質量の相対的割合を意味する。
【００１６】
そして、前記微粉砕処理を実行した後、コラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理が実行される。
【００１７】
前記微粉砕処理を実行により、十分なメカノケミカル効果が与えられた魚由来の原料は、酵素活性が維持される３０℃〜７０℃の温度の水中でコラーゲンの可溶化、抽出化が実行することができる。したがって、従来別工程で行なわれていた前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理及び前記加水分解処理を同時に行なうことができるとともに、前記抽出する工程と前記加水分解処理工程の間に、冷却工程を省略することができる。
【００１８】
しかも、この粉砕処理によれば、嵩が従来と比較して著しく低いので、前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理及び前記加水分解処理に際して、一度により多量の粉砕原料を対象としてコラーゲンペプチドの抽出をすることができる。
【００１９】
この結果、本発明の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収することができる。
【００２０】
なお、前記コラーゲンペプチドの回収率は、単位質量あたりの魚鱗から回収可能なコラーゲンペプチドの最大値が、回収率１００％として定義される。この最大値は実験により定められる。たとえば、コンバージミルで魚鱗を粉砕処理する継続時間を延ばしても、回収率が向上しなくなったときの値が当該最大値として定められる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】秋刀魚の鱗を試料とする実施例３〜５及び比較例２のＸ線回折測定で得られた回折パターンを示す図。
【図２】鰯の鱗を試料とする実施例１、２及び比較例１のＸ線回折測定で得られたミラー指数（００２）の回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの抽出率との関係説明図。
【図３】秋刀魚の鱗を試料とする実施例３〜５及び比較例２のＸ線回折測定で得られたミラー指数（００２）の回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの抽出率との関係説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
次に、本発明の実施の形態について図を用いて、さらに詳しく説明する。
【００２３】
図１は、Ｘ線回折法によって測定した、秋刀魚由来の原料に含まれるヒドロキシアパタイト結晶のｃ軸に属する回折強度を示すグラフである。図１（ａ）は、粉砕処理として、カッターミルによる一次粉砕のみをした場合の回折強度のグラフである。図１（ｂ）は、前記一次粉砕に加え、後述のコンバージミルによって２０分の微粉砕処理を実行した場合の回折強度のグラフである。図１（ｃ）は、同様に４０分の微粉砕処理を実行した場合の回折強度のグラフである。図１（ｄ）は、同様に６０分の微粉砕処理を実行した場合の回折強度のグラフである。
【００２４】
この図１（ａ）乃至図１（ｃ）から明らかなように、コンバージミルによる微粉砕処理の実行時間が長くなり、原料に与えられるメカノケミカル効果が高くなるほど、当該結晶のｃ軸に属するミラー指数（００２）における回折強度が、粉砕前の回折強度と比較して低くなることがわかる。
【００２５】
また、図１（ｃ）及び図１（ｄ）から明らかなように、回折強度の減少率は、所定の程度まで達すると、それ以上時間を掛けて微粉砕処理を継続しても、回折強度の減少率はほとんど変化しないということがわかる。
【００２６】
本実施形態は、これらの実験結果に基づいて、前記ｃ軸に属するミラー指数（００２）における回折強度の粉砕前の回折強度を基準とした減少率が、所定範囲に収まるように原料を微粉砕する処理を実行するものである。
【００２７】
本実施形態における魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法で用いられる魚由来の原料の種類は、特に限定されず、例えば平目、鮭、鱸、鰯、秋刀魚、真鯛などの魚類である。前記知見された傾向は、いずれの魚類であっても同様に示される。また、魚由来の原料であれば、魚皮であってもよいが、魚鱗が比較的魚臭さが少ないことから好ましい。
【００２８】
本実施形態の魚由来の原料の微粉砕工程においては、あらかじめ洗浄して不純物を除去した未脱灰の魚由来の原料をカッターミルで９０秒程度一次粉砕した後、微粉砕手段によって、Ｘ線回折法によって得られたヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度が粉砕前の回折強度と比較して１３．４％〜３７．２％減少するように微粉砕する。
【００２９】
前記微粉砕手段は、特に限定されないが、複数個の粉砕媒体ボールと粉体とを収納した処理容器の回転により、該粉体を微粒子化する高速粉体反応装置が好ましく用いられ、特に特許第３４８６６８２号又は特許第３５３３５２６号に開示されているコンバージミルの原理を利用した高速粉体反応装置を用いるのが好ましい。
【００３０】
この高速粉体反応装置は、粉砕用容器や粉砕用ボールの衝突による磨耗分の混入を軽減でき、スケールアップも容易であるので、本実施形態の微粉砕手段として好ましい。但し、前記高速粉体反応装置の規模、性能により、前記所定の回折強度の減少率（１３．４％〜３７．２％）になるのに必要な粉砕処理の実行時間は異なるため、予め実験で当該装置の運転時間と減少率との関係を求めておくことが好ましい。
【００３１】
本実施形態のコラーゲンペプチド抽出工程では、前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行う。
【００３２】
まず、前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理として、前記微粉砕した魚由来の原料を水中に浸漬する。これにより、魚由来の原料のコラーゲンタンパク質の大半がゼラチン化して水に溶出するので、後述のタンパク質分解酵素による加水分解を行いうる。このコラーゲンタンパク質を短時間でゼラチン化して水に溶出させるためには、水温が３０℃以上であることが好ましい。一方で、前記水温が７０℃を超えてしまうと、後述のタンパク質を加水分解する酵素が活性を失ってしまうため、６０℃以下であることが好ましい。
【００３３】
次に、前記コラーゲンタンパク質を加水分解する処理は、前記水に溶出したコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によって、加水分解することにより行われる。本加水分解処理は、水に可溶化したコラーゲン（ゼラチン）のみならず、上記温度条件で可溶化できないコラーゲンにも作用することができるため、さらにコラーゲンペプチドの回収率を上げることができる。
【００３４】
本実施形態に用いられるタンパク質分解酵素は、化学的な脱灰処理なしに、コラーゲンタンパク質を加水分解することができるものであれば特に制限されない。例えば、天野エンザイム株式会社製「プロテアーゼＮアマノＧ（商標）」、「プロレザーＦＧ−Ｆ（商標）」やナガセケムテックス株式会社製「デナプシン２Ｐ（商標）」など、食品に使用できるものが好ましい。なお、これらの酵素を変性させ活性を失わせることは、沸騰水浴下（９５℃）で１０分間加熱処理することにより行なうことができる。
【００３５】
本実施形態の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によって得られたコラーゲンペプチドは、公知の手段によって更に濃縮・精製することができる。例えば、濃縮には遠心濃縮や凍結乾燥など、精製には活性炭や合成吸着樹脂などを挙げることができる。なお、活性炭による精製の場合、補助剤（例えば、珪藻土（ダイアトマイト））とともに用いることが好ましい。
【００３６】
本実施形態の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、Ｘ線回折法によって魚由来の原料に含まれるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度を測定し、微粉砕前の回折強度を基準とした回折強度の減少率を把握することにより、メカノケミカル効果の発生の程度を認識することができる。そして、メカノケミカル効果の発生の程度により、コラーゲンペプチドの回収率が変化することから、工業上効率的にコラーゲンペプチドの回収率が達成できる程度のメカノケミカル効果が発生させるために、必要最小限の前記微粉砕処理をすべき程度を認識することができる。
【００３７】
また、メカノケミカル効果が与えられるように微粉砕処理された魚由来の原料は、３０℃〜６０℃という酵素が活性を失わない温度域でコラーゲンの可溶化及び高抽出化が実現できるため、従来別工程で行なわれていた加熱によるコラーゲンタンパク質抽出処理と酵素による加水分解処理を同時に行なうことができる。
【００３８】
しかも、この微粉砕処理によれば、発生する嵩が従来の粉砕処理で発生する嵩と比較して著しく少ないので、前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理及び前記加水分解処理に際して、一度により多量の粉砕原料を対象としてコラーゲンの抽出をすることができる。
【００３９】
この結果、本実施形態の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収することができる。
【実施例】
【００４０】
［鰯を原料とした実験例］
<実施例１>
（鱗の採取、洗浄、脱脂、乾燥）
鮮度低下を防ぐため−３５度で凍結保存しておいた鰯の鱗に対し、水道水で十分洗浄処理を施した。この洗浄済みの鱗にアセトンを添加し脱脂処理を行ない、これを数回繰り返した。さらに、この鰯の鱗をドラフト内で自然乾燥後、シリカゲル入りのデシケーター内で２〜３日間乾燥させ、洗浄乾燥鱗を得た。
【００４１】
（鱗の一次粉砕）
前記洗浄乾燥鱗を、室温２０〜２５℃でＰｏｗｅｒ ｇｒｉｎｄｅｒ（カッターミル、Ｍａｓｔｅｒ社製）を回転数３００００ｒｐｍで９０秒の粉砕処理を行った。
【００４２】
（鱗の二次粉砕）
前記粗粉砕鱗を、特許第３４８６６８２号及び特許第３５３３５２６号に記載されたコンバージミルの原理を利用した高速粉体反応装置（株式会社真壁技研社製）を用いて微粉砕した。具体的には、上記高速粉体反応装置のジルコニア製粉砕容器（１０００ｍｌ）に、原料粉として粗粉砕鱗３０ｇと、媒体ボールとして直径１０ｍｍのジルコニアボール２７１ｇ（８０ｍｌ）とを投入し、空気雰囲気下、回転数７００ｒｐｍにて６０分の粉砕処理を行った。
【００４３】
これにより、得られた微粉砕鱗の平均粒子径は３６μｍであった。また、Ｘ線回折法によるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）に帰属する回折強度は、粉砕前の回折強度と比較すると３５．８％減少した。
【００４４】
（抽出・加水分解）
上記の微粉砕鱗を０．１ｇ秤量し、これに蒸留水１０ｍｌと１４ｍｇ／ｍｌに調製したプロテアーゼ（天野エンザイム（株）製プロレザー（商標）ＦＧ−Ｆ）を０．１ｍｌ加え、酵素製剤終濃度約１４０μｇ／ｍｌとし、当該液体を６０℃に保ち、６０分攪拌混合して加水分解した。
【００４５】
（固液分離）
加水分解後の懸濁液を１２０００×ｇ、２０分の条件で遠心分離を行ない、コラーゲンペプチドを含む上清液を回収した。
【００４６】
（酵素の変性）
沸騰水浴下で１０分間加熱することで酵素の失活・変性処理を行なった。
【００４７】
（変性酵素の除去）
固液分離と同条件で遠心分離を行ない、変性酵素を除去し上清液（コラーゲンペプチド）を得た。
【００４８】
上記溶液のコラーゲンペプチド濃度はウシ血清アルブミンを標準タンパク質とするＬｏｗｒｙ法（非特許文献：Ｌｏｗｒｙら (１９５１) Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９２巻， ｐ２６３−２７５）により定量することで求めた。得られた濃度に酵素の変性処理後の液量を乗じてコラーゲンペプチド量を算出した。なお、上記固液分離操作前に酵素の変性処理を施せば、固液分離の際ヒドロキシアパタイトと変性酵素の除去を同時に行なうことができるが、本実施例では抽出・加水分解工程で得られるコラーゲンペプチド量を純粋に評価するため、上記手順に従って処理を行なった。
【００４９】
（Ｘ線回折強度の測定）
Ｘ線回折強度の測定に用いた魚鱗粉末試料は、タンパク質が共存すると回折強度のベースラインが大きく乱れるため、これを回避するため十分に除タンパクされたものを使用した。具体的には、魚鱗粉末試料に対して、特開２００４‐５７１９６の実施例１と同様の操作を施し、得られる残渣（ヒドロキシアパタイト）を洗浄・乾燥して測定用試料を得た。Ｘ線回折強度の測定には日本電子株式会社製のＪＤＸ−３５３０を用い、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα線、管電圧：３０ｋＶ、管電流：３０ｍＡ、測定範囲：２θ＝７０°まで、Ｘ線のスキャンスピード：０．０４°×０．５ｓｅｃの条件で測定した。
【００５０】
（コラーゲンペプチドの回収率）
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図２（ａ）に示された表１の実施例１の欄に示した。なお、実施例１におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９７．８％であった。
【００５１】
なお、前記コラーゲンペプチドの回収率は、単位質量あたりの魚鱗から回収可能なコラーゲンペプチドの最大値が、回収率１００％として定義される。この最大値は実験により定められる。たとえば、コンバージミルで魚鱗を粉砕処理する継続時間を延ばしても、回収率が向上しなくなったときの値が当該最大値として定められる。なお、コラーゲンペプチドの回収率が向上しなくなった状態では、ミラー指数（００２）の回折強度の減少率も４０％以上には向上しなくなった。このことから、回折強度の減少率は４０％が上限であり、減少率が４０％に到達すれば、コラーゲンペプチドの回収率は１００％となることが推測される。
【００５２】
<実施例２>
二次粉砕の時間を１８０分に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。
【００５３】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図２（ａ）に示された表１の実施例２の欄に示した。なお、実施例２におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９９．８％であった。
【００５４】
<比較例１>
二次粉砕を行わなかった以外は、実施例１と同様の操作を行った。
【００５５】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図２（ａ）に示された表１の比較例１欄に示した。なお、比較例１におけるコラーゲンペプチドの回収率は、６０．３％であった。
【００５６】
<考察>
鰯の魚鱗を試料に用いた実施例１、２及び比較例１のヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の関係を図２（ｂ）に示した。なお、回折強度の減少率は、比較例１の回折強度を基準として各実験例の回折強度の減少の割合を算出することによって求めた。
【００５７】
図２（ｂ）によれば、鰯を原料とした実験より求めた前記回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率との近似曲線として、近似式（１）が算出される。
【００５８】
【数１】
【００５９】
上述のとおり、本来、工業上の要請としてコラーゲンペプチドの回収率は７５％以上必要とされている。そのため、当該近似式（１）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が３．８２％以上であれば、コラーゲンペプチドの回収率は７５％を超えることがわかる。
【００６０】
また、コラーゲンペプチドの回収率はほぼ１００％（９５％〜９８％）に到達する程度に微粉砕する処理を実行すれば十分であり、それ以上に回収率を上昇させるために処理工程を追加又は継続して実行することは、却って工業上の作業効率の点から好ましくない。
【００６１】
そのため、当該式（１）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が１３．７％以下であれば、コラーゲンペプチドの回収率を９５％以内に調整でき、工業上の作業効率の観点から好ましくない余分な微粉砕処理を回避しうることがわかる。なお、前記回折強度の減少率が１３．７％であるときのコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加の割合、すなわち、前記回折強度の減少率が１３．７％であるときの近似式（１）の接線の傾きは、０．８１であることがわかる。
【００６２】
［秋刀魚を原料とした実験例］
<実施例３>
試料を鰯の鱗から秋刀魚の魚鱗に変更した。また、二次粉砕としてコンバージミルを用いて２０分間微粉砕した。それ以外の操作は実施例１と同様に行った。
【００６３】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の実施例３の欄に示した。なお、実施例３におけるコラーゲンペプチドの回収率は、８０．３％であった。
【００６４】
<実施例４>
二次粉砕の時間を４０分とした以外は、実施例３と同様の操作を行った。
【００６５】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の実施例４の欄に示した。なお、実施例４におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９２．９％であった。
【００６６】
<実施例５>
二次粉砕の時間を６０分とした以外は、実施例６と同様の操作を行った。
【００６７】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の実施例５の欄に示した。なお、実施例５におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９９．９％であった。
【００６８】
<比較例２>
二次粉砕を行わなかった以外は、実施例３と同様の操作を行った。
【００６９】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の比較例２欄に示した。なお、比較例２におけるコラーゲンペプチドの回収率は、３７．９％であった。
【００７０】
<考察>
秋刀魚の魚鱗を試料に用いた実施例３〜５及び比較例２のヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の関係を図３（ｂ）に示した。なお、回折強度の減少率は、比較例２の回折強度を基準として各実験例の回折強度の減少の割合を算出することによって求めた。
【００７１】
図３（ｂ）によれば、秋刀魚を原料とした実験より求めた前記回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率との近似曲線として、近似式（２）が算出される。
【００７２】
【数２】
【００７３】
そして、同様に近似式（２）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が１３．４％以上であれば、コラーゲンペプチドの回収率は７５％を超えることがわかる。
【００７４】
また、当該式（２）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が３７．２％以下であれば、コラーゲンペプチドの回収率を９５％以内に調整できることがわかる。なお、前記回折強度の減少率が３７．２％であるときのコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加の割合、すなわち、前記回折強度の減少率が３７．２％であるときの近似式（２）の接線の傾きは、０．３４であることがわかる。
【００７５】
<結果>
図２（ｂ）及び図３（ｂ）によれば、一次粉砕後の魚鱗にメカノケミカル効果を付与できる粉砕機により二次粉砕すると、鰯及び秋刀魚の両魚鱗とも粉砕処理時間の経過とともにヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度の減少率が増加することがわかる。
【００７６】
また、図２（ｂ）及び図３（ｂ）によれば、回折強度の減少率は、所定の程度まで達すると、それ以上時間を掛けて微粉砕処理を継続しても、回折強度の減少率はほとんど変化しないということがわかる。
【００７７】
この結果、前記回折強度の減少率が所定範囲（例えば鰯であれば、３．８２％〜１３．７％、例えば秋刀魚であれば、１３．４％〜３７．２％）に収まるように微粉砕処理を実行する魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収することができることが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは食品から医薬品・化粧品に至るまで幅広い分野で利用され、年間３００億円の市場があるといわれている。このコラーゲンは、従来は牛や豚などの哺乳動物由来のものが主であったが、牛海綿状脳症、口蹄疫が発生して以来、利用が敬遠されるようになっている。特に化粧品に使われるコラーゲンは、水生動物由来のものが大半を占めるようになっている。
コラーゲン及びこの変性物であるゼラチンは、体内や肌への吸収率向上や機能性を付与する目的で、酵素等により低分子化（加水分解）処理が行なわれる。なお、この処理を受けた試料をコラーゲンペプチドという。
【０００３】
水生動物からコラーゲンペプチドを抽出する方法として、未脱灰の魚鱗を粉砕処理することでコラーゲンの可溶化及び酵素との接触を促進し、コラーゲンペプチドを抽出する方法が知られている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−５７１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、当該抽出方法によってコラーゲン抽出を行なうには、堅い三重螺旋構造を持ったコラーゲン、特に内部コラーゲン線維を可溶化するため、粉砕処理をした魚鱗を酵素処理する前に、９０℃以上で２時間以上の加熱処理を行ないゼラチン化する処理を必要とする。このため、コラーゲン抽出処理と後の酵素による加水分解処理を別工程としなければならず、また両工程の間には冷却工程も必要となる。当該加熱処理は省略することもできるが、省略した場合にはコラーゲンペプチドの回収率が著しく減少する。また、当該抽出方法における粉砕処理は、魚鱗の嵩が増すため、一度に高濃度のコラーゲンペプチドが得られないという欠点もあり、さらなる改良が望まれる。
【０００６】
そこで、本発明は、かかる不都合を解消して、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収できる魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる目的を達成するために、本発明の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法は、魚由来の原料をＸ線回折法において得られるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）の粉砕前を基準とした回折強度の減少率が所定範囲に収まるように微粉砕する原料微粉砕工程と、３０℃〜７０℃の温度の水中において前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行うコラーゲンペプチド抽出工程を有し、前記所定範囲の下限値は、コラーゲンペプチドの回収率を７５％以上にする観点から定められ、前記所定範囲の上限値は、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持する観点から定められていることを特徴とする。
【０００８】
発明者は、魚由来の原料に対して、十分なメカノケミカル効果が与えられるように粉砕処理が実行されることにより、コラーゲンの抽出率を向上させうることを知見した。ここで「メカノケミカル効果」とは、粉砕過程で微粒子化した試料に機械的エネルギー（衝撃又は摩擦）を与えることにより、機械的エネルギーの一部が粒子内に蓄積され、結晶構造の歪み又は化学結合の切断等を引き起こす効果である。
【０００９】
また発明者は、メカノケミカル効果が発生する程度と、Ｘ線回折法によって測定できる魚由来の原料に含まれるヒドロキシアパタイト結晶のｃ軸に属する回折強度の減少の程度とが比例関係にあることを知見した。
【００１０】
具体的には、発明者は、魚由来の原料は、六方晶系に属するイオン結晶であるヒドロキシアパタイトと、当該結晶のｃ軸に沿って整列したコラーゲン繊維とからなるために機械的強度に優れた構造をしているのに対して、当該原料に与えられるメカノケミカル効果がが高くなるほど、当該結晶のｃ軸に属するミラー指数（００２）におけるＸ線回折法によって得られる回折強度が、粉砕前の回折強度と比較して低くなることを知見した。
【００１１】
この知見に基づくことにより、前記ｃ軸に属するミラー指数（００２）における回折強度が粉砕前の回折強度と比較して所定の割合以上減少するように原料を微粉砕する処理を実行しうる。
【００１２】
前記所定割合の下限値は、本来、工業上の要請としてコラーゲンペプチドの回収率は７５％以上必要とされていることから、この７５％を超えるように設定する。
【００１３】
一方、コラーゲンペプチドの回収率はほぼ１００％（９５％〜９８％）に到達する程度に微粉砕する処理を実行すれば十分であり、それ以上に回収率を上昇させるために処理工程を追加又は継続して実行することは、却って工業上の作業効率の点から無駄が生じる結果となる。したがって、前記所定範囲の上限値は、コラーゲンペプチドの回収率が９５％を超えないように、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持しうるように設定する。
【００１４】
また、発明者の実験によれば、本発明の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法では、前記所定の割合は１３．４％〜３７．２％に設定することが好ましい。
【００１５】
なお、このコラーゲンペプチドの回収率は、原料に含まれるコラーゲンペプチドを１００としたときの、回収したコラーゲンペプチドの質量の相対的割合を意味する。
【００１６】
そして、前記微粉砕処理を実行した後、コラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理が実行される。
【００１７】
前記微粉砕処理を実行により、十分なメカノケミカル効果が与えられた魚由来の原料は、酵素活性が維持される３０℃〜７０℃の温度の水中でコラーゲンの可溶化、抽出化が実行することができる。したがって、従来別工程で行なわれていた前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理及び前記加水分解処理を同時に行なうことができるとともに、前記抽出する工程と前記加水分解処理工程の間に、冷却工程を省略することができる。
【００１８】
しかも、この粉砕処理によれば、嵩が従来と比較して著しく低いので、前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理及び前記加水分解処理に際して、一度により多量の粉砕原料を対象としてコラーゲンペプチドの抽出をすることができる。
【００１９】
この結果、本発明の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収することができる。
【００２０】
なお、前記コラーゲンペプチドの回収率は、単位質量あたりの魚鱗から回収可能なコラーゲンペプチドの最大値が、回収率１００％として定義される。この最大値は実験により定められる。たとえば、コンバージミルで魚鱗を粉砕処理する継続時間を延ばしても、回収率が向上しなくなったときの値が当該最大値として定められる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】秋刀魚の鱗を試料とする実施例３〜５及び比較例２のＸ線回折測定で得られた回折パターンを示す図。
【図２】鰯の鱗を試料とする実施例１、２及び比較例１のＸ線回折測定で得られたミラー指数（００２）の回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの抽出率との関係説明図。
【図３】秋刀魚の鱗を試料とする実施例３〜５及び比較例２のＸ線回折測定で得られたミラー指数（００２）の回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの抽出率との関係説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
次に、本発明の実施の形態について図を用いて、さらに詳しく説明する。
【００２３】
図１は、Ｘ線回折法によって測定した、秋刀魚由来の原料に含まれるヒドロキシアパタイト結晶のｃ軸に属する回折強度を示すグラフである。図１（ａ）は、粉砕処理として、カッターミルによる一次粉砕のみをした場合の回折強度のグラフである。図１（ｂ）は、前記一次粉砕に加え、後述のコンバージミルによって２０分の微粉砕処理を実行した場合の回折強度のグラフである。図１（ｃ）は、同様に４０分の微粉砕処理を実行した場合の回折強度のグラフである。図１（ｄ）は、同様に６０分の微粉砕処理を実行した場合の回折強度のグラフである。
【００２４】
この図１（ａ）乃至図１（ｃ）から明らかなように、コンバージミルによる微粉砕処理の実行時間が長くなり、原料に与えられるメカノケミカル効果が高くなるほど、当該結晶のｃ軸に属するミラー指数（００２）における回折強度が、粉砕前の回折強度と比較して低くなることがわかる。
【００２５】
また、図１（ｃ）及び図１（ｄ）から明らかなように、回折強度の減少率は、所定の程度まで達すると、それ以上時間を掛けて微粉砕処理を継続しても、回折強度の減少率はほとんど変化しないということがわかる。
【００２６】
本実施形態は、これらの実験結果に基づいて、前記ｃ軸に属するミラー指数（００２）における回折強度の粉砕前の回折強度を基準とした減少率が、所定範囲に収まるように原料を微粉砕する処理を実行するものである。
【００２７】
本実施形態における魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法で用いられる魚由来の原料の種類は、特に限定されず、例えば平目、鮭、鱸、鰯、秋刀魚、真鯛などの魚類である。前記知見された傾向は、いずれの魚類であっても同様に示される。また、魚由来の原料であれば、魚皮であってもよいが、魚鱗が比較的魚臭さが少ないことから好ましい。
【００２８】
本実施形態の魚由来の原料の微粉砕工程においては、あらかじめ洗浄して不純物を除去した未脱灰の魚由来の原料をカッターミルで９０秒程度一次粉砕した後、微粉砕手段によって、Ｘ線回折法によって得られたヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度が粉砕前の回折強度と比較して１３．４％〜３７．２％減少するように微粉砕する。
【００２９】
前記微粉砕手段は、特に限定されないが、複数個の粉砕媒体ボールと粉体とを収納した処理容器の回転により、該粉体を微粒子化する高速粉体反応装置が好ましく用いられ、特に特許第３４８６６８２号又は特許第３５３３５２６号に開示されているコンバージミルの原理を利用した高速粉体反応装置を用いるのが好ましい。
【００３０】
この高速粉体反応装置は、粉砕用容器や粉砕用ボールの衝突による磨耗分の混入を軽減でき、スケールアップも容易であるので、本実施形態の微粉砕手段として好ましい。但し、前記高速粉体反応装置の規模、性能により、前記所定の回折強度の減少率（１３．４％〜３７．２％）になるのに必要な粉砕処理の実行時間は異なるため、予め実験で当該装置の運転時間と減少率との関係を求めておくことが好ましい。
【００３１】
本実施形態のコラーゲンペプチド抽出工程では、前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行う。
【００３２】
まず、前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理として、前記微粉砕した魚由来の原料を水中に浸漬する。これにより、魚由来の原料のコラーゲンタンパク質の大半がゼラチン化して水に溶出するので、後述のタンパク質分解酵素による加水分解を行いうる。このコラーゲンタンパク質を短時間でゼラチン化して水に溶出させるためには、水温が３０℃以上であることが好ましい。一方で、前記水温が７０℃を超えてしまうと、後述のタンパク質を加水分解する酵素が活性を失ってしまうため、６０℃以下であることが好ましい。
【００３３】
次に、前記コラーゲンタンパク質を加水分解する処理は、前記水に溶出したコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によって、加水分解することにより行われる。本加水分解処理は、水に可溶化したコラーゲン（ゼラチン）のみならず、上記温度条件で可溶化できないコラーゲンにも作用することができるため、さらにコラーゲンペプチドの回収率を上げることができる。
【００３４】
本実施形態に用いられるタンパク質分解酵素は、化学的な脱灰処理なしに、コラーゲンタンパク質を加水分解することができるものであれば特に制限されない。例えば、天野エンザイム株式会社製「プロテアーゼＮアマノＧ（商標）」、「プロレザーＦＧ−Ｆ（商標）」やナガセケムテックス株式会社製「デナプシン２Ｐ（商標）」など、食品に使用できるものが好ましい。なお、これらの酵素を変性させ活性を失わせることは、沸騰水浴下（９５℃）で１０分間加熱処理することにより行なうことができる。
【００３５】
本実施形態の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によって得られたコラーゲンペプチドは、公知の手段によって更に濃縮・精製することができる。例えば、濃縮には遠心濃縮や凍結乾燥など、精製には活性炭や合成吸着樹脂などを挙げることができる。なお、活性炭による精製の場合、補助剤（例えば、珪藻土（ダイアトマイト））とともに用いることが好ましい。
【００３６】
本実施形態の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、Ｘ線回折法によって魚由来の原料に含まれるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度を測定し、微粉砕前の回折強度を基準とした回折強度の減少率を把握することにより、メカノケミカル効果の発生の程度を認識することができる。そして、メカノケミカル効果の発生の程度により、コラーゲンペプチドの回収率が変化することから、工業上効率的にコラーゲンペプチドの回収率が達成できる程度のメカノケミカル効果が発生させるために、必要最小限の前記微粉砕処理をすべき程度を認識することができる。
【００３７】
また、メカノケミカル効果が与えられるように微粉砕処理された魚由来の原料は、３０℃〜６０℃という酵素が活性を失わない温度域でコラーゲンの可溶化及び高抽出化が実現できるため、従来別工程で行なわれていた加熱によるコラーゲンタンパク質抽出処理と酵素による加水分解処理を同時に行なうことができる。
【００３８】
しかも、この微粉砕処理によれば、発生する嵩が従来の粉砕処理で発生する嵩と比較して著しく少ないので、前記コラーゲンタンパク質を抽出する処理及び前記加水分解処理に際して、一度により多量の粉砕原料を対象としてコラーゲンの抽出をすることができる。
【００３９】
この結果、本実施形態の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収することができる。
【実施例】
【００４０】
［鰯を原料とした実験例］
<実施例１>
（鱗の採取、洗浄、脱脂、乾燥）
鮮度低下を防ぐため−３５度で凍結保存しておいた鰯の鱗に対し、水道水で十分洗浄処理を施した。この洗浄済みの鱗にアセトンを添加し脱脂処理を行ない、これを数回繰り返した。さらに、この鰯の鱗をドラフト内で自然乾燥後、シリカゲル入りのデシケーター内で２〜３日間乾燥させ、洗浄乾燥鱗を得た。
【００４１】
（鱗の一次粉砕）
前記洗浄乾燥鱗を、室温２０〜２５℃でＰｏｗｅｒ ｇｒｉｎｄｅｒ（カッターミル、Ｍａｓｔｅｒ社製）を回転数３００００ｒｐｍで９０秒の粉砕処理を行った。
【００４２】
（鱗の二次粉砕）
前記粗粉砕鱗を、特許第３４８６６８２号及び特許第３５３３５２６号に記載されたコンバージミルの原理を利用した高速粉体反応装置（株式会社真壁技研社製）を用いて微粉砕した。具体的には、上記高速粉体反応装置のジルコニア製粉砕容器（１０００ｍｌ）に、原料粉として粗粉砕鱗３０ｇと、媒体ボールとして直径１０ｍｍのジルコニアボール２７１ｇ（８０ｍｌ）とを投入し、空気雰囲気下、回転数７００ｒｐｍにて６０分の粉砕処理を行った。
【００４３】
これにより、得られた微粉砕鱗の平均粒子径は３６μｍであった。また、Ｘ線回折法によるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）に帰属する回折強度は、粉砕前の回折強度と比較すると３５．８％減少した。
【００４４】
（抽出・加水分解）
上記の微粉砕鱗を０．１ｇ秤量し、これに蒸留水１０ｍｌと１４ｍｇ／ｍｌに調製したプロテアーゼ（天野エンザイム（株）製プロレザー（商標）ＦＧ−Ｆ）を０．１ｍｌ加え、酵素製剤終濃度約１４０μｇ／ｍｌとし、当該液体を６０℃に保ち、６０分攪拌混合して加水分解した。
【００４５】
（固液分離）
加水分解後の懸濁液を１２０００×ｇ、２０分の条件で遠心分離を行ない、コラーゲンペプチドを含む上清液を回収した。
【００４６】
（酵素の変性）
沸騰水浴下で１０分間加熱することで酵素の失活・変性処理を行なった。
【００４７】
（変性酵素の除去）
固液分離と同条件で遠心分離を行ない、変性酵素を除去し上清液（コラーゲンペプチド）を得た。
【００４８】
上記溶液のコラーゲンペプチド濃度はウシ血清アルブミンを標準タンパク質とするＬｏｗｒｙ法（非特許文献：Ｌｏｗｒｙら (１９５１) Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９２巻， ｐ２６３−２７５）により定量することで求めた。得られた濃度に酵素の変性処理後の液量を乗じてコラーゲンペプチド量を算出した。なお、上記固液分離操作前に酵素の変性処理を施せば、固液分離の際ヒドロキシアパタイトと変性酵素の除去を同時に行なうことができるが、本実施例では抽出・加水分解工程で得られるコラーゲンペプチド量を純粋に評価するため、上記手順に従って処理を行なった。
【００４９】
（Ｘ線回折強度の測定）
Ｘ線回折強度の測定に用いた魚鱗粉末試料は、タンパク質が共存すると回折強度のベースラインが大きく乱れるため、これを回避するため十分に除タンパクされたものを使用した。具体的には、魚鱗粉末試料に対して、特開２００４‐５７１９６の実施例１と同様の操作を施し、得られる残渣（ヒドロキシアパタイト）を洗浄・乾燥して測定用試料を得た。Ｘ線回折強度の測定には日本電子株式会社製のＪＤＸ−３５３０を用い、Ｘ線源：Ｃｕ／Ｋα線、管電圧：３０ｋＶ、管電流：３０ｍＡ、測定範囲：２θ＝７０°まで、Ｘ線のスキャンスピード：０．０４°×０．５ｓｅｃの条件で測定した。
【００５０】
（コラーゲンペプチドの回収率）
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図２（ａ）に示された表１の実施例１の欄に示した。なお、実施例１におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９７．８％であった。
【００５１】
なお、前記コラーゲンペプチドの回収率は、単位質量あたりの魚鱗から回収可能なコラーゲンペプチドの最大値が、回収率１００％として定義される。この最大値は実験により定められる。たとえば、コンバージミルで魚鱗を粉砕処理する継続時間を延ばしても、回収率が向上しなくなったときの値が当該最大値として定められる。なお、コラーゲンペプチドの回収率が向上しなくなった状態では、ミラー指数（００２）の回折強度の減少率も４０％以上には向上しなくなった。このことから、回折強度の減少率は４０％が上限であり、減少率が４０％に到達すれば、コラーゲンペプチドの回収率は１００％となることが推測される。
【００５２】
<実施例２>
二次粉砕の時間を１８０分に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。
【００５３】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図２（ａ）に示された表１の実施例２の欄に示した。なお、実施例２におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９９．８％であった。
【００５４】
<比較例１>
二次粉砕を行わなかった以外は、実施例１と同様の操作を行った。
【００５５】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図２（ａ）に示された表１の比較例１欄に示した。なお、比較例１におけるコラーゲンペプチドの回収率は、６０．３％であった。
【００５６】
<考察>
鰯の魚鱗を試料に用いた実施例１、２及び比較例１のヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の関係を図２（ｂ）に示した。なお、回折強度の減少率は、比較例１の回折強度を基準として各実験例の回折強度の減少の割合を算出することによって求めた。
【００５７】
図２（ｂ）によれば、鰯を原料とした実験より求めた前記回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率との近似曲線として、近似式（１）が算出される。
【００５８】
【数１】
【００５９】
上述のとおり、本来、工業上の要請としてコラーゲンペプチドの回収率は７５％以上必要とされている。そのため、当該近似式（１）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が３．８２％以上であれば、コラーゲンペプチドの回収率は７５％を超えることがわかる。
【００６０】
また、コラーゲンペプチドの回収率はほぼ１００％（９５％〜９８％）に到達する程度に微粉砕する処理を実行すれば十分であり、それ以上に回収率を上昇させるために処理工程を追加又は継続して実行することは、却って工業上の作業効率の点から好ましくない。
【００６１】
そのため、当該式（１）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が１３．７％以下であれば、コラーゲンペプチドの回収率を９５％以内に調整でき、工業上の作業効率の観点から好ましくない余分な微粉砕処理を回避しうることがわかる。なお、前記回折強度の減少率が１３．７％であるときのコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加の割合、すなわち、前記回折強度の減少率が１３．７％であるときの近似式（１）の接線の傾きは、０．８１であることがわかる。
【００６２】
［秋刀魚を原料とした実験例］
<実施例３>
試料を鰯の鱗から秋刀魚の魚鱗に変更した。また、二次粉砕としてコンバージミルを用いて２０分間微粉砕した。それ以外の操作は実施例１と同様に行った。
【００６３】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の実施例３の欄に示した。なお、実施例３におけるコラーゲンペプチドの回収率は、８０．３％であった。
【００６４】
<実施例４>
二次粉砕の時間を４０分とした以外は、実施例３と同様の操作を行った。
【００６５】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の実施例４の欄に示した。なお、実施例４におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９２．９％であった。
【００６６】
<実施例５>
二次粉砕の時間を６０分とした以外は、実施例６と同様の操作を行った。
【００６７】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の実施例５の欄に示した。なお、実施例５におけるコラーゲンペプチドの回収率は、９９．９％であった。
【００６８】
<比較例２>
二次粉砕を行わなかった以外は、実施例３と同様の操作を行った。
【００６９】
ヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における粉砕前の回折強度からの回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の結果は、図３（ａ）に示された表２の比較例２欄に示した。なお、比較例２におけるコラーゲンペプチドの回収率は、３７．９％であった。
【００７０】
<考察>
秋刀魚の魚鱗を試料に用いた実施例３〜５及び比較例２のヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率の関係を図３（ｂ）に示した。なお、回折強度の減少率は、比較例２の回折強度を基準として各実験例の回折強度の減少の割合を算出することによって求めた。
【００７１】
図３（ｂ）によれば、秋刀魚を原料とした実験より求めた前記回折強度の減少率とコラーゲンペプチドの回収率との近似曲線として、近似式（２）が算出される。
【００７２】
【数２】
【００７３】
そして、同様に近似式（２）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が１３．４％以上であれば、コラーゲンペプチドの回収率は７５％を超えることがわかる。
【００７４】
また、当該式（２）に基づいて計算すると、前記回折強度の減少率が３７．２％以下であれば、コラーゲンペプチドの回収率を９５％以内に調整できることがわかる。なお、前記回折強度の減少率が３７．２％であるときのコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加の割合、すなわち、前記回折強度の減少率が３７．２％であるときの近似式（２）の接線の傾きは、０．３４であることがわかる。
【００７５】
<結果>
図２（ｂ）及び図３（ｂ）によれば、一次粉砕後の魚鱗にメカノケミカル効果を付与できる粉砕機により二次粉砕すると、鰯及び秋刀魚の両魚鱗とも粉砕処理時間の経過とともにヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）における回折強度の減少率が増加することがわかる。
【００７６】
また、図２（ｂ）及び図３（ｂ）によれば、回折強度の減少率は、所定の程度まで達すると、それ以上時間を掛けて微粉砕処理を継続しても、回折強度の減少率はほとんど変化しないということがわかる。
【００７７】
この結果、前記回折強度の減少率が所定範囲（例えば鰯であれば、３．８２％〜１３．７％、例えば秋刀魚であれば、１３．４％〜３７．２％）に収まるように微粉砕処理を実行する魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法によれば、処理時間の短縮しつつ、コラーゲンペプチドを効率よく高回収率で回収することができることが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚由来の原料をＸ線回折法において得られるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）の回折強度が粉砕前を基準とした減少率が所定範囲に収まるように微粉砕する原料微粉砕工程と、３０℃〜７０℃の温度の水中において前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行うコラーゲンペプチド抽出工程を有し、
前記所定範囲の下限値は、コラーゲンペプチドの回収率を７５％以上にする観点から定められ、前記所定範囲の上限値は、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持する観点から定められていることを特徴とする魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法。
【請求項２】
前記所定の割合は１３．４％〜３７．２％であることを特徴とする請求項1記載の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法。
【請求項１】
魚由来の原料をＸ線回折法において得られるヒドロキシアパタイト結晶のミラー指数（００２）の回折強度が粉砕前を基準とした減少率が所定範囲に収まるように微粉砕する原料微粉砕工程と、３０℃〜７０℃の温度の水中において前記微粉砕した魚由来の原料からコラーゲンタンパク質を抽出する処理と抽出されたコラーゲンタンパク質をタンパク質分解酵素によってコラーゲンペプチドに加水分解する処理とを一の工程として行うコラーゲンペプチド抽出工程を有し、
前記所定範囲の下限値は、コラーゲンペプチドの回収率を７５％以上にする観点から定められ、前記所定範囲の上限値は、前記回折強度の減少率に対するコラーゲンペプチドの回収率の比率の増加を０．３４以上に維持する観点から定められていることを特徴とする魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法。
【請求項２】
前記所定の割合は１３．４％〜３７．２％であることを特徴とする請求項1記載の魚由来のコラーゲンペプチドの抽出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１０９９２７（Ｐ２０１１−１０９９２７Ａ）
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６６４２７（Ｐ２００９−２６６４２７）
【出願日】平成２１年１１月２４日（２００９．１１．２４）
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月９日（２０１１．６．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月２４日（２００９．１１．２４）
【出願人】（５０４２３７０５０）独立行政法人国立高等専門学校機構 (656)
【Ｆターム（参考）】
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