龍眼肉抽出物またはこれを含む混合抽出物を含有する退行性脳神経疾患の予防用または治療用の組成物
【課題】退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物および食品組成物の提供。
【解決手段】ムクロジ科植物である龍眼の木の仮種皮である龍眼肉の抽出物を有効成分として含む薬学的組成物および食品組成物。該組成物へ、さらに藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含み、また、さらに葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択される一種以上の抽出物を追加的に含む薬学的組成物および食品組成物であることも好ましい。該退行性脳神経疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択されるものであることが好ましい。
【解決手段】ムクロジ科植物である龍眼の木の仮種皮である龍眼肉の抽出物を有効成分として含む薬学的組成物および食品組成物。該組成物へ、さらに藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含み、また、さらに葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択される一種以上の抽出物を追加的に含む薬学的組成物および食品組成物であることも好ましい。該退行性脳神経疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択されるものであることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、龍眼肉抽出物またはこれを含む混合抽出物を含有する、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の組成物に関し、より具体的には、前記抽出物を有効成分として含む退行性脳神経疾患の予防用もしくは治療用の薬学的組成物、または予防用もしくは改善用の食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）で代表される退行性脳神経疾患は、脳の黒質緻密部のドーパミン神経細胞の死滅が特徴的であり、その結果、線条体内の神経伝達物質であるドーパミンが減少することによって、神経伝達体系全体の均衡が崩れ、その結果としてパーキンソン病の代表的な症状である震え（ｔｒｅｍｏｒ）、硬直（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、運動緩徐（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、姿勢の不安定（ｐｏｓｔｕｒａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）などの症状が現れる。
【０００３】
しかし、パーキンソン病のような退行性脳神経疾患の発病原因はまだ正確に明らかになっておらず、単に遺伝的な要因や外部からの毒性などによってドーパミン性神経細胞の消失が生じる可能性があるという仮説があり、最近の一連の研究では脳の動脈硬化症、一酸化炭素中毒、薬物、副甲状腺機能低下症などによる代謝性、外傷性脳炎後遺症などが関与しているといわれている。
【０００４】
パーキンソン病のような退行性脳神経疾患に対する効果的な治療法は、１９７０年代までは殆どなかったが、ドーパミンの前駆物質であるＬ−ドーパを使用して、脳組織で減少しているドーパミンの補充、またはドーパミン受容体作用剤、抗コリン薬剤、エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ＝ｄｅｐｒｅｙｌ）などを使用する治療法などが知られている。しかし、これらの薬品の大部分は原因的な治療ではなく、症状を調節する役割を果たすものであり、これらのような薬品の長期投与は薬品副作用の問題点を招くこととなる。例えば、抗コリン薬剤は自律神経系の異常や精神機能の異常などが現れることがあり、高齢の患者に持続的に投与することに限界がある。また、Ｌ−ドーパ製剤の場合、長期間の服用によって漸次効果が低下し、体がよじれ、手や足が意図せずに動く異常運動が生じるなどの副作用が発生するようになる。その他、高周波を利用した神経刺激術、即ち、高周波破壊術または深部脳刺激術などの手術治療も行われているが、浸湿的な手術を必要とし、また、多大な費用がかかるという問題がある。
【０００５】
したがって、パーキンソン病のような退行性脳神経疾患の治療において、臨床症状を好転させるための対症的治療法の開発も重要であるが、パーキンソン病の直接的な原因である黒質内ドーパミン性神経細胞の死滅を防止する根本的な治療方法の開発も、緊急に要求されている。
【０００６】
また、パーキンソン病のような退行性脳神経疾患の原因に対する最近報告された研究によれば、パーキンソン病患者の脳では、「α−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）」という蛋白質が誤って畳まれた奇形状態で発見される。このα−シヌクレインが細胞に蓄積することによって神経細胞を破壊する現象は、パーキンソン病の特徴の１つとして知られている。したがって、このような異常蛋白質の凝集を防止または溶解する方法を研究することが、パーキンソン病の進行の遅延または予防を可能にする新たな治療法として注目されている（Ｒｙｕ， Ｊ． 外２人。 Ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎａ． Ｋｏｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎ． ３３；１９１〜１９３、２００２）。
【０００７】
一方、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）は、人体内で生じる代表的な蛋白質分解メカニズムであって、多くの退行性脳神経疾患患者はこの機能の低下により変形した蛋白質の蓄積が制御できないことが知られている（Ｏｌａｎｏｗ Ｃ．Ｗ， ＭｃＮａｕｇｈｔ Ｋ．Ｓ． Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｍｏｖ． Ｄｉｓｏｒｄ．２００６；２１：１８０６〜１８２３）。ＵＰＳ以外にもう１つの重要な蛋白質分解のメカニズムには、自食作用リソソーム経路（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐａｔｈｗａｙ；ＡＬＰ）があり、最近退行性脳神経疾患治療の重要な標的として研究されている（Ｂａｎｄｈｙｏｐａｄｈｙａｙ Ｕ，Ｃｕｅｒｖｏ ＡＭ．Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２００７；４２：１２０〜８）。即ち、ＵＰＳの機能に異常が生じてリソソームの分解機能が遮断されると、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）というまた別の蛋白質分解経路が活性を示しながら、一種の補償作用を試みる。このメカニズムではα−シヌクレインのような異常蛋白質を分解して、蛋白質が脳神経細胞に蓄積されることによる細胞損傷を起こすことを防止する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖｉｃｅｎｔｅ Ｍ． Ｃｕｅｒｖｏ Ａ．Ｍ， Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｃｒｅｗ ｇｏｅｓ ｏｎ ｓｔｒｉｋｅ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７；６：３５２〜３６１．，Ｒａｖｉｋｕｍａｒ Ｂ， Ｄｕｄｅｎ Ｒ， Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ Ｄ．Ｃ． Ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｐｒｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ ａｒｅ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｐｈａｇｙ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１：１１０７〜１１１７）。したがって、ＵＰＳ機能に異常が生じた退行性脳神経疾患患者に対しては、ＡＬＰ、即ち、自食作用を通した治療法の開発が重要である。
【０００８】
一方、龍眼の木はムクロジ科 （Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）に属する植物であり、この植物の 假種皮を龍眼肉（生薬名：ｌｏｎｇａｎ ａｒｉｌｌｕｓまたはｌｏｎｇａｎａｅ ａｒｉｌｌｕｓ）という。東医宝鑑によれば、龍眼肉の効能は補益心脾、養血安神であり、主治病症は健忘失眠、血虚萎黄、気血不足、心悸亢進であって、漢方では強壮剤、鎮静剤として健忘症と不眠症に主に服用するといわれている。
【０００９】
しかし、前記龍眼肉が退行性脳神経疾患の予防および治療に効果があるか否かについては、全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは退行性脳神経疾患の予防および治療に効果がある天然物質に関して研究していたところ、龍眼肉およびこれを含む混合抽出物が、退行性脳神経疾患の予防および治療に非常に効果的であることを明らかにして、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明は、龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、龍眼肉抽出物を含む退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような課題を解決するために、本発明は龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は龍眼肉抽出物を含む、退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物を提供する。
【００１５】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１６】
本発明で「龍眼肉」は、龍眼の木の仮種皮を意味し、生薬名はｌｏｎｇａｎ ａｒｉｌｌｕｓまたはｌｏｎｇａｎａｅ ａｒｉｌｌｕｓである。
【００１７】
本発明で「藁本」は、セリ科に属する薬品植物であり、生薬名がａｎｇｅｌｉｃａｅ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａｅ ｒａｄｉｘであり、本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００１８】
本発明で「遠志」は、遠志科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）に属する薬品植物であり、生薬名がｐｏｌｙｇａｌａｅ ｒａｄｉｘであり、本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００１９】
本発明で「葛根」は、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ （Ｗｉｌｌｄ．） Ｏｈｗｉ）の周皮を除去した根を意味する。
【００２０】
本発明で「オウゴン」は、学名がＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ Ｒａｄｉｘであり、双子葉植物キク亜綱シソ科の多年草で、本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００２１】
本発明で「桔梗」は、学名がＰｌａｔｙｃｏｄｉ Ｒａｄｉｘで、キキョウ科の多年草であり、夏に白色と紫色の花が咲く。本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００２２】
本発明で「升麻」は、学名がＣｉｍｉｃｉｆｕｇａｅ Ｒｈｉｚｏｍａで、キンボウゲ科の升麻（Ｃｉｍｉｃｉｆｕｇａ ｈｅｒａｃｌｅｉｆｏｌｉａ Ｋｏｍａｒｏｖ）または同属植物の根茎で作った薬剤である。
【００２３】
本発明で「ビャクシ」は、繖形科のヨロイグサ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ Ｂｅｎｔｈａｍ ｅｔ Ｈｏｏｋｅｒ）またはその変種の根を乾燥させて作った薬材で、学名がＡｎｇｅｌｉｃａｅ Ｄａｈｕｒｉｃａｅ Ｒａｄｉｘである。
【００２４】
本発明で「ライフクシ」は、十字花科の大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）または同属植物の種を使用して作った薬材であり、学名がＲａｐｈａｎｉ Ｓｅｍｅｎである。
【００２５】
本発明で「石菖蒲」は、学名がＡｃｏｒｉ Ｇｒａｍｉｎｅｒｉ Ｒｈｉｚｏｍａで単子葉植物天南星科目天南星科の多年草である。本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根茎を使用することができる。
【００２６】
本発明で「退行性脳神経疾患」は、これに限定されないが、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）および多発性硬化症であり得、前記筋萎縮性側索硬化症はルー・ゲーリック病であり得、最も好ましくはパーキンソン病であり得る。
【００２７】
本発明で抽出物は、熱水抽出物または有機溶媒抽出物であってもよく、当業界に公知の植物抽出物の製造方法を利用して製造することができる。好ましくは水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択された一種以上を使用して製造することができる。
【００２８】
本発明の抽出物は、龍眼肉、好ましくは、龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上を混合し、より好ましくは前記混合物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上を追加混合し、これを水およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された一種以上を使用して１次抽出した抽出物であるか、または前記１次抽出物を水、ヘキサン、塩化メチレンおよびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された一種以上を使用して追加的に抽出した２次抽出物であってもよい。より好ましくは、前記２次抽出物をアセトニトリル、メタノール、アセトンおよび水からなる群より選択された一種以上を使用して追加的に抽出した３次抽出物であってもよい。
【００２９】
本発明の一実験例では、龍眼肉またはこれを含む混合抽出物として、水を加えて製造された熱水抽出物を使用する（実施例１参照）。
【００３０】
本発明の退行性脳神経疾患の予防または治療に活性がある有効成分は、龍眼肉単独抽出物（ＹＡ）であってもよいが、好ましくは、龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物であるか、または龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物がさらに追加的に含有された抽出物であってもよい。より好ましくは、龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物（ＤＧ）、最も好ましくは、龍眼肉、藁本、遠志葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲の混合抽出物（ＭＹＨ）であってもよい。
【００３１】
前記抽出物が龍眼肉および遠志の混合抽出物である場合、龍眼肉および遠志が１：０．２〜１：１０の重量比で、より好ましくは１：０．４〜１：５の重量比で、より一層好ましくは１：０．８〜１：２．５の重量比で混合されて抽出されたものであるか、最も好ましくは龍眼肉および遠志が１：１の重量比で混合されて抽出されたものであってもよい。
【００３２】
前記抽出物が龍眼肉および藁本の混合抽出物である場合、龍眼肉および藁本が１：０．１〜１：５の重量比で、より好ましくは１：０．２〜１：２．５の重量比で、より一層好ましくは１：０．８〜１：１．２５の重量比で混合されて抽出されたものであるか、最も好ましくは龍眼肉および遠志が１：１の重量比で混合されて抽出されたものであってもよい。
【００３３】
前記抽出物が龍眼肉、遠志および藁本の混合抽出物である場合、好ましくは龍眼肉、遠志および藁本が１：０．１〜１０：０．１〜１０の重量比で、１：０．２〜５：０．２〜５の重量比で、より一層好ましくは１：０．４〜２．５：０．４〜２．５の重量比で、最も好ましくは１：１：１の重量比で混合（混合抽出物ＤＧと表示する）されて抽出されたものであってもよい。
【００３４】
前記抽出物が龍眼肉、遠志、藁本、葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲抽出物を全て含む場合、これに限定されないが、好ましくは龍眼肉１５〜２０重量部、藁本１０〜１５重量部、遠志１０〜１５重量部、葛根１５〜２０重量部、オウゴン５〜１０重量部、桔梗１〜５重量部、ビャクシ５〜１０重量部、升麻５〜１０重量部、ライフクシ５〜１０重量部および石菖蒲１５〜２０重量部で混合されて抽出されものであってもよく、好ましくは龍眼肉１５〜１８重量部、藁本１０〜１３重量部、遠志１０〜１３重量部、葛根１５〜１８重量部、オウゴン５〜８重量部、桔梗１〜３重量部、ビャクシ５〜８重量部、升麻５〜８重量部、ライフクシ５〜８重量部および石菖蒲１５〜１８重量部で混合されて抽出されたものであってもよく、最も好ましくは龍眼肉１６〜１８重量部、藁本１０〜１２重量部、遠志１０〜１２重量部、葛根１６〜１８重量部、オウゴン５〜７重量部、桔梗２〜３重量部、ビャクシ５〜７重量部、升麻５〜７重量部、ライフクシ５〜７重量部および石菖蒲１６〜１８重量部で混合されて抽出されたものであってもよい。
【００３５】
本発明の一実施例では、龍眼肉抽出物、龍眼肉が含まれた混合抽出物の脳細胞の死滅に及ぼす効果を分析した結果、ＭＰＴＰ（実施例２参照）で脳細胞の死滅を誘導した後、前記抽出物らを投与した結果、前記抽出物らは脳細胞の死滅を効果的に抑制することができる活性があり、脳細胞の保護効果があることが分かる。
【００３６】
また、本発明の一実施例では、龍眼肉抽出物、龍眼肉が含まれた混合抽出物がパーキンソン病の原因といわれているα−シヌクレイン蛋白質の分解を促進する、自食作用を誘導する効果が非常に優れていることが分かる（実施例３参照）。
【００３７】
また、本発明の一実施例では、（ｉｎ ｖｉｖｏ実験）ＭＰＴＰでマウスにパーキンソン病を誘発させた後、行動実験（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ、Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）およびドーパミン細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）保護活性実験を行った結果、龍眼肉抽出物、龍眼肉が含まれた混合抽出物を投与した場合、ＭＰＴＰによって引き起こされる運動機能の退化を復元させ（実施例４参照）、また、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）と黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ）で優れたドーパミン細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の保護活性を示すことが分かる（実施例４参照）。ひいては、チロシン加水分解酵素（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）に対する組織免疫染色方法（ＴＨ−ＩＨＣ）とアビジン‐ビオチンペルオキシターゼ（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を利用した免疫染色方法（ＴＨ−ＩＲ）によってもＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を効果的に抑制することができることが分かる（実施例４参照）。
【００３８】
したがって、本発明の薬学的組成物が龍眼肉の単独抽出物や、好ましくは龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物、より好ましくは前記混合抽出物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物を有効成分として含むことによって、退行性脳神経疾患の予防または治療の効果が著しく優れている。
【００３９】
より具体的には、本発明の薬学的組成物が、ドーパミン性神経系に選択的作用をするＭＰＴＰによる神経毒性と、α−シヌクレイン蛋白質凝集による神経毒性とから、ドーパミン神経細胞を有意性があるように保護することによって、退行性脳神経疾患を予防および治療することができることが分かる。
【００４０】
本発明の薬学的組成物内の有効成分としての前記抽出物の含量は、使用形態および目的、患者の状態、症状の種類および軽重などに応じて適切に調節することができ、固形分の重量基準で０．００１〜９９．９重量％、好ましくは０．１〜５０重量％であってもよく、これに限定されない。前記「固形分の重量」は抽出物中の溶媒成分を除去して残った成分の重量をいう。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、ヒトを含む哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与方式は通常使用される全ての方式であってもよく、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内の硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）への注射によって投与することができる。本発明の薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤型、経皮剤、座薬および滅菌注射溶液の形態の非経口剤型などに剤型化して使用することができる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、前記抽出物以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤などの補助剤を追加的に含むものであってもよい。本発明の薬学的組成物に含まれることのある担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトル、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は前記遠志、藁本および龍眼肉抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤することができる。また、単なる賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤らも使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬、経皮剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。座薬の基剤としては、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されることができる。
【００４３】
本発明の薬学的組成物はヒトに単独で投与することができるが、一般的に投与方式と標準薬剤学的慣行（ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を考慮して選択された薬剤学的担体と混合して投与することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、デンプンまたはラクトースを含む錠剤形態で、または単独または賦形剤を含むカプセル形態で、または味や色を有するようにする化学薬品を含むエリキシルまたは懸濁剤の形態で経口、口腔内または舌下投与することができる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、メチルセルロース、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）のような半合成グリセリド、または杏仁油（ａｐｒｉｃｏｔ ｋｅｒｎｅｌ ｏｉｌ）とＰＥＧ−６エステルの混合物、またはＰＥＧ−８とカプリルリック／カプリックグリセライド（Ｃａｐｒｙｌｉｃ／Ｃａｐｒｉｃ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の混合物のようなグリセリド混合物）のような薬剤学的に許容可能な添加剤と共に剤型化することができる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物の投与容量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患の程度に応じて変更することができ、一定時間の間隔で１日１回〜数回に分割投与することもできる。例えば、有効成分の含量を基準に１日投与量が０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。前記投与量は平均的な場合を例示したもので、個人的な差によってその投与量が高くなったり低くなったりすることができる。本発明の薬学的組成物の１日投与量が前記投与容量未満であれば有意性ある効果を得ることができず、それ以上を超える場合には非経済的であるばかりか、常用量の範囲を超えるため好ましくない副作用が現れる可能性があるので、前記範囲とすることが好ましい。
【００４５】
前記患者はヒトを含む哺乳動物をいい、好ましくは退行性脳神経疾患、より好ましくはパーキンソン病と診断されたヒトをいう。
【００４６】
一方、本発明の退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物は、龍眼肉単独抽出物、好ましくは龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む混合抽出物、より好ましくは前記混合抽出物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む混合抽出物を含むことを特徴とする。
【００４７】
前記組成物の製造方法および退行性脳神経疾患を予防し症状を改善することができる活性については前述した通りである。
【００４８】
本発明の食品組成物は、機能性食品、栄養補助剤、健康食品および食品添加剤等の全ての形態を含む。前記食品組成物の類型は当業界に公知の通常の方法によって多様な形態に製造することができる。
【００４９】
例えば、健康食品としては、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物自体を、お茶、ジュースおよびドリンクの形態に製造して飲用に供したり、顆粒化、カプセル化および粉末化して摂取することができる。また、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物と退行性脳神経疾患の改善効果があるといわれている公知の活性成分とを共に混合して組成物の形態に製造することができる。
【００５０】
また、機能性食品としては、飲み物（アルコール性飲み物を含む）、果実およびその加工食品（例：果物缶詰め、瓶詰め、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類およびその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コーンビーフなど）、パン類および麺類（例：うどん、そば、ラーメン、スパゲティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、醤油、ソースなど）などに、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物を添加して製造することができる。
【００５１】
また、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物を食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態に製造して使用することができる。
【００５２】
本発明の食品組成物のうち、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物の好ましい含有量としては、食品１００ｇ当り約０．００１ｇ〜２０ｇである。好ましくは、本発明での前記龍眼肉抽出物または混合抽出物は特に、退行性脳神経疾患の改善効果があるといわれた活性成分と共に混合して健康食品の形態に製造することができる。
【発明の効果】
【００５３】
本発明の組成物は、龍眼肉抽出物またはこれを含む混合抽出物を有効成分として含むことによって、退行性脳神経疾患の予防効果または治療効果が著しく優れており、特に本発明の組成物はドーパミン性神経系に選択的作用をするＭＰＴＰによる神経毒性と、α−シヌクレイン蛋白質凝集による神経毒性からドーパミン神経細胞を有意性があるように保護することによって、退行性脳神経疾患を効果的に予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】龍眼肉抽出物が、濃度増加に応じて、ＭＰＴＰで誘発された脳細胞の死滅に及ぼす効果を測定した結果である（ＹＡ：龍眼肉）。
【図１ｂ】龍眼肉抽出物に藁本および遠志抽出物を混合した混合抽出物（ＤＧ）が、濃度増加に応じて、ＭＰＴＰで誘発された脳細胞死滅に及ぼす効果を測定した結果である。
【図１ｃ】龍眼肉と藁本の混合抽出物、あるいは龍眼肉と遠志の混合抽出物と龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物が、多様な混合比率に応じて、ＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果を測定した結果である（ＹＡまたはＹ：龍眼肉、ＷＪまたはＷ：遠志、ＧＢまたはＧ：藁本、Ｙ１Ｗ１：龍眼肉と遠志が１：１の重量比で混合された場合）。
【図１ｄ】混合抽出物（ＭＹＨ）が、濃度増加に応じて、ＭＰＴＰで誘発された脳細胞死滅に及ぼす効果を測定した結果である。
【図２ａ】龍眼肉抽出物（ＹＡ）の濃度増加に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｂ】龍眼肉抽出物（ＹＡ）と混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導活性を比較した実験結果である。
【図２ｃ】混合抽出物（ＤＧ）の濃度の増加に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｄ】混合抽出物（ＤＧ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｅ】自食作用阻害剤を利用した混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導効果を検証した実験結果である。
【図２ｆ】混合抽出物（ＭＹＨ）の濃度の増加に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｇ】混合抽出物（ＭＹＨ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｈ】自食作用阻害剤を利用した混合抽出物（ＭＹＨ）の自食作用誘導効果を検証した実験結果である。
【図３ａ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病（を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対する混合抽出物（ＤＧ）の行動試験（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）のＴ-回転（Ｔ−ｔｕｒｎ）の結果（％）を示したグラフである（各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊は対照群に比べてｐ＜０．０１である場合、♯はｐ＜０．０５である場合、♯♯はｐ＜０．０１である場合を意味する）。
【図３ｂ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対する混合抽出物（ＤＧ）の行動試験（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）Ｔ−ＬＡの結果（％）を示したグラフである（各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊は対照群に比べてｐ＜０．０１である場合、♯はｐ＜０．０５である場合、♯♯はｐ＜０．０１である場合を意味する）。
【図３ｃ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対する混合抽出物（ＤＧ）の行動試験（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）の結果（％）を示したグラフである（各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．０５である場合を意味する）。
【図３ｄ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで黒質ドーパミン陽性細胞（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）減少に対する混合抽出物（ＤＧ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフと、ＤＧの抑制活性効果を示した写真である（Ｘ１００）。（スケールバーは１００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯♯♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．００１である場合を意味する）。
【図３ｅ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで線条体の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）減少に対する混合抽出物（ＤＧ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフと混合抽出物（ＤＧ）の抑制活性効果を示した写真である（Ｘ４０）。（スケールバーは２００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．０５である場合を意味する）。
【図３ｆ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで黒質のドーパミン陽性細胞減少に対する混合抽出物（ＭＹＨ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフとＭＹＨの抑制活性効果を示した写真である（Ｘ４０）。（スケールバーは１００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．００１である場合を意味する）。
【図３ｇ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで線条体の光学密度減少に対する混合抽出物（ＭＹＨ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフとＭＹＨの抑制活性効果を示した写真である（Ｘ１００）。（スケールバーは２００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．０５である場合を意味する）。
【図４ａ】混合抽出物（ＤＧ）が細胞活性度に及ぼす効果を測定した結果である。
【図４ｂ】混合抽出物（ＭＹＨ）が細胞活性度に及ぼす効果を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００５６】
龍眼肉抽出物および龍眼肉を含む混合抽出物の製造
＜１−１＞龍眼肉抽出物の製造
龍眼肉（大田大学付属天安漢方病院）４０ｇをきれいに洗浄して細かく切断した後、重量比率の４倍の水を加えて陶器薬湯器において９５℃で４時間かけて１次抽出した後、ろ過して残った固形分に再び水を半分量追加して、前記と同一の条件で２次抽出した。
【００５７】
前記２種の抽出液を集めてろ過し固形分を除去した後、３２００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清液を収集した。再び上清液を２．０μｍマイクロフィルターを使用して、フィルタリングした液体のみを収集して使用した。
【００５８】
＜１−２＞多様な混合比の龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物の製造
龍眼肉および藁本、龍眼肉および遠志、または龍眼肉、藁本および遠志を全て混合した混合抽出物を、多様な混合比率で構成して、前記実施例＜１−１＞と同一の方法で混合抽出物を製造した。前記薬材原料は全て大田大学付属天安漢方病院で購入した。
【００５９】
特に、龍眼肉、藁本および遠志を１：１：１の比率で混合した抽出物を、混合抽出物ＤＧと命名した。
【表１】
【００６０】
＜１−３＞龍眼肉、葛根、藁本、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシ、遠志および石菖蒲の混合抽出物（ＭＹＨ）の製造
葛根１２ｇ、藁本８ｇ、オウゴン４ｇ、桔梗２ｇ、ビャクシ４ｇ、升麻４ｇ、ライフクシ４ｇ、遠志８ｇ、石菖蒲１２ｇ、龍眼肉１２ｇを購入（大田大学付属天安漢方病院）してそれぞれ準備し、これを前記実施例＜１−１＞と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【表２】
【実施例２】
【００６１】
本発明の混合抽出物がＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
前記実施例１で製造された龍眼肉抽出物、混合抽出物（ＤＧ）および混合抽出物（ＭＹＨ）が、細胞外部に処理したＭＰＴＰ（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）によって誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果を、次の方法で確認した。具体的には、ドーパミン性神経系に選択的に毒性を示す物質であるＮ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、ＭＰＴＰ）を用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に細胞毒性を誘導した後、細胞保護活性実験を行った。
【００６２】
＜２−１＞抽出物が含有された培地
前記実施例１の単一抽出物または混合抽出物を、１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖａｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１％抗生剤を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に、多様な濃度で希釈して使用した。
【００６３】
＜２−２＞細胞培養
神経細胞モデルとして使用される細胞は、ヒト神経細胞種を起源とするＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（寄託番号：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）を選択した。前記細胞は１０％牛胎児血清および１％抗生剤を含む前記実施例＜２−１＞のＭＥＭ培地で培養した。
【００６４】
＜２−３＞細胞毒性実験ＭＴＴ分析
本発明の龍眼肉抽出物と、混合抽出物（ＤＧ）、および混合抽出物（ＭＹＨ）が、４００μＭ ＭＰＴＰで誘導した細胞毒性に対して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞活性度（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）に及ぼす効果を測定するために、公知の細胞毒性測定（ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）方法を使用した。
【００６５】
＜２−３−１＞龍眼肉抽出物が濃度増加に応じてＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−１＞で製造した龍眼肉抽出物を３．１２５、６．２５、１２．５、２５μｇ／ｍｌ濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、ＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を用いて吸光度を測定した。
【００６６】
前記のようにＭＴＴの還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得て、その結果を図１ａに示した。
【００６７】
図１ａに記載した通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は、対照群に比べて６２．７５％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して龍眼肉抽出物３．１２５μｇ／ｍｌ処理群で細胞活性度が１２３％、６．２５μｇ／ｍｌ処理群では細胞活性度が１３８％まで上昇し、以降にも細胞保護活性を示した。
【００６８】
前記結果を通して本発明の龍眼肉抽出物は、外部処理されたＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を、濃度依存的に抑制することが可能であることを確認した。
【００６９】
＜２−３−２＞混合抽出物（ＤＧ）が濃度増加に応じてＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）をそれぞれ２５、５０、１００、２００、３００μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群とＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【００７０】
前記のようにＭＴＴ還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得て、その結果を図１ｂに示した。
【００７１】
図１ｂに記載された通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は対照群に比べて６２．１３％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して混合抽出物（ＤＧ）２５μｇ／ｍｌ処理群で細胞活性度が１１０％まで上昇し、以降にも濃度依存的に細胞保護活性を示した。
【００７２】
前記結果を通じて本発明の混合抽出物（ＤＧ）は外部処理されたＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を、濃度依存的に抑制可能であることを確認した。
【００７３】
＜２−３−３＞多様な混合比率に応じた混合抽出物らがＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果の比較
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−２＞で製造したそれぞれの混合抽出物をそれぞれ２５μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、ＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【００７４】
前記のようにＭＴＴ還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得てその結果を図１ｃに示した。
【００７５】
図１ｃに記載された通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は対照群に比べて７０．２１％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して２種の薬材で構成された混合抽出物処理群の細胞活性度は６５〜７５％の細胞保護活性があることが確認された。特に、龍眼肉および遠志が含有された混合抽出物の場合、１：１〜２、より好ましくは１：１の重量比で混合して製造された場合、非常に効果的な細胞保護活性があることが分かる。また、龍眼肉および藁本が含有された混合抽出物の場合、１：０．５〜１、より好ましくは１：１の重量比で混合して製造された場合、非常に効果的な細胞保護活性があることが分かる。
【００７６】
一方、龍眼肉、遠志および藁本の３種の薬材で構成された混合抽出物処理群の細胞活性度は、８０〜１１０％と細胞保護活性が増加することが分かる。特に、龍眼肉、藁本、遠志を１：０．５〜２：０．５〜２の重量比で混合した場合、より好ましくは１：１：１の重量比で混合する場合、細胞保護活性がより優れていることが分かる。
【００７７】
＜２−３−４＞龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）が濃度増加に応じてＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−３＞で製造した龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）をそれぞれ６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、ＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【００７８】
前記のようにＭＴＴの還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得てその結果を図１ｄに示した。
【００７９】
図１ｄに記載された通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は対照群に比べて６４．７４％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して混合抽出物（ＭＹＨ）を処理した場合、６．２５μｇ／ｍｌでは８５．８６％の細胞保護活性を示し、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度では培地のみで処理した対照群と比較した時、全て完璧に細胞保護活性を示すことを観察することができた。
【００８０】
前記結果を通して本発明の龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）は、外部処理されたＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を濃度依存的に抑制可能であることを確認した。
【実施例３】
【００８１】
本発明の龍眼肉抽出物または混合抽出物が脳神経細胞で自食作用を誘導する効果
ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を利用して神経細胞に分化させたＰＣ１２細胞株で自食作用誘導活性を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現を確認するために、ウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験を下記の通り行った。
【００８２】
＜３−１＞抽出物が含有された培地
前記実施例１の混合抽出物（Ｉ）または混合抽出物（ＩＩ）を１０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖａｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１％抗生剤を含むＤＭＥＭ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｒｄ．， Ｌｏｇａｎ ＵＴ， 米国）に多様な濃度で希釈して使用した。
【００８３】
３−２細胞培養
神経細胞モデルとして使用される細胞は、白ネズミの褐色細胞種を起源とするＰＣ１２細胞（ＮＧＦにより分化，ＲＣＢ０００９，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ 細胞バンク，茨城県つくば市， 日本）を選択した。
前記細胞は１０％牛胎児血清および１％抗生剤を含むＤＭＥＭ培地で培養し、実験に使用する前にＮＧＦを利用して神経細胞に分化させた。
【００８４】
＜３−３＞自食作用誘導活性確認
前記実施例１で製造された龍眼肉抽出物または混合抽出物が自食作用を誘導する効果を確認するために、ウエスタンブロッティングアッセイを利用して自食作用発現マーカーであるＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を測定した。
【００８５】
＜３−３−１＞龍眼肉抽出物の濃度増加に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−１＞で製造した龍眼肉抽出物をそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、捕集して２５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、ＦＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。得られた細胞は、ミトコンドリア溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３％ ＮＰ−４０、１００μＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ アプロチニン）と４℃で２０分間反応させて蛋白質を分離した後、１３，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清液を、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ'ｓ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）によって蛋白質を定量した。
【００８６】
同量の細胞破砕液は、ＳＤＳ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと混合して９９℃で５分間加熱した後に１５％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）を施行した。蛋白質は分子量に基づいて分離するために、単一１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用した。各ゲル当り１５０Ｖで電気泳動した蛋白質は、セミドライ（ｓｅｍｉ−ｄｒｙ）法で、室温で１５Ｃ（ｃｏｕｌｏｍｂ）の電荷を１時間印加してニトロセルロース膜上に移動させた。ニトロセルロース膜はブロッキング緩衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５％スキムミルク／トリス緩衝食塩水）と常温で３０分間反応して非特異的な抗体結合を予防した。ＬＣ３、ＧａｐＤＨに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． ＜Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， 米国＞で購入）は０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５％ スキムミルク／トリス緩衝食塩水に１：１０００で希釈して４℃で一晩反応させた後、２次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． ＜Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，米国＞で購入）を１：２０００の比率で希釈して、１時間反応した。ニトロセルロース膜はＴＢＳで３回洗浄後、ＥＣＬ ｋｉｔを使用してＥＣＬフィルムに現像した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ａに示した。
【００８７】
図２ａに記載された通り、龍眼肉抽出物を処理した場合、１００μｇ／ｍｌ処理群でＬＣ３ ２／ＬＣ３ １の比率が対照群に比べて増加する傾向を確認され、龍眼肉抽出物がＬＣ３ ２蛋白質の発現を誘導することが分かった。
【００８８】
＜３−３−２＞本発明の龍眼肉抽出物と混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導活性の比較
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−１＞で製造した龍眼肉抽出物をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ濃度で処理し、実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）を３００μｇ／ｍｌ処理して、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｂに示した。
【００８９】
図２ｂに示したように、龍眼肉抽出物１００μｇ／ｍｌ処理群でＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が１．７３と増加したのに比べて、混合抽出物ＤＧ３００μｇ／ｍｌ処理群では非常に明確なＬＣ３ ２蛋白質発現が現れ、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が１４．１０であることを確認した。
【００９０】
以上の結果から、龍眼肉抽出物のみならず、龍眼肉、藁本および遠志を混合した抽出物において自食作用の誘導効果が非常に優れていることが分かる。
【００９１】
＜３−３−３＞混合抽出物（ＤＧ）の濃度増加に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）を多様な濃度（７５、１５０、３００、６００μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｃに示した。
【００９２】
図２ｃに示されているように、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は濃度が増加するに伴い自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が増加することを確認することによって、本発明の混合抽出物は濃度が増加するに伴い、自食作用を誘導する効果を増加させることが分かった。
【００９３】
＜３−３−４＞混合抽出物（ＤＧ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性
前記培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）３００μｇ／ｍｌを処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で多様な時間（６、１２、２４、４８ｈ）の間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｄに示した。
【００９４】
図２ｄに記載された通り、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は時間が経過するに伴って自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が対照群に比べて増加したが、特に１２時間が経過した時点で、ＬＣ３ ２／ＬＣ３ １転換比率が最も大きく増加した。
【００９５】
＜３−３−５＞自食作用阻害剤（ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を利用した混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導効果検証
本発明の混合抽出物（ＤＧ）のａｕｔｏｐｈａｇｙ誘導効果をより確実に検証するために、自食作用阻害剤を利用した実験を進行した。本実験に使用された３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ（３ＭＡ）は、特異的な自食作用阻害剤であり、細胞に自食作用を誘発する薬品と共に処理した時、薬品によって誘発される自食作用の効果を抑制することによって、薬品の自食作用誘導効果を検証する実験に主に使用する試薬である（Ｓｅｇｌｅｎ Ｐ．Ｏ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｐ．Ｂ．（１９８２）． ３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ／ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７９；１８８９〜１８９２，１９８２．）
【００９６】
培養されたＰＣ１２細胞に混合抽出物（ＤＧ）３００μｇ／ｍｌのみで処理した実験群と混合抽出物（ＤＧ）３００μｇ／ｍｌと３ＭＡ １０ｍＭを混合処理した実験群を５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｅに示した。
【００９７】
図２ｅに記載された通り、混合抽出物（ＤＧ）のみで処理した実験群で観察されたＬＣ３ ２蛋白質の発現が混合抽出物（ＤＧ）と３ＭＡを混合投与した実験群では対照群水準に減少し、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は自主的に自食作用を誘発する効果があることを検証した。
【００９８】
＜３−３−６＞混合抽出物（ＭＹＨ）の濃度増加に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−３＞で製造した混合抽出物（ＭＹＨ）を多様な濃度（１００、４００、８００、１２００μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、実験結果はＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認したものを、図２ｆに示した。
【００９９】
図２ｆに示されているように、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は濃度が増加するに伴って自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が増加することを確認することによって、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は濃度が増加するに伴って自食作用を誘導する効果を増加させることが分かった。
【０１００】
＜３−３−７＞混合抽出物（ＭＹＨ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−３＞で製造した混合抽出物（ＭＹＨ）４００μｇ／ｍｌを処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で多様な時間（６、１２、２４ｈ）培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、実験結果はＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認して、図２ｇに示した。
【０１０１】
図２ｇに記載された通り、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は、時間の経過に伴って、自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を、対照群に比べて増加させることを確認した。
【０１０２】
＜３−３−８＞自食作用阻害剤を利用した混合抽出物（ＭＹＨ）の自食作用誘導効果検証
本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）の自食作用誘導効果をより確実に検証するために、自食作用阻害剤を利用した実験を進行した。培養されたＰＣ１２細胞に混合抽出物（ＭＹＨ）４００μｇ／ｍｌのみで処理した実験群と混合抽出物（ＭＹＨ）４００μｇ／ｍｌと３ＭＡ１０ｍＭを混合処理した実験群を５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｈに示した。
【０１０３】
図２ｈに記載された通り、混合抽出物（ＭＹＨ）のみで処理した実験群で観察されたＬＣ３ ２蛋白質の発現が混合抽出物（ＭＹＨ）と３ＭＡを混合投与した実験群では対照群水準に減少し、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は自主的に自食作用を誘発する効果があることを検証した。
【実施例４】
【０１０４】
ＭＰＴＰ投与によるパーキンソン病の動物モデルで、本発明の混合抽出物が行動障害および脳細胞死滅に及ぼす効果
＜４−１＞本実験に使用された混合抽出物
前記実施例＜１−２＞の混合抽出物（ＤＧ）と実施例＜１−３＞の混合抽出物（ＭＹＨ）を生理食塩水に多様な濃度で希釈して使用した。
【０１０５】
＜４−２＞実験動物処置
＜４−２−１＞混合抽出物（ＤＧ）による実験動物の処置
マウスを各群当り９匹ずつ４群に分けた。第１群（対照群）および第２群（ＭＰＴＰ群）は生理食塩水をマウス体重ｋｇ当り５ｍｌで６日間１日１回経口投与し、第３群（混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群）および第４群（混合抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群）は生理食塩水に溶解させたそれぞれの混合抽出物を６日間１日１回経口投与した。薬品投与３日目となる日に最後の投与をした２時間後、第１群（対照群）は生理食塩水をマウス体重ｋｇ当り５ｍｌで１日４回（急性、Ａｃｕｔｅ）２時間間隔で腹腔投与し、第２群、第３群および第４群は、ＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で生理食塩水に溶解させて１日４回（急性、Ａｃｕｔｅ）２時間間隔で腹腔投与した。
【０１０６】
＜４−２−２＞混合抽出物（ＭＹＨ）による実験動物の処置
マウスを各群当り７匹ずつ３群に分けた。第１群（対照群）および第２群（ＭＰＴＰ群）は第３群（混合抽出物（ＭＹＨ）１００ｍｇ／ｋｇ投与群）は生理食塩水に溶解させた混合抽出物（ＭＹＨ）を３日間１日１回経口投与し、第１群（対照群）および第２群（ＭＰＴＰ群）は同一の生理食塩水量を経口投与した。薬品投与３日目となる日に第２群と第３群にＭＰＴＰを２０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で生理食塩水に溶解させて１日４回（急性、ａｃｕｔｅ）２時間間隔で腹腔投与した。ＭＰＴＰ投与７日後、麻酔を通じてマウスを殺した後、脳組織を４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）で固定して−８０℃で保管した。
【０１０７】
＜４−３＞混合抽出物（ＤＧ）の行動障害の改善効果
＜４−３−１＞行動試験；ポールテスト（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）
前記ＭＰＴＰ投与終了の翌日、高さ５０ｃｍ、直径１ｃｍの棒でポールテストを行った。棒の上にＣ５７ＢＬ／６マウスの頭が上を向くように置き、マウスが頂上を１８０°度回転する時間（Ｔ‐回転）と、回転して４本足が床につくまで降りてくる時間（Ｔ−ＬＡ）を測定した。各マウスを３回ずつ練習させた後、７回本実験を行い、その結果を図３ａまたは図３ｂに示した。
【０１０８】
図３ａまたは図３ｂに示したように、ＭＰＴＰ群は、対照群に比べて％で分析時、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間がそれぞれ２６０．２１％、１５１．８２％とＭＰＴＰによる行動障害が誘発されており、これに対して第３群（混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群）では、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間がそれぞれ１３３．１０％、１１０．５１％と現れ、第４群（混合抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群）では、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間がそれぞれ１４３．０５％、１２１．８５％と現れて、有意性が確認され、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間の全てが濃度依存的に減少することを確認した。
【０１０９】
＜４−３−２＞行動試験；ロタロッドテスト（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）
本発明の混合抽出物の投与が終わった１日後（ＭＰＴＰ投与後５日）、加速モード（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）で８ｒｐｍに設定されたロタロッド装置（Ｒｏｔａ ｒｏｄ Ｂ１００１、Ｂ．Ｓ Ｔｅｃｈｎｏｌａｂ ＩＮＣ．， Ｋｏｒｅａ）のプラスチック棒（直径１インチ）にマウスを乗せて、５分ずつトレーニングを行った。２４時間後、加速モードで１６ｒｐｍに設定して本実験を行い、その結果を図３ｃに示した。
【０１１０】
図３ｃに記載された通り、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％で分析時、マウスが落ちる時間（Ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）は２１．６９％と減少してＭＰＴＰによる行動障害が誘発され、これに対して第３群（混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群）では５３．２４％と現れ、第４群（混合抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群）では７７．８９％と測定されて、Ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅが有意に増加したことを確認した。
【０１１１】
前記行動試験の結果、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は、ＭＰＴＰによる行動障害に対する有効な改善効果を示すことを確認することができた。
【０１１２】
＜４−４＞混合抽出物（ＤＧ）のドーパミン細胞への保護活性評価
前記ポールテストとロタロッドテストが完了した（ＭＰＴＰ投与後７日）各群のマウスを致死させた後、脳組織（黒質および線条体）を分離した。分離された脳組織を過酸化水素で脱水した後、１次抗体であるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）（ＴＨ， ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ｒａｂｂｉｔ ｏｒｉｇｉｎ １：２０００， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ． ＜Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ＞で購入）を一晩反応させた後、２次抗体でビオチン化抗ウサギ抗体（ヤギ由来， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＜Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ＞で購入）を使用し、ＡＢＣ反応（ＡＢＣ ｋｉｔ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＜Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ＞で購入）を経て、ジアミノベンジジン（Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を利用して発色させた。ドーパミン細胞保護効果は黒質におけるＴＨ陽性細胞の数を数えて分析し、線条体における光学密度を測定して評価し、その結果を図３ｄおよび図３ｅに示した。
【０１１３】
図３ｄで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％で分析時、黒質におけるＴＨ陽性細胞数が３０．８２％とＭＰＴＰによる細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群では５２．７５％、１００ｍｇ／ｋｇ投与群では８９．１９％と増加して、ＭＰＴＰで誘導した細胞毒性に対して保護効果を示し、特に１００ｍｇ／ｋｇ投与群でＴＨ陽性細胞数が統計学的に有意に増加した。
【０１１４】
一方、図３ｅで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％分析時、線条体における光学密度が２６．３０％とＭＰＴＰによるドーパミン細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群では３６．３１％、１００ｍｇ／ｋｇ投与群では４３．４２％と増加してドーパミン細胞の保護効果が確認されており、特に１００ｍｇ／ｋｇ投与群で光学密度が統計学的に有意に増加した。
【０１１５】
以上の結果で、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は、黒質および線条体で、濃度依存的に、優れたドーパミン細胞の保護活性を示すことを確認することができた。
【０１１６】
＜４−５＞龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）のドーパミン細胞の保護活性の評価
前記実施例＜４−２−２＞で準備された脳組織を実施例＜４−４＞の実験方法を利用して処置した後、ドーパミン細胞保護効果の評価のために黒質におけるＴＨ陽性細胞の数を数えて分析し、線条体における光学密度を測定して、その結果を図３ｆおよび図３ｇに示した。
【０１１７】
図３ｆで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％で分析時、黒質におけるＴＨ陽性細胞数が３６．７％とＭＰＴＰによる細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物（ＭＹＨ）１００ｍｇ／ｋｇ投与群では５３．０４％と増加して、ＭＰＴＰで誘導した細胞毒性に対して保護効果を示した。
【０１１８】
一方、図３ｇで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％分析時、線条体における光学密度が３７．７９％でＭＰＴＰによるドーパミンの細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物（ＭＹＨ）１００ｍｇ／ｋｇ投与群では５３．１０％と増加して、ドーパミン細胞の保護効果が確認された。
【０１１９】
以上の結果から、龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）は、黒質（および線条体で濃度依存的に優れたドーパミン細胞の保護活性を示すことを確認することができた。
【０１２０】
＜試験例１＞
本発明の混合抽出物が脳細胞死滅に及ぼす効果
＜１−１＞混合抽出物（ＤＧ）の脳細胞死滅に及ぼす効果
本発明の混合抽出物（ＤＧ）がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞活性度に及ぼす効果を測定するために、公知の細胞毒性測定（ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）方法を使用した。
【０１２１】
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）を多様な濃度（２５、５０、１００、２００、３００μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用した。２４時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【０１２２】
前記のようにＭＴＴ還元の程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得て、その結果を図４ａに示した。
【０１２３】
図４ａに記載された通り、本発明の混合抽出物を多量服用するとしても、細胞毒性がないため、本発明の混合抽出物は薬学的組成物または食品組成物の有効な成分で、安全に使用できることが分かった。
【０１２４】
一方、ＩＣＲ マウス（５週齢）を利用した単回投与急性毒性実験結果、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は２ｇ／ｋｇ／１０ｍｌ（経口投与）の濃度まで毒性を示さなかった（結果未記載）。
【０１２５】
＜１−２＞混合抽出物（ＭＹＨ）の脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−３＞で製造した混合抽出物（ＭＹＨ）を多様な濃度（６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用した。２４時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【０１２６】
前記のようにＭＴＴ還元の程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得、その結果を図４ｂに示した。
【０１２７】
図４ｂに記載された通り、本発明の混合抽出物を多量服用するとしても、細胞毒性がないため、本発明の混合抽出物は薬学的組成物または食品組成物の有効な成分で安全に使用できることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、龍眼肉抽出物またはこれを含む混合抽出物を含有する、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の組成物に関し、より具体的には、前記抽出物を有効成分として含む退行性脳神経疾患の予防用もしくは治療用の薬学的組成物、または予防用もしくは改善用の食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）で代表される退行性脳神経疾患は、脳の黒質緻密部のドーパミン神経細胞の死滅が特徴的であり、その結果、線条体内の神経伝達物質であるドーパミンが減少することによって、神経伝達体系全体の均衡が崩れ、その結果としてパーキンソン病の代表的な症状である震え（ｔｒｅｍｏｒ）、硬直（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、運動緩徐（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、姿勢の不安定（ｐｏｓｔｕｒａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）などの症状が現れる。
【０００３】
しかし、パーキンソン病のような退行性脳神経疾患の発病原因はまだ正確に明らかになっておらず、単に遺伝的な要因や外部からの毒性などによってドーパミン性神経細胞の消失が生じる可能性があるという仮説があり、最近の一連の研究では脳の動脈硬化症、一酸化炭素中毒、薬物、副甲状腺機能低下症などによる代謝性、外傷性脳炎後遺症などが関与しているといわれている。
【０００４】
パーキンソン病のような退行性脳神経疾患に対する効果的な治療法は、１９７０年代までは殆どなかったが、ドーパミンの前駆物質であるＬ−ドーパを使用して、脳組織で減少しているドーパミンの補充、またはドーパミン受容体作用剤、抗コリン薬剤、エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ＝ｄｅｐｒｅｙｌ）などを使用する治療法などが知られている。しかし、これらの薬品の大部分は原因的な治療ではなく、症状を調節する役割を果たすものであり、これらのような薬品の長期投与は薬品副作用の問題点を招くこととなる。例えば、抗コリン薬剤は自律神経系の異常や精神機能の異常などが現れることがあり、高齢の患者に持続的に投与することに限界がある。また、Ｌ−ドーパ製剤の場合、長期間の服用によって漸次効果が低下し、体がよじれ、手や足が意図せずに動く異常運動が生じるなどの副作用が発生するようになる。その他、高周波を利用した神経刺激術、即ち、高周波破壊術または深部脳刺激術などの手術治療も行われているが、浸湿的な手術を必要とし、また、多大な費用がかかるという問題がある。
【０００５】
したがって、パーキンソン病のような退行性脳神経疾患の治療において、臨床症状を好転させるための対症的治療法の開発も重要であるが、パーキンソン病の直接的な原因である黒質内ドーパミン性神経細胞の死滅を防止する根本的な治療方法の開発も、緊急に要求されている。
【０００６】
また、パーキンソン病のような退行性脳神経疾患の原因に対する最近報告された研究によれば、パーキンソン病患者の脳では、「α−シヌクレイン（ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）」という蛋白質が誤って畳まれた奇形状態で発見される。このα−シヌクレインが細胞に蓄積することによって神経細胞を破壊する現象は、パーキンソン病の特徴の１つとして知られている。したがって、このような異常蛋白質の凝集を防止または溶解する方法を研究することが、パーキンソン病の進行の遅延または予防を可能にする新たな治療法として注目されている（Ｒｙｕ， Ｊ． 外２人。 Ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ Ｅｕｐｈｏｒｉａ ｌｏｎｇａｎａ． Ｋｏｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎ． ３３；１９１〜１９３、２００２）。
【０００７】
一方、ユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）は、人体内で生じる代表的な蛋白質分解メカニズムであって、多くの退行性脳神経疾患患者はこの機能の低下により変形した蛋白質の蓄積が制御できないことが知られている（Ｏｌａｎｏｗ Ｃ．Ｗ， ＭｃＮａｕｇｈｔ Ｋ．Ｓ． Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｍｏｖ． Ｄｉｓｏｒｄ．２００６；２１：１８０６〜１８２３）。ＵＰＳ以外にもう１つの重要な蛋白質分解のメカニズムには、自食作用リソソーム経路（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐａｔｈｗａｙ；ＡＬＰ）があり、最近退行性脳神経疾患治療の重要な標的として研究されている（Ｂａｎｄｈｙｏｐａｄｈｙａｙ Ｕ，Ｃｕｅｒｖｏ ＡＭ．Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ａｇｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ． Ｅｘｐ Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．２００７；４２：１２０〜８）。即ち、ＵＰＳの機能に異常が生じてリソソームの分解機能が遮断されると、自食作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）というまた別の蛋白質分解経路が活性を示しながら、一種の補償作用を試みる。このメカニズムではα−シヌクレインのような異常蛋白質を分解して、蛋白質が脳神経細胞に蓄積されることによる細胞損傷を起こすことを防止する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖｉｃｅｎｔｅ Ｍ． Ｃｕｅｒｖｏ Ａ．Ｍ， Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｃｒｅｗ ｇｏｅｓ ｏｎ ｓｔｒｉｋｅ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２００７；６：３５２〜３６１．，Ｒａｖｉｋｕｍａｒ Ｂ， Ｄｕｄｅｎ Ｒ， Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ Ｄ．Ｃ． Ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｐｒｏｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ ａｒｅ ｄｅｇｒａｄｅｄ ｂｙ ａｕｔｏｐｈａｇｙ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１：１１０７〜１１１７）。したがって、ＵＰＳ機能に異常が生じた退行性脳神経疾患患者に対しては、ＡＬＰ、即ち、自食作用を通した治療法の開発が重要である。
【０００８】
一方、龍眼の木はムクロジ科 （Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）に属する植物であり、この植物の 假種皮を龍眼肉（生薬名：ｌｏｎｇａｎ ａｒｉｌｌｕｓまたはｌｏｎｇａｎａｅ ａｒｉｌｌｕｓ）という。東医宝鑑によれば、龍眼肉の効能は補益心脾、養血安神であり、主治病症は健忘失眠、血虚萎黄、気血不足、心悸亢進であって、漢方では強壮剤、鎮静剤として健忘症と不眠症に主に服用するといわれている。
【０００９】
しかし、前記龍眼肉が退行性脳神経疾患の予防および治療に効果があるか否かについては、全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは退行性脳神経疾患の予防および治療に効果がある天然物質に関して研究していたところ、龍眼肉およびこれを含む混合抽出物が、退行性脳神経疾患の予防および治療に非常に効果的であることを明らかにして、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明は、龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１２】
また、本発明は、龍眼肉抽出物を含む退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような課題を解決するために、本発明は龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は龍眼肉抽出物を含む、退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物を提供する。
【００１５】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１６】
本発明で「龍眼肉」は、龍眼の木の仮種皮を意味し、生薬名はｌｏｎｇａｎ ａｒｉｌｌｕｓまたはｌｏｎｇａｎａｅ ａｒｉｌｌｕｓである。
【００１７】
本発明で「藁本」は、セリ科に属する薬品植物であり、生薬名がａｎｇｅｌｉｃａｅ ｔｅｎｕｉｓｓｉｍａｅ ｒａｄｉｘであり、本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００１８】
本発明で「遠志」は、遠志科（Ｐｏｌｙｇａｌａｃｅａｅ）に属する薬品植物であり、生薬名がｐｏｌｙｇａｌａｅ ｒａｄｉｘであり、本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００１９】
本発明で「葛根」は、葛（Ｐｕｅｒａｒｉａ ｌｏｂａｔａ （Ｗｉｌｌｄ．） Ｏｈｗｉ）の周皮を除去した根を意味する。
【００２０】
本発明で「オウゴン」は、学名がＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｅ Ｒａｄｉｘであり、双子葉植物キク亜綱シソ科の多年草で、本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００２１】
本発明で「桔梗」は、学名がＰｌａｔｙｃｏｄｉ Ｒａｄｉｘで、キキョウ科の多年草であり、夏に白色と紫色の花が咲く。本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根を使用することができる。
【００２２】
本発明で「升麻」は、学名がＣｉｍｉｃｉｆｕｇａｅ Ｒｈｉｚｏｍａで、キンボウゲ科の升麻（Ｃｉｍｉｃｉｆｕｇａ ｈｅｒａｃｌｅｉｆｏｌｉａ Ｋｏｍａｒｏｖ）または同属植物の根茎で作った薬剤である。
【００２３】
本発明で「ビャクシ」は、繖形科のヨロイグサ（Ａｎｇｅｌｉｃａ ｄａｈｕｒｉｃａ Ｂｅｎｔｈａｍ ｅｔ Ｈｏｏｋｅｒ）またはその変種の根を乾燥させて作った薬材で、学名がＡｎｇｅｌｉｃａｅ Ｄａｈｕｒｉｃａｅ Ｒａｄｉｘである。
【００２４】
本発明で「ライフクシ」は、十字花科の大根（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．）または同属植物の種を使用して作った薬材であり、学名がＲａｐｈａｎｉ Ｓｅｍｅｎである。
【００２５】
本発明で「石菖蒲」は、学名がＡｃｏｒｉ Ｇｒａｍｉｎｅｒｉ Ｒｈｉｚｏｍａで単子葉植物天南星科目天南星科の多年草である。本発明で前記植物の根、茎および葉の部位を抽出して使用することができるが、より好ましくは前記植物の根茎を使用することができる。
【００２６】
本発明で「退行性脳神経疾患」は、これに限定されないが、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリック病）および多発性硬化症であり得、前記筋萎縮性側索硬化症はルー・ゲーリック病であり得、最も好ましくはパーキンソン病であり得る。
【００２７】
本発明で抽出物は、熱水抽出物または有機溶媒抽出物であってもよく、当業界に公知の植物抽出物の製造方法を利用して製造することができる。好ましくは水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択された一種以上を使用して製造することができる。
【００２８】
本発明の抽出物は、龍眼肉、好ましくは、龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上を混合し、より好ましくは前記混合物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上を追加混合し、これを水およびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された一種以上を使用して１次抽出した抽出物であるか、または前記１次抽出物を水、ヘキサン、塩化メチレンおよびＣ１〜Ｃ４の低級アルコールからなる群より選択された一種以上を使用して追加的に抽出した２次抽出物であってもよい。より好ましくは、前記２次抽出物をアセトニトリル、メタノール、アセトンおよび水からなる群より選択された一種以上を使用して追加的に抽出した３次抽出物であってもよい。
【００２９】
本発明の一実験例では、龍眼肉またはこれを含む混合抽出物として、水を加えて製造された熱水抽出物を使用する（実施例１参照）。
【００３０】
本発明の退行性脳神経疾患の予防または治療に活性がある有効成分は、龍眼肉単独抽出物（ＹＡ）であってもよいが、好ましくは、龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物であるか、または龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物がさらに追加的に含有された抽出物であってもよい。より好ましくは、龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物（ＤＧ）、最も好ましくは、龍眼肉、藁本、遠志葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲の混合抽出物（ＭＹＨ）であってもよい。
【００３１】
前記抽出物が龍眼肉および遠志の混合抽出物である場合、龍眼肉および遠志が１：０．２〜１：１０の重量比で、より好ましくは１：０．４〜１：５の重量比で、より一層好ましくは１：０．８〜１：２．５の重量比で混合されて抽出されたものであるか、最も好ましくは龍眼肉および遠志が１：１の重量比で混合されて抽出されたものであってもよい。
【００３２】
前記抽出物が龍眼肉および藁本の混合抽出物である場合、龍眼肉および藁本が１：０．１〜１：５の重量比で、より好ましくは１：０．２〜１：２．５の重量比で、より一層好ましくは１：０．８〜１：１．２５の重量比で混合されて抽出されたものであるか、最も好ましくは龍眼肉および遠志が１：１の重量比で混合されて抽出されたものであってもよい。
【００３３】
前記抽出物が龍眼肉、遠志および藁本の混合抽出物である場合、好ましくは龍眼肉、遠志および藁本が１：０．１〜１０：０．１〜１０の重量比で、１：０．２〜５：０．２〜５の重量比で、より一層好ましくは１：０．４〜２．５：０．４〜２．５の重量比で、最も好ましくは１：１：１の重量比で混合（混合抽出物ＤＧと表示する）されて抽出されたものであってもよい。
【００３４】
前記抽出物が龍眼肉、遠志、藁本、葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲抽出物を全て含む場合、これに限定されないが、好ましくは龍眼肉１５〜２０重量部、藁本１０〜１５重量部、遠志１０〜１５重量部、葛根１５〜２０重量部、オウゴン５〜１０重量部、桔梗１〜５重量部、ビャクシ５〜１０重量部、升麻５〜１０重量部、ライフクシ５〜１０重量部および石菖蒲１５〜２０重量部で混合されて抽出されものであってもよく、好ましくは龍眼肉１５〜１８重量部、藁本１０〜１３重量部、遠志１０〜１３重量部、葛根１５〜１８重量部、オウゴン５〜８重量部、桔梗１〜３重量部、ビャクシ５〜８重量部、升麻５〜８重量部、ライフクシ５〜８重量部および石菖蒲１５〜１８重量部で混合されて抽出されたものであってもよく、最も好ましくは龍眼肉１６〜１８重量部、藁本１０〜１２重量部、遠志１０〜１２重量部、葛根１６〜１８重量部、オウゴン５〜７重量部、桔梗２〜３重量部、ビャクシ５〜７重量部、升麻５〜７重量部、ライフクシ５〜７重量部および石菖蒲１６〜１８重量部で混合されて抽出されたものであってもよい。
【００３５】
本発明の一実施例では、龍眼肉抽出物、龍眼肉が含まれた混合抽出物の脳細胞の死滅に及ぼす効果を分析した結果、ＭＰＴＰ（実施例２参照）で脳細胞の死滅を誘導した後、前記抽出物らを投与した結果、前記抽出物らは脳細胞の死滅を効果的に抑制することができる活性があり、脳細胞の保護効果があることが分かる。
【００３６】
また、本発明の一実施例では、龍眼肉抽出物、龍眼肉が含まれた混合抽出物がパーキンソン病の原因といわれているα−シヌクレイン蛋白質の分解を促進する、自食作用を誘導する効果が非常に優れていることが分かる（実施例３参照）。
【００３７】
また、本発明の一実施例では、（ｉｎ ｖｉｖｏ実験）ＭＰＴＰでマウスにパーキンソン病を誘発させた後、行動実験（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ、Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）およびドーパミン細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）保護活性実験を行った結果、龍眼肉抽出物、龍眼肉が含まれた混合抽出物を投与した場合、ＭＰＴＰによって引き起こされる運動機能の退化を復元させ（実施例４参照）、また、線条体（ｓｔｒｉａｔｕｍ）と黒質（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ）で優れたドーパミン細胞（ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の保護活性を示すことが分かる（実施例４参照）。ひいては、チロシン加水分解酵素（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）に対する組織免疫染色方法（ＴＨ−ＩＨＣ）とアビジン‐ビオチンペルオキシターゼ（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を利用した免疫染色方法（ＴＨ−ＩＲ）によってもＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を効果的に抑制することができることが分かる（実施例４参照）。
【００３８】
したがって、本発明の薬学的組成物が龍眼肉の単独抽出物や、好ましくは龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物、より好ましくは前記混合抽出物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物が追加的に含有された混合抽出物を有効成分として含むことによって、退行性脳神経疾患の予防または治療の効果が著しく優れている。
【００３９】
より具体的には、本発明の薬学的組成物が、ドーパミン性神経系に選択的作用をするＭＰＴＰによる神経毒性と、α−シヌクレイン蛋白質凝集による神経毒性とから、ドーパミン神経細胞を有意性があるように保護することによって、退行性脳神経疾患を予防および治療することができることが分かる。
【００４０】
本発明の薬学的組成物内の有効成分としての前記抽出物の含量は、使用形態および目的、患者の状態、症状の種類および軽重などに応じて適切に調節することができ、固形分の重量基準で０．００１〜９９．９重量％、好ましくは０．１〜５０重量％であってもよく、これに限定されない。前記「固形分の重量」は抽出物中の溶媒成分を除去して残った成分の重量をいう。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、ヒトを含む哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与方式は通常使用される全ての方式であってもよく、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内の硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）への注射によって投与することができる。本発明の薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤型、経皮剤、座薬および滅菌注射溶液の形態の非経口剤型などに剤型化して使用することができる。
【００４２】
本発明の薬学的組成物は、前記抽出物以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤などの補助剤を追加的に含むものであってもよい。本発明の薬学的組成物に含まれることのある担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトル、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は前記遠志、藁本および龍眼肉抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して調剤することができる。また、単なる賦形剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤らも使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬、経皮剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。座薬の基剤としては、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されることができる。
【００４３】
本発明の薬学的組成物はヒトに単独で投与することができるが、一般的に投与方式と標準薬剤学的慣行（ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）を考慮して選択された薬剤学的担体と混合して投与することができる。例えば、本発明の薬学的組成物は、デンプンまたはラクトースを含む錠剤形態で、または単独または賦形剤を含むカプセル形態で、または味や色を有するようにする化学薬品を含むエリキシルまたは懸濁剤の形態で経口、口腔内または舌下投与することができる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、メチルセルロース、ウイテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）のような半合成グリセリド、または杏仁油（ａｐｒｉｃｏｔ ｋｅｒｎｅｌ ｏｉｌ）とＰＥＧ−６エステルの混合物、またはＰＥＧ−８とカプリルリック／カプリックグリセライド（Ｃａｐｒｙｌｉｃ／Ｃａｐｒｉｃ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）の混合物のようなグリセリド混合物）のような薬剤学的に許容可能な添加剤と共に剤型化することができる。
【００４４】
本発明の薬学的組成物の投与容量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患の程度に応じて変更することができ、一定時間の間隔で１日１回〜数回に分割投与することもできる。例えば、有効成分の含量を基準に１日投与量が０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。前記投与量は平均的な場合を例示したもので、個人的な差によってその投与量が高くなったり低くなったりすることができる。本発明の薬学的組成物の１日投与量が前記投与容量未満であれば有意性ある効果を得ることができず、それ以上を超える場合には非経済的であるばかりか、常用量の範囲を超えるため好ましくない副作用が現れる可能性があるので、前記範囲とすることが好ましい。
【００４５】
前記患者はヒトを含む哺乳動物をいい、好ましくは退行性脳神経疾患、より好ましくはパーキンソン病と診断されたヒトをいう。
【００４６】
一方、本発明の退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物は、龍眼肉単独抽出物、好ましくは龍眼肉に藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む混合抽出物、より好ましくは前記混合抽出物に葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む混合抽出物を含むことを特徴とする。
【００４７】
前記組成物の製造方法および退行性脳神経疾患を予防し症状を改善することができる活性については前述した通りである。
【００４８】
本発明の食品組成物は、機能性食品、栄養補助剤、健康食品および食品添加剤等の全ての形態を含む。前記食品組成物の類型は当業界に公知の通常の方法によって多様な形態に製造することができる。
【００４９】
例えば、健康食品としては、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物自体を、お茶、ジュースおよびドリンクの形態に製造して飲用に供したり、顆粒化、カプセル化および粉末化して摂取することができる。また、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物と退行性脳神経疾患の改善効果があるといわれている公知の活性成分とを共に混合して組成物の形態に製造することができる。
【００５０】
また、機能性食品としては、飲み物（アルコール性飲み物を含む）、果実およびその加工食品（例：果物缶詰め、瓶詰め、ジャム、マーマレードなど）、魚類、肉類およびその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コーンビーフなど）、パン類および麺類（例：うどん、そば、ラーメン、スパゲティ、マカロニなど）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズなど）、食用植物油脂、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料（例：味噌、醤油、ソースなど）などに、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物を添加して製造することができる。
【００５１】
また、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物を食品添加剤の形態で使用するためには、粉末または濃縮液の形態に製造して使用することができる。
【００５２】
本発明の食品組成物のうち、前記龍眼肉抽出物または混合抽出物の好ましい含有量としては、食品１００ｇ当り約０．００１ｇ〜２０ｇである。好ましくは、本発明での前記龍眼肉抽出物または混合抽出物は特に、退行性脳神経疾患の改善効果があるといわれた活性成分と共に混合して健康食品の形態に製造することができる。
【発明の効果】
【００５３】
本発明の組成物は、龍眼肉抽出物またはこれを含む混合抽出物を有効成分として含むことによって、退行性脳神経疾患の予防効果または治療効果が著しく優れており、特に本発明の組成物はドーパミン性神経系に選択的作用をするＭＰＴＰによる神経毒性と、α−シヌクレイン蛋白質凝集による神経毒性からドーパミン神経細胞を有意性があるように保護することによって、退行性脳神経疾患を効果的に予防または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】龍眼肉抽出物が、濃度増加に応じて、ＭＰＴＰで誘発された脳細胞の死滅に及ぼす効果を測定した結果である（ＹＡ：龍眼肉）。
【図１ｂ】龍眼肉抽出物に藁本および遠志抽出物を混合した混合抽出物（ＤＧ）が、濃度増加に応じて、ＭＰＴＰで誘発された脳細胞死滅に及ぼす効果を測定した結果である。
【図１ｃ】龍眼肉と藁本の混合抽出物、あるいは龍眼肉と遠志の混合抽出物と龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物が、多様な混合比率に応じて、ＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果を測定した結果である（ＹＡまたはＹ：龍眼肉、ＷＪまたはＷ：遠志、ＧＢまたはＧ：藁本、Ｙ１Ｗ１：龍眼肉と遠志が１：１の重量比で混合された場合）。
【図１ｄ】混合抽出物（ＭＹＨ）が、濃度増加に応じて、ＭＰＴＰで誘発された脳細胞死滅に及ぼす効果を測定した結果である。
【図２ａ】龍眼肉抽出物（ＹＡ）の濃度増加に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｂ】龍眼肉抽出物（ＹＡ）と混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導活性を比較した実験結果である。
【図２ｃ】混合抽出物（ＤＧ）の濃度の増加に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｄ】混合抽出物（ＤＧ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｅ】自食作用阻害剤を利用した混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導効果を検証した実験結果である。
【図２ｆ】混合抽出物（ＭＹＨ）の濃度の増加に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｇ】混合抽出物（ＭＹＨ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性を示した実験結果である。
【図２ｈ】自食作用阻害剤を利用した混合抽出物（ＭＹＨ）の自食作用誘導効果を検証した実験結果である。
【図３ａ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病（を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対する混合抽出物（ＤＧ）の行動試験（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）のＴ-回転（Ｔ−ｔｕｒｎ）の結果（％）を示したグラフである（各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊は対照群に比べてｐ＜０．０１である場合、♯はｐ＜０．０５である場合、♯♯はｐ＜０．０１である場合を意味する）。
【図３ｂ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対する混合抽出物（ＤＧ）の行動試験（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）Ｔ−ＬＡの結果（％）を示したグラフである（各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊は対照群に比べてｐ＜０．０１である場合、♯はｐ＜０．０５である場合、♯♯はｐ＜０．０１である場合を意味する）。
【図３ｃ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスに対する混合抽出物（ＤＧ）の行動試験（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）の結果（％）を示したグラフである（各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．０５である場合を意味する）。
【図３ｄ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで黒質ドーパミン陽性細胞（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）減少に対する混合抽出物（ＤＧ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフと、ＤＧの抑制活性効果を示した写真である（Ｘ１００）。（スケールバーは１００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯♯♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．００１である場合を意味する）。
【図３ｅ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで線条体の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）減少に対する混合抽出物（ＤＧ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフと混合抽出物（ＤＧ）の抑制活性効果を示した写真である（Ｘ４０）。（スケールバーは２００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．０５である場合を意味する）。
【図３ｆ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで黒質のドーパミン陽性細胞減少に対する混合抽出物（ＭＹＨ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフとＭＹＨの抑制活性効果を示した写真である（Ｘ４０）。（スケールバーは１００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．００１である場合を意味する）。
【図３ｇ】ＭＰＴＰ投与によってパーキンソン病を誘導させたＣ５７ＢＬ／６マウスで線条体の光学密度減少に対する混合抽出物（ＭＹＨ）の抑制活性を測定した結果（％）を示したグラフとＭＹＨの抑制活性効果を示した写真である（Ｘ１００）。（スケールバーは２００μｍであり、各数値は平均±標準偏差を意味し、＊＊＊は対照群に比べてｐ＜０．００１である場合、♯はＭＰＴＰのみで処理した群に比べてｐ＜０．０５である場合を意味する）。
【図４ａ】混合抽出物（ＤＧ）が細胞活性度に及ぼす効果を測定した結果である。
【図４ｂ】混合抽出物（ＭＹＨ）が細胞活性度に及ぼす効果を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００５６】
龍眼肉抽出物および龍眼肉を含む混合抽出物の製造
＜１−１＞龍眼肉抽出物の製造
龍眼肉（大田大学付属天安漢方病院）４０ｇをきれいに洗浄して細かく切断した後、重量比率の４倍の水を加えて陶器薬湯器において９５℃で４時間かけて１次抽出した後、ろ過して残った固形分に再び水を半分量追加して、前記と同一の条件で２次抽出した。
【００５７】
前記２種の抽出液を集めてろ過し固形分を除去した後、３２００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清液を収集した。再び上清液を２．０μｍマイクロフィルターを使用して、フィルタリングした液体のみを収集して使用した。
【００５８】
＜１−２＞多様な混合比の龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物の製造
龍眼肉および藁本、龍眼肉および遠志、または龍眼肉、藁本および遠志を全て混合した混合抽出物を、多様な混合比率で構成して、前記実施例＜１−１＞と同一の方法で混合抽出物を製造した。前記薬材原料は全て大田大学付属天安漢方病院で購入した。
【００５９】
特に、龍眼肉、藁本および遠志を１：１：１の比率で混合した抽出物を、混合抽出物ＤＧと命名した。
【表１】
【００６０】
＜１−３＞龍眼肉、葛根、藁本、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシ、遠志および石菖蒲の混合抽出物（ＭＹＨ）の製造
葛根１２ｇ、藁本８ｇ、オウゴン４ｇ、桔梗２ｇ、ビャクシ４ｇ、升麻４ｇ、ライフクシ４ｇ、遠志８ｇ、石菖蒲１２ｇ、龍眼肉１２ｇを購入（大田大学付属天安漢方病院）してそれぞれ準備し、これを前記実施例＜１−１＞と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【表２】
【実施例２】
【００６１】
本発明の混合抽出物がＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
前記実施例１で製造された龍眼肉抽出物、混合抽出物（ＤＧ）および混合抽出物（ＭＹＨ）が、細胞外部に処理したＭＰＴＰ（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）によって誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果を、次の方法で確認した。具体的には、ドーパミン性神経系に選択的に毒性を示す物質であるＮ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、ＭＰＴＰ）を用いてＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に細胞毒性を誘導した後、細胞保護活性実験を行った。
【００６２】
＜２−１＞抽出物が含有された培地
前記実施例１の単一抽出物または混合抽出物を、１０％牛胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖａｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１％抗生剤を含むＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に、多様な濃度で希釈して使用した。
【００６３】
＜２−２＞細胞培養
神経細胞モデルとして使用される細胞は、ヒト神経細胞種を起源とするＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（寄託番号：ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）を選択した。前記細胞は１０％牛胎児血清および１％抗生剤を含む前記実施例＜２−１＞のＭＥＭ培地で培養した。
【００６４】
＜２−３＞細胞毒性実験ＭＴＴ分析
本発明の龍眼肉抽出物と、混合抽出物（ＤＧ）、および混合抽出物（ＭＹＨ）が、４００μＭ ＭＰＴＰで誘導した細胞毒性に対して、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞活性度（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）に及ぼす効果を測定するために、公知の細胞毒性測定（ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）方法を使用した。
【００６５】
＜２−３−１＞龍眼肉抽出物が濃度増加に応じてＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−１＞で製造した龍眼肉抽出物を３．１２５、６．２５、１２．５、２５μｇ／ｍｌ濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、ＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を用いて吸光度を測定した。
【００６６】
前記のようにＭＴＴの還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得て、その結果を図１ａに示した。
【００６７】
図１ａに記載した通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は、対照群に比べて６２．７５％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して龍眼肉抽出物３．１２５μｇ／ｍｌ処理群で細胞活性度が１２３％、６．２５μｇ／ｍｌ処理群では細胞活性度が１３８％まで上昇し、以降にも細胞保護活性を示した。
【００６８】
前記結果を通して本発明の龍眼肉抽出物は、外部処理されたＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を、濃度依存的に抑制することが可能であることを確認した。
【００６９】
＜２−３−２＞混合抽出物（ＤＧ）が濃度増加に応じてＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）をそれぞれ２５、５０、１００、２００、３００μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群とＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【００７０】
前記のようにＭＴＴ還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得て、その結果を図１ｂに示した。
【００７１】
図１ｂに記載された通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は対照群に比べて６２．１３％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して混合抽出物（ＤＧ）２５μｇ／ｍｌ処理群で細胞活性度が１１０％まで上昇し、以降にも濃度依存的に細胞保護活性を示した。
【００７２】
前記結果を通じて本発明の混合抽出物（ＤＧ）は外部処理されたＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を、濃度依存的に抑制可能であることを確認した。
【００７３】
＜２−３−３＞多様な混合比率に応じた混合抽出物らがＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果の比較
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−２＞で製造したそれぞれの混合抽出物をそれぞれ２５μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、ＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【００７４】
前記のようにＭＴＴ還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得てその結果を図１ｃに示した。
【００７５】
図１ｃに記載された通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は対照群に比べて７０．２１％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して２種の薬材で構成された混合抽出物処理群の細胞活性度は６５〜７５％の細胞保護活性があることが確認された。特に、龍眼肉および遠志が含有された混合抽出物の場合、１：１〜２、より好ましくは１：１の重量比で混合して製造された場合、非常に効果的な細胞保護活性があることが分かる。また、龍眼肉および藁本が含有された混合抽出物の場合、１：０．５〜１、より好ましくは１：１の重量比で混合して製造された場合、非常に効果的な細胞保護活性があることが分かる。
【００７６】
一方、龍眼肉、遠志および藁本の３種の薬材で構成された混合抽出物処理群の細胞活性度は、８０〜１１０％と細胞保護活性が増加することが分かる。特に、龍眼肉、藁本、遠志を１：０．５〜２：０．５〜２の重量比で混合した場合、より好ましくは１：１：１の重量比で混合する場合、細胞保護活性がより優れていることが分かる。
【００７７】
＜２−３−４＞龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）が濃度増加に応じてＭＰＴＰで誘発される脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−３＞で製造した龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）をそれぞれ６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌの濃度で処理し、２時間後にＭＰＴＰを４００μＭの濃度で添加した後、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群と、ＭＰＴＰのみで処理した実験群も共に準備して実験に使用した。４８時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【００７８】
前記のようにＭＴＴの還元程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得てその結果を図１ｄに示した。
【００７９】
図１ｄに記載された通り、４００μＭ ＭＰＴＰ処理群の細胞活性度は対照群に比べて６４．７４％で細胞毒性が誘発されており、この毒性に対して混合抽出物（ＭＹＨ）を処理した場合、６．２５μｇ／ｍｌでは８５．８６％の細胞保護活性を示し、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度では培地のみで処理した対照群と比較した時、全て完璧に細胞保護活性を示すことを観察することができた。
【００８０】
前記結果を通して本発明の龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）は、外部処理されたＭＰＴＰによって誘発される脳細胞死滅を濃度依存的に抑制可能であることを確認した。
【実施例３】
【００８１】
本発明の龍眼肉抽出物または混合抽出物が脳神経細胞で自食作用を誘導する効果
ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を利用して神経細胞に分化させたＰＣ１２細胞株で自食作用誘導活性を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現を確認するために、ウエスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験を下記の通り行った。
【００８２】
＜３−１＞抽出物が含有された培地
前記実施例１の混合抽出物（Ｉ）または混合抽出物（ＩＩ）を１０％牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖａｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１％抗生剤を含むＤＭＥＭ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｒｄ．， Ｌｏｇａｎ ＵＴ， 米国）に多様な濃度で希釈して使用した。
【００８３】
３−２細胞培養
神経細胞モデルとして使用される細胞は、白ネズミの褐色細胞種を起源とするＰＣ１２細胞（ＮＧＦにより分化，ＲＣＢ０００９，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ 細胞バンク，茨城県つくば市， 日本）を選択した。
前記細胞は１０％牛胎児血清および１％抗生剤を含むＤＭＥＭ培地で培養し、実験に使用する前にＮＧＦを利用して神経細胞に分化させた。
【００８４】
＜３−３＞自食作用誘導活性確認
前記実施例１で製造された龍眼肉抽出物または混合抽出物が自食作用を誘導する効果を確認するために、ウエスタンブロッティングアッセイを利用して自食作用発現マーカーであるＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を測定した。
【００８５】
＜３−３−１＞龍眼肉抽出物の濃度増加に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−１＞で製造した龍眼肉抽出物をそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、捕集して２５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、ＦＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄した。得られた細胞は、ミトコンドリア溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．３％ ＮＰ−４０、１００μＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ ロイペプチン、２μｇ／ｍｌ アプロチニン）と４℃で２０分間反応させて蛋白質を分離した後、１３，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離して得られた上清液を、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ'ｓ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）によって蛋白質を定量した。
【００８６】
同量の細胞破砕液は、ＳＤＳ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒと混合して９９℃で５分間加熱した後に１５％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ）を施行した。蛋白質は分子量に基づいて分離するために、単一１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを使用した。各ゲル当り１５０Ｖで電気泳動した蛋白質は、セミドライ（ｓｅｍｉ−ｄｒｙ）法で、室温で１５Ｃ（ｃｏｕｌｏｍｂ）の電荷を１時間印加してニトロセルロース膜上に移動させた。ニトロセルロース膜はブロッキング緩衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５％スキムミルク／トリス緩衝食塩水）と常温で３０分間反応して非特異的な抗体結合を予防した。ＬＣ３、ＧａｐＤＨに対する抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． ＜Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ， 米国＞で購入）は０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５％ スキムミルク／トリス緩衝食塩水に１：１０００で希釈して４℃で一晩反応させた後、２次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． ＜Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，米国＞で購入）を１：２０００の比率で希釈して、１時間反応した。ニトロセルロース膜はＴＢＳで３回洗浄後、ＥＣＬ ｋｉｔを使用してＥＣＬフィルムに現像した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ａに示した。
【００８７】
図２ａに記載された通り、龍眼肉抽出物を処理した場合、１００μｇ／ｍｌ処理群でＬＣ３ ２／ＬＣ３ １の比率が対照群に比べて増加する傾向を確認され、龍眼肉抽出物がＬＣ３ ２蛋白質の発現を誘導することが分かった。
【００８８】
＜３−３−２＞本発明の龍眼肉抽出物と混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導活性の比較
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−１＞で製造した龍眼肉抽出物をそれぞれ１００μｇ／ｍｌ濃度で処理し、実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）を３００μｇ／ｍｌ処理して、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｂに示した。
【００８９】
図２ｂに示したように、龍眼肉抽出物１００μｇ／ｍｌ処理群でＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が１．７３と増加したのに比べて、混合抽出物ＤＧ３００μｇ／ｍｌ処理群では非常に明確なＬＣ３ ２蛋白質発現が現れ、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が１４．１０であることを確認した。
【００９０】
以上の結果から、龍眼肉抽出物のみならず、龍眼肉、藁本および遠志を混合した抽出物において自食作用の誘導効果が非常に優れていることが分かる。
【００９１】
＜３−３−３＞混合抽出物（ＤＧ）の濃度増加に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）を多様な濃度（７５、１５０、３００、６００μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｃに示した。
【００９２】
図２ｃに示されているように、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は濃度が増加するに伴い自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が増加することを確認することによって、本発明の混合抽出物は濃度が増加するに伴い、自食作用を誘導する効果を増加させることが分かった。
【００９３】
＜３−３−４＞混合抽出物（ＤＧ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性
前記培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）３００μｇ／ｍｌを処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で多様な時間（６、１２、２４、４８ｈ）の間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｄに示した。
【００９４】
図２ｄに記載された通り、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は時間が経過するに伴って自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が対照群に比べて増加したが、特に１２時間が経過した時点で、ＬＣ３ ２／ＬＣ３ １転換比率が最も大きく増加した。
【００９５】
＜３−３−５＞自食作用阻害剤（ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を利用した混合抽出物（ＤＧ）の自食作用誘導効果検証
本発明の混合抽出物（ＤＧ）のａｕｔｏｐｈａｇｙ誘導効果をより確実に検証するために、自食作用阻害剤を利用した実験を進行した。本実験に使用された３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ（３ＭＡ）は、特異的な自食作用阻害剤であり、細胞に自食作用を誘発する薬品と共に処理した時、薬品によって誘発される自食作用の効果を抑制することによって、薬品の自食作用誘導効果を検証する実験に主に使用する試薬である（Ｓｅｇｌｅｎ Ｐ．Ｏ， Ｇｏｒｄｏｎ Ｐ．Ｂ．（１９８２）． ３−Ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｎｅ：ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ／ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，７９；１８８９〜１８９２，１９８２．）
【００９６】
培養されたＰＣ１２細胞に混合抽出物（ＤＧ）３００μｇ／ｍｌのみで処理した実験群と混合抽出物（ＤＧ）３００μｇ／ｍｌと３ＭＡ １０ｍＭを混合処理した実験群を５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｅに示した。
【００９７】
図２ｅに記載された通り、混合抽出物（ＤＧ）のみで処理した実験群で観察されたＬＣ３ ２蛋白質の発現が混合抽出物（ＤＧ）と３ＭＡを混合投与した実験群では対照群水準に減少し、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は自主的に自食作用を誘発する効果があることを検証した。
【００９８】
＜３−３−６＞混合抽出物（ＭＹＨ）の濃度増加に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−３＞で製造した混合抽出物（ＭＹＨ）を多様な濃度（１００、４００、８００、１２００μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、実験結果はＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認したものを、図２ｆに示した。
【００９９】
図２ｆに示されているように、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は濃度が増加するに伴って自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率が増加することを確認することによって、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は濃度が増加するに伴って自食作用を誘導する効果を増加させることが分かった。
【０１００】
＜３−３−７＞混合抽出物（ＭＹＨ）の時間経過に応じた自食作用誘導活性
培養されたＰＣ１２細胞に実施例＜１−３＞で製造した混合抽出物（ＭＹＨ）４００μｇ／ｍｌを処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で多様な時間（６、１２、２４ｈ）培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、実験結果はＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認して、図２ｇに示した。
【０１０１】
図２ｇに記載された通り、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は、時間の経過に伴って、自食作用誘導効果を示すマーカーであるＬＣ３ ２蛋白質の発現、あるいはＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を、対照群に比べて増加させることを確認した。
【０１０２】
＜３−３−８＞自食作用阻害剤を利用した混合抽出物（ＭＹＨ）の自食作用誘導効果検証
本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）の自食作用誘導効果をより確実に検証するために、自食作用阻害剤を利用した実験を進行した。培養されたＰＣ１２細胞に混合抽出物（ＭＹＨ）４００μｇ／ｍｌのみで処理した実験群と混合抽出物（ＭＹＨ）４００μｇ／ｍｌと３ＭＡ１０ｍＭを混合処理した実験群を５％のＣＯ２、３７℃の条件で２４時間培養した後、実施例＜３−３−１＞と同一の方法で実験した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用し、ＧａｐＤＨ蛋白質は同量確認のために測定した。以降、ＬＣ３ １からＬＣ３ ２への転換比率を確認した実験結果を、図２ｈに示した。
【０１０３】
図２ｈに記載された通り、混合抽出物（ＭＹＨ）のみで処理した実験群で観察されたＬＣ３ ２蛋白質の発現が混合抽出物（ＭＹＨ）と３ＭＡを混合投与した実験群では対照群水準に減少し、本発明の混合抽出物（ＭＹＨ）は自主的に自食作用を誘発する効果があることを検証した。
【実施例４】
【０１０４】
ＭＰＴＰ投与によるパーキンソン病の動物モデルで、本発明の混合抽出物が行動障害および脳細胞死滅に及ぼす効果
＜４−１＞本実験に使用された混合抽出物
前記実施例＜１−２＞の混合抽出物（ＤＧ）と実施例＜１−３＞の混合抽出物（ＭＹＨ）を生理食塩水に多様な濃度で希釈して使用した。
【０１０５】
＜４−２＞実験動物処置
＜４−２−１＞混合抽出物（ＤＧ）による実験動物の処置
マウスを各群当り９匹ずつ４群に分けた。第１群（対照群）および第２群（ＭＰＴＰ群）は生理食塩水をマウス体重ｋｇ当り５ｍｌで６日間１日１回経口投与し、第３群（混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群）および第４群（混合抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群）は生理食塩水に溶解させたそれぞれの混合抽出物を６日間１日１回経口投与した。薬品投与３日目となる日に最後の投与をした２時間後、第１群（対照群）は生理食塩水をマウス体重ｋｇ当り５ｍｌで１日４回（急性、Ａｃｕｔｅ）２時間間隔で腹腔投与し、第２群、第３群および第４群は、ＭＰＴＰ２０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で生理食塩水に溶解させて１日４回（急性、Ａｃｕｔｅ）２時間間隔で腹腔投与した。
【０１０６】
＜４−２−２＞混合抽出物（ＭＹＨ）による実験動物の処置
マウスを各群当り７匹ずつ３群に分けた。第１群（対照群）および第２群（ＭＰＴＰ群）は第３群（混合抽出物（ＭＹＨ）１００ｍｇ／ｋｇ投与群）は生理食塩水に溶解させた混合抽出物（ＭＹＨ）を３日間１日１回経口投与し、第１群（対照群）および第２群（ＭＰＴＰ群）は同一の生理食塩水量を経口投与した。薬品投与３日目となる日に第２群と第３群にＭＰＴＰを２０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で生理食塩水に溶解させて１日４回（急性、ａｃｕｔｅ）２時間間隔で腹腔投与した。ＭＰＴＰ投与７日後、麻酔を通じてマウスを殺した後、脳組織を４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ：ＰＦＡ）で固定して−８０℃で保管した。
【０１０７】
＜４−３＞混合抽出物（ＤＧ）の行動障害の改善効果
＜４−３−１＞行動試験；ポールテスト（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）
前記ＭＰＴＰ投与終了の翌日、高さ５０ｃｍ、直径１ｃｍの棒でポールテストを行った。棒の上にＣ５７ＢＬ／６マウスの頭が上を向くように置き、マウスが頂上を１８０°度回転する時間（Ｔ‐回転）と、回転して４本足が床につくまで降りてくる時間（Ｔ−ＬＡ）を測定した。各マウスを３回ずつ練習させた後、７回本実験を行い、その結果を図３ａまたは図３ｂに示した。
【０１０８】
図３ａまたは図３ｂに示したように、ＭＰＴＰ群は、対照群に比べて％で分析時、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間がそれぞれ２６０．２１％、１５１．８２％とＭＰＴＰによる行動障害が誘発されており、これに対して第３群（混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群）では、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間がそれぞれ１３３．１０％、１１０．５１％と現れ、第４群（混合抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群）では、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間がそれぞれ１４３．０５％、１２１．８５％と現れて、有意性が確認され、Ｔ−回転とＴ−ＬＡ時間の全てが濃度依存的に減少することを確認した。
【０１０９】
＜４−３−２＞行動試験；ロタロッドテスト（Ｒｏｔａ−ｒｏｄ ｔｅｓｔ）
本発明の混合抽出物の投与が終わった１日後（ＭＰＴＰ投与後５日）、加速モード（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）で８ｒｐｍに設定されたロタロッド装置（Ｒｏｔａ ｒｏｄ Ｂ１００１、Ｂ．Ｓ Ｔｅｃｈｎｏｌａｂ ＩＮＣ．， Ｋｏｒｅａ）のプラスチック棒（直径１インチ）にマウスを乗せて、５分ずつトレーニングを行った。２４時間後、加速モードで１６ｒｐｍに設定して本実験を行い、その結果を図３ｃに示した。
【０１１０】
図３ｃに記載された通り、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％で分析時、マウスが落ちる時間（Ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅ）は２１．６９％と減少してＭＰＴＰによる行動障害が誘発され、これに対して第３群（混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群）では５３．２４％と現れ、第４群（混合抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群）では７７．８９％と測定されて、Ｌａｔｅｎｃｙ ｔｉｍｅが有意に増加したことを確認した。
【０１１１】
前記行動試験の結果、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は、ＭＰＴＰによる行動障害に対する有効な改善効果を示すことを確認することができた。
【０１１２】
＜４−４＞混合抽出物（ＤＧ）のドーパミン細胞への保護活性評価
前記ポールテストとロタロッドテストが完了した（ＭＰＴＰ投与後７日）各群のマウスを致死させた後、脳組織（黒質および線条体）を分離した。分離された脳組織を過酸化水素で脱水した後、１次抗体であるチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）（ＴＨ， ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ｒａｂｂｉｔ ｏｒｉｇｉｎ １：２０００， Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ． ＜Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ， ＵＳＡ＞で購入）を一晩反応させた後、２次抗体でビオチン化抗ウサギ抗体（ヤギ由来， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＜Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ＞で購入）を使用し、ＡＢＣ反応（ＡＢＣ ｋｉｔ， Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＜Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ， ＵＳＡ＞で購入）を経て、ジアミノベンジジン（Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を利用して発色させた。ドーパミン細胞保護効果は黒質におけるＴＨ陽性細胞の数を数えて分析し、線条体における光学密度を測定して評価し、その結果を図３ｄおよび図３ｅに示した。
【０１１３】
図３ｄで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％で分析時、黒質におけるＴＨ陽性細胞数が３０．８２％とＭＰＴＰによる細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群では５２．７５％、１００ｍｇ／ｋｇ投与群では８９．１９％と増加して、ＭＰＴＰで誘導した細胞毒性に対して保護効果を示し、特に１００ｍｇ／ｋｇ投与群でＴＨ陽性細胞数が統計学的に有意に増加した。
【０１１４】
一方、図３ｅで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％分析時、線条体における光学密度が２６．３０％とＭＰＴＰによるドーパミン細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群では３６．３１％、１００ｍｇ／ｋｇ投与群では４３．４２％と増加してドーパミン細胞の保護効果が確認されており、特に１００ｍｇ／ｋｇ投与群で光学密度が統計学的に有意に増加した。
【０１１５】
以上の結果で、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は、黒質および線条体で、濃度依存的に、優れたドーパミン細胞の保護活性を示すことを確認することができた。
【０１１６】
＜４−５＞龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）のドーパミン細胞の保護活性の評価
前記実施例＜４−２−２＞で準備された脳組織を実施例＜４−４＞の実験方法を利用して処置した後、ドーパミン細胞保護効果の評価のために黒質におけるＴＨ陽性細胞の数を数えて分析し、線条体における光学密度を測定して、その結果を図３ｆおよび図３ｇに示した。
【０１１７】
図３ｆで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％で分析時、黒質におけるＴＨ陽性細胞数が３６．７％とＭＰＴＰによる細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物（ＭＹＨ）１００ｍｇ／ｋｇ投与群では５３．０４％と増加して、ＭＰＴＰで誘導した細胞毒性に対して保護効果を示した。
【０１１８】
一方、図３ｇで、ＭＰＴＰ群は対照群に比べて％分析時、線条体における光学密度が３７．７９％でＭＰＴＰによるドーパミンの細胞損傷が誘導されており、これに対して混合抽出物（ＭＹＨ）１００ｍｇ／ｋｇ投与群では５３．１０％と増加して、ドーパミン細胞の保護効果が確認された。
【０１１９】
以上の結果から、龍眼肉、藁本および遠志の混合抽出物を含む組成物（ＭＹＨ）は、黒質（および線条体で濃度依存的に優れたドーパミン細胞の保護活性を示すことを確認することができた。
【０１２０】
＜試験例１＞
本発明の混合抽出物が脳細胞死滅に及ぼす効果
＜１−１＞混合抽出物（ＤＧ）の脳細胞死滅に及ぼす効果
本発明の混合抽出物（ＤＧ）がＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞活性度に及ぼす効果を測定するために、公知の細胞毒性測定（ＭＴＴ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）方法を使用した。
【０１２１】
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−２＞で製造した混合抽出物（ＤＧ）を多様な濃度（２５、５０、１００、２００、３００μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用した。２４時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【０１２２】
前記のようにＭＴＴ還元の程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得て、その結果を図４ａに示した。
【０１２３】
図４ａに記載された通り、本発明の混合抽出物を多量服用するとしても、細胞毒性がないため、本発明の混合抽出物は薬学的組成物または食品組成物の有効な成分で、安全に使用できることが分かった。
【０１２４】
一方、ＩＣＲ マウス（５週齢）を利用した単回投与急性毒性実験結果、本発明の混合抽出物（ＤＧ）は２ｇ／ｋｇ／１０ｍｌ（経口投与）の濃度まで毒性を示さなかった（結果未記載）。
【０１２５】
＜１−２＞混合抽出物（ＭＹＨ）の脳細胞死滅に及ぼす効果
ＭＴＴ分析のために培養されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に実施例＜１−３＞で製造した混合抽出物（ＭＹＨ）を多様な濃度（６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ）で処理し、５％のＣＯ２、３７℃の条件で培養した。この時、培地のみで処理した対照群も共に準備して実験に使用した。２４時間後にＭＴＴ溶液を添加して１時間培養した後、ＥＬＩＳＡ機器を利用して吸光度を測定した。
【０１２６】
前記のようにＭＴＴ還元の程度を測定することによって、各群の細胞活性度を得、その結果を図４ｂに示した。
【０１２７】
図４ｂに記載された通り、本発明の混合抽出物を多量服用するとしても、細胞毒性がないため、本発明の混合抽出物は薬学的組成物または食品組成物の有効な成分で安全に使用できることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項２】
藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択される一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記抽出物は、龍眼肉および遠志を１：０．２〜１：１０の重量比で混合して抽出されたものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記抽出物は、龍眼肉および藁本を１：０．１〜１：５の重量比で混合されて抽出されたものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抽出物は、龍眼肉、遠志および藁本を１：０．１〜１０：０．１〜１０の重量比で混合されて抽出されたものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記抽出物は、龍眼肉を１５〜２０重量部、藁本を１０〜１５重量部、遠志を１０〜１５重量部、葛根を１５〜２０重量部、オウゴンを５〜１０重量部、桔梗を１〜５重量部、ビャクシを５〜１０重量部、升麻を５〜１０重量部、ライフクシを５〜１０重量部、および石菖蒲を１５〜２０重量部で混合して抽出されたものである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される一種以上を使用して抽出されたものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記退行性脳神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物。
【請求項１１】
藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項１０に記載の食品組成物。
【請求項１２】
葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１３】
前記抽出物は、龍眼肉および遠志を、１：０．２〜１０の重量比で混合して抽出されたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１４】
前記抽出物は、龍眼肉および藁本を、１：０．１〜５の重量比で混合して抽出されたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１５】
前記抽出物は、龍眼肉、遠志および藁本を、１：０．１〜１０：０．１〜１０の重量比で混合して抽出されたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１６】
前記抽出物は、龍眼肉を１５〜２０重量部、藁本を１０〜１５重量部、遠志を１０〜１５重量部、葛根を１５〜２０重量部、オウゴンを５〜１０重量部、桔梗を１〜５重量部、ビャクシを５〜１０重量部、升麻を５〜１０重量部、ライフクシを５〜１０重量部および石菖蒲を１５〜２０重量部で混合して抽出されたものである、請求項１２に記載の食品組成物。
【請求項１７】
前記抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される一種以上を使用して抽出されたものである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の食品組成物。
【請求項１８】
前記退行性脳神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の食品組成物。
【請求項１】
龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項２】
藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択される一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記抽出物は、龍眼肉および遠志を１：０．２〜１：１０の重量比で混合して抽出されたものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記抽出物は、龍眼肉および藁本を１：０．１〜１：５の重量比で混合されて抽出されたものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記抽出物は、龍眼肉、遠志および藁本を１：０．１〜１０：０．１〜１０の重量比で混合されて抽出されたものである、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記抽出物は、龍眼肉を１５〜２０重量部、藁本を１０〜１５重量部、遠志を１０〜１５重量部、葛根を１５〜２０重量部、オウゴンを５〜１０重量部、桔梗を１〜５重量部、ビャクシを５〜１０重量部、升麻を５〜１０重量部、ライフクシを５〜１０重量部、および石菖蒲を１５〜２０重量部で混合して抽出されたものである、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される一種以上を使用して抽出されたものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記退行性脳神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
龍眼肉抽出物を有効成分として含む、退行性脳神経疾患の予防用または改善用の食品組成物。
【請求項１１】
藁本および遠志からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項１０に記載の食品組成物。
【請求項１２】
葛根、オウゴン、桔梗、ビャクシ、升麻、ライフクシおよび石菖蒲からなる群より選択された一種以上の抽出物を追加的に含む、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１３】
前記抽出物は、龍眼肉および遠志を、１：０．２〜１０の重量比で混合して抽出されたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１４】
前記抽出物は、龍眼肉および藁本を、１：０．１〜５の重量比で混合して抽出されたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１５】
前記抽出物は、龍眼肉、遠志および藁本を、１：０．１〜１０：０．１〜１０の重量比で混合して抽出されたものである、請求項１１に記載の食品組成物。
【請求項１６】
前記抽出物は、龍眼肉を１５〜２０重量部、藁本を１０〜１５重量部、遠志を１０〜１５重量部、葛根を１５〜２０重量部、オウゴンを５〜１０重量部、桔梗を１〜５重量部、ビャクシを５〜１０重量部、升麻を５〜１０重量部、ライフクシを５〜１０重量部および石菖蒲を１５〜２０重量部で混合して抽出されたものである、請求項１２に記載の食品組成物。
【請求項１７】
前記抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコール、ヘキサン、塩化メチレン、アセトニトリルおよびアセトンからなる一種以上の溶媒およびこれらの混合溶媒からなる群より選択される一種以上を使用して抽出されたものである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の食品組成物。
【請求項１８】
前記退行性脳神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症および多発性硬化症からなる群より選択される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の食品組成物。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図２ｈ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図３ｆ】
【図３ｇ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図２ｅ】
【図２ｆ】
【図２ｇ】
【図２ｈ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図３ｄ】
【図３ｅ】
【図３ｆ】
【図３ｇ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【公開番号】特開２０１２−６９０６（Ｐ２０１２−６９０６Ａ）
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４９０４４（Ｐ２０１０−２４９０４４）
【出願日】平成２２年１１月５日（２０１０．１１．５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔刊行物名〕 韓国国立中央図書館所蔵（登録）の論文資料 〔発行所〕 大田大学校 〔配架日〕 平成２２年５月１７日
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】３９−１ Ｈａｗｏｌｇｏｋ−ｄｏｎｇ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ １３６−７９１ＫＯＲＥＡ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月１２日（２０１２．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月５日（２０１０．１１．５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔刊行物名〕 韓国国立中央図書館所蔵（登録）の論文資料 〔発行所〕 大田大学校 〔配架日〕 平成２２年５月１７日
【出願人】（５９１０７４１１６）韓国科学技術研究院 (17)
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＮＯＬＯＧＹ
【住所又は居所原語表記】３９−１ Ｈａｗｏｌｇｏｋ−ｄｏｎｇ，Ｓｅｏｎｇｂｕｋ−ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ １３６−７９１ＫＯＲＥＡ
【Ｆターム（参考）】
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