（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラート及び２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼを使用の製造方法
本発明は、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラート及びその作製方法に関する。さらに、本発明は、上記化合物が中間体として使用される、スタチン（特に、ロスバスタチン）及びその誘導体を作製するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラート及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、上記化合物が中間体として使用される、スタチン（特に、ロスバスタチン）及びその誘導体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラートは、スタチンの合成において中間体となり得る。スタチン（その代表例は、ロスバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチン、ダルバスタチン若しくはこれらの類縁体又はプラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン若しくはこれらの類縁体から選択され得る。）は、それぞれ、芳香族又は脂環式の殻に接続されたヘプテン酸又はヘプタン酸部分（遊離の酸、塩又はラクトン）によって規定される特徴的構造を共有する。スタチンの生物活性は、その立体化学、特に、前記ヘプテン酸又はヘプタン酸部分のキラル原子における立体配置と密接に関連する。
【０００３】
ＷＯ２００６／１３４４８２には、アトルバスタチンを形成するための方法中に、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって触媒されるアルドール付加工程が含まれる。
【０００４】
日本国特許２００５２２９８５８は、ＤＥＲＡの存在下で、ベンジルオキシアセトアルデヒドをアセトアルデヒドと反応させる、（（４Ｒ，６Ｓ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２−ピロンを作製するための方法を開示する。酵素触媒の反応時間は、１２時間であった。
【０００５】
ＷＯ０５／１１８７９４は、ＤＥＲＡ酵素の改善を取り扱っている。極めて多様な置換基を有する２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを調製するために、単離された変異体酵素が使用され得る。
【０００６】
ＤＥＲＡ変異体は、立体特異的なアルドール反応を触媒することが記載された（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２００４，４５，２４３９−２４４１）。ＤＥＲＡ変異体は触媒活性の相対的改善を示し、従って、野生型ＤＥＲＡと比較して収率を改善した。酵素触媒の反応時間は６日であった。この酵素触媒から得られた１つの産物は、アトルバスタチンの合成に関して提案された。
【０００７】
立体特異的アルドール反応を触媒するためのＤＥＲＡは、「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００４， １０１（１６） ５７８８−５７９３」中にさらに記載されており、酵素プロセスの改善された容積生産性を示した。使用される基質の酵素活性に対する阻害的効果も記載されている。酵素触媒の反応時間は３時間であった。この酵素的触媒から得られた産物は、アトルバスタチン又はロスバスタチンの合成に関して提案された。
【０００８】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって触媒される３つのアルデヒド基質との立体特異的アルドール反応は、全ての置換されたアセトアルデヒドをＤＥＲＡに対する基質として等しく受容するわけではなく（Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ；１１７，２９，（１９９５）ｐｐ７５８５）、ある種の基質は、ＤＥＲＡ活性に対して阻害的効果を示す。酵素的触媒の反応時間は６日であった。
【０００９】
ＷＯ２００７／０３９２８７Ａ１では、ヨードラクトン合成を介したラクトン化されたスタチン側鎖中間体ＶＩの合成が記載されており、これには、６つの有機合成工程が必要とされる。この複数工程の合成において、４番目の工程は、ヨードラクトン中間体産物の立体化学を規定するラクトン形成工程である。このラクトン形成工程は、相対的に低い立体選択性を与えるに過ぎない。Ｉ化合物、Ａｇ化合物、グリニャール試薬及び鏡像異性体的に純粋な出発化合物のような化学量論的量で使用される幾つかの試薬は、極めて高価である。（以下に示されている）有機合成の６つの工程は、１９％の総収率を得られた。
【００１０】
【化１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００６／１３４４８２号
【特許文献２】特許第２００５２２９８５８号明細書
【特許文献３】国際公開第０５／１１８７９４号
【特許文献４】国際公開第２００７／０３９２８７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５、２００４年、ｐｐ．２４３９−２４４１
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１（１６）、２００４年、ｐｐ．５７８８−５７９３
【非特許文献３】Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、１１７，２９、１９９５年、ｐｐ．７５８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、スタチンを効果的に作製するための構築ブロックとして中間体化合物及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的は、少数の合成段階を必要とし、相対的に短い反応時間を示し、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰に関して高い立体化学的純度を有する産物の高総収率をもたらす方法により、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラートを提供することによって解決される。本発明のさらなる課題は、安価な出発材料と単純な装置を用いて上記カルボキシラートを作製することである。
【００１５】
本発明の一態様は、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下記に定義されているとおりである。）を、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００１６】
【化２】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する方法である。連続的アルドール反応を触媒する酵素を好ましく使用することによって、ＩＶに到達するための反応工程の数は低減させることができる。
【００１７】
好ましくは、基質は、式ＩＩＩの化合物（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである。）から選択される。このような適切な酵素基質の選択によって、大幅に短縮された反応時間が可能となり、反応の顕著に改善された立体選択性が提供される。酵素反応は水性溶媒中で実施されるので、基質の適切な選択によって、基質を制御することがさらに可能となる。さらに、ＩＶのエステル部分は、好ましくは水によって切断されないように選択される。従って、より好ましくは、Ｒ１＝ＣＨ３である。特に、適切な酵素基質は、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式ＩＶの化合物を提供するために好ましく選択される。その後、産物の精製及び単離がより容易であり、従って、収率がより高くなるので、高い鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰は著しく有利である。
【００１８】
酵素は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４．）であることが好ましい。より広い基質特異性を有する酵素を見出すために、ＤＥＲＡ酵素の異なる種類をスクリーニングすることが有用であり得る。さらに、ＤＥＲＡ酵素は、特異的基質に対して特別に加工され得る。これらの理由のため、異なる変異体ＤＥＲＡ酵素を検査し得る。より具体的には、前記アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２、ＤＥＲＡ０３、ＤＥＲＡ０４、ＤＥＲＡ０５、ＤＥＲＡ０６、ＤＥＲＡ０７、ＤＥＲＡ０８、ＤＥＲＡ０９、ＤＥＲＡ１０、ＤＥＲＡ１１、ＤＥＲＡ１２、ＤＥＲＡ１３、ＤＥＲＡ１４、ＤＥＲＡ１５、ＤＥＲＡ１６、ＤＥＲＡ１７、ＤＥＲＡ１８、ＤＥＲＡ１９、ＤＥＲＡ２０、ＤＥＲＡ２１、ＤＥＲＡ２２及びＤＥＲＡ２３又は前記アルドラーゼの何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアルドラーゼからなる群から選択される。より具体的には、前記アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２、ＤＥＲＡ０５、ＤＥＲＡ１２及びＤＥＲＡ１３からなる群から選択され、特に、前記アルドラーゼは配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは、配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯを接触させる前記工程は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び前記式ＩＩＩのアルデヒドを接触させることによって達成される。前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように行われる。この実施形態によれば、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。酵素調製及び産物の精製における数個の工程が省略されるので、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物を使用する可能性は、「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００４， １０１ （１６） ５７８８−５７９３」に記載されている方法と比べて、より低い製造コストをさらに可能にする。また、細胞環境の安定化効果は、他の酵素調製物と比べて、酵素活性に対する影響をより低く抑えながら、より高い基質濃度を使用することを可能にする。これによって、より低い酵素負荷量で、より高い容積生産性が可能となり、これは、製造コストを著しく低下させる。驚くべきことに、アルドラーゼを過剰発現する生物を完全細胞触媒として使用することによって、式ＩＶの化合物の高い鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰が保持される。
【００２０】
本発明の別の態様は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００２１】
【化３】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）を調製する方法である。前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように行われる。本発明のこの実施形態によれば、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。好ましくは、完全細胞触媒の形態の酵素は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。
【００２２】
本発明の別の態様は、アルドール縮合を触媒する酵素とアセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含み、前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、式ＩＶの化合物
【００２３】
【化４】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）を調製する方法である。
【００２４】
本発明の別の態様は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、上に定義されている。）を接触させる工程を含む、式ＸＶの化合物
【００２５】
【化５】
（Ｒ４＝ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法である。前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように実施される。本発明のこの態様によれば、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。
【００２６】
好ましくは、完全細胞触媒の形態の酵素は２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。
【００２７】
本発明の別の態様は、アルドール縮合を触媒する酵素とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、下に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含み、前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、式ＸＶの化合物
【００２８】
【化６】
（Ｒ４は、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法である。
【００２９】
酵素調製及び産物の精製における幾つかの工程が省略されるので、完全細胞触媒の形態で酵素が使用されると、著しくより低いプロセスコストが達成される。また、細胞環境の安定化効果によって、他の酵素調製物と比べて、酵素活性に対する影響をより低く抑えながら、より高い基質を使用することが可能となる。さらに、完全細胞触媒の形態で酵素を使用すると、高い鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰が得られる。
【００３０】
本発明の方法の態様は、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合に対するｐＨが４．５から１０、好ましくは５から１０の範囲に維持され、特に、５から８、好ましくは５から７のｐＨ範囲の緩衝液を用いてｐＨが維持される反応条件で効果的に実施することができる。適切なｐＨ値は、より短い反応時間をもたらす。別の態様において、適切なｐＨは、基質及び／又は産物の分解を低下させる。緩衝液は、ｐＨ値を一定のレベルに調整することを可能にし、これは、ｐＨ値に関して一定した反応条件に寄与する。この目的のために、緩衝液は、好ましくは、ホスファート緩衝液である。あるいは、ｐＨ制御されたポンプの補助を得て、酸又はアルカリの自動化された添加によって、正確なｐＨの調節を達成することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯを接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）を形成させるために、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件下で、式ＩＩＩの基質Ｒ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）をアセトアルデヒドと反応させるための、アルドラーゼの使用である。特に、前記アルドラーゼは、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼである。さらに具体的には、アルドラーゼは、上に記載されているＤＥＲＡ０１からＤＥＲＡ２３からなる群から選択される。特に、前記アルドラーゼは、生きた完全細胞内に含まれ、又は不活化された完全細胞内に含まれ、又は均質化された完全細胞内に含まれ、又は無細胞抽出物内に含まれ、又は精製された酵素であり、又は固定化されており、細胞外に発現されたタンパク質の形態である。
【００３２】
本発明の別の態様は、酸化により、式ＩＶの化合物を式Ｖの化合物へ転化する工程を含む、式Ｖの化合物
【００３３】
【化７】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する方法である。酸化のための反応試薬は、安価であり、及び高い収率を与えるべきである。従って、好ましくは、酸化は、Ｂｒ２及びＢａＣＯ３を用いて行われる。
【００３４】
特に、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式Ｖの化合物が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様は、
ａ）式ＩＩの化合物Ｒ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ２ＣＲ２（Ｒ２は、下に定義されている。）
【００３６】
【化８】
を溶媒と及びオゾンと接触させる工程、及び
ｂ）工程ａ）から得られたオゾニドを加水分解する工程、
を含む、式ＩＩＩ’のアルデヒドＲ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ２は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである（ｎ−プロピル、シクロヘキシル、フェニル、モルホリン、ピロリジン及びイミダゾールを除く。）を作製する方法。
【００３７】
オゾン分解は、高い収率での前記アルデヒドの安価な作製を与える。特に、２つの所望される産物が加水分解後に得られるので、（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）位に、Ｈの他に２つの同じ置換基を有する（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）−アルケンは、高い分子的経済性を与えるが、（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）位に、Ｈの他に２つの異なる置換基を有する（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）−アルケンの転化は、１つの所望の産物及び１つの廃棄産物を与える。特に、工程ａ）の溶媒はジクロロメタンである。好ましくは、Ｒ２は、ｎ−プロピル、シクロヘキシルを除くＣ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである。より好ましくは、Ｒ２は、ＣＨ３である。−５０から−９０℃範囲の、より好ましくは、約−８０℃の温度で、工程ａ）を実施することが好ましい。さらに、工程ａ）の得られたオゾニドを硫化メチルと接触させることによって、工程ｂ）を実施することが好ましい。特に、工程ｂ）は、−８０℃と室温の間に含まれる温度で実施される。
【００３８】
式ＩＩの化合物は、（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）−ブト−２−エン−１，４−ジオールを式Ｉの無水物Ｒ２ＣＯ２ＣＯＲ２（Ｒ２は、上で定義されている。）を、実施例１の工程１に又は従来技術の合成に記載されているように（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５６， ２１， ３２８−３３１）反応させることによって得られる。
【００３９】
本発明の別の態様は、式ＩＶ又はＶの化合物
【００４０】
【化９】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
である。Ｒ１が、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシであり、特に、Ｒ１がＣＨ３である式ＩＶ又はＶの化合物が好ましい。
【００４１】
本発明のさらに別の態様は、
ａ）式ＶＩの化合物
【００４２】
【化１０】
を得るために、保護基Ｒ３（Ｒ３は、独立に置換された又は置換されていない、シリル、ベンジル、アルキル及びアセチルから好ましく選択される保護基であり、より好ましくは、Ｒ３は、場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８トリアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８ジアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８アルキルジアリールシリル（アルキルは、同一又は別異であり得る。）から選択され、より好ましくは、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。）によって、４位の水酸基において、式Ｖの化合物
【００４３】
【化１１】
（Ｒ１＝それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキル。）
を保護する工程、
ｂ）スタチン又は医薬として許容されるその誘導体を作製するのに十分な条件下で、式ＶＩの前記化合物を反応させる工程、
を含む、スタチン又はその誘導体を作製する方法である。
【００４４】
特に、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式ＶＩの化合物が提供される。
【００４５】
スタチン又はその誘導体を作製するための方法において、工程ｂ）の条件はアルデヒドへのＶＩの転化によって、及びスタチン又はその誘導体を与えるための適切なホスホニウム塩又は他のリン誘導体とのＷｉｔｔｉｇカップリングによって設定されることが好ましい。さらにより好ましくは、Ｗｉｔｔｉｇカップリング工程は、以下の工程を含む。
ｂ１）式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る工程、
ｂ２）式Ｘの化合物
【００４６】
【化１２】
を得るために、式ＩＸを有するホスホニウム塩
【００４７】
【化１３】
（Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、並びにＸは陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートである。）
を得る工程、
ｂ３）続いて、化合物Ｘをロスバスタチン又はその塩へ転化する工程。
【００４８】
式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る前記工程ｂ１）は、式ＶＩＩの化合物
【００４９】
【化１４】
（Ｒ３は、上に定義されている。）
を通じて実施される。
【００５０】
特に、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式ＶＩＩの化合物が提供される。
【００５１】
本発明のさらに別の態様は、
ａ）アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、上に定義されている。）のアルデヒドを、アルドール縮合を職倍する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００５２】
【化１５】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する工程、
ｂ）酸化によって、式ＩＶの前記化合物を式Ｖの化合物
【００５３】
【化１６】
（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）
へ転化する工程、
ｃ）式ＶＩの化合物
【００５４】
【化１７】
を得るために、保護基Ｒ３（Ｒ３は、独立に置換された又は置換されていない、シリル、ベンジル、アルキル及びアセチルから好ましく選択される保護基であり、より好ましくは、Ｒ３は、場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８トリアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８ジアルキルアリールシリル、Ｃ１−Ｃ８アルキルジアリールシリル（アルキルは、同一又は別異であり得る。）から選択され、より好ましくは、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。）によって、４位の水酸基において、式Ｖの前記化合物を保護する工程、
ｄ）スタチン又は医薬として許容されるその誘導体を作製するのに十分な条件下で、式ＶＩの前記化合物を反応させる工程、
を含み、
工程ｄ）の条件が、アルデヒドへのＶＩの転化によって、及びスタチン又はその誘導体を得るために、適切なホスホニウム塩又は他のリン化合物とのＷｉｔｔｉｇカップリングによって設定され、好ましくは、Ｗｉｔｔｉｇカップリング工程が、
ｂ１）式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る工程、
ｂ２）式Ｘの化合物
【００５５】
【化１８】
を得るために、式ＩＸを有するホスホニウム塩
【００５６】
【化１９】
（Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、
並びにＸは陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートである。）
を得る工程、
ｂ３）その後、化合物Ｘをロスバスタチン又はその塩へ転化する工程、
を含む、
スタチン又はその誘導体を作製する方法である。
【００５７】
以下では、添付の図面を参照しながら、好ましい実施形態及び実施例によって本発明の方法がより詳しく記載されているが、これらの実施形態、実施例及び図面は、例示の目的で提示されているに過ぎず、いかなる意味においても本発明を限定するものではないことに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例６に係る酵素的反応の反応プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、化学的には以下の一般式の（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラートである式ＩＶの化合物を提供する。
【００６０】
【化２０】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
【００６１】
特に、Ｒ１がそれぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである場合、とりわけ、Ｒ１がＣＨ３である場合の式ＩＶの化合物の特徴は、所望の立体化学を有しており、以降の中間体をその後分離することが回避される点に存する。従って、中間体化合物ＩＶの提供は、可能な連続的選択的酸化工程又は適切な機能的修飾（例えば、６位の水酸基の最初の酸化工程、場合によって行われる、４位の水酸基の第二の酸化工程、及びこれに加えて又はこれに代えて、Ｒ１アシル残基の切断後のメトキシ基での第三の酸化工程を含む。）を可能とする。
【００６２】
本発明は、以下のスキームに示されているように、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合反応において、対応するラクトールＩＶを形成するために、置換されたアセトアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（式ＩＩＩ）の化合物及びアセトアルデヒドを使用する酵素的プロセスを提供する。
【００６３】
【化２１】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルから選択される。）本発明の構造ＩＶは、２及び４位において、厳格に確定された立体異性を有するのに対して、他のキラル中心は両方の可能性で存在し得、エピマーの混合物を形成する。
【００６４】
本明細書において使用される「アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件」という用語は、本明細書に記載されているように、アルドラーゼによって触媒されることができる本分野において公知のあらゆるアルドール縮合条件を表す。特に、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件は、所望の産物の形成及び蓄積を可能とするような条件である。これらの条件には、一態様において、アルドラーゼが連続的縮合の実行を可能とするのに十分な量で提供される活性酵素である条件、別の態様において、アルドラーゼの活性の最小的阻害を示す量で、基質及びアセトアルデヒドが反応中に存在する条件、別の態様において、温度、ｐＨ、溶媒組成、撹拌及び反応の長さが所望の産物の蓄積を可能とする条件、別の態様において、前記条件が産物の安定性に対して有害な効果を持たない条件が含まれる。具体的には、これらの条件は、実施例に開示されている値によって規定される。
【００６５】
式ＩＩＩの上記化合物に対するアルドラーゼ活性は、指定された酵素が単離及び／又は精製され、又は固定化され又は細胞内に存在し、又は不活化された完全細胞内に含まれ、又は均質化された細胞物質中に含まれ、又は式ＩＩＩの化合物及びアセトアルデヒドの上記反応を触媒して、ＩＶに到達する無細胞抽出物中にあることを意味する。
【００６６】
本明細書において使用される「スタチン（特に、ロスバスタチン）又は医薬として許容されるその塩を産生するのに十分な条件」という用語は、所望のスタチン化合物を得るために本分野において記載されている手段（本明細書に記載されている手段を含む。）を表す。
【００６７】
本明細書において使用される「アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する生物」という用語は、強力なプロモーターの調節下でアルドラーゼ発現を有し、及びアルドラーゼが（野生型発現対照と比べて）高いレベルで発現されており、及び細胞内又は細胞外に蓄積されているあらゆる生物を表す。このような生物を作製する方法は、当業者に周知である。
【００６８】
本発明において使用するためのアルドラーゼは、式ＩＩＩの上記化合物に対してアルドラーゼ活性を有するあらゆる化合物であり得る。本発明の一実施形態において、アルドラーゼは、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）である。適切なＤＥＲＡ−アルドラーゼの例には、配列表に記載されているそれらのヌクレオチド配列又はそれぞれのコドン最適化されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列によって特定される、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２、ＤＥＲＡ０３、ＤＥＲＡ０４、ＤＥＲＡ０５、ＤＥＲＡ０６、ＤＥＲＡ０７、ＤＥＲＡ０８、ＤＥＲＡ０９、ＤＥＲＡ１０、ＤＥＲＡ１１、ＤＥＲＡ１２、ＤＥＲＡ１３、ＤＥＲＡ１４、ＤＥＲＡ１５、ＤＥＲＡ１６、ＤＥＲＡ１７、ＤＥＲＡ１８、ＤＥＲＡ１９、ＤＥＲＡ２０、ＤＥＲＡ２１，ＤＥＲＡ２２及びＤＥＲＡ２３が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
一般に、本分野において公知のＤＥＲＡアルドラーゼの何れもが、上に列記されているＤＥＲＡアルドラーゼに対する配列同一性とは無関係に、反応のために使用され得る。本発明は、３０．１％に過ぎない同一性を有する２つの異なるアルドラーゼを用いて、前記反応を首尾よく実施する例を提供する。しかしながら、反応の収率は、各アルドラーゼの基質特異性及び各アルドラーゼに対する基質の阻害的効果に依存し得る。
【００７０】
ＤＥＲＡ０１は、配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。ＤＥＲＡ０１（イー・コリ）は、カタログ番号９１２５２で、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡから市販されている。
【００７１】
ＤＥＲＡ０２は、配列番号３若しくは４のヌクレオチド配列又は配列番号５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。ＤＥＲＡ０２は、「Ｗｉｌｌｉａｍ Ａ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， （２００４）， Ｖｏｌ．１０１ ， Ｎｏ．１６， ｐｐ． ５７８８」中に記載されている。
【００７２】
ＤＥＲＡ０３は、配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７３】
ＤＥＲＡ０４は、配列番号８のヌクレオチド配列又は配列番号９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７４】
ＤＥＲＡ０５は、配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７５】
ＤＥＲＡ０６は、配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７６】
ＤＥＲＡ０７は、配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７７】
ＤＥＲＡ０８は、配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７８】
ＤＥＲＡ０９は、配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７９】
ＤＥＲＡ１０は、配列番号２０のヌクレオチド配列又は配列番号２１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８０】
ＤＥＲＡ１１は、配列番号２２のヌクレオチド配列又は配列番号２３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８１】
ＤＥＲＡ１２は、配列番号２４のヌクレオチド配列又は配列番号２５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８２】
ＤＥＲＡ１３は、配列番号２６のヌクレオチド配列又は配列番号２７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８３】
ＤＥＲＡ１４は、配列番号２８のヌクレオチド配列又は配列番号２９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８４】
ＤＥＲＡ１５は、配列番号３０のヌクレオチド配列又は配列番号３１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８５】
ＤＥＲＡ１６は、配列番号３２のヌクレオチド配列又は配列番号３３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８６】
ＤＥＲＡ１７は、配列番号３４のヌクレオチド配列又は配列番号３５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８７】
ＤＥＲＡ１８は、配列番号３６のヌクレオチド配列又は配列番号３７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８８】
ＤＥＲＡ１９は、配列番号３８のヌクレオチド配列又は配列番号３９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８９】
ＤＥＲＡ２０は、配列番号４０のヌクレオチド配列又は配列番号４１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９０】
ＤＥＲＡ２１は、配列番号４２のヌクレオチド配列又は配列番号４３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９１】
ＤＥＲＡ２２は、配列番号４４のヌクレオチド配列又は配列番号４５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９２】
ＤＥＲＡ２３は、配列番号４６のヌクレオチド配列又は配列番号４７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９３】
アルドラーゼは、本明細書中に記載されているアルドラーゼに対してその少なくとも約５０％、好ましくは、その少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアルドラーゼを含む。アミノ酸配列の同一性は、配列比較アルゴリズムを用いた分析によって、又は視覚的な調査によって決定される。一態様において、配列比較アルゴリズムは、設定を初期設定にしたＶｅｃｔｏｒＮＴＩ９．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ）のＡｌｉｇｎＸアルゴリズムを用いて作製される。
【００９４】
特に、本発明は、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下記に定義されている。）を、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００９５】
【化２２】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する方法を提供する。
【００９６】
好ましい実施形態において、アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０１若しくはＤＥＲＡ０２若しくはＤＥＲＡ０５若しくはＤＥＲＡ１２若しくはＤＥＲＡ１３又はこれらと少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するあらゆるアルドラーゼから選択され、又は別の実施形態において、アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０６若しくはＤＥＲＡ１７又はこれらと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するあらゆるアルドラーゼから好ましい実施形態において選択される。
【００９７】
化合物ＩＶは、スタチン（特に、ロスバスタチン）の合成におけるその後の使用において特に価値がある。
【００９８】
本明細書中に記載されているＤＥＲＡアルドラーゼは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ２００１」に記載されているような組換えイー・コリ中でのタンパク質発現のための標準的プロトコールなど（但し、これに限定されない。）本分野において公知のあらゆる手段によって調製することができる。クローニング条件によっては、公知のＤＥＲＡアルドラーゼの修飾された様式が必要であり得、又はもたらされ得、公知のＤＥＲＡアルドラーゼの修飾された様式は本発明によって包含される。
【００９９】
本明細書中に記載されているＤＥＲＡアルドラーゼは、あらゆる生物学的に活性な形態で使用することができる。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、生きた完全細胞触媒の形態で使用され得る。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、不活化された完全細胞触媒の形態で使用され得る。
【０１００】
一実施形態における完全細胞触媒は、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現するあらゆる微生物又は微生物の一部である。前記微生物は、生きた又は休止した又は不活化された完全細胞の形態であり得る。
【０１０１】
これらの形態には、細胞懸濁物、細胞菌糸、細胞ペースト及び細胞が意図的に、物理的に、化学的に又は生物学的に破壊されていない微生物培養物のあらゆる他の形態が含まれ得、これらの形態には、このような微生物又はその一部の、担体に支持された、固定化された又は接着された担体がさらに含まれ得る。前記微生物は、好ましくは、細菌及び酵母から選択される。好ましくは、細菌は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択され、より好ましくは、エシェリヒア・コリが使用される。酵母は、好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる属の群から選択される。
【０１０２】
一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、均質化された完全細胞触媒の形態で使用され得る。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、無細胞抽出物の形態で使用され得る。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、本分野において公知のあらゆる方法を用いて、精製された酵素の形態で使用され得る。別の実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、細胞外で発現されたタンパク質の形態で使用され得る。
【０１０３】
スタチン産生に関して有用な中間体を作製するために使用されるアルドラーゼの最適な活性を与えるために、基質及び反応条件を選択した。
【０１０４】
式ＩＩＩの化合物は、最適な反応条件での、式ＩＶの対応する化合物の産物安定性に従って選択される。特に、最高の安定性を有する産物を与えるアクセプター基質が反応のために好ましい。
【０１０５】
式ＩＩＩの化合物は、式ＶＩの対応する化合物（遮蔽されたアルデヒド基を有するこれらの産物は、スタチンの調製におけるさらなる工程を可能にするＷＯ２００７／０３９２８７Ａ１における中心的な中間体であり、特に、アルデヒド基を有する産物を与える基質が好ましい）に従っても選択される。
【０１０６】
式ＩＩＩの化合物は、特に、アセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）であり得る。
【０１０７】
一般に、アルドラーゼは適切な容器又は反応装置中に与えられ、式ＩＩＩの化合物及びアセトアルデヒドは、バッチ様式で又は継続的に添加される。
【０１０８】
具体的には、アルドラーゼは、場合によって塩（特に、５０から５００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ）の存在下で、（特に、０．１ｇ／Ｌから３０ｇ／Ｌまでの濃度範囲で）水溶液中に調製される。水溶液は、水と混和性の有機溶媒（特に、２から１５％Ｖ／Ｖの濃度のジメチルスルホキシド）を含有し得、ｐＨ４．５から９、好ましくは、ｐＨ５から９、より好ましくは、ｐＨ６から９になるように緩衝化され得る。
【０１０９】
適切な緩衝液は、酸、塩基、塩又はこれらの混合物及び一級、二級又は三級アミノ基を有するものを除く本分野で公知のあらゆる他の緩衝系から調製することができる。特に、１０から５００ｍＭの濃度のホスファート緩衝液を使用することができる。水溶液は、前記アルドラーゼを水に添加し、無機酸、塩基、塩又はこれらの混合物の自動化された添加を用いて、反応の間にｐＨを維持することによっても調製することができる。
【０１１０】
あるいは、場合によって、塩（特に、５０から５００ｍＭの濃度のＮａＣｌ）の存在下で、（特に、２０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ湿潤細胞重量の濃度範囲の、より具体的には、２０ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌ湿潤細胞重量の濃度範囲の）ＤＥＲＡ過剰発現細胞、特にＤＥＲＡ過剰発現イー・コリ細胞の水性懸濁物中で、アルドラーゼが調製される。水性懸濁液は、水と混和性の有機溶媒（特に、２から１５％Ｖ／Ｖの濃度範囲のジメチルスルホキシド）を含有し得、ｐＨ４．５から９、好ましくは、ｐＨ５から９、より好ましくは、ｐＨ６から９になるように緩衝化され得る。適切な緩衝液は、酸、塩基、塩又はこれらの混合物及び一級、二級又は三級アミノ基を有するものを除く本分野で公知のあらゆる他の緩衝系から調製することができる。特に、１０から５００ｍＭの濃度のホスファート緩衝液を使用することができる。水性懸濁液は、前記ＤＥＲＡ過剰発現細胞を水に添加し、無機酸、塩基、塩又はこれらの混合物の自動化された添加を用いて、反応の間にｐＨを維持することによっても調製することができる。
【０１１１】
方法の態様において、式ＩＩＩの化合物は、反応混合物へ連続的に添加され得、あるいは、式ＩＩＩの化合物は、１つのバッチ又はそれ以上のバッチ中の反応混合物に添加される。一態様において、混合物に添加される基質の総量は、添加される式ＩＩＩの化合物の総量が反応混合物の約２０ｍｍｏｌ／Ｌから反応混合物の約２ｍｏｌ／Ｌ、特に、反応混合物の約１００ｍｍｏｌ／Ｌから反応混合物の約１．５ｍｏｌ／Ｌ、より具体的には、反応混合物の約２００ｍｍｏｌ／Ｌから反応混合物の約７００ｍｏｌ／Ｌである。アセトアルデヒドは、幾つかの手段によって添加され得る。一態様において、アセトアルデヒドは、１つのバッチ若しくはそれ以上のバッチ中であるいは連続的に、反応混合物に添加される。アセトアルデヒドは、式ＩＩＩの化合物と予め混合され、反応混合物に添加され得る。反応混合物に添加されるアセトアルデヒドの総量は、約０．１から約４モル濃度当量からアクセプター基質（化合物ＩＩＩ）の総量まで、特に、約１から約３モル濃度当量、より好ましくは、約２から約２．５モル濃度当量である。特に、これは、所望でない産物、特に式ＸＩＩ及びＸＩＩＩの化合物の最小限の濃度を可能にするのに対して、式ＸＩＩの化合物は、アセトアルデヒドの一分子をＩＩＩの一分子と反応させることによって得られ、式ＸＩＩＩの化合物はアセトアルデヒドの三分子を反応させることによって得られる。
【０１１２】
【化２３】
【０１１３】
好ましい実施形態において、基質は、反応のあらゆる所定の時点で、特定の流速で、プログラム可能なポンプを用いて反応混合物に継続的に添加される。流速は、基質が反応混合物中に蓄積しない最大の流速として決定される。特に、これは、所望でない産物の最小濃度を可能にする。より具体的には、この産物は、式ＸＩＩ及びＸＩＩＩの化合物であり得る。別の実施形態において、基質の阻害的効果は、正しい添加戦略を用いてさらに最小化することができる。
【０１１４】
あるいは、アルドラーゼは、式ＩＩＩの化合物又はアセトアルデヒドの少なくとも１つを含有する反応混合物に添加され得る。反応混合物は、溶媒と及びアルドラーゼ又は式ＩＩＩの化合物又はアセトアルデヒドの少なくとも１つを含むものと理解される。
【０１１５】
一態様において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用されるｐＨは、約５から１０である。一実施形態において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用されるｐＨは、約５から約８である。具体的には、ｐＨは、５から７の範囲の適切な緩衝液によって維持される。
【０１１６】
アルドラーゼ縮合中間体（特に、第一の縮合反応産物）は緩衝液と化学的な反応を起こし得るので、一般的に使用される幾つかの緩衝液は、アルドラーゼ縮合中間体（特に、第一の縮合反応産物）の利用可能性を制約することによって、先述のアルドラーゼによって触媒される反応の収率を低下させ得る。本発明者らは、ビス−トリスプロパンが前記中間体と反応することを発見した。同様に反応し得る他の緩衝液は、ビス−トリス、トリシン、トリス、ビシン又は一級、二級若しくは三級アミノ基を有するあらゆる他の緩衝液である。従って、ｐＨ値を調整するための適切な緩衝液は、この調整が必要であれば、酸、塩基、塩又はこれらの混合物、特に、リン酸及び水酸化ナトリウムを用いて作製される。
【０１１７】
一態様において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用される温度は、約２０から約７０℃である。一実施形態において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用される温度は、約２５から約６０℃である。一実施形態において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用される温度は、約３０から約５０℃である。
【０１１８】
反応は２から３時間以内に完了まで進行するので、産業的に適切である。
【０１１９】
反応の完了後、アセトニトリルの少なくとも約１容量を反応混合物の１容量に添加することによって、酵素は反応混合物から除去される。あるいは、酵素は、本分野において公知のあらゆる沈殿法によって除去される。一実施形態において、沈殿は、少なくとも５％ｍ／Ｖの硫酸アンモニウムの添加によって行われる。あるいは、ＩＶは、本分野において公知の塩析法によって抽出される。特に、塩析は、アセトニトリルの少なくとも約１容量から反応混合物の１容量及びＮａＣｌの５％（ｍ／Ｖ）を添加することによって行われる。次いで、少なくとも４０℃まで混合物を冷却し、液相を分離させる。次いで、アセトニトリル相を蒸発させて、ＩＶの未精製産物を与える。あるいは、沈降技術、特に遠心を用いて、反応混合物から完全細胞触媒が除去される。別の態様において、完全細胞触媒は、ろ過技術、特に、微小ろ過によって除去され得る。
【０１２０】
本発明は、前記反応によって作製された純粋なラクトールを取得するための精製法も提供する。一態様において、アセトニトリルは、反応混合物から蒸発され、次いで、残存する水溶液が凍結乾燥される。別の態様において、沈降された沈殿溶液又は完全細胞触媒懸濁液の何れかの上清が凍結乾燥される。次いで、粉末化された残りがアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１中に懸濁される。不溶性の塩を除去するために、懸濁液をろ過し、移動相としてアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１を用いるシリカゲルカラムへろ液を搭載する。別の態様において、塩析抽出から得られるアセトニトリル相を蒸発させ、残りの油をアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１の最小容積中に溶解し、移動相としてアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１を用いるシリカゲルカラムに搭載する。
【０１２１】
特定の実施形態において、本発明は、使用されるアルドラーゼが（必要であれば、酸、塩基、塩又はこれらの混合物を用いて、特に、リン酸及び水酸化ナトリウムを用いて調整された）５から１０、特に５から８のｐＨ範囲の適切な溶媒（特に、水溶性有機溶媒と混合された水であり得る水性溶媒）中の、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２であり、反応が約３５から４０℃の温度で進行し、転化が１から６時間で終了する、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを形成するための、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合下でのＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯのアセトアルデヒドとの反応を提供する。
【０１２２】
一般に、使用されるアルドラーゼは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．」に記載されているタンパク質発現の方法によって調製される。アルドラーゼをコードする遺伝子は発現ベクター中にクローニングされ、酵素は適切な発現宿主中に発現される。
【０１２３】
反応収率は、反応混合物に添加された式ＩＩＩの化合物の総量に対して相対的に計算され、単離された産物のモルと反応混合物に添加された式ＩＩＩの化合物のモルとの間の比として測定される。
【０１２４】
本発明は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、下記に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含む、
式ＸＶの化合物
【０１２５】
【化２４】
（Ｒ４は、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法も提供する。好ましくは、Ｒ４は、アセタート、塩化物、水素であり、より好ましくは、Ｒ４はアセタートである。
【０１２６】
前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように実施される。従って、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。好ましくは、完全細胞触媒の形態の酵素は、上に定義されている２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。
【０１２７】
好ましくは、前記完全細胞触媒は、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する細菌及び酵母から選択される。細菌は、好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる属の群から選択され、より好ましくは、エシェリヒア・コリが使用される。酵母は、好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる属の群から好ましく選択される。
【０１２８】
本発明の特定の態様において、ロスバスタチンは、以下のスキームに開示されているように、本発明者らの式ＶＩの化合物から開始して、ＷＯ２００７／０３９２８７Ａ１に従って調製することができる。
【０１２９】
【化２５】
【０１３０】
ロスバスタチン又は他のスタチンを作製するために、式ＶＩの化合物は、（式ＶＩＩの化合物を介した）２つの工程で、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（保護された）−６−オキソ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルバルデヒドＶＩＩＩ又はその水和物ＶＩＩＩ’へ転換される。アルデヒドＶＩＩＩ又はその水和物ＶＩＩＩ’は、適切な試薬とのＷｉｔｔｉｇカップリングの条件下で反応させることができ、続いて、必要であれば、水素が添加される。
【０１３１】
適切な試薬は、以下の式の複素環式又は脂環式誘導体（スタチンの骨格）である。
【０１３２】
【化２６】
（Ａは、結合又はＯであり得、
並びにＲｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、
並びにＸが陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートであり；
並びにＨｅｔは、スタチンの複素環式又は脂環式骨格を形成するように選択される。）
他のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（好ましくは、セリバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチン、ダルバスタチンの中から選択される。）を同様に調製することができる。
【０１３３】
スタチンの複素環式又は脂環式骨格（Ｈｅｔ）は、特に、以下から選択される。
【０１３４】
【化２７】
【０１３５】
以下の実施例は、本発明の方法を例示するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１３６】
アセトキシアセトアルデヒド（ＩＩＩ）
１．工程
【０１３７】
【化２８】
トリエチルアミン（６７ｍＬ、４当量）中に、１，４−ジヒドロキシブト−２−エン（１０ｍＬ、０．１２ｍｏｌ、１当量）を溶解した。溶液を０℃まで冷却し、無水酢酸（Ｉ）（３４ｍＬ、３当量）を滴加した。得られた反応混合物を室温まで加温し、一晩撹拌した。
【０１３８】
１ＭＨ３ＰＯ４溶液（６０ｍＬ）で２回、ＮａＨＣＯ３１Ｍ溶液（６０ｍＬ）で２回、溶液を洗浄した。次いで、ＭｇＳＯ４で溶液を脱水させ、濃縮した。高真空ポンプを７０℃で使用して、ＡｃＯＨ及びＡｃ２Ｏの微量を除去した。
【０１３９】
淡黄色ないし暗色の液体として、純粋なＩＩを得た（２０．６ｇ、１００％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．６５（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｓ，６Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．２，１２７．６，５９．５，２０．２。
【０１４０】
２．工程
【０１４１】
【化２９】
１，４−ジアセトキシブト−２−エン（ＩＩ）（１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン（０．１７Ｍ）中に溶解した。酸素（又は乾燥空気）散布を作動させ（約１０Ｌ／ｈ）、溶液を−８０℃まで冷却した。−８０℃になったら、オゾン発生装置を作動させ、溶液が青色に変化するまで、オゾンを通気した。次いで、オゾン発生装置を停止させ、青色が消失するまで、酸素（又は乾燥空気）を通気した。アルゴンを１０分間通気した。散布を取り除き、−８０℃で、溶液をアルゴン下に保った。硫化メチル（１．８ｍＬ、２．５当量）を滴加し、反応を室温まで加温し、２０時間撹拌した。反応を濃縮して、１，４−アセトキシアセトアルデヒド（ＩＩＩ）及びＤＭＳＯの２：１混合物を得た。収率は定量的であると思われ、１，４−ジアセトキシブト−２−エンの微量は存在しなかった。さらなる精製なしに、産物を使用した。（ＩＩＩ）１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．５１（ｓ，１Ｈ），４．５９（ｓ，２Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．５８（ｓ，ＤＭＳＯ）。
【実施例２】
【０１４２】
アルドラーゼの調製
イー・コリＫ−１２株由来の単離されたゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ反応において、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ遺伝子ｄｅｏＣを増幅した。
ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣ及び
ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＴＡＣＣ
（それぞれ、配列番号４８及び４９を有する。）
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて産物を切断し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動上で分離し、精製した。同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて、発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎｅ ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を切断し、精製した。Ｔ４リガーゼ反応において、断片を集合させた。
【０１４３】
上記連結反応を用いて、形質転換受容性のエシェリヒア・コリＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを単離した。得られた構築物をｐＱＥ３０ＤｅｒａＣと表記し、遺伝子配列を確認するために配列決定した。ベクターｐＱＥ３０ＤｅｒａＣで形質転換受容性のエシェリヒア・コリＴＯＰ１０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を形質転換することによって、アルドラーゼ発現生物を調製した。この方法に対して使用した方法は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ」に記載されており、当業者に周知である。
【０１４４】
ＴＯＰ１０Ｆ’ＰＱＥ３０ＤｅｒａＣの３ｍＬ一晩培養物とともに、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）が補充されたＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（１５０ｍＬ、１２ｇ／Ｌバクト・トリプトン、２４ｇ／Ｌバクト酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、２．３１ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、１２．５４ｇ／ＬＫ２ＨＰＯ４）に接種した。ＯＤ６００が約０．８に到達するまで、細胞を増殖させた（３７℃、２５０ｒｐｍ）。ＩＰＴＧ（１ｍＭ最終濃度）を用いてタンパク質発現を誘導し、さらに４時間、同じ増殖条件中に細胞を放置した。遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって、細胞沈降物を採集した。上清を除去し、緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ）の同じ容量によって交換した。沈降物を再懸濁し、遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって再度集めた。上清を除去し、使用前に、細胞を−２０℃で保存した。ＤＥＲＡ０１を有する完全細胞触媒をこのようにして得た。
【０１４５】
あるいは、溶解緩衝液１Ｌ当り沈降物２００ｇを用いて、溶解緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＤＴＴ）中に沈降物を再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎデジタル音波処理装置を用いて、細胞を音波処理し（３×１５秒）、沈降（１０分、２０，０００ｇ、４℃）によって、細胞破片を除去した。ＤＥＲＡ０１の透明な水溶液をこのようにして得た。
【実施例３】
【０１４６】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１４７】
【化３０】
ＤＥＲＡ０１の溶液６００ｍＬ、反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、水中）２００ｍＬ、アセトアルデヒド（反応緩衝液中１．０５Ｍ溶液）の溶液１００ｍＬ及びＩＩＩ’の１００ｍＬ（反応緩衝液中の５００ｍＭ溶液）を撹拌された反応容器中で混合し、反応混合物１Ｌを得た。ＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いて、混合物のｐＨ値を７．０に補正した。３７℃に設定された温度制御された槽中で、混合物を３時間温置した。ＳｙｎｅｒｇｙＦｕｓｉｏｎ、２５０×４．６ｍｍ、４μｍカラムを使用して、ＥＳＩイオン化を備えた三連四重極ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ／ＭＳシステム上でのＬＣ−ＭＳ分析を用いて、反応の間、ＩＶの産生をモニターした。クロマトグラフィー条件は、以下のとおりであった。Ｔカラム＝５０℃、流速：１．５ｍＬ／分、Ｖｉｎｊ＝５０μＬ。移動相を以下のように使用した。
Ａ：水中の０．１％（ｍ／ｖ）ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ、ｐＨ６．５
Ｂ：ＭｉｌｌｉＱ水
Ｃ：アセトニトリル
線形勾配：
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
保持時間＝７．７±０．５分及び２０８の質量（Ｍ＋ＮＨ４＋に相当）を有するピーク面積の増大が反応の間に観察されたが、反応緩衝液で置換された反応混合物の一成分をそれぞれ有する対照の何れにもピーク面積の増大は観察されなかった。
【０１５０】
アセトニトリル４Ｌ及びＮａＣｌ５０ｇの添加を用いて、反応を停止させた。懸濁液を０℃まで冷却し、遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって、液相を分離した。上方の相を取り出し、減圧下で蒸発させて、痰黄色の油（未精製産物）８．４ｇを得た。シリカゲルカラム（移動相：アセトニトリル／ジイソプロピルエーテル＝１／１）上で未精製産物を精製した。その後、減圧下で溶液を蒸発させて、産物ＩＶ２．４ｇを得た。（ＩＶ）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．３９（ｄ，１Ｈ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０４−１．６０（ｍ，４Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．８，９１．７，６８．１，６６．８，６３．３，３３．９，２０．７
【実施例４】
【０１５１】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１５２】
【化３１】
【０１５３】
反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、水中）７５０ｍＬ中に、ＤＥＲＡ０１を有する完全細胞触媒（３００ｇ）を懸濁し、３７℃に設定した制御された温度で、撹拌された容器中において温置した。較正された蠕動式ポンプを用いて、２時間の反応時間の間に、基質溶液（６３０ｍＭアセトアルデヒド（ＩＩＩ）、反応緩衝液中の３００ｍＭ溶液）７５０ｍＬを添加した。ＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いて、ｐＨを７．０に調節した。反応をさらに３０分間継続し、次いで、遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって、完全細胞触媒を沈降させた。次いで、上清を凍結乾燥して淡黄色結晶（未精製産物）１９．４ｇを得た。シリカゲルカラム（移動相：アセトニトリル／ジイソプロピルエーテル＝１／１）上で未精製産物を精製した。その後、溶液を減圧下で蒸発させて、産物ＩＶ７．４ｇを得た。（ＩＶ）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．３９（ｄ，１Ｈ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０４−１．６０（ｍ，４Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．８，９１．７，６８．１，６６．８，６３．３，３３．９，２０．７。
【０１５４】
反応の間、ＬＣ−ＭＳ分析を用いて、ＩＶの産生をモニターした。反応の間、２０８の質量を有するピーク面積（Ｍ＋ＮＨ４＋に相当）の増大が観察され、ＬＣ−ＭＳを用いた２．５時間後の反応混合物の定量分析によって、ＩＶの１３．１ｇ／Ｌの存在が示された。
【実施例５】
【０１５５】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１５６】
【化３２】
【０１５７】
反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、水中）６ｍＬ中に、ＤＥＲＡ０２を有する完全細胞触媒（３ｇ）を懸濁した。アセトアルデヒド（反応緩衝液中の２．１Ｍ溶液）の溶液２ｍＬ及びＩＩＩ（反応緩衝液中の１Ｍ溶液）の２ｍＬを反応管中に混合して、反応混合物１０ｍＬを得た。ＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いて、混合物のｐＨ値を７．０に補正した。３７℃に設定された温度制御された槽中で、混合物を３時間温置した。反応の間、ＬＣ−ＭＳ分析を用いて、ＩＶの産生をモニターした。２０８の質量（Ｍ＋ＮＨ４＋に相当）を有するピーク面積の増大が反応の間に観察されたが、反応緩衝液で置換された反応混合物の一成分をそれぞれ有する対照の何れにもピーク面積の増大は観察されず、ＬＣ−ＭＳを用いた１時間後における反応混合物の定量分析は、ＩＶの８．７ｇ／Ｌの存在を示した。
【実施例６】
【０１５８】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１５９】
【化３３】
【０１６０】
反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）１０７０ｍＬ中に、ＩＩＩの５６．６ｇ（９２％）を希釈した。ＮａＨＣＯ３塩を用いて、この溶液のｐＨ値を６．２になるように調整した。ＤＥＲＡ０１を有する完全細胞触媒（７００ｇ／Ｌ）５１０ｍＬを前溶液に添加し、ＮａＨＣＯ３塩を用いて、ｐＨ値を６．２になるように再度補正した。３７℃及び一定の撹拌の８００ｒｐｍに設定された、温度制御された２Ｌバイオリアクター内で、混合物を３時間温置した。下表に記載されている３時間の時間枠で、プログラム可能なポンプを用いて、反応緩衝液中に希釈されたアセトアルデヒド（４５．４ｇ）１２０ｍＬを反応混合物に継続的に添加した。
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
反応の間、ｐＨは補正されず、５．５の最終値までゆっくり推移した。５．１７分（化合物ＩＩＩ）、１４．０４分（化合物ＸＩＩ）、１４．４４分化合物（化合物ＸＩＩＩ）及び２０．３５分（化合物ＩＶ）での保持時間をモニタリングすることによって、ＧＣ分析（クロマトグラフィーカラム：ＤＢ−１ １００％ジメチルポリシロキサン；温度プログラム：初期温度５０℃、初期時間：５分、温度速度１０℃／分、最終温度：２１５℃、最終時間：１０分；注入装置：スプリット／スプリットレス注入装置、担体気体：ヘリウム、初期流速：１０ｍＬ／分；検出装置：炎イオン化検出装置、検出装置温度：２３０℃；クロマトグラフィー溶液：ＩＶの１から５ｍｇ／ｍＬアセトニトリル）を用いて、ＩＶの産生をモニターした。反応プロファイルは、図１に示されている。
【０１６３】
ＧＣを用いた３時間後における反応混合物の定量分析は、６７．７％モル濃度収率で、ＩＶの３５．３ｇ／Ｌを示した。実施例６に記載されている物質に由来するさらなる合成工程中の化合物の鏡像異性体純度の分析は、９９．８％又はそれ以上の鏡像異性体過剰を示し、これは、この物質の極めて高い鏡像異性体純度を示唆する。実施例６に記載されている物質に由来するさらなる合成工程中の化合物のジアステレオマー異性体純度の分析は、９８％又はそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を示し、これも、ＩＶの極めて高いジアステレオマー異性体純度を示唆する。
【実施例７】
【０１６４】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（Ｖ）
【０１６５】
【化３４】
【０１６６】
水中の（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）（１当量）の溶液を０℃まで冷却した。炭酸バリウム（１．４当量）を添加した後、Ｂｒ２（１．２当量）を滴加し、反応を室温で一晩撹拌した。溶液をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃを用いて４回抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを用いた精製（ヘキサン／アセトン＝７５／２５から５５／４５）によって、（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（Ｖ）を得た。
【０１６７】
（Ｖ）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）δ４．８８（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｈｅｘ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），２．６８（ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．５ＨＺ，１Ｈ），２．５１（ｄｄｄｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ，１Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）δ１７０．８，１６９．７，７４．２，６６．５，６２．７，３９．１，３２．３，２０．６。
【実施例８】
【０１６８】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）
【０１６９】
【化３５】
【０１７０】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピランー２−イル）メチルアセタート（Ｖ）（１．８８ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を無水ＤＭＦ（２ｍＬ、１Ｍ）中に溶解した。イミダゾール（０．８８ｇ、１．３当量）及びＴＢＤＭＳＣＩ（１．６６ｇ、１．１当量）を連続して添加し、反応が完了するまで、反応を撹拌した。水（２０ｍＬ）とエーテル（２０ｍＬ）の間に、反応混合物を分配した。エーテル（２０ｍＬ）で１回、水相を抽出した。水（１０ｍＬ）の少量、ＨＣｌ１Ｎ（２０ｍＬ）及び塩水（２０ｍＬ）で、合わせた有機相を２回洗浄した。溶液をＭｇＳＯ４で脱水させ、濃縮して、定量的収率で、（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）を得た。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．９３（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），１．８４−１．８０（ｍ，２Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．０９（２ｓ，６Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．４，１６９．１，７３．３，６５．５，６３．０，３８．９，３２．２，２０．５，１７．７，−５．１，−５．２。
【実施例９】
【０１７１】
酵素反応を介した（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）の（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）への転化
【０１７２】
【化３６】
【０１７３】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）（５０ｇ、８０％純度；１３２．４ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液（Ｐ．Ｂ．Ｓ）、ｐＨ＝５．２０（１．５Ｌ）に添加し、３７℃まで溶液を加温した。次いで、パンクレアチン粉末（０．５当量質量；２０ｇ）を滴加した（６回、８ｇ＋３×４ｇ）。平行して、ｐＨをモニターし、ｐＨを４．８５と４．９５の間に維持するために、１時間ごとに、ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｍ）を添加することによってｐＨを制御した。酵素の最初の添加後９時間、反応を撹拌した。
【０１７４】
ｃｅｌｉｔｅ（Ｒ）を未精製混合物に添加した。ｃｅｌｉｔｅ（Ｒ）を通して、溶液をろ別した。淡黄色の液体を回収した。ＥｔＯＡｃの１．５Ｌを用いて、フィルター上の固体を洗浄した。ろ液を５分間撹拌した。２つの層を分離した。ＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）を用いて、水相を１回再抽出した。４０℃で減圧下において、合わせた有機相を部分的に蒸発させ、メチルシクロヘキサンから産物を再結晶させて、（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）の８２％を白色結晶として得た。反応の転化はほぼ定量的であり（＞９８％）、鏡像異性体は０．１％未満であった。
【０１７５】
スプリット／スプリットレス注入装置及びＦＩＤ検出装置を有するＢｅｔａｄｅｘ１２０カラム上で、ＤＣＭ溶液（２から３ｍｇ／ｍＬ）を用いて鏡像異性体を測定するためのＧＣ分析を行った。
【０１７６】
化合物ＶＩＩのＮＭＲ分析は、検出限界での高スキャン蓄積を用いた場合でさえ、ジアステレオマー異性体が存在しないことを示し、ＶＩＩ中のジアステレオマー異性体のレベルが１％を下回ることを示唆している。
【実施例１０】
【０１７７】
化学的反応を介した（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）の（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）への転化
【０１７８】
【化３７】
【０１７９】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）（０．６２５ｇ、８０％純度、１．６５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８ｍＬ）及びＭｅＯＨ（８ｍＬ）中に溶解した。スズ触媒（ｔＢｕ２ＳｎＣｌＯＨ）２（９４ｍｇ、０．１当量）を添加し、反応を一晩撹拌した。反応を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純粋な（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）（１２６ｍｇ、３０％）を得た。ＶＩＩは鏡像異性体の０．１％未満を含有することが明らかとなった。
【０１８０】
スプリット／スプリットレス注入装置及びＦＩＤ検出装置を有するＢｅｔａｄｅｘ１２０カラム上で、ＤＣＭ溶液（２から３ｍｇ／ｍＬ）を用いて鏡像異性体を測定するためのＧＣ分析を行った。
【０１８１】
化合物ＶＩＩのＮＭＲ分析は、検出限界での高スキャン蓄積を用いた場合でさえ、ジアステレオマー異性体が存在しないことを示し、ＶＩＩ中のジアステレオマー異性体のレベルが１％を下回ることを示唆している。
【０１８２】
酵素的反応を介した及び化学的反応を介した化合物ＶＩＩへの化合物ＶＩの転化は、望ましくない鏡像異性体が０．１％未満である優れた鏡像異性体純度を有する産物を与え、２つの方法によって調製された化合物ＶＩＩの鏡像異性体純度には、差は観察されなかった。また、調製された化合物ＶＩＩのジアステレオマー異性体純度は高く、望ましくないジアステレオマー異性体は１％未満であった。従って、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体の過剰は、より初期の合成工程に（例えば、アルドラーゼによって触媒される化合物ＩＩＩの化合物ＩＶへの転化に）起因する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラート及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、上記化合物が中間体として使用される、スタチン（特に、ロスバスタチン）及びその誘導体の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラートは、スタチンの合成において中間体となり得る。スタチン（その代表例は、ロスバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチン、ダルバスタチン若しくはこれらの類縁体又はプラバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン若しくはこれらの類縁体から選択され得る。）は、それぞれ、芳香族又は脂環式の殻に接続されたヘプテン酸又はヘプタン酸部分（遊離の酸、塩又はラクトン）によって規定される特徴的構造を共有する。スタチンの生物活性は、その立体化学、特に、前記ヘプテン酸又はヘプタン酸部分のキラル原子における立体配置と密接に関連する。
【０００３】
ＷＯ２００６／１３４４８２には、アトルバスタチンを形成するための方法中に、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって触媒されるアルドール付加工程が含まれる。
【０００４】
日本国特許２００５２２９８５８は、ＤＥＲＡの存在下で、ベンジルオキシアセトアルデヒドをアセトアルデヒドと反応させる、（（４Ｒ，６Ｓ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２−ピロンを作製するための方法を開示する。酵素触媒の反応時間は、１２時間であった。
【０００５】
ＷＯ０５／１１８７９４は、ＤＥＲＡ酵素の改善を取り扱っている。極めて多様な置換基を有する２，４−ジデオキシヘキソース又は２，４，６−トリデオキシヘキソースを調製するために、単離された変異体酵素が使用され得る。
【０００６】
ＤＥＲＡ変異体は、立体特異的なアルドール反応を触媒することが記載された（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２００４，４５，２４３９−２４４１）。ＤＥＲＡ変異体は触媒活性の相対的改善を示し、従って、野生型ＤＥＲＡと比較して収率を改善した。酵素触媒の反応時間は６日であった。この酵素触媒から得られた１つの産物は、アトルバスタチンの合成に関して提案された。
【０００７】
立体特異的アルドール反応を触媒するためのＤＥＲＡは、「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００４， １０１（１６） ５７８８−５７９３」中にさらに記載されており、酵素プロセスの改善された容積生産性を示した。使用される基質の酵素活性に対する阻害的効果も記載されている。酵素触媒の反応時間は３時間であった。この酵素的触媒から得られた産物は、アトルバスタチン又はロスバスタチンの合成に関して提案された。
【０００８】
２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）によって触媒される３つのアルデヒド基質との立体特異的アルドール反応は、全ての置換されたアセトアルデヒドをＤＥＲＡに対する基質として等しく受容するわけではなく（Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ；１１７，２９，（１９９５）ｐｐ７５８５）、ある種の基質は、ＤＥＲＡ活性に対して阻害的効果を示す。酵素的触媒の反応時間は６日であった。
【０００９】
ＷＯ２００７／０３９２８７Ａ１では、ヨードラクトン合成を介したラクトン化されたスタチン側鎖中間体ＶＩの合成が記載されており、これには、６つの有機合成工程が必要とされる。この複数工程の合成において、４番目の工程は、ヨードラクトン中間体産物の立体化学を規定するラクトン形成工程である。このラクトン形成工程は、相対的に低い立体選択性を与えるに過ぎない。Ｉ化合物、Ａｇ化合物、グリニャール試薬及び鏡像異性体的に純粋な出発化合物のような化学量論的量で使用される幾つかの試薬は、極めて高価である。（以下に示されている）有機合成の６つの工程は、１９％の総収率を得られた。
【００１０】
【化１】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００６／１３４４８２号
【特許文献２】特許第２００５２２９８５８号明細書
【特許文献３】国際公開第０５／１１８７９４号
【特許文献４】国際公開第２００７／０３９２８７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、４５、２００４年、ｐｐ．２４３９−２４４１
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１（１６）、２００４年、ｐｐ．５７８８−５７９３
【非特許文献３】Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ、１１７，２９、１９９５年、ｐｐ．７５８５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、スタチンを効果的に作製するための構築ブロックとして中間体化合物及び方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的は、少数の合成段階を必要とし、相対的に短い反応時間を示し、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰に関して高い立体化学的純度を有する産物の高総収率をもたらす方法により、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラートを提供することによって解決される。本発明のさらなる課題は、安価な出発材料と単純な装置を用いて上記カルボキシラートを作製することである。
【００１５】
本発明の一態様は、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下記に定義されているとおりである。）を、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００１６】
【化２】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する方法である。連続的アルドール反応を触媒する酵素を好ましく使用することによって、ＩＶに到達するための反応工程の数は低減させることができる。
【００１７】
好ましくは、基質は、式ＩＩＩの化合物（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである。）から選択される。このような適切な酵素基質の選択によって、大幅に短縮された反応時間が可能となり、反応の顕著に改善された立体選択性が提供される。酵素反応は水性溶媒中で実施されるので、基質の適切な選択によって、基質を制御することがさらに可能となる。さらに、ＩＶのエステル部分は、好ましくは水によって切断されないように選択される。従って、より好ましくは、Ｒ１＝ＣＨ３である。特に、適切な酵素基質は、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式ＩＶの化合物を提供するために好ましく選択される。その後、産物の精製及び単離がより容易であり、従って、収率がより高くなるので、高い鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰は著しく有利である。
【００１８】
酵素は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４．）であることが好ましい。より広い基質特異性を有する酵素を見出すために、ＤＥＲＡ酵素の異なる種類をスクリーニングすることが有用であり得る。さらに、ＤＥＲＡ酵素は、特異的基質に対して特別に加工され得る。これらの理由のため、異なる変異体ＤＥＲＡ酵素を検査し得る。より具体的には、前記アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２、ＤＥＲＡ０３、ＤＥＲＡ０４、ＤＥＲＡ０５、ＤＥＲＡ０６、ＤＥＲＡ０７、ＤＥＲＡ０８、ＤＥＲＡ０９、ＤＥＲＡ１０、ＤＥＲＡ１１、ＤＥＲＡ１２、ＤＥＲＡ１３、ＤＥＲＡ１４、ＤＥＲＡ１５、ＤＥＲＡ１６、ＤＥＲＡ１７、ＤＥＲＡ１８、ＤＥＲＡ１９、ＤＥＲＡ２０、ＤＥＲＡ２１、ＤＥＲＡ２２及びＤＥＲＡ２３又は前記アルドラーゼの何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアルドラーゼからなる群から選択される。より具体的には、前記アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２、ＤＥＲＡ０５、ＤＥＲＡ１２及びＤＥＲＡ１３からなる群から選択され、特に、前記アルドラーゼは配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、又は前記アルドラーゼは、配列番号２７のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯを接触させる前記工程は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び前記式ＩＩＩのアルデヒドを接触させることによって達成される。前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように行われる。この実施形態によれば、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。酵素調製及び産物の精製における数個の工程が省略されるので、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物を使用する可能性は、「Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ２００４， １０１ （１６） ５７８８−５７９３」に記載されている方法と比べて、より低い製造コストをさらに可能にする。また、細胞環境の安定化効果は、他の酵素調製物と比べて、酵素活性に対する影響をより低く抑えながら、より高い基質濃度を使用することを可能にする。これによって、より低い酵素負荷量で、より高い容積生産性が可能となり、これは、製造コストを著しく低下させる。驚くべきことに、アルドラーゼを過剰発現する生物を完全細胞触媒として使用することによって、式ＩＶの化合物の高い鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰が保持される。
【００２０】
本発明の別の態様は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００２１】
【化３】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）を調製する方法である。前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように行われる。本発明のこの実施形態によれば、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。好ましくは、完全細胞触媒の形態の酵素は、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。
【００２２】
本発明の別の態様は、アルドール縮合を触媒する酵素とアセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含み、前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、式ＩＶの化合物
【００２３】
【化４】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）を調製する方法である。
【００２４】
本発明の別の態様は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、上に定義されている。）を接触させる工程を含む、式ＸＶの化合物
【００２５】
【化５】
（Ｒ４＝ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法である。前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように実施される。本発明のこの態様によれば、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。
【００２６】
好ましくは、完全細胞触媒の形態の酵素は２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。
【００２７】
本発明の別の態様は、アルドール縮合を触媒する酵素とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、下に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含み、前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、式ＸＶの化合物
【００２８】
【化６】
（Ｒ４は、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法である。
【００２９】
酵素調製及び産物の精製における幾つかの工程が省略されるので、完全細胞触媒の形態で酵素が使用されると、著しくより低いプロセスコストが達成される。また、細胞環境の安定化効果によって、他の酵素調製物と比べて、酵素活性に対する影響をより低く抑えながら、より高い基質を使用することが可能となる。さらに、完全細胞触媒の形態で酵素を使用すると、高い鏡像異性体及びジアステレオマー異性体過剰が得られる。
【００３０】
本発明の方法の態様は、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合に対するｐＨが４．５から１０、好ましくは５から１０の範囲に維持され、特に、５から８、好ましくは５から７のｐＨ範囲の緩衝液を用いてｐＨが維持される反応条件で効果的に実施することができる。適切なｐＨ値は、より短い反応時間をもたらす。別の態様において、適切なｐＨは、基質及び／又は産物の分解を低下させる。緩衝液は、ｐＨ値を一定のレベルに調整することを可能にし、これは、ｐＨ値に関して一定した反応条件に寄与する。この目的のために、緩衝液は、好ましくは、ホスファート緩衝液である。あるいは、ｐＨ制御されたポンプの補助を得て、酸又はアルカリの自動化された添加によって、正確なｐＨの調節を達成することができる。
【００３１】
本発明の別の態様は、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯを接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）を形成させるために、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件下で、式ＩＩＩの基質Ｒ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）をアセトアルデヒドと反応させるための、アルドラーゼの使用である。特に、前記アルドラーゼは、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼである。さらに具体的には、アルドラーゼは、上に記載されているＤＥＲＡ０１からＤＥＲＡ２３からなる群から選択される。特に、前記アルドラーゼは、生きた完全細胞内に含まれ、又は不活化された完全細胞内に含まれ、又は均質化された完全細胞内に含まれ、又は無細胞抽出物内に含まれ、又は精製された酵素であり、又は固定化されており、細胞外に発現されたタンパク質の形態である。
【００３２】
本発明の別の態様は、酸化により、式ＩＶの化合物を式Ｖの化合物へ転化する工程を含む、式Ｖの化合物
【００３３】
【化７】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する方法である。酸化のための反応試薬は、安価であり、及び高い収率を与えるべきである。従って、好ましくは、酸化は、Ｂｒ２及びＢａＣＯ３を用いて行われる。
【００３４】
特に、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式Ｖの化合物が提供される。
【００３５】
本発明の別の態様は、
ａ）式ＩＩの化合物Ｒ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ２ＣＲ２（Ｒ２は、下に定義されている。）
【００３６】
【化８】
を溶媒と及びオゾンと接触させる工程、及び
ｂ）工程ａ）から得られたオゾニドを加水分解する工程、
を含む、式ＩＩＩ’のアルデヒドＲ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ２は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである（ｎ−プロピル、シクロヘキシル、フェニル、モルホリン、ピロリジン及びイミダゾールを除く。）を作製する方法。
【００３７】
オゾン分解は、高い収率での前記アルデヒドの安価な作製を与える。特に、２つの所望される産物が加水分解後に得られるので、（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）位に、Ｈの他に２つの同じ置換基を有する（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）−アルケンは、高い分子的経済性を与えるが、（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）位に、Ｈの他に２つの異なる置換基を有する（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）−アルケンの転化は、１つの所望の産物及び１つの廃棄産物を与える。特に、工程ａ）の溶媒はジクロロメタンである。好ましくは、Ｒ２は、ｎ−プロピル、シクロヘキシルを除くＣ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである。より好ましくは、Ｒ２は、ＣＨ３である。−５０から−９０℃範囲の、より好ましくは、約−８０℃の温度で、工程ａ）を実施することが好ましい。さらに、工程ａ）の得られたオゾニドを硫化メチルと接触させることによって、工程ｂ）を実施することが好ましい。特に、工程ｂ）は、−８０℃と室温の間に含まれる温度で実施される。
【００３８】
式ＩＩの化合物は、（Ｚ）−及び／又は（Ｅ）−ブト−２−エン−１，４−ジオールを式Ｉの無水物Ｒ２ＣＯ２ＣＯＲ２（Ｒ２は、上で定義されている。）を、実施例１の工程１に又は従来技術の合成に記載されているように（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９５６， ２１， ３２８−３３１）反応させることによって得られる。
【００３９】
本発明の別の態様は、式ＩＶ又はＶの化合物
【００４０】
【化９】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
である。Ｒ１が、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシであり、特に、Ｒ１がＣＨ３である式ＩＶ又はＶの化合物が好ましい。
【００４１】
本発明のさらに別の態様は、
ａ）式ＶＩの化合物
【００４２】
【化１０】
を得るために、保護基Ｒ３（Ｒ３は、独立に置換された又は置換されていない、シリル、ベンジル、アルキル及びアセチルから好ましく選択される保護基であり、より好ましくは、Ｒ３は、場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８トリアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８ジアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８アルキルジアリールシリル（アルキルは、同一又は別異であり得る。）から選択され、より好ましくは、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。）によって、４位の水酸基において、式Ｖの化合物
【００４３】
【化１１】
（Ｒ１＝それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキル。）
を保護する工程、
ｂ）スタチン又は医薬として許容されるその誘導体を作製するのに十分な条件下で、式ＶＩの前記化合物を反応させる工程、
を含む、スタチン又はその誘導体を作製する方法である。
【００４４】
特に、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式ＶＩの化合物が提供される。
【００４５】
スタチン又はその誘導体を作製するための方法において、工程ｂ）の条件はアルデヒドへのＶＩの転化によって、及びスタチン又はその誘導体を与えるための適切なホスホニウム塩又は他のリン誘導体とのＷｉｔｔｉｇカップリングによって設定されることが好ましい。さらにより好ましくは、Ｗｉｔｔｉｇカップリング工程は、以下の工程を含む。
ｂ１）式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る工程、
ｂ２）式Ｘの化合物
【００４６】
【化１２】
を得るために、式ＩＸを有するホスホニウム塩
【００４７】
【化１３】
（Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、並びにＸは陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートである。）
を得る工程、
ｂ３）続いて、化合物Ｘをロスバスタチン又はその塩へ転化する工程。
【００４８】
式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る前記工程ｂ１）は、式ＶＩＩの化合物
【００４９】
【化１４】
（Ｒ３は、上に定義されている。）
を通じて実施される。
【００５０】
特に、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する式ＶＩＩの化合物が提供される。
【００５１】
本発明のさらに別の態様は、
ａ）アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、上に定義されている。）のアルデヒドを、アルドール縮合を職倍する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００５２】
【化１５】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する工程、
ｂ）酸化によって、式ＩＶの前記化合物を式Ｖの化合物
【００５３】
【化１６】
（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）
へ転化する工程、
ｃ）式ＶＩの化合物
【００５４】
【化１７】
を得るために、保護基Ｒ３（Ｒ３は、独立に置換された又は置換されていない、シリル、ベンジル、アルキル及びアセチルから好ましく選択される保護基であり、より好ましくは、Ｒ３は、場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８トリアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８ジアルキルアリールシリル、Ｃ１−Ｃ８アルキルジアリールシリル（アルキルは、同一又は別異であり得る。）から選択され、より好ましくは、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。）によって、４位の水酸基において、式Ｖの前記化合物を保護する工程、
ｄ）スタチン又は医薬として許容されるその誘導体を作製するのに十分な条件下で、式ＶＩの前記化合物を反応させる工程、
を含み、
工程ｄ）の条件が、アルデヒドへのＶＩの転化によって、及びスタチン又はその誘導体を得るために、適切なホスホニウム塩又は他のリン化合物とのＷｉｔｔｉｇカップリングによって設定され、好ましくは、Ｗｉｔｔｉｇカップリング工程が、
ｂ１）式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る工程、
ｂ２）式Ｘの化合物
【００５５】
【化１８】
を得るために、式ＩＸを有するホスホニウム塩
【００５６】
【化１９】
（Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、
並びにＸは陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートである。）
を得る工程、
ｂ３）その後、化合物Ｘをロスバスタチン又はその塩へ転化する工程、
を含む、
スタチン又はその誘導体を作製する方法である。
【００５７】
以下では、添付の図面を参照しながら、好ましい実施形態及び実施例によって本発明の方法がより詳しく記載されているが、これらの実施形態、実施例及び図面は、例示の目的で提示されているに過ぎず、いかなる意味においても本発明を限定するものではないことに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】実施例６に係る酵素的反応の反応プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、化学的には以下の一般式の（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルカルボキシラートである式ＩＶの化合物を提供する。
【００６０】
【化２０】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
【００６１】
特に、Ｒ１がそれぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである場合、とりわけ、Ｒ１がＣＨ３である場合の式ＩＶの化合物の特徴は、所望の立体化学を有しており、以降の中間体をその後分離することが回避される点に存する。従って、中間体化合物ＩＶの提供は、可能な連続的選択的酸化工程又は適切な機能的修飾（例えば、６位の水酸基の最初の酸化工程、場合によって行われる、４位の水酸基の第二の酸化工程、及びこれに加えて又はこれに代えて、Ｒ１アシル残基の切断後のメトキシ基での第三の酸化工程を含む。）を可能とする。
【００６２】
本発明は、以下のスキームに示されているように、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合反応において、対応するラクトールＩＶを形成するために、置換されたアセトアルデヒドＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（式ＩＩＩ）の化合物及びアセトアルデヒドを使用する酵素的プロセスを提供する。
【００６３】
【化２１】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルから選択される。）本発明の構造ＩＶは、２及び４位において、厳格に確定された立体異性を有するのに対して、他のキラル中心は両方の可能性で存在し得、エピマーの混合物を形成する。
【００６４】
本明細書において使用される「アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件」という用語は、本明細書に記載されているように、アルドラーゼによって触媒されることができる本分野において公知のあらゆるアルドール縮合条件を表す。特に、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件は、所望の産物の形成及び蓄積を可能とするような条件である。これらの条件には、一態様において、アルドラーゼが連続的縮合の実行を可能とするのに十分な量で提供される活性酵素である条件、別の態様において、アルドラーゼの活性の最小的阻害を示す量で、基質及びアセトアルデヒドが反応中に存在する条件、別の態様において、温度、ｐＨ、溶媒組成、撹拌及び反応の長さが所望の産物の蓄積を可能とする条件、別の態様において、前記条件が産物の安定性に対して有害な効果を持たない条件が含まれる。具体的には、これらの条件は、実施例に開示されている値によって規定される。
【００６５】
式ＩＩＩの上記化合物に対するアルドラーゼ活性は、指定された酵素が単離及び／又は精製され、又は固定化され又は細胞内に存在し、又は不活化された完全細胞内に含まれ、又は均質化された細胞物質中に含まれ、又は式ＩＩＩの化合物及びアセトアルデヒドの上記反応を触媒して、ＩＶに到達する無細胞抽出物中にあることを意味する。
【００６６】
本明細書において使用される「スタチン（特に、ロスバスタチン）又は医薬として許容されるその塩を産生するのに十分な条件」という用語は、所望のスタチン化合物を得るために本分野において記載されている手段（本明細書に記載されている手段を含む。）を表す。
【００６７】
本明細書において使用される「アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する生物」という用語は、強力なプロモーターの調節下でアルドラーゼ発現を有し、及びアルドラーゼが（野生型発現対照と比べて）高いレベルで発現されており、及び細胞内又は細胞外に蓄積されているあらゆる生物を表す。このような生物を作製する方法は、当業者に周知である。
【００６８】
本発明において使用するためのアルドラーゼは、式ＩＩＩの上記化合物に対してアルドラーゼ活性を有するあらゆる化合物であり得る。本発明の一実施形態において、アルドラーゼは、２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ）である。適切なＤＥＲＡ−アルドラーゼの例には、配列表に記載されているそれらのヌクレオチド配列又はそれぞれのコドン最適化されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列によって特定される、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２、ＤＥＲＡ０３、ＤＥＲＡ０４、ＤＥＲＡ０５、ＤＥＲＡ０６、ＤＥＲＡ０７、ＤＥＲＡ０８、ＤＥＲＡ０９、ＤＥＲＡ１０、ＤＥＲＡ１１、ＤＥＲＡ１２、ＤＥＲＡ１３、ＤＥＲＡ１４、ＤＥＲＡ１５、ＤＥＲＡ１６、ＤＥＲＡ１７、ＤＥＲＡ１８、ＤＥＲＡ１９、ＤＥＲＡ２０、ＤＥＲＡ２１，ＤＥＲＡ２２及びＤＥＲＡ２３が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
一般に、本分野において公知のＤＥＲＡアルドラーゼの何れもが、上に列記されているＤＥＲＡアルドラーゼに対する配列同一性とは無関係に、反応のために使用され得る。本発明は、３０．１％に過ぎない同一性を有する２つの異なるアルドラーゼを用いて、前記反応を首尾よく実施する例を提供する。しかしながら、反応の収率は、各アルドラーゼの基質特異性及び各アルドラーゼに対する基質の阻害的効果に依存し得る。
【００７０】
ＤＥＲＡ０１は、配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。ＤＥＲＡ０１（イー・コリ）は、カタログ番号９１２５２で、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡから市販されている。
【００７１】
ＤＥＲＡ０２は、配列番号３若しくは４のヌクレオチド配列又は配列番号５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。ＤＥＲＡ０２は、「Ｗｉｌｌｉａｍ Ａ． Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ， ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， （２００４）， Ｖｏｌ．１０１ ， Ｎｏ．１６， ｐｐ． ５７８８」中に記載されている。
【００７２】
ＤＥＲＡ０３は、配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７３】
ＤＥＲＡ０４は、配列番号８のヌクレオチド配列又は配列番号９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７４】
ＤＥＲＡ０５は、配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７５】
ＤＥＲＡ０６は、配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７６】
ＤＥＲＡ０７は、配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７７】
ＤＥＲＡ０８は、配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７８】
ＤＥＲＡ０９は、配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００７９】
ＤＥＲＡ１０は、配列番号２０のヌクレオチド配列又は配列番号２１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８０】
ＤＥＲＡ１１は、配列番号２２のヌクレオチド配列又は配列番号２３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８１】
ＤＥＲＡ１２は、配列番号２４のヌクレオチド配列又は配列番号２５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８２】
ＤＥＲＡ１３は、配列番号２６のヌクレオチド配列又は配列番号２７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８３】
ＤＥＲＡ１４は、配列番号２８のヌクレオチド配列又は配列番号２９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８４】
ＤＥＲＡ１５は、配列番号３０のヌクレオチド配列又は配列番号３１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８５】
ＤＥＲＡ１６は、配列番号３２のヌクレオチド配列又は配列番号３３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８６】
ＤＥＲＡ１７は、配列番号３４のヌクレオチド配列又は配列番号３５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８７】
ＤＥＲＡ１８は、配列番号３６のヌクレオチド配列又は配列番号３７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８８】
ＤＥＲＡ１９は、配列番号３８のヌクレオチド配列又は配列番号３９のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００８９】
ＤＥＲＡ２０は、配列番号４０のヌクレオチド配列又は配列番号４１のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９０】
ＤＥＲＡ２１は、配列番号４２のヌクレオチド配列又は配列番号４３のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９１】
ＤＥＲＡ２２は、配列番号４４のヌクレオチド配列又は配列番号４５のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９２】
ＤＥＲＡ２３は、配列番号４６のヌクレオチド配列又は配列番号４７のアミノ酸配列を有するアルドラーゼである。
【００９３】
アルドラーゼは、本明細書中に記載されているアルドラーゼに対してその少なくとも約５０％、好ましくは、その少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアルドラーゼを含む。アミノ酸配列の同一性は、配列比較アルゴリズムを用いた分析によって、又は視覚的な調査によって決定される。一態様において、配列比較アルゴリズムは、設定を初期設定にしたＶｅｃｔｏｒＮＴＩ９．０（ＩｎｆｏｒＭａｘ）のＡｌｉｇｎＸアルゴリズムを用いて作製される。
【００９４】
特に、本発明は、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下記に定義されている。）を、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物
【００９５】
【化２２】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を調製する方法を提供する。
【００９６】
好ましい実施形態において、アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０１若しくはＤＥＲＡ０２若しくはＤＥＲＡ０５若しくはＤＥＲＡ１２若しくはＤＥＲＡ１３又はこれらと少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するあらゆるアルドラーゼから選択され、又は別の実施形態において、アルドラーゼは、ＤＥＲＡ０６若しくはＤＥＲＡ１７又はこれらと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するあらゆるアルドラーゼから好ましい実施形態において選択される。
【００９７】
化合物ＩＶは、スタチン（特に、ロスバスタチン）の合成におけるその後の使用において特に価値がある。
【００９８】
本明細書中に記載されているＤＥＲＡアルドラーゼは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ ２００１」に記載されているような組換えイー・コリ中でのタンパク質発現のための標準的プロトコールなど（但し、これに限定されない。）本分野において公知のあらゆる手段によって調製することができる。クローニング条件によっては、公知のＤＥＲＡアルドラーゼの修飾された様式が必要であり得、又はもたらされ得、公知のＤＥＲＡアルドラーゼの修飾された様式は本発明によって包含される。
【００９９】
本明細書中に記載されているＤＥＲＡアルドラーゼは、あらゆる生物学的に活性な形態で使用することができる。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、生きた完全細胞触媒の形態で使用され得る。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、不活化された完全細胞触媒の形態で使用され得る。
【０１００】
一実施形態における完全細胞触媒は、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現するあらゆる微生物又は微生物の一部である。前記微生物は、生きた又は休止した又は不活化された完全細胞の形態であり得る。
【０１０１】
これらの形態には、細胞懸濁物、細胞菌糸、細胞ペースト及び細胞が意図的に、物理的に、化学的に又は生物学的に破壊されていない微生物培養物のあらゆる他の形態が含まれ得、これらの形態には、このような微生物又はその一部の、担体に支持された、固定化された又は接着された担体がさらに含まれ得る。前記微生物は、好ましくは、細菌及び酵母から選択される。好ましくは、細菌は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択され、より好ましくは、エシェリヒア・コリが使用される。酵母は、好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる属の群から選択される。
【０１０２】
一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、均質化された完全細胞触媒の形態で使用され得る。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、無細胞抽出物の形態で使用され得る。一実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、本分野において公知のあらゆる方法を用いて、精製された酵素の形態で使用され得る。別の実施形態において、アルドラーゼは活性を有し、細胞外で発現されたタンパク質の形態で使用され得る。
【０１０３】
スタチン産生に関して有用な中間体を作製するために使用されるアルドラーゼの最適な活性を与えるために、基質及び反応条件を選択した。
【０１０４】
式ＩＩＩの化合物は、最適な反応条件での、式ＩＶの対応する化合物の産物安定性に従って選択される。特に、最高の安定性を有する産物を与えるアクセプター基質が反応のために好ましい。
【０１０５】
式ＩＩＩの化合物は、式ＶＩの対応する化合物（遮蔽されたアルデヒド基を有するこれらの産物は、スタチンの調製におけるさらなる工程を可能にするＷＯ２００７／０３９２８７Ａ１における中心的な中間体であり、特に、アルデヒド基を有する産物を与える基質が好ましい）に従っても選択される。
【０１０６】
式ＩＩＩの化合物は、特に、アセチルオキシアセトアルデヒド（ＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ）であり得る。
【０１０７】
一般に、アルドラーゼは適切な容器又は反応装置中に与えられ、式ＩＩＩの化合物及びアセトアルデヒドは、バッチ様式で又は継続的に添加される。
【０１０８】
具体的には、アルドラーゼは、場合によって塩（特に、５０から５００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌ）の存在下で、（特に、０．１ｇ／Ｌから３０ｇ／Ｌまでの濃度範囲で）水溶液中に調製される。水溶液は、水と混和性の有機溶媒（特に、２から１５％Ｖ／Ｖの濃度のジメチルスルホキシド）を含有し得、ｐＨ４．５から９、好ましくは、ｐＨ５から９、より好ましくは、ｐＨ６から９になるように緩衝化され得る。
【０１０９】
適切な緩衝液は、酸、塩基、塩又はこれらの混合物及び一級、二級又は三級アミノ基を有するものを除く本分野で公知のあらゆる他の緩衝系から調製することができる。特に、１０から５００ｍＭの濃度のホスファート緩衝液を使用することができる。水溶液は、前記アルドラーゼを水に添加し、無機酸、塩基、塩又はこれらの混合物の自動化された添加を用いて、反応の間にｐＨを維持することによっても調製することができる。
【０１１０】
あるいは、場合によって、塩（特に、５０から５００ｍＭの濃度のＮａＣｌ）の存在下で、（特に、２０ｇ／Ｌから３００ｇ／Ｌ湿潤細胞重量の濃度範囲の、より具体的には、２０ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌ湿潤細胞重量の濃度範囲の）ＤＥＲＡ過剰発現細胞、特にＤＥＲＡ過剰発現イー・コリ細胞の水性懸濁物中で、アルドラーゼが調製される。水性懸濁液は、水と混和性の有機溶媒（特に、２から１５％Ｖ／Ｖの濃度範囲のジメチルスルホキシド）を含有し得、ｐＨ４．５から９、好ましくは、ｐＨ５から９、より好ましくは、ｐＨ６から９になるように緩衝化され得る。適切な緩衝液は、酸、塩基、塩又はこれらの混合物及び一級、二級又は三級アミノ基を有するものを除く本分野で公知のあらゆる他の緩衝系から調製することができる。特に、１０から５００ｍＭの濃度のホスファート緩衝液を使用することができる。水性懸濁液は、前記ＤＥＲＡ過剰発現細胞を水に添加し、無機酸、塩基、塩又はこれらの混合物の自動化された添加を用いて、反応の間にｐＨを維持することによっても調製することができる。
【０１１１】
方法の態様において、式ＩＩＩの化合物は、反応混合物へ連続的に添加され得、あるいは、式ＩＩＩの化合物は、１つのバッチ又はそれ以上のバッチ中の反応混合物に添加される。一態様において、混合物に添加される基質の総量は、添加される式ＩＩＩの化合物の総量が反応混合物の約２０ｍｍｏｌ／Ｌから反応混合物の約２ｍｏｌ／Ｌ、特に、反応混合物の約１００ｍｍｏｌ／Ｌから反応混合物の約１．５ｍｏｌ／Ｌ、より具体的には、反応混合物の約２００ｍｍｏｌ／Ｌから反応混合物の約７００ｍｏｌ／Ｌである。アセトアルデヒドは、幾つかの手段によって添加され得る。一態様において、アセトアルデヒドは、１つのバッチ若しくはそれ以上のバッチ中であるいは連続的に、反応混合物に添加される。アセトアルデヒドは、式ＩＩＩの化合物と予め混合され、反応混合物に添加され得る。反応混合物に添加されるアセトアルデヒドの総量は、約０．１から約４モル濃度当量からアクセプター基質（化合物ＩＩＩ）の総量まで、特に、約１から約３モル濃度当量、より好ましくは、約２から約２．５モル濃度当量である。特に、これは、所望でない産物、特に式ＸＩＩ及びＸＩＩＩの化合物の最小限の濃度を可能にするのに対して、式ＸＩＩの化合物は、アセトアルデヒドの一分子をＩＩＩの一分子と反応させることによって得られ、式ＸＩＩＩの化合物はアセトアルデヒドの三分子を反応させることによって得られる。
【０１１２】
【化２３】
【０１１３】
好ましい実施形態において、基質は、反応のあらゆる所定の時点で、特定の流速で、プログラム可能なポンプを用いて反応混合物に継続的に添加される。流速は、基質が反応混合物中に蓄積しない最大の流速として決定される。特に、これは、所望でない産物の最小濃度を可能にする。より具体的には、この産物は、式ＸＩＩ及びＸＩＩＩの化合物であり得る。別の実施形態において、基質の阻害的効果は、正しい添加戦略を用いてさらに最小化することができる。
【０１１４】
あるいは、アルドラーゼは、式ＩＩＩの化合物又はアセトアルデヒドの少なくとも１つを含有する反応混合物に添加され得る。反応混合物は、溶媒と及びアルドラーゼ又は式ＩＩＩの化合物又はアセトアルデヒドの少なくとも１つを含むものと理解される。
【０１１５】
一態様において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用されるｐＨは、約５から１０である。一実施形態において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用されるｐＨは、約５から約８である。具体的には、ｐＨは、５から７の範囲の適切な緩衝液によって維持される。
【０１１６】
アルドラーゼ縮合中間体（特に、第一の縮合反応産物）は緩衝液と化学的な反応を起こし得るので、一般的に使用される幾つかの緩衝液は、アルドラーゼ縮合中間体（特に、第一の縮合反応産物）の利用可能性を制約することによって、先述のアルドラーゼによって触媒される反応の収率を低下させ得る。本発明者らは、ビス−トリスプロパンが前記中間体と反応することを発見した。同様に反応し得る他の緩衝液は、ビス−トリス、トリシン、トリス、ビシン又は一級、二級若しくは三級アミノ基を有するあらゆる他の緩衝液である。従って、ｐＨ値を調整するための適切な緩衝液は、この調整が必要であれば、酸、塩基、塩又はこれらの混合物、特に、リン酸及び水酸化ナトリウムを用いて作製される。
【０１１７】
一態様において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用される温度は、約２０から約７０℃である。一実施形態において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用される温度は、約２５から約６０℃である。一実施形態において、アルドラーゼによって触媒される反応のために使用される温度は、約３０から約５０℃である。
【０１１８】
反応は２から３時間以内に完了まで進行するので、産業的に適切である。
【０１１９】
反応の完了後、アセトニトリルの少なくとも約１容量を反応混合物の１容量に添加することによって、酵素は反応混合物から除去される。あるいは、酵素は、本分野において公知のあらゆる沈殿法によって除去される。一実施形態において、沈殿は、少なくとも５％ｍ／Ｖの硫酸アンモニウムの添加によって行われる。あるいは、ＩＶは、本分野において公知の塩析法によって抽出される。特に、塩析は、アセトニトリルの少なくとも約１容量から反応混合物の１容量及びＮａＣｌの５％（ｍ／Ｖ）を添加することによって行われる。次いで、少なくとも４０℃まで混合物を冷却し、液相を分離させる。次いで、アセトニトリル相を蒸発させて、ＩＶの未精製産物を与える。あるいは、沈降技術、特に遠心を用いて、反応混合物から完全細胞触媒が除去される。別の態様において、完全細胞触媒は、ろ過技術、特に、微小ろ過によって除去され得る。
【０１２０】
本発明は、前記反応によって作製された純粋なラクトールを取得するための精製法も提供する。一態様において、アセトニトリルは、反応混合物から蒸発され、次いで、残存する水溶液が凍結乾燥される。別の態様において、沈降された沈殿溶液又は完全細胞触媒懸濁液の何れかの上清が凍結乾燥される。次いで、粉末化された残りがアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１中に懸濁される。不溶性の塩を除去するために、懸濁液をろ過し、移動相としてアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１を用いるシリカゲルカラムへろ液を搭載する。別の態様において、塩析抽出から得られるアセトニトリル相を蒸発させ、残りの油をアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１の最小容積中に溶解し、移動相としてアセトニトリル／ジイソプロピルエーテル１：１を用いるシリカゲルカラムに搭載する。
【０１２１】
特定の実施形態において、本発明は、使用されるアルドラーゼが（必要であれば、酸、塩基、塩又はこれらの混合物を用いて、特に、リン酸及び水酸化ナトリウムを用いて調整された）５から１０、特に５から８のｐＨ範囲の適切な溶媒（特に、水溶性有機溶媒と混合された水であり得る水性溶媒）中の、ＤＥＲＡ０１、ＤＥＲＡ０２であり、反応が約３５から４０℃の温度で進行し、転化が１から６時間で終了する、（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタートを形成するための、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合下でのＣＨ３ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯのアセトアルデヒドとの反応を提供する。
【０１２２】
一般に、使用されるアルドラーゼは、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ．」に記載されているタンパク質発現の方法によって調製される。アルドラーゼをコードする遺伝子は発現ベクター中にクローニングされ、酵素は適切な発現宿主中に発現される。
【０１２３】
反応収率は、反応混合物に添加された式ＩＩＩの化合物の総量に対して相対的に計算され、単離された産物のモルと反応混合物に添加された式ＩＩＩの化合物のモルとの間の比として測定される。
【０１２４】
本発明は、それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、下記に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含む、
式ＸＶの化合物
【０１２５】
【化２４】
（Ｒ４は、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、上に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法も提供する。好ましくは、Ｒ４は、アセタート、塩化物、水素であり、より好ましくは、Ｒ４はアセタートである。
【０１２６】
前記接触工程は、アルドール縮合が触媒されるように実施される。従って、完全細胞触媒としてアルドラーゼを過剰発現する生物が使用される。好ましくは、完全細胞触媒の形態の酵素は、上に定義されている２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である。
【０１２７】
好ましくは、前記完全細胞触媒は、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する細菌及び酵母から選択される。細菌は、好ましくは、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる属の群から選択され、より好ましくは、エシェリヒア・コリが使用される。酵母は、好ましくは、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる属の群から好ましく選択される。
【０１２８】
本発明の特定の態様において、ロスバスタチンは、以下のスキームに開示されているように、本発明者らの式ＶＩの化合物から開始して、ＷＯ２００７／０３９２８７Ａ１に従って調製することができる。
【０１２９】
【化２５】
【０１３０】
ロスバスタチン又は他のスタチンを作製するために、式ＶＩの化合物は、（式ＶＩＩの化合物を介した）２つの工程で、（２Ｓ，４Ｒ）−４−（保護された）−６−オキソ−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルバルデヒドＶＩＩＩ又はその水和物ＶＩＩＩ’へ転換される。アルデヒドＶＩＩＩ又はその水和物ＶＩＩＩ’は、適切な試薬とのＷｉｔｔｉｇカップリングの条件下で反応させることができ、続いて、必要であれば、水素が添加される。
【０１３１】
適切な試薬は、以下の式の複素環式又は脂環式誘導体（スタチンの骨格）である。
【０１３２】
【化２６】
（Ａは、結合又はＯであり得、
並びにＲｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、
並びにＸが陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートであり；
並びにＨｅｔは、スタチンの複素環式又は脂環式骨格を形成するように選択される。）
他のＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（好ましくは、セリバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、ベルバスタチン、ダルバスタチンの中から選択される。）を同様に調製することができる。
【０１３３】
スタチンの複素環式又は脂環式骨格（Ｈｅｔ）は、特に、以下から選択される。
【０１３４】
【化２７】
【０１３５】
以下の実施例は、本発明の方法を例示するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０１３６】
アセトキシアセトアルデヒド（ＩＩＩ）
１．工程
【０１３７】
【化２８】
トリエチルアミン（６７ｍＬ、４当量）中に、１，４−ジヒドロキシブト−２−エン（１０ｍＬ、０．１２ｍｏｌ、１当量）を溶解した。溶液を０℃まで冷却し、無水酢酸（Ｉ）（３４ｍＬ、３当量）を滴加した。得られた反応混合物を室温まで加温し、一晩撹拌した。
【０１３８】
１ＭＨ３ＰＯ４溶液（６０ｍＬ）で２回、ＮａＨＣＯ３１Ｍ溶液（６０ｍＬ）で２回、溶液を洗浄した。次いで、ＭｇＳＯ４で溶液を脱水させ、濃縮した。高真空ポンプを７０℃で使用して、ＡｃＯＨ及びＡｃ２Ｏの微量を除去した。
【０１３９】
淡黄色ないし暗色の液体として、純粋なＩＩを得た（２０．６ｇ、１００％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．６５（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｓ，６Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．２，１２７．６，５９．５，２０．２。
【０１４０】
２．工程
【０１４１】
【化２９】
１，４−ジアセトキシブト−２−エン（ＩＩ）（１．７ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン（０．１７Ｍ）中に溶解した。酸素（又は乾燥空気）散布を作動させ（約１０Ｌ／ｈ）、溶液を−８０℃まで冷却した。−８０℃になったら、オゾン発生装置を作動させ、溶液が青色に変化するまで、オゾンを通気した。次いで、オゾン発生装置を停止させ、青色が消失するまで、酸素（又は乾燥空気）を通気した。アルゴンを１０分間通気した。散布を取り除き、−８０℃で、溶液をアルゴン下に保った。硫化メチル（１．８ｍＬ、２．５当量）を滴加し、反応を室温まで加温し、２０時間撹拌した。反応を濃縮して、１，４−アセトキシアセトアルデヒド（ＩＩＩ）及びＤＭＳＯの２：１混合物を得た。収率は定量的であると思われ、１，４−ジアセトキシブト−２−エンの微量は存在しなかった。さらなる精製なしに、産物を使用した。（ＩＩＩ）１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．５１（ｓ，１Ｈ），４．５９（ｓ，２Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），２．５８（ｓ，ＤＭＳＯ）。
【実施例２】
【０１４２】
アルドラーゼの調製
イー・コリＫ−１２株由来の単離されたゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ反応において、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ遺伝子ｄｅｏＣを増幅した。
ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣ及び
ＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＣＴＴＡＣＣ
（それぞれ、配列番号４８及び４９を有する。）
制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて産物を切断し、得られた断片をアガロースゲル電気泳動上で分離し、精製した。同じ前記制限エンドヌクレアーゼを用いて、発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎｅ ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を切断し、精製した。Ｔ４リガーゼ反応において、断片を集合させた。
【０１４３】
上記連結反応を用いて、形質転換受容性のエシェリヒア・コリＤＨ５α細胞を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーを培養し、プラスミドＤＮＡを単離した。得られた構築物をｐＱＥ３０ＤｅｒａＣと表記し、遺伝子配列を確認するために配列決定した。ベクターｐＱＥ３０ＤｅｒａＣで形質転換受容性のエシェリヒア・コリＴＯＰ１０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を形質転換することによって、アルドラーゼ発現生物を調製した。この方法に対して使用した方法は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ」に記載されており、当業者に周知である。
【０１４４】
ＴＯＰ１０Ｆ’ＰＱＥ３０ＤｅｒａＣの３ｍＬ一晩培養物とともに、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）が補充されたＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（１５０ｍＬ、１２ｇ／Ｌバクト・トリプトン、２４ｇ／Ｌバクト酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌグリセロール、２．３１ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、１２．５４ｇ／ＬＫ２ＨＰＯ４）に接種した。ＯＤ６００が約０．８に到達するまで、細胞を増殖させた（３７℃、２５０ｒｐｍ）。ＩＰＴＧ（１ｍＭ最終濃度）を用いてタンパク質発現を誘導し、さらに４時間、同じ増殖条件中に細胞を放置した。遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって、細胞沈降物を採集した。上清を除去し、緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ）の同じ容量によって交換した。沈降物を再懸濁し、遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって再度集めた。上清を除去し、使用前に、細胞を−２０℃で保存した。ＤＥＲＡ０１を有する完全細胞触媒をこのようにして得た。
【０１４５】
あるいは、溶解緩衝液１Ｌ当り沈降物２００ｇを用いて、溶解緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＤＴＴ）中に沈降物を再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎデジタル音波処理装置を用いて、細胞を音波処理し（３×１５秒）、沈降（１０分、２０，０００ｇ、４℃）によって、細胞破片を除去した。ＤＥＲＡ０１の透明な水溶液をこのようにして得た。
【実施例３】
【０１４６】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１４７】
【化３０】
ＤＥＲＡ０１の溶液６００ｍＬ、反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、水中）２００ｍＬ、アセトアルデヒド（反応緩衝液中１．０５Ｍ溶液）の溶液１００ｍＬ及びＩＩＩ’の１００ｍＬ（反応緩衝液中の５００ｍＭ溶液）を撹拌された反応容器中で混合し、反応混合物１Ｌを得た。ＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いて、混合物のｐＨ値を７．０に補正した。３７℃に設定された温度制御された槽中で、混合物を３時間温置した。ＳｙｎｅｒｇｙＦｕｓｉｏｎ、２５０×４．６ｍｍ、４μｍカラムを使用して、ＥＳＩイオン化を備えた三連四重極ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ／ＭＳシステム上でのＬＣ−ＭＳ分析を用いて、反応の間、ＩＶの産生をモニターした。クロマトグラフィー条件は、以下のとおりであった。Ｔカラム＝５０℃、流速：１．５ｍＬ／分、Ｖｉｎｊ＝５０μＬ。移動相を以下のように使用した。
Ａ：水中の０．１％（ｍ／ｖ）ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ、ｐＨ６．５
Ｂ：ＭｉｌｌｉＱ水
Ｃ：アセトニトリル
線形勾配：
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
保持時間＝７．７±０．５分及び２０８の質量（Ｍ＋ＮＨ４＋に相当）を有するピーク面積の増大が反応の間に観察されたが、反応緩衝液で置換された反応混合物の一成分をそれぞれ有する対照の何れにもピーク面積の増大は観察されなかった。
【０１５０】
アセトニトリル４Ｌ及びＮａＣｌ５０ｇの添加を用いて、反応を停止させた。懸濁液を０℃まで冷却し、遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって、液相を分離した。上方の相を取り出し、減圧下で蒸発させて、痰黄色の油（未精製産物）８．４ｇを得た。シリカゲルカラム（移動相：アセトニトリル／ジイソプロピルエーテル＝１／１）上で未精製産物を精製した。その後、減圧下で溶液を蒸発させて、産物ＩＶ２．４ｇを得た。（ＩＶ）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．３９（ｄ，１Ｈ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０４−１．６０（ｍ，４Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．８，９１．７，６８．１，６６．８，６３．３，３３．９，２０．７
【実施例４】
【０１５１】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１５２】
【化３１】
【０１５３】
反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、水中）７５０ｍＬ中に、ＤＥＲＡ０１を有する完全細胞触媒（３００ｇ）を懸濁し、３７℃に設定した制御された温度で、撹拌された容器中において温置した。較正された蠕動式ポンプを用いて、２時間の反応時間の間に、基質溶液（６３０ｍＭアセトアルデヒド（ＩＩＩ）、反応緩衝液中の３００ｍＭ溶液）７５０ｍＬを添加した。ＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いて、ｐＨを７．０に調節した。反応をさらに３０分間継続し、次いで、遠心（１０分、６０００ｇ、４℃）によって、完全細胞触媒を沈降させた。次いで、上清を凍結乾燥して淡黄色結晶（未精製産物）１９．４ｇを得た。シリカゲルカラム（移動相：アセトニトリル／ジイソプロピルエーテル＝１／１）上で未精製産物を精製した。その後、溶液を減圧下で蒸発させて、産物ＩＶ７．４ｇを得た。（ＩＶ）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．３９（ｄ，１Ｈ），４．５３（ｍ，１Ｈ），４．２９（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０４−１．６０（ｍ，４Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７０．８，９１．７，６８．１，６６．８，６３．３，３３．９，２０．７。
【０１５４】
反応の間、ＬＣ−ＭＳ分析を用いて、ＩＶの産生をモニターした。反応の間、２０８の質量を有するピーク面積（Ｍ＋ＮＨ４＋に相当）の増大が観察され、ＬＣ−ＭＳを用いた２．５時間後の反応混合物の定量分析によって、ＩＶの１３．１ｇ／Ｌの存在が示された。
【実施例５】
【０１５５】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１５６】
【化３２】
【０１５７】
反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、３００ｍＭＮａＣｌ、水中）６ｍＬ中に、ＤＥＲＡ０２を有する完全細胞触媒（３ｇ）を懸濁した。アセトアルデヒド（反応緩衝液中の２．１Ｍ溶液）の溶液２ｍＬ及びＩＩＩ（反応緩衝液中の１Ｍ溶液）の２ｍＬを反応管中に混合して、反応混合物１０ｍＬを得た。ＮａＯＨの１Ｍ水溶液を用いて、混合物のｐＨ値を７．０に補正した。３７℃に設定された温度制御された槽中で、混合物を３時間温置した。反応の間、ＬＣ−ＭＳ分析を用いて、ＩＶの産生をモニターした。２０８の質量（Ｍ＋ＮＨ４＋に相当）を有するピーク面積の増大が反応の間に観察されたが、反応緩衝液で置換された反応混合物の一成分をそれぞれ有する対照の何れにもピーク面積の増大は観察されず、ＬＣ−ＭＳを用いた１時間後における反応混合物の定量分析は、ＩＶの８．７ｇ／Ｌの存在を示した。
【実施例６】
【０１５８】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）
【０１５９】
【化３３】
【０１６０】
反応緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ）１０７０ｍＬ中に、ＩＩＩの５６．６ｇ（９２％）を希釈した。ＮａＨＣＯ３塩を用いて、この溶液のｐＨ値を６．２になるように調整した。ＤＥＲＡ０１を有する完全細胞触媒（７００ｇ／Ｌ）５１０ｍＬを前溶液に添加し、ＮａＨＣＯ３塩を用いて、ｐＨ値を６．２になるように再度補正した。３７℃及び一定の撹拌の８００ｒｐｍに設定された、温度制御された２Ｌバイオリアクター内で、混合物を３時間温置した。下表に記載されている３時間の時間枠で、プログラム可能なポンプを用いて、反応緩衝液中に希釈されたアセトアルデヒド（４５．４ｇ）１２０ｍＬを反応混合物に継続的に添加した。
【０１６１】
【表２】
【０１６２】
反応の間、ｐＨは補正されず、５．５の最終値までゆっくり推移した。５．１７分（化合物ＩＩＩ）、１４．０４分（化合物ＸＩＩ）、１４．４４分化合物（化合物ＸＩＩＩ）及び２０．３５分（化合物ＩＶ）での保持時間をモニタリングすることによって、ＧＣ分析（クロマトグラフィーカラム：ＤＢ−１ １００％ジメチルポリシロキサン；温度プログラム：初期温度５０℃、初期時間：５分、温度速度１０℃／分、最終温度：２１５℃、最終時間：１０分；注入装置：スプリット／スプリットレス注入装置、担体気体：ヘリウム、初期流速：１０ｍＬ／分；検出装置：炎イオン化検出装置、検出装置温度：２３０℃；クロマトグラフィー溶液：ＩＶの１から５ｍｇ／ｍＬアセトニトリル）を用いて、ＩＶの産生をモニターした。反応プロファイルは、図１に示されている。
【０１６３】
ＧＣを用いた３時間後における反応混合物の定量分析は、６７．７％モル濃度収率で、ＩＶの３５．３ｇ／Ｌを示した。実施例６に記載されている物質に由来するさらなる合成工程中の化合物の鏡像異性体純度の分析は、９９．８％又はそれ以上の鏡像異性体過剰を示し、これは、この物質の極めて高い鏡像異性体純度を示唆する。実施例６に記載されている物質に由来するさらなる合成工程中の化合物のジアステレオマー異性体純度の分析は、９８％又はそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を示し、これも、ＩＶの極めて高いジアステレオマー異性体純度を示唆する。
【実施例７】
【０１６４】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（Ｖ）
【０１６５】
【化３４】
【０１６６】
水中の（（２Ｓ，４Ｒ）−４，６−ジヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＩＶ）（１当量）の溶液を０℃まで冷却した。炭酸バリウム（１．４当量）を添加した後、Ｂｒ２（１．２当量）を滴加し、反応を室温で一晩撹拌した。溶液をＮａＣｌで飽和させ、ＥｔＯＡｃを用いて４回抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で脱水させ、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィーを用いた精製（ヘキサン／アセトン＝７５／２５から５５／４５）によって、（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（Ｖ）を得た。
【０１６７】
（Ｖ）：１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）δ４．８８（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３８（ｈｅｘ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，１Ｈ），２．６８（ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．５ＨＺ，１Ｈ），２．５１（ｄｄｄｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｊ＝１７．５Ｈｚ，１Ｈ），２．０３（ｓ，３Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）δ１７０．８，１６９．７，７４．２，６６．５，６２．７，３９．１，３２．３，２０．６。
【実施例８】
【０１６８】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）
【０１６９】
【化３５】
【０１７０】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピランー２−イル）メチルアセタート（Ｖ）（１．８８ｇ、１０ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を無水ＤＭＦ（２ｍＬ、１Ｍ）中に溶解した。イミダゾール（０．８８ｇ、１．３当量）及びＴＢＤＭＳＣＩ（１．６６ｇ、１．１当量）を連続して添加し、反応が完了するまで、反応を撹拌した。水（２０ｍＬ）とエーテル（２０ｍＬ）の間に、反応混合物を分配した。エーテル（２０ｍＬ）で１回、水相を抽出した。水（１０ｍＬ）の少量、ＨＣｌ１Ｎ（２０ｍＬ）及び塩水（２０ｍＬ）で、合わせた有機相を２回洗浄した。溶液をＭｇＳＯ４で脱水させ、濃縮して、定量的収率で、（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）を得た。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ４．９３（ｍ，１Ｈ），４．３７（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｄｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，Ｊ＝１２Ｈｚ，１Ｈ），２．６２（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），１．８４−１．８０（ｍ，２Ｈ），０．８９（ｓ，９Ｈ），０．０９（２ｓ，６Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７０．４，１６９．１，７３．３，６５．５，６３．０，３８．９，３２．２，２０．５，１７．７，−５．１，−５．２。
【実施例９】
【０１７１】
酵素反応を介した（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）の（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）への転化
【０１７２】
【化３６】
【０１７３】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）（５０ｇ、８０％純度；１３２．４ｍｍｏｌ）をリン酸緩衝液（Ｐ．Ｂ．Ｓ）、ｐＨ＝５．２０（１．５Ｌ）に添加し、３７℃まで溶液を加温した。次いで、パンクレアチン粉末（０．５当量質量；２０ｇ）を滴加した（６回、８ｇ＋３×４ｇ）。平行して、ｐＨをモニターし、ｐＨを４．８５と４．９５の間に維持するために、１時間ごとに、ＮａＨＣＯ３溶液（１Ｍ）を添加することによってｐＨを制御した。酵素の最初の添加後９時間、反応を撹拌した。
【０１７４】
ｃｅｌｉｔｅ（Ｒ）を未精製混合物に添加した。ｃｅｌｉｔｅ（Ｒ）を通して、溶液をろ別した。淡黄色の液体を回収した。ＥｔＯＡｃの１．５Ｌを用いて、フィルター上の固体を洗浄した。ろ液を５分間撹拌した。２つの層を分離した。ＥｔＯＡｃ（１．５Ｌ）を用いて、水相を１回再抽出した。４０℃で減圧下において、合わせた有機相を部分的に蒸発させ、メチルシクロヘキサンから産物を再結晶させて、（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）の８２％を白色結晶として得た。反応の転化はほぼ定量的であり（＞９８％）、鏡像異性体は０．１％未満であった。
【０１７５】
スプリット／スプリットレス注入装置及びＦＩＤ検出装置を有するＢｅｔａｄｅｘ１２０カラム上で、ＤＣＭ溶液（２から３ｍｇ／ｍＬ）を用いて鏡像異性体を測定するためのＧＣ分析を行った。
【０１７６】
化合物ＶＩＩのＮＭＲ分析は、検出限界での高スキャン蓄積を用いた場合でさえ、ジアステレオマー異性体が存在しないことを示し、ＶＩＩ中のジアステレオマー異性体のレベルが１％を下回ることを示唆している。
【実施例１０】
【０１７７】
化学的反応を介した（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）の（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）への転化
【０１７８】
【化３７】
【０１７９】
（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−オキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）メチルアセタート（ＶＩ）（０．６２５ｇ、８０％純度、１．６５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８ｍＬ）及びＭｅＯＨ（８ｍＬ）中に溶解した。スズ触媒（ｔＢｕ２ＳｎＣｌＯＨ）２（９４ｍｇ、０．１当量）を添加し、反応を一晩撹拌した。反応を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純粋な（４Ｒ，６Ｓ）−４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オン（ＶＩＩ）（１２６ｍｇ、３０％）を得た。ＶＩＩは鏡像異性体の０．１％未満を含有することが明らかとなった。
【０１８０】
スプリット／スプリットレス注入装置及びＦＩＤ検出装置を有するＢｅｔａｄｅｘ１２０カラム上で、ＤＣＭ溶液（２から３ｍｇ／ｍＬ）を用いて鏡像異性体を測定するためのＧＣ分析を行った。
【０１８１】
化合物ＶＩＩのＮＭＲ分析は、検出限界での高スキャン蓄積を用いた場合でさえ、ジアステレオマー異性体が存在しないことを示し、ＶＩＩ中のジアステレオマー異性体のレベルが１％を下回ることを示唆している。
【０１８２】
酵素的反応を介した及び化学的反応を介した化合物ＶＩＩへの化合物ＶＩの転化は、望ましくない鏡像異性体が０．１％未満である優れた鏡像異性体純度を有する産物を与え、２つの方法によって調製された化合物ＶＩＩの鏡像異性体純度には、差は観察されなかった。また、調製された化合物ＶＩＩのジアステレオマー異性体純度は高く、望ましくないジアステレオマー異性体は１％未満であった。従って、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体の過剰は、より初期の合成工程に（例えば、アルドラーゼによって触媒される化合物ＩＩＩの化合物ＩＶへの転化に）起因する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下記に定義されているとおりである。）のアルデヒドを、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物を調製する方法
【化１】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）。
【請求項２】
Ｒ１がそれぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである、好ましくはＲ１がＣＨ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式ＩＶの化合物が９８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵素が２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が以下のアルドラーゼの１つである、請求項１から４の何れかに記載の方法。
配列番号１のヌクレオチド配列若しくは配列番号２のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０１；
配列番号３若しくは配列番号４のヌクレオチド配列若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０２；
配列番号６のヌクレオチド配列若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０３；
配列番号８のヌクレオチド配列若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０４；
配列番号１０のヌクレオチド配列若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０５；
配列番号１２のヌクレオチド配列若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０６；
配列番号１４のヌクレオチド配列若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０７；
配列番号１６のヌクレオチド配列若しくは配列番号１７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０８；
配列番号１８のヌクレオチド配列若しくは配列番号１９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０９；
配列番号２０のヌクレオチド配列若しくは配列番号２１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１０；
配列番号２２のヌクレオチド配列若しくは配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１１；
配列番号２４のヌクレオチド配列若しくは配列番号２５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１２；
配列番号２６のヌクレオチド配列若しくは配列番号２７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１３；
配列番号２８のヌクレオチド配列若しくは配列番号２９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１４；
配列番号３０のヌクレオチド配列若しくは配列番号３１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１５；
配列番号３２のヌクレオチド配列若しくは配列番号３３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１６；
配列番号３４のヌクレオチド配列若しくは配列番号３５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１７；
ＤＥＲＡ１８は配列番号３６のヌクレオチド配列若しくは配列番号３７のアミノ酸配列を含むアルドラーゼであり；
配列番号３８のヌクレオチド配列若しくは配列番号３９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１９；
配列番号４０のヌクレオチド配列若しくは配列番号４１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２０；
配列番号４２のヌクレオチド配列若しくは配列番号４３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２１；
配列番号４４のヌクレオチド配列若しくは配列番号４５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２２；
配列番号４６のヌクレオチド配列若しくは配列番号４７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２３；
又は前記アルドラーゼの何れかのアミノ酸配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアルドラーゼ。
【請求項６】
前記アルドラーゼが以下の群の１つから選択される、請求項４に記載の方法；
配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号５のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号２５のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号２７のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性。
【請求項７】
アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合に対するｐＨが、４．５から１０、好ましくは５から１０の範囲に維持され、より好ましくは、ｐＨがｐＨ範囲５から８の緩衝液を用いて維持される、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ホスファート緩衝液がアルドール縮合を触媒するために使用される、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドを接触させる工程を含む、
式ＩＶの化合物
【化２】
（Ｒ１は下記に定義のとおりである。）
を形成させるために、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件下で、式ＩＩＩの基質Ｒ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）をアセトアルデヒドと反応させるための、アルドラーゼの使用。
【請求項１０】
前記アルドラーゼが２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、好ましくは、
配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０１；
配列番号３若しくは配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０２；
配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０３；
配列番号８のヌクレオチド配列又は配列番号９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０４；
配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０５；
配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０６；
配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０７；
配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０８；
配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０９；
配列番号２０のヌクレオチド配列又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１０；
配列番号２２のヌクレオチド配列又は配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１１；
配列番号２４のヌクレオチド配列又は配列番号２５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１２；
配列番号２６のヌクレオチド配列又は配列番号２７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１３；
配列番号２８のヌクレオチド配列又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１４；
配列番号３０のヌクレオチド配列又は配列番号３１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１５；
配列番号３２のヌクレオチド配列又は配列番号３３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１６；
配列番号３４のヌクレオチド配列又は配列番号３５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１７；
ＤＥＲＡ１８は配列番号３６のヌクレオチド配列又は配列番号３７のアミノ酸配列を含むアルドラーゼであり；
配列番号３８のヌクレオチド配列又は配列番号３９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１９；
配列番号４０のヌクレオチド配列又は配列番号４１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２０；
配列番号４２のヌクレオチド配列又は配列番号４３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２１；
配列番号４４のヌクレオチド配列又は配列番号４５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２２；
配列番号４６のヌクレオチド配列又は配列番号４７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２３；
である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アルドラーゼが生きた完全細胞内に含まれ、又は不活化された完全細胞内に含まれ、又は均質化された完全細胞内に含まれ、又は無細胞抽出物内に含まれ、又は精製された酵素であり、又は固定化されており、又は細胞外に発現されたタンパク質の形態である、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
酸化によって、式ＩＶの化合物
【化３】
を式Ｖの化合物へ転化させる工程を含む、
式Ｖの化合物
【化４】
（Ｒ１は、請求項１に定義されている。）
を調製する方法。
【請求項１３】
酸化がＢｒ２及びＢａＣＯ３を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）式ＩＩの化合物Ｒ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ２ＣＲ２（Ｒ２は、下記に定義されている。）を溶媒と及びオゾンと接触させる工程、並びに
ｂ）工程ａ）から得られたオゾニドを加水分解する工程、
を含む、式ＩＩＩ’のアルデヒドＲ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ２は、ｎ−プロピル、シクロヘキシル、フェニル、モルホリン、ピロリジン及びイミダゾールを除く請求項１に定義されているＲ１である。）を作製する方法。
【請求項１５】
工程ａ）の溶媒がジクロロメタンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ２が、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシ（ｎ−プロピル、シクロヘキシルを除く。）であり、好ましくはＲ２がＣＨ３である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）が−５０から−９０℃の範囲の温度で実施され、及び／又は工程ｂ）が室温で実施される、請求項１４から１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）の得られたオゾニドを硫化メチルと接触させることによって、工程ｂ）が実施される、請求項１４から１７に記載の方法。
【請求項１９】
式ＩＶ又はＶに記載の化合物
【化５】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）。
【請求項２０】
Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシ、好ましくは、Ｒ１がＣＨ３である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
ａ）式ＶＩの化合物
【化６】
を得るために、保護基Ｒ３によって、４位の水酸基において、式Ｖの化合物
【化７】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を保護する工程、
ｂ）スタチン又は医薬として許容されるその誘導体を作製するのに十分な条件下で、式ＶＩの前記化合物を反応させる工程、
を含む、スタチン又はその誘導体を作製する方法。
【請求項２２】
工程ｂ）の条件が、アルデヒドへのＶＩの転化によって、及びスタチン又はその誘導体を得るための適切なホスホニウム塩とのこのアルデヒドのＷｉｔｔｉｇカップリングによって設定され、
ｂ１）式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る工程、
ｂ２）式Ｘの化合物
【化８】
を得るために、式ＩＸを有するホスホニウム塩を得る工程、
【化９】
（Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、
並びにＸは陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートである。）
ｂ３）その後、化合物Ｘをロスバスタチン又はその塩へ転化する工程、
を好ましく含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る前記工程ｂ１）が式ＶＩＩの化合物
【化１０】
（Ｒ３は、独立に置換された又は置換されていない、シリル、ベンジル、アルキル及びアセチルから選択される保護基であり、好ましくは、Ｒ３は、場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８トリアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８ジアルキルアリールシリル、Ｃ１−Ｃ８アルキルジアリールシリルから選択され、アルキルは同一又は別異であり得、より好ましくは、保護基はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。）
を通じて行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドを接触させることによって、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドを接触させる前記工程が達成される、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、下記に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含む、
式ＸＶの化合物
【化１１】
（Ｒ４は、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、請求項１に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法。
【請求項２６】
アルドール縮合が触媒されるように、接触工程が行われる、請求項２４から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アセトアルデヒドと式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４が下記に定義されている。）を、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させることを含み、前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、
式ＸＶの化合物
【化１２】
（Ｒ４は、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、請求項１に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法。
【請求項２９】
前記微生物が、好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクボタシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる属の群から選択される細菌であり、より好ましくは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が使用される、請求項２４から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物が、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる属の群から選択される酵母である、請求項２４から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの前記化合物が９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する、請求項１から８、１２から１３、２１から２４又は２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
それぞれ、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの化合物。
【請求項１】
アセトアルデヒド及び式ＩＩＩＲ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、下記に定義されているとおりである。）のアルデヒドを、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させる工程を含む、式ＩＶの化合物を調製する方法
【化１】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）。
【請求項２】
Ｒ１がそれぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシである、好ましくはＲ１がＣＨ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式ＩＶの化合物が９８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵素が２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ（ＤＥＲＡ、ＥＣ４．１．２．４）である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が以下のアルドラーゼの１つである、請求項１から４の何れかに記載の方法。
配列番号１のヌクレオチド配列若しくは配列番号２のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０１；
配列番号３若しくは配列番号４のヌクレオチド配列若しくは配列番号５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０２；
配列番号６のヌクレオチド配列若しくは配列番号７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０３；
配列番号８のヌクレオチド配列若しくは配列番号９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０４；
配列番号１０のヌクレオチド配列若しくは配列番号１１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０５；
配列番号１２のヌクレオチド配列若しくは配列番号１３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０６；
配列番号１４のヌクレオチド配列若しくは配列番号１５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０７；
配列番号１６のヌクレオチド配列若しくは配列番号１７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０８；
配列番号１８のヌクレオチド配列若しくは配列番号１９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０９；
配列番号２０のヌクレオチド配列若しくは配列番号２１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１０；
配列番号２２のヌクレオチド配列若しくは配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１１；
配列番号２４のヌクレオチド配列若しくは配列番号２５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１２；
配列番号２６のヌクレオチド配列若しくは配列番号２７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１３；
配列番号２８のヌクレオチド配列若しくは配列番号２９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１４；
配列番号３０のヌクレオチド配列若しくは配列番号３１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１５；
配列番号３２のヌクレオチド配列若しくは配列番号３３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１６；
配列番号３４のヌクレオチド配列若しくは配列番号３５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１７；
ＤＥＲＡ１８は配列番号３６のヌクレオチド配列若しくは配列番号３７のアミノ酸配列を含むアルドラーゼであり；
配列番号３８のヌクレオチド配列若しくは配列番号３９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１９；
配列番号４０のヌクレオチド配列若しくは配列番号４１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２０；
配列番号４２のヌクレオチド配列若しくは配列番号４３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２１；
配列番号４４のヌクレオチド配列若しくは配列番号４５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２２；
配列番号４６のヌクレオチド配列若しくは配列番号４７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２３；
又は前記アルドラーゼの何れかのアミノ酸配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を有するアルドラーゼ。
【請求項６】
前記アルドラーゼが以下の群の１つから選択される、請求項４に記載の方法；
配列番号２のアミノ酸配列に対する少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号５のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号１１のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号２５のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性；及び
配列番号２７のアミノ酸配列に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性。
【請求項７】
アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合に対するｐＨが、４．５から１０、好ましくは５から１０の範囲に維持され、より好ましくは、ｐＨがｐＨ範囲５から８の緩衝液を用いて維持される、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
ホスファート緩衝液がアルドール縮合を触媒するために使用される、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドを接触させる工程を含む、
式ＩＶの化合物
【化２】
（Ｒ１は下記に定義のとおりである。）
を形成させるために、アルドラーゼによって触媒されるアルドール縮合条件下で、式ＩＩＩの基質Ｒ１ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）をアセトアルデヒドと反応させるための、アルドラーゼの使用。
【請求項１０】
前記アルドラーゼが２−デオキシリボース−５−リン酸アルドラーゼ、好ましくは、
配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０１；
配列番号３若しくは配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０２；
配列番号６のヌクレオチド配列又は配列番号７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０３；
配列番号８のヌクレオチド配列又は配列番号９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０４；
配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０５；
配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０６；
配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０７；
配列番号１６のヌクレオチド配列又は配列番号１７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０８；
配列番号１８のヌクレオチド配列又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ０９；
配列番号２０のヌクレオチド配列又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１０；
配列番号２２のヌクレオチド配列又は配列番号２３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１１；
配列番号２４のヌクレオチド配列又は配列番号２５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１２；
配列番号２６のヌクレオチド配列又は配列番号２７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１３；
配列番号２８のヌクレオチド配列又は配列番号２９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１４；
配列番号３０のヌクレオチド配列又は配列番号３１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１５；
配列番号３２のヌクレオチド配列又は配列番号３３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１６；
配列番号３４のヌクレオチド配列又は配列番号３５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１７；
ＤＥＲＡ１８は配列番号３６のヌクレオチド配列又は配列番号３７のアミノ酸配列を含むアルドラーゼであり；
配列番号３８のヌクレオチド配列又は配列番号３９のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ１９；
配列番号４０のヌクレオチド配列又は配列番号４１のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２０；
配列番号４２のヌクレオチド配列又は配列番号４３のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２１；
配列番号４４のヌクレオチド配列又は配列番号４５のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２２；
配列番号４６のヌクレオチド配列又は配列番号４７のアミノ酸配列を含むＤＥＲＡ２３；
である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アルドラーゼが生きた完全細胞内に含まれ、又は不活化された完全細胞内に含まれ、又は均質化された完全細胞内に含まれ、又は無細胞抽出物内に含まれ、又は精製された酵素であり、又は固定化されており、又は細胞外に発現されたタンパク質の形態である、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
酸化によって、式ＩＶの化合物
【化３】
を式Ｖの化合物へ転化させる工程を含む、
式Ｖの化合物
【化４】
（Ｒ１は、請求項１に定義されている。）
を調製する方法。
【請求項１３】
酸化がＢｒ２及びＢａＣＯ３を用いて行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）式ＩＩの化合物Ｒ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２Ｏ２ＣＲ２（Ｒ２は、下記に定義されている。）を溶媒と及びオゾンと接触させる工程、並びに
ｂ）工程ａ）から得られたオゾニドを加水分解する工程、
を含む、式ＩＩＩ’のアルデヒドＲ２ＣＯ２ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ２は、ｎ−プロピル、シクロヘキシル、フェニル、モルホリン、ピロリジン及びイミダゾールを除く請求項１に定義されているＲ１である。）を作製する方法。
【請求項１５】
工程ａ）の溶媒がジクロロメタンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ２が、Ｃ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシ（ｎ−プロピル、シクロヘキシルを除く。）であり、好ましくはＲ２がＣＨ３である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）が−５０から−９０℃の範囲の温度で実施され、及び／又は工程ｂ）が室温で実施される、請求項１４から１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程ａ）の得られたオゾニドを硫化メチルと接触させることによって、工程ｂ）が実施される、請求項１４から１７に記載の方法。
【請求項１９】
式ＩＶ又はＶに記載の化合物
【化５】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）。
【請求項２０】
Ｒ１がＣ１−Ｃ６アルキル又はアルコキシ、好ましくは、Ｒ１がＣＨ３である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
ａ）式ＶＩの化合物
【化６】
を得るために、保護基Ｒ３によって、４位の水酸基において、式Ｖの化合物
【化７】
（Ｒ１は、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル又はヘテロアリールアルキルである。）
を保護する工程、
ｂ）スタチン又は医薬として許容されるその誘導体を作製するのに十分な条件下で、式ＶＩの前記化合物を反応させる工程、
を含む、スタチン又はその誘導体を作製する方法。
【請求項２２】
工程ｂ）の条件が、アルデヒドへのＶＩの転化によって、及びスタチン又はその誘導体を得るための適切なホスホニウム塩とのこのアルデヒドのＷｉｔｔｉｇカップリングによって設定され、
ｂ１）式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る工程、
ｂ２）式Ｘの化合物
【化８】
を得るために、式ＩＸを有するホスホニウム塩を得る工程、
【化９】
（Ｒｘ、Ｒｙ及びＲｚは同一又は別異であり、並びに場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８アルキル又はＣ３−Ｃ６シクロアルキル又はＣ１−Ｃ８アルケニル又はＣ５−Ｃ６シクロアルケニル又はアリールから選択され、
並びにＸは陰イオン、好ましくは、ハロゲン又はカルボキシラート陰イオン、より好ましくは、塩化物、臭化物又はトリフルオロアセタートである。）
ｂ３）その後、化合物Ｘをロスバスタチン又はその塩へ転化する工程、
を好ましく含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
式ＶＩの化合物から式ＶＩＩＩを有するアルデヒドを得る前記工程ｂ１）が式ＶＩＩの化合物
【化１０】
（Ｒ３は、独立に置換された又は置換されていない、シリル、ベンジル、アルキル及びアセチルから選択される保護基であり、好ましくは、Ｒ３は、場合によって置換された、Ｃ１−Ｃ８トリアルキルシリル、Ｃ１−Ｃ８ジアルキルアリールシリル、Ｃ１−Ｃ８アルキルジアリールシリルから選択され、アルキルは同一又は別異であり得、より好ましくは、保護基はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。）
を通じて行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドを接触させることによって、アセトアルデヒド及び式ＩＩＩのアルデヒドを接触させる前記工程が達成される、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
それぞれ、アルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物又は微生物の一部とアセトアルデヒド及び式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４は、下記に定義されているとおりである。）を接触させる工程を含む、
式ＸＶの化合物
【化１１】
（Ｒ４は、それぞれ及び独立に置換された又は置換されていない、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、請求項１に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法。
【請求項２６】
アルドール縮合が触媒されるように、接触工程が行われる、請求項２４から２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アセトアルデヒドと式ＸＩＶのアルデヒドＲ４ＣＨ２ＣＨＯ（Ｒ４が下記に定義されている。）を、アルドール縮合を触媒する酵素と接触させることを含み、前記酵素が完全細胞触媒の形態であり、前記完全細胞触媒がアルドラーゼの生物学的に活性な形態を過剰発現する微生物である、
式ＸＶの化合物
【化１２】
（Ｒ４は、ＯＣＯＲ１（Ｒ１は、請求項１に定義されているとおりである。）、塩化物、水素、それぞれ及び独立に、置換された又は置換されていない、アリルオキシ及びベンジルオキシである。）
を調製する方法。
【請求項２９】
前記微生物が、好ましくはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクボタシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる属の群から選択される細菌であり、より好ましくは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が使用される、請求項２４から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物が、好ましくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からなる属の群から選択される酵母である、請求項２４から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの前記化合物が９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する、請求項１から８、１２から１３、２１から２４又は２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
それぞれ、９９．８％若しくはそれ以上の鏡像異性体過剰及び／又は９８％若しくはそれ以上のジアステレオマー異性体過剰を有する、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩの化合物。
【図１】
【公表番号】特表２０１１−５１００３８（Ｐ２０１１−５１００３８Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４３４７３（Ｐ２０１０−５４３４７３）
【出願日】平成２１年１月２０日（２００９．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０５８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９２７０２
【国際公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２０日（２００９．１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０５８３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９２７０２
【国際公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【出願人】（５０４３５９２９３）レツク・フアーマシユーテイカルズ・デー・デー (60)
【Ｆターム（参考）】
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