１型糖尿病の処置のための治療的ワクチン組成物
本発明は、１型糖尿病の処置および予防のための免疫原としての使用に適する修飾インスリンＢ鎖組成物を含む治療的ワクチン組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年６月２日出願の米国仮特許出願番号第６０／４７４，８５７の優先権を主張し、その開示内容は、その全体を本明細書に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、１型糖尿病の処置および予防のための免疫原性物質として用いるのに適する修飾インスリンＢ鎖成分を含む、治療的ワクチン組成物に関する。
【０００３】
発明の背景
１型糖尿病は、膵島細胞に影響を及ぼす自己免疫性疾患である。様々な膵島細胞タンパク質に対する抗体が、１型糖尿病の進行の初期段階でその疾患の血清中に発見されている。これらには、インスリン（Vardiら、(1988) Diabetes Care 11、736−739）；グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５）（Hagoplanら、(1993) Diabetes 42：631−636）に対する抗体が含まれる。１型糖尿病に罹患しているかまたは危険のある個人に対する低用量のインスリンＢ鎖の反復投与が、糖尿病の症状および患者のインスリン依存性を予防または減少することを示す証拠がある（Kellerら、(1993) Lancet 341：927−928）。インスリンＢ鎖（米国特許番号第５，８９１，４３５号および米国特許出願番号第２００３／００４５４６７号を参照のこと）またはインスリンＢ鎖の断片、特に残基９−２３（米国特許番号第５，５９４，１００号、Danielら、(1996)PNAS 93：956−960を参照のこと）での免疫は、ＮＯＤマウスにて糖尿病の発症を防ぐことが実証されている。
【０００４】
発明の概要
本発明は、インスリンＢ鎖類似体ペプチドを含む免疫原性組成物（ここで、インスリンＢ鎖の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換されている。）、ならびに糖尿病および前糖尿病状態を処置するためのかかるインスリンＢ鎖類似体の使用、に関する。本発明のある態様は、免疫原性の担体と複合体形成したインスリンＢ鎖類似体ペプチド（ここで、インスリンＢ鎖の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換されている。）を含む免疫原性組成物に関する。ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態を処置する方法であって、修飾インスリンＢ鎖類似体を含む免疫原性組成物を上記被験者に投与することを含む方法も提供する。
【０００５】
発明の詳しい説明
インスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列は、下記：
【０００６】
【表１】
である。
インスリンＢ鎖は、７位および１９位に２個のシステイニル残基を有する。これらは両方とも、インスリンＡ鎖のシステイニル残基７および２０との鎖間ジスルフィドに関与する。Ａ鎖のシステイニル残基６および１１は、鎖間ジスルフィド結合に関与する。遊離インスリンＢ鎖ペプチドまたはインスリンＢ鎖のペプチド断片９−２３は両方とも、酸化されやすいスルフヒドリル残基を含み、それは、結果としてペプチドの重合化をもたらすジスルフィド結合を形成するかもしれない。このことは、中性かまたは中性付近のｐＨ（それは、医薬的使用に最も適するｐＨである。）にて製剤中に望まれないシステイニル残基を有するかかるペプチドをもたらす。
【０００７】
本発明は、上記ペプチドのシステイニル残基の一方または両方が、その位置で置換基セリン、スレオニン、またはアラニン残基により置換されている、修飾ヒトインスリンＢ鎖ペプチドに関する。かかる修飾インスリンＢ鎖ペプチド類似体は、天然のインスリンＢ鎖の免疫模倣性等価物（immunomimic equivalent）として機能するはずであるが、中性ｐＨで保存のとき酸化重合の傾向はないはずである。アラニン、セリンまたはスレオニン置換基はいずれも、天然Ｂ鎖のそれに近い流体力学的性質を保持していなければならない。本発明の修飾ペプチドは、ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態の免疫治療的処置のための組成物に有用である。
【０００８】
インスリンＢ鎖またはインスリンＢ鎖の９−２３ペプチド断片でのヒト患者の免疫治療的処置は、米国特許番号第５，８９１，４３５号および第５，５９４，１００号、ならびに刊行された米国特許出願番号第２００３／００４５４６７に開示されており、その開示内容は出典明示によりその全体を本明細書に包含される。
【０００９】
単一のシステイン置換基（すなわち、Ｃｙｓ７およびＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｌａｌ９またはＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｌａ７およびＣｙｓｌ９）を含むペプチド類似体は、制御された酸化によるホモジスルフィド二量体などのＢ鎖二量体の製造に適する。かかる修飾インスリンＢ鎖ペプチド・ホモジスルフィド二量体類似体は、天然のインスリンＢ鎖の免疫模倣性等価物として機能するはずであるが、安定な医薬品の製剤化に悪影響をもたらす中性ｐＨで保存のときさらに酸化重合の傾向はないはずである。その他のシステイン部位のアラニン、セリンまたはスレオニン置換基のいずれかは、天然Ｂ鎖のそれに近い流体力学的性質を保持していなければならない。本発明の修飾ホモジスルフィド二量体ペプチドは、ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態の免疫治療的処置のための組成物に有用である。
【００１０】
さらに、単一のシステイン置換基（すなわち、Ｃｙｓ７およびＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｌａｌ９またはＳｅｒ／Ｔｌｌｒ／Ａｌａ７およびＣｙｓｌ９）を含む上記ペプチド類似体は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはコレラＢトキソイドなどの免疫原性のタンパク質性担体との架橋にも適する。ＤＴおよびＴＴなどの免疫原性タンパク質は、不規則なＴ細胞エピトープを担持する。インスリンＢ鎖類似体とＤＴまたはＴＴなどの免疫原性担体との架橋は、トキソイド分子のアミノ基とそれぞれのＢ鎖類似体の単一のスルフヒドリル基を介するカップリングに適する二官能性架橋剤を用いて達成され得る。かかるトキソイド結合インスリンＢ鎖エピトープは、インスリンＢ鎖またはインスリンＢ鎖類似体自体と比較して、初期の免疫応答、ならびに免疫応答のより高い維持の両方でより優れた免疫原性を提供すると予期され得る。
【００１１】
Ｂ鎖類似体およびそのトキソイド複合誘導体は、免疫原としてのその利用性を最大にするために、ミョウバンなどのアジュバントと共にまたは不完全なフロイント様エマルジョン中に製剤化され得る。
【００１２】
インスリンＢ鎖９−２３の水剤(aqueous formulation)は、ＮＯＤマウスに皮下に投与されたときインスリンに対する免疫応答を誘導し得、かつその動物モデルの糖尿病の発症を防ぎ得ることが報告されている。さらに、ＮＯＤマウスの糖尿病に対する部分的な予防が、鼻腔内に投与されたインスリンＢ鎖断片９−２３での免疫化後に得られることが報告されている。Ｂ鎖断片９−２３は１個のシステイニル残基を含み、それは、中性ｐＨまたは中性付近のｐＨで水剤中酸化的二量体化を受けることが予期され得る。原則として、二量体化は、９−２３インスリンＢ鎖断片の免疫原性特性に不利に影響しないかもしれないが、中性ｐＨ値でかまたは中性付近のｐＨ値で製造された剤形中のこの分子の薬学的な許容性を損なうであろう。インスリンＢ鎖断片９−２３の単一のシステイニル残基におけるセリン、スレオニンまたはアラニンの置換は、「天然の」９−２３断片と実質的に同じ流体力学的性質を有するが、薬学的に悪影響を及ぼす酸化二量体化の傾向のない、免疫学的に等価な分子を提供するであろう。
【００１３】
本発明の他の態様は、インスリンペプチド類似体二量体の免疫原性組成物に関する。これらの二量体にはホモ二量体が含まれ、前記二量体は、上記ペプチドそれぞれのシステイン残基のジスルフィド結合を介して２個の同一のインスリンＢ鎖類似体分子をカップリングすることにより製造されるホモ二量体または２個の異なるインスリンＢ鎖類似体分子が、システイン−システイン・ジスルフィド結合を介して結合されるヘテロ二量体を含む。例えば、ヒトインスリンＢ鎖断片９−２３のホモジスルフィド二量体は、制御された酸化により製造され得る。かかる修飾インスリンＢ鎖９−２３断片ホモジスルフィド二量体類似体は、９−２３Ｂ鎖断片単量体の免疫模倣性等価物として機能するはずであるが、中性ｐＨでの保存のとき酸化重合の傾向はないはずである。酸化重合は、安定な医薬品の製剤化に悪影響を及ぼすであろう。
【００１４】
本発明による薬学的に許容される免疫原としてのインスリンＢ鎖類似体の製造方法には、下記の実施例が含まれる：
【００１５】
実施例１
免疫原ビヒクルの選択
天然のＢ−インスリンを、プレミックスした３０：７０ 水／油の均質化により３０：７０ 油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンとして製剤化することができる。連続油相を、マンニドモノオレエート（Mannide monooleate、ＭＭＯ）、ポリオキシル−４０−水添ヒマシ油（ＰＯＣＯ）、または同様の両親媒性物質およびそれらの混合物などの乳化剤と共に適当に製剤化されたスクワレン、スクアラン、またはスクアランおよびスクワレンの組合せから製造することができる。別法にて、天然のＢ−インスリンを、乳化剤、例えば、マンニドモノオレエート、ポリオキシル−４０−水添ヒマシ油、または同様の両親媒性物質およびそれらの混合物と共に剤形化された、鉱物油が基礎のプレミックスした５０：５０ 水／油の均質化による５０：５０ ｗ／ｏエマルジョンとして製剤化することができる。油中水エマルジョン中連続油相として用いるのに適する製剤は、ＳＥＰＰＩＣ（パリ、フランス）によりマンニド製剤として市販されている。
【００１６】
得られた油中水型エマルジョンは、ＮＯＤマウスもしくは前糖尿病ラット、または前糖尿病患者もしくは糖尿病患者を免疫化するために用いられ得、そしてその免疫応答を比較する。
【００１７】
油中水型エマルジョンはまた、水性天然インスリンＢ鎖のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を、プレミックスしたが均質化していない３０：７０ 水／油として適切に製剤化された油性ビヒクルと共に混合することにより製造され得る。その後、上記プレミックスを、ＮＯＤマウスまたは前糖尿病ラットモデル、または前糖尿病患者または糖尿病患者に免疫化する前に、手で激しく振るかまたは約３０から１２０秒間ボルテックスする。
【００１８】
さらに、「活性」油中水型エマルジョンはまた、ＰＢＳ中天然インスリンＢ鎖と、３０：７０ 水：油（ｗ／ｏ）の割合で適当に剤形された油性ビヒクルプレミックスとを均質化することにより提供され得、その後「活性」エマルジョンを、同様に製造された「プラセボ」エマルジョンで「活性」エマルジョンを希釈することにより所望の強度に調整する。故に、「抗原」用量および「アジュバント」用量の割合は、免疫原性応答を最大にし、かつ注射部位における炎症反応を最小にするために最適化され得る、免疫原性組成物を提供するために修正され得る。製剤成分比率および分散（水）相および連続（油）相の水：油比率は、プロセシングのための剤形の強さを最適にし、かつエマルジョンの寿命を最大にするためにさらに調整され得る。様々なエマルジョンの安定性および薬学的許容性を、その水球サイズ分布、粘度、ならびに氷点下温度、冷蔵温度（２−８℃）、室温（２５℃）、およびより高いよりストレスのある温度（＞４０℃）で長時間にわたり相分離することなくエマルジョンを維持する能力により評価することができる。
【００１９】
実施例２
選択的インスリン抗原剤形：
セリン、スレオニン、またはアラニンのいずれかでシステインを置換することにより、天然インスリンＢ鎖と本質的に関連する酸化重合化の可能性を排除するために適当に修飾されたインスリンＢ鎖類似体を、上記のエマルジョンに製剤化することができる。適当なインスリンＢ鎖類似体を、当技術分野で公知のいずれかの方法で作製することができ、下記：
インスリン−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）７、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号３）
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号４）
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号５）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号６）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号７）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号８）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号９）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１０）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１１）
インスリン−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）７、ＣｙＳＨｌ９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１２）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１３）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１４）
インスリン−ＣｙＳＨ７、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１５）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１７）
インスリン９−２３、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧ （配列番号１８）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧ （配列番号１９）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧ （配列番号２０）
が含まれる。
【００２０】
これらのインスリンＢ鎖類似体は、１型糖尿病の処置のための治療的ワクチンまたは免疫寛容原（toleragen）として使用される薬学的に許容される担体と共に製剤化され得る。前記インスリンＢ鎖類似体はまた、ミョウバンまたはトキソイドなどの免疫原性担体と共に投与されるか、またはトキソイドなどの免疫原性担体と直接的に複合体形成され、そして薬学的に許容される担体（所望により許容されるアジュバントを含んでいて良い。）中で製剤化されて投与され得る。治療的ワクチンまたは免疫寛容原（tolerogen）は、当技術分野で報告される処置方法を用いて投与され得る。ある態様にて、油中水型エマルジョンを、ヒト患者の糖尿病または前糖尿病状態の処置のための薬学的に許容される免疫原の製剤化に用いることができる。
【００２１】
実施例３
インスリンＢ鎖類似体−トキソイド複合体の調製
初期の免疫原性の高い抗体力価および持続性免疫応答を、不規則なＴ細胞エピトープを有する適当な免疫原性の担体タンパク質に適したインスリンＢ鎖類似体を複合体化することにより得ることができる。本発明の特定の態様にて、ヒト患者に最初にＴｈ２型ＩｇＧ、または混合Ｔｈｌ／Ｔｈ２型免疫応答を誘発する免疫原性担体を用いる。適したタンパク質担体には、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）および破傷風トキソイド（ＴＴ）が含まれる。下記のインスリンＢ鎖類似体は、トキソイドとの複合体化に適し得る：
インスリン−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）７、ＣｙＳＨｌ９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１２）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１３）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１４）
インスリン−ＣｙＳＨ７、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１５）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１７）
インスリン９−２３ＣｙＳＨ、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＣ （配列番号２１）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＣ （配列番号２２）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＣ （配列番号２３）
インスリンＣｙｓ７−２３、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体
ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧ （配列番号２４）
ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧ （配列番号２５）
ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧ （配列番号２６）
【００２２】
さらに、インスリンＢ鎖類似体 配列番号３−１１も、担体タンパク質との結合に適する。特に、アミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかにシステイン残基を有し、２から６個の中性アミノ酸残基の介在するスペーサー配列を有するかまたは有しない、インスリンＢ鎖類似体 配列番号３−１１が、担体タンパク質との結合に適する。
【００２３】
ＤＴまたはＴＴなどの免疫原性担体を、低分子量不純物および分解産物を除去するために０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．６±０．２（ＰＡ緩衝液、ｐＨ６．６）でダイアフィルトレーション（diafiltration）することにより無関係な非特異的タンパク質断片がないように精製することができる。例えば、ＤＴの例としては、上記精製ＤＴをＰＡ緩衝液、ｐＨ６．６で約２０ｍｇ／ｍｌに調整し、その後、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．６±０．２中、過剰量の二官能性架橋剤 Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドカプロレート（maleimdocaproate）（ＥＭＣＳ）で室温にて１−３時間反応させる。本目的のために、ＥＭＣＳをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、１０分かけてトキソイド水溶液に滴下する。ＥＭＣＳは、その活性なエステル基によりタンパク質トキソイドの遊離アミノ基と反応し、故に、遊離スルフヒドリル基との反応を可能とするマレイミジル基を生じる。ＥＭＣＳとの反応後、「活性化された」トキソイドを０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０±０．２（ＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０）でダイアフィルトレーションすることにより過剰な反応物質がないように精製する。ＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解されたスルフヒドリル含有インスリンＢ鎖類似体それぞれを、マレイミジル−トキソイドに加え、そして室温で一晩反応させる。類似体−ＤＴ複合体を、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２±０．２（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）でダイアフィルトレーションすることにより過剰な反応物質がないように精製する。別の態様にて、類似体ペプチドは、当技術分野で公知の方法によりシステイン残基を含むスペーサーペプチドを介してトキソイドと複合体形成され得る。
【００２４】
それぞれの場合にて、トキソイドとカップリングしたペプチド類似体の割合は、トキソイド１モル当たり類似体５から２５モルの範囲で変化し得る。薬学的に許容される複合体（ＰＢＳ中溶解性および安定性、ｐＨ７．２）を提供し、かつエマルジョンに製剤化後許容される免疫応答を誘発するための最適な類似体対トキソイド置換率を、ＮＯＤマウスまたは前糖尿病性ラットモデルを免疫化後に選択することができる。
【００２５】
実施例４
インスリンＢ鎖ホモジスルフィド二量体類似体の調製
安定な免疫原性の医薬組成物を、システインモノ置換インスリンＢ鎖類似体の制御された酸化を介する二量体の形成により得ることができる。インスリンＢ鎖のホモジスルフィド二量体類似体の製造に適するシステインモノ置換インスリンＢ鎖類似体には、本明細書にて配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６として同定されるペプチドが含まれる。それぞれの場合にて、上記選ばれたペプチドを室温でリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２±０．２に溶解する。純粋な、フィルターを通した酸素を、システイン残基の酸化二量体化を促進し、それらのそれぞれのホモジスルフィド二量体を形成させるために、ペプチド溶液に通して泡立てる。前記反応を、反応混合物をサンプリングすることにより定期的に観測し、そして逆相高速液体クロマトグラフィーにより単量体・二量体比について分析するか、または５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）との反応により残った遊離スルフヒドリル残基について分析する。
【００２６】
これらのインスリンＢ鎖ホモジスルフィド二量体類似体（要すれば許容されるアジュバントを含んでいてよい。）は、当技術分野で報告されている処置方法を用いて治療的ワクチンまたは免疫寛容原として用いられ得る。ある態様にて、最適な油中水型エマルジョンを、糖尿病または前糖尿病状態の処置のための薬学的に許容される免疫原を製剤化するために用いることができる。
【００２７】
実施例５
インスリンＢ鎖類似体ヘテロジスルフィド二量体の調製
インスリンＢ鎖類似体のヘテロジスルフィド二量体を、モノシステインＢ鎖類似体を５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応させることにより製造し得る。これは、５−チオ−２−ニトロ安息香酸で混合ジスルフィドを形成することにより、システイン残基のスルフヒドリル基を活性化し得る。ＤＴＮＢ−活性化Ｂ鎖類似体を、過剰量のＤＴＮＢおよび遊離５−チオ−２−ニトロ−安息香酸塩から精製し、その後、第二の異なるモノシステインＢ鎖類似体と反応させ、５−チオ−２−ニトロ安息香酸を除去してヘテロジスルフィドインスリンＢ鎖類似体を形成させる。活性化反応およびジスルフィド形成反応の両方を、５−チオ−２−ニトロ−安息香酸塩の除去を、４１２ｎｍでのその吸収を測定することによる分光光度法で観測することにより追跡できる。ヘテロジスルフィドインスリンＢ鎖類似体は、１型糖尿病の人々に広範な免疫応答を与え得る。ヘテロジスルフィド二量体のこの特定の形成方法を、１型糖尿病の寛容化のための免疫治療的医薬として有用なインスリンＢ鎖類似体の多様なヘテロジスルフィド二量体を製造するため、それぞれのＢ鎖類似体のいずれかの利用可能部位にアミノ酸残基のさらなる置換基を導入するために用いることができる。
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
【表５】
【００３２】
【表６】
【配列表】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年６月２日出願の米国仮特許出願番号第６０／４７４，８５７の優先権を主張し、その開示内容は、その全体を本明細書に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、１型糖尿病の処置および予防のための免疫原性物質として用いるのに適する修飾インスリンＢ鎖成分を含む、治療的ワクチン組成物に関する。
【０００３】
発明の背景
１型糖尿病は、膵島細胞に影響を及ぼす自己免疫性疾患である。様々な膵島細胞タンパク質に対する抗体が、１型糖尿病の進行の初期段階でその疾患の血清中に発見されている。これらには、インスリン（Vardiら、(1988) Diabetes Care 11、736−739）；グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ６５）（Hagoplanら、(1993) Diabetes 42：631−636）に対する抗体が含まれる。１型糖尿病に罹患しているかまたは危険のある個人に対する低用量のインスリンＢ鎖の反復投与が、糖尿病の症状および患者のインスリン依存性を予防または減少することを示す証拠がある（Kellerら、(1993) Lancet 341：927−928）。インスリンＢ鎖（米国特許番号第５，８９１，４３５号および米国特許出願番号第２００３／００４５４６７号を参照のこと）またはインスリンＢ鎖の断片、特に残基９−２３（米国特許番号第５，５９４，１００号、Danielら、(1996)PNAS 93：956−960を参照のこと）での免疫は、ＮＯＤマウスにて糖尿病の発症を防ぐことが実証されている。
【０００４】
発明の概要
本発明は、インスリンＢ鎖類似体ペプチドを含む免疫原性組成物（ここで、インスリンＢ鎖の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換されている。）、ならびに糖尿病および前糖尿病状態を処置するためのかかるインスリンＢ鎖類似体の使用、に関する。本発明のある態様は、免疫原性の担体と複合体形成したインスリンＢ鎖類似体ペプチド（ここで、インスリンＢ鎖の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換されている。）を含む免疫原性組成物に関する。ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態を処置する方法であって、修飾インスリンＢ鎖類似体を含む免疫原性組成物を上記被験者に投与することを含む方法も提供する。
【０００５】
発明の詳しい説明
インスリンのＡ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列は、下記：
【０００６】
【表１】
である。
インスリンＢ鎖は、７位および１９位に２個のシステイニル残基を有する。これらは両方とも、インスリンＡ鎖のシステイニル残基７および２０との鎖間ジスルフィドに関与する。Ａ鎖のシステイニル残基６および１１は、鎖間ジスルフィド結合に関与する。遊離インスリンＢ鎖ペプチドまたはインスリンＢ鎖のペプチド断片９−２３は両方とも、酸化されやすいスルフヒドリル残基を含み、それは、結果としてペプチドの重合化をもたらすジスルフィド結合を形成するかもしれない。このことは、中性かまたは中性付近のｐＨ（それは、医薬的使用に最も適するｐＨである。）にて製剤中に望まれないシステイニル残基を有するかかるペプチドをもたらす。
【０００７】
本発明は、上記ペプチドのシステイニル残基の一方または両方が、その位置で置換基セリン、スレオニン、またはアラニン残基により置換されている、修飾ヒトインスリンＢ鎖ペプチドに関する。かかる修飾インスリンＢ鎖ペプチド類似体は、天然のインスリンＢ鎖の免疫模倣性等価物（immunomimic equivalent）として機能するはずであるが、中性ｐＨで保存のとき酸化重合の傾向はないはずである。アラニン、セリンまたはスレオニン置換基はいずれも、天然Ｂ鎖のそれに近い流体力学的性質を保持していなければならない。本発明の修飾ペプチドは、ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態の免疫治療的処置のための組成物に有用である。
【０００８】
インスリンＢ鎖またはインスリンＢ鎖の９−２３ペプチド断片でのヒト患者の免疫治療的処置は、米国特許番号第５，８９１，４３５号および第５，５９４，１００号、ならびに刊行された米国特許出願番号第２００３／００４５４６７に開示されており、その開示内容は出典明示によりその全体を本明細書に包含される。
【０００９】
単一のシステイン置換基（すなわち、Ｃｙｓ７およびＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｌａｌ９またはＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｌａ７およびＣｙｓｌ９）を含むペプチド類似体は、制御された酸化によるホモジスルフィド二量体などのＢ鎖二量体の製造に適する。かかる修飾インスリンＢ鎖ペプチド・ホモジスルフィド二量体類似体は、天然のインスリンＢ鎖の免疫模倣性等価物として機能するはずであるが、安定な医薬品の製剤化に悪影響をもたらす中性ｐＨで保存のときさらに酸化重合の傾向はないはずである。その他のシステイン部位のアラニン、セリンまたはスレオニン置換基のいずれかは、天然Ｂ鎖のそれに近い流体力学的性質を保持していなければならない。本発明の修飾ホモジスルフィド二量体ペプチドは、ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態の免疫治療的処置のための組成物に有用である。
【００１０】
さらに、単一のシステイン置換基（すなわち、Ｃｙｓ７およびＳｅｒ／Ｔｈｒ／Ａｌａｌ９またはＳｅｒ／Ｔｌｌｒ／Ａｌａ７およびＣｙｓｌ９）を含む上記ペプチド類似体は、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）またはコレラＢトキソイドなどの免疫原性のタンパク質性担体との架橋にも適する。ＤＴおよびＴＴなどの免疫原性タンパク質は、不規則なＴ細胞エピトープを担持する。インスリンＢ鎖類似体とＤＴまたはＴＴなどの免疫原性担体との架橋は、トキソイド分子のアミノ基とそれぞれのＢ鎖類似体の単一のスルフヒドリル基を介するカップリングに適する二官能性架橋剤を用いて達成され得る。かかるトキソイド結合インスリンＢ鎖エピトープは、インスリンＢ鎖またはインスリンＢ鎖類似体自体と比較して、初期の免疫応答、ならびに免疫応答のより高い維持の両方でより優れた免疫原性を提供すると予期され得る。
【００１１】
Ｂ鎖類似体およびそのトキソイド複合誘導体は、免疫原としてのその利用性を最大にするために、ミョウバンなどのアジュバントと共にまたは不完全なフロイント様エマルジョン中に製剤化され得る。
【００１２】
インスリンＢ鎖９−２３の水剤(aqueous formulation)は、ＮＯＤマウスに皮下に投与されたときインスリンに対する免疫応答を誘導し得、かつその動物モデルの糖尿病の発症を防ぎ得ることが報告されている。さらに、ＮＯＤマウスの糖尿病に対する部分的な予防が、鼻腔内に投与されたインスリンＢ鎖断片９−２３での免疫化後に得られることが報告されている。Ｂ鎖断片９−２３は１個のシステイニル残基を含み、それは、中性ｐＨまたは中性付近のｐＨで水剤中酸化的二量体化を受けることが予期され得る。原則として、二量体化は、９−２３インスリンＢ鎖断片の免疫原性特性に不利に影響しないかもしれないが、中性ｐＨ値でかまたは中性付近のｐＨ値で製造された剤形中のこの分子の薬学的な許容性を損なうであろう。インスリンＢ鎖断片９−２３の単一のシステイニル残基におけるセリン、スレオニンまたはアラニンの置換は、「天然の」９−２３断片と実質的に同じ流体力学的性質を有するが、薬学的に悪影響を及ぼす酸化二量体化の傾向のない、免疫学的に等価な分子を提供するであろう。
【００１３】
本発明の他の態様は、インスリンペプチド類似体二量体の免疫原性組成物に関する。これらの二量体にはホモ二量体が含まれ、前記二量体は、上記ペプチドそれぞれのシステイン残基のジスルフィド結合を介して２個の同一のインスリンＢ鎖類似体分子をカップリングすることにより製造されるホモ二量体または２個の異なるインスリンＢ鎖類似体分子が、システイン−システイン・ジスルフィド結合を介して結合されるヘテロ二量体を含む。例えば、ヒトインスリンＢ鎖断片９−２３のホモジスルフィド二量体は、制御された酸化により製造され得る。かかる修飾インスリンＢ鎖９−２３断片ホモジスルフィド二量体類似体は、９−２３Ｂ鎖断片単量体の免疫模倣性等価物として機能するはずであるが、中性ｐＨでの保存のとき酸化重合の傾向はないはずである。酸化重合は、安定な医薬品の製剤化に悪影響を及ぼすであろう。
【００１４】
本発明による薬学的に許容される免疫原としてのインスリンＢ鎖類似体の製造方法には、下記の実施例が含まれる：
【００１５】
実施例１
免疫原ビヒクルの選択
天然のＢ−インスリンを、プレミックスした３０：７０ 水／油の均質化により３０：７０ 油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンとして製剤化することができる。連続油相を、マンニドモノオレエート（Mannide monooleate、ＭＭＯ）、ポリオキシル−４０−水添ヒマシ油（ＰＯＣＯ）、または同様の両親媒性物質およびそれらの混合物などの乳化剤と共に適当に製剤化されたスクワレン、スクアラン、またはスクアランおよびスクワレンの組合せから製造することができる。別法にて、天然のＢ−インスリンを、乳化剤、例えば、マンニドモノオレエート、ポリオキシル−４０−水添ヒマシ油、または同様の両親媒性物質およびそれらの混合物と共に剤形化された、鉱物油が基礎のプレミックスした５０：５０ 水／油の均質化による５０：５０ ｗ／ｏエマルジョンとして製剤化することができる。油中水エマルジョン中連続油相として用いるのに適する製剤は、ＳＥＰＰＩＣ（パリ、フランス）によりマンニド製剤として市販されている。
【００１６】
得られた油中水型エマルジョンは、ＮＯＤマウスもしくは前糖尿病ラット、または前糖尿病患者もしくは糖尿病患者を免疫化するために用いられ得、そしてその免疫応答を比較する。
【００１７】
油中水型エマルジョンはまた、水性天然インスリンＢ鎖のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を、プレミックスしたが均質化していない３０：７０ 水／油として適切に製剤化された油性ビヒクルと共に混合することにより製造され得る。その後、上記プレミックスを、ＮＯＤマウスまたは前糖尿病ラットモデル、または前糖尿病患者または糖尿病患者に免疫化する前に、手で激しく振るかまたは約３０から１２０秒間ボルテックスする。
【００１８】
さらに、「活性」油中水型エマルジョンはまた、ＰＢＳ中天然インスリンＢ鎖と、３０：７０ 水：油（ｗ／ｏ）の割合で適当に剤形された油性ビヒクルプレミックスとを均質化することにより提供され得、その後「活性」エマルジョンを、同様に製造された「プラセボ」エマルジョンで「活性」エマルジョンを希釈することにより所望の強度に調整する。故に、「抗原」用量および「アジュバント」用量の割合は、免疫原性応答を最大にし、かつ注射部位における炎症反応を最小にするために最適化され得る、免疫原性組成物を提供するために修正され得る。製剤成分比率および分散（水）相および連続（油）相の水：油比率は、プロセシングのための剤形の強さを最適にし、かつエマルジョンの寿命を最大にするためにさらに調整され得る。様々なエマルジョンの安定性および薬学的許容性を、その水球サイズ分布、粘度、ならびに氷点下温度、冷蔵温度（２−８℃）、室温（２５℃）、およびより高いよりストレスのある温度（＞４０℃）で長時間にわたり相分離することなくエマルジョンを維持する能力により評価することができる。
【００１９】
実施例２
選択的インスリン抗原剤形：
セリン、スレオニン、またはアラニンのいずれかでシステインを置換することにより、天然インスリンＢ鎖と本質的に関連する酸化重合化の可能性を排除するために適当に修飾されたインスリンＢ鎖類似体を、上記のエマルジョンに製剤化することができる。適当なインスリンＢ鎖類似体を、当技術分野で公知のいずれかの方法で作製することができ、下記：
インスリン−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）７、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号３）
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号４）
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号５）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号６）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号７）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号８）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号９）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１０）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１１）
インスリン−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）７、ＣｙＳＨｌ９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１２）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１３）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１４）
インスリン−ＣｙＳＨ７、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１５）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１７）
インスリン９−２３、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧ （配列番号１８）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧ （配列番号１９）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧ （配列番号２０）
が含まれる。
【００２０】
これらのインスリンＢ鎖類似体は、１型糖尿病の処置のための治療的ワクチンまたは免疫寛容原（toleragen）として使用される薬学的に許容される担体と共に製剤化され得る。前記インスリンＢ鎖類似体はまた、ミョウバンまたはトキソイドなどの免疫原性担体と共に投与されるか、またはトキソイドなどの免疫原性担体と直接的に複合体形成され、そして薬学的に許容される担体（所望により許容されるアジュバントを含んでいて良い。）中で製剤化されて投与され得る。治療的ワクチンまたは免疫寛容原（tolerogen）は、当技術分野で報告される処置方法を用いて投与され得る。ある態様にて、油中水型エマルジョンを、ヒト患者の糖尿病または前糖尿病状態の処置のための薬学的に許容される免疫原の製剤化に用いることができる。
【００２１】
実施例３
インスリンＢ鎖類似体−トキソイド複合体の調製
初期の免疫原性の高い抗体力価および持続性免疫応答を、不規則なＴ細胞エピトープを有する適当な免疫原性の担体タンパク質に適したインスリンＢ鎖類似体を複合体化することにより得ることができる。本発明の特定の態様にて、ヒト患者に最初にＴｈ２型ＩｇＧ、または混合Ｔｈｌ／Ｔｈ２型免疫応答を誘発する免疫原性担体を用いる。適したタンパク質担体には、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）および破傷風トキソイド（ＴＴ）が含まれる。下記のインスリンＢ鎖類似体は、トキソイドとの複合体化に適し得る：
インスリン−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）７、ＣｙＳＨｌ９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＳＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１２）
ＦＶＮＱＨＬＴＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１３）
ＦＶＮＱＨＬＡＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１４）
インスリン−ＣｙＳＨ７、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１５）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１６）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＡ （配列番号１７）
インスリン９−２３ＣｙＳＨ、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体：
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＣ （配列番号２１）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＣ （配列番号２２）
ＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＣ （配列番号２３）
インスリンＣｙｓ７−２３、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ／Ａｌａ）１９ Ｂ鎖類似体
ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＳＧＥＲＧ （配列番号２４）
ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＴＧＥＲＧ （配列番号２５）
ＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＡＧＥＲＧ （配列番号２６）
【００２２】
さらに、インスリンＢ鎖類似体 配列番号３−１１も、担体タンパク質との結合に適する。特に、アミノ末端またはカルボキシ末端のどちらかにシステイン残基を有し、２から６個の中性アミノ酸残基の介在するスペーサー配列を有するかまたは有しない、インスリンＢ鎖類似体 配列番号３−１１が、担体タンパク質との結合に適する。
【００２３】
ＤＴまたはＴＴなどの免疫原性担体を、低分子量不純物および分解産物を除去するために０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．６±０．２（ＰＡ緩衝液、ｐＨ６．６）でダイアフィルトレーション（diafiltration）することにより無関係な非特異的タンパク質断片がないように精製することができる。例えば、ＤＴの例としては、上記精製ＤＴをＰＡ緩衝液、ｐＨ６．６で約２０ｍｇ／ｍｌに調整し、その後、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．６±０．２中、過剰量の二官能性架橋剤 Ｎ−スクシンイミジル−６−マレイミドカプロレート（maleimdocaproate）（ＥＭＣＳ）で室温にて１−３時間反応させる。本目的のために、ＥＭＣＳをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、１０分かけてトキソイド水溶液に滴下する。ＥＭＣＳは、その活性なエステル基によりタンパク質トキソイドの遊離アミノ基と反応し、故に、遊離スルフヒドリル基との反応を可能とするマレイミジル基を生じる。ＥＭＣＳとの反応後、「活性化された」トキソイドを０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０±０．２（ＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０）でダイアフィルトレーションすることにより過剰な反応物質がないように精製する。ＣＣ緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解されたスルフヒドリル含有インスリンＢ鎖類似体それぞれを、マレイミジル−トキソイドに加え、そして室温で一晩反応させる。類似体−ＤＴ複合体を、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２±０．２（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）でダイアフィルトレーションすることにより過剰な反応物質がないように精製する。別の態様にて、類似体ペプチドは、当技術分野で公知の方法によりシステイン残基を含むスペーサーペプチドを介してトキソイドと複合体形成され得る。
【００２４】
それぞれの場合にて、トキソイドとカップリングしたペプチド類似体の割合は、トキソイド１モル当たり類似体５から２５モルの範囲で変化し得る。薬学的に許容される複合体（ＰＢＳ中溶解性および安定性、ｐＨ７．２）を提供し、かつエマルジョンに製剤化後許容される免疫応答を誘発するための最適な類似体対トキソイド置換率を、ＮＯＤマウスまたは前糖尿病性ラットモデルを免疫化後に選択することができる。
【００２５】
実施例４
インスリンＢ鎖ホモジスルフィド二量体類似体の調製
安定な免疫原性の医薬組成物を、システインモノ置換インスリンＢ鎖類似体の制御された酸化を介する二量体の形成により得ることができる。インスリンＢ鎖のホモジスルフィド二量体類似体の製造に適するシステインモノ置換インスリンＢ鎖類似体には、本明細書にて配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５および２６として同定されるペプチドが含まれる。それぞれの場合にて、上記選ばれたペプチドを室温でリン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２±０．２に溶解する。純粋な、フィルターを通した酸素を、システイン残基の酸化二量体化を促進し、それらのそれぞれのホモジスルフィド二量体を形成させるために、ペプチド溶液に通して泡立てる。前記反応を、反応混合物をサンプリングすることにより定期的に観測し、そして逆相高速液体クロマトグラフィーにより単量体・二量体比について分析するか、または５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）との反応により残った遊離スルフヒドリル残基について分析する。
【００２６】
これらのインスリンＢ鎖ホモジスルフィド二量体類似体（要すれば許容されるアジュバントを含んでいてよい。）は、当技術分野で報告されている処置方法を用いて治療的ワクチンまたは免疫寛容原として用いられ得る。ある態様にて、最適な油中水型エマルジョンを、糖尿病または前糖尿病状態の処置のための薬学的に許容される免疫原を製剤化するために用いることができる。
【００２７】
実施例５
インスリンＢ鎖類似体ヘテロジスルフィド二量体の調製
インスリンＢ鎖類似体のヘテロジスルフィド二量体を、モノシステインＢ鎖類似体を５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と反応させることにより製造し得る。これは、５−チオ−２−ニトロ安息香酸で混合ジスルフィドを形成することにより、システイン残基のスルフヒドリル基を活性化し得る。ＤＴＮＢ−活性化Ｂ鎖類似体を、過剰量のＤＴＮＢおよび遊離５−チオ−２−ニトロ−安息香酸塩から精製し、その後、第二の異なるモノシステインＢ鎖類似体と反応させ、５−チオ−２−ニトロ安息香酸を除去してヘテロジスルフィドインスリンＢ鎖類似体を形成させる。活性化反応およびジスルフィド形成反応の両方を、５−チオ−２−ニトロ−安息香酸塩の除去を、４１２ｎｍでのその吸収を測定することによる分光光度法で観測することにより追跡できる。ヘテロジスルフィドインスリンＢ鎖類似体は、１型糖尿病の人々に広範な免疫応答を与え得る。ヘテロジスルフィド二量体のこの特定の形成方法を、１型糖尿病の寛容化のための免疫治療的医薬として有用なインスリンＢ鎖類似体の多様なヘテロジスルフィド二量体を製造するため、それぞれのＢ鎖類似体のいずれかの利用可能部位にアミノ酸残基のさらなる置換基を導入するために用いることができる。
【００２８】
【表２】
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
【表５】
【００３２】
【表６】
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンＢ鎖の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換されている、インスリンＢ鎖類似体ペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
第一のインスリンＢ鎖ペプチド類似体の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換され、かつ残りのシステインが、ジスルフィド結合により第二のインスリンＢ鎖分子のシステインと結合している、第一のインスリンＢ鎖ペプチド類似体を含むインスリンＢ鎖類似体ペプチド二量体。
【請求項３】
インスリンＢ鎖類似体が、配列番号３−２６からなる群から選択されるペプチドである、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
第一のインスリンＢ鎖ペプチド類似体が、配列番号１２−１６および２１−２６からなる群から選択される、インスリンＢ鎖類似体ペプチド二量体。
【請求項５】
インスリンＢ鎖類似体ペプチドが、免疫原性の担体と複合体を形成している、請求項１または３記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
請求項２または４記載の二量体および免疫原性の担体を含んで成る、免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項１、２、３または４記載の組成物を被験者に投与することを含んで成る、ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態を処置する方法。
【請求項１】
インスリンＢ鎖の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換されている、インスリンＢ鎖類似体ペプチドを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
第一のインスリンＢ鎖ペプチド類似体の２個のシステイン残基のうち少なくとも１個が、セリン、スレオニンまたはアラニン残基により置換され、かつ残りのシステインが、ジスルフィド結合により第二のインスリンＢ鎖分子のシステインと結合している、第一のインスリンＢ鎖ペプチド類似体を含むインスリンＢ鎖類似体ペプチド二量体。
【請求項３】
インスリンＢ鎖類似体が、配列番号３−２６からなる群から選択されるペプチドである、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
第一のインスリンＢ鎖ペプチド類似体が、配列番号１２−１６および２１−２６からなる群から選択される、インスリンＢ鎖類似体ペプチド二量体。
【請求項５】
インスリンＢ鎖類似体ペプチドが、免疫原性の担体と複合体を形成している、請求項１または３記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
請求項２または４記載の二量体および免疫原性の担体を含んで成る、免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項１、２、３または４記載の組成物を被験者に投与することを含んで成る、ヒト被験者の糖尿病または前糖尿病状態を処置する方法。
【公表番号】特表２００６−５２６６５１（Ｐ２００６−５２６６５１Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１５０５８（Ｐ２００６−５１５０５８）
【出願日】平成１６年６月１日（２００４．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１０３７３
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０５４４４９１６）マーシア・ファーマ・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｉａ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２４日（２００６．１１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１日（２００４．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１１０３７３
【国際公開日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【出願人】（５０５４４４９１６）マーシア・ファーマ・インコーポレイテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｉａ Ｐｈａｒｍａ， Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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