１，３−プロパンジオールの製造方法
【課題】グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際に、遺伝子組み換え大腸菌を利用して、１，３−プロパンジオールの生産性を向上させる１，３−プロパンジオールの製造方法を提供する。
【解決手段】少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法。
【解決手段】少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−プロパンジオールの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、ポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとして、また環状化合物の合成用出発材料としてなど、広範な用途を有する有用な化合物である。
【０００３】
１，３−プロパンジオールの製造方法は、大別して、化学合成法と微生物発酵法とがあり、化学合成法としては、アクロレインを原料とするＤｅｇｕｓｓａ法と、エチレンオキシドを原料とするＳｈｅｌｌ法とが挙げられる。
【０００４】
【化１】
【０００５】
【化２】
【０００６】
一方、微生物発酵法としては、例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する嫌気性菌などを利用する方法、遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法が挙げられる（例えば、特許文献１，２を参照）。
【０００７】
非特許文献１には、嫌気性菌などを利用する方法として、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を用い、グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子（以下「ＧＤ／ＧＤＲ」と略す場合もある）を添加し、グリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、さらに、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（以下「ＰＤＨ」と略す場合もある）を添加して、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換して、１，３−プロパンジオールを得る方法が記載されている。非特許文献１に記載の方法は、一般的なグリセロールからの嫌気発酵による方法のため、厳密に酸素を遮断する必要があり、工業生産には不向きである。
【０００８】
また、特許文献１には、遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法として、グルコースを原料として、出芽酵母（Ｓａｃｃｈｓｔｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離された、グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）ホスファターゼをコードする遺伝子ＤＡＲ１，ＧＰＰ１と、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離された、グリセロールデヒドラターゼとをコードする遺伝子ｄｈａＢ１，ｄｈａＢ２，ｄｈａＢ３と、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子ｏｒｆＸ，ｏｒｆＺと、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子ｄｈａＴとが組み換えられた大腸菌株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を使用して、グルコースを原料として、１，３−プロパンジオールへ転換し、１，３−プロパンジオールを得る方法が記載されている。
【０００９】
特許文献２には、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子およびまたはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得て、この３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造する方法が記載されている。すなわち、特許文献２に記載の方法は、化学的合成方法も含まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００６−５１２９０７号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２５３３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．２０，８２−８６（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、発酵性基質から１，３−プロパンジオールを製造する際に、遺伝子組み換え大腸菌を利用して、１，３−プロパンジオールの生産性を向上させる１，３−プロパンジオールの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示す本発明に至った。
【００１４】
（１）少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１５】
（２）少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１６】
（３）グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１７】
（４）微好気培養条件下で１，３−プロパンジオールを製造する、上記（１）から（３）のいずれか１つに記載の１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１８】
（５）グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子とアデノシルトランスファラーゼを含んでなる菌体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であって、宿主大腸菌として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからなる群から選択される単一種である、上記（１）から（４）のいずれか１つに記載の１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法により、従来の方法より更に、１，３−プロパンジオールの生産量が増大する方法が提供された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法について、以下に説明する。
【００２１】
［１，３−プロパンジオールの製造方法］
本実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法は、少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、グリセロールを単一の炭素源した培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００２２】
本実施の形態における他の１，３−プロパンジオールの製造方法は、グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体に、グリセロールを単一の炭素源した培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００２３】
本実施の形態において、グリセロールデヒドラターゼは、特に制限されることなく、この酵素を有する／発現するいずれの源由来であってもよい。具体的には、Klebsiella属、Citrobacter属、Clostridium属、Lactobacillus属、Enterobacter属、 Caloramator属、Salmonella属及びListeria属に属する微生物があり、より詳しくは、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter pneumoniae、Clostridium pasteurianum、Lactobacillus leichmannii、Citrobacter intermedium、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus brevis、Enterobacter agglomerans、Clostridium butyricum、Caloramator viterbensis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus hilgardii、Salmonella typhimurium、Listeria monocytogenes、及びListeria innocua由来のグリセロールデヒドラターゼなどが挙げられる。これらのグリセロールデヒドラターゼは、単独で使用されてもあるいは２以上の混合物として使用されてもよい。
【００２４】
上記起源からグリセロールデヒドラターゼを単離する方法は、特に制限されることなく、抽出、カラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）等の、公知の酵素の分離・単離方法と同様にして、上記したようないずれかの微生物から単離できる。
【００２５】
本発明において、「グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」とは、グリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋Ｈ２Ｏの反応を触媒して失活したデヒドラターゼの活性を再度促す（再活性化する）因子を意味する。より詳細には、デヒドラターゼが触媒するグリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋Ｈ２Ｏの反応には、補酵素Ｂ１２が関与しているが、グリセロールデヒドラターゼは、グリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋Ｈ２Ｏの反応を展開・触媒すると、補酵素Ｂ１２がつぶれて、活性中心が失活してしまうが、ここでグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がつぶれた補酵素Ｂ１２を新たな補酵素Ｂ１２と置換して、グリセロールデヒドラターゼの活性を再度促して（再活性化して）、グリセロールデヒドラターゼをグリセロールの脱水反応に再使用できるようにする。このようにグリセロールデヒドラターゼを再活性化する作用を有するものを、本発明においては、「グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」と称する。このグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子は、上記したような作用を有するものであれば、特に制限されることなく、公知の、不活化したグリセロールデヒドラターゼを活性化するグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子が使用される。
【００２６】
ここで、「グリセロールデヒドラターゼ」を以下「ＧＤ」と略し、「グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」を以下「ＧＤＲ」と略す場合もある。また、「グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」を、以下「ＧＤ／ＧＤＲ」と略す場合もある。
【００２７】
本願発明者らは、グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを組み込んだ遺伝子組み換え大腸菌を、グリセロールを単一の炭素源した培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールの生産量が向上することを見出した。
【００２８】
本実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法は、微好気培養条件下で、前記菌体を培養する。ここで、本明細書における「微好気培養」とは、溶存酸素濃度／飽和酸素濃度を１／１０００〜１／１０として培養することをいい、嫌気培養に比べ好気性の培養をいう。溶存酸素濃度／飽和酸素濃度は好ましくは１／５００〜１／３０であり、更に好ましくは１／２００〜１／４０である。ここで、本明細書における『微好気培養条件』は、１，３−プロパンジオールの製造工程において少なくとも一定時間維持されていれば良く、必ずしも１，３−プロパンジオールの製造工程において継続的に維持される場合のみに限定されない。
【００２９】
また、本実施の形態において、利用できる宿主大腸菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからなる群から選択される単一種である。
【００３０】
本実施の形態において、「グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体」として、例えば、プラスミドｐＳＰＫＧＲＴで、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０を形質転換した、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐＳＰＫＧＲＴ）を用いることができ、表１に示すような遺伝子が導入された遺伝子組み換え大腸菌株である。
【００３１】
【表１】
【００３２】
ここで、表１に示す「ｄｈａＢ１」および「ｄｈａＢ２」および「ｄｈａＢ３」は、グリセロールデヒドラターゼの機能的に結合した活性をコードする遺伝子であり、いずれも、クレブシエラ・ニューモニエ由来である。また、表１に示す「ｏｒｆＸ」と「ｏｒｆＺ」は、デヒドラターゼ再活性遺伝子をコードする遺伝子であり、「ｄｈａＴ」は、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子であり、いずれも、クレブシエラ・ニューモニエ由来である。また、表１に示す「ＫｏＡＤＴ」は、アデノシルトランスフェラーゼの機能的に結合した活性をコードする遺伝子であり、クレブシエラ・オキシトカ由来である。
【００３３】
本実施の形態において発酵性基質としては、次に示すような一般的な炭素源より、使用する宿主微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
糖類：
グルコース、
フルクトース、
マルトース、
ガラクトース。
天然炭水化物：
澱粉、
澱粉加水分解物、
糖蜜、
廃糖蜜、
麦、
とうもろこしなど。
アルコール類：
グリセロール、
メタノール、
エタノールなど。
脂肪酸類：
酢酸、
グルコン酸、
ピルビン酸、
クエン酸など。
アミノ酸類：
グリシン、
グルタミン、
アスパラギンなど。
炭化水素類：
ノルマルパラフィンなど。
【００３４】
培地に添加するエタノールアミンまたは２−アミノプロパン−１−オンは、例えば、０．１から５ｇ／Ｌであり、好ましくは、１．０〜１．５ｇ／Ｌである。
【００３５】
ここで、本実施の形態における培地組成として、公知の培養組成を用い、先に示した１，３−プロパンジオール生産能を有する菌体について、当業者が適宜培地組成を選択することができる。本実施の形態の培地として、例えば、本発明の好ましい生育培養液は、ＬＢ培地、ＳＤ培地、ＹＭ培地などの一般的な培地等が用いられる。
【００３６】
培地に添加される、炭素源でもあり原料であるグリセロールの濃度は、３０〜８０ｇ／Ｌの範囲から添加量を選択することによって、過不足が避けられる。
【００３７】
グリセロールに加えて、培地には、窒素源が加えられる。本実施の形態において、窒素原としては、上述したように、エタノールアミンまたは２−アミノ−１−プロパノールを必須成分とし、さらに、適宜、通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物が用いられる。好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。より好ましい窒素源はアルギニン、シトルリン、オルニチン、リジン、酵母エキス、ペプトン類である。
【００３８】
さらに、炭素源のグリセロールや上記窒素源に加えて、本実施の形態に用いる菌体または菌体処理物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。例えば、上述したビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を必須成分として、その他に、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、偏性嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。例えば、無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
【００３９】
無機化合物として、例えば、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウムが挙げられる。
【００４０】
また、ビタミン類として、必須成分のビタミンＢ１２の他に、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、チオオクト酸、ｐ−アミノ安息香酸が挙げられる。
【００４１】
これらの無機化合物やビタミン類、あるいは増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法は公知である。従って、適宜製造方法にしたがって、培養液を作製する。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。本実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法において、好ましい培地の形態は、液体培地である。
【００４２】
本実施の形態における菌体の培養は、上述した微好気培養条件下であることを除き、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム (continuous fermentation system)も使用できる。
【００４３】
本実施の形態における菌体の培養において、連続培養システム内へ所定量の酸素を混入させて微好気条件にする。培養器は通常用いられる培養槽がそのまま利用できる。嫌気性微生物の培養にも利用することができる培養タンクは市販されており、培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは基質ガスなどで置換することにより、上述した範囲の微好気の雰囲気を作ることができる。
【００４４】
例えば、嫌気培養ジャー(anaerobic jar)を、嫌気性微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。さらに、嫌気培養ジャーは、嫌気培養ジャー内部の空間や培養液中に含まれる分子状酸素を除去するための機構を備えることができる。例えば、窒素、ヘリウム、水素、炭酸ガスなどを底部から通気攪拌することで、内部を嫌気状態に維持することができる。
【００４５】
本実施の形態において、培養槽に、付加的な機能を与えることができる。例えば、通常使用される撹拌混合槽のほか、気泡塔型、ドラフトチューブ型の培養槽も利用できる。液体培地に吹き込まれる混合気体によって菌体または菌体処理物は遊離分散され、菌体または菌体処理物と培地を十分に接触させることができる。また、バイオトリックリングフィルター（biotrickling filter）のように通気性の高いスラグ、その他セラミック系の無機充てん物、あるいはポリプロピレン等の有機合成物質の充てん層に、水分を滴らせながら菌体または菌体処理物を生息させ、そこにガスを通気しながら培養することもできる。さらに、使用する菌体または菌体処理物は常法によりカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、アクリルアミドゲル、キチン、セルロース、寒天などに固定化して用いることもできる。
【００４６】
本実施の形態では、当業者が、培養された菌体または菌体処理物と培養生成液を分離するため、公知の方法を用いることができる。好ましい分離の方法は、濾過性能、濃縮性能を有するホローファイバー型限外濾過あるいは精密濾過膜を利用する方法である。また、菌体または菌体処理物と該生成液の分離に十分な濾過速度を得るためには使用する菌体または菌体処理物に応じて適当な分画分子量の膜を選択すれば良い。培養槽から限外濾過膜を通して分離された培養液から１，３−プロパンジオールを回収することができる。回収された１，３−プロパンジオールの精製方法は公知であり、例えば、培養物を遠心分離などで菌体を除き、上清を減圧下に濃縮、乾固後、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ハロゲン系などの有機溶媒で抽出する。抽出液をさらにシリカゲルクロマトグラフィーや晶析などの操作を行うことで精製できる。培養槽の形状によっては、培地を十分撹拌するため、撹拌機等を利用することもできる。培養槽内の培養物を攪拌することによって、培地成分や必要なガスを嫌気性微生物に接触させる機会を増やして、１，３−プロパンジオールの生成効率を最適化することができる。また水素、窒素、炭酸ガスなどの単一あるいは混合ガスをマイクロあるいはナノバブルとして供給することもできる。
【００４７】
菌体または菌体処理物の十分な生育のため、培養物のｐＨは、３．０〜９．０が好ましく、５．５〜８．５がより好ましい。また、１，３−プロパンジオールの回収量を増加させるため、培養槽の温度は特に制限されるものではないが、２８〜３７℃を好ましい温度、３２℃〜３４℃をより好ましい温度として挙げることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４９】
以下、各実施例においては、以下の方法により、グリセロール、１，３−プロパンジオールの定量を行った。
【００５０】
グリセロール、１，３−プロパンジオールの定量：
培養液１ｍＬを遠心分離して除菌した後、０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜で濾過して高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。
【００５１】
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ (８．０ｍｍ×３００ｍｍ)
移動相：１０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４水溶液
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：屈折率（ＲＩ）
保持時間：グリセロールが１４．８分、１，３−プロパンジオールが１９．０分である。
【００５２】
培養時のＯＤ６００の測定：
培養液を水で４７倍希釈したのち、BioRad社製 SmartSpec3000を用いて、６００ｎｍにおける濁度を測定した。
【００５３】
［実施例１］（１，３−プロパンジオール生合成遺伝子を含有するプラスミドの構築）
Klebsiella pneumoniae ATCC25955から抽出したゲノムを鋳型にして、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（配列番号１）、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子（配列番号２）、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（配列番号３）をそれぞれＰＣＲ増幅させた。次に、Klebsiella oxytoca ATCC 8724 から抽出したゲノムを鋳型にして、アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号４）をＰＣＲ増幅させた。得られた各ＤＮＡ断片をpSE420U（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、WO 2006/132145）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換株を、アンピシリンを含むＬＢ培地で生育させ、生育した形質転換体からプラスミドを抽出し、全ての遺伝子が挿入されている事が確認できたプラスミドをｐＳＰＫＧＲＴとした。
【００５４】
［実施例２］（フラスコ培養による１，３−プロパンジオールの生産）
実施例１により得られたｐＳＰＫＧＲＴで、Ｗ３１１０、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５αを形質転換し、生産菌株を作製した。次に、各菌株を７ｍＬのＬＢ培地で生育させて前培養液を調製し、そのうちの２．５ｍＬを１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。なお、１，３−プロパンジオール生産培地は、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコに５０ｍＬを仕込んだ。
【００５５】
培地組成は、６０ｇ／Ｌ グリセロール、６．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ 酵母エキス（極東）、３．０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７水和物、１．０ｇ／Ｌ クエン酸、１．０ｇ／Ｌ エタノールアミン、ミネラル溶液 １０ｍＬ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ シアノコバラミン、０．０２ｍＭ ＩＰＴＧ、ｐＨ ７．５とした。ミネラル溶液は、２ｇのニトリロ三酢酸を３００ｍＬのイオン交換水で溶解し、ＫＯＨでｐＨ ６．０に調整した後、１ｇのＭｎＳＯ４・１水和物、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６水和物、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６水和物、０．００２ｇのＺｎＳＯ４・７水和物、０．０２ｇのＣｕＳＯ４・２水和物、０．０２ｇのＮｉＣｌ２・６水和物、０．０２ｇのＮａ２ＭｎＯ４・２水和物、０，０２ｇのＮａ２ＳｅＯ４、０．０２ｇのＮａ２ＷＯ４を溶解させ、イオン交換水で１Ｌとした。
【００５６】
前培養液を植菌した後、温度を３３℃、回転速度を１４５ｒｐｍとして、培養を開始した。１６時間後、ＯＤ６００が２〜４になった事を確認した後、回転速度を７０ｒｐｍに下げて培養を継続した。培養中の１，３−プロパンジオールの生産濃度を表１に示した。比較例として、１４５ｒｐｍで培養を継続した結果を表２に示し、エタノールアミン無添加の培地で実施例１と同様に培養した結果を表３に示した。微好気条件で培養する事により生産量が増え、さらにエタノールアミンを添加する事により生産量が増えた。
【００５７】
【表２】
【００５８】
［比較例１］
回転速度を終始１４５ｒｐｍとして培養を行った以外は、実施例２に準拠して行った。結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
［比較例２］
エタノールアミンを添加しなかった以外は、実施例２に準拠して行った。結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】
［実施例３］（ミニジャーによる１，３−プロパンジオールの生産）
実施例２で調製したＷ３１１０（ｐＳＰＫＧＲＴ）およびＪＭ１０９（ｐＳＰＫＧＲＴ）を５０ｍＬのＬＢ培地で生育させて前培養液を調製し、１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。植菌量は１４ｍＬとし、生産培地は１．２Ｌとした。生産培地の成分は、実施例２と同じである。植菌後、温度を３３℃、撹拌速度を６００ｒｐｍ、通気量を０．５ｖｖｍ、ｐＨを７．２で制御しながら培養を開始し、ＯＤ６００が２〜３になった時点から、溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の２％になるように撹拌速度をコントロールしながら培養を継続した。培養中の１，３−プロパンジオールの生産量を表５に示した。
【００６３】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，３−プロパンジオールの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、ポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとして、また環状化合物の合成用出発材料としてなど、広範な用途を有する有用な化合物である。
【０００３】
１，３−プロパンジオールの製造方法は、大別して、化学合成法と微生物発酵法とがあり、化学合成法としては、アクロレインを原料とするＤｅｇｕｓｓａ法と、エチレンオキシドを原料とするＳｈｅｌｌ法とが挙げられる。
【０００４】
【化１】
【０００５】
【化２】
【０００６】
一方、微生物発酵法としては、例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属に属する嫌気性菌などを利用する方法、遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法が挙げられる（例えば、特許文献１，２を参照）。
【０００７】
非特許文献１には、嫌気性菌などを利用する方法として、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を用い、グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子（以下「ＧＤ／ＧＤＲ」と略す場合もある）を添加し、グリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得、さらに、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（以下「ＰＤＨ」と略す場合もある）を添加して、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換して、１，３−プロパンジオールを得る方法が記載されている。非特許文献１に記載の方法は、一般的なグリセロールからの嫌気発酵による方法のため、厳密に酸素を遮断する必要があり、工業生産には不向きである。
【０００８】
また、特許文献１には、遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法として、グルコースを原料として、出芽酵母（Ｓａｃｃｈｓｔｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離された、グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）ホスファターゼをコードする遺伝子ＤＡＲ１，ＧＰＰ１と、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離された、グリセロールデヒドラターゼとをコードする遺伝子ｄｈａＢ１，ｄｈａＢ２，ｄｈａＢ３と、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子ｏｒｆＸ，ｏｒｆＺと、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子ｄｈａＴとが組み換えられた大腸菌株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を使用して、グルコースを原料として、１，３−プロパンジオールへ転換し、１，３−プロパンジオールを得る方法が記載されている。
【０００９】
特許文献２には、ジオールデヒドラターゼおよび／またはグリセロールデヒドラターゼならびにジオールデヒドラターゼ再活性化因子およびまたはグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を含んでなる菌体および／または菌体処理物を用いて、グリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得て、この３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを液相において酵素を使用しない化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造する方法が記載されている。すなわち、特許文献２に記載の方法は、化学的合成方法も含まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００６−５１２９０７号公報
【特許文献２】特開２００５−１０２５３３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．２０，８２−８６（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、発酵性基質から１，３−プロパンジオールを製造する際に、遺伝子組み換え大腸菌を利用して、１，３−プロパンジオールの生産性を向上させる１，３−プロパンジオールの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下に示す本発明に至った。
【００１４】
（１）少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１５】
（２）少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１６】
（３）グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１７】
（４）微好気培養条件下で１，３−プロパンジオールを製造する、上記（１）から（３）のいずれか１つに記載の１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００１８】
（５）グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子とアデノシルトランスファラーゼを含んでなる菌体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であって、宿主大腸菌として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからなる群から選択される単一種である、上記（１）から（４）のいずれか１つに記載の１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の１，３−プロパンジオールの製造方法により、従来の方法より更に、１，３−プロパンジオールの生産量が増大する方法が提供された。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法について、以下に説明する。
【００２１】
［１，３−プロパンジオールの製造方法］
本実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法は、少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、グリセロールを単一の炭素源した培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００２２】
本実施の形態における他の１，３−プロパンジオールの製造方法は、グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体に、グリセロールを単一の炭素源した培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造する方法である。
【００２３】
本実施の形態において、グリセロールデヒドラターゼは、特に制限されることなく、この酵素を有する／発現するいずれの源由来であってもよい。具体的には、Klebsiella属、Citrobacter属、Clostridium属、Lactobacillus属、Enterobacter属、 Caloramator属、Salmonella属及びListeria属に属する微生物があり、より詳しくは、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter pneumoniae、Clostridium pasteurianum、Lactobacillus leichmannii、Citrobacter intermedium、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus brevis、Enterobacter agglomerans、Clostridium butyricum、Caloramator viterbensis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus hilgardii、Salmonella typhimurium、Listeria monocytogenes、及びListeria innocua由来のグリセロールデヒドラターゼなどが挙げられる。これらのグリセロールデヒドラターゼは、単独で使用されてもあるいは２以上の混合物として使用されてもよい。
【００２４】
上記起源からグリセロールデヒドラターゼを単離する方法は、特に制限されることなく、抽出、カラムクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）等の、公知の酵素の分離・単離方法と同様にして、上記したようないずれかの微生物から単離できる。
【００２５】
本発明において、「グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」とは、グリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋Ｈ２Ｏの反応を触媒して失活したデヒドラターゼの活性を再度促す（再活性化する）因子を意味する。より詳細には、デヒドラターゼが触媒するグリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋Ｈ２Ｏの反応には、補酵素Ｂ１２が関与しているが、グリセロールデヒドラターゼは、グリセロール→３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド＋Ｈ２Ｏの反応を展開・触媒すると、補酵素Ｂ１２がつぶれて、活性中心が失活してしまうが、ここでグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子がつぶれた補酵素Ｂ１２を新たな補酵素Ｂ１２と置換して、グリセロールデヒドラターゼの活性を再度促して（再活性化して）、グリセロールデヒドラターゼをグリセロールの脱水反応に再使用できるようにする。このようにグリセロールデヒドラターゼを再活性化する作用を有するものを、本発明においては、「グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」と称する。このグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子は、上記したような作用を有するものであれば、特に制限されることなく、公知の、不活化したグリセロールデヒドラターゼを活性化するグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子が使用される。
【００２６】
ここで、「グリセロールデヒドラターゼ」を以下「ＧＤ」と略し、「グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」を以下「ＧＤＲ」と略す場合もある。また、「グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子」を、以下「ＧＤ／ＧＤＲ」と略す場合もある。
【００２７】
本願発明者らは、グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを組み込んだ遺伝子組み換え大腸菌を、グリセロールを単一の炭素源した培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールの生産量が向上することを見出した。
【００２８】
本実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法は、微好気培養条件下で、前記菌体を培養する。ここで、本明細書における「微好気培養」とは、溶存酸素濃度／飽和酸素濃度を１／１０００〜１／１０として培養することをいい、嫌気培養に比べ好気性の培養をいう。溶存酸素濃度／飽和酸素濃度は好ましくは１／５００〜１／３０であり、更に好ましくは１／２００〜１／４０である。ここで、本明細書における『微好気培養条件』は、１，３−プロパンジオールの製造工程において少なくとも一定時間維持されていれば良く、必ずしも１，３−プロパンジオールの製造工程において継続的に維持される場合のみに限定されない。
【００２９】
また、本実施の形態において、利用できる宿主大腸菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからなる群から選択される単一種である。
【００３０】
本実施の形態において、「グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体」として、例えば、プラスミドｐＳＰＫＧＲＴで、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０を形質転換した、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ｐＳＰＫＧＲＴ）を用いることができ、表１に示すような遺伝子が導入された遺伝子組み換え大腸菌株である。
【００３１】
【表１】
【００３２】
ここで、表１に示す「ｄｈａＢ１」および「ｄｈａＢ２」および「ｄｈａＢ３」は、グリセロールデヒドラターゼの機能的に結合した活性をコードする遺伝子であり、いずれも、クレブシエラ・ニューモニエ由来である。また、表１に示す「ｏｒｆＸ」と「ｏｒｆＺ」は、デヒドラターゼ再活性遺伝子をコードする遺伝子であり、「ｄｈａＴ」は、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素をコードする遺伝子であり、いずれも、クレブシエラ・ニューモニエ由来である。また、表１に示す「ＫｏＡＤＴ」は、アデノシルトランスフェラーゼの機能的に結合した活性をコードする遺伝子であり、クレブシエラ・オキシトカ由来である。
【００３３】
本実施の形態において発酵性基質としては、次に示すような一般的な炭素源より、使用する宿主微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
糖類：
グルコース、
フルクトース、
マルトース、
ガラクトース。
天然炭水化物：
澱粉、
澱粉加水分解物、
糖蜜、
廃糖蜜、
麦、
とうもろこしなど。
アルコール類：
グリセロール、
メタノール、
エタノールなど。
脂肪酸類：
酢酸、
グルコン酸、
ピルビン酸、
クエン酸など。
アミノ酸類：
グリシン、
グルタミン、
アスパラギンなど。
炭化水素類：
ノルマルパラフィンなど。
【００３４】
培地に添加するエタノールアミンまたは２−アミノプロパン−１−オンは、例えば、０．１から５ｇ／Ｌであり、好ましくは、１．０〜１．５ｇ／Ｌである。
【００３５】
ここで、本実施の形態における培地組成として、公知の培養組成を用い、先に示した１，３−プロパンジオール生産能を有する菌体について、当業者が適宜培地組成を選択することができる。本実施の形態の培地として、例えば、本発明の好ましい生育培養液は、ＬＢ培地、ＳＤ培地、ＹＭ培地などの一般的な培地等が用いられる。
【００３６】
培地に添加される、炭素源でもあり原料であるグリセロールの濃度は、３０〜８０ｇ／Ｌの範囲から添加量を選択することによって、過不足が避けられる。
【００３７】
グリセロールに加えて、培地には、窒素源が加えられる。本実施の形態において、窒素原としては、上述したように、エタノールアミンまたは２−アミノ−１−プロパノールを必須成分とし、さらに、適宜、通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物が用いられる。好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。より好ましい窒素源はアルギニン、シトルリン、オルニチン、リジン、酵母エキス、ペプトン類である。
【００３８】
さらに、炭素源のグリセロールや上記窒素源に加えて、本実施の形態に用いる菌体または菌体処理物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。例えば、上述したビタミンＢ１２（シアノコバラミン）を必須成分として、その他に、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、偏性嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。例えば、無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
【００３９】
無機化合物として、例えば、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、明ばん、モリブデン酸ソーダ、塩化カリウム、ホウ酸等、塩化ニッケル、タングステン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、硫酸第一鉄アンモニウムが挙げられる。
【００４０】
また、ビタミン類として、必須成分のビタミンＢ１２の他に、例えば、ビオチン、葉酸、ピリドキシン、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、チオオクト酸、ｐ−アミノ安息香酸が挙げられる。
【００４１】
これらの無機化合物やビタミン類、あるいは増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法は公知である。従って、適宜製造方法にしたがって、培養液を作製する。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。本実施の形態における１，３−プロパンジオールの製造方法において、好ましい培地の形態は、液体培地である。
【００４２】
本実施の形態における菌体の培養は、上述した微好気培養条件下であることを除き、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム (continuous fermentation system)も使用できる。
【００４３】
本実施の形態における菌体の培養において、連続培養システム内へ所定量の酸素を混入させて微好気条件にする。培養器は通常用いられる培養槽がそのまま利用できる。嫌気性微生物の培養にも利用することができる培養タンクは市販されており、培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは基質ガスなどで置換することにより、上述した範囲の微好気の雰囲気を作ることができる。
【００４４】
例えば、嫌気培養ジャー(anaerobic jar)を、嫌気性微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。さらに、嫌気培養ジャーは、嫌気培養ジャー内部の空間や培養液中に含まれる分子状酸素を除去するための機構を備えることができる。例えば、窒素、ヘリウム、水素、炭酸ガスなどを底部から通気攪拌することで、内部を嫌気状態に維持することができる。
【００４５】
本実施の形態において、培養槽に、付加的な機能を与えることができる。例えば、通常使用される撹拌混合槽のほか、気泡塔型、ドラフトチューブ型の培養槽も利用できる。液体培地に吹き込まれる混合気体によって菌体または菌体処理物は遊離分散され、菌体または菌体処理物と培地を十分に接触させることができる。また、バイオトリックリングフィルター（biotrickling filter）のように通気性の高いスラグ、その他セラミック系の無機充てん物、あるいはポリプロピレン等の有機合成物質の充てん層に、水分を滴らせながら菌体または菌体処理物を生息させ、そこにガスを通気しながら培養することもできる。さらに、使用する菌体または菌体処理物は常法によりカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、アクリルアミドゲル、キチン、セルロース、寒天などに固定化して用いることもできる。
【００４６】
本実施の形態では、当業者が、培養された菌体または菌体処理物と培養生成液を分離するため、公知の方法を用いることができる。好ましい分離の方法は、濾過性能、濃縮性能を有するホローファイバー型限外濾過あるいは精密濾過膜を利用する方法である。また、菌体または菌体処理物と該生成液の分離に十分な濾過速度を得るためには使用する菌体または菌体処理物に応じて適当な分画分子量の膜を選択すれば良い。培養槽から限外濾過膜を通して分離された培養液から１，３−プロパンジオールを回収することができる。回収された１，３−プロパンジオールの精製方法は公知であり、例えば、培養物を遠心分離などで菌体を除き、上清を減圧下に濃縮、乾固後、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、キシレン、ヘキサン、ヘプタン、メチルイソブチルケトン、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ハロゲン系などの有機溶媒で抽出する。抽出液をさらにシリカゲルクロマトグラフィーや晶析などの操作を行うことで精製できる。培養槽の形状によっては、培地を十分撹拌するため、撹拌機等を利用することもできる。培養槽内の培養物を攪拌することによって、培地成分や必要なガスを嫌気性微生物に接触させる機会を増やして、１，３−プロパンジオールの生成効率を最適化することができる。また水素、窒素、炭酸ガスなどの単一あるいは混合ガスをマイクロあるいはナノバブルとして供給することもできる。
【００４７】
菌体または菌体処理物の十分な生育のため、培養物のｐＨは、３．０〜９．０が好ましく、５．５〜８．５がより好ましい。また、１，３−プロパンジオールの回収量を増加させるため、培養槽の温度は特に制限されるものではないが、２８〜３７℃を好ましい温度、３２℃〜３４℃をより好ましい温度として挙げることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００４９】
以下、各実施例においては、以下の方法により、グリセロール、１，３−プロパンジオールの定量を行った。
【００５０】
グリセロール、１，３−プロパンジオールの定量：
培養液１ｍＬを遠心分離して除菌した後、０．４５μｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜で濾過して高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとした。
【００５１】
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：ＵＬＴＲＯＮ ＰＳ−８０Ｈ (８．０ｍｍ×３００ｍｍ)
移動相：１０ｍＭ Ｈ２ＳＯ４水溶液
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：屈折率（ＲＩ）
保持時間：グリセロールが１４．８分、１，３−プロパンジオールが１９．０分である。
【００５２】
培養時のＯＤ６００の測定：
培養液を水で４７倍希釈したのち、BioRad社製 SmartSpec3000を用いて、６００ｎｍにおける濁度を測定した。
【００５３】
［実施例１］（１，３−プロパンジオール生合成遺伝子を含有するプラスミドの構築）
Klebsiella pneumoniae ATCC25955から抽出したゲノムを鋳型にして、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（配列番号１）、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子（配列番号２）、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ遺伝子（配列番号３）をそれぞれＰＣＲ増幅させた。次に、Klebsiella oxytoca ATCC 8724 から抽出したゲノムを鋳型にして、アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号４）をＰＣＲ増幅させた。得られた各ＤＮＡ断片をpSE420U（Invitrogen製のプラスミドベクターpSE420のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、WO 2006/132145）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換株を、アンピシリンを含むＬＢ培地で生育させ、生育した形質転換体からプラスミドを抽出し、全ての遺伝子が挿入されている事が確認できたプラスミドをｐＳＰＫＧＲＴとした。
【００５４】
［実施例２］（フラスコ培養による１，３−プロパンジオールの生産）
実施例１により得られたｐＳＰＫＧＲＴで、Ｗ３１１０、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＤＨ１、ＤＨ５、ＤＨ５αを形質転換し、生産菌株を作製した。次に、各菌株を７ｍＬのＬＢ培地で生育させて前培養液を調製し、そのうちの２．５ｍＬを１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。なお、１，３−プロパンジオール生産培地は、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコに５０ｍＬを仕込んだ。
【００５５】
培地組成は、６０ｇ／Ｌ グリセロール、６．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ 酵母エキス（極東）、３．０ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７水和物、１．０ｇ／Ｌ クエン酸、１．０ｇ／Ｌ エタノールアミン、ミネラル溶液 １０ｍＬ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ シアノコバラミン、０．０２ｍＭ ＩＰＴＧ、ｐＨ ７．５とした。ミネラル溶液は、２ｇのニトリロ三酢酸を３００ｍＬのイオン交換水で溶解し、ＫＯＨでｐＨ ６．０に調整した後、１ｇのＭｎＳＯ４・１水和物、０．８ｇのＦｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６水和物、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６水和物、０．００２ｇのＺｎＳＯ４・７水和物、０．０２ｇのＣｕＳＯ４・２水和物、０．０２ｇのＮｉＣｌ２・６水和物、０．０２ｇのＮａ２ＭｎＯ４・２水和物、０，０２ｇのＮａ２ＳｅＯ４、０．０２ｇのＮａ２ＷＯ４を溶解させ、イオン交換水で１Ｌとした。
【００５６】
前培養液を植菌した後、温度を３３℃、回転速度を１４５ｒｐｍとして、培養を開始した。１６時間後、ＯＤ６００が２〜４になった事を確認した後、回転速度を７０ｒｐｍに下げて培養を継続した。培養中の１，３−プロパンジオールの生産濃度を表１に示した。比較例として、１４５ｒｐｍで培養を継続した結果を表２に示し、エタノールアミン無添加の培地で実施例１と同様に培養した結果を表３に示した。微好気条件で培養する事により生産量が増え、さらにエタノールアミンを添加する事により生産量が増えた。
【００５７】
【表２】
【００５８】
［比較例１］
回転速度を終始１４５ｒｐｍとして培養を行った以外は、実施例２に準拠して行った。結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
［比較例２］
エタノールアミンを添加しなかった以外は、実施例２に準拠して行った。結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】
［実施例３］（ミニジャーによる１，３−プロパンジオールの生産）
実施例２で調製したＷ３１１０（ｐＳＰＫＧＲＴ）およびＪＭ１０９（ｐＳＰＫＧＲＴ）を５０ｍＬのＬＢ培地で生育させて前培養液を調製し、１，３−プロパンジオール生産培地に植菌した。植菌量は１４ｍＬとし、生産培地は１．２Ｌとした。生産培地の成分は、実施例２と同じである。植菌後、温度を３３℃、撹拌速度を６００ｒｐｍ、通気量を０．５ｖｖｍ、ｐＨを７．２で制御しながら培養を開始し、ＯＤ６００が２〜３になった時点から、溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の２％になるように撹拌速度をコントロールしながら培養を継続した。培養中の１，３−プロパンジオールの生産量を表５に示した。
【００６３】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項２】
少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項３】
グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項４】
微好気培養条件下で１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項５】
グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子とアデノシルトランスファラーゼを含んでなる菌体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であって、宿主大腸菌として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからなる群から選択される単一種であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項１】
少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項２】
少なくともグリセロールデヒドラターゼと１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項３】
グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、およびアデノシルトランスフェラーゼを含んでなる菌体に、グリセロールを含む発酵性基質を炭素源とした培地にエタノールアミン、または２−アミノ−１−プロパノールを加えて培養することにより、１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項４】
微好気培養条件下で１，３−プロパンジオールを製造することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【請求項５】
グリセロールデヒドラターゼとグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子とアデノシルトランスファラーゼを含んでなる菌体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株であって、宿主大腸菌として、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからなる群から選択される単一種であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の１，３−プロパンジオールの製造方法。
【公開番号】特開２０１３−１３３５３（Ｐ２０１３−１３３５３Ａ）
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１４７３５３（Ｐ２０１１−１４７３５３）
【出願日】平成２３年７月１日（２０１１．７．１）
【出願人】（０００００２９０１）株式会社ダイセル (1,236)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１日（２０１１．７．１）
【出願人】（０００００２９０１）株式会社ダイセル (1,236)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]