１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法
【課題】１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを鳥類卵脱脂卵黄より簡便に高純度かつ収率よく製造する方法を提供すること。
【解決手段】鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、鳥類脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化１】
【解決手段】鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、鳥類脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化１】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法に関する。また、本発明は、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、核酸及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。
膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が、癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であると考えられている。
【０００３】
糖鎖の多くは、生体内において糖タンパク質及び糖脂質として存在し、細胞間の認識及び相互作用などにより生理機能を担うと考えられている。
生体内における糖鎖は多様な構造を有するだけでなく、存在量も微量であり、タンパク質などと結合して存在することも多いことから、一般にその精製は数多くの工程を経る必要があることが多く、糖鎖の抽出・精製操作は難しいことが知られている。
【０００４】
近年の糖化学分野における研究の進展に伴い、酵母型糖鎖を持つ糖タンパク質の糖鎖をヒト型糖鎖に置換する酵素の研究が加速しており、高い効率で酵母型糖鎖をヒト型糖鎖に置換できるようになってきている。当該方法によれば、動物細胞を用いてヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質を製造するのに比べて、ヒト型糖鎖を持つ糖たんぱく質医薬を安価で大量に供給することができる。
例えば、酵母に発現させたエリスロポエチンの酵母型糖鎖をヒト型糖鎖に置換することにより、均一なヒト型糖鎖を持つエリスロポエチンを製造することができる。
斯かる方法により得られる糖たんぱく質医薬は、その糖鎖構造がヒト型でしかも同一であることから、医薬品としての均一性が保持されることになる。上述のように、抗体医薬や生理活性タンパク質を製造する上で、ヒト型糖鎖を供給し、酵母に発現させた糖タンパク質の酵母型糖鎖をヒト型糖鎖に置換する方法は、今後非常に有効な方法になりうると考えられている。
【０００５】
しかしながら、大量のヒト型糖鎖を供給する方法は未だ確立されていないので、当該方法の確立が望まれている。
近年、ヒト型糖鎖の供給源として卵黄が注目されている。卵黄には主にヒト型糖鎖と同じ、２本鎖のＮ結合型複合型糖鎖が含まれているため、当該糖鎖を効率よく大量に抽出することができれば、卵黄を供給源としてヒト型糖鎖を供給することができる。
【０００６】
例えば、特許文献１には、鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）から１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを調製することが開示されている。また、特許文献１には、鶏卵由来脱脂卵黄に、アーモンド又は杏種子を添加することにより、アミノ酸やペプチドが結合していないシアル酸誘導体が得られることが開示されている。
非特許文献１には、鶏卵の可溶画分より抽出される糖鎖ペプチド（ＳＧＰ：シアリルグリコペプチド）が得られることが開示されている。このＳＧＰは、ヒト型糖鎖からなる１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端に、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖のペプチド残基が結合した化合物である。
特許文献２には、シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から水又は塩溶液で抽出することにより製造する方法が開示されている。
【０００７】
特許文献３には、アミノ基に脂溶性保護基（Ｆｍｏｃ基又はＢｏｃ基）を導入して、糖鎖アスパラギン誘導体を製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９６／０２２５５号パンフレット
【特許文献２】特開平８−９９９８８号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Akira Seko, Mamoru Koketsu, Masakazu Nishizono, Yuko Enoki, Hisham R. Ibrahim, Lekh Raj Juneja, Mujo Kim, Takehiko Yamamoto, Biochimica et Biophysica Acta, 1997, Vol.1335, p.23-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献３に開示された方法で調製される糖鎖アスパラギン誘導体は、１）脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、２）糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、３）糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、４）糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程などを含む、極めて煩雑な工程を経て得られている。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、鳥類卵脱脂卵黄より簡便に高純度かつ収率よく１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、鳥類卵脱脂卵黄を原料として、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法において、まず、鳥類卵脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物をアルコール沈殿して得られる沈殿物を脱塩する製造方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
[１]
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化１】
[２]
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物を脱塩して、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化２】
[３]
前記糖ペプチド沈殿物又は糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程が、前記沈殿物を樹脂へ保持し、次いで、水により洗浄する工程である、[１]又は[２]に記載の製造方法。
[４]
前記樹脂が、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂である、[３]に記載の製造方法。
[５]
前記逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂が、化学結合型シリカゲル樹脂である、[４]に記載の製造方法。
[６]
前記脱塩が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有する有機溶媒水溶液により溶出する工程を含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の製造方法。
[７]
前記有機溶媒水溶液の濃度が０．１〜１０％(ｖ／ｖ)である、[６]に記載の製造方法。
[８]
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からエタノール沈殿して、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物をＯＤＳ樹脂で脱塩して１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からエタノール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化３】
[９]
前記１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンが下記式２で表される構造である、[１]〜[８]のいずれかに記載の製造方法。
式２：
【化４】
[１０]
[１]〜[９]のいずれかに記載の製造方法によって得られる１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に対し、脂溶性保護基を導入する工程、及び
アルコール沈殿工程、を含む、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
[１１]
前記脂溶性保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、トリチル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、及び２−ニトロベンゼンスルホニル基からなる群より選択される、［１０］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、簡便に高純度かつ収率よく１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの1Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】実施例１においてＯＤＳ樹脂を用いた溶出を再度行って製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】実施例２において製造された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのＨＰＬＣチャートを示す。
【図６】実施例３において製造されたＦｍｏｃ１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのＨＰＬＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１７】
本実施の形態の１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン（以下、単に、「糖鎖アスパラギン」と記載する場合がある。）の製造方法は、鳥類卵脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び、前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程を含む。
【００１８】
本実施の形態において、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンとは、１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端にアスパラギンが結合している、下記式１で表される化合物を意味する。
式１：
【化５】
【００１９】
本実施の形態の製造方法により、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模においても、簡便に、また、好ましくは安価に、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造することができる。
また、本実施の形態の好ましい態様において、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを、工業的規模で簡便な工程により、９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上の高純度で、かつ収率よく製造することができる。
【００２０】
本実施の形態において、鳥類卵脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド混合物を得、さらに以下のような工程を行うことにより、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得ることができる（以下、単に、「１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド」を「糖ペプチド」と記載する場合がある。）。
斯かる工程として、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、前記沈殿物を脱塩して、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、及び前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程を含む。
【００２１】
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程とは、鳥類卵脱脂卵黄を、水又は塩溶液に懸濁し、糖ペプチドの混合物などを抽出して、糖ペプチドの粗精製物である糖ペプチド抽出液を得る工程である。
糖ペプチド抽出液に含まれる糖ペプチドとしては、下記式３で表される化合物が挙げられる。
式３：
【化６】
【００２２】
式３で表わされる糖ペプチドの糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）からなるペプチド鎖が結合している（配列番号１）。
【００２３】
鳥類卵脱脂卵黄としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の脱脂卵黄や、鳥類卵から調製した脱脂卵黄が挙げられる。
鳥類卵としては、特に限定されるものではないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモ、ダチョウ、及びハトなどの卵が挙げられ、卵黄内に含まれる糖ペプチドの量が多いので、ニワトリの卵である鶏卵などが好ましい。
鳥類卵脱脂卵黄は、鳥類卵の全卵又は卵黄を、有機溶媒により脱脂処理することにより得ることができる。
鳥類卵としては、生の卵であってもよく、乾燥して得られる卵の乾燥粉末であってもよく、鶏卵卵黄及び鶏卵卵黄粉末などを用いることが好ましい。
【００２４】
脱脂処理する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類卵に有機溶媒を添加して、沈殿物と有機溶媒層を分離する方法などが挙げられる。
脱脂処理に用いられる有機溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールなどが挙げられ、有機溶媒として、１種の溶媒を用いてもよく、２種の溶媒の混合溶媒を用いてもよい。
脱脂処理において、鳥類卵に添加する有機溶媒の量として、特に限定されるものではないが、鳥類卵に対して、質量で、１〜５倍の有機溶媒を用いることにより脱脂処理を行うことができる。
脱脂処理は、特に限定されるものではないが、０〜２５℃の温度で行うことができる。
【００２５】
鳥類卵に有機溶媒を添加した後、有機溶媒と鳥類卵とをよく撹拌することにより、有機溶媒により鳥類卵に含まれる脂分を除去することができる。
有機溶媒と沈殿物とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
有機溶媒を用いた脱脂処理は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましい。
【００２６】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加して、鳥類卵脱脂卵黄から糖ペプチドを抽出する方法は、特に限定されるものではない。抽出工程において用いられる塩溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液などが挙げられ、塩溶液として、１種の塩溶液を用いてもよく、２種以上の塩溶液の混合塩溶液を用いてもよい。
塩溶液の濃度としては、特に限定されるものではないが、０．０００１〜２．０％（ｗ／ｖ）である。鳥類卵脱脂卵黄に添加する水又は塩溶液の量として、特に限定されるものではないが、鳥類卵脱脂卵黄に対して、質量で、０．１〜５０倍の水又は塩溶液を用いることにより糖ペプチドの抽出を行うことができる。
糖ペプチドの抽出は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００２７】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加した後、鳥類卵脱脂卵黄と水又は塩溶液とをよく撹拌することにより、水又は塩溶液により鳥類卵脱脂卵黄に含まれる糖ペプチドを抽出することができる。
水又は塩溶液で抽出した糖ペプチドを含有する抽出液（糖ペプチド抽出液）と、鳥類卵脱脂卵黄とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
水又は塩溶液を用いた抽出処理は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましく、２〜４回行うことがより好ましい。
抽出工程は、水を用いて行うことが好ましい。
【００２８】
糖ペプチド抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程とは、抽出工程で得られた、糖ペプチドを含有する抽出液をアルコールに添加することにより、糖ペプチドの抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物（糖ペプチド沈殿物）として得る工程である。沈殿工程においては、抽出液にアルコールを添加することで、粗精製物として、糖ペプチド沈殿物を沈殿させてもよい。
本実施の形態において、アルコールとは、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリンなどのアルコールからなる群から選択される溶媒が挙げられる。また１種の溶媒を用いてもよく、２種以上の溶媒の混合溶媒を用いてもよい。特に、炭素数１〜５からなるアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、糖ペプチド抽出液をアルコールに添加して糖ペプチドを沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）であり、抽出工程で得られた、糖ペプチド抽出液をアルコールに添加することにより、糖ペプチドの抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。
【００２９】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量として、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で、２〜２０倍のアルコールを用いることにより糖ペプチドの抽出を行うことができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールとしては、炭素数１〜５個のアルコールが好ましく、炭素数１〜３個のアルコールがより好ましい。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、メタノール及びエタノールが好ましく、中でもエタノールが好ましい。医療用用途あるいは医薬用用途として糖ペプチドを用いる場合には、アルコール沈殿工程に用いられるアルコールはエタノールを用いることが好ましい。
本実施の形態において、アルコール沈殿工程において用いるアルコールとしては、１種のアルコールを用いてもよく、２種以上のアルコールの混合溶媒を用いてもよく、アルコールと他の溶媒との混合溶媒を用いてもよい。
アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００３０】
糖ペプチドの抽出は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００３１】
アルコール沈殿工程で用いる、先の抽出工程により得られた糖ペプチド抽出液は、沈殿工程の前に、抽出液をろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮して得られる抽出液の濃縮液を用いてもよい。
【００３２】
アルコール沈殿工程において、糖ペプチドを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖ペプチドを、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された糖ペプチドを得ることができる。アルコールに対し糖ペプチドは溶解しないので、アルコール沈殿工程は不純物除去のために必要に応じて繰り返すことができる。アルコール沈殿工程を繰り返し行うことにより、より精製された糖ペプチドを得ることができ、糖ペプチドの沈殿は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましく、２〜４回行うことがより好ましい。
【００３３】
糖ペプチド沈殿物を脱塩する脱塩工程とは、沈殿工程で得られた糖ペプチドを含有する粗精製物としての沈殿物（糖ペプチド沈殿物）から塩を除去する工程である。
脱塩工程としては、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができ特に限定されるものではない。脱塩工程は、特に限定されるものではないが、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することが可能である。脱塩工程としては、例えば、沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂へ保持させ、次いで、水により洗浄することにより脱塩することもできる。
また、本実施の形態においては、上述した抽出工程と沈殿工程を行うことにより得られる沈殿物を脱塩することにより、工業的規模で簡便に１１糖シアリルオリゴ糖ぺプチドを製造することができる。
特許文献１に記載されるような従来の方法においては、鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）から水で抽出、逆浸透膜により濃縮、陰イオン交換樹脂に吸着させた後、脱塩してＮａＣｌ水溶液による溶出を行い、濃縮し、再度、脱塩工程を行う必要があり、工業的規模で行うには簡便な方法であるとは言えない。
【００３４】
沈殿物の樹脂への保持は、吸着、担持など公知の結合様式を利用した保持方法により、沈殿物を樹脂へ保持させることができる。また、沈殿物は、水で洗浄する際に、沈殿物が洗浄液と共に流出しない程度に、保持されていればよい。
樹脂としては、特に限定されるものではないが、例えば、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂などが挙げられ、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂とは、シリカゲル系、ポリマー系を代表とする樹脂を意味し、特に限定されるものではないが、例えば、ポリ(スチレン／ジビニルベンゼン)ポリマーゲル樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂、スチレンビニルベンゼン共重合体樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、化学結合型シリカゲル樹脂などが挙げられる。
化学結合型シリカゲル樹脂とは、特に限定されるものではないが、例えば、多孔性シリカゲルにジメチルオクタデシルクロロシランの様なシランカップリング剤を反応させて製造する樹脂などが挙げられ、シリカゲルに対し、同様の手法で異なるシリル化剤を用いることで、ジメチルオクタデシル、オクタデシル（Ｃ１８）、トリメチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル（Ｃ８）、ブチル、エチル、メチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル基からなる群から選択される基を化学結合することで得られる樹脂などが挙げられる。あるいは炭素数２２のドコシル（Ｃ２０）基及び炭素数３０のトリアコンチル（Ｃ３０）基を結合して得られる樹脂であってもよい。
本実施の形態において、好ましい化学結合型シリカゲル樹脂として、シリカゲルを基材として、オクタデシル基が担持された、オクタデシル基結合シリカゲル樹脂（ＯＤＳ樹脂）が挙げられる。
【００３５】
脱塩工程は、脱塩した後に樹脂に保持されている糖ペプチド（１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド）を、有機溶媒水溶液により溶出する工程を含むことが好ましく、脱塩工程において脱塩した後に、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する溶出工程を行うことにより１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの純度を向上させることができる。より好ましい態様においては、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの純度を９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上とすることができる。例えば、再度、脱塩工程（溶出工程）を繰り返すことで糖ペプチドの純度をさらに向上させることができる。糖ペプチドの純度を向上させることは、例えばＥｎｄｏ−Ｍの様な糖転移酵素を用いて、本実施の形態において得られた糖ペプチドの糖鎖部分を他の糖鎖あるいは糖鎖誘導体へ転移反応を行う場合（ペプチド鎖中の糖鎖へ転移する場合も含む）には、不純物による妨害反応が減少し、目的の転移反応の反応効率が向上するのでより好ましい。
溶出工程に用いる有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、有機溶媒水溶液の濃度が、有機溶媒の水溶液中での濃度として、０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であることが好ましく、０．１〜１０％(ｖ／ｖ)であることがより好ましい。
【００３６】
脱塩工程又は溶出工程は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００３７】
脱塩工程としては、樹脂を用いた脱塩工程以外にも、分離膜を用いることにより沈殿工程で得られた沈殿物から脱塩することが可能である。
斯かる脱塩工程としては、例えば、限外ろ過膜又は逆浸透膜を用いることで沈殿物の脱塩を行うことができる。
脱塩工程に用いる膜としては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリビニリデンフルオライド、ポリテトラフルオロエチレン、芳香族ポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコールを構成基材とする平膜又は中空糸膜、スパイラル膜又はチューブラー膜などが挙げられる。該膜として、さらにはイオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜あるいは逆浸透膜で脱塩することも可能である。
【００３８】
本実施の形態において、糖ペプチドを精製する方法としては、公知のペプチド、糖質、又は糖ペプチドなどの精製方法を用いることができるが、特に限定されるものではない。例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、メチルなどを充填剤表面に固定化したものが挙げられ、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００３９】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖ペプチド中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖ペプチドを添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖ペプチドの脱塩を行うことができる。脱塩工程が、糖ペプチド沈殿物を樹脂に、好ましくは、ＯＤＳ樹脂に保持し、水でより洗浄し、次いで有機溶媒水溶液により１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
【００４０】
脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖ペプチドを得ることができる。より好ましい態様においては、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの純度を９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上、更に好ましくは９９％以上とすることができる。
糖ペプチドを添加することで糖ペプチドを保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で、樹脂の１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることにより糖ペプチドを得ることができる。
【００４１】
有機溶媒水溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種の有機溶媒の水溶液などが挙げられる。
有機溶媒水溶液としてはアセトニトリルが好ましく、特にアセトニトリル水溶液で溶出工程を実施することで、不純物の１つである末端シアル酸が部分的に切断された糖ペプチドと、所望の糖ペプチドとの溶出工程における分離の純度向上が著しく、９５％以上の純度で糖ペプチドを得ることができる。
有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であることが好ましく、より好ましくは０．５〜２０％(ｖ／ｖ)であり、さらに好ましくは１０％(ｖ／ｖ)以下、よりさらに好ましくは５％(ｖ／ｖ)以下である。有機溶媒水溶液の濃度は、０．５〜３％(ｖ／ｖ)が好ましい。
【００４２】
特許文献１に記載されるような従来の方法においては、樹脂からの溶出操作において、例えば、陰イオン交換樹脂などを用いた場合には樹脂に吸着させた後、塩溶液又は酸性溶液による溶出操作が必要となる。ところが、酸性溶液で溶出する場合、末端シアル酸が糖ペプチドから脱離することも考えられることから好ましくない。また、塩溶液での溶出の場合は溶出液からの脱塩処理を再度行う必要が生じ、大量製造においては工程数の増加となる。本実施の形態においては、溶出工程において好ましくは有機溶媒水溶液にて溶出することにより、溶出液の脱塩操作を必要としないため工程数を減少させることができるので大量製造に適する。また、本実施の形態における方法では、溶出液の濃縮時のｐＨ変化も起こらず糖ペプチドの糖鎖部分の分解もこれまで開示された方法に比べて少ない点で有利である。
有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程においては、水から徐々に、溶出液としての有機溶媒水溶液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００４３】
溶出された糖ペプチドは、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチドとして得ることができる。
本実施の形態において、得られた糖ペプチドは、再度アルコール沈殿工程を行ってさらに精製してもよい。また、ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、再度糖ペプチドを吸着させ、質量で、樹脂の１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて再度樹脂から溶出させることにより、より高純度（９９％以上）の糖ペプチドを得ることができる。
【００４４】
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程は、糖ペプチドのペプチド部分を選択的に加水分解することで、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを含む酵素分解物の混合物（１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物）を得る工程である。通常、アスパラギン混合物は、糖鎖アスパラギンを含む酵素反応液として得ることができる。
該工程においては、上記式４で表される１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドが、ペプチド分解酵素により酵素分解されて、上記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンへと変換される。一般的には、糖鎖アスパラギンの立体化学は、糖ペプチドの立体化学が保持される形式で、酵素分解が行われる。
【００４５】
ペプチド分解酵素としては、例えば、プロナーゼ（和光純薬社製）、アクチナーゼ-E（科研製薬社製）、オリエンターゼなど、一般のカルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼなどのプロテアーゼを使用することができる。
プロテアーゼとしては、至適ｐＨを７〜８に有するエンド型プロテアーゼが挙げられ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの産生するプロテアーゼなどが考えられる。
具体的には、オリエンターゼＯＮＳ、９０Ｎ（阪急バイオ社製）、プロテアーゼＮ（天野製薬社製）、ＡＯプロテアーゼ（盛進製薬社製）などの食品添加物用プロテアーゼなどがあり、また他の起源であるアクチナーゼＥ、キモトリプシン、トリプシンなどの酵素などが挙げられる。
酵素分解反応は、各プロテアーゼの至適ｐＨ・温度・イオン強度において行うことで１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンへ進行させることができる。
分解反応条件として、ｐＨ７〜８、温度３０〜５０℃、イオン強度０．１〜１．０で酵素分解反応を行うことが好適である。
また、酵素分解反応におけるペプチド分解酵素の酵素量は、脱脂卵黄に対し０．０３〜２０％（ｗ／ｗ）加えることにより効率良く１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンへと酵素分解反応を行うことができる。
【００４６】
次いで、アルコールを用いた糖鎖アスパラギンの沈殿工程において糖鎖アスパラギン混合物を分離する。
１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る工程は、酵素反応工程で得られた糖鎖アスパラギンを含有する混合物（糖鎖アスパラギン混合物）をアルコールに添加することにより、糖鎖アスパラギンの混合物を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖鎖アスパラギンを沈殿物（糖鎖アスパラギン沈殿物）として得る工程である。
本沈殿工程においては、混合物にアルコールを添加することで、粗精製物として、糖鎖アスパラギンを沈殿させてもよい。この工程において糖鎖アスパラギンと酵素が主に沈殿生成物として得られる。
【００４７】
本実施の形態において、本沈殿工程は、糖ペプチド抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る上記沈殿工程として記載する方法と同様にして行うことができる。また、本沈殿工程を上記アルコール沈殿工程として行ってもよい。
本実施の形態における、アルコールとは、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリンなどのアルコールからなる群から選択される溶媒が挙げられる。また１種の溶媒を用いてもよく、２種以上の溶媒の混合溶媒を用いてもよい。特に、炭素数１〜５からなるアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、糖鎖アスパラギンの抽出液をアルコールに添加して糖鎖アスパラギンを沈殿させる工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）であり、抽出工程で得られた、糖鎖アスパラギンを含有する抽出液をアルコールに添加することにより、糖鎖アスパラギンの混合液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖鎖アスパラギンを沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。
【００４８】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量として、特に限定されるものではないが、酵素反応液に対して、質量で、２〜２０倍のアルコールを用いることにより糖鎖アスパラギンの抽出を行うことができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールとしては、炭素数１〜５個のアルコールが好ましく、炭素数１〜３個のアルコールがより好ましい。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、メタノール及びエタノールが好ましく、中でもエタノールが好ましい。医療用用途あるいは医薬用用途として糖鎖アスパラギンを用いる場合には、アルコール沈殿工程に用いられるアルコールはエタノールを用いることが好ましい。アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００４９】
糖鎖アスパラギンの抽出は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００５０】
アルコール沈殿工程において、糖鎖アスパラギンを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖鎖アスパラギンを、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された糖鎖アスパラギンを得ることができる。アルコールに対し糖鎖アスパラギンは溶解しないので、アルコール沈殿工程は不純物除去のために必要に応じて繰り返すことができる。アルコール沈殿工程を繰り返し行うことにより、より精製された糖鎖アスパラギンを得ることができ、糖鎖アスパラギンの沈殿は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましく、２〜４回行うことがより好ましい。
【００５１】
次いで、糖鎖アスパラギン及び混合物の脱塩工程において糖鎖アスパラギンを分離する。
糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程とは、沈殿工程で得られた糖鎖アスパラギンを含有する粗精製物としての沈殿物（糖鎖アスパラギン沈殿物）から塩、ペプチド及びアミノ酸などの低分子量化合物あるいは酵素等を除去する工程である。
本脱塩工程は、糖ペプチド沈殿物を脱塩する上記脱塩工程として記載する方法と同様にして行うことができる。
脱塩工程としては、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができ特に限定されるものではない。脱塩工程は、特に限定されるものではないが、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することが可能である。脱塩工程としては、例えば、アルコール沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂へ保持させ、次いで、水により洗浄することにより脱塩することもできる。
具体的には、公知のクロマトグラフィー、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーにより得られた糖鎖アスパラギン中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよい。この脱塩工程において糖鎖アスパラギンに分離する。
【００５２】
糖鎖アスパラギンの脱塩工程は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖鎖アスパラギンを得ることができる。より好ましい態様においては、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの純度を９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上とすることができる。
【００５３】
本実施の形態において、糖鎖アスパラギンを精製する方法としては、上述の糖ペプチドを精製する方法と同様にして、公知のペプチド、糖質、又は糖ペプチドなどの精製方法を用いることができるが、特に限定されるものではない。例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、メチルなどを充填剤表面に固定化したものが挙げられ、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００５４】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖鎖アスパラギン中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖鎖アスパラギンを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖鎖アスパラギンを添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖鎖アスパラギンの脱塩を行うことができる。脱塩工程が、糖鎖アスパラギン沈殿物を樹脂に、好ましくは、ＯＤＳ樹脂に保持し、水でより洗浄し、次いで有機溶媒水溶液により１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを溶出する工程を含んでいてもよい。
【００５５】
本実施の形態における製造方法により得られる１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンは、下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンである。
式１：
【化７】
糖鎖アスパラギンとしては、下記式２で表される構造であってもよい。
式２：
【化８】
【００５６】
本実施の形態において、上記のようにして得られる糖鎖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に対し、脂溶性保護基を導入する工程、及びアルコール沈殿工程、を含む、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法をも提供する（以下、単に、「脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン」を「糖鎖アスパラギン誘導体」と記載する場合がある。）。
【００５７】
本実施の形態において、「脂溶性保護基が導入された」とは、糖鎖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に、脂溶性保護基が結合していることを意味する。
【００５８】
脂溶性保護基としては、カーバメート系、アシル系、イミド系、アルキル系、スルホンアミド系から選択される脂溶性保護基が挙げられる。カーバメート系保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ又はＣｂｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）基、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられ、アシル系保護基としては、アセチル（Ａｃ）基等が挙げられ、イミド系保護基としては、フタロイル（Ｐｈｔ）基等が挙げられ、アルキル系保護基としては、トリチル（Ｔｒｔ）基等が挙げられ、スルホンアミド系保護基としては、ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ又はＴｏｓ）基、２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）基等が挙げられる。なお、上記記載した略号は例示であり、また、例えば、ｐ−トルエンスルホニル基は、トシル基と別名で記載される場合もあるように、本実施の形態において上記例示する脂溶性保護基としては、上記している基が示す構造を有している基であればよい。
【００５９】
脂溶性保護基をアスパラギンのアミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いることができる。
例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ，ＪＯＨＮ ＷＩＬＬＹ ＆ ＳＯＮＳ， ＩＮＣ．に記載された方法を適宜用いることができる。
例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノールなどの活性エステルによりカルボキシル基が活性化されたアミノ基脂溶性保護試薬を、必要に応じて、試薬を溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等の無機塩基の存在下、氷冷下又は室温下で１５分〜１８０分反応させる方法が挙げられる。
アミノ基脂溶性保護試薬は、アスパラギンのアミノ基に対して過剰量、例えばアミノ基の１モルに対して１．１モルから３モルのアミノ基脂溶性保護試薬を添加することで、アスパラギンのアミノ基に脂溶性保護基を導入することができる。
【００６０】
本実施の形態の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法においては、アルコール沈殿工程を介して糖鎖アスパラギン誘導体が得られるが、必要に応じてアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程のみで、純度９５％程度の糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。更に高純度の糖鎖アスパラギン誘導体を得るためには、必要に応じて脱塩工程を組み合わせることで達成される。すなわち、ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に添加し水で溶出し脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。すなわち糖鎖アスパラギン誘導体を添加して、糖鎖アスパラギン誘導体を保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることで、より高純度の糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
【００６１】
有機溶媒水溶液としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種の有機溶媒の水溶液などが挙げられ、有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜７０％(ｖ／ｖ)であり、好ましくは１〜５０％(ｖ／ｖ)である。有機溶媒水溶液により糖鎖アスパラギン誘導体を溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき溶出を行えばよく、又は有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００６２】
溶出された糖鎖アスパラギン誘導体は、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖鎖アスパラギン誘導体として得ることができる。本実施の形態において、得られた糖鎖アスパラギン誘導体は、再度アルコール沈殿工程あるいは脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。
【００６３】
また、トリフェニルメチルクロライドをＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミンなどの有機塩基存在下、室温下で４時間〜２日反応させる方法によりアスパラギンのアミノ基にトリチル基を導入することができる。糖鎖アスパラギン誘導体の精製は、必要に応じてアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程のみで、高純度の糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
以上、本実施の形態において、脂溶性保護基が導入された糖鎖アスパラギンの精製においてはアルコール沈殿工程が重要であり、クロマトグラフィーに供さずに、この工程のみでも高純度の生成物を得ることができる。
【００６４】
糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法における、アルコール沈殿工程や脱塩工程などの工程については、上記した方法と同様に、また、参考にして実施することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００６６】
［ＨＰＬＣ分析］糖ペプチド
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６７】
［1Ｈ−ＮＭＲ測定］糖ペプチド
Ｄ2Ｏ ０．４ｍＬに試料 ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００６８】
［ＨＰＬＣ分析］糖鎖アスパラギン（実施例１）
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；０％→１５％（３０ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
[ＨＰＬＣ分析］糖鎖アスパラギン（実施例２）
カラム（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ Ａｑｕａ(関東化学、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；０％→１０％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
［ＨＰＬＣ分析］Ｆｍｏｃ糖鎖アスパラギン（実施例３）
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２０％→１００％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６９】
以下の測定条件でＬＣ／ＭＳ測定を行った。用いたＬＣ及びＭＳのシステムは以下のとおりである。
[ＬＣ／ＭＳ測定]糖鎖アスパラギン（実施例１）
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｉｍｔａｋｔ，Ｓｃｈｅｒｚｏ−Ｃ１８ (１５０×２ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；Ａ＝水（０．０５％ ＨＣＯＯＨ）
Ｂ＝０．１Ｍ ＨＣＯＯＮＨ4／ＣＨ3ＣＮ（１／１）
Ｂ％：２％→１００％（２０ｍｉｎ）
ＭＳ：サーモエレクトロン（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｎｅｇａｔｉｖｅ
[ＬＣ／ＭＳ測定]Ｆｍｏｃ糖鎖アスパラギン（実施例３）
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｉｍｔａｋｔ，Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (１５０×２ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；Ａ＝水（０．１％ ＴＦＡ）
Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ（０．１％ ＴＦＡ）
Ｂ％：２０％→１００％（２０ｍｉｎ）
ＭＳ：サーモエレクトロン（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｎｅｇａｔｉｖｅ
【００７０】
［実施例１］
鶏卵卵黄２０個にエタノール５００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール５００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄２７０ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄２７０ｇに水５００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、３５０ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール１５００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド２．５８ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）４０ｇを用い、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド２．５ｇを水２０ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水２００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで２１２ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により下記式４で表される構造であることが分かった（配列番号２）。
式４：
【化９】
【００７１】
さらにＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）４０ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。上記で得られた糖ペプチド１００ｍｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを再度溶出した。溶出液を凍結乾燥することで７０ｍｇの糖ペプチドを得た。得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度は９９％であった。
【００７２】
上記糖ペプチド１０ｍｇを０．５ｍＬのトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（５０ｎｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ ＮａＮ３ ｐＨ７．５）に溶解し０．１ｍＬの同緩衝液に溶解した１ｍｇ科研製薬製ＡｃｉｔｎａｓｅＥを加え３７℃で３日間攪拌した。その後反応液を５ｍＬエタノールに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を水０．５ｍＬに溶解し、５ｍＬエタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。最終沈殿物を水０．５ｍＬに溶解しゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂、８ｍL）により水溶離液による脱塩を行い、その後凍結乾燥することで目的とする１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン４．５ｍｇ（収率５５．２％）を得た。
【００７３】
得られた糖鎖アスパラギンのＨＰＬＣによる測定結果を図４に示す。ＨＰＬＣによる純度は９５％であった。得られた糖鎖アスパラギンはＬＣ／ＭＳ測定により１１６９．５([Ｍ＋２Ｈ]2+)及び１１６７．７([Ｍ−２Ｈ]2-)であり上記式１で表される化合物の分子量２３３７と一致することが分かった。
【００７４】
［実施例２］
実施例１と同様にして得られた、糖ペプチド１００ｍｇを５ｍＬのトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（５０ｎｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ ＮａＮ３ ｐＨ７．５）に溶解し１ｍＬの同緩衝液に溶解した５０ｍｇ科研製薬製ＡｃｉｔｎａｓｅＥを加え３７℃で７日間攪拌した。その後反応液を２０ｍＬエタノールに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を水１ｍＬに溶解し１０，０００ｒｐｍで分遠心分離したが沈殿は見られなかった。またデカンテーションによるＥｔＯＨ層には糖鎖アスパラギンが検出されなかった。次いで水溶液を１０ｍＬエタノールに注加し、１０，０００ｒｐｍで３分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。この操作を３回繰り返した。最終沈殿物を水０．５ｍＬに溶解しゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂、８ｍL）に添加し水で溶出することで脱塩を行い、その後凍結乾燥することで粗精製１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン６６．４ｍｇを得た。次いでＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）を用いて水で溶出するカラムクロマトグラフィーを行い目的とする１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン５０ｍｇ（収率６１％）を得た。
得られた糖鎖アスパラギンのＨＰＬＣによる測定結果を図５に示す。糖鎖アスパラギンはＬＣ／ＭＳ測定によれば１１６７．７([Ｍ−２Ｈ]2-)であり上記式１で表される糖鎖アスパラギンと一致することが分かった。
【００７５】
［実施例３］
実施例２で得られた糖鎖アスパラギン５ｍｇを１ｍＬの水に溶解し、ＤＭＦ０．５ｍＬを加えた、次いでＦｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎ−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｎｏｎｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）６ｍｇを１．５ｍＬのＤＭＦに溶解したものを加えた。次いで１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ０．１ｍＬを加え室温下６時間反応を行った。
その後反応液を１０ｍＬエタノールに注加し９，０００ｒｐｍで３分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を水０．５ｍＬに溶解し１０ｍＬエタノールに注加し、９，０００ｒｐｍで３分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。この操作を３回繰り返した。沈殿物を０．５ｍＬの水に溶解し凍結乾燥することで目的とする糖鎖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基がＦｍｏｃ化されたＦｍｏｃ糖鎖アスパラギン５ｍｇを得た。
得られたＦｍｏｃ糖鎖アスパラギンのＨＰＬＣによる測定結果を図６に示す。ＨＰＬＣによる純度は９５％であった。得られたＦｍｏｃ糖鎖アスパラギンはＬＣ／ＭＳにより１２８０．７([Ｍ＋２Ｈ]2+)及び１２７８．８([Ｍ−２Ｈ]2-)であることから、分子量２５５８．８９である下記式５で表される構造であることが示唆された。
式５：
【化１０】
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で簡便に高純度かつ収率よく製造する方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１は、式３で表わされる化合物における、Ａｓｎ残基を介して糖鎖の還元末端と結合するアミノ酸配列である。
配列番号２は、式４で表わされる化合物における、Ａｓｎ残基を介して糖鎖の還元末端と結合するアミノ酸配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法に関する。また、本発明は、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命分子として、核酸及びタンパク質に加え、糖鎖が注目されている。
膜タンパク質や細胞外などに存在する糖鎖は、細胞間の認識及び相互作用に関わる働きを有すると考えられている。そして、細胞間の認識や相互作用における変化が、癌、慢性疾患、感染症、及び老化などを引き起こす原因であると考えられている。
【０００３】
糖鎖の多くは、生体内において糖タンパク質及び糖脂質として存在し、細胞間の認識及び相互作用などにより生理機能を担うと考えられている。
生体内における糖鎖は多様な構造を有するだけでなく、存在量も微量であり、タンパク質などと結合して存在することも多いことから、一般にその精製は数多くの工程を経る必要があることが多く、糖鎖の抽出・精製操作は難しいことが知られている。
【０００４】
近年の糖化学分野における研究の進展に伴い、酵母型糖鎖を持つ糖タンパク質の糖鎖をヒト型糖鎖に置換する酵素の研究が加速しており、高い効率で酵母型糖鎖をヒト型糖鎖に置換できるようになってきている。当該方法によれば、動物細胞を用いてヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質を製造するのに比べて、ヒト型糖鎖を持つ糖たんぱく質医薬を安価で大量に供給することができる。
例えば、酵母に発現させたエリスロポエチンの酵母型糖鎖をヒト型糖鎖に置換することにより、均一なヒト型糖鎖を持つエリスロポエチンを製造することができる。
斯かる方法により得られる糖たんぱく質医薬は、その糖鎖構造がヒト型でしかも同一であることから、医薬品としての均一性が保持されることになる。上述のように、抗体医薬や生理活性タンパク質を製造する上で、ヒト型糖鎖を供給し、酵母に発現させた糖タンパク質の酵母型糖鎖をヒト型糖鎖に置換する方法は、今後非常に有効な方法になりうると考えられている。
【０００５】
しかしながら、大量のヒト型糖鎖を供給する方法は未だ確立されていないので、当該方法の確立が望まれている。
近年、ヒト型糖鎖の供給源として卵黄が注目されている。卵黄には主にヒト型糖鎖と同じ、２本鎖のＮ結合型複合型糖鎖が含まれているため、当該糖鎖を効率よく大量に抽出することができれば、卵黄を供給源としてヒト型糖鎖を供給することができる。
【０００６】
例えば、特許文献１には、鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）から１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを調製することが開示されている。また、特許文献１には、鶏卵由来脱脂卵黄に、アーモンド又は杏種子を添加することにより、アミノ酸やペプチドが結合していないシアル酸誘導体が得られることが開示されている。
非特許文献１には、鶏卵の可溶画分より抽出される糖鎖ペプチド（ＳＧＰ：シアリルグリコペプチド）が得られることが開示されている。このＳＧＰは、ヒト型糖鎖からなる１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端に、アミノ酸６残基からなるペプチド鎖のペプチド残基が結合した化合物である。
特許文献２には、シアル酸類含有オリゴ糖を、鳥類卵脱脂卵黄から水又は塩溶液で抽出することにより製造する方法が開示されている。
【０００７】
特許文献３には、アミノ基に脂溶性保護基（Ｆｍｏｃ基又はＢｏｃ基）を導入して、糖鎖アスパラギン誘導体を製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９６／０２２５５号パンフレット
【特許文献２】特開平８−９９９８８号公報
【特許文献３】国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Akira Seko, Mamoru Koketsu, Masakazu Nishizono, Yuko Enoki, Hisham R. Ibrahim, Lekh Raj Juneja, Mujo Kim, Takehiko Yamamoto, Biochimica et Biophysica Acta, 1997, Vol.1335, p.23-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献３に開示された方法で調製される糖鎖アスパラギン誘導体は、１）脱脂卵黄をタンパク質分解酵素により糖鎖ペプチド混合物を製造する工程、２）糖鎖ペプチド混合物をペプチド分解酵素により糖鎖アスパラギン混合物を製造する工程、３）糖鎖アスパラギン混合物中の糖鎖アスパラギンに脂溶性の保護基を導入し糖鎖アスパラギン誘導体混合物を製造する工程、４）糖鎖アスパラギン誘導体混合物をクロマトグラフィーに供して各糖鎖アスパラギン誘導体を分離する工程などを含む、極めて煩雑な工程を経て得られている。
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、鳥類卵脱脂卵黄より簡便に高純度かつ収率よく１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、鳥類卵脱脂卵黄を原料として、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法において、まず、鳥類卵脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物をアルコール沈殿して得られる沈殿物を脱塩する製造方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
[１]
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化１】
[２]
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物を脱塩して、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化２】
[３]
前記糖ペプチド沈殿物又は糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程が、前記沈殿物を樹脂へ保持し、次いで、水により洗浄する工程である、[１]又は[２]に記載の製造方法。
[４]
前記樹脂が、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂である、[３]に記載の製造方法。
[５]
前記逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂が、化学結合型シリカゲル樹脂である、[４]に記載の製造方法。
[６]
前記脱塩が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有する有機溶媒水溶液により溶出する工程を含む、[１]〜[５]のいずれかに記載の製造方法。
[７]
前記有機溶媒水溶液の濃度が０．１〜１０％(ｖ／ｖ)である、[６]に記載の製造方法。
[８]
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からエタノール沈殿して、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物をＯＤＳ樹脂で脱塩して１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からエタノール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化３】
[９]
前記１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンが下記式２で表される構造である、[１]〜[８]のいずれかに記載の製造方法。
式２：
【化４】
[１０]
[１]〜[９]のいずれかに記載の製造方法によって得られる１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に対し、脂溶性保護基を導入する工程、及び
アルコール沈殿工程、を含む、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
[１１]
前記脂溶性保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、トリチル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、及び２−ニトロベンゼンスルホニル基からなる群より選択される、［１０］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、簡便に高純度かつ収率よく１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの1Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図３】実施例１においてＯＤＳ樹脂を用いた溶出を再度行って製造された１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドのＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】実施例１において製造された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】実施例２において製造された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのＨＰＬＣチャートを示す。
【図６】実施例３において製造されたＦｍｏｃ１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのＨＰＬＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１７】
本実施の形態の１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン（以下、単に、「糖鎖アスパラギン」と記載する場合がある。）の製造方法は、鳥類卵脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び、前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程を含む。
【００１８】
本実施の形態において、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンとは、１１個の糖残基からなる複合型糖鎖の還元末端にアスパラギンが結合している、下記式１で表される化合物を意味する。
式１：
【化５】
【００１９】
本実施の形態の製造方法により、鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模においても、簡便に、また、好ましくは安価に、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造することができる。
また、本実施の形態の好ましい態様において、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを、工業的規模で簡便な工程により、９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上の高純度で、かつ収率よく製造することができる。
【００２０】
本実施の形態において、鳥類卵脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド混合物を得、さらに以下のような工程を行うことにより、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得ることができる（以下、単に、「１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド」を「糖ペプチド」と記載する場合がある。）。
斯かる工程として、鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、前記沈殿物を脱塩して、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、及び前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程を含む。
【００２１】
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程とは、鳥類卵脱脂卵黄を、水又は塩溶液に懸濁し、糖ペプチドの混合物などを抽出して、糖ペプチドの粗精製物である糖ペプチド抽出液を得る工程である。
糖ペプチド抽出液に含まれる糖ペプチドとしては、下記式３で表される化合物が挙げられる。
式３：
【化６】
【００２２】
式３で表わされる糖ペプチドの糖鎖の還元末端には、アミノ酸６残基（Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）からなるペプチド鎖が結合している（配列番号１）。
【００２３】
鳥類卵脱脂卵黄としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の脱脂卵黄や、鳥類卵から調製した脱脂卵黄が挙げられる。
鳥類卵としては、特に限定されるものではないが、例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル、カモ、ダチョウ、及びハトなどの卵が挙げられ、卵黄内に含まれる糖ペプチドの量が多いので、ニワトリの卵である鶏卵などが好ましい。
鳥類卵脱脂卵黄は、鳥類卵の全卵又は卵黄を、有機溶媒により脱脂処理することにより得ることができる。
鳥類卵としては、生の卵であってもよく、乾燥して得られる卵の乾燥粉末であってもよく、鶏卵卵黄及び鶏卵卵黄粉末などを用いることが好ましい。
【００２４】
脱脂処理する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、鳥類卵に有機溶媒を添加して、沈殿物と有機溶媒層を分離する方法などが挙げられる。
脱脂処理に用いられる有機溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、アセトン、メタノール、エタノール、及び２−プロパノールなどが挙げられ、有機溶媒として、１種の溶媒を用いてもよく、２種の溶媒の混合溶媒を用いてもよい。
脱脂処理において、鳥類卵に添加する有機溶媒の量として、特に限定されるものではないが、鳥類卵に対して、質量で、１〜５倍の有機溶媒を用いることにより脱脂処理を行うことができる。
脱脂処理は、特に限定されるものではないが、０〜２５℃の温度で行うことができる。
【００２５】
鳥類卵に有機溶媒を添加した後、有機溶媒と鳥類卵とをよく撹拌することにより、有機溶媒により鳥類卵に含まれる脂分を除去することができる。
有機溶媒と沈殿物とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
有機溶媒を用いた脱脂処理は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましい。
【００２６】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加して、鳥類卵脱脂卵黄から糖ペプチドを抽出する方法は、特に限定されるものではない。抽出工程において用いられる塩溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム水溶液及びリン酸緩衝液などが挙げられ、塩溶液として、１種の塩溶液を用いてもよく、２種以上の塩溶液の混合塩溶液を用いてもよい。
塩溶液の濃度としては、特に限定されるものではないが、０．０００１〜２．０％（ｗ／ｖ）である。鳥類卵脱脂卵黄に添加する水又は塩溶液の量として、特に限定されるものではないが、鳥類卵脱脂卵黄に対して、質量で、０．１〜５０倍の水又は塩溶液を用いることにより糖ペプチドの抽出を行うことができる。
糖ペプチドの抽出は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００２７】
鳥類卵脱脂卵黄に水又は塩溶液を添加した後、鳥類卵脱脂卵黄と水又は塩溶液とをよく撹拌することにより、水又は塩溶液により鳥類卵脱脂卵黄に含まれる糖ペプチドを抽出することができる。
水又は塩溶液で抽出した糖ペプチドを含有する抽出液（糖ペプチド抽出液）と、鳥類卵脱脂卵黄とを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよい。
水又は塩溶液を用いた抽出処理は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましく、２〜４回行うことがより好ましい。
抽出工程は、水を用いて行うことが好ましい。
【００２８】
糖ペプチド抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程とは、抽出工程で得られた、糖ペプチドを含有する抽出液をアルコールに添加することにより、糖ペプチドの抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物（糖ペプチド沈殿物）として得る工程である。沈殿工程においては、抽出液にアルコールを添加することで、粗精製物として、糖ペプチド沈殿物を沈殿させてもよい。
本実施の形態において、アルコールとは、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリンなどのアルコールからなる群から選択される溶媒が挙げられる。また１種の溶媒を用いてもよく、２種以上の溶媒の混合溶媒を用いてもよい。特に、炭素数１〜５からなるアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、糖ペプチド抽出液をアルコールに添加して糖ペプチドを沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）であり、抽出工程で得られた、糖ペプチド抽出液をアルコールに添加することにより、糖ペプチドの抽出液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖ペプチドを沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。
【００２９】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量として、特に限定されるものではないが、抽出液に対して、質量で、２〜２０倍のアルコールを用いることにより糖ペプチドの抽出を行うことができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールとしては、炭素数１〜５個のアルコールが好ましく、炭素数１〜３個のアルコールがより好ましい。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、メタノール及びエタノールが好ましく、中でもエタノールが好ましい。医療用用途あるいは医薬用用途として糖ペプチドを用いる場合には、アルコール沈殿工程に用いられるアルコールはエタノールを用いることが好ましい。
本実施の形態において、アルコール沈殿工程において用いるアルコールとしては、１種のアルコールを用いてもよく、２種以上のアルコールの混合溶媒を用いてもよく、アルコールと他の溶媒との混合溶媒を用いてもよい。
アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００３０】
糖ペプチドの抽出は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００３１】
アルコール沈殿工程で用いる、先の抽出工程により得られた糖ペプチド抽出液は、沈殿工程の前に、抽出液をろ過することで、清澄な抽出液とすることもでき、また、減圧濃縮などにより濃縮して得られる抽出液の濃縮液を用いてもよい。
【００３２】
アルコール沈殿工程において、糖ペプチドを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖ペプチドを、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された糖ペプチドを得ることができる。アルコールに対し糖ペプチドは溶解しないので、アルコール沈殿工程は不純物除去のために必要に応じて繰り返すことができる。アルコール沈殿工程を繰り返し行うことにより、より精製された糖ペプチドを得ることができ、糖ペプチドの沈殿は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましく、２〜４回行うことがより好ましい。
【００３３】
糖ペプチド沈殿物を脱塩する脱塩工程とは、沈殿工程で得られた糖ペプチドを含有する粗精製物としての沈殿物（糖ペプチド沈殿物）から塩を除去する工程である。
脱塩工程としては、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができ特に限定されるものではない。脱塩工程は、特に限定されるものではないが、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することが可能である。脱塩工程としては、例えば、沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂へ保持させ、次いで、水により洗浄することにより脱塩することもできる。
また、本実施の形態においては、上述した抽出工程と沈殿工程を行うことにより得られる沈殿物を脱塩することにより、工業的規模で簡便に１１糖シアリルオリゴ糖ぺプチドを製造することができる。
特許文献１に記載されるような従来の方法においては、鶏卵由来脱脂卵黄（粉末）から水で抽出、逆浸透膜により濃縮、陰イオン交換樹脂に吸着させた後、脱塩してＮａＣｌ水溶液による溶出を行い、濃縮し、再度、脱塩工程を行う必要があり、工業的規模で行うには簡便な方法であるとは言えない。
【００３４】
沈殿物の樹脂への保持は、吸着、担持など公知の結合様式を利用した保持方法により、沈殿物を樹脂へ保持させることができる。また、沈殿物は、水で洗浄する際に、沈殿物が洗浄液と共に流出しない程度に、保持されていればよい。
樹脂としては、特に限定されるものではないが、例えば、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂などが挙げられ、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂とは、シリカゲル系、ポリマー系を代表とする樹脂を意味し、特に限定されるものではないが、例えば、ポリ(スチレン／ジビニルベンゼン)ポリマーゲル樹脂、ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、ポリヒドロキシメタクリレート樹脂、スチレンビニルベンゼン共重合体樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、化学結合型シリカゲル樹脂などが挙げられる。
化学結合型シリカゲル樹脂とは、特に限定されるものではないが、例えば、多孔性シリカゲルにジメチルオクタデシルクロロシランの様なシランカップリング剤を反応させて製造する樹脂などが挙げられ、シリカゲルに対し、同様の手法で異なるシリル化剤を用いることで、ジメチルオクタデシル、オクタデシル（Ｃ１８）、トリメチルオクタデシル、ジメチルオクチル、オクチル（Ｃ８）、ブチル、エチル、メチル、フェニル、シアノプロピル、アミノプロピル基からなる群から選択される基を化学結合することで得られる樹脂などが挙げられる。あるいは炭素数２２のドコシル（Ｃ２０）基及び炭素数３０のトリアコンチル（Ｃ３０）基を結合して得られる樹脂であってもよい。
本実施の形態において、好ましい化学結合型シリカゲル樹脂として、シリカゲルを基材として、オクタデシル基が担持された、オクタデシル基結合シリカゲル樹脂（ＯＤＳ樹脂）が挙げられる。
【００３５】
脱塩工程は、脱塩した後に樹脂に保持されている糖ペプチド（１１糖シアリルオリゴ糖ペプチド）を、有機溶媒水溶液により溶出する工程を含むことが好ましく、脱塩工程において脱塩した後に、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する溶出工程を行うことにより１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの純度を向上させることができる。より好ましい態様においては、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの純度を９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上とすることができる。例えば、再度、脱塩工程（溶出工程）を繰り返すことで糖ペプチドの純度をさらに向上させることができる。糖ペプチドの純度を向上させることは、例えばＥｎｄｏ−Ｍの様な糖転移酵素を用いて、本実施の形態において得られた糖ペプチドの糖鎖部分を他の糖鎖あるいは糖鎖誘導体へ転移反応を行う場合（ペプチド鎖中の糖鎖へ転移する場合も含む）には、不純物による妨害反応が減少し、目的の転移反応の反応効率が向上するのでより好ましい。
溶出工程に用いる有機溶媒は、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有し、有機溶媒水溶液の濃度が、有機溶媒の水溶液中での濃度として、０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であることが好ましく、０．１〜１０％(ｖ／ｖ)であることがより好ましい。
【００３６】
脱塩工程又は溶出工程は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００３７】
脱塩工程としては、樹脂を用いた脱塩工程以外にも、分離膜を用いることにより沈殿工程で得られた沈殿物から脱塩することが可能である。
斯かる脱塩工程としては、例えば、限外ろ過膜又は逆浸透膜を用いることで沈殿物の脱塩を行うことができる。
脱塩工程に用いる膜としては、特に限定されるものではないが、例えば、ポリアクリロニトリル、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリビニリデンフルオライド、ポリテトラフルオロエチレン、芳香族ポリアミド、酢酸セルロース、ポリビニルアルコールを構成基材とする平膜又は中空糸膜、スパイラル膜又はチューブラー膜などが挙げられる。該膜として、さらにはイオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜あるいは逆浸透膜で脱塩することも可能である。
【００３８】
本実施の形態において、糖ペプチドを精製する方法としては、公知のペプチド、糖質、又は糖ペプチドなどの精製方法を用いることができるが、特に限定されるものではない。例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、メチルなどを充填剤表面に固定化したものが挙げられ、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００３９】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖ペプチド中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖ペプチドを添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖ペプチドの脱塩を行うことができる。脱塩工程が、糖ペプチド沈殿物を樹脂に、好ましくは、ＯＤＳ樹脂に保持し、水でより洗浄し、次いで有機溶媒水溶液により１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを溶出する工程を含んでいてもよい。
【００４０】
脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖ペプチドを得ることができる。より好ましい態様においては、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの純度を９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上、更に好ましくは９９％以上とすることができる。
糖ペプチドを添加することで糖ペプチドを保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で、樹脂の１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることにより糖ペプチドを得ることができる。
【００４１】
有機溶媒水溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種の有機溶媒の水溶液などが挙げられる。
有機溶媒水溶液としてはアセトニトリルが好ましく、特にアセトニトリル水溶液で溶出工程を実施することで、不純物の１つである末端シアル酸が部分的に切断された糖ペプチドと、所望の糖ペプチドとの溶出工程における分離の純度向上が著しく、９５％以上の純度で糖ペプチドを得ることができる。
有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜２０％(ｖ／ｖ)であることが好ましく、より好ましくは０．５〜２０％(ｖ／ｖ)であり、さらに好ましくは１０％(ｖ／ｖ)以下、よりさらに好ましくは５％(ｖ／ｖ)以下である。有機溶媒水溶液の濃度は、０．５〜３％(ｖ／ｖ)が好ましい。
【００４２】
特許文献１に記載されるような従来の方法においては、樹脂からの溶出操作において、例えば、陰イオン交換樹脂などを用いた場合には樹脂に吸着させた後、塩溶液又は酸性溶液による溶出操作が必要となる。ところが、酸性溶液で溶出する場合、末端シアル酸が糖ペプチドから脱離することも考えられることから好ましくない。また、塩溶液での溶出の場合は溶出液からの脱塩処理を再度行う必要が生じ、大量製造においては工程数の増加となる。本実施の形態においては、溶出工程において好ましくは有機溶媒水溶液にて溶出することにより、溶出液の脱塩操作を必要としないため工程数を減少させることができるので大量製造に適する。また、本実施の形態における方法では、溶出液の濃縮時のｐＨ変化も起こらず糖ペプチドの糖鎖部分の分解もこれまで開示された方法に比べて少ない点で有利である。
有機溶媒水溶液により糖ペプチドを溶出する工程においては、水から徐々に、溶出液としての有機溶媒水溶液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００４３】
溶出された糖ペプチドは、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖ペプチドとして得ることができる。
本実施の形態において、得られた糖ペプチドは、再度アルコール沈殿工程を行ってさらに精製してもよい。また、ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、再度糖ペプチドを吸着させ、質量で、樹脂の１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて再度樹脂から溶出させることにより、より高純度（９９％以上）の糖ペプチドを得ることができる。
【００４４】
１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程は、糖ペプチドのペプチド部分を選択的に加水分解することで、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを含む酵素分解物の混合物（１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物）を得る工程である。通常、アスパラギン混合物は、糖鎖アスパラギンを含む酵素反応液として得ることができる。
該工程においては、上記式４で表される１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドが、ペプチド分解酵素により酵素分解されて、上記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンへと変換される。一般的には、糖鎖アスパラギンの立体化学は、糖ペプチドの立体化学が保持される形式で、酵素分解が行われる。
【００４５】
ペプチド分解酵素としては、例えば、プロナーゼ（和光純薬社製）、アクチナーゼ-E（科研製薬社製）、オリエンターゼなど、一般のカルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼなどのプロテアーゼを使用することができる。
プロテアーゼとしては、至適ｐＨを７〜８に有するエンド型プロテアーゼが挙げられ、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属などの産生するプロテアーゼなどが考えられる。
具体的には、オリエンターゼＯＮＳ、９０Ｎ（阪急バイオ社製）、プロテアーゼＮ（天野製薬社製）、ＡＯプロテアーゼ（盛進製薬社製）などの食品添加物用プロテアーゼなどがあり、また他の起源であるアクチナーゼＥ、キモトリプシン、トリプシンなどの酵素などが挙げられる。
酵素分解反応は、各プロテアーゼの至適ｐＨ・温度・イオン強度において行うことで１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンへ進行させることができる。
分解反応条件として、ｐＨ７〜８、温度３０〜５０℃、イオン強度０．１〜１．０で酵素分解反応を行うことが好適である。
また、酵素分解反応におけるペプチド分解酵素の酵素量は、脱脂卵黄に対し０．０３〜２０％（ｗ／ｗ）加えることにより効率良く１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンへと酵素分解反応を行うことができる。
【００４６】
次いで、アルコールを用いた糖鎖アスパラギンの沈殿工程において糖鎖アスパラギン混合物を分離する。
１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る工程は、酵素反応工程で得られた糖鎖アスパラギンを含有する混合物（糖鎖アスパラギン混合物）をアルコールに添加することにより、糖鎖アスパラギンの混合物を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖鎖アスパラギンを沈殿物（糖鎖アスパラギン沈殿物）として得る工程である。
本沈殿工程においては、混合物にアルコールを添加することで、粗精製物として、糖鎖アスパラギンを沈殿させてもよい。この工程において糖鎖アスパラギンと酵素が主に沈殿生成物として得られる。
【００４７】
本実施の形態において、本沈殿工程は、糖ペプチド抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る上記沈殿工程として記載する方法と同様にして行うことができる。また、本沈殿工程を上記アルコール沈殿工程として行ってもよい。
本実施の形態における、アルコールとは、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、エチレングリコール、グリセリンなどのアルコールからなる群から選択される溶媒が挙げられる。また１種の溶媒を用いてもよく、２種以上の溶媒の混合溶媒を用いてもよい。特に、炭素数１〜５からなるアルコールであることが好ましく、沈殿工程において、水溶性有機溶媒がアルコールである場合、該沈殿工程は、糖鎖アスパラギンの抽出液をアルコールに添加して糖鎖アスパラギンを沈殿させる工程（以下、「アルコール沈殿工程」と記載する場合がある。）であり、抽出工程で得られた、糖鎖アスパラギンを含有する抽出液をアルコールに添加することにより、糖鎖アスパラギンの混合液を濃縮するだけでなく精製度の向上した糖鎖アスパラギンを沈殿物として得るアルコール沈殿工程である。
【００４８】
アルコール沈殿工程に用いられるアルコールの量として、特に限定されるものではないが、酵素反応液に対して、質量で、２〜２０倍のアルコールを用いることにより糖鎖アスパラギンの抽出を行うことができる。またアルコール沈殿工程に用いられるアルコールとしては、炭素数１〜５個のアルコールが好ましく、炭素数１〜３個のアルコールがより好ましい。炭素数１〜３個のアルコールとしては具体的には、メタノール、エタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）を挙げることができ、メタノール及びエタノールが好ましく、中でもエタノールが好ましい。医療用用途あるいは医薬用用途として糖鎖アスパラギンを用いる場合には、アルコール沈殿工程に用いられるアルコールはエタノールを用いることが好ましい。アルコール溶媒が混合物である場合、例えば、メタノール又は２−プロパノールをエタノールに対し０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。また、エタノールに対しアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテルを０．０１〜５０％添加した混合溶媒を用いてもよい。
【００４９】
糖鎖アスパラギンの抽出は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
【００５０】
アルコール沈殿工程において、糖鎖アスパラギンを分離する方法としては、特に限定されるものではないが、２，０００〜１０，０００ｒｐｍで５〜３０分遠心分離してもよく、４〜２５℃で静置することで分離してもよい。
得られた糖鎖アスパラギンを、水又は塩溶液に溶解し、再度アルコール沈殿工程を行うことにより、より精製された糖鎖アスパラギンを得ることができる。アルコールに対し糖鎖アスパラギンは溶解しないので、アルコール沈殿工程は不純物除去のために必要に応じて繰り返すことができる。アルコール沈殿工程を繰り返し行うことにより、より精製された糖鎖アスパラギンを得ることができ、糖鎖アスパラギンの沈殿は、特に限定されるものではないが、２〜６回行うことが好ましく、２〜４回行うことがより好ましい。
【００５１】
次いで、糖鎖アスパラギン及び混合物の脱塩工程において糖鎖アスパラギンを分離する。
糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程とは、沈殿工程で得られた糖鎖アスパラギンを含有する粗精製物としての沈殿物（糖鎖アスパラギン沈殿物）から塩、ペプチド及びアミノ酸などの低分子量化合物あるいは酵素等を除去する工程である。
本脱塩工程は、糖ペプチド沈殿物を脱塩する上記脱塩工程として記載する方法と同様にして行うことができる。
脱塩工程としては、脱塩方法として知られた種々の公知の方法で行うことができ特に限定されるものではない。脱塩工程は、特に限定されるものではないが、イオン交換樹脂、イオン交換膜、ゲルろ過、透析膜、限外ろ過膜又は逆浸透膜などを用いて脱塩することが可能である。脱塩工程としては、例えば、アルコール沈殿工程で得られた沈殿物を樹脂へ保持させ、次いで、水により洗浄することにより脱塩することもできる。
具体的には、公知のクロマトグラフィー、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーにより得られた糖鎖アスパラギン中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよい。この脱塩工程において糖鎖アスパラギンに分離する。
【００５２】
糖鎖アスパラギンの脱塩工程は、特に限定されるものではないが、４〜２５℃の温度で行うことができる。
脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖鎖アスパラギンを得ることができる。より好ましい態様においては、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの純度を９０％以上、好ましくは９３％、より好ましく９５％以上とすることができる。
【００５３】
本実施の形態において、糖鎖アスパラギンを精製する方法としては、上述の糖ペプチドを精製する方法と同様にして、公知のペプチド、糖質、又は糖ペプチドなどの精製方法を用いることができるが、特に限定されるものではない。例えば、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーなどが挙げられる。逆相クロマトグラフィーに用いられる担体としては、特に限定されるものではないが、例えば、シリカを基材としてオクタデシル、オクチル、フェニル、シアノプロピル、メチルなどを充填剤表面に固定化したものが挙げられ、その中でＯＤＳ樹脂などが挙げられる。
【００５４】
ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂充填剤を用いたカラムクロマトグラフィーによる精製方法においては、沈殿により得られた糖鎖アスパラギン中に含まれる塩を脱塩する工程を含んでいてもよく、有機溶媒水溶液により糖鎖アスパラギンを溶出する工程を含んでいてもよい。
糖鎖アスパラギンを添加して保持させたシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の水を用いて樹脂を洗浄することにより糖鎖アスパラギンの脱塩を行うことができる。脱塩工程が、糖鎖アスパラギン沈殿物を樹脂に、好ましくは、ＯＤＳ樹脂に保持し、水でより洗浄し、次いで有機溶媒水溶液により１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを溶出する工程を含んでいてもよい。
【００５５】
本実施の形態における製造方法により得られる１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンは、下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンである。
式１：
【化７】
糖鎖アスパラギンとしては、下記式２で表される構造であってもよい。
式２：
【化８】
【００５６】
本実施の形態において、上記のようにして得られる糖鎖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に対し、脂溶性保護基を導入する工程、及びアルコール沈殿工程、を含む、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法をも提供する（以下、単に、「脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン」を「糖鎖アスパラギン誘導体」と記載する場合がある。）。
【００５７】
本実施の形態において、「脂溶性保護基が導入された」とは、糖鎖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に、脂溶性保護基が結合していることを意味する。
【００５８】
脂溶性保護基としては、カーバメート系、アシル系、イミド系、アルキル系、スルホンアミド系から選択される脂溶性保護基が挙げられる。カーバメート系保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ又はＣｂｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）基、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられ、アシル系保護基としては、アセチル（Ａｃ）基等が挙げられ、イミド系保護基としては、フタロイル（Ｐｈｔ）基等が挙げられ、アルキル系保護基としては、トリチル（Ｔｒｔ）基等が挙げられ、スルホンアミド系保護基としては、ｐ−トルエンスルホニル基（Ｔｓ又はＴｏｓ）基、２−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ）基等が挙げられる。なお、上記記載した略号は例示であり、また、例えば、ｐ−トルエンスルホニル基は、トシル基と別名で記載される場合もあるように、本実施の形態において上記例示する脂溶性保護基としては、上記している基が示す構造を有している基であればよい。
【００５９】
脂溶性保護基をアスパラギンのアミノ基に導入する方法は、特に限定されないが、通常のペプチド合成に用いる縮合方法を用いることができる。
例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒａ Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ，ＪＯＨＮ ＷＩＬＬＹ ＆ ＳＯＮＳ， ＩＮＣ．に記載された方法を適宜用いることができる。
例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノールなどの活性エステルによりカルボキシル基が活性化されたアミノ基脂溶性保護試薬を、必要に応じて、試薬を溶解できるアセトン、アセトニトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミンなどの有機塩基、炭酸水素ナトリウム、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等の無機塩基の存在下、氷冷下又は室温下で１５分〜１８０分反応させる方法が挙げられる。
アミノ基脂溶性保護試薬は、アスパラギンのアミノ基に対して過剰量、例えばアミノ基の１モルに対して１．１モルから３モルのアミノ基脂溶性保護試薬を添加することで、アスパラギンのアミノ基に脂溶性保護基を導入することができる。
【００６０】
本実施の形態の糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法においては、アルコール沈殿工程を介して糖鎖アスパラギン誘導体が得られるが、必要に応じてアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程のみで、純度９５％程度の糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。更に高純度の糖鎖アスパラギン誘導体を得るためには、必要に応じて脱塩工程を組み合わせることで達成される。すなわち、ＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に添加し水で溶出し脱塩を行った後に、有機溶媒水溶液により溶出することにより糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。すなわち糖鎖アスパラギン誘導体を添加して、糖鎖アスパラギン誘導体を保持させたＯＤＳ樹脂などのシリカゲル樹脂に対し、質量で、１〜５０倍の有機溶媒水溶液を用いて樹脂から溶出させることで、より高純度の糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
【００６１】
有機溶媒水溶液としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種の有機溶媒の水溶液などが挙げられ、有機溶媒水溶液の濃度は０．１〜７０％(ｖ／ｖ)であり、好ましくは１〜５０％(ｖ／ｖ)である。有機溶媒水溶液により糖鎖アスパラギン誘導体を溶出する工程においては、水から徐々に濃度を上げていき溶出を行えばよく、又は有機溶媒水溶液である溶出液にグラジエントをかけて溶出を行ってもよい。
【００６２】
溶出された糖鎖アスパラギン誘導体は、有機溶媒水溶液の減圧濃縮及び乾燥などにより粉末状の糖鎖アスパラギン誘導体として得ることができる。本実施の形態において、得られた糖鎖アスパラギン誘導体は、再度アルコール沈殿工程あるいは脱塩工程を行ってさらに精製してもよい。
【００６３】
また、トリフェニルメチルクロライドをＤＭＦ、ＤＭＳＯ等の有機溶媒と水との混合溶媒中で、有機アミンなどの有機塩基存在下、室温下で４時間〜２日反応させる方法によりアスパラギンのアミノ基にトリチル基を導入することができる。糖鎖アスパラギン誘導体の精製は、必要に応じてアセトン、アセトニトリル又はジエチルエーテル等を添加したアルコール沈殿工程のみで、高純度の糖鎖アスパラギン誘導体を得ることができる。
以上、本実施の形態において、脂溶性保護基が導入された糖鎖アスパラギンの精製においてはアルコール沈殿工程が重要であり、クロマトグラフィーに供さずに、この工程のみでも高純度の生成物を得ることができる。
【００６４】
糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法における、アルコール沈殿工程や脱塩工程などの工程については、上記した方法と同様に、また、参考にして実施することができる。
【実施例】
【００６５】
以下、本実施の形態を実施例及び比較例によってさらに具体的に説明するが、本実施の形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施の形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。
【００６６】
［ＨＰＬＣ分析］糖ペプチド
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２％→１７％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６７】
［1Ｈ−ＮＭＲ測定］糖ペプチド
Ｄ2Ｏ ０．４ｍＬに試料 ２ｍｇを溶解して、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−６００（６００ＭＨｚ）で1Ｈ−ＮＭＲを測定した。
【００６８】
［ＨＰＬＣ分析］糖鎖アスパラギン（実施例１）
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；０％→１５％（３０ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．３ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
[ＨＰＬＣ分析］糖鎖アスパラギン（実施例２）
カラム（Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ Ａｑｕａ(関東化学、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；０％→１０％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
［ＨＰＬＣ分析］Ｆｍｏｃ糖鎖アスパラギン（実施例３）
カラム（Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (Ｉｍｔａｋｔ、１５０×２ｍｍ）)を備えたＧＬサイエンス製ＨＰＬＣ ＧＬ−７４００システムを用いて、以下の測定条件によりＨＰＬＣ分析を行った。
測定条件：
グラジエント；２０％→１００％（１５ｍｉｎ）、ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ；２１４ｎｍ
【００６９】
以下の測定条件でＬＣ／ＭＳ測定を行った。用いたＬＣ及びＭＳのシステムは以下のとおりである。
[ＬＣ／ＭＳ測定]糖鎖アスパラギン（実施例１）
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｉｍｔａｋｔ，Ｓｃｈｅｒｚｏ−Ｃ１８ (１５０×２ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；Ａ＝水（０．０５％ ＨＣＯＯＨ）
Ｂ＝０．１Ｍ ＨＣＯＯＮＨ4／ＣＨ3ＣＮ（１／１）
Ｂ％：２％→１００％（２０ｍｉｎ）
ＭＳ：サーモエレクトロン（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｎｅｇａｔｉｖｅ
[ＬＣ／ＭＳ測定]Ｆｍｏｃ糖鎖アスパラギン（実施例３）
ＬＣ:アジレント製１１００シリーズ
カラム：Ｉｍｔａｋｔ，Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８ (１５０×２ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速；０．２ｍＬ／ｍｉｎ
ＵＶ：２１４ｎｍ
グラジエント；Ａ＝水（０．１％ ＴＦＡ）
Ｂ＝ＣＨ3ＣＮ（０．１％ ＴＦＡ）
Ｂ％：２０％→１００％（２０ｍｉｎ）
ＭＳ：サーモエレクトロン（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）製ＬＣＱ
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｎｅｇａｔｉｖｅ
【００７０】
［実施例１］
鶏卵卵黄２０個にエタノール５００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を得た。得られた沈殿物にエタノール５００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を除去する操作を３回繰り返して、沈殿物として脱脂卵黄２７０ｇを得た。
得られた上記脱脂卵黄２７０ｇに水５００ｍＬを添加し、よく撹拌した。８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を得た。デカンテーションにより得られた沈殿物に水３００ｍＬを添加し、よく撹拌後、遠心分離し、上清を回収する操作を３回繰り返した。回収した上清をグラスフィルターにて濾過後、３５０ｍＬまで減圧濃縮した。その後、得られた濃縮溶液をエタノール１５００ｍＬに注加し、生じた沈殿物を、８，０００ｒｐｍで２０分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで回収した。得られた沈殿物を水に溶解し、再度エタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。ここで生じた沈殿物を回収することで粗精製糖ペプチド２．５８ｇを得た。
ＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）４０ｇを用い、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。粗精製糖ペプチド２．５ｇを水２０ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。粗精製糖ペプチドを添加した樹脂を水２００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを溶出した。溶出液を凍結乾燥することで２１２ｍｇの糖ペプチドを得た。
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ及び1Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図１及び２に示す。ＨＰＬＣによる純度では９５％であった。得られた糖ペプチドは標品（東京化成製）との比較により下記式４で表される構造であることが分かった（配列番号２）。
式４：
【化９】
【００７１】
さらにＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）４０ｇをガラスカラムに充填し、該樹脂をメタノールで洗浄後、水で置換した。上記で得られた糖ペプチド１００ｍｇを水５ｍＬに溶解し水で置換後の樹脂に添加した。糖ペプチドを添加した樹脂を水１００ｍＬで洗浄後、２％アセトニトリル水溶液で糖ペプチドを再度溶出した。溶出液を凍結乾燥することで７０ｍｇの糖ペプチドを得た。得られた糖ペプチドのＨＰＬＣによる測定結果を図３に示す。ＨＰＬＣによる純度は９９％であった。
【００７２】
上記糖ペプチド１０ｍｇを０．５ｍＬのトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（５０ｎｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ ＮａＮ３ ｐＨ７．５）に溶解し０．１ｍＬの同緩衝液に溶解した１ｍｇ科研製薬製ＡｃｉｔｎａｓｅＥを加え３７℃で３日間攪拌した。その後反応液を５ｍＬエタノールに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を水０．５ｍＬに溶解し、５ｍＬエタノールに注加した。この操作を３回繰り返した。最終沈殿物を水０．５ｍＬに溶解しゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂、８ｍL）により水溶離液による脱塩を行い、その後凍結乾燥することで目的とする１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン４．５ｍｇ（収率５５．２％）を得た。
【００７３】
得られた糖鎖アスパラギンのＨＰＬＣによる測定結果を図４に示す。ＨＰＬＣによる純度は９５％であった。得られた糖鎖アスパラギンはＬＣ／ＭＳ測定により１１６９．５([Ｍ＋２Ｈ]2+)及び１１６７．７([Ｍ−２Ｈ]2-)であり上記式１で表される化合物の分子量２３３７と一致することが分かった。
【００７４】
［実施例２］
実施例１と同様にして得られた、糖ペプチド１００ｍｇを５ｍＬのトリス−塩酸・塩化カルシウム緩衝溶液（５０ｎｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ ＮａＮ３ ｐＨ７．５）に溶解し１ｍＬの同緩衝液に溶解した５０ｍｇ科研製薬製ＡｃｉｔｎａｓｅＥを加え３７℃で７日間攪拌した。その後反応液を２０ｍＬエタノールに注加し８，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を水１ｍＬに溶解し１０，０００ｒｐｍで分遠心分離したが沈殿は見られなかった。またデカンテーションによるＥｔＯＨ層には糖鎖アスパラギンが検出されなかった。次いで水溶液を１０ｍＬエタノールに注加し、１０，０００ｒｐｍで３分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。この操作を３回繰り返した。最終沈殿物を水０．５ｍＬに溶解しゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５樹脂、８ｍL）に添加し水で溶出することで脱塩を行い、その後凍結乾燥することで粗精製１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン６６．４ｍｇを得た。次いでＯＤＳ樹脂としてシリカゲル樹脂Ｗａｋｏｇｅｌ（１００Ｃ１８）を用いて水で溶出するカラムクロマトグラフィーを行い目的とする１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン５０ｍｇ（収率６１％）を得た。
得られた糖鎖アスパラギンのＨＰＬＣによる測定結果を図５に示す。糖鎖アスパラギンはＬＣ／ＭＳ測定によれば１１６７．７([Ｍ−２Ｈ]2-)であり上記式１で表される糖鎖アスパラギンと一致することが分かった。
【００７５】
［実施例３］
実施例２で得られた糖鎖アスパラギン５ｍｇを１ｍＬの水に溶解し、ＤＭＦ０．５ｍＬを加えた、次いでＦｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎ−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｎｏｎｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）６ｍｇを１．５ｍＬのＤＭＦに溶解したものを加えた。次いで１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ０．１ｍＬを加え室温下６時間反応を行った。
その後反応液を１０ｍＬエタノールに注加し９，０００ｒｐｍで３分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。得られた沈殿物を水０．５ｍＬに溶解し１０ｍＬエタノールに注加し、９，０００ｒｐｍで３分遠心分離し、デカンテーションにより上清を除去することで沈殿物を回収した。この操作を３回繰り返した。沈殿物を０．５ｍＬの水に溶解し凍結乾燥することで目的とする糖鎖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基がＦｍｏｃ化されたＦｍｏｃ糖鎖アスパラギン５ｍｇを得た。
得られたＦｍｏｃ糖鎖アスパラギンのＨＰＬＣによる測定結果を図６に示す。ＨＰＬＣによる純度は９５％であった。得られたＦｍｏｃ糖鎖アスパラギンはＬＣ／ＭＳにより１２８０．７([Ｍ＋２Ｈ]2+)及び１２７８．８([Ｍ−２Ｈ]2-)であることから、分子量２５５８．８９である下記式５で表される構造であることが示唆された。
式５：
【化１０】
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によれば、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを鳥類卵脱脂卵黄より工業的規模で簡便に高純度かつ収率よく製造する方法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１は、式３で表わされる化合物における、Ａｓｎ残基を介して糖鎖の還元末端と結合するアミノ酸配列である。
配列番号２は、式４で表わされる化合物における、Ａｓｎ残基を介して糖鎖の還元末端と結合するアミノ酸配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化１】
【請求項２】
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物を脱塩して、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化２】
【請求項３】
前記糖ペプチド沈殿物又は糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程が、前記沈殿物を樹脂へ保持し、次いで、水により洗浄する工程である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記樹脂が、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂が、化学結合型シリカゲル樹脂である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記脱塩が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有する有機溶媒水溶液により溶出する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記有機溶媒水溶液の濃度が０．１〜１０％(ｖ／ｖ)である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からエタノール沈殿して、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物をＯＤＳ樹脂で脱塩して１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からエタノール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化３】
【請求項９】
前記１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンが下記式２で表される構造である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
式２：
【化４】
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法によって得られる１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に対し、脂溶性保護基を導入する工程、及び
アルコール沈殿工程、を含む、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
【請求項１１】
前記脂溶性保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、トリチル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、及び２−ニトロベンゼンスルホニル基からなる群より選択される、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１】
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類脱脂卵黄から１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得、次いで、前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化１】
【請求項２】
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水又は塩溶液で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からアルコール沈殿させて、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物を脱塩して、１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からアルコール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
前記糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化２】
【請求項３】
前記糖ペプチド沈殿物又は糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程が、前記沈殿物を樹脂へ保持し、次いで、水により洗浄する工程である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記樹脂が、逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記逆相分配クロマトグラフィー充填用樹脂が、化学結合型シリカゲル樹脂である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記脱塩が、アセトニトリル、メタノール、及びエタノールからなる群から選択される少なくとも１種を含有する有機溶媒水溶液により溶出する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記有機溶媒水溶液の濃度が０．１〜１０％(ｖ／ｖ)である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
鳥類卵脱脂卵黄から下記式１で表される１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンを製造する方法であって、
鳥類卵脱脂卵黄を水で抽出して糖ペプチド抽出液を得る抽出工程、
前記抽出液からエタノール沈殿して、糖ペプチド沈殿物を得る沈殿工程、
前記沈殿物をＯＤＳ樹脂で脱塩して１１糖シアリルオリゴ糖ペプチドを得る工程、
前記糖ペプチドをペプチド分解酵素により分解して１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギン混合物を得る工程、
前記混合物からエタノール沈殿して、糖鎖アスパラギン沈殿物を得る沈殿工程、及び
糖鎖アスパラギン沈殿物を脱塩する脱塩工程、を含む、１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
式１：
【化３】
【請求項９】
前記１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンが下記式２で表される構造である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
式２：
【化４】
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法によって得られる１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンのアスパラギンに由来するアミノ基に対し、脂溶性保護基を導入する工程、及び
アルコール沈殿工程、を含む、脂溶性保護基が導入された１１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法。
【請求項１１】
前記脂溶性保護基が、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、トリチル基、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基、フタロイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、及び２−ニトロベンゼンスルホニル基からなる群より選択される、請求項１０に記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−１９１９３２（Ｐ２０１２−１９１９３２Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−４５４１７（Ｐ２０１２−４５４１７）
【出願日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【出願人】（０００１７３９２４）公益財団法人野口研究所 (108)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【出願人】（０００００００３３）旭化成株式会社 (901)
【出願人】（０００１７３９２４）公益財団法人野口研究所 (108)
【Ｆターム（参考）】
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