２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法
【課題】２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法の提供。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、（ａ）特定のアミノ酸配列、（ｂ）特定のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、（ａ）特定のアミノ酸配列、（ｂ）特定のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法に係り、特にユーグレナ属由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）は、動物学と植物学の双方に分類され、動物学上は鞭毛虫綱、植物学上はミドリムシ藻類綱に属するミドリムシ目の微生物である。ユーグレナ属の微生物は、動物学的、植物学的な特徴を兼ね備えた独特の性質を有しており、生化学、生理学等の分野で古くから研究対象として用いられてきた。
【０００３】
ユーグレナは、他の微生物と比較して特殊なＴＣＡ回路を有しており、コハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）という物質を産生することが知られている。
コハク酸セミアルデヒドは、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ（２−ＯＧＤ）により２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ：α−ケトグルタル酸ともいう）から生成する。２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの触媒反応は、下記一般式（１）のとおりである。
【０００４】
【化１】
（ここで、ＴＰＰはチアミンピロリン酸を示す。）
【０００５】
コハク酸セミアルデヒドの炭素鎖は、乳酸よりも炭素１つ分長いため、コハク酸セミアルデヒドの重合体はポリ乳酸と同様に生分解性プラスチックとしての性質を有していると同時に、ポリ乳酸とは炭素１つ分異なる特性を有していると考えられる。
このため、コハク酸セミアルデヒドは、現在ポリ乳酸を主体に研究、開発が進んでいる生分解性プラスチックの分野において、乳酸に代わる新たな原料として期待されている。
【０００６】
さらに、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの遺伝子を他の植物等に遺伝子組換えなどで組み込むことにより、コハク酸セミアルデヒドやその重合体である生分解性プラスチックを産生する植物等を生成することも可能になる。特に、コハク酸セミアルデヒドは、濃度が高くなると自然に重合するため、宿主細胞中でコハク酸セミアルデヒドを大量に生成させて高濃度状態とすることにより、細胞中にコハク酸セミアルデヒド重合体からなる生分解性プラスチックを産生する新規な生物を作出できると期待されている。
【０００７】
また、上述した２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの生成物であるコハク酸セミアルデヒドの利用のみならず、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼそのものを産業に利用することも期待されている。
例えば、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用いることで、酵素反応により２−オキソグルタル酸を定量することができる。以下、詳細に説明する。
【０００８】
従来から、悪性腫瘍を有する患者は、血漿中の２−オキソグルタル酸濃度が高くなることが知られている。これは、腫瘍細胞ではクエン酸回路に異常が生じて細胞中に２−オキソグルタル酸が大量に蓄積し、高濃度の２−オキソグルタル酸が血漿中に浸潤するためと考えられている。したがって、血漿中の２−オキソグルタル酸を定量することで、悪性腫瘍の有無を検出することが可能となる。
【０００９】
従来、血漿中に含まれる２−オキソグルタル酸の定量は、２−オキソグルタル酸と反応する試薬を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により行われていた（例えば、非特許文献１参照）。
非特許文献１の方法では、２−オキソグルタル酸を含む血漿中に２−ニトロフェニルヒドラジンと２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを混合して反応させ、生成した２−オキソグルタル酸誘導体をＨＰＬＣ用のカラムに流して２−オキソグルタル酸誘導体を定量する。これにより、間接的に２−オキソグルタル酸の定量を行っている。
【００１０】
しかしながら、ＨＰＬＣ法による定量では、反応物をカラムから溶出する時間がかかり、迅速な定量が困難であった。そこで、２−オキソグルタル酸の定量方法として、２−オキソグルタル酸を基質として特異的に反応する２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用いる方法が新たに検討されている。
【００１１】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｃｈａｉｌら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ」、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ、（オランダ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００７、５８１、ｐ．２８７−２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このように、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、生成物であるコハク酸セミアルデヒドが産業上有用であるばかりでなく、基質である２−オキソグルタル酸の定量にも用いることができることから、その生化学的、構造学的特性の詳細な研究が期待されている。
しかしながら、これまで、ユーグレナ由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニングに成功した例はなく、そのアミノ酸配列やＤＮＡ塩基配列についても未知であった。
【００１３】
本発明の目的は、上記課題に鑑み、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
今回発明者らは、上記目的を達成するために鋭意努力した結果、ユーグレナ由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの新たなアミノ酸配列及びＤＮＡ塩基配列の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００１５】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｄ）前記（ｃ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
以下の（ｅ）又は（ｆ）に示されるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２に記載のＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
前記いずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【００１８】
前記組換えベクターを含有する形質転換体。
【００１９】
前記形質転換体を培養し、培養物から２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを採取することを特徴とする２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【００２０】
前記いずれかに記載の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼと２−オキソグルタル酸とを反応させ、生成したコハク酸セミアルデヒド及び二酸化炭素の少なくとも一方の生成量を測定することで、前記２−オキソグルタル酸の定量を行うことを特徴とする２−オキソグルタル酸の測定方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの新規なアミノ酸配列と、これをコードするＤＮＡ塩基配列とが初めて提供された。そして、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用いることで、その基質である２−オキソグルタル酸の定量が容易になり、また、その反応生成物であるコハク酸セミアルデヒドを用いて新たな特性を有する生分解性プラスチックを生成することが可能となる。このため、本発明は産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の一実施形態について説明する。なお、以下に説明する部材、配置等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
【００２３】
本発明の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、チアミンピロリン酸とマグネシウムイオンの存在下で２−オキソグルタル酸を非酸化的に脱炭酸し、コハク酸セミアルデヒドを生成する脱炭酸酵素の一種である。２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、分子量約６万２０００からなる４量体構造をしている。
【００２４】
本発明の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列であるか、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列を有している。
【００２５】
ここで、上記「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の任意のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
なお、アミノ酸の欠失、置換、付加は、自然発生的な突然変異により、又は部位特異的突然変異により導入することができる。
【００２６】
また、本発明のＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであるか、又はこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
特に、本発明のＤＮＡは、配列番号２に記載のＤＮＡであるか、又は配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。
【００２７】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドがほとんど形成されない条件をいう。このような条件としては、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％のデンハルト溶液（フィコール４００＋ＰＶＰ＋ＢＳＡ＝１：１：１）、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの熱変性サケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミドを含む溶液中、４５℃での一晩保存する条件が挙げられる。また、より高ストリンジェンシーな条件として、５０℃以上、更には６０℃以上、特に６５℃以上の条件が挙げられる。
【００２８】
なお、上述した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列又は配列番号２のＤＮＡ塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。この場合の相同性としては、通常６０％以上であり、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
【００２９】
本発明の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、例えばユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属の微生物から単離することができる。ここで「ユーグレナ」とは、動物学や植物学の分類でユーグレナ属に属する種、変種、変異種のすべてを含み、かつ配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを生成するすべての生物を意味する。さらに、この場合のユーグレナには、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する生物も含まれる。
【００３０】
ここで、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）の微生物とは、動物学では原生動物門（Ｐｒｏｔｏｚｏａ）の鞭毛虫綱（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）、植物鞭毛虫亜綱（Ｐｈｙｔｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）に属するミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎｉｄａ）のユーグレノイディナ亜目（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｉｎａ）に属する微生物である。一方、ユーグレナ属の微生物は、植物学ではミドリムシ植物門（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）のミドリムシ藻類綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）に属するミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎａｌｅｓ）に属している。
【００３１】
ユーグレナ属の微生物としては、具体的には、Ｅｕｇｌｅｎａ ａｃｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｃａｕｄａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｃｈａｄｅｆａｕｄｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｏｘｙｕｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｐｒｏｘｉｍａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓなどが挙げられる。このうち特に、広く研究に利用されているユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）が好適である。
【００３２】
ユーグレナは、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地、Ｈｕｔｎｅｒ培地、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地や、これらの一部組成を変更した改変培地などを用いて培養することができる。培養容器には、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどを用いることができる。ユーグレナはＣＯ２を資化するため、１〜５％ＣＯ２を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、終濃度０．５〜１．０％（容量比）となるように培地中にエタノールを加えると良好な生育となるため好ましい。さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地１リットルあたり１〜５ｇ程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常２０〜３４℃で、特に２８〜３０℃が好適である。ユーグレナは、培養条件にもよるが、通常、培養開始後２〜３日で対数増殖期となり、４〜５日程度で定常期に到達する。
【００３３】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、ユーグレナから公知の精製方法を用いて精製することができる。精製方法としては、例えばクロマトグラフィー法が挙げられる。クロマトグラフィー法の具体例として、分子排斥クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３４】
得られた精製品は、２０％〜５０％のグリセロールやエチレングリコール等の凍結保護剤が添加された保存液中で保存することができる。なお、長期保存安定性の観点から、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、−２０℃程度で冷凍保存されることが好ましい。
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、精製されたタンパク質を用いてエドマン法などの公知のアミノ酸配列決定方法で行うことができる。
【００３５】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニングは、ユーグレナのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することで行われる。
ｍＲＮＡの調製は、公知のｍＲＮＡ抽出方法で行うことができる。例えば、培養後のユーグレナをフェノール・クロロホルムなどの有機溶媒で溶解し、ｍＲＮＡを水層に移動させ、エタノール沈殿法によりｍＲＮＡを沈殿させる方法で行う。
【００３６】
ｃＤＮＡの増幅は、上述したアミノ酸配列決定方法により決定された既知配列の一部をプライマーとして、ＲＡＣＥ法などの公知の手法で行うことができる。例えば、上記エドマン法で決定されたＮ末端側のアミノ酸残基を元にセンスプライマーを作成し、一方でｍＲＮＡの３'側のポリＡ領域にアニールするポリｄＴ領域を含むアンカープライマーを用いて、センス・アンカープライマー間の未知領域の増幅を行う。
ｃＤＮＡの増幅は、逆転写酵素を作用させることで行うことができる。逆転写酵素としては、遺伝子工学で通常用いられる酵素、例えばＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）などを用いることができる。
【００３７】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列決定は、上記でクローニングされたｃＤＮＡを用いて公知の配列決定方法、例えばマキサム・ギルバート法やジデオキシヌクレオチド法（サンガー法）などで行うことができる。
【００３８】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードする二本鎖ＤＮＡを適当なベクターに組み込むことで組換えベクターを作成することができる。ベクターとしては、プラスミド、ファージなどの宿主細胞内で自立複製が可能なベクターや、宿主細胞の染色体中に組み込まれることで複製可能なベクターなどが挙げられる。これらのベクターには、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子が組み込まれる位置の上流側や下流側にプロモータ、エンハンサー、ターミネータなどの配列を有するものを用いることができる。
このようなベクターとして、例えばｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＫＣ系などの大腸菌プラスミドベクター、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などの枯草菌プラスミドベクター、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系などの酵母プラスミドベクターなどが挙げられる。
【００３９】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターは、適当な宿主細胞に導入され、これを形質転換する。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。形質転換は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法などの公知の方法で行うことができる。
組換えベクターを用いて形質転換体を作成することにより、特定の細胞内で２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを大量発現させる大量発現系を構築することが可能である。
【００４０】
得られた２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、２−オキソグルタル酸の定量に用いることができる。２−オキソグルタル酸は、悪性腫瘍を有する患者の血漿中から高濃度に検出されることから、腫瘍診断のマーカとして用いられている。
２−オキソグルタル酸は、反応生成物であるコハク酸セミアルデヒドの生成量を測定することにより、定量することができる。コハク酸セミアルデヒドは、例えばｏ−アミノベンズアルデヒドとの反応により発色させ、分光光度計などを用いて波長４４０ｎｍでの吸光度を測定することで定量する。
なお、２−オキソグルタル酸は、他の反応生成物である二酸化炭素をＣＯ２センサーなどで測定することでも定量することができる。
【実施例】
【００４１】
（１）ユーグレナの培養
ユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）を、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ改変培地（以下、ＫＨ改変培地という）で培養した。ＫＨ改変培地は、公知のＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地（Ｋｏｒｅｎ，Ｌ．Ｅ． ａｎｄ Ｈｕｔｎｅｒ， Ｓ．Ｈ． （１９６７） Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．， １４， Ｓｕｐｐｌ．， １７．）のグルタミン酸を４倍量にした培地である。
【００４２】
まず、坂口フラスコにＫＨ改変培地１５０ｍｌを入れ、同じく予めＫＨ改変培地で生育して対数増殖期にあるユーグレナ グラシリス ＳＭ−ＺＫ株１ｍｌを植え継ぎ、２９℃、１００回転／分の振とう条件下で培養し、４日後に培養を停止した。
次に、培養停止後のユーグレナ培養液を、遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ製 ｈｉｍａｃ ＣＲ２００）を用いて４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞を回収した。
【００４３】
（２）２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの精製
（細胞の破砕）
得られた細胞約６９．２３ｇに対し、破砕バッファ１４０ｍｌで懸濁した。ここで、破砕バッファの組成は、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＴＰＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの２‐メルカプトエタノール、残部が２０％ポリエチレングリコール（ＭＷ．６００）である。次に、４２８０Ｓ型（海上電機製）を用いてこの懸濁液を４℃で１０秒×１０回超音波処理し、細胞を破砕した。得られた細胞破砕液を、遠心分離機を用いて４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、約１７２ｍｌの上清を得た。
得られた上清を、恒温槽 Ｍｉｎｉ−８０（ＴＡＩＴＥＣ製）を用いて５０℃で１０分間熱処理し、さらに熱処理後の細胞破砕液を１２０００ｒｐｍ、１０分間で超遠心分離し、約１４６ｍｌの上清を得た。
【００４４】
（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）精製）
上で得られた上清を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １７−０７０９−０１（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製））を充填したカラムにアプライした。続いて、初期濃度０Ｍ〜最終濃度０．５ＭとなるようにＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を２ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、各フラクションに含まれる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの量を、以下に述べる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性測定法を用いて調べた。その結果、活性のピークが検出されたフラクションを含む第１６〜５０番目のフラクションを回収し、約６８ｍｌの溶液を得た。得られた溶液を透析チューブに入れ、破砕バッファ中で４℃、１６時間透析した。
【００４５】
（２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性測定法）
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性測定は、下記の１）〜８）に示すｏ−アミノベンズアルデヒド法により行った。すなわち、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼと２−オキソグルタル酸の反応により生成するコハク酸セミアルデヒドをｏ−アミノベンズアルデヒドで発色定量することにより、溶液中の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性を測定した。
コハク酸セミアルデヒドの測定は、波長４４０ｎｍの吸光度を測定することで行った（Ａ４４０＝０．４８のときコハク酸セミアルデヒド濃度＝０．９ｍＭ）。以下、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性測定においても同様の方法を用いた。
【００４６】
１） 活性測定バッファ２ｍｌに５０μｌの粗酵素溶液を添加（活性測定バッファの組成：５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭの２−オキソグルタル酸、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＴＰＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋、１ｍＭの２−メルカプトエタノール）
２） ３０℃で１０分間インキュベート
３） ２５％ ＴＣＡを１００μｌ添加し、反応を停止
４） 反応液５００μｌに０．８Ｍ ＫＯＨを２００μｌ添加
５） １．０Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ ８．８）を１μｌ添加
６） ２５ｍＭ ｏ−アミノベンズアルデヒドを５００μｌ添加
７） ３５℃で１５分間インキュベート
８） 分光光度計を用いて波長４４０ｎｍの吸光度を測定
【００４７】
（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製）
Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰ １７−０４１２−０１（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製））を充填したカラムに透析後の溶液をアプライした。続いて、上述したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの精製時と同様に、０〜０．５ＭでＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を１ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、各フラクションに含まれる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの量を、上述した２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性測定法を用いて調べた。その結果、活性のピークが検出されたフラクションを含む第９〜４１番目のフラクションを回収し、約３４ｍｌの溶液を得た。得られた溶液を透析チューブに入れ、破砕バッファ中で４℃、１６時間透析した。
【００４８】
（ＵＮＯ Ｑ精製）
次に、ＵＮＯ Ｑ（ＵＮＯ Ｑ−６カラム ７２０−０００３（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））を充填したカラムに濃縮後の溶液をアプライした。続いて、上述したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの精製時と同様に、０〜０．５ＭでＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を１ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、各フラクションに含まれる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの量を、上述した２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性測定法を用いて調べた。その結果、活性のピークが検出されたフラクションを含む第２２〜２６番目のフラクションを回収し、約５ｍｌの溶液を得た。得られた溶液を透析チューブに入れ、破砕バッファ中で４℃、１６時間透析した。
【００４９】
（ゲルろ過）
続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １７−１０６９−０１（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製））を充填したカラムに濃縮後の溶液をアプライし、バッファ（破砕バッファの中のトリスを１０ｍＭリン酸に変えた溶液）を用いて４℃で溶出させた。カラムから溶出した溶液を１２０ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、活性のピークが検出されたフラクションを含むフラクションを回収し、約６．５ｍｌの溶液を得た。
【００５０】
（ハイドロキシアパタイトゲル精製）
最後に、ＣＨＴ−Ｉ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ １０−Ｉカラム ７５１−００２５（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））を充填したカラムに濃縮後の溶液をアプライした。続いて、上述したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの精製時と同様に、０〜０．５ＭでＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を１ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、活性のピークが検出されたフラクションを含むフラクションを回収し、約３．６ｍｌの溶液を得た。
【００５１】
精製の結果を図１に示す。図１は各精製過程において溶液をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した結果を示す写真である。
この写真において、両端のレーンはマーカ、第１レーンは集菌直後（クルード）、第２レーンは熱処理後、第３レーンはＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後、第４レーンはＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後、第５レーンはＵＮＯ Ｑ精製後、第６レーンはゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）後、第７レーンはハイドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）ゲル精製後を示している。
【００５２】
この図の第７レーンに示すように、精製の最終段階では目的とする２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼが高濃度に精製され、他のタンパク質がほとんど含まれないことがわかる。
次に、精製の各段階での総タンパク量、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの全酵素活性、比活性、収率、精製度をそれぞれ求めた。その結果を表１に示す。
【表１】
【００５３】
（３）２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング・配列決定
（Ｎ末端側アミノ酸配列の決定）
精製後の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用い、４９２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ製）を使用して、エドマン法によりＮ末端側から十数残基分のアミノ酸配列を決定した。得られた配列（配列番号３）は以下のとおりである。
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｘａａ
（ここで、N末端側から１番目のＬｙｓはＳｅｒであってもよい。）
【００５４】
続いて、このＮ末端側配列を元に、ＥＳＴデータベース（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｄｅ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ）に登録されているユーグレナ グラシリスのＤＮＡ塩基配列に対してＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。その結果、アセトラクテート シンテース（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＳＥＱ ＩＤ ＥＬＬ００００２３０３）のＮ末端側の一部の配列（１１６８ｂｐ）がヒットした。そのＮ末端側アミノ酸配列を確認したところ、得られた配列（配列番号４）は以下のとおりであった。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
【００５５】
（Ｓｅｐａｓｏｌ−ＣＴＡＢ法によるＲＮＡ抽出）
上記「（１）ユーグレナの培養」で述べた方法でユーグレナを５０ｍｌフラスコで４日間培養し、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して細胞約１ｇを得た。
得られた細胞をファルコンチューブに入れ、これにＳｅｐａｓｏｌ（登録商標）を加えてボルテックスで強く攪拌し、細胞を完全に破砕した。次に、破砕後の試料を５０℃、１０分間加温し、室温で５分間静置した。続いて、１．５ｍｌのエッペンドルフ（登録商標）チューブに１ｍｌずつ試料を分注し、５０℃、１０分間加温した後、室温で５分間静置した。
【００５６】
次に、クロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を７００μｌ加え、ボルテックスで攪拌した後、３分間室温に静置した。次に、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を別のチューブに移した。このチューブに等量のイソプロパノールを加え、ボルテックスで攪拌後、室温で１０分間静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
【００５７】
次に、ＤＥＰＣ処理水６００μｌに沈殿を溶解し、５ＭのＮａＣｌを１００μｌ、ＣＴＡＢ（１０％）／ＮａＣｌ（０．７Ｍ）溶液を８０μｌ加え、６５℃、１０分間静置した。さらに、クロロホルム・イソアミルアルコールを７００μｌ加え、ボルテックスで攪拌後、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して水層を別のチューブに移した。
続いて、イソプロパノール７００μｌを加え、ボルテックスで攪拌後、室温に１０分間静置した後、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除き、７５％エタノール１ｍｌを加えて沈殿を洗浄し、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除き、沈殿を軽く乾かした後、ＤＥＰＣ処理水に溶解した。
【００５８】
（全ＲＮＡの定量）
ＲＮＡの定量は、石英セルを用いて分光光度計により行った。波長２６０ｎｍは核酸、２８０ｎｍはタンパク質による吸光であるため、ＲＮＡの濃度は〔ＯＤ２６０ｎｍ×４０＝μｇ／ｍｌ〕で計算した。純粋な核酸があるときには、２６０ｎｍの吸光度は２８０ｎｍの吸光度の１．８〜２．０倍になる。
まず、全ＲＮＡを１μｌ分取し、１ｍｌのＤＥＰＣ処理水で希釈した。続いて、波長２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。ＯＤ２６０ｎｍの値から全ＲＮＡ濃度を算出した。その結果、全ＲＮＡ濃度は２．５μｇ／μｌであった。
【００５９】
（ＤＮａｓｅＩ処理法によるゲノムＤＮＡ除去）
上記Ｓｅｐａｓｏｌ−ＣＴＡＢ法により得られた試料中に含まれるゲノムＤＮＡの除去を行った。
まず、全ＲＮＡを５０μｇ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）を２０Ｕ、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ：５Ｕ／μｌ）を１０Ｕとなるように加え、さらに１０×ＤＮａｓｅＩ緩衝液を１倍希釈となるように加えた。さらに、ＤＥＰＣ処理水を混合し、Ｔｏｔａｌ５０μｌの反応液を調製した。続いて、この反応液を３７℃で２０〜３０分間反応させた。
【００６０】
次に、５０μｌのＤＥＰＣ処理水と１００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えて混合し、室温、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清を新しいチューブに移し、１００μｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて混合し、室温、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００６１】
上清を新しいチューブに移し、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと２５０μｌの冷エタノールを加えて−８０℃で２０分間静置した。次に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、７０％エタノールで沈殿を洗浄した。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を乾燥させた後、１０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。上述した全ＲＮＡの定量法を用いてＲＮＡ濃度を測定した結果、全ＲＮＡ濃度は１．０μｇ／μｌであった。
【００６２】
（逆転写反応による１ｓｔ ｓｔｒａｎｄの作製）
以下の反応系により逆転写反応を行い、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。プライマーとして、ｍＲＮＡの３'側ポリＡ配列と相補的なポリｄＴ配列とアンカー配列の２つの配列を有する３' ＲＡＣＥ アンカープライマー（配列番号５）を用いた。
【００６３】
まず、反応混合液（１μｇの全ＲＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、０．２５μＭの３' ＲＡＣＥ アンカープライマー（配列番号５）、１００ＵのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μｌ）、１×ＲＴバッファ）を２０μｌ調製した。
続いて、サーマルサイクラー（ＭｙＣｙｃｌｅｒ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ５７７ＢＲ ０２０９（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））を用い、４２℃で６０分間、９５℃で５分間、逆転写反応を行った。反応終了後のサンプルを、４℃で３分間冷却したのち、１０秒間スピンダウンした。
【００６４】
（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄを用いたＰＣＲ法による２ＯＧＤ合成遺伝子の部分作製）
得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡに対して５'側センスプライマー及び３'側アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、以下に述べる方法で２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。上述したＥＳＴデータベースでヒットした配列（配列番号４）を元にＥＧ．２ＯＧＤ ５'−１ プライマー（配列番号７）とＥＧ．２ＯＧＤ ５'−２（配列番号８）の２種類のプライマーを作成し、センスプライマーとして用いた。また、アンチセンスプライマーとして、上記３' ＲＡＣＥ アンカープライマー（配列番号５）のアンカー配列と同一の配列である３' ＲＡＣＥ１ プライマー（配列番号６）を用いた。
【００６５】
まず、反応混合液（１μｌのサンプル、１ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、０．２５μＭのＥＧ．２ＯＧＤ ５'−１ プライマー、０．２５μＭの３' ＲＡＣＥ１ プライマー（配列番号６）、１００ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）（ＴａＫａＲａ製、１００Ｕ／μｌ）、１×ＲＴバッファ）を５０μｌ調製した。続いて、上述したサーマルサイクラーを用い、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１．５分間を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分間とした。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により電気泳動し、２．１〜２．２ｋｂｐのバンドを含むゲルを切り出して回収した。
【００６６】
（ｃＤＮＡのシークエンスによる部分配列決定）
得られたｃＤＮＡを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（日本ジーン製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＺＥｒＯ−２（インビトロジェン製））に組み込んだ。得られた組換えベクターを用いて大腸菌（Ｔｏｐ１０（インビトロジェン製））を形質転換し、形質転換体を得た。
得られた形質転換体を培養し、アルカリＳＤＳ法により組換えベクターを回収し、ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製 ３１００ＡＶＡＮＴ）を用いてＤＮＡシーケンスを行った。
【００６７】
（プライマーウォーキング法による全長配列決定）
５'−１ プライマーと５'−２ プライマーを用いて決定された配列を元に、ＥＧ．２ＯＧＤ ５'−３ プライマー（配列番号９）を作製した。続いて、「ＲＴ−ＰＣＲ法による２ｎｄ ｓｔｒａｎｄの作製」で説明した反応系及び反応温度と同様の条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンスにより配列を決定した。決定された配列を元に、ＥＧ．２ＯＧＤ ５'−４ プライマー（配列番号１０）を作製し、更にＤＮＡシーケンスを行った。
【００６８】
次に、ＥＳＴデータベースでヒットしたＮ末端側配列と、上述したシーケンスで得られた配列とを連結し、ユーグレナ グラシリス ＳＭ−ＺＫ株由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのｃＤＮＡ全長配列を得た（配列番号２）。また、この全長配列を元に、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を得た（配列番号１）。
【００６９】
（得られた全長配列の確認）
上で得られたＤＮＡはＥＳＴデータベースで得られた部分配列と、ＤＮＡシーケンスで得られた配列を組み合わせて決定された配列であるため、これがクローニングされたｃＤＮＡの全長配列と同じであることを確かめるため、全長配列の読み直しを行った。まず、全長配列を元に、５'末端側の配列を含むプライマー（プライマーＡ）と、３'末端側の配列を含むプライマー（プライマーＢ）の２種類のプライマーを作製した。プライマーＡは制限酵素ＮｄｅＩの切断サイトを、プライマーＢは制限酵素ＸｈｏＩの切断サイトをそれぞれ有している。
上記プライマーＡ，Ｂを用いてＰＣＲを９５℃（１０秒）→５５℃（１０秒）→７２℃（２分）を計３５サイクル行い、７２℃、１０分間に保温した後、１２℃で保存した。得られたＰＣＲ産物で大腸菌（Ｔｏｐ１０）を形質転換し、プレート上に撒いて得られたコロニーのいくつかを選択して培養した。培養後にアルカリＳＤＳによりＤＮＡを抽出し、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩを用いて切断を行い、アガロースゲル電気泳動により制限酵素で切断が確認されたサンプルを選択した。
選択したサンプルのベクターに対して、上述したＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡシーケンスを行い、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのｃＤＮＡ全長配列を得た。この全長配列と先に得られたｃＤＮＡ全長配列（配列番号２）とを比較し、両者が同一であることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】各精製過程において溶液をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法に係り、特にユーグレナ属由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）は、動物学と植物学の双方に分類され、動物学上は鞭毛虫綱、植物学上はミドリムシ藻類綱に属するミドリムシ目の微生物である。ユーグレナ属の微生物は、動物学的、植物学的な特徴を兼ね備えた独特の性質を有しており、生化学、生理学等の分野で古くから研究対象として用いられてきた。
【０００３】
ユーグレナは、他の微生物と比較して特殊なＴＣＡ回路を有しており、コハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）という物質を産生することが知られている。
コハク酸セミアルデヒドは、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ（２−ＯＧＤ）により２−オキソグルタル酸（２−ＯＧ：α−ケトグルタル酸ともいう）から生成する。２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの触媒反応は、下記一般式（１）のとおりである。
【０００４】
【化１】
（ここで、ＴＰＰはチアミンピロリン酸を示す。）
【０００５】
コハク酸セミアルデヒドの炭素鎖は、乳酸よりも炭素１つ分長いため、コハク酸セミアルデヒドの重合体はポリ乳酸と同様に生分解性プラスチックとしての性質を有していると同時に、ポリ乳酸とは炭素１つ分異なる特性を有していると考えられる。
このため、コハク酸セミアルデヒドは、現在ポリ乳酸を主体に研究、開発が進んでいる生分解性プラスチックの分野において、乳酸に代わる新たな原料として期待されている。
【０００６】
さらに、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの遺伝子を他の植物等に遺伝子組換えなどで組み込むことにより、コハク酸セミアルデヒドやその重合体である生分解性プラスチックを産生する植物等を生成することも可能になる。特に、コハク酸セミアルデヒドは、濃度が高くなると自然に重合するため、宿主細胞中でコハク酸セミアルデヒドを大量に生成させて高濃度状態とすることにより、細胞中にコハク酸セミアルデヒド重合体からなる生分解性プラスチックを産生する新規な生物を作出できると期待されている。
【０００７】
また、上述した２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの生成物であるコハク酸セミアルデヒドの利用のみならず、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼそのものを産業に利用することも期待されている。
例えば、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用いることで、酵素反応により２−オキソグルタル酸を定量することができる。以下、詳細に説明する。
【０００８】
従来から、悪性腫瘍を有する患者は、血漿中の２−オキソグルタル酸濃度が高くなることが知られている。これは、腫瘍細胞ではクエン酸回路に異常が生じて細胞中に２−オキソグルタル酸が大量に蓄積し、高濃度の２−オキソグルタル酸が血漿中に浸潤するためと考えられている。したがって、血漿中の２−オキソグルタル酸を定量することで、悪性腫瘍の有無を検出することが可能となる。
【０００９】
従来、血漿中に含まれる２−オキソグルタル酸の定量は、２−オキソグルタル酸と反応する試薬を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法により行われていた（例えば、非特許文献１参照）。
非特許文献１の方法では、２−オキソグルタル酸を含む血漿中に２−ニトロフェニルヒドラジンと２，４−ジニトロフェニルヒドラジンを混合して反応させ、生成した２−オキソグルタル酸誘導体をＨＰＬＣ用のカラムに流して２−オキソグルタル酸誘導体を定量する。これにより、間接的に２−オキソグルタル酸の定量を行っている。
【００１０】
しかしながら、ＨＰＬＣ法による定量では、反応物をカラムから溶出する時間がかかり、迅速な定量が困難であった。そこで、２−オキソグルタル酸の定量方法として、２−オキソグルタル酸を基質として特異的に反応する２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用いる方法が新たに検討されている。
【００１１】
【非特許文献１】Ｋ．Ｍｉｃｈａｉｌら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｆｕｒｆｕｒａｌ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ」、ＡＮＡＬＹＴＩＣＡ ＣＨＩＭＩＣＡ ＡＣＴＡ、（オランダ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２００７、５８１、ｐ．２８７−２９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このように、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、生成物であるコハク酸セミアルデヒドが産業上有用であるばかりでなく、基質である２−オキソグルタル酸の定量にも用いることができることから、その生化学的、構造学的特性の詳細な研究が期待されている。
しかしながら、これまで、ユーグレナ由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニングに成功した例はなく、そのアミノ酸配列やＤＮＡ塩基配列についても未知であった。
【００１３】
本発明の目的は、上記課題に鑑み、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを用いて得られた形質転換体、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法及び２−オキソグルタル酸の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
今回発明者らは、上記目的を達成するために鋭意努力した結果、ユーグレナ由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの新たなアミノ酸配列及びＤＮＡ塩基配列の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００１５】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｄ）前記（ｃ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１６】
以下の（ｅ）又は（ｆ）に示されるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２に記載のＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１７】
前記いずれかに記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【００１８】
前記組換えベクターを含有する形質転換体。
【００１９】
前記形質転換体を培養し、培養物から２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを採取することを特徴とする２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【００２０】
前記いずれかに記載の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼと２−オキソグルタル酸とを反応させ、生成したコハク酸セミアルデヒド及び二酸化炭素の少なくとも一方の生成量を測定することで、前記２−オキソグルタル酸の定量を行うことを特徴とする２−オキソグルタル酸の測定方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの新規なアミノ酸配列と、これをコードするＤＮＡ塩基配列とが初めて提供された。そして、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用いることで、その基質である２−オキソグルタル酸の定量が容易になり、また、その反応生成物であるコハク酸セミアルデヒドを用いて新たな特性を有する生分解性プラスチックを生成することが可能となる。このため、本発明は産業上極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の一実施形態について説明する。なお、以下に説明する部材、配置等は、本発明を限定するものではなく、本発明の趣旨に沿って各種改変することができることは勿論である。
【００２３】
本発明の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、チアミンピロリン酸とマグネシウムイオンの存在下で２−オキソグルタル酸を非酸化的に脱炭酸し、コハク酸セミアルデヒドを生成する脱炭酸酵素の一種である。２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、分子量約６万２０００からなる４量体構造をしている。
【００２４】
本発明の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列であるか、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列を有している。
【００２５】
ここで、上記「１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個の任意のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を意味する。
なお、アミノ酸の欠失、置換、付加は、自然発生的な突然変異により、又は部位特異的突然変異により導入することができる。
【００２６】
また、本発明のＤＮＡは、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであるか、又はこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
特に、本発明のＤＮＡは、配列番号２に記載のＤＮＡであるか、又は配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであることが好ましい。
【００２７】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドがほとんど形成されない条件をいう。このような条件としては、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％のデンハルト溶液（フィコール４００＋ＰＶＰ＋ＢＳＡ＝１：１：１）、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの熱変性サケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミドを含む溶液中、４５℃での一晩保存する条件が挙げられる。また、より高ストリンジェンシーな条件として、５０℃以上、更には６０℃以上、特に６５℃以上の条件が挙げられる。
【００２８】
なお、上述した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ塩基配列又は配列番号２のＤＮＡ塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。この場合の相同性としては、通常６０％以上であり、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
【００２９】
本発明の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、例えばユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属の微生物から単離することができる。ここで「ユーグレナ」とは、動物学や植物学の分類でユーグレナ属に属する種、変種、変異種のすべてを含み、かつ配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを生成するすべての生物を意味する。さらに、この場合のユーグレナには、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成する生物も含まれる。
【００３０】
ここで、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）の微生物とは、動物学では原生動物門（Ｐｒｏｔｏｚｏａ）の鞭毛虫綱（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）、植物鞭毛虫亜綱（Ｐｈｙｔｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒｅａ）に属するミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎｉｄａ）のユーグレノイディナ亜目（Ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｉｎａ）に属する微生物である。一方、ユーグレナ属の微生物は、植物学ではミドリムシ植物門（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）のミドリムシ藻類綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）に属するミドリムシ目（Ｅｕｇｌｅｎａｌｅｓ）に属している。
【００３１】
ユーグレナ属の微生物としては、具体的には、Ｅｕｇｌｅｎａ ａｃｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｃａｕｄａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｃｈａｄｅｆａｕｄｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｄｅｓｅｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｏｘｙｕｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｐｒｏｘｉｍａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓなどが挙げられる。このうち特に、広く研究に利用されているユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）が好適である。
【００３２】
ユーグレナは、Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地、Ｈｕｔｎｅｒ培地、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地や、これらの一部組成を変更した改変培地などを用いて培養することができる。培養容器には、坂口フラスコ、三角フラスコ、試薬ビンなどを用いることができる。ユーグレナはＣＯ２を資化するため、１〜５％ＣＯ２を含む空気を培地中に通過させることが好ましい。また、終濃度０．５〜１．０％（容量比）となるように培地中にエタノールを加えると良好な生育となるため好ましい。さらに、葉緑体を十分に発達させるために、培地１リットルあたり１〜５ｇ程度のリン酸アンモニウムを加えるとよい。培養温度は、通常２０〜３４℃で、特に２８〜３０℃が好適である。ユーグレナは、培養条件にもよるが、通常、培養開始後２〜３日で対数増殖期となり、４〜５日程度で定常期に到達する。
【００３３】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、ユーグレナから公知の精製方法を用いて精製することができる。精製方法としては、例えばクロマトグラフィー法が挙げられる。クロマトグラフィー法の具体例として、分子排斥クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３４】
得られた精製品は、２０％〜５０％のグリセロールやエチレングリコール等の凍結保護剤が添加された保存液中で保存することができる。なお、長期保存安定性の観点から、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、−２０℃程度で冷凍保存されることが好ましい。
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列は、精製されたタンパク質を用いてエドマン法などの公知のアミノ酸配列決定方法で行うことができる。
【００３５】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニングは、ユーグレナのｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成することで行われる。
ｍＲＮＡの調製は、公知のｍＲＮＡ抽出方法で行うことができる。例えば、培養後のユーグレナをフェノール・クロロホルムなどの有機溶媒で溶解し、ｍＲＮＡを水層に移動させ、エタノール沈殿法によりｍＲＮＡを沈殿させる方法で行う。
【００３６】
ｃＤＮＡの増幅は、上述したアミノ酸配列決定方法により決定された既知配列の一部をプライマーとして、ＲＡＣＥ法などの公知の手法で行うことができる。例えば、上記エドマン法で決定されたＮ末端側のアミノ酸残基を元にセンスプライマーを作成し、一方でｍＲＮＡの３'側のポリＡ領域にアニールするポリｄＴ領域を含むアンカープライマーを用いて、センス・アンカープライマー間の未知領域の増幅を行う。
ｃＤＮＡの増幅は、逆転写酵素を作用させることで行うことができる。逆転写酵素としては、遺伝子工学で通常用いられる酵素、例えばＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）などを用いることができる。
【００３７】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列決定は、上記でクローニングされたｃＤＮＡを用いて公知の配列決定方法、例えばマキサム・ギルバート法やジデオキシヌクレオチド法（サンガー法）などで行うことができる。
【００３８】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードする二本鎖ＤＮＡを適当なベクターに組み込むことで組換えベクターを作成することができる。ベクターとしては、プラスミド、ファージなどの宿主細胞内で自立複製が可能なベクターや、宿主細胞の染色体中に組み込まれることで複製可能なベクターなどが挙げられる。これらのベクターには、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子が組み込まれる位置の上流側や下流側にプロモータ、エンハンサー、ターミネータなどの配列を有するものを用いることができる。
このようなベクターとして、例えばｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＫＣ系などの大腸菌プラスミドベクター、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４などの枯草菌プラスミドベクター、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系などの酵母プラスミドベクターなどが挙げられる。
【００３９】
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターは、適当な宿主細胞に導入され、これを形質転換する。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。形質転換は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥデキストラン法などの公知の方法で行うことができる。
組換えベクターを用いて形質転換体を作成することにより、特定の細胞内で２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを大量発現させる大量発現系を構築することが可能である。
【００４０】
得られた２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼは、２−オキソグルタル酸の定量に用いることができる。２−オキソグルタル酸は、悪性腫瘍を有する患者の血漿中から高濃度に検出されることから、腫瘍診断のマーカとして用いられている。
２−オキソグルタル酸は、反応生成物であるコハク酸セミアルデヒドの生成量を測定することにより、定量することができる。コハク酸セミアルデヒドは、例えばｏ−アミノベンズアルデヒドとの反応により発色させ、分光光度計などを用いて波長４４０ｎｍでの吸光度を測定することで定量する。
なお、２−オキソグルタル酸は、他の反応生成物である二酸化炭素をＣＯ２センサーなどで測定することでも定量することができる。
【実施例】
【００４１】
（１）ユーグレナの培養
ユーグレナ グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）を、Ｋｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ改変培地（以下、ＫＨ改変培地という）で培養した。ＫＨ改変培地は、公知のＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地（Ｋｏｒｅｎ，Ｌ．Ｅ． ａｎｄ Ｈｕｔｎｅｒ， Ｓ．Ｈ． （１９６７） Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．， １４， Ｓｕｐｐｌ．， １７．）のグルタミン酸を４倍量にした培地である。
【００４２】
まず、坂口フラスコにＫＨ改変培地１５０ｍｌを入れ、同じく予めＫＨ改変培地で生育して対数増殖期にあるユーグレナ グラシリス ＳＭ−ＺＫ株１ｍｌを植え継ぎ、２９℃、１００回転／分の振とう条件下で培養し、４日後に培養を停止した。
次に、培養停止後のユーグレナ培養液を、遠心分離機（ＨＩＴＡＣＨＩ製 ｈｉｍａｃ ＣＲ２００）を用いて４℃、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、細胞を回収した。
【００４３】
（２）２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの精製
（細胞の破砕）
得られた細胞約６９．２３ｇに対し、破砕バッファ１４０ｍｌで懸濁した。ここで、破砕バッファの組成は、５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＴＰＰ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの２‐メルカプトエタノール、残部が２０％ポリエチレングリコール（ＭＷ．６００）である。次に、４２８０Ｓ型（海上電機製）を用いてこの懸濁液を４℃で１０秒×１０回超音波処理し、細胞を破砕した。得られた細胞破砕液を、遠心分離機を用いて４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、約１７２ｍｌの上清を得た。
得られた上清を、恒温槽 Ｍｉｎｉ−８０（ＴＡＩＴＥＣ製）を用いて５０℃で１０分間熱処理し、さらに熱処理後の細胞破砕液を１２０００ｒｐｍ、１０分間で超遠心分離し、約１４６ｍｌの上清を得た。
【００４４】
（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）精製）
上で得られた上清を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ １７−０７０９−０１（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製））を充填したカラムにアプライした。続いて、初期濃度０Ｍ〜最終濃度０．５ＭとなるようにＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を２ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、各フラクションに含まれる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの量を、以下に述べる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性測定法を用いて調べた。その結果、活性のピークが検出されたフラクションを含む第１６〜５０番目のフラクションを回収し、約６８ｍｌの溶液を得た。得られた溶液を透析チューブに入れ、破砕バッファ中で４℃、１６時間透析した。
【００４５】
（２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性測定法）
２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性測定は、下記の１）〜８）に示すｏ−アミノベンズアルデヒド法により行った。すなわち、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼと２−オキソグルタル酸の反応により生成するコハク酸セミアルデヒドをｏ−アミノベンズアルデヒドで発色定量することにより、溶液中の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの活性を測定した。
コハク酸セミアルデヒドの測定は、波長４４０ｎｍの吸光度を測定することで行った（Ａ４４０＝０．４８のときコハク酸セミアルデヒド濃度＝０．９ｍＭ）。以下、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性測定においても同様の方法を用いた。
【００４６】
１） 活性測定バッファ２ｍｌに５０μｌの粗酵素溶液を添加（活性測定バッファの組成：５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭの２−オキソグルタル酸、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＴＰＰ、０．５ｍＭのＮＡＤＰ＋、１ｍＭの２−メルカプトエタノール）
２） ３０℃で１０分間インキュベート
３） ２５％ ＴＣＡを１００μｌ添加し、反応を停止
４） 反応液５００μｌに０．８Ｍ ＫＯＨを２００μｌ添加
５） １．０Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ ８．８）を１μｌ添加
６） ２５ｍＭ ｏ−アミノベンズアルデヒドを５００μｌ添加
７） ３５℃で１５分間インキュベート
８） 分光光度計を用いて波長４４０ｎｍの吸光度を測定
【００４７】
（Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製）
Ｂｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰ １７−０４１２−０１（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製））を充填したカラムに透析後の溶液をアプライした。続いて、上述したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの精製時と同様に、０〜０．５ＭでＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を１ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、各フラクションに含まれる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの量を、上述した２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性測定法を用いて調べた。その結果、活性のピークが検出されたフラクションを含む第９〜４１番目のフラクションを回収し、約３４ｍｌの溶液を得た。得られた溶液を透析チューブに入れ、破砕バッファ中で４℃、１６時間透析した。
【００４８】
（ＵＮＯ Ｑ精製）
次に、ＵＮＯ Ｑ（ＵＮＯ Ｑ−６カラム ７２０−０００３（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））を充填したカラムに濃縮後の溶液をアプライした。続いて、上述したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの精製時と同様に、０〜０．５ＭでＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を１ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、各フラクションに含まれる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの量を、上述した２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性測定法を用いて調べた。その結果、活性のピークが検出されたフラクションを含む第２２〜２６番目のフラクションを回収し、約５ｍｌの溶液を得た。得られた溶液を透析チューブに入れ、破砕バッファ中で４℃、１６時間透析した。
【００４９】
（ゲルろ過）
続いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００（ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ １７−１０６９−０１（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス製））を充填したカラムに濃縮後の溶液をアプライし、バッファ（破砕バッファの中のトリスを１０ｍＭリン酸に変えた溶液）を用いて４℃で溶出させた。カラムから溶出した溶液を１２０ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、活性のピークが検出されたフラクションを含むフラクションを回収し、約６．５ｍｌの溶液を得た。
【００５０】
（ハイドロキシアパタイトゲル精製）
最後に、ＣＨＴ−Ｉ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ １０−Ｉカラム ７５１−００２５（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））を充填したカラムに濃縮後の溶液をアプライした。続いて、上述したＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの精製時と同様に、０〜０．５ＭでＫＣｌ濃度を変化させつつ、破砕バッファにより４℃でグラジエント溶出を行った。カラムから溶出した溶液を１ｍｌずつフラクションコレクターで採取し、活性のピークが検出されたフラクションを含むフラクションを回収し、約３．６ｍｌの溶液を得た。
【００５１】
精製の結果を図１に示す。図１は各精製過程において溶液をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した結果を示す写真である。
この写真において、両端のレーンはマーカ、第１レーンは集菌直後（クルード）、第２レーンは熱処理後、第３レーンはＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後、第４レーンはＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後、第５レーンはＵＮＯ Ｑ精製後、第６レーンはゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）後、第７レーンはハイドロキシアパタイト（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）ゲル精製後を示している。
【００５２】
この図の第７レーンに示すように、精製の最終段階では目的とする２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼが高濃度に精製され、他のタンパク質がほとんど含まれないことがわかる。
次に、精製の各段階での総タンパク量、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの全酵素活性、比活性、収率、精製度をそれぞれ求めた。その結果を表１に示す。
【表１】
【００５３】
（３）２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング・配列決定
（Ｎ末端側アミノ酸配列の決定）
精製後の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを用い、４９２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ製）を使用して、エドマン法によりＮ末端側から十数残基分のアミノ酸配列を決定した。得られた配列（配列番号３）は以下のとおりである。
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｘａａ
（ここで、N末端側から１番目のＬｙｓはＳｅｒであってもよい。）
【００５４】
続いて、このＮ末端側配列を元に、ＥＳＴデータベース（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｄｅ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄｅ Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ）に登録されているユーグレナ グラシリスのＤＮＡ塩基配列に対してＢＬＡＳＴによる相同性検索を行った。その結果、アセトラクテート シンテース（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＳＥＱ ＩＤ ＥＬＬ００００２３０３）のＮ末端側の一部の配列（１１６８ｂｐ）がヒットした。そのＮ末端側アミノ酸配列を確認したところ、得られた配列（配列番号４）は以下のとおりであった。
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｙｒ
【００５５】
（Ｓｅｐａｓｏｌ−ＣＴＡＢ法によるＲＮＡ抽出）
上記「（１）ユーグレナの培養」で述べた方法でユーグレナを５０ｍｌフラスコで４日間培養し、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して細胞約１ｇを得た。
得られた細胞をファルコンチューブに入れ、これにＳｅｐａｓｏｌ（登録商標）を加えてボルテックスで強く攪拌し、細胞を完全に破砕した。次に、破砕後の試料を５０℃、１０分間加温し、室温で５分間静置した。続いて、１．５ｍｌのエッペンドルフ（登録商標）チューブに１ｍｌずつ試料を分注し、５０℃、１０分間加温した後、室温で５分間静置した。
【００５６】
次に、クロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を７００μｌ加え、ボルテックスで攪拌した後、３分間室温に静置した。次に、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を別のチューブに移した。このチューブに等量のイソプロパノールを加え、ボルテックスで攪拌後、室温で１０分間静置した。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除いた。
【００５７】
次に、ＤＥＰＣ処理水６００μｌに沈殿を溶解し、５ＭのＮａＣｌを１００μｌ、ＣＴＡＢ（１０％）／ＮａＣｌ（０．７Ｍ）溶液を８０μｌ加え、６５℃、１０分間静置した。さらに、クロロホルム・イソアミルアルコールを７００μｌ加え、ボルテックスで攪拌後、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して水層を別のチューブに移した。
続いて、イソプロパノール７００μｌを加え、ボルテックスで攪拌後、室温に１０分間静置した後、４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を除き、７５％エタノール１ｍｌを加えて沈殿を洗浄し、４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除き、沈殿を軽く乾かした後、ＤＥＰＣ処理水に溶解した。
【００５８】
（全ＲＮＡの定量）
ＲＮＡの定量は、石英セルを用いて分光光度計により行った。波長２６０ｎｍは核酸、２８０ｎｍはタンパク質による吸光であるため、ＲＮＡの濃度は〔ＯＤ２６０ｎｍ×４０＝μｇ／ｍｌ〕で計算した。純粋な核酸があるときには、２６０ｎｍの吸光度は２８０ｎｍの吸光度の１．８〜２．０倍になる。
まず、全ＲＮＡを１μｌ分取し、１ｍｌのＤＥＰＣ処理水で希釈した。続いて、波長２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度を測定した。ＯＤ２６０ｎｍの値から全ＲＮＡ濃度を算出した。その結果、全ＲＮＡ濃度は２．５μｇ／μｌであった。
【００５９】
（ＤＮａｓｅＩ処理法によるゲノムＤＮＡ除去）
上記Ｓｅｐａｓｏｌ−ＣＴＡＢ法により得られた試料中に含まれるゲノムＤＮＡの除去を行った。
まず、全ＲＮＡを５０μｇ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μｌ）を２０Ｕ、ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ：５Ｕ／μｌ）を１０Ｕとなるように加え、さらに１０×ＤＮａｓｅＩ緩衝液を１倍希釈となるように加えた。さらに、ＤＥＰＣ処理水を混合し、Ｔｏｔａｌ５０μｌの反応液を調製した。続いて、この反応液を３７℃で２０〜３０分間反応させた。
【００６０】
次に、５０μｌのＤＥＰＣ処理水と１００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加えて混合し、室温、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清を新しいチューブに移し、１００μｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加えて混合し、室温、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００６１】
上清を新しいチューブに移し、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと２５０μｌの冷エタノールを加えて−８０℃で２０分間静置した。次に、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、７０％エタノールで沈殿を洗浄した。４℃、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を乾燥させた後、１０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。上述した全ＲＮＡの定量法を用いてＲＮＡ濃度を測定した結果、全ＲＮＡ濃度は１．０μｇ／μｌであった。
【００６２】
（逆転写反応による１ｓｔ ｓｔｒａｎｄの作製）
以下の反応系により逆転写反応を行い、１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。プライマーとして、ｍＲＮＡの３'側ポリＡ配列と相補的なポリｄＴ配列とアンカー配列の２つの配列を有する３' ＲＡＣＥ アンカープライマー（配列番号５）を用いた。
【００６３】
まず、反応混合液（１μｇの全ＲＮＡ、１ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、０．２５μＭの３' ＲＡＣＥ アンカープライマー（配列番号５）、１００ＵのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μｌ）、１×ＲＴバッファ）を２０μｌ調製した。
続いて、サーマルサイクラー（ＭｙＣｙｃｌｅｒ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ５７７ＢＲ ０２０９（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））を用い、４２℃で６０分間、９５℃で５分間、逆転写反応を行った。反応終了後のサンプルを、４℃で３分間冷却したのち、１０秒間スピンダウンした。
【００６４】
（１ｓｔ ｓｔｒａｎｄを用いたＰＣＲ法による２ＯＧＤ合成遺伝子の部分作製）
得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡに対して５'側センスプライマー及び３'側アンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行い、以下に述べる方法で２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。上述したＥＳＴデータベースでヒットした配列（配列番号４）を元にＥＧ．２ＯＧＤ ５'−１ プライマー（配列番号７）とＥＧ．２ＯＧＤ ５'−２（配列番号８）の２種類のプライマーを作成し、センスプライマーとして用いた。また、アンチセンスプライマーとして、上記３' ＲＡＣＥ アンカープライマー（配列番号５）のアンカー配列と同一の配列である３' ＲＡＣＥ１ プライマー（配列番号６）を用いた。
【００６５】
まず、反応混合液（１μｌのサンプル、１ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ、０．２５μＭのＥＧ．２ＯＧＤ ５'−１ プライマー、０．２５μＭの３' ＲＡＣＥ１ プライマー（配列番号６）、１００ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）（ＴａＫａＲａ製、１００Ｕ／μｌ）、１×ＲＴバッファ）を５０μｌ調製した。続いて、上述したサーマルサイクラーを用い、９８℃で１０秒間、５５℃で５秒間、７２℃で１．５分間を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１０分間とした。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により電気泳動し、２．１〜２．２ｋｂｐのバンドを含むゲルを切り出して回収した。
【００６６】
（ｃＤＮＡのシークエンスによる部分配列決定）
得られたｃＤＮＡを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（日本ジーン製）を用いて大腸菌ベクター（ｐＺＥｒＯ−２（インビトロジェン製））に組み込んだ。得られた組換えベクターを用いて大腸菌（Ｔｏｐ１０（インビトロジェン製））を形質転換し、形質転換体を得た。
得られた形質転換体を培養し、アルカリＳＤＳ法により組換えベクターを回収し、ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製 ３１００ＡＶＡＮＴ）を用いてＤＮＡシーケンスを行った。
【００６７】
（プライマーウォーキング法による全長配列決定）
５'−１ プライマーと５'−２ プライマーを用いて決定された配列を元に、ＥＧ．２ＯＧＤ ５'−３ プライマー（配列番号９）を作製した。続いて、「ＲＴ−ＰＣＲ法による２ｎｄ ｓｔｒａｎｄの作製」で説明した反応系及び反応温度と同様の条件でＰＣＲを行い、ＤＮＡシーケンスにより配列を決定した。決定された配列を元に、ＥＧ．２ＯＧＤ ５'−４ プライマー（配列番号１０）を作製し、更にＤＮＡシーケンスを行った。
【００６８】
次に、ＥＳＴデータベースでヒットしたＮ末端側配列と、上述したシーケンスで得られた配列とを連結し、ユーグレナ グラシリス ＳＭ−ＺＫ株由来の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのｃＤＮＡ全長配列を得た（配列番号２）。また、この全長配列を元に、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を得た（配列番号１）。
【００６９】
（得られた全長配列の確認）
上で得られたＤＮＡはＥＳＴデータベースで得られた部分配列と、ＤＮＡシーケンスで得られた配列を組み合わせて決定された配列であるため、これがクローニングされたｃＤＮＡの全長配列と同じであることを確かめるため、全長配列の読み直しを行った。まず、全長配列を元に、５'末端側の配列を含むプライマー（プライマーＡ）と、３'末端側の配列を含むプライマー（プライマーＢ）の２種類のプライマーを作製した。プライマーＡは制限酵素ＮｄｅＩの切断サイトを、プライマーＢは制限酵素ＸｈｏＩの切断サイトをそれぞれ有している。
上記プライマーＡ，Ｂを用いてＰＣＲを９５℃（１０秒）→５５℃（１０秒）→７２℃（２分）を計３５サイクル行い、７２℃、１０分間に保温した後、１２℃で保存した。得られたＰＣＲ産物で大腸菌（Ｔｏｐ１０）を形質転換し、プレート上に撒いて得られたコロニーのいくつかを選択して培養した。培養後にアルカリＳＤＳによりＤＮＡを抽出し、ＮｄｅＩ、ＸｈｏＩを用いて切断を行い、アガロースゲル電気泳動により制限酵素で切断が確認されたサンプルを選択した。
選択したサンプルのベクターに対して、上述したＤＮＡシーケンサーを用いてＤＮＡシーケンスを行い、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼのｃＤＮＡ全長配列を得た。この全長配列と先に得られたｃＤＮＡ全長配列（配列番号２）とを比較し、両者が同一であることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】各精製過程において溶液をサンプリングし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｄ）前記（ｃ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ｅ）又は（ｆ）に示されるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２に記載のＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、培養物から２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを採取することを特徴とする２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼと２−オキソグルタル酸とを反応させ、生成したコハク酸セミアルデヒド及び二酸化炭素の少なくとも一方の生成量を測定することで、前記２−オキソグルタル酸の定量を行うことを特徴とする２−オキソグルタル酸の測定方法。
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるアミノ酸配列からなる２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
（ｄ）前記（ｃ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ｅ）又は（ｆ）に示されるＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２に記載のＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、培養物から２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼを採取することを特徴とする２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の２−オキソグルタル酸デカルボキシラーゼと２−オキソグルタル酸とを反応させ、生成したコハク酸セミアルデヒド及び二酸化炭素の少なくとも一方の生成量を測定することで、前記２−オキソグルタル酸の定量を行うことを特徴とする２−オキソグルタル酸の測定方法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−１３６１９７（Ｐ２００９−１３６１９７Ａ）
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１４９１３（Ｐ２００７−３１４９１３）
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【出願人】（５０６１４１２２５）株式会社ユーグレナ (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月５日（２００７．１２．５）
【出願人】（５０６１４１２２５）株式会社ユーグレナ (12)
【Ｆターム（参考）】
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