２種類以上の多孔質充填剤を充填するカラム
【課題】セファロース系担体以外の担体においても、セファロース系担体と同等以上のＢＬ−アンジオスタチンの精製効率が得られるカラムの提供。
【解決手段】酵素と該酵素による分解物と親和性を持つ分子を個別に固定化した２種類の担体に分け、酵素反応と該酵素による分解物の濃縮の順序となるようなカラムとすることで、過剰分解物の生成を抑制できるアフィニティートラップリアクター。
【解決手段】酵素と該酵素による分解物と親和性を持つ分子を個別に固定化した２種類の担体に分け、酵素反応と該酵素による分解物の濃縮の順序となるようなカラムとすることで、過剰分解物の生成を抑制できるアフィニティートラップリアクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドを固定化した２種類以上の多孔質充填剤が充填されることを特徴とするカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種用途に用いるプロテアーゼなどの酵素を反応に用いるために担体に固定化した酵素固定化リアクター（バイオリアクター）が、従来提案されている。しかし、プロテアーゼについては、固定化したプロテアーゼが自己消化による分解で失活しやすい。またプロテアーゼなどの酵素の基質が高分子である場合、空間的な制限により担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく速やかに進行しにくい。これらの理由から、酵素固定化リアクター（バイオリアクター）については、用いる酵素と基質の種類によってはその用途が制限されており、各種酵素及び基質について広く利用できる酵素固定化リアクター（バイオリアクター）の開発が期待されている。尚、酵素固定化リアクター（バイオリアクター）の１つとして、アフィニティーカラムによる親和性を利用した分離方法とバイオリアクターカラムによる酵素反応の特徴を合わせ持ったアフィニティートラップリアクターの開発も行われており、生体由来タンパクを基質とした血管の新生を阻害する物質を生成するアフィニティートラップリアクターカラムの開発も進められている。
【０００３】
この血管の新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することから、抗腫瘍剤としての用途が期待されており、このような物質の一つとしてアンジオスタチンが知られている。アンジオスタチンは、血液中に存在する、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる分子量約４０，０００のタンパク質であり、動物実験では、癌に対して劇的な効果を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。アンジオスタチンの生産には、（１）プラスミノーゲンをエラスターゼというプロテアーゼで加水分解する（非特許文献２参照） 、（２） 遺伝子組換え技術を用いて大腸菌に直接生産させる（非特許文献３参照）、という２種類の方法が用いられている。この（１）の方法では、エラスターゼの基質特異性が低いため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難である。また得られるアンジオスタチンの活性が低いなどの欠点がある。（２）の方法では、大腸菌によって生産されるアンジオスタチンの精製が困難であり、コストもかかる。また、溶解性の低さにも問題がある。このため、高純度のアンジオスタチンを簡便な方法で得る手段の開発が求められていた。
【０００４】
最近、Bacillus megaterium A9542株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡが、プラスミノーゲンを特異的に切断して新生血管抑制作用を有するアンジオスタチン様断片（主にGlu1−Ser441，以降、ＢＬ−アンジオスタチンと記載する）と、血栓溶解活性を有するミニプラスミノーゲン様断片（主にVal442−Asn791）を生成することが認められた（特許文献１参照）。また、この酵素バシロライシンＭＡは、非常に安定であるため、担体に固定化して各種用途に用いることが可能である。そこでこのようなバシロライシンＭＡの特性を利用して、バシロライシンＭＡと基質プラスミノーゲンとの反応と、その結果得られる生成物ＢＬ−アンジオスタチンの精製までの工程を一段階で行なって高純度でＢＬ−アンジオスタチンを得る方法、及びそれを行なうための装置の開発が求められていた。
【０００５】
また、上記のような問題点を解決するため、市販のセファロース系担体にプロテアーゼ（酵素）としてバシロライシンＭＡを固定化し、該酵素の基質と特異的に結合する分子としてリジン（Ｌｙｓ）を固定化したカラムであるアフィニティートラップリアクターカラムを用いることにより、血液などの生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを高効率かつ速やかに分解精製する方法が開発された（特許文献２、３参照）。
【０００６】
しかし、市販のセファロース系担体で多量のアフィニティートラップリアクターカラムを作製する場合、高コスト及び流通量が少ないなどの理由により汎用性が無いことが問題とされている。一方、汎用性のある担体（セファロース担体を除く）を使用したアフィニティートラップリアクターカラムでは、過剰分解物の生成による収量の低下などでアフィニティートラップリアクターカラムとして十分な性能が得られないことが問題とされており、汎用性の高いアフィニティートラップリアクターカラムを多量に取得する技術の開発が期待されていた。
【０００７】
本発明者は、上記のような汎用性の高いアフィニティートラップリアクターカラムを開発するために鋭意研究を行なった結果、低コスト化が可能なポリビニルアルコール系担体において十分な性能が得られるアフィニティートラップリアクターカラムを発見して、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２７２４５３号公報
【特許文献２】特許第３８３０５０１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／０７９８３５号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】エム・エス・オリリー（M.S.O'Reilly）ほか、「セル」（Cell）、（米国）、１９９４年１０月２１日、第７９巻、第２号、ｐ３１５−３２８
【非特許文献２】エム・エス・オリリー（M.S.O'Reilly）ほか、「ネイチャー・メディシン」（Nature Medicine）、（米国）、１９９６年、第２巻、ｐ６８９−６９２
【非特許文献３】ビー・ケー・シム（B.K.Sim）ほか、「キャンサー・リサーチ」（Cancer Research） 、（米国）、１９９７年、第５７巻、ｐ１３２９−１３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＮＨＳ活性化された多孔質担体へのバシロライシンＭＡとリジンを固定化したアフィニティートラップリアクターカラムにおいて、基質であるプラスミノーゲンの過剰消化によりＢＬ−アンジオスタチンの精製効率が低下する現象が見られることを確認していた。しかし、同一の多孔質担体へ２種類のリガンドを固定化し、過剰消化の抑制も可能なアフィニティートラップリアクターカラムの調製条件を見出すには、多くの組み合わせが考えられ、困難であることが分かっていた。すなわち、本発明の目的は、バシロライシンＭＡによる過剰消化を抑制し、ＢＬ−アンジオスタチンを効率良く取得できるアフィニティートラップリアクターカラムを開発し、２種類以上のリガンドを用いるバイオリアクターカラムに応用可能なカラム機能を調整する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、リジンの固定化量に比例して、プラスミノーゲンとのアフィニティーが増加するが、過剰分解物も増加することを明らかにした。すなわち、過剰分解物を抑制するためにリジンの固定化量を減らしても、プラスミノーゲンとのアフィニティーが低下し、ＢＬ−アンジオスタチンの精製量が低下することが分かった。そこで、酵素反応により生成したＢＬ−アンジオスタチンと酵素との再接触による過剰分解物を低下させるため、酵素と該酵素による分解物と親和性を持つ分子を個別に固定化した２種類の担体に分けることで、酵素反応と該酵素による分解物の濃縮の順序となるようなカラムとすることで、過剰分解物の生成を抑制できるアフィニティートラップリアクターカラムを作製できることを明らかにした。すなわち本発明は、酵素または該酵素による分解物と親和性を持つ分子の組み合わせのように２種類以上のリガンドを固定化した多孔質担体の充填方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
セファロース系担体以外の担体においても、セファロース系担体と同等以上のＢＬ−アンジオスタチンの精製効率が得られるカラムを提供できる。また、酵素を固定化したアフィニティートラップリアクターカラムにおいては、基質であるプラスミノーゲンの過剰分解による精製量の低下を抑制することが可能である。加えて、その他の酵素を固定化したバイオリアクターへの応用も可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明によるカラムの例
本発明によるカラムは、リガンドを固定化した２種類以上の多孔質充填剤を充填した１つのカラムとすることで、異なる機能を同一カラムで発揮させることが可能である。また、充填される多孔質充填剤を任意の比率で変更することで、最適なカラムの使用条件を提供できるため、２段階以上に分けた場合よりも優れた精製効果を取得することが期待できる。
【００１４】
また、リガンドとして固定化可能な分子としては、多孔質充填剤に共有結合で固定化できる分子であれば、種々の分子を必要に応じて使用することができる。酵素を固定化する例では、プロテアーゼ、糖質分解酵素、及び脂質分解酵素などを含む加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、除去付加酵素、異性化酵素、合成酵素など、種々の酵素を使用することができる。また、酵素以外にも種々のタンパク質、高分子（ポリマーや多糖類など）、低分子（アミン、カルボン酸、アルコール、アミノ酸、糖類など）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
尚、リガンドとして、光学活性分子、糖類の誘導体、タンパク質などを固定化した多孔質担体を２種類以上組み合わせて充填することで、単一の多孔質担体を充填したカラムでは得られない分離性能を持った光学分割カラムなどへの応用が可能である。
【００１６】
また、酵素を固定化した多孔質担体を２種類以上組み合わせて充填することで、２種類以上の酵素反応を連続して行うことができるバイオリアクターへの応用が可能である。例えば、Ｄ−アミノアシラーゼを固定化した多孔質担体とＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼを固定化した多孔質担体を組み合わせることで、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を１段階で調製できるバイオリアクターカラムへの応用が可能である。
【００１７】
また、リガンドとして、酵素及び酵素の基質と特異的に結合する分子を固定化した多孔質充填剤を組み合わせて使用することで、バイオリアクターカラムとアフィニティーカラムの機能を合わせ持ったアフィニティートラップリアクターカラムへの応用も可能である。
【００１８】
アフィニティートラップリアクターの場合、酵素の基質と特異的に結合する分子は、低分子リガンドや抗原抗体反応などにより、酵素基質と特異的かつ可逆的に結合する分子であって、担体と結合しうる分子であれば、必要に応じて任意のものを用いることができる。例えば、酵素の基質、及び目的とする反応生成物には特異的に結合するが、副生成物には結合しない分子を選択して結合させることにより、酵素反応後の副生成物はアフィニティートラップリアクターから容易に除去され、目的生成物のみを高純度で回収することができる。以下に、酵素、基質、それと特異的に結合する分子の例を以下に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
上記に示したように、担体に結合させる酵素がBacillus megaterium A9542株が産生する酵素であるバシロライシンＭＡである場合、このような分子としてはリジン（Ｌｙｓ）を好ましく用いることができる。この場合、リジンは、基質であるプラスミノーゲン、及び目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンとは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物は担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。
【００２１】
アフィニティートラップリアクターカラムに使用しうる多孔質担体としては、アフィニティークロマトグラフィーにおいて通常使用されている担体であれば、固定化する分子、酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類、性質に応じて、当業者であれば適宜選択、使用することができる。
【００２２】
また、上記の酵素は、担体と直接結合していてもよいが、必要に応じて、スペーサー基を介して結合していてもよい。例えば、担体と酵素を化学結合で直接カップリングさせることができない場合、酵素が比較的小さい分子であって酵素と基質との結合を完全に行なわせるのが困難である場合などに、スペーサー基を用いることができる。このようなスペーサー基は、当業者が、結合させる酵素の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
以下に、本発明によるバイオリアクターカラムに好適に使用しうる担体、リガンド（酵素、その基質、基質と特異的に結合しうる分子）及び用いうるスペーサー基の例を挙げるが、本発明によるバイオリアクターは、これらに限定されるものではない。
【００２４】
【表２】
【００２５】
本発明によるバイオリアクターカラムの作製例
バイオリアクターカラムは、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させたものであるので、生化学の分野で使用されるアフィニティークロマトグラフィーを製造する方法を応用することにより、当業者であれば容易に作製をすることができる。
【００２６】
作製に際しては、固定化する酵素に応じて、結合させるスペーサーを選択する。スペーサーを結合させる際は、必要に応じて、多孔質担体の官能基を活性化することにより、担体とスペーサーを容易に結合することができる。例えば多孔質担体としてＰＶＡ（ポリビニルアルコール重合体）を用いる場合には、エピクロロヒドリンによりエポキシ活性化したＰＶＡ担体とし、６−アミノカプロン酸と反応させることで、スペーサーとして６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体とする。この６−アミノカプロン酸固定化ＰＶＡ担体は、酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体としても使用することができる。
【００２７】
次に、使用する担体に酵素を結合させる。結合に際しては、必要に応じて、担体の官能基を活性化することにより、担体と酵素との結合を容易にする。例えば担体としてスペーサーを結合させていないＰＶＡ担体を用いる場合には、臭化シアンにより活性化したＣＮＢｒ活性化ＰＶＡ担体とすることで、容易に酵素を結合することができる。また、担体として６−アミノカプロン酸固定化ＰＶＡ担体を用いる場合には、末端のカルボン酸をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと脱水縮合し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（ＮＨＳ）基に変換した、ＮＨＳ活性化されたＰＶＡ担体とすることで、容易に酵素を結合することができる。尚、ＮＨＳ活性化担体の方が、酵素との反応速度が速く、固定化能力に優れているので、ＮＨＳ活性化担体を使用することが望ましい。
【００２８】
必要に応じて活性化した担体を緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液に溶解した酵素溶液で担体を処理して、担体に酵素を結合させる。緩衝液に含まれる酵素の濃度は、固定化する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。また、ここで使用する緩衝液の組成、ｐＨ、反応時間なども、固定化する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。例えばバシロライシンＭＡをＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体に固定化する場合、バシロライシンＭＡ約０．０１〜１ｍｇ/ｍＬ、好ましくは約０．４ｍｇ/ｍＬを含む緩衝液（組成：０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、更に約０．５Ｍ ＮａＣｌ、約５％イソプロピルアルコールを含む）を用い、５℃で約４時間反応させる。
【００２９】
次に、酵素溶液をろ過等で除去し、酵素を結合させた担体を緩衝液で洗浄することによって、酵素を結合させた担体が得られる。緩衝液の種類は、固定化する酵素の種類に応じて適宜選択することができるが、バシロライシンＭＡを結合させた酵素固定化担体の場合、緩衝液Ｂ（組成：２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、約５％イソプロピルアルコールを含む）などの緩衝液で洗浄することができる。
【００３０】
上記のバシロライシンＭＡを結合させた酵素固定化担体を作製する各工程で用いる緩衝液又は水溶液に含まれるイソプロピルアルコール濃度は、約１〜１０％、好ましくは約５％ である。イソプロピルアルコールの存在下で上記の各工程を行なうことにより、担体に固定化した酵素の失活を防ぎ、酵素を安定に長期間保持することができる。
【００３１】
尚、上述した、担体に酵素を結合させる担体と該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させる担体とを組み合わせる比率、混合方法及び充填する順序は、固定化する酵素の種類及び該酵素の基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、バイオリアクター担体としてバシロライシンＭＡの固定化量が０．８ｍｇ/ｍＬの酵素固定化担体とアフィニティー担体として６−アミノカプロン酸固定化担体を組み合わせたアフィニティートラップリアクターカラムの場合は、基質であるプラスミノーゲンと固定化したバシロライシンＭＡとの接触時間が短いと基質が消化されずに残り、接触時間が長いと生成物の過消化による副生成物が増加するため、カラムへのバシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体の充填比率を１：１〜１：９とするのが好ましく、生成物と副生成物のバランスから１：１とするのがより好ましい。また、上記のアフィニティートラップリアクターカラムへの充填方法においては、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体が混合しないようにバシロライシンＭＡ固定化担体をカラムの上流側に充填することが好ましく、さらに好ましくは、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体の間に基質及び生成物は通すが担体は通さないようなフィルターまたはメッシュを設置して上流側のバシロライシンＭＡ固定化担体と下流側の６−アミノカプロン酸固定化担体が混合しないようにするとよい。尚、カラムへの充填操作で、上流側の担体と下流側の担体が混合しないように充填できる場合は、上記のフィルターまたはメッシュを設置する必要は無い。また、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体が混合してもアフィニティートラップリアクターカラムとして機能するが、完全に混ざってしまうと過消化による副反応が進行し易くなるため、副反応の進行を抑制するには、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体の混合比率がそれぞれ５０％以下となるようにするのが好ましい。
【００３２】
このようにして得たアフィニティートラップリアクターカラムは、緩衝液中、約−９０〜４℃程度の低温、好ましくは約−１０℃で保存する。緩衝液の種類は、適宜選択することができるが、バシロライシンＭＡを固定化する場合、前述の緩衝液Ｂ中で保存することができる。このように緩衝液Ｂ中、低温で保存することにより、上記のアフィニティートラップリアクターカラムは、酵素を失活させることなく、長期にわたって安定に保存することができる。
【００３３】
本発明によるバイオリアクターカラムでは、上記のような構成とすることにより、固定化する酵素と、酵素の基質と特異的に結合する分子の種類に制限されることなく、酵素と基質との反応を高効率で、かつ特異的に進行させることが可能なアフィニティートラップリアクターへの応用が可能である。
【００３４】
本発明によるバイオリアクターカラムの使用例
本発明によるバイオリアクターカラムの１つであるアフィニティートラップリアクターを用いて、所望の酵素と基質の反応を進行させるには、上記のように調製したアフィニティートラップリアクターをあらかじめ緩衝液で平衡化しておく。緩衝液の種類は、固定化した酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができる。酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｃ）を用いることができる。
【００３５】
次に、アフィニティートラップリアクターカラムに固定化した酵素に適した基質を含んでいる生体試料などの試料（血液など）から遠心分離などの処理により上清を得る。酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合には、試料の種類に応じて適宜決定した、遠心分離の条件で処理することで得られた上清を、平衡化しておいた上記のアフィニティートラップリアクターカラムに添加することによって生体試料中の基質と酵素との反応を進行させ、その後このアフィニティートラップリアクターカラムを緩衝液で洗浄し、次いで溶出液を添加することにより酵素反応によって生じた生成物を溶出する。洗浄に用いる緩衝液としては、平衡化に用いた緩衝液を用いることができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合、約０．５ＭのＮａＣｌを含む上記の緩衝液Ｃで洗浄する。溶出液も、酵素、基質の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターの場合、約２００ｍＭの６−アミノカプロン酸を溶出液として用いる。
【００３６】
酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターの場合、上記の一連の反応はすべて、約０〜５０℃程度の温度、好ましくは約２０〜３０℃の温度で行なう。このような温度で反応を進行させることによって、上記のアフィニティートラップリアクターに固定化されたバシロライシンＭＡは自己消化せずに安定に保持される一方、プラスミノーゲンに対するバシロライシンＭＡの作用は、必要最低限確保されるため、酵素反応は円滑かつ特異的に進行する。またこの一連の反応で使用する各種緩衝液には、カルシウムイオンを含有させず、カルシウムイオンの存在しない条件で各反応を進行させる。
【００３７】
以上、本発明によるバイオリアクターカラムの作製例及び使用例について記載したが、本発明は、このアフィニティートラップリアクターカラムを用いた、生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法にも関する。本方法は、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及び６−アミノカプロン酸を結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターカラムに付して、約０〜５０℃、好ましくは約２０〜３０℃の温度で、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得ることによる。６−アミノカプロン酸は、基質であるプラスミノーゲンと、目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンの両者とは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物は６−アミノカプロン酸を介して担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターカラムから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。このような特定の条件で上記のアフィニティートラップリアクターカラムを用いて酵素反応を進行させることにより、プラスミノーゲンから高純度のＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得ることができる。
【００３８】
本発明は、先に詳細に記載した本発明によるバイオリアクターカラムの作製例のアフィニティートラップリアクターを用い、先に記載した本発明によるバイオリアクターカラムの使用例により実施することができる。プラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得るための具体的かつ詳細な条件は、以下の実施例に記載したとおりであるので、実施例の記載に基づいて実施することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明について具体的に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限定されるものではない。
（実施例１）
【００４０】
ＰＶＡ（ポリビニルアルコール重合）担体の作製
特開２００７−１３１６６８に記載の実施例と同様に、ＰＶＡ担体を作製した。
【００４１】
エポキシ活性化したＰＶＡ担体の調製
ＰＶＡ担体１５１ｇに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１８３ｍＬ、３０％ＮａＯＨ１５．２ｍＬ、エピクロロヒドリン１２２ｍＬを加えて、４０℃で５時間反応させた。このスラリーをＤＭＳＯ０．６Ｌ、水３．０Ｌで洗浄することで、エポキシ活性化ＰＶＡ担体を得た。
【００４２】
６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体の作製
エポキシ活性化ＰＶＡ担体１６０ｍＬに水１００ｍＬ、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液４０．１ｍＬ、２Ｍアミノカプロン酸水溶液２０．５ｍＬを加え、５０℃で５時間反応させた。このスラリーを水３．２Ｌで洗浄することで６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体を得た。
【００４３】
バシロライシンＭＡを固定化したＰＶＡ担体の作製
６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体９８ｍＬをＤＭＳＯ２４５ｍＬで洗浄し、洗浄した担体にＤＭＳＯ９４ｍＬ、ＮＨＳ１２．６ｇ、ＥＤＣ２１．０ｇを加え、４０℃で１０時間反応させた。このスラリーをＤＭＳＯ２．０Ｌで、ＩＰＡ０．３Ｌで洗浄することでＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体を得た。このＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体５ｍＬを冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液２５ｍＬで洗浄し、洗浄した担体に１ｍＭ ＨＣｌ溶液２．６ｍＬ、次に４ｍｇのバシロライシンＭＡを含む緩衝液Ａ（１ｍＭ ＨＣｌ溶液と合わせて、０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールとなる溶液）７．４ｍＬを添加し、５℃で４時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液Ｂ（５％イソプロピルアルコールを含む、２５ｍＭ リン酸ナトリウム）５０ｍＬでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液Ｂ中、−１０℃以下で保存した。
【００４４】
バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターの作製
６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体と、６−アミノカプロン酸とバシロライシンＭＡを固定化したＰＶＡ担体を各々０．５ｍＬ計量し、１ｍＬ容積のカラムに６−アミノカプロン酸とバシロライシンＭＡを固定化したＰＶＡ担体がカラムの上流側となるように充填し、バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターカラムを作製した。前記リアクターカラム内部の液体を前述の緩衝液Ｂで置換し、−１０℃以下で保存した。
【００４５】
バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬ−アンジオスタチンの一段階精製プロセス
上記で作製した、バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターカラム（１ｍＬ）を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。平衡化したリアクターカラムに、クエン酸処理したヒト血漿５ｍＬを流速０．１２５ｍＬ/分で添加した。その後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む上記組成の緩衝液Ｃ１０ｍＬでリアクターを洗浄した（３ｍＬ/分）。生成したＢＬ−アンジオスタチンの溶出は、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸溶液３ｍＬで行なった。その結果、ＢＬ−アンジオスタチンの収量及び純度は、３１５μｇ及び４３％であった。
（比較例１）
【００４６】
実施例１と同様に調製したＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体１０ｍＬを冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液５０ｍＬで洗浄し、洗浄した担体に１ｍＭ ＨＣｌ溶液８．８１ｍＬ、次に０．４ｍｇのバシロライシンＭＡを含む緩衝液Ａ（１ｍＭ ＨＣｌ溶液と合わせて、０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールとなる溶液）１１．１９ｍＬを添加し、５℃で１０分間撹拌した。次に、１Ｍ リジン溶液（５％イソプロピルアルコールを含む）２ｍＬを添加し、５℃で３．５時間攪拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液Ｂ（５％イソプロピルアルコールを含む、２５ｍＭ リン酸ナトリウム）１００ｍＬでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液Ｂ中、−１０℃以下で保存した。左記のリアクターを使用する以外は、実施例１と同じ方法で評価を行った。その結果、ＢＬ−アンジオスタチンの収量及び純度は、９０μｇ及び２７％であった。
（参考例１）
【００４７】
バシロライシンＭＡとリジンを同一担体に固定化したリアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬ−アンジオスタチンの一段階精製プロセス
市販のＮＨＳ活性化セファロース担体約３．９ｍＬを冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液１１７ｍＬで洗浄し、洗浄した担体に７８μｇのバシロライシンＭＡを含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールとなる溶液）７．８ｍＬを添加し、２５℃で２時間撹拌することによって、酵素固定化反応を行った。反応終了後に反応溶液を除去し、０．２Ｍ リジン溶液（５％イソプロピルアルコールを含む）７．８ｍＬを添加し、２５℃で２時間攪拌することによって、リジン固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液Ｂ（５％イソプロピルアルコールを含む、２５ｍＭ リン酸ナトリウム）１１７ｍＬでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液Ｂ中、−１０℃以下で保存した。左記のリアクターを使用する以外は、実施例１と同じ方法で評価を行った。その結果、ＢＬ−アンジオスタチンの収量及び純度は、２２４μｇ及び４２％であった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンドを固定化した２種類以上の多孔質充填剤が充填されることを特徴とするカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種用途に用いるプロテアーゼなどの酵素を反応に用いるために担体に固定化した酵素固定化リアクター（バイオリアクター）が、従来提案されている。しかし、プロテアーゼについては、固定化したプロテアーゼが自己消化による分解で失活しやすい。またプロテアーゼなどの酵素の基質が高分子である場合、空間的な制限により担体に結合した酵素と基質との反応が効率よく速やかに進行しにくい。これらの理由から、酵素固定化リアクター（バイオリアクター）については、用いる酵素と基質の種類によってはその用途が制限されており、各種酵素及び基質について広く利用できる酵素固定化リアクター（バイオリアクター）の開発が期待されている。尚、酵素固定化リアクター（バイオリアクター）の１つとして、アフィニティーカラムによる親和性を利用した分離方法とバイオリアクターカラムによる酵素反応の特徴を合わせ持ったアフィニティートラップリアクターの開発も行われており、生体由来タンパクを基質とした血管の新生を阻害する物質を生成するアフィニティートラップリアクターカラムの開発も進められている。
【０００３】
この血管の新生を阻害する物質は、癌の増殖、浸潤、転移を抑制することから、抗腫瘍剤としての用途が期待されており、このような物質の一つとしてアンジオスタチンが知られている。アンジオスタチンは、血液中に存在する、線溶因子であるプラスミノーゲンを分解することにより得られる分子量約４０，０００のタンパク質であり、動物実験では、癌に対して劇的な効果を示すことが報告されている（非特許文献１参照）。アンジオスタチンの生産には、（１）プラスミノーゲンをエラスターゼというプロテアーゼで加水分解する（非特許文献２参照） 、（２） 遺伝子組換え技術を用いて大腸菌に直接生産させる（非特許文献３参照）、という２種類の方法が用いられている。この（１）の方法では、エラスターゼの基質特異性が低いため、副生成物が多く生じ、プラスミノーゲンからアンジオスタチンを選択的に生成させることが困難である。また得られるアンジオスタチンの活性が低いなどの欠点がある。（２）の方法では、大腸菌によって生産されるアンジオスタチンの精製が困難であり、コストもかかる。また、溶解性の低さにも問題がある。このため、高純度のアンジオスタチンを簡便な方法で得る手段の開発が求められていた。
【０００４】
最近、Bacillus megaterium A9542株が産生するプロテアーゼであるバシロライシンＭＡが、プラスミノーゲンを特異的に切断して新生血管抑制作用を有するアンジオスタチン様断片（主にGlu1−Ser441，以降、ＢＬ−アンジオスタチンと記載する）と、血栓溶解活性を有するミニプラスミノーゲン様断片（主にVal442−Asn791）を生成することが認められた（特許文献１参照）。また、この酵素バシロライシンＭＡは、非常に安定であるため、担体に固定化して各種用途に用いることが可能である。そこでこのようなバシロライシンＭＡの特性を利用して、バシロライシンＭＡと基質プラスミノーゲンとの反応と、その結果得られる生成物ＢＬ−アンジオスタチンの精製までの工程を一段階で行なって高純度でＢＬ−アンジオスタチンを得る方法、及びそれを行なうための装置の開発が求められていた。
【０００５】
また、上記のような問題点を解決するため、市販のセファロース系担体にプロテアーゼ（酵素）としてバシロライシンＭＡを固定化し、該酵素の基質と特異的に結合する分子としてリジン（Ｌｙｓ）を固定化したカラムであるアフィニティートラップリアクターカラムを用いることにより、血液などの生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを高効率かつ速やかに分解精製する方法が開発された（特許文献２、３参照）。
【０００６】
しかし、市販のセファロース系担体で多量のアフィニティートラップリアクターカラムを作製する場合、高コスト及び流通量が少ないなどの理由により汎用性が無いことが問題とされている。一方、汎用性のある担体（セファロース担体を除く）を使用したアフィニティートラップリアクターカラムでは、過剰分解物の生成による収量の低下などでアフィニティートラップリアクターカラムとして十分な性能が得られないことが問題とされており、汎用性の高いアフィニティートラップリアクターカラムを多量に取得する技術の開発が期待されていた。
【０００７】
本発明者は、上記のような汎用性の高いアフィニティートラップリアクターカラムを開発するために鋭意研究を行なった結果、低コスト化が可能なポリビニルアルコール系担体において十分な性能が得られるアフィニティートラップリアクターカラムを発見して、本発明を完成するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２７２４５３号公報
【特許文献２】特許第３８３０５０１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００５／０７９８３５号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】エム・エス・オリリー（M.S.O'Reilly）ほか、「セル」（Cell）、（米国）、１９９４年１０月２１日、第７９巻、第２号、ｐ３１５−３２８
【非特許文献２】エム・エス・オリリー（M.S.O'Reilly）ほか、「ネイチャー・メディシン」（Nature Medicine）、（米国）、１９９６年、第２巻、ｐ６８９−６９２
【非特許文献３】ビー・ケー・シム（B.K.Sim）ほか、「キャンサー・リサーチ」（Cancer Research） 、（米国）、１９９７年、第５７巻、ｐ１３２９−１３３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＮＨＳ活性化された多孔質担体へのバシロライシンＭＡとリジンを固定化したアフィニティートラップリアクターカラムにおいて、基質であるプラスミノーゲンの過剰消化によりＢＬ−アンジオスタチンの精製効率が低下する現象が見られることを確認していた。しかし、同一の多孔質担体へ２種類のリガンドを固定化し、過剰消化の抑制も可能なアフィニティートラップリアクターカラムの調製条件を見出すには、多くの組み合わせが考えられ、困難であることが分かっていた。すなわち、本発明の目的は、バシロライシンＭＡによる過剰消化を抑制し、ＢＬ−アンジオスタチンを効率良く取得できるアフィニティートラップリアクターカラムを開発し、２種類以上のリガンドを用いるバイオリアクターカラムに応用可能なカラム機能を調整する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、リジンの固定化量に比例して、プラスミノーゲンとのアフィニティーが増加するが、過剰分解物も増加することを明らかにした。すなわち、過剰分解物を抑制するためにリジンの固定化量を減らしても、プラスミノーゲンとのアフィニティーが低下し、ＢＬ−アンジオスタチンの精製量が低下することが分かった。そこで、酵素反応により生成したＢＬ−アンジオスタチンと酵素との再接触による過剰分解物を低下させるため、酵素と該酵素による分解物と親和性を持つ分子を個別に固定化した２種類の担体に分けることで、酵素反応と該酵素による分解物の濃縮の順序となるようなカラムとすることで、過剰分解物の生成を抑制できるアフィニティートラップリアクターカラムを作製できることを明らかにした。すなわち本発明は、酵素または該酵素による分解物と親和性を持つ分子の組み合わせのように２種類以上のリガンドを固定化した多孔質担体の充填方法に関する。
【発明の効果】
【００１２】
セファロース系担体以外の担体においても、セファロース系担体と同等以上のＢＬ−アンジオスタチンの精製効率が得られるカラムを提供できる。また、酵素を固定化したアフィニティートラップリアクターカラムにおいては、基質であるプラスミノーゲンの過剰分解による精製量の低下を抑制することが可能である。加えて、その他の酵素を固定化したバイオリアクターへの応用も可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明によるカラムの例
本発明によるカラムは、リガンドを固定化した２種類以上の多孔質充填剤を充填した１つのカラムとすることで、異なる機能を同一カラムで発揮させることが可能である。また、充填される多孔質充填剤を任意の比率で変更することで、最適なカラムの使用条件を提供できるため、２段階以上に分けた場合よりも優れた精製効果を取得することが期待できる。
【００１４】
また、リガンドとして固定化可能な分子としては、多孔質充填剤に共有結合で固定化できる分子であれば、種々の分子を必要に応じて使用することができる。酵素を固定化する例では、プロテアーゼ、糖質分解酵素、及び脂質分解酵素などを含む加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、除去付加酵素、異性化酵素、合成酵素など、種々の酵素を使用することができる。また、酵素以外にも種々のタンパク質、高分子（ポリマーや多糖類など）、低分子（アミン、カルボン酸、アルコール、アミノ酸、糖類など）などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
尚、リガンドとして、光学活性分子、糖類の誘導体、タンパク質などを固定化した多孔質担体を２種類以上組み合わせて充填することで、単一の多孔質担体を充填したカラムでは得られない分離性能を持った光学分割カラムなどへの応用が可能である。
【００１６】
また、酵素を固定化した多孔質担体を２種類以上組み合わせて充填することで、２種類以上の酵素反応を連続して行うことができるバイオリアクターへの応用が可能である。例えば、Ｄ−アミノアシラーゼを固定化した多孔質担体とＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼを固定化した多孔質担体を組み合わせることで、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を１段階で調製できるバイオリアクターカラムへの応用が可能である。
【００１７】
また、リガンドとして、酵素及び酵素の基質と特異的に結合する分子を固定化した多孔質充填剤を組み合わせて使用することで、バイオリアクターカラムとアフィニティーカラムの機能を合わせ持ったアフィニティートラップリアクターカラムへの応用も可能である。
【００１８】
アフィニティートラップリアクターの場合、酵素の基質と特異的に結合する分子は、低分子リガンドや抗原抗体反応などにより、酵素基質と特異的かつ可逆的に結合する分子であって、担体と結合しうる分子であれば、必要に応じて任意のものを用いることができる。例えば、酵素の基質、及び目的とする反応生成物には特異的に結合するが、副生成物には結合しない分子を選択して結合させることにより、酵素反応後の副生成物はアフィニティートラップリアクターから容易に除去され、目的生成物のみを高純度で回収することができる。以下に、酵素、基質、それと特異的に結合する分子の例を以下に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
上記に示したように、担体に結合させる酵素がBacillus megaterium A9542株が産生する酵素であるバシロライシンＭＡである場合、このような分子としてはリジン（Ｌｙｓ）を好ましく用いることができる。この場合、リジンは、基質であるプラスミノーゲン、及び目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンとは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物は担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。
【００２１】
アフィニティートラップリアクターカラムに使用しうる多孔質担体としては、アフィニティークロマトグラフィーにおいて通常使用されている担体であれば、固定化する分子、酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類、性質に応じて、当業者であれば適宜選択、使用することができる。
【００２２】
また、上記の酵素は、担体と直接結合していてもよいが、必要に応じて、スペーサー基を介して結合していてもよい。例えば、担体と酵素を化学結合で直接カップリングさせることができない場合、酵素が比較的小さい分子であって酵素と基質との結合を完全に行なわせるのが困難である場合などに、スペーサー基を用いることができる。このようなスペーサー基は、当業者が、結合させる酵素の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２３】
以下に、本発明によるバイオリアクターカラムに好適に使用しうる担体、リガンド（酵素、その基質、基質と特異的に結合しうる分子）及び用いうるスペーサー基の例を挙げるが、本発明によるバイオリアクターは、これらに限定されるものではない。
【００２４】
【表２】
【００２５】
本発明によるバイオリアクターカラムの作製例
バイオリアクターカラムは、担体に酵素、及び該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させたものであるので、生化学の分野で使用されるアフィニティークロマトグラフィーを製造する方法を応用することにより、当業者であれば容易に作製をすることができる。
【００２６】
作製に際しては、固定化する酵素に応じて、結合させるスペーサーを選択する。スペーサーを結合させる際は、必要に応じて、多孔質担体の官能基を活性化することにより、担体とスペーサーを容易に結合することができる。例えば多孔質担体としてＰＶＡ（ポリビニルアルコール重合体）を用いる場合には、エピクロロヒドリンによりエポキシ活性化したＰＶＡ担体とし、６−アミノカプロン酸と反応させることで、スペーサーとして６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体とする。この６−アミノカプロン酸固定化ＰＶＡ担体は、酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させた担体としても使用することができる。
【００２７】
次に、使用する担体に酵素を結合させる。結合に際しては、必要に応じて、担体の官能基を活性化することにより、担体と酵素との結合を容易にする。例えば担体としてスペーサーを結合させていないＰＶＡ担体を用いる場合には、臭化シアンにより活性化したＣＮＢｒ活性化ＰＶＡ担体とすることで、容易に酵素を結合することができる。また、担体として６−アミノカプロン酸固定化ＰＶＡ担体を用いる場合には、末端のカルボン酸をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと脱水縮合し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（ＮＨＳ）基に変換した、ＮＨＳ活性化されたＰＶＡ担体とすることで、容易に酵素を結合することができる。尚、ＮＨＳ活性化担体の方が、酵素との反応速度が速く、固定化能力に優れているので、ＮＨＳ活性化担体を使用することが望ましい。
【００２８】
必要に応じて活性化した担体を緩衝液で洗浄し、次に同じ緩衝液に溶解した酵素溶液で担体を処理して、担体に酵素を結合させる。緩衝液に含まれる酵素の濃度は、固定化する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。また、ここで使用する緩衝液の組成、ｐＨ、反応時間なども、固定化する酵素の種類に応じて適宜決定することができる。例えばバシロライシンＭＡをＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体に固定化する場合、バシロライシンＭＡ約０．０１〜１ｍｇ/ｍＬ、好ましくは約０．４ｍｇ/ｍＬを含む緩衝液（組成：０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、更に約０．５Ｍ ＮａＣｌ、約５％イソプロピルアルコールを含む）を用い、５℃で約４時間反応させる。
【００２９】
次に、酵素溶液をろ過等で除去し、酵素を結合させた担体を緩衝液で洗浄することによって、酵素を結合させた担体が得られる。緩衝液の種類は、固定化する酵素の種類に応じて適宜選択することができるが、バシロライシンＭＡを結合させた酵素固定化担体の場合、緩衝液Ｂ（組成：２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、約５％イソプロピルアルコールを含む）などの緩衝液で洗浄することができる。
【００３０】
上記のバシロライシンＭＡを結合させた酵素固定化担体を作製する各工程で用いる緩衝液又は水溶液に含まれるイソプロピルアルコール濃度は、約１〜１０％、好ましくは約５％ である。イソプロピルアルコールの存在下で上記の各工程を行なうことにより、担体に固定化した酵素の失活を防ぎ、酵素を安定に長期間保持することができる。
【００３１】
尚、上述した、担体に酵素を結合させる担体と該酵素の基質と特異的に結合する分子を結合させる担体とを組み合わせる比率、混合方法及び充填する順序は、固定化する酵素の種類及び該酵素の基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、バイオリアクター担体としてバシロライシンＭＡの固定化量が０．８ｍｇ/ｍＬの酵素固定化担体とアフィニティー担体として６−アミノカプロン酸固定化担体を組み合わせたアフィニティートラップリアクターカラムの場合は、基質であるプラスミノーゲンと固定化したバシロライシンＭＡとの接触時間が短いと基質が消化されずに残り、接触時間が長いと生成物の過消化による副生成物が増加するため、カラムへのバシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体の充填比率を１：１〜１：９とするのが好ましく、生成物と副生成物のバランスから１：１とするのがより好ましい。また、上記のアフィニティートラップリアクターカラムへの充填方法においては、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体が混合しないようにバシロライシンＭＡ固定化担体をカラムの上流側に充填することが好ましく、さらに好ましくは、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体の間に基質及び生成物は通すが担体は通さないようなフィルターまたはメッシュを設置して上流側のバシロライシンＭＡ固定化担体と下流側の６−アミノカプロン酸固定化担体が混合しないようにするとよい。尚、カラムへの充填操作で、上流側の担体と下流側の担体が混合しないように充填できる場合は、上記のフィルターまたはメッシュを設置する必要は無い。また、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体が混合してもアフィニティートラップリアクターカラムとして機能するが、完全に混ざってしまうと過消化による副反応が進行し易くなるため、副反応の進行を抑制するには、バシロライシンＭＡ固定化担体と６−アミノカプロン酸固定化担体の混合比率がそれぞれ５０％以下となるようにするのが好ましい。
【００３２】
このようにして得たアフィニティートラップリアクターカラムは、緩衝液中、約−９０〜４℃程度の低温、好ましくは約−１０℃で保存する。緩衝液の種類は、適宜選択することができるが、バシロライシンＭＡを固定化する場合、前述の緩衝液Ｂ中で保存することができる。このように緩衝液Ｂ中、低温で保存することにより、上記のアフィニティートラップリアクターカラムは、酵素を失活させることなく、長期にわたって安定に保存することができる。
【００３３】
本発明によるバイオリアクターカラムでは、上記のような構成とすることにより、固定化する酵素と、酵素の基質と特異的に結合する分子の種類に制限されることなく、酵素と基質との反応を高効率で、かつ特異的に進行させることが可能なアフィニティートラップリアクターへの応用が可能である。
【００３４】
本発明によるバイオリアクターカラムの使用例
本発明によるバイオリアクターカラムの１つであるアフィニティートラップリアクターを用いて、所望の酵素と基質の反応を進行させるには、上記のように調製したアフィニティートラップリアクターをあらかじめ緩衝液で平衡化しておく。緩衝液の種類は、固定化した酵素及び基質と特異的に結合する分子の種類に応じて適宜選択することができる。酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合、５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）（緩衝液Ｃ）を用いることができる。
【００３５】
次に、アフィニティートラップリアクターカラムに固定化した酵素に適した基質を含んでいる生体試料などの試料（血液など）から遠心分離などの処理により上清を得る。酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合には、試料の種類に応じて適宜決定した、遠心分離の条件で処理することで得られた上清を、平衡化しておいた上記のアフィニティートラップリアクターカラムに添加することによって生体試料中の基質と酵素との反応を進行させ、その後このアフィニティートラップリアクターカラムを緩衝液で洗浄し、次いで溶出液を添加することにより酵素反応によって生じた生成物を溶出する。洗浄に用いる緩衝液としては、平衡化に用いた緩衝液を用いることができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターカラムの場合、約０．５ＭのＮａＣｌを含む上記の緩衝液Ｃで洗浄する。溶出液も、酵素、基質の種類に応じて適宜決定することができる。例えば、酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターの場合、約２００ｍＭの６−アミノカプロン酸を溶出液として用いる。
【００３６】
酵素としてバシロライシンＭＡを、基質と特異的に結合する分子として６−アミノカプロン酸を結合させた上記のアフィニティートラップリアクターの場合、上記の一連の反応はすべて、約０〜５０℃程度の温度、好ましくは約２０〜３０℃の温度で行なう。このような温度で反応を進行させることによって、上記のアフィニティートラップリアクターに固定化されたバシロライシンＭＡは自己消化せずに安定に保持される一方、プラスミノーゲンに対するバシロライシンＭＡの作用は、必要最低限確保されるため、酵素反応は円滑かつ特異的に進行する。またこの一連の反応で使用する各種緩衝液には、カルシウムイオンを含有させず、カルシウムイオンの存在しない条件で各反応を進行させる。
【００３７】
以上、本発明によるバイオリアクターカラムの作製例及び使用例について記載したが、本発明は、このアフィニティートラップリアクターカラムを用いた、生体試料に含まれるプラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得る方法にも関する。本方法は、プラスミノーゲンを含む生体試料をバシロライシンＭＡ及び６−アミノカプロン酸を結合させた担体からなるアフィニティートラップリアクターカラムに付して、約０〜５０℃、好ましくは約２０〜３０℃の温度で、カルシウムイオンの存在しない条件で反応させて、ＢＬ−アンジオスタチンを得ることによる。６−アミノカプロン酸は、基質であるプラスミノーゲンと、目的とする分解生成物であるＢＬ−アンジオスタチンの両者とは特異的に結合するが、副生成物であるミニプラスミノーゲンとは結合しない。このため、酵素反応後、副生成物は６−アミノカプロン酸を介して担体に結合されずにアフィニティートラップリアクターカラムから除去されるため、目的生成物のみを選択的に回収することができる。このような特定の条件で上記のアフィニティートラップリアクターカラムを用いて酵素反応を進行させることにより、プラスミノーゲンから高純度のＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得ることができる。
【００３８】
本発明は、先に詳細に記載した本発明によるバイオリアクターカラムの作製例のアフィニティートラップリアクターを用い、先に記載した本発明によるバイオリアクターカラムの使用例により実施することができる。プラスミノーゲンからＢＬ−アンジオスタチンを一段階で得るための具体的かつ詳細な条件は、以下の実施例に記載したとおりであるので、実施例の記載に基づいて実施することができる。
【実施例】
【００３９】
以下に、本発明について具体的に説明するが、本発明は実施例に記載されたものに限定されるものではない。
（実施例１）
【００４０】
ＰＶＡ（ポリビニルアルコール重合）担体の作製
特開２００７−１３１６６８に記載の実施例と同様に、ＰＶＡ担体を作製した。
【００４１】
エポキシ活性化したＰＶＡ担体の調製
ＰＶＡ担体１５１ｇに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１８３ｍＬ、３０％ＮａＯＨ１５．２ｍＬ、エピクロロヒドリン１２２ｍＬを加えて、４０℃で５時間反応させた。このスラリーをＤＭＳＯ０．６Ｌ、水３．０Ｌで洗浄することで、エポキシ活性化ＰＶＡ担体を得た。
【００４２】
６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体の作製
エポキシ活性化ＰＶＡ担体１６０ｍＬに水１００ｍＬ、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液４０．１ｍＬ、２Ｍアミノカプロン酸水溶液２０．５ｍＬを加え、５０℃で５時間反応させた。このスラリーを水３．２Ｌで洗浄することで６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体を得た。
【００４３】
バシロライシンＭＡを固定化したＰＶＡ担体の作製
６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体９８ｍＬをＤＭＳＯ２４５ｍＬで洗浄し、洗浄した担体にＤＭＳＯ９４ｍＬ、ＮＨＳ１２．６ｇ、ＥＤＣ２１．０ｇを加え、４０℃で１０時間反応させた。このスラリーをＤＭＳＯ２．０Ｌで、ＩＰＡ０．３Ｌで洗浄することでＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体を得た。このＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体５ｍＬを冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液２５ｍＬで洗浄し、洗浄した担体に１ｍＭ ＨＣｌ溶液２．６ｍＬ、次に４ｍｇのバシロライシンＭＡを含む緩衝液Ａ（１ｍＭ ＨＣｌ溶液と合わせて、０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールとなる溶液）７．４ｍＬを添加し、５℃で４時間撹拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液Ｂ（５％イソプロピルアルコールを含む、２５ｍＭ リン酸ナトリウム）５０ｍＬでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液Ｂ中、−１０℃以下で保存した。
【００４４】
バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターの作製
６−アミノカプロン酸を固定化したＰＶＡ担体と、６−アミノカプロン酸とバシロライシンＭＡを固定化したＰＶＡ担体を各々０．５ｍＬ計量し、１ｍＬ容積のカラムに６−アミノカプロン酸とバシロライシンＭＡを固定化したＰＶＡ担体がカラムの上流側となるように充填し、バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターカラムを作製した。前記リアクターカラム内部の液体を前述の緩衝液Ｂで置換し、−１０℃以下で保存した。
【００４５】
バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬ−アンジオスタチンの一段階精製プロセス
上記で作製した、バシロライシンＭＡ／６−アミノカプロン酸リアクターカラム（１ｍＬ）を、緩衝液Ｃ（５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で平衡化した。平衡化したリアクターカラムに、クエン酸処理したヒト血漿５ｍＬを流速０．１２５ｍＬ/分で添加した。その後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む上記組成の緩衝液Ｃ１０ｍＬでリアクターを洗浄した（３ｍＬ/分）。生成したＢＬ−アンジオスタチンの溶出は、２００ｍＭの６−アミノヘキサン酸溶液３ｍＬで行なった。その結果、ＢＬ−アンジオスタチンの収量及び純度は、３１５μｇ及び４３％であった。
（比較例１）
【００４６】
実施例１と同様に調製したＮＨＳ活性化ＰＶＡ担体１０ｍＬを冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液５０ｍＬで洗浄し、洗浄した担体に１ｍＭ ＨＣｌ溶液８．８１ｍＬ、次に０．４ｍｇのバシロライシンＭＡを含む緩衝液Ａ（１ｍＭ ＨＣｌ溶液と合わせて、０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールとなる溶液）１１．１９ｍＬを添加し、５℃で１０分間撹拌した。次に、１Ｍ リジン溶液（５％イソプロピルアルコールを含む）２ｍＬを添加し、５℃で３．５時間攪拌することによって、固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液Ｂ（５％イソプロピルアルコールを含む、２５ｍＭ リン酸ナトリウム）１００ｍＬでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液Ｂ中、−１０℃以下で保存した。左記のリアクターを使用する以外は、実施例１と同じ方法で評価を行った。その結果、ＢＬ−アンジオスタチンの収量及び純度は、９０μｇ及び２７％であった。
（参考例１）
【００４７】
バシロライシンＭＡとリジンを同一担体に固定化したリアクターを用いた、ヒト血漿からのＢＬ−アンジオスタチンの一段階精製プロセス
市販のＮＨＳ活性化セファロース担体約３．９ｍＬを冷１ｍＭ ＨＣｌ溶液１１７ｍＬで洗浄し、洗浄した担体に７８μｇのバシロライシンＭＡを含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ 炭酸水素ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコールとなる溶液）７．８ｍＬを添加し、２５℃で２時間撹拌することによって、酵素固定化反応を行った。反応終了後に反応溶液を除去し、０．２Ｍ リジン溶液（５％イソプロピルアルコールを含む）７．８ｍＬを添加し、２５℃で２時間攪拌することによって、リジン固定化反応を行なった。反応終了後、溶液を除去し、緩衝液Ｂ（５％イソプロピルアルコールを含む、２５ｍＭ リン酸ナトリウム）１１７ｍＬでゲルを洗浄し、最後に上記組成の緩衝液Ｂ中、−１０℃以下で保存した。左記のリアクターを使用する以外は、実施例１と同じ方法で評価を行った。その結果、ＢＬ−アンジオスタチンの収量及び純度は、２２４μｇ及び４２％であった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを固定化した２種類以上の多孔質担体が充填されることを特徴とするカラム。
【請求項２】
少なくとも１種類の多孔質担体がカラムの下流側に充填され、且つ体積で１０％以上を占める、請求項１記載のカラム。
【請求項３】
２種類の多孔質担体がカラムの下流側および上流側にそれぞれ５０％ずつ充填され、且つ２種類の多孔質担体が混合状態にある体積が５０％以下である、請求項１または２に記載のカラム。
【請求項４】
２種類の多孔質担体がカラムの下流側および上流側にそれぞれ５０％ずつ充填され、それらの多孔質担体が互いに混ざらないようにすることができるフィルターまたはメッシュのようなもので仕切られている、請求項１から３のいずれかに記載のカラム。
【請求項５】
１種類の多孔質担体がリガンドとして酵素を固定化した多孔質担体であり、もう１種類の多孔質担体がリガンドとして前述の酵素による分解物と親和性を持つ分子を固定化した多孔質担体である、請求項１から４のいずれかに記載のカラム。
【請求項６】
１種類の多孔質担体がリガンドとしてプラスミノーゲンを基質とする酵素を固定化した多孔質担体であり、もう１種類の多孔質担体がリガンドとして前述の酵素によるプラスミノーゲンの分解物と親和性を持つ分子を固定化した多孔質担体である、請求項１から５のいずれかに記載のカラム。
【請求項７】
１種類の多孔質担体がリガンドとしてプラスミノーゲンを基質とする酵素であるバシロライシンＭＡを固定化した多孔質担体であり、もう１種類の多孔質担体がリガンドとしてバシロライシンＭＡによるプラスミノーゲンの分解物と親和性を持つ分子であるリジンまたは／および６−アミノカプロン酸を固定化した多孔質担体である、請求項１から６のいずれかに記載のカラム。
【請求項８】
多孔質担体が水酸基を有する化合物からなる水不溶性多孔質担体である、請求項１から７のいずれかに記載のカラム。
【請求項９】
水不溶性多孔質担体がセルロース、アガロースなどの多糖類、ポリビニルアルコールなどの合成高分子などの群から選ばれるものである、請求項１から８のいずれかに記載のカラム。
【請求項１】
リガンドを固定化した２種類以上の多孔質担体が充填されることを特徴とするカラム。
【請求項２】
少なくとも１種類の多孔質担体がカラムの下流側に充填され、且つ体積で１０％以上を占める、請求項１記載のカラム。
【請求項３】
２種類の多孔質担体がカラムの下流側および上流側にそれぞれ５０％ずつ充填され、且つ２種類の多孔質担体が混合状態にある体積が５０％以下である、請求項１または２に記載のカラム。
【請求項４】
２種類の多孔質担体がカラムの下流側および上流側にそれぞれ５０％ずつ充填され、それらの多孔質担体が互いに混ざらないようにすることができるフィルターまたはメッシュのようなもので仕切られている、請求項１から３のいずれかに記載のカラム。
【請求項５】
１種類の多孔質担体がリガンドとして酵素を固定化した多孔質担体であり、もう１種類の多孔質担体がリガンドとして前述の酵素による分解物と親和性を持つ分子を固定化した多孔質担体である、請求項１から４のいずれかに記載のカラム。
【請求項６】
１種類の多孔質担体がリガンドとしてプラスミノーゲンを基質とする酵素を固定化した多孔質担体であり、もう１種類の多孔質担体がリガンドとして前述の酵素によるプラスミノーゲンの分解物と親和性を持つ分子を固定化した多孔質担体である、請求項１から５のいずれかに記載のカラム。
【請求項７】
１種類の多孔質担体がリガンドとしてプラスミノーゲンを基質とする酵素であるバシロライシンＭＡを固定化した多孔質担体であり、もう１種類の多孔質担体がリガンドとしてバシロライシンＭＡによるプラスミノーゲンの分解物と親和性を持つ分子であるリジンまたは／および６−アミノカプロン酸を固定化した多孔質担体である、請求項１から６のいずれかに記載のカラム。
【請求項８】
多孔質担体が水酸基を有する化合物からなる水不溶性多孔質担体である、請求項１から７のいずれかに記載のカラム。
【請求項９】
水不溶性多孔質担体がセルロース、アガロースなどの多糖類、ポリビニルアルコールなどの合成高分子などの群から選ばれるものである、請求項１から８のいずれかに記載のカラム。
【公開番号】特開２０１２−５０３８６（Ｐ２０１２−５０３８６Ａ）
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１９６１８１（Ｐ２０１０−１９６１８１）
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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