３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための改良法
【課題】３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための方法の提供。
【解決手段】ラセミ３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物の酵素を触媒とするエナンチオ選択的加水分解を含む、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法。
【解決手段】ラセミ３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物の酵素を触媒とするエナンチオ選択的加水分解を含む、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための方法に関する。特に、本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンまたはそのエナンチオマー（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを調製するための方法に関する。さらに、本発明は、上記化合物からのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
式（Ｉ）の既知化合物、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンは、強力なＰＮＰ阻害剤が含まれる特定の本出願人の阻害化合物を合成するための重要な中間化合物である（例えば、ＰＣＴ／ＮＺ０３／０００１８６を参照）。式（Ｉ）の化合物のエナンチオマーは、式（Ｉａ）の化合物であり、これも、ＰＮＰ阻害剤を合成するための中間体として有用である。
【化１】
【０００３】
ＭａｋｉｎｏおよびＩｃｈｉｋａｗａ（Ｋ．ＭａｋｉｎｏおよびＹ．Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８）３９、８２４５）は、化合物（Ｉ）の合成を報告している。化合物（Ｉ）の必要なキラリティーは、シャープレス不斉エポキシ化を用いて導入される。
【０００４】
ＫａｒｉｓｓｏｎおよびＨｏｇｂｅｒｇ（ＫａｒｉｓｓｏｎおよびＨｏｇｂｅｒｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００１）１２、１９７７）は、代替合成法について記載している。この方法において、キラリティーは、キラルなスルタム補助剤を用いて導入される。
【０００５】
Ｇａｌｅａｚｚｉ他（Ｒ．Ｇａｌｅａｚｚｉ、Ｇ．Ｍａｒｔｅｌｌｉ、Ｇ．Ｍｏｂｂｉｌｉ、Ｍ．ＯｒｅｎａおよびＳ．Ｒｉｎａｌｄｉ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００４）１５、３２４９）は、２−シリルオキシ−３−メトキシカルボニル−ブタ−３−エン酸エチルへの（Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの付加により化合物（Ｉ）を調製した。
【０００６】
Ｆｉｌｉｃｈｅｖ他（Ｖ．Ｖ．ＦｉｌｉｃｈｅｖおよびＥ．Ｂ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）５７、９１６３；Ｖ．Ｖ．Ｆｉｌｉｃｈｅｖ、Ｍ．ＢｒａｎｄｔおよびＥ．Ｂ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）３３３、１１５）は、キラルな出発材料を用いて化合物（Ｉ）を製造している。例えば、化合物（Ｉ）は、ジアセトン−Ｄ−グルコースまたはＤ−キシロースから調製することができる。しかしながら、両合成手順は、複雑であり、多くの反応ステップを必要とする。
【０００７】
キラリティーを導入するための代替法は、生物触媒を使用するものである。例えば、ＨａｎｓｅｎおよびＢｏｌｓ（Ｓ．Ｕ．ＨａｎｓｅｎおよびＭ．Ｂｏｌｓ、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ（１９９８）５２、１２１４）は、カンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）およびムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来の固定化リパーゼを用いるラセミのトランス−４−ヒドロキシメチルピロリジン−３−オールのＮ−Ｂｏｃ誘導体の酵素的分割を試みた。この方法は、酵素的手段によりジオールの分割を試みることに焦点を合わせている。しかしながら、この方法では不十分なエナンチオマー過剰率が得られ、ほんの少量の化合物（Ｉ）が他の化合物の調製における中間体として使用できるようになるという結果であった。低い生成物収率は、かなりの損耗量ひいては高い総費用を意味する。
【０００８】
公表されている化合物（Ｉ）の合成は、この価値ある中間化合物に対する商業的に実行可能な経路として不満足と見なされる。ほんのわずかな反応ステップを用い、許容可能な全生成物収率の改良法を開発することによりこの問題を克服する必要性が引き続き存在している。
【０００９】
Ｏ−アシル化による炭素環式のシスおよびトランス−β−ヒドロキシエステルのリパーゼを触媒とする分割は、高収率でエナンチオマー純度の高い化合物を提供できることが知られている（Ｌ．Ｍ．Ｌｅｖｙ、Ｊ．Ｒ．ＤｅｈｌｉおよびＶ．Ｇｏｔｏｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００３）１４、２０５３）。しかしながら、潜在的基質に対する酵素の反応性を予測することは極めて困難である。酵素の特異性は、当技術分野においてよく知られている。たとえ特定の化合物が酵素基質であることが分かっている場合でも、生成物の反応収率およびエナンチオマー純度に関してほとんど確実性がないことが多い。
【００１０】
本出願人は、リパーゼを触媒とするエステル化を介し、（±）−トランス−１−Ｎ−保護−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸アルキルエステルから高い収率および高いエナンチオマー過剰率で化合物（Ｉ）を調製することができることを明らかにしている（国際公開第２００５／０３３０７６号パンフレット）。しかしながら、その調製方法には、いくつかの重要な欠点がある。特に、この方法は、クロマトグラフ精製ステップを必要とする。そのようなステップは、費用のかかる処理ステップである。そのようなステップは、方法全体にかなりの費用を追加し、通常は、化合物の低収率をもたらす。これらの欠点は、この方法が大規模に行われる場合は特に明白である。したがって、特に、商業生産に必要とされるプロセスの規模のために、これらの欠点を回避する式（Ｉ）および（Ｉａ）の化合物を調製するための改良法が必要とされてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
今回、本出願人は、容易に入手できる出発材料を用い、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための改良法を開発した。この新たな経路は、アキラルな出発材料を用いる合成で遭遇することが多い問題点を克服する。この経路は、公表されている方法よりも少ない化学変換を含み、高い収率およびエナンチオマー過剰率での望ましい化合物の調製を可能にする。最も重要なことだが、この改良法は、あらゆるクロマトグラフ精製ステップの必要性を回避する。この驚くべき発見は、国際公開第２００５／０３３０７６号パンフレットに記載されている方法が含まれる既知の方法を上回る利点を提供し、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物、およびそれらから調製することができるＰＮＰ阻害剤などの他の化合物への著しく簡単かつ対費用効果の高い経路を可能にする。
【００１２】
したがって、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための改良法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様において、本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化２】
以下のステップ、すなわち
ステップ（ａ）：ラセミの式（ＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解であって、
【化３】
［ここで、Ｒ１は、ベンジルまたはベンズヒドリルであり、それらの各々は、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよく、Ｒ２は、アリールまたは直鎖もしくは分岐鎖のアルキルもしくはアラルキルであり、それらのいずれも、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよい］
混合物（ｉ）：式（ＩＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶ）の未反応ピロリジン化合物か、
【化４】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
混合物（ｉｉ）：式（ＩＩＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶａ）の未反応ピロリジン化合物のどちらかを得るための加水分解、
【化５】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
（ここで、酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素か、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素のどちらかを用いて行われる）
ステップ（ｂ）：混合物（ｉ）における式（ＩＶ）の化合物からの式（ＩＩＩ）の化合物の分離、または混合物（ｉｉ）における式（ＩＶａ）の化合物からの式（ＩＩＩａ）の化合物の分離、および
ステップ（ｃ）：式（ＩＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＶａ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換、または式（ＩＶ）の化合物もしくは式（ＩＩＩａ）の化合物の式（Ｉａ）の化合物への変換
を含む方法を提供する。
【００１４】
ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素を用いて行われることが好ましい。
【００１５】
ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解が、式（ＩＩＩ）と（ＩＶ）の化合物の混合物を生じさせる場合、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％であることが好ましく、少なくとも約９０％であることが最も好ましい。あるいは、ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解が、式（ＩＩＩａ）と（ＩＶａ）の化合物の混合物を生じさせる場合、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％であることが好ましく、少なくとも約９０％であることが最も好ましい。
【００１６】
さらに、ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解において使用される酵素は、リパーゼまたはエステラーゼであることが好ましい。一実施形態において、酵素は、リパーゼ、好ましくはカンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来である。別の実施形態において、酵素は、エステラーゼ、好ましくはブタ肝臓エステラーゼである。
【００１７】
式（ＩＩＩ）の化合物が、式（Ｉ）の化合物に変換される場合、変換は、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物を得るための式（ＩＩＩ）または式（ＩＩＩａ）の化合物の還元のステップを含む方法により行われることが好ましい。
【化６】
［ここで、Ｒ１は、上記で定義した通りである］
【００１８】
還元は、水素化リチウムアルミニウムまたはボランを用いて行われることが好ましく、ボランを用いて行われることが最も好ましい。
【００１９】
変換には、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の化合物のＲ１基を水素で置換し、式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物を得るステップをさらに含むことが好ましい。これは、水素化分解により行われることが好ましい。
【００２０】
また、ステップ（ｂ）における式（ＩＶ）の化合物からの式（ＩＩＩ）の化合物の分離は、第１の水不混和性溶媒を用い、式（ＩＶ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を含有する水溶液から式（ＩＶ）の化合物を抽出し、次いで、得られる混合物のｐＨを低下させて式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸体に変換し、次いで、得られる混合物を第２の水不混和性溶媒で再度抽出することにより行われることが好ましい。
【００２１】
水不混和性溶媒は、ジクロロメタンまたはクロロホルムであり、第２の水不混和性溶媒は、酢酸エチルであることが好ましい。
【００２２】
場合により、式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物を、式（ＶＩ）または式（ＶＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物に変換してもよい。
【化７】
［ここで、Ｒ４は、Ｎ保護基である］
【００２３】
Ｒ４は、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルまたはアラルコキシカルボニルであることが好ましい。Ｒ４は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、メトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルであることが最も好ましい。
【００２４】
Ｒ４が、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルまたはアラルコキシカルボニルである場合、式（Ｉ）の化合物は、トリエチルアミンまたは水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下または非存在下でのアルコキシカルボニル化剤、アリールオキシカルボニル化剤またはアラルコキシカルボニル化剤による式（Ｉ）の化合物の処理により式（ＶＩ）の化合物に変換されることが好ましい。
【００２５】
さらに、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（ＩＩ）の化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップを含む方法により調製されることが好ましい。
【化８】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
【００２６】
式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンと式（ＩＸ）のアルケンの１，３−環化付加により調製されることが最も好ましい。
【化９】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
【００２７】
１，３−環化付加は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンを生成させ、次いで、それを、式（ＩＸ）のアルケンとｉｎ ｓｉｔｕで反応させることにより行われることが好ましい。Ｒ１がベンジルの場合、式（ＶＩＩＩ）のニトロンは、Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミンとＨＣＨＯの反応により生成されることが好ましい。
【００２８】
Ｒ１は、ベンジルであることが好ましい。さらに、Ｒ２は、アルキルであることが好ましい。Ｒ２は、メチルまたはエチルであることが最も好ましい。
【００２９】
また、還元的切断およびｉｎ ｓｉｔｕ環化は、水素化分解によるか、あるいは酸の存在下でＺｎを用いることにより行われることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法には、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換するステップをさらに含むことが好ましい。
【化１０】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明の方法には、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換し、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップも含む。
【化１１】
【化１２】
【化１３】
［ここで、Ｒ５は、上記で定義した通りであり、
Ａは、Ｎ、ＣＨおよびＣＲ６から選択され、ここで、Ｒ６は、ハロゲン、ＯＨおよびＮＨ２から選択されるか、あるいは、Ｒ６は、アルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、それらの各々は、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいか、あるいは、Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＮＲ７Ｒ８およびＳＲ９から選択され、ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｂは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１０、ＳＨ、水素およびハロゲンから選択され、ここで、Ｒ１０は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１１、水素、ハロゲンおよびＳＣＨ３から選択され、ここで、Ｒ１１は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択される］
【００３２】
反応は、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド等価体を用いて行われることが好ましい。
【００３３】
代替実施形態において、式（ＸＩ）の化合物は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に変換され、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩＩＩ）の化合物と反応させると式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物が得られる。
【化１４】
［ここで、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは、それらの各々を上記で定義した通りであり、５員環内のＮＨは、適当な保護基で保護されていてもよい］
【００３４】
本発明の方法には、式（ＩＩ）の化合物を調製するステップをさらに含み、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換するステップをさらに含むことが好ましい。
【化１５】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【００３５】
この方法には、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップをさらに含む。
【化１６】
【化１７】
【化１８】
［ここで、Ｒ５、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは、上記で定義した通りである］
【００３６】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化１９】
（ｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物を得るための式（２）のニトロンと式（３）のアルケンの１，３−環化付加のステップ、
【化２０】
（ｉｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（５）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップ、
【化２１】
（ｉｉｉ）式（６）の化合物と式（５）の未反応化合物の混合物、または式（６ａ）の化合物と式（５ａ）の未反応化合物の混合物を得るための式（５）の化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解のステップ、
【化２２】
（ｉｖ）式（５）の化合物からの式（６）の化合物の分離、または式（５ａ）の化合物からの式（６ａ）の化合物の分離のステップ、
（ｖ）式（７）の化合物を得るための式（６）もしくは（５ａ）の化合物の還元、および式（７ａ）の化合物を得るための式（６ａ）もしくは（５）の化合物の還元のステップ、
【化２３】
（ｖｉ）式（Ｉ）の化合物を得るための式（７）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換、または式（Ｉａ）の化合物を得るための式（７ａ）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換のステップを含む方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態において、この方法は、
（ｖｉｉ）式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換であって、
【化２４】
二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルまたは二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルによる式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物の処理による変換のステップを含む。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物は、場合により単離されず、ステップ（ｖｉｉ）において、式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換は、ｉｎ ｓｉｔｕで行われる。
【００３９】
また、本発明は、本発明の方法により調製される（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、および本発明の方法により調製される（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明の方法により調製される式（ＸＩＩ）の化合物、および本発明の方法により調製される式（ＸＩＩａ）の化合物を提供する。
【００４１】
さらに、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。
【化２５】
［ここで、Ｒ１は、上記で定義した通りである］
【００４２】
また、本発明は、式（ＩＶ）の化合物を提供する。
【化２６】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、そのどちらも、特定の強力な酵素阻害剤の合成に有用である（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンならびにそのエナンチオマー（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンへの好都合な経路を提供する。
【００４４】
本発明の方法によれば、キラリティーは、生物触媒を用いて好都合に導入され、分割ステップにおいて一切のクロマトグラフ精製は必要とされない。有利には、この方法は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンの調製のための中間体である式（ＩＩＩ）の化合物への経路を提供する。また、この方法は、（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンの調製のための中間体である式（ＩＩＩａ）の化合物への経路を提供する。この方法の別の利点は、この方法が、式（ＩＶ）および（ＩＶａ）の化合物への経路を容易に提供することである。式（ＩＶ）および（ＩＶａ）の化合物は、他の応用例における使用を見出すことができる。
【００４５】
有利には、化合物（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は、優れたエナンチオ選択性とともに高収率で製造され、容易に分離される。
【００４６】
この方法の他の利点は、酵素の選択により、この方法が、式（ＩＩＩａ）の化合物から容易に分離し、望ましい化合物、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンに変換することができる化合物（ＩＶａ）への経路も提供できることである。
【００４７】
当業者には当然のことながら、本発明によれば、式（ＶＩＩ）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物および式（ＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物のラセミ混合物が得られる。有利には、容易に入手できる出発材料を用い、ほんの２ステップで、かつ高収率で式（ＩＩ）の化合物を初めに製造することができる。続く式（ＩＩ）の化合物のエナンチオ選択的加水分解は、純粋なエナンチオマー体、または少なくとも、一方のエナンチオマーに極めて富んだ混合物を提供する。
【００４８】
当業者には明らかであるが、基Ｒ１およびＲ２は、上記で定義されているように、それ自体が場合により置換されていてもよい。例えば、Ｒ２は、ハロゲンおよび直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルコキシから選択される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。同様に、Ｒ１は、ハロゲンまたは直鎖もしくは分岐鎖アルキルもしくはアルコキシ、例えば、ｐ−メトキシで置換されていてもよい。
【００４９】
当然のことながら、置換基ＢおよびＤを有する任意の化合物の表示は、Ｂおよび／またはＤがヒドロキシ基である場合、対応するアミドのエノール型互変異性体であり、大部分はアミド体で存在するはずである。エノール型互変異性表示の使用は、単に、より少ない構造式で本発明の化合物を表すためである。
【００５０】
同様に、当然のことながら、置換基ＢおよびＤを有する任意の化合物の表示は、Ｂおよび／またはＤがチオール基である場合、対応するチオアミドのエノール型互変異性体であり、大部分はチオアミド体で存在するはずである。チオエノール型互変異性表示の使用は、単に、より少ない構造式で本発明の化合物を表すためである。
【００５１】
式（ＶＩ）の化合物は、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルＮ−保護基を組み入れることが好ましいが、当業者には明らかであるが、他のＮ−保護基を用いることができる（例えば、ＴｈｅｏｄｏｒａＷ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｎｅｃｅ、第３版（１９９９年５月１５日）を参照）。他の適当な保護基には、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルまたはスルホニル誘導体が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用するように、「楔」記号を示す構造式、例えば、下式は、トランス異性体の純粋なエナンチオマー体を表すことを意図している。
【化２７】
【００５３】
同様に、「長方形」記号を示す構造式、例えば、下式は、トランス異性体のラセミ混合物を表すことを意図している。
【化２８】
【００５４】
化合物の合成
本発明の好ましい実施形態（スキーム１）において、化合物（＋）−８は、マレイン酸ジエチル３およびニトロン２から調製される。スキーム１に示す続く環化付加、還元的切断および転位ステップは、これまでシス−トランス混合物の分別結晶によってのみ得られていた（Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｔ．、Ｋｉｇａｗａ，Ｙ．、Ｉｈａｒａ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９７９、３１３−３１６）純粋なトランス−置換ピロリジノン（±）−５を効率的に提供する。
【００５５】
イソオキサゾリジンをもたらす２などのニトロンのアルケンとの１，３−環化付加反応は、当業者に知られている反応である。この環化付加は、イソオキサゾリジンのＣ−４およびＣ−５における相対的立体化学が、アルケン上の置換基の幾何学的関係によって常に制御されるように、特異的にシス形式で進行する。
【００５６】
最も一般的には水素化分解または亜鉛と酸によるイソオキサゾリジンのＮ−Ｏ結合の還元的切断は、βアミノアルコールを生じさせる。５−アルコキシカルボニルイソオキサゾリジンから誘導されるアミノアルコールは、Ｃ−４またはＣ−５（イソオキサゾリジンナンバリング）におけるエピマー化なしにピロリジノンへ容易に環化する。したがって、４，５−シス−二置換イソオキサゾリジンは、３，４−トランス−二置換ピロリジノンを生じる。
【００５７】
【化２９】
【００５８】
上記化学反応の生成物（±）−４および（±）−５は、ラセミ混合物である。エナンチオ選択的加水分解の使用は、純粋なエナンチオマー体、または少なくとも、一方のエナンチオマー［（＋）−６、（＋）−７、（＋）−１、（＋）−８］に極めて富んだ混合物を提供する。したがって、この方法は、医薬生成物の構築における使用に適している。
【００５９】
リパーゼは、エステルの立体選択的およびエナンチオ選択的加水分解によく使用される（Ｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００４、９４−１１９）。近年、酵母カンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のＢ−リパーゼ（ＣＡＬＢ）は、多くのエナンチオ選択的な反応を触媒する特に効率的かつ強力な酵素であることが明らかにされている（Ｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００４、９４−１１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｌａｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｋｉｒｋ，Ｏ．ＢｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、１９９７、１６、１８１−２０４）。
【００６０】
市販製品ノボザイム（登録商標）４３５などのＣＡＬＢの固定化形態は、強化された安定性を有し、反応生成物から容易に分離される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｌａｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｋｉｒｋ，Ｏ．ＢｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、１９９７、１６、１８１−２０４）。
【００６１】
本発明の方法は、ノボザイム（登録商標）４３５を用いてラセミエステル（±）−５を分割することが好ましい。エナンチオ選択的加水分解は、エステル（−）−５（ｅｅ＞９７％）と一緒に、良好な収率（ラセミ化合物に基づき３６〜４５％）および優れたエナンチオマー過剰率（９４〜９６％）で（＋）−（３Ｒ，４Ｓ）−酸６を生じさせる。
【００６２】
カルボン酸およびラクタム部分の還元は、最も一般的には、水素化リチウムアルミニウムか、ボランのどちらかを用いて行われる（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｇ．Ｍ．（ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．およびＦｌｅｍｉｎｇ，Ｉ編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１、８、２３７−２３８および２４９−２５１））。
【００６３】
本出願人は、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を用いる水素化ホウ素ナトリウムからのボランのｉｎｓｉｔｕ生成が、（＋）−６をＮ−ベンジルピロリジン（＋）−７へ還元し、次いで、水素化分解により（＋）−１へ変換するための好都合な方法であることを見出した。対応するＢｏｃ−カルバメート（＋）−８は、当業者に知られている様々な方法によって形成させることができる。本発明の好ましい実施形態において、メタノール中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルおよび水酸化ナトリウムまたはトリエチルアミンなどの塩基が、このステップで使用される。
【００６４】
有利には、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを合成するための新たな方法は、これまでに知られている方法よりも少ない化学変換を含む。望ましい化合物は、高収率で得られる。さらに、この方法は、より大量（例えば、数キログラム）が必要とされる場合に問題となるクロマトグラフ精製の使用を回避または低減し、薬学的使用のための大量な化合物の調製におけるスケールアップに極めて適した方法にしている。
【００６５】
本方法の他の利点は、Ｎ−ベンジルピロリジン（＋）−７を結晶化し、エナンチオマー過剰率をさらに改善できることである。さらに、化合物（＋）−１は、結晶性材料、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル誘導体（＋）−８へ容易に変換することができる。化合物（＋）−８は、極めて安定な中間体であり、簡単な酸処理により、もとの（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン（＋）−１へ好都合に変換される。
【００６６】
場合により、望ましい化合物のエナンチオマー純度を高めるために再結晶ステップを加えることができる。
【００６７】
ＰＮＰ阻害剤の調製における中間体として式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を使用するための方法は、国際公開第２００４／０１８４９６号パンフレット（ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００１８６）および国際公開第２００４／０６９８５６号パンフレット（ＰＣＴ／ＮＺ２００４／００００１７）に詳細に記載されている。
【００６８】
ヒドロラーゼのスクリーニング
以下に示すスクリーニング方法により、任意の酵素が本発明の酵素的分割ステップに有効であるか否かを判定することができる。したがって、当然のことながら、本発明は、記載されているか、あるいは特許請求の範囲に記載されているいかなる特異的酵素にも限定されるものではない。この方法により、ある群から任意の酵素を選択し、望ましい収率およびエナンチオマー過剰率についてその酵素をスクリーニングし、本発明の方法においてその酵素を使用するか、あるいは代わりの酵素を選択することができる。
【００６９】
【化３０】
【００７０】
合計２２種のリパーゼ、エステラーゼ、およびプロテアーゼ（表１）を、それらのスキーム１に示す加水分解を触媒する能力について試験した。各酵素（５〜５０ｍｇ、表１）を、ラセミエステル（±）−５（５０ｍｇ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、０．１ｍＬ）、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５、０．１ｍＬ）、水（１ｍＬ）およびフェノールレッド指示薬と一緒に撹拌した。加水分解が進行したら、生成物の酸（６）を、フェノールレッド終点まで水酸化ナトリウム（０．１Ｍ）により滴定した。したがって、水酸化ナトリウムの消費は、反応の程度の尺度である。酵素のうち１５種類は、２４時間で１０％の変換を行えなかったため放棄した。５０％の変換に到達したか［ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）、サブチリシン、ノボザイム４３５］、それ以上の変換が観察されないか［パンクレアチン、シュードモナス属リポタンパク質リパーゼ、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ）リポタンパク質リパーゼ、リポザイム］のどちらかの場合、残りの７つの反応物に抽出処理を行った。エステル５および酸６の両方を含有する抽出物を、トリメチルシリルジアゾメタンで処理し、酸を、対応するメチルエステルに変換した。次いで、５および６のエナンチオマー純度を、ＨＰＬＣ（ＣｈｉｒａｃｅｌＯＤ−Ｈ）により決定した。ブタ肝臓エステラーゼ、ノボザイム４３５およびパンクレアチンは、中程度から高いエナンチオマー過剰率で５および６を与えたが（表１）、パンクレアチンは、高い酵素負荷で極めてゆっくりと反応したに過ぎなかった。したがって、これらの酵素のうち最初の２種を、さらなる試験のために選択した。それらは各々、エステル５の異なるエナンチオマーを優先的に加水分解する。ノボザイム４３５は、（＋）酸６および（−）エステル５を生じさせるが、ＰＬＥは、（−）６および（＋）５を生じさせる。
【００７１】
【表１】
【００７２】
ＰＬＥは、いくつかの共溶媒の存在下で５の加水分解を触媒した。回収されたエステルおよび酸のエナンチオマー過剰率は、共溶媒とほとんど無関係であった（表２）。加水分解反応を７０％完了まで進行させた場合、未反応エステル（＋）−５は、優れたエナンチオマー過剰率で得られたが（表３）、同時に、収率は低下した。
【００７３】
【表２】
【００７４】
【表３】
【００７５】
ノボザイム４３５は、共溶媒なしに、およびアセトン存在下の両方で、（±）−５を、各々良好なｅ．ｅ．（約９５％）で酸（＋）−６およびエステル（−）−５に分割した。エステル５は、中程度の収率で、ボラン−ジメチルスルフィド錯体によりＮ−ベンジルピロリジン７に還元された。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。当然のことながら、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００７７】
（実施例１）
（±）−２−Ｎ−ベンジル−イソオキサゾリジン−４，５−シス−ジカルボン酸ジエチルエステル［（±）−４］）
Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（１４４．８ｇ、０．９１ｍｏｌ）および無水酢酸ナトリウム（８２ｇ、１ｍｏｌ）を、周囲温度にて３０分間、エタノール（８００ｍＬ）中で一緒に撹拌した後、３７％ホルムアルデヒド水溶液（１３４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を加え、撹拌を１時間続けた。マレイン酸ジエチル３（１３４ｍＬ、０．８３ｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌し、続いて２時間還流下で加熱した。冷却後、混合物を濾過し、濾液を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（１．５Ｌ）に取り、飽和重炭酸ナトリウムで３回（各２００ｍＬ）洗浄した。有機層を取り出して乾燥し（ＭｇＳＯ４）、溶媒を蒸発させると、黄色の油状物として粗生成物（±）−４（２５０．３ｇ、マレイン酸ジエチルの量に基づいて９８％）が得られた。少量を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、２：８ｖ／ｖ）により精製した。分析データは以下の通りである。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：７．４０〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、４．７６（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．２９〜４．０８（ｍ，５Ｈ）、４．０２（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７７（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、３．６０〜３．００（ｂｒ．ｍ，２Ｈ）、１．２８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：１６９．７（ｓ）、１６９．１（ｓ）、１３６．４（ｓ）、１２９．０（ｄ）、１２８．４（ｄ）、１２７．６（ｄ）、７７．０（ｄ）、６２．５（ｔ）、６１．４（ｔ）、６１．３（ｔ）、５６．８（ｂｒ．ｔ）、５０．４（ｂｒ．ｄ）、１４．０（ｑ）。ＥＩＭＳ（＋ｖｅ）：ｍ／ｚＣ１６Ｈ２１ＮＯ５（Ｍ）＋の計算値：３０７．１４１９７；実測値：３０７．１４１８４
【００７８】
（実施例２）
（±）−トランス−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−２−ピロリジノン−４−カルボン酸エチルエステル［（±）−５）］
粗製の２−Ｎ−ベンジル−イソオキサゾリジン−４，５−シス−ジカルボン酸ジエチルエステル（±）−４（２５０．３ｇ、０．８１ｍｏｌ）の酢酸（２Ｌ）溶液に、粉末亜鉛（１０６ｇ、１．６２ｍｏｌ）を一度に加えた。氷水浴を数分間用い、極めて緩やかな放熱を制御した。混合物を１５分間撹拌し、次いで、セライトに通して濾過した。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン（１．５Ｌ）に取り、脱ガスがもはや観察されなくなるまで重炭酸ナトリウムの飽和溶液３００ｍＬで洗浄した。有機層を取り出して乾燥し（ＭｇＳＯ４）、溶媒を蒸発させると、淡褐色の油状物として粗生成物（±）−５（１９３．６ｇ、９１％）が得られた。少量を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン、１：１ｖ／ｖ）により精製した。分析データは以下の通りである。融点６５〜６６℃（酢酸エチル−ヘキサン）、文献値６２〜６３．５℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：７．３８〜７．１９（ｍ，５Ｈ）、４．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３，３．４Ｈｚ，Ｄ２Ｏ交換でｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚとなった）、４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｄ２Ｏ交換で消失）、４．５３（ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ，ＡＢシステムのＡ）、４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，ＡＢシステムのＢ）、４．１９（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、３．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、３．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、３．１４（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、１．２６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：１７２．９（ｓ）、１７１．４（ｓ）、１３５．１（ｓ）、１２８．９（ｄ）、１２８．２（ｄ）、１２８．０（ｄ）、７２．３（ｄ）、６１．５（ｔ）、４７．０（ｔ）、４６．１（ｄ）、４５．１（ｔ）、１４．１（ｑ）。ＥＩＭＳ：ｍ／ｚＣ１４Ｈ１７ＮＯ４（Ｍ）＋の計算値：２６３．１１５７６。実測値：２６３．１１５３８。
【００７９】
（実施例３）
（３Ｒ，４Ｓ）−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−２−ピロリジノン−４−カルボン酸［（±）−６］および（３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−２−ピロリジノン−４−カルボン酸エチルエステル［（−）−５］
リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１０Ｌ）中の粗製エステル（±）−５（１９１．８ｇ、０．７２ｍｏｌ）の懸濁液を、２５℃にて５時間、ノボザイム（登録商標）４３５（２０．０ｇ）上で撹拌した。酵素を濾過により除去し、濾液を塩化ナトリウムで飽和させた。未反応エステル（−）−５は、クロロホルム（３×５Ｌ）による抽出により除去した。次いで、水性混合物をＨＣｌ（６Ｎ）でｐＨ１とし、クロロホルム（９×５Ｌ）でさらに抽出した。次いで、水相を半分の容量のＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮すると、淡褐色の固体として粗製の表題化合物（＋）−６（６６．７ｇ、３９％）が得られた。小バッチ（３．９５ｍｍｏｌ）のクロマトグラフにより精製した（±）−５の酵素的加水分解から得られる（＋）−６（収率：１．７８ｍｍｏｌ、４４％）および（−）−５（収率：１．８５ｍｍｏｌ、４６％）についての分析データは以下の通りである。
【００８０】
（＋）−６の分析データ：融点（酢酸エチル）１４４〜１４６℃。［α］２０Ｄ＋６２．３（ｃ＝１，ＥｔＯＨ）。エナンチオマーの過剰（ＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ−Ｈ上のメチルエステルのＨＰＬＣ）９４．８％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：７．３７〜７．２１（５Ｈ，ｂｍ）、４．７６（４Ｈ，ｂｓ，２×ＯＨ，Ｈ２Ｏ）４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、４．４６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１０．３）、３．４４（２Ｈ，ｍ）、３．１９（１Ｈ，ｍ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ｐｐｍ：１７４．７、１７３．８、１３５．１、１２９．３、１２８．６、１２８．５、７２．６、４７．６、４６．１、４５．５。元素分析：実測値，Ｃ ６１．３６，Ｈ ５．５６，Ｎ ５．９２．Ｃ１２Ｈ１３ＮＯ４計算値Ｃ ６１．２７，Ｈ ５．５７，Ｎ ５．９５。
【００８１】
（−）−５の分析データ：［α］２０Ｄ−４６．８（ｃ＝１．１、ＥｔＯＨ）。エナンチオマー過剰率（ＣｈｉｒａｃｅｌＯＤ−Ｈ上のＨＰＬＣ）９７．７％。
【００８２】
（実施例４）
（３Ｒ，４Ｒ）−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン［（＋）−７］
ＢＦ３ＯＥｔ２（１７０ｍＬ、１３８２ｍｍｏｌ）を、０℃にて、ＴＨＦ（１Ｌ）中の酸（＋）−６（６２ｇ、２６４ｍｍｏｌ）およびＮａＢＨ４（４０ｇ、１０５７ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴加した。混合物を７２時間放置した。次いで、反応を、氷冷下、ＭｅＯＨ（５００ｍＬ）でクエンチし（脱ガス）、溶媒を蒸発させた。次いで、残渣を６ＮＨＣｌ水性液（１Ｌ）で１０分間処理し、続いて蒸発させた。ｐＨ１２〜１４までＮａＯＨ（１５％水溶液、２５０ｍＬ）を加えた。得られた溶液を真空下で濃縮して固体とし、次いで、これをクロロホルム（１Ｌ）に懸濁した。セライトに通す濾過後、濾液を蒸発乾固させると油状物が得られ、これをトルエンからゆっくりと結晶化させた。真空下でさらに乾燥すると、白色の結晶性固体として化合物（＋）−７（５４ｇ、２６１ｍｍｏｌ、収率９９％）が得られた。［α］２０Ｄ＋３７．３（ｃ＝１、ＭｅＯＨ）、融点５４〜５６℃。
【００８３】
（実施例５）
（３Ｒ，４Ｒ）−１−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン［（＋）−８］
前ステップからの粗製（＋）−７（６０ｇ）をメタノール（８００ｍＬ）に取り、１０％Ｐｄ／Ｃ（１２ｇ、湿ったＤｅｇｕｓｓａタイプ）を加え、混合物を水素の雰囲気中で１２時間撹拌すると、粗製の（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン（＋）−１が得られた。触媒を濾過により除去し、メタノール溶液にトリエチルアミン（３０ｍＬ、２１６ｍｍｏｌ）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４７．５ｇ、２１８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温にて１時間撹拌した（わずかな放熱）。次いで、混合物を、シリカゲルに前吸収させ、乾式フラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、５：２：１ｖ／ｖ／ｖ）によりクロマトグラフを行うと、淡いオレンジ色のシロップとして（＋）−８（２５．４ｇ、（＋）−６から５９％）が得られた。最終生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル、１：４）により除去できる可能性のあるトリエチルアンモニウム塩約１５％（ｗ／ｗ）を含有していた。完全に精製された（＋）−８についてのデータは以下の通りである：［α］２０Ｄ＋１５．４（ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ ｐｐｍ：４．１４（ｍ、１Ｈ）、３．５８〜３．４５（ｍ、４Ｈ）、３．２４〜３．１８（ｍ、２Ｈ）、２．２４（ｍ、１Ｈ）、１．４６（ｓ、９Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ ｐｐｍ（一部のピークは、回転異性体の遅い相互変換のため２本になっている）：１５６．９９、８１．３１、（７３．１０、７２．４０）、６３．０６、（５４．４５、５４．０３）、（５０．４２、４９．７５）、（４８．４７、４８．０３）、２９．１８。
【００８４】
（実施例６）
（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（メチルチオメチル）−ピロリジン
【化３１】
保護アミン（７．７５ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）およびジブチルスズオキシド（１０．６６ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に懸濁し、ディーンスターク条件下で加熱還流した。反応物は、約１００℃で均一になった。溶液をさらに１．５時間還流下で加熱し、−１０℃まで冷却し、次いで、塩化メタンスルホニル（３．３４ｍＬ、４２．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてモニターした。１時間後、反応が不完全に見えたので、撹拌しながら室温まで温め、一夜放置すると、反応は完了したように見えた。ジクロロメタン中の５％ｖ／ｖＭｅＯＨで溶出されるシリカゲルのカラム上に直接ロードされた溶液のカラムクロマトグラフィーにより、無色の油状物としてメシレート（１０．０ｇ、３３．９ｍｍｏｌ、収率９５％）が得られた。
【００８５】
【化３２】
【００８６】
メシレート（１０ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶かし、ナトリウムチオメトキシド（４．７５ｇ、６７．７ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。溶液を一夜撹拌し、トルエンで希釈し、水および食塩水で洗浄し、乾燥して（ＭｇＳＯ４）真空中で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液ジクロロメタン中の５％ｖ／ｖＭｅＯＨ）により、黄色の油状物としてＮ−保護３−ヒドロキシ−４−（メチルチオメチル）−ピロリジン（８．２ｇ、３３．２ｍｍｏｌ、収率９８％）が得られた。
【００８７】
【化３３】
【００８８】
Ｎ−保護３−ヒドロキシ−４−（メチルチオメチル）−ピロリジン（８．２ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ、３３．２ｍｍｏｌ）に溶かし、これに塩酸（１０ｍＬ、３２６ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を真空中で濃縮した。このステップを繰り返すと、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ−ジクロロメタン中の１０％ｖ／ｖ７Ｎ ＮＨ３）は、完全な脱保護を示した。ＭｅＯＨ−ジクロロメタン中の１０〜２０％ ７Ｎ ＮＨ３で溶出されるシリカ上のカラムクロマトグラフィーにより、表題化合物（４．３ｇ、２９．２ｍｍｏｌ、収率８８％）が得られた。
【００８９】
（実施例７）
ヒドロラーゼのスクリーニング
ラセミエステル（±）−５（５０±５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、試験管中でＭＴＢＥ（０．１ｍＬ）と一緒に撹拌し、次いで、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、０．１Ｍ ＮａＣｌで、ｐＨ７．５、０．１ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）およびフェノールレッド溶液（０．１％水溶液、０．０１ｍＬ）を加えた。酵素調製物（５〜５０ｍｇ）を加えて反応を開始させ、指示薬をピンクがかった赤色に維持するため必要に応じてＮａＯＨ（０．１Ｍ）を注射器から加えた。１．０±０．１ｍＬのＮａＯＨ溶液（約５０％の加水分解を示す）が消費された場合（または２３時間後か、あるいは反応が停止したように見えた場合）、ｐＨ１までＨＣｌ（１Ｍ）を添加することにより反応を停止させ、酵素調製物を濾過または遠心分離により除去した。濾液または上清をＮａＣｌ（約７５０ｍｇ）で飽和させ、ＥｔＯＡｃ（３×１ｍＬ）で抽出した。乾燥した（ＭｇＳＯ４）抽出液を減圧下で濃縮し、乾燥メタノール（２ｍＬ）に取った。この溶液を、氷水浴中、アルゴン下で冷却し、試薬の黄色が残存するまでトリメチルシリルジアゾメタン（２．０Ｍヘキサン溶液）を加えた。溶液を室温にて５分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。得られたエチルエステルとメチルエステルの混合物を、ヘキサン−イソプロパノールで溶出されるＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ−Ｈカラムを用いるＨＰＬＣにより分析した。
【００９０】
（実施例８）
ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）による加水分解
方法（ａ）。−エステル（±）−５（０．５ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）のトルエン（０．２ｍＬ）溶液を、リン酸塩緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ７．５、２．０ｍＬ）およびＰＬＥ（５ｍｇ）と一緒に５４時間撹拌した。反応混合物をアセトンで希釈し、Ｗｈａｔｍａｎ５０濾紙上でセライトのパッドに通して濾過した。濾液を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた抽出液を乾燥して（ＭｇＳＯ４）減圧下で濃縮すると、（＋）−５（０．２５ｇ、５０％、８４％ｅ．ｅ．）が得られた。
【００９１】
方法（ｂ）。−ラセミエステル（±）−５（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．１ｍＬ）溶液を、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、０．１ＭＮａＣｌで、ｐＨ７．５、０．１ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）、フェノールレッド溶液（０．１％水溶液、０．０１ｍＬ）およびＰＬＥ（４．６ｍｇ）と一緒に撹拌した。指示薬をピンクがかった赤色に維持するため必要に応じてＮａＯＨ（０．１Ｍ）を注射器から加えた。１．４ｍＬのＮａＯＨ溶液が消費された場合（約７０％の変換を示す）、反応混合物をアセトンで希釈し、Ｗｈａｔｍａｎ５０濾紙上でセライトのパッドに通して濾過した。濾液を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた抽出液を乾燥して（ＭｇＳＯ４）減圧下で濃縮すると、（＋）−５（１０ｍｇ、９３％ｅ．ｅ．）が得られた。
【００９２】
（実施例９）
共溶媒としてアセトンを用いるノボザイム４３５による加水分解
粗製エステル（±）−５（３１９ｇ、１．２１ｍｏｌ）をアセトン（３２０ｍＬ）に溶かし、この溶液に、Ｋ２ＨＰＯ４緩衝液（３．２Ｌ、０．５Ｍ、ｐＨメーターを用い、０．５ＭＫＨ２ＰＯ４でｐＨを７．５に調整する）を加えた。ノボザイム（登録商標）４３５（３０．０ｇ）を加え、得られた懸濁液を２７℃にて６時間撹拌した。次いで、酵素をセライトに通す濾過により除去し、残渣をＫ２ＨＰＯ４緩衝液（３００ｍＬ）で洗浄した。濾液をＮａＣｌ（約７５０ｇ）で飽和させ、未反応エステル（−）−５をクロロホルム（３×４００ｍＬ）による抽出により除去した。次いで、水性混合物をｃＨＣｌ（１５０ｍＬ；１２Ｎ）でｐＨ１とし、ＮａＣｌ（１００ｇ）で再飽和させ、酢酸エチル（６×４００ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮すると、灰色がかった白色の固体として粗製の表題化合物（＋）−６が得られ、それを酢酸エチルから結晶化すると、白色の固体として（＋）−６（１０６ｇ、７２％）が得られた。融点１４４〜１４６℃。［α］２０Ｄ＋６２．３（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）。
【００９３】
（実施例１０）
エステル５の還元による１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン
エステル５（３．１ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液を氷水浴中で冷却し、次いで、注射器を介してボラン−ジメチルスルフィド錯体（６．０ｍＬ、５８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温まで温め、次いで、２時間還流下で加熱した。反応物を冷却し、メタノールを少しずつ加えることによりクエンチし、シリカゲル（約１５ｍＬ）で減圧下で濃縮した。シリカを、酢酸エチルで溶出される短いシリカゲルカラムの上部に入れた。生成物を含有する溶離液分画を減圧下で濃縮し、残渣を、ＴＦＡ−水（１：１、３０ｍＬ）中で一夜撹拌した。溶媒の蒸発およびイオン交換カラムクロマトグラフィー（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲＡ−９００、Ｃｌ−型、メタノール−水、１：１ｖ／ｖで溶出）通過により、油状物が得られ、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフにさらにかけると（溶出液としてジクロロメタン−メタノール６：１〜４：１）、表題化合物（１．５０ｇ、７．２ｍｍｏｌ、５８％）が得られた。
【００９４】
本発明を一例として説明してきたが、当然のことながら、本発明の範囲を逸脱することなく変更または改変を行うことができる。さらに、具体的特徴に対して既知の等価体が存在する場合、そのような等価体は、あたかも本明細書において具体的に言及されるかのように組み込まれるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンおよびそのエナンチオマー（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを調製するための改良法を提供し、そのどちらも、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの阻害剤の調製において価値ある中間化合物である。そのような阻害剤は、様々な疾患、特に癌を治療する可能性のある治療薬である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための方法に関する。特に、本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンまたはそのエナンチオマー（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを調製するための方法に関する。さらに、本発明は、上記化合物からのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）阻害剤の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
式（Ｉ）の既知化合物、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンは、強力なＰＮＰ阻害剤が含まれる特定の本出願人の阻害化合物を合成するための重要な中間化合物である（例えば、ＰＣＴ／ＮＺ０３／０００１８６を参照）。式（Ｉ）の化合物のエナンチオマーは、式（Ｉａ）の化合物であり、これも、ＰＮＰ阻害剤を合成するための中間体として有用である。
【化１】
【０００３】
ＭａｋｉｎｏおよびＩｃｈｉｋａｗａ（Ｋ．ＭａｋｉｎｏおよびＹ．Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８）３９、８２４５）は、化合物（Ｉ）の合成を報告している。化合物（Ｉ）の必要なキラリティーは、シャープレス不斉エポキシ化を用いて導入される。
【０００４】
ＫａｒｉｓｓｏｎおよびＨｏｇｂｅｒｇ（ＫａｒｉｓｓｏｎおよびＨｏｇｂｅｒｇ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００１）１２、１９７７）は、代替合成法について記載している。この方法において、キラリティーは、キラルなスルタム補助剤を用いて導入される。
【０００５】
Ｇａｌｅａｚｚｉ他（Ｒ．Ｇａｌｅａｚｚｉ、Ｇ．Ｍａｒｔｅｌｌｉ、Ｇ．Ｍｏｂｂｉｌｉ、Ｍ．ＯｒｅｎａおよびＳ．Ｒｉｎａｌｄｉ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００４）１５、３２４９）は、２−シリルオキシ−３−メトキシカルボニル−ブタ−３−エン酸エチルへの（Ｓ）−１−フェニルエチルアミンの付加により化合物（Ｉ）を調製した。
【０００６】
Ｆｉｌｉｃｈｅｖ他（Ｖ．Ｖ．ＦｉｌｉｃｈｅｖおよびＥ．Ｂ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）５７、９１６３；Ｖ．Ｖ．Ｆｉｌｉｃｈｅｖ、Ｍ．ＢｒａｎｄｔおよびＥ．Ｂ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）３３３、１１５）は、キラルな出発材料を用いて化合物（Ｉ）を製造している。例えば、化合物（Ｉ）は、ジアセトン−Ｄ−グルコースまたはＤ−キシロースから調製することができる。しかしながら、両合成手順は、複雑であり、多くの反応ステップを必要とする。
【０００７】
キラリティーを導入するための代替法は、生物触媒を使用するものである。例えば、ＨａｎｓｅｎおよびＢｏｌｓ（Ｓ．Ｕ．ＨａｎｓｅｎおよびＭ．Ｂｏｌｓ、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ（１９９８）５２、１２１４）は、カンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）およびムコールミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来の固定化リパーゼを用いるラセミのトランス−４−ヒドロキシメチルピロリジン−３−オールのＮ−Ｂｏｃ誘導体の酵素的分割を試みた。この方法は、酵素的手段によりジオールの分割を試みることに焦点を合わせている。しかしながら、この方法では不十分なエナンチオマー過剰率が得られ、ほんの少量の化合物（Ｉ）が他の化合物の調製における中間体として使用できるようになるという結果であった。低い生成物収率は、かなりの損耗量ひいては高い総費用を意味する。
【０００８】
公表されている化合物（Ｉ）の合成は、この価値ある中間化合物に対する商業的に実行可能な経路として不満足と見なされる。ほんのわずかな反応ステップを用い、許容可能な全生成物収率の改良法を開発することによりこの問題を克服する必要性が引き続き存在している。
【０００９】
Ｏ−アシル化による炭素環式のシスおよびトランス−β−ヒドロキシエステルのリパーゼを触媒とする分割は、高収率でエナンチオマー純度の高い化合物を提供できることが知られている（Ｌ．Ｍ．Ｌｅｖｙ、Ｊ．Ｒ．ＤｅｈｌｉおよびＶ．Ｇｏｔｏｒ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（２００３）１４、２０５３）。しかしながら、潜在的基質に対する酵素の反応性を予測することは極めて困難である。酵素の特異性は、当技術分野においてよく知られている。たとえ特定の化合物が酵素基質であることが分かっている場合でも、生成物の反応収率およびエナンチオマー純度に関してほとんど確実性がないことが多い。
【００１０】
本出願人は、リパーゼを触媒とするエステル化を介し、（±）−トランス−１−Ｎ−保護−４−ヒドロキシピロリジン−３−カルボン酸アルキルエステルから高い収率および高いエナンチオマー過剰率で化合物（Ｉ）を調製することができることを明らかにしている（国際公開第２００５／０３３０７６号パンフレット）。しかしながら、その調製方法には、いくつかの重要な欠点がある。特に、この方法は、クロマトグラフ精製ステップを必要とする。そのようなステップは、費用のかかる処理ステップである。そのようなステップは、方法全体にかなりの費用を追加し、通常は、化合物の低収率をもたらす。これらの欠点は、この方法が大規模に行われる場合は特に明白である。したがって、特に、商業生産に必要とされるプロセスの規模のために、これらの欠点を回避する式（Ｉ）および（Ｉａ）の化合物を調製するための改良法が必要とされてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
今回、本出願人は、容易に入手できる出発材料を用い、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための改良法を開発した。この新たな経路は、アキラルな出発材料を用いる合成で遭遇することが多い問題点を克服する。この経路は、公表されている方法よりも少ない化学変換を含み、高い収率およびエナンチオマー過剰率での望ましい化合物の調製を可能にする。最も重要なことだが、この改良法は、あらゆるクロマトグラフ精製ステップの必要性を回避する。この驚くべき発見は、国際公開第２００５／０３３０７６号パンフレットに記載されている方法が含まれる既知の方法を上回る利点を提供し、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物、およびそれらから調製することができるＰＮＰ阻害剤などの他の化合物への著しく簡単かつ対費用効果の高い経路を可能にする。
【００１２】
したがって、３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン化合物を調製するための改良法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様において、本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化２】
以下のステップ、すなわち
ステップ（ａ）：ラセミの式（ＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解であって、
【化３】
［ここで、Ｒ１は、ベンジルまたはベンズヒドリルであり、それらの各々は、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよく、Ｒ２は、アリールまたは直鎖もしくは分岐鎖のアルキルもしくはアラルキルであり、それらのいずれも、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよい］
混合物（ｉ）：式（ＩＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶ）の未反応ピロリジン化合物か、
【化４】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
混合物（ｉｉ）：式（ＩＩＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶａ）の未反応ピロリジン化合物のどちらかを得るための加水分解、
【化５】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
（ここで、酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素か、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素のどちらかを用いて行われる）
ステップ（ｂ）：混合物（ｉ）における式（ＩＶ）の化合物からの式（ＩＩＩ）の化合物の分離、または混合物（ｉｉ）における式（ＩＶａ）の化合物からの式（ＩＩＩａ）の化合物の分離、および
ステップ（ｃ）：式（ＩＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＶａ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換、または式（ＩＶ）の化合物もしくは式（ＩＩＩａ）の化合物の式（Ｉａ）の化合物への変換
を含む方法を提供する。
【００１４】
ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素を用いて行われることが好ましい。
【００１５】
ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解が、式（ＩＩＩ）と（ＩＶ）の化合物の混合物を生じさせる場合、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％であることが好ましく、少なくとも約９０％であることが最も好ましい。あるいは、ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解が、式（ＩＩＩａ）と（ＩＶａ）の化合物の混合物を生じさせる場合、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％であることが好ましく、少なくとも約９０％であることが最も好ましい。
【００１６】
さらに、ステップ（ａ）における酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解において使用される酵素は、リパーゼまたはエステラーゼであることが好ましい。一実施形態において、酵素は、リパーゼ、好ましくはカンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来である。別の実施形態において、酵素は、エステラーゼ、好ましくはブタ肝臓エステラーゼである。
【００１７】
式（ＩＩＩ）の化合物が、式（Ｉ）の化合物に変換される場合、変換は、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物を得るための式（ＩＩＩ）または式（ＩＩＩａ）の化合物の還元のステップを含む方法により行われることが好ましい。
【化６】
［ここで、Ｒ１は、上記で定義した通りである］
【００１８】
還元は、水素化リチウムアルミニウムまたはボランを用いて行われることが好ましく、ボランを用いて行われることが最も好ましい。
【００１９】
変換には、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の化合物のＲ１基を水素で置換し、式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物を得るステップをさらに含むことが好ましい。これは、水素化分解により行われることが好ましい。
【００２０】
また、ステップ（ｂ）における式（ＩＶ）の化合物からの式（ＩＩＩ）の化合物の分離は、第１の水不混和性溶媒を用い、式（ＩＶ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を含有する水溶液から式（ＩＶ）の化合物を抽出し、次いで、得られる混合物のｐＨを低下させて式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸体に変換し、次いで、得られる混合物を第２の水不混和性溶媒で再度抽出することにより行われることが好ましい。
【００２１】
水不混和性溶媒は、ジクロロメタンまたはクロロホルムであり、第２の水不混和性溶媒は、酢酸エチルであることが好ましい。
【００２２】
場合により、式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物を、式（ＶＩ）または式（ＶＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物に変換してもよい。
【化７】
［ここで、Ｒ４は、Ｎ保護基である］
【００２３】
Ｒ４は、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルまたはアラルコキシカルボニルであることが好ましい。Ｒ４は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、メトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルであることが最も好ましい。
【００２４】
Ｒ４が、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルまたはアラルコキシカルボニルである場合、式（Ｉ）の化合物は、トリエチルアミンまたは水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下または非存在下でのアルコキシカルボニル化剤、アリールオキシカルボニル化剤またはアラルコキシカルボニル化剤による式（Ｉ）の化合物の処理により式（ＶＩ）の化合物に変換されることが好ましい。
【００２５】
さらに、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（ＩＩ）の化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップを含む方法により調製されることが好ましい。
【化８】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
【００２６】
式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンと式（ＩＸ）のアルケンの１，３−環化付加により調製されることが最も好ましい。
【化９】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
【００２７】
１，３−環化付加は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンを生成させ、次いで、それを、式（ＩＸ）のアルケンとｉｎ ｓｉｔｕで反応させることにより行われることが好ましい。Ｒ１がベンジルの場合、式（ＶＩＩＩ）のニトロンは、Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミンとＨＣＨＯの反応により生成されることが好ましい。
【００２８】
Ｒ１は、ベンジルであることが好ましい。さらに、Ｒ２は、アルキルであることが好ましい。Ｒ２は、メチルまたはエチルであることが最も好ましい。
【００２９】
また、還元的切断およびｉｎ ｓｉｔｕ環化は、水素化分解によるか、あるいは酸の存在下でＺｎを用いることにより行われることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法には、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換するステップをさらに含むことが好ましい。
【化１０】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【００３１】
好ましい実施形態において、本発明の方法には、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換し、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップも含む。
【化１１】
【化１２】
【化１３】
［ここで、Ｒ５は、上記で定義した通りであり、
Ａは、Ｎ、ＣＨおよびＣＲ６から選択され、ここで、Ｒ６は、ハロゲン、ＯＨおよびＮＨ２から選択されるか、あるいは、Ｒ６は、アルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、それらの各々は、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいか、あるいは、Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＮＲ７Ｒ８およびＳＲ９から選択され、ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｂは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１０、ＳＨ、水素およびハロゲンから選択され、ここで、Ｒ１０は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１１、水素、ハロゲンおよびＳＣＨ３から選択され、ここで、Ｒ１１は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択される］
【００３２】
反応は、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド等価体を用いて行われることが好ましい。
【００３３】
代替実施形態において、式（ＸＩ）の化合物は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に変換され、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩＩＩ）の化合物と反応させると式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物が得られる。
【化１４】
［ここで、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは、それらの各々を上記で定義した通りであり、５員環内のＮＨは、適当な保護基で保護されていてもよい］
【００３４】
本発明の方法には、式（ＩＩ）の化合物を調製するステップをさらに含み、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換するステップをさらに含むことが好ましい。
【化１５】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【００３５】
この方法には、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップをさらに含む。
【化１６】
【化１７】
【化１８】
［ここで、Ｒ５、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは、上記で定義した通りである］
【００３６】
１つの好ましい実施形態において、本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化１９】
（ｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物を得るための式（２）のニトロンと式（３）のアルケンの１，３−環化付加のステップ、
【化２０】
（ｉｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（５）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップ、
【化２１】
（ｉｉｉ）式（６）の化合物と式（５）の未反応化合物の混合物、または式（６ａ）の化合物と式（５ａ）の未反応化合物の混合物を得るための式（５）の化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解のステップ、
【化２２】
（ｉｖ）式（５）の化合物からの式（６）の化合物の分離、または式（５ａ）の化合物からの式（６ａ）の化合物の分離のステップ、
（ｖ）式（７）の化合物を得るための式（６）もしくは（５ａ）の化合物の還元、および式（７ａ）の化合物を得るための式（６ａ）もしくは（５）の化合物の還元のステップ、
【化２３】
（ｖｉ）式（Ｉ）の化合物を得るための式（７）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換、または式（Ｉａ）の化合物を得るための式（７ａ）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換のステップを含む方法を提供する。
【００３７】
別の実施形態において、この方法は、
（ｖｉｉ）式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換であって、
【化２４】
二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルまたは二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルによる式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物の処理による変換のステップを含む。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物は、場合により単離されず、ステップ（ｖｉｉ）において、式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換は、ｉｎ ｓｉｔｕで行われる。
【００３９】
また、本発明は、本発明の方法により調製される（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、および本発明の方法により調製される（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明の方法により調製される式（ＸＩＩ）の化合物、および本発明の方法により調製される式（ＸＩＩａ）の化合物を提供する。
【００４１】
さらに、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を提供する。
【化２５】
［ここで、Ｒ１は、上記で定義した通りである］
【００４２】
また、本発明は、式（ＩＶ）の化合物を提供する。
【化２６】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、そのどちらも、特定の強力な酵素阻害剤の合成に有用である（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンならびにそのエナンチオマー（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンへの好都合な経路を提供する。
【００４４】
本発明の方法によれば、キラリティーは、生物触媒を用いて好都合に導入され、分割ステップにおいて一切のクロマトグラフ精製は必要とされない。有利には、この方法は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンの調製のための中間体である式（ＩＩＩ）の化合物への経路を提供する。また、この方法は、（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンの調製のための中間体である式（ＩＩＩａ）の化合物への経路を提供する。この方法の別の利点は、この方法が、式（ＩＶ）および（ＩＶａ）の化合物への経路を容易に提供することである。式（ＩＶ）および（ＩＶａ）の化合物は、他の応用例における使用を見出すことができる。
【００４５】
有利には、化合物（ＩＩＩ）および（ＩＶ）は、優れたエナンチオ選択性とともに高収率で製造され、容易に分離される。
【００４６】
この方法の他の利点は、酵素の選択により、この方法が、式（ＩＩＩａ）の化合物から容易に分離し、望ましい化合物、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンに変換することができる化合物（ＩＶａ）への経路も提供できることである。
【００４７】
当業者には当然のことながら、本発明によれば、式（ＶＩＩ）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物および式（ＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物のラセミ混合物が得られる。有利には、容易に入手できる出発材料を用い、ほんの２ステップで、かつ高収率で式（ＩＩ）の化合物を初めに製造することができる。続く式（ＩＩ）の化合物のエナンチオ選択的加水分解は、純粋なエナンチオマー体、または少なくとも、一方のエナンチオマーに極めて富んだ混合物を提供する。
【００４８】
当業者には明らかであるが、基Ｒ１およびＲ２は、上記で定義されているように、それ自体が場合により置換されていてもよい。例えば、Ｒ２は、ハロゲンおよび直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルコキシから選択される１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。同様に、Ｒ１は、ハロゲンまたは直鎖もしくは分岐鎖アルキルもしくはアルコキシ、例えば、ｐ−メトキシで置換されていてもよい。
【００４９】
当然のことながら、置換基ＢおよびＤを有する任意の化合物の表示は、Ｂおよび／またはＤがヒドロキシ基である場合、対応するアミドのエノール型互変異性体であり、大部分はアミド体で存在するはずである。エノール型互変異性表示の使用は、単に、より少ない構造式で本発明の化合物を表すためである。
【００５０】
同様に、当然のことながら、置換基ＢおよびＤを有する任意の化合物の表示は、Ｂおよび／またはＤがチオール基である場合、対応するチオアミドのエノール型互変異性体であり、大部分はチオアミド体で存在するはずである。チオエノール型互変異性表示の使用は、単に、より少ない構造式で本発明の化合物を表すためである。
【００５１】
式（ＶＩ）の化合物は、ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルＮ−保護基を組み入れることが好ましいが、当業者には明らかであるが、他のＮ−保護基を用いることができる（例えば、ＴｈｅｏｄｏｒａＷ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｎｅｃｅ、第３版（１９９９年５月１５日）を参照）。他の適当な保護基には、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルまたはスルホニル誘導体が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用するように、「楔」記号を示す構造式、例えば、下式は、トランス異性体の純粋なエナンチオマー体を表すことを意図している。
【化２７】
【００５３】
同様に、「長方形」記号を示す構造式、例えば、下式は、トランス異性体のラセミ混合物を表すことを意図している。
【化２８】
【００５４】
化合物の合成
本発明の好ましい実施形態（スキーム１）において、化合物（＋）−８は、マレイン酸ジエチル３およびニトロン２から調製される。スキーム１に示す続く環化付加、還元的切断および転位ステップは、これまでシス−トランス混合物の分別結晶によってのみ得られていた（Ｋａｍｅｔａｎｉ，Ｔ．、Ｋｉｇａｗａ，Ｙ．、Ｉｈａｒａ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９７９、３１３−３１６）純粋なトランス−置換ピロリジノン（±）−５を効率的に提供する。
【００５５】
イソオキサゾリジンをもたらす２などのニトロンのアルケンとの１，３−環化付加反応は、当業者に知られている反応である。この環化付加は、イソオキサゾリジンのＣ−４およびＣ−５における相対的立体化学が、アルケン上の置換基の幾何学的関係によって常に制御されるように、特異的にシス形式で進行する。
【００５６】
最も一般的には水素化分解または亜鉛と酸によるイソオキサゾリジンのＮ−Ｏ結合の還元的切断は、βアミノアルコールを生じさせる。５−アルコキシカルボニルイソオキサゾリジンから誘導されるアミノアルコールは、Ｃ−４またはＣ−５（イソオキサゾリジンナンバリング）におけるエピマー化なしにピロリジノンへ容易に環化する。したがって、４，５−シス−二置換イソオキサゾリジンは、３，４−トランス−二置換ピロリジノンを生じる。
【００５７】
【化２９】
【００５８】
上記化学反応の生成物（±）−４および（±）−５は、ラセミ混合物である。エナンチオ選択的加水分解の使用は、純粋なエナンチオマー体、または少なくとも、一方のエナンチオマー［（＋）−６、（＋）−７、（＋）−１、（＋）−８］に極めて富んだ混合物を提供する。したがって、この方法は、医薬生成物の構築における使用に適している。
【００５９】
リパーゼは、エステルの立体選択的およびエナンチオ選択的加水分解によく使用される（Ｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００４、９４−１１９）。近年、酵母カンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のＢ−リパーゼ（ＣＡＬＢ）は、多くのエナンチオ選択的な反応を触媒する特に効率的かつ強力な酵素であることが明らかにされている（Ｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、２００４、９４−１１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｌａｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｋｉｒｋ，Ｏ．ＢｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、１９９７、１６、１８１−２０４）。
【００６０】
市販製品ノボザイム（登録商標）４３５などのＣＡＬＢの固定化形態は、強化された安定性を有し、反応生成物から容易に分離される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．、Ｌａｒｓｏｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｋｉｒｋ，Ｏ．ＢｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓＢｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、１９９７、１６、１８１−２０４）。
【００６１】
本発明の方法は、ノボザイム（登録商標）４３５を用いてラセミエステル（±）−５を分割することが好ましい。エナンチオ選択的加水分解は、エステル（−）−５（ｅｅ＞９７％）と一緒に、良好な収率（ラセミ化合物に基づき３６〜４５％）および優れたエナンチオマー過剰率（９４〜９６％）で（＋）−（３Ｒ，４Ｓ）−酸６を生じさせる。
【００６２】
カルボン酸およびラクタム部分の還元は、最も一般的には、水素化リチウムアルミニウムか、ボランのどちらかを用いて行われる（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｇ．Ｍ．（ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．およびＦｌｅｍｉｎｇ，Ｉ編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１、８、２３７−２３８および２４９−２５１））。
【００６３】
本出願人は、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を用いる水素化ホウ素ナトリウムからのボランのｉｎｓｉｔｕ生成が、（＋）−６をＮ−ベンジルピロリジン（＋）−７へ還元し、次いで、水素化分解により（＋）−１へ変換するための好都合な方法であることを見出した。対応するＢｏｃ−カルバメート（＋）−８は、当業者に知られている様々な方法によって形成させることができる。本発明の好ましい実施形態において、メタノール中の二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルおよび水酸化ナトリウムまたはトリエチルアミンなどの塩基が、このステップで使用される。
【００６４】
有利には、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを合成するための新たな方法は、これまでに知られている方法よりも少ない化学変換を含む。望ましい化合物は、高収率で得られる。さらに、この方法は、より大量（例えば、数キログラム）が必要とされる場合に問題となるクロマトグラフ精製の使用を回避または低減し、薬学的使用のための大量な化合物の調製におけるスケールアップに極めて適した方法にしている。
【００６５】
本方法の他の利点は、Ｎ−ベンジルピロリジン（＋）−７を結晶化し、エナンチオマー過剰率をさらに改善できることである。さらに、化合物（＋）−１は、結晶性材料、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル誘導体（＋）−８へ容易に変換することができる。化合物（＋）−８は、極めて安定な中間体であり、簡単な酸処理により、もとの（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン（＋）−１へ好都合に変換される。
【００６６】
場合により、望ましい化合物のエナンチオマー純度を高めるために再結晶ステップを加えることができる。
【００６７】
ＰＮＰ阻害剤の調製における中間体として式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を使用するための方法は、国際公開第２００４／０１８４９６号パンフレット（ＰＣＴ／ＮＺ２００４／０００１８６）および国際公開第２００４／０６９８５６号パンフレット（ＰＣＴ／ＮＺ２００４／００００１７）に詳細に記載されている。
【００６８】
ヒドロラーゼのスクリーニング
以下に示すスクリーニング方法により、任意の酵素が本発明の酵素的分割ステップに有効であるか否かを判定することができる。したがって、当然のことながら、本発明は、記載されているか、あるいは特許請求の範囲に記載されているいかなる特異的酵素にも限定されるものではない。この方法により、ある群から任意の酵素を選択し、望ましい収率およびエナンチオマー過剰率についてその酵素をスクリーニングし、本発明の方法においてその酵素を使用するか、あるいは代わりの酵素を選択することができる。
【００６９】
【化３０】
【００７０】
合計２２種のリパーゼ、エステラーゼ、およびプロテアーゼ（表１）を、それらのスキーム１に示す加水分解を触媒する能力について試験した。各酵素（５〜５０ｍｇ、表１）を、ラセミエステル（±）−５（５０ｍｇ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、０．１ｍＬ）、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．５、０．１ｍＬ）、水（１ｍＬ）およびフェノールレッド指示薬と一緒に撹拌した。加水分解が進行したら、生成物の酸（６）を、フェノールレッド終点まで水酸化ナトリウム（０．１Ｍ）により滴定した。したがって、水酸化ナトリウムの消費は、反応の程度の尺度である。酵素のうち１５種類は、２４時間で１０％の変換を行えなかったため放棄した。５０％の変換に到達したか［ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）、サブチリシン、ノボザイム４３５］、それ以上の変換が観察されないか［パンクレアチン、シュードモナス属リポタンパク質リパーゼ、クロモバクテリウムビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｓｃｏｓｕｍ）リポタンパク質リパーゼ、リポザイム］のどちらかの場合、残りの７つの反応物に抽出処理を行った。エステル５および酸６の両方を含有する抽出物を、トリメチルシリルジアゾメタンで処理し、酸を、対応するメチルエステルに変換した。次いで、５および６のエナンチオマー純度を、ＨＰＬＣ（ＣｈｉｒａｃｅｌＯＤ−Ｈ）により決定した。ブタ肝臓エステラーゼ、ノボザイム４３５およびパンクレアチンは、中程度から高いエナンチオマー過剰率で５および６を与えたが（表１）、パンクレアチンは、高い酵素負荷で極めてゆっくりと反応したに過ぎなかった。したがって、これらの酵素のうち最初の２種を、さらなる試験のために選択した。それらは各々、エステル５の異なるエナンチオマーを優先的に加水分解する。ノボザイム４３５は、（＋）酸６および（−）エステル５を生じさせるが、ＰＬＥは、（−）６および（＋）５を生じさせる。
【００７１】
【表１】
【００７２】
ＰＬＥは、いくつかの共溶媒の存在下で５の加水分解を触媒した。回収されたエステルおよび酸のエナンチオマー過剰率は、共溶媒とほとんど無関係であった（表２）。加水分解反応を７０％完了まで進行させた場合、未反応エステル（＋）−５は、優れたエナンチオマー過剰率で得られたが（表３）、同時に、収率は低下した。
【００７３】
【表２】
【００７４】
【表３】
【００７５】
ノボザイム４３５は、共溶媒なしに、およびアセトン存在下の両方で、（±）−５を、各々良好なｅ．ｅ．（約９５％）で酸（＋）−６およびエステル（−）−５に分割した。エステル５は、中程度の収率で、ボラン−ジメチルスルフィド錯体によりＮ−ベンジルピロリジン７に還元された。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明する。当然のことながら、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００７７】
（実施例１）
（±）−２−Ｎ−ベンジル−イソオキサゾリジン−４，５−シス−ジカルボン酸ジエチルエステル［（±）−４］）
Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミン塩酸塩（１４４．８ｇ、０．９１ｍｏｌ）および無水酢酸ナトリウム（８２ｇ、１ｍｏｌ）を、周囲温度にて３０分間、エタノール（８００ｍＬ）中で一緒に撹拌した後、３７％ホルムアルデヒド水溶液（１３４ｍＬ、１．８ｍｏｌ）を加え、撹拌を１時間続けた。マレイン酸ジエチル３（１３４ｍＬ、０．８３ｍｏｌ）を加え、混合物を１時間撹拌し、続いて２時間還流下で加熱した。冷却後、混合物を濾過し、濾液を蒸発させ、残渣を酢酸エチル（１．５Ｌ）に取り、飽和重炭酸ナトリウムで３回（各２００ｍＬ）洗浄した。有機層を取り出して乾燥し（ＭｇＳＯ４）、溶媒を蒸発させると、黄色の油状物として粗生成物（±）−４（２５０．３ｇ、マレイン酸ジエチルの量に基づいて９８％）が得られた。少量を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、２：８ｖ／ｖ）により精製した。分析データは以下の通りである。１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：７．４０〜７．２０（ｍ，５Ｈ）、４．７６（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、４．２９〜４．０８（ｍ，５Ｈ）、４．０２（ｂｒ．ｄ，１Ｈ）、３．７７（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ）、３．６０〜３．００（ｂｒ．ｍ，２Ｈ）、１．２８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：１６９．７（ｓ）、１６９．１（ｓ）、１３６．４（ｓ）、１２９．０（ｄ）、１２８．４（ｄ）、１２７．６（ｄ）、７７．０（ｄ）、６２．５（ｔ）、６１．４（ｔ）、６１．３（ｔ）、５６．８（ｂｒ．ｔ）、５０．４（ｂｒ．ｄ）、１４．０（ｑ）。ＥＩＭＳ（＋ｖｅ）：ｍ／ｚＣ１６Ｈ２１ＮＯ５（Ｍ）＋の計算値：３０７．１４１９７；実測値：３０７．１４１８４
【００７８】
（実施例２）
（±）−トランス−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−２−ピロリジノン−４−カルボン酸エチルエステル［（±）−５）］
粗製の２−Ｎ−ベンジル−イソオキサゾリジン−４，５−シス−ジカルボン酸ジエチルエステル（±）−４（２５０．３ｇ、０．８１ｍｏｌ）の酢酸（２Ｌ）溶液に、粉末亜鉛（１０６ｇ、１．６２ｍｏｌ）を一度に加えた。氷水浴を数分間用い、極めて緩やかな放熱を制御した。混合物を１５分間撹拌し、次いで、セライトに通して濾過した。溶媒を蒸発させ、残渣をジクロロメタン（１．５Ｌ）に取り、脱ガスがもはや観察されなくなるまで重炭酸ナトリウムの飽和溶液３００ｍＬで洗浄した。有機層を取り出して乾燥し（ＭｇＳＯ４）、溶媒を蒸発させると、淡褐色の油状物として粗生成物（±）−５（１９３．６ｇ、９１％）が得られた。少量を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：酢酸エチル：ヘキサン、１：１ｖ／ｖ）により精製した。分析データは以下の通りである。融点６５〜６６℃（酢酸エチル−ヘキサン）、文献値６２〜６３．５℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：７．３８〜７．１９（ｍ，５Ｈ）、４．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３，３．４Ｈｚ，Ｄ２Ｏ交換でｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚとなった）、４．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，Ｄ２Ｏ交換で消失）、４．５３（ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ，ＡＢシステムのＡ）、４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．７Ｈｚ，ＡＢシステムのＢ）、４．１９（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）、３．４４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、３．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、３．１４（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、１．２６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ：１７２．９（ｓ）、１７１．４（ｓ）、１３５．１（ｓ）、１２８．９（ｄ）、１２８．２（ｄ）、１２８．０（ｄ）、７２．３（ｄ）、６１．５（ｔ）、４７．０（ｔ）、４６．１（ｄ）、４５．１（ｔ）、１４．１（ｑ）。ＥＩＭＳ：ｍ／ｚＣ１４Ｈ１７ＮＯ４（Ｍ）＋の計算値：２６３．１１５７６。実測値：２６３．１１５３８。
【００７９】
（実施例３）
（３Ｒ，４Ｓ）−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−２−ピロリジノン−４−カルボン酸［（±）−６］および（３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−２−ピロリジノン−４−カルボン酸エチルエステル［（−）−５］
リン酸カリウム緩衝液（０．１Ｍ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１０Ｌ）中の粗製エステル（±）−５（１９１．８ｇ、０．７２ｍｏｌ）の懸濁液を、２５℃にて５時間、ノボザイム（登録商標）４３５（２０．０ｇ）上で撹拌した。酵素を濾過により除去し、濾液を塩化ナトリウムで飽和させた。未反応エステル（−）−５は、クロロホルム（３×５Ｌ）による抽出により除去した。次いで、水性混合物をＨＣｌ（６Ｎ）でｐＨ１とし、クロロホルム（９×５Ｌ）でさらに抽出した。次いで、水相を半分の容量のＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮すると、淡褐色の固体として粗製の表題化合物（＋）−６（６６．７ｇ、３９％）が得られた。小バッチ（３．９５ｍｍｏｌ）のクロマトグラフにより精製した（±）−５の酵素的加水分解から得られる（＋）−６（収率：１．７８ｍｍｏｌ、４４％）および（−）−５（収率：１．８５ｍｍｏｌ、４６％）についての分析データは以下の通りである。
【００８０】
（＋）−６の分析データ：融点（酢酸エチル）１４４〜１４６℃。［α］２０Ｄ＋６２．３（ｃ＝１，ＥｔＯＨ）。エナンチオマーの過剰（ＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ−Ｈ上のメチルエステルのＨＰＬＣ）９４．８％。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：７．３７〜７．２１（５Ｈ，ｂｍ）、４．７６（４Ｈ，ｂｓ，２×ＯＨ，Ｈ２Ｏ）４．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、４．４６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．６，１０．３）、３．４４（２Ｈ，ｍ）、３．１９（１Ｈ，ｍ）。１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ｐｐｍ：１７４．７、１７３．８、１３５．１、１２９．３、１２８．６、１２８．５、７２．６、４７．６、４６．１、４５．５。元素分析：実測値，Ｃ ６１．３６，Ｈ ５．５６，Ｎ ５．９２．Ｃ１２Ｈ１３ＮＯ４計算値Ｃ ６１．２７，Ｈ ５．５７，Ｎ ５．９５。
【００８１】
（−）−５の分析データ：［α］２０Ｄ−４６．８（ｃ＝１．１、ＥｔＯＨ）。エナンチオマー過剰率（ＣｈｉｒａｃｅｌＯＤ−Ｈ上のＨＰＬＣ）９７．７％。
【００８２】
（実施例４）
（３Ｒ，４Ｒ）−１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン［（＋）−７］
ＢＦ３ＯＥｔ２（１７０ｍＬ、１３８２ｍｍｏｌ）を、０℃にて、ＴＨＦ（１Ｌ）中の酸（＋）−６（６２ｇ、２６４ｍｍｏｌ）およびＮａＢＨ４（４０ｇ、１０５７ｍｍｏｌ）の懸濁液に滴加した。混合物を７２時間放置した。次いで、反応を、氷冷下、ＭｅＯＨ（５００ｍＬ）でクエンチし（脱ガス）、溶媒を蒸発させた。次いで、残渣を６ＮＨＣｌ水性液（１Ｌ）で１０分間処理し、続いて蒸発させた。ｐＨ１２〜１４までＮａＯＨ（１５％水溶液、２５０ｍＬ）を加えた。得られた溶液を真空下で濃縮して固体とし、次いで、これをクロロホルム（１Ｌ）に懸濁した。セライトに通す濾過後、濾液を蒸発乾固させると油状物が得られ、これをトルエンからゆっくりと結晶化させた。真空下でさらに乾燥すると、白色の結晶性固体として化合物（＋）−７（５４ｇ、２６１ｍｍｏｌ、収率９９％）が得られた。［α］２０Ｄ＋３７．３（ｃ＝１、ＭｅＯＨ）、融点５４〜５６℃。
【００８３】
（実施例５）
（３Ｒ，４Ｒ）−１−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン［（＋）−８］
前ステップからの粗製（＋）−７（６０ｇ）をメタノール（８００ｍＬ）に取り、１０％Ｐｄ／Ｃ（１２ｇ、湿ったＤｅｇｕｓｓａタイプ）を加え、混合物を水素の雰囲気中で１２時間撹拌すると、粗製の（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン（＋）−１が得られた。触媒を濾過により除去し、メタノール溶液にトリエチルアミン（３０ｍＬ、２１６ｍｍｏｌ）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４７．５ｇ、２１８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を、室温にて１時間撹拌した（わずかな放熱）。次いで、混合物を、シリカゲルに前吸収させ、乾式フラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、５：２：１ｖ／ｖ／ｖ）によりクロマトグラフを行うと、淡いオレンジ色のシロップとして（＋）−８（２５．４ｇ、（＋）−６から５９％）が得られた。最終生成物は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル、１：４）により除去できる可能性のあるトリエチルアンモニウム塩約１５％（ｗ／ｗ）を含有していた。完全に精製された（＋）−８についてのデータは以下の通りである：［α］２０Ｄ＋１５．４（ｃ＝０．５、ＭｅＯＨ）。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ ｐｐｍ：４．１４（ｍ、１Ｈ）、３．５８〜３．４５（ｍ、４Ｈ）、３．２４〜３．１８（ｍ、２Ｈ）、２．２４（ｍ、１Ｈ）、１．４６（ｓ、９Ｈ）。１３ＣＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）：δ ｐｐｍ（一部のピークは、回転異性体の遅い相互変換のため２本になっている）：１５６．９９、８１．３１、（７３．１０、７２．４０）、６３．０６、（５４．４５、５４．０３）、（５０．４２、４９．７５）、（４８．４７、４８．０３）、２９．１８。
【００８４】
（実施例６）
（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−（メチルチオメチル）−ピロリジン
【化３１】
保護アミン（７．７５ｇ、３５．７ｍｍｏｌ）およびジブチルスズオキシド（１０．６６ｇ、４２．８ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に懸濁し、ディーンスターク条件下で加熱還流した。反応物は、約１００℃で均一になった。溶液をさらに１．５時間還流下で加熱し、−１０℃まで冷却し、次いで、塩化メタンスルホニル（３．３４ｍＬ、４２．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてモニターした。１時間後、反応が不完全に見えたので、撹拌しながら室温まで温め、一夜放置すると、反応は完了したように見えた。ジクロロメタン中の５％ｖ／ｖＭｅＯＨで溶出されるシリカゲルのカラム上に直接ロードされた溶液のカラムクロマトグラフィーにより、無色の油状物としてメシレート（１０．０ｇ、３３．９ｍｍｏｌ、収率９５％）が得られた。
【００８５】
【化３２】
【００８６】
メシレート（１０ｇ、３３．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶かし、ナトリウムチオメトキシド（４．７５ｇ、６７．７ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。溶液を一夜撹拌し、トルエンで希釈し、水および食塩水で洗浄し、乾燥して（ＭｇＳＯ４）真空中で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液ジクロロメタン中の５％ｖ／ｖＭｅＯＨ）により、黄色の油状物としてＮ−保護３−ヒドロキシ−４−（メチルチオメチル）−ピロリジン（８．２ｇ、３３．２ｍｍｏｌ、収率９８％）が得られた。
【００８７】
【化３３】
【００８８】
Ｎ−保護３−ヒドロキシ−４−（メチルチオメチル）−ピロリジン（８．２ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）をメタノール（４０ｍＬ、３３．２ｍｍｏｌ）に溶かし、これに塩酸（１０ｍＬ、３２６ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を真空中で濃縮した。このステップを繰り返すと、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ−ジクロロメタン中の１０％ｖ／ｖ７Ｎ ＮＨ３）は、完全な脱保護を示した。ＭｅＯＨ−ジクロロメタン中の１０〜２０％ ７Ｎ ＮＨ３で溶出されるシリカ上のカラムクロマトグラフィーにより、表題化合物（４．３ｇ、２９．２ｍｍｏｌ、収率８８％）が得られた。
【００８９】
（実施例７）
ヒドロラーゼのスクリーニング
ラセミエステル（±）−５（５０±５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、試験管中でＭＴＢＥ（０．１ｍＬ）と一緒に撹拌し、次いで、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、０．１Ｍ ＮａＣｌで、ｐＨ７．５、０．１ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）およびフェノールレッド溶液（０．１％水溶液、０．０１ｍＬ）を加えた。酵素調製物（５〜５０ｍｇ）を加えて反応を開始させ、指示薬をピンクがかった赤色に維持するため必要に応じてＮａＯＨ（０．１Ｍ）を注射器から加えた。１．０±０．１ｍＬのＮａＯＨ溶液（約５０％の加水分解を示す）が消費された場合（または２３時間後か、あるいは反応が停止したように見えた場合）、ｐＨ１までＨＣｌ（１Ｍ）を添加することにより反応を停止させ、酵素調製物を濾過または遠心分離により除去した。濾液または上清をＮａＣｌ（約７５０ｍｇ）で飽和させ、ＥｔＯＡｃ（３×１ｍＬ）で抽出した。乾燥した（ＭｇＳＯ４）抽出液を減圧下で濃縮し、乾燥メタノール（２ｍＬ）に取った。この溶液を、氷水浴中、アルゴン下で冷却し、試薬の黄色が残存するまでトリメチルシリルジアゾメタン（２．０Ｍヘキサン溶液）を加えた。溶液を室温にて５分間撹拌し、次いで、減圧下で濃縮した。得られたエチルエステルとメチルエステルの混合物を、ヘキサン−イソプロパノールで溶出されるＣｈｉｒａｌｃｅｌＯＤ−Ｈカラムを用いるＨＰＬＣにより分析した。
【００９０】
（実施例８）
ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）による加水分解
方法（ａ）。−エステル（±）−５（０．５ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）のトルエン（０．２ｍＬ）溶液を、リン酸塩緩衝液（１．０Ｍ、ｐＨ７．５、２．０ｍＬ）およびＰＬＥ（５ｍｇ）と一緒に５４時間撹拌した。反応混合物をアセトンで希釈し、Ｗｈａｔｍａｎ５０濾紙上でセライトのパッドに通して濾過した。濾液を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた抽出液を乾燥して（ＭｇＳＯ４）減圧下で濃縮すると、（＋）−５（０．２５ｇ、５０％、８４％ｅ．ｅ．）が得られた。
【００９１】
方法（ｂ）。−ラセミエステル（±）−５（５０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のトルエン（０．１ｍＬ）溶液を、リン酸塩緩衝液（０．１Ｍ、０．１ＭＮａＣｌで、ｐＨ７．５、０．１ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）、フェノールレッド溶液（０．１％水溶液、０．０１ｍＬ）およびＰＬＥ（４．６ｍｇ）と一緒に撹拌した。指示薬をピンクがかった赤色に維持するため必要に応じてＮａＯＨ（０．１Ｍ）を注射器から加えた。１．４ｍＬのＮａＯＨ溶液が消費された場合（約７０％の変換を示す）、反応混合物をアセトンで希釈し、Ｗｈａｔｍａｎ５０濾紙上でセライトのパッドに通して濾過した。濾液を酢酸エチルで３回抽出し、合わせた抽出液を乾燥して（ＭｇＳＯ４）減圧下で濃縮すると、（＋）−５（１０ｍｇ、９３％ｅ．ｅ．）が得られた。
【００９２】
（実施例９）
共溶媒としてアセトンを用いるノボザイム４３５による加水分解
粗製エステル（±）−５（３１９ｇ、１．２１ｍｏｌ）をアセトン（３２０ｍＬ）に溶かし、この溶液に、Ｋ２ＨＰＯ４緩衝液（３．２Ｌ、０．５Ｍ、ｐＨメーターを用い、０．５ＭＫＨ２ＰＯ４でｐＨを７．５に調整する）を加えた。ノボザイム（登録商標）４３５（３０．０ｇ）を加え、得られた懸濁液を２７℃にて６時間撹拌した。次いで、酵素をセライトに通す濾過により除去し、残渣をＫ２ＨＰＯ４緩衝液（３００ｍＬ）で洗浄した。濾液をＮａＣｌ（約７５０ｇ）で飽和させ、未反応エステル（−）−５をクロロホルム（３×４００ｍＬ）による抽出により除去した。次いで、水性混合物をｃＨＣｌ（１５０ｍＬ；１２Ｎ）でｐＨ１とし、ＮａＣｌ（１００ｇ）で再飽和させ、酢酸エチル（６×４００ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた抽出液を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮すると、灰色がかった白色の固体として粗製の表題化合物（＋）−６が得られ、それを酢酸エチルから結晶化すると、白色の固体として（＋）−６（１０６ｇ、７２％）が得られた。融点１４４〜１４６℃。［α］２０Ｄ＋６２．３（ｃ＝１．０、ＥｔＯＨ）。
【００９３】
（実施例１０）
エステル５の還元による１−Ｎ−ベンジル−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン
エステル５（３．１ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液を氷水浴中で冷却し、次いで、注射器を介してボラン−ジメチルスルフィド錯体（６．０ｍＬ、５８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温まで温め、次いで、２時間還流下で加熱した。反応物を冷却し、メタノールを少しずつ加えることによりクエンチし、シリカゲル（約１５ｍＬ）で減圧下で濃縮した。シリカを、酢酸エチルで溶出される短いシリカゲルカラムの上部に入れた。生成物を含有する溶離液分画を減圧下で濃縮し、残渣を、ＴＦＡ−水（１：１、３０ｍＬ）中で一夜撹拌した。溶媒の蒸発およびイオン交換カラムクロマトグラフィー（ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＩＲＡ−９００、Ｃｌ−型、メタノール−水、１：１ｖ／ｖで溶出）通過により、油状物が得られ、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフにさらにかけると（溶出液としてジクロロメタン−メタノール６：１〜４：１）、表題化合物（１．５０ｇ、７．２ｍｍｏｌ、５８％）が得られた。
【００９４】
本発明を一例として説明してきたが、当然のことながら、本発明の範囲を逸脱することなく変更または改変を行うことができる。さらに、具体的特徴に対して既知の等価体が存在する場合、そのような等価体は、あたかも本明細書において具体的に言及されるかのように組み込まれるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明は、（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンおよびそのエナンチオマー（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジンを調製するための改良法を提供し、そのどちらも、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの阻害剤の調製において価値ある中間化合物である。そのような阻害剤は、様々な疾患、特に癌を治療する可能性のある治療薬である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化１】
以下のステップ、すなわち
ステップ（ａ）：ラセミの式（ＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解であって、
【化２】
［ここで、Ｒ１は、ベンジルまたはベンズヒドリルであり、それらの各々は、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよく、Ｒ２は、アリールまたは直鎖もしくは分岐鎖のアルキルもしくはアラルキルであり、それらのいずれも、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよい］
混合物（ｉ）：式（ＩＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶ）の未反応ピロリジン化合物か、
【化３】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
混合物（ｉｉ）：式（ＩＩＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶａ）の未反応ピロリジン化合物のどちらかを得るための加水分解、
【化４】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
（ここで、酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素か、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素のどちらかを用いて行われる）
ステップ（ｂ）：混合物（ｉ）における式（ＩＶ）の化合物からの式（ＩＩＩ）の化合物の分離、または混合物（ｉｉ）における式（ＩＶａ）の化合物からの式（ＩＩＩａ）の化合物の分離、および
ステップ（ｃ）：式（ＩＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＶａ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換、または式（ＩＶ）の化合物もしくは式（ＩＩＩａ）の化合物の式（Ｉａ）の化合物への変換
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素を用いて混合物（ｉ）を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約９０％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）は、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素を用いて混合物（ｉｉ）を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約９０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において使用される酵素は、リパーゼまたはエステラーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酵素はリパーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
リパーゼは、カンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵素はエステラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
エステラーゼは、ブタ肝臓エステラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）は、式（ＩＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物へ変換するステップである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）は、式（ＩＩＩａ）の化合物から式（Ｉａ）の化合物へ変換するステップである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
変換は、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物を生じさせるために、式（ＩＩＩ）または式（ＩＩＩａ）の化合物を還元するステップを含む方法により行われる、請求項１３または１４に記載の方法。
【化５】
［ここで、Ｒ１は、請求項１で定義した通りである］
【請求項１６】
還元は、水素化リチウムアルミニウムまたはボランを用いて行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１はベンジルであり、かつ、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の化合物は、そのエナンチオマー過剰率を改善するために再結晶される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物を得るため、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の化合物のＲ１基の水素による置換のステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１基の水素による置換は、水素化分解により行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）における式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）の化合物から分離することは、第１の水不混和性溶媒を用い、式（ＩＶ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を含有する水溶液から式（ＩＶ）の化合物を抽出し、次いで、得られる混合物のｐＨを低下させて式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸体に変換し、次いで、得られる混合物を第２の水不混和性溶媒で再度抽出することにより行われる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
水不混和性溶媒は、ジクロロメタンまたはクロロホルムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の水不混和性溶媒は、酢酸エチルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物は、式（ＶＩ）または式（ＶＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物に変換される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
［ここで、Ｒ４は、Ｎ保護基である］
【請求項２４】
Ｒ４は、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルまたはアラルコキシカルボニルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ４は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、メトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
式（ＶＩ）または（ＶＩａ）の化合物は、そのエナンチオマー過剰率を改善するために再結晶される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
式（Ｉ）の化合物は、場合により塩基の存在下で、アルコキシカルボニル化剤、アリールオキシカルボニル化剤またはアラルコキシカルボニル化剤による処理によって、式（ＶＩ）の化合物に変換される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
塩基は、トリエチルアミンまたは水酸化ナトリウムである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
式（ＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（ＩＩ）の化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップを含む方法により調製される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【化７】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義した通りである］
【請求項３０】
式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンと式（ＩＸ）のアルケンとの１，３−環化付加により調製される、請求項２９に記載の方法。
【化８】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義した通りである］
【請求項３１】
１，３−環化付加は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンを生成させ、次いで、それを、式（ＩＸ）のアルケンとｉｎ ｓｉｔｕで反応させることにより行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ１は、ベンジルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
式（ＶＩＩＩ）のニトロンは、Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミンとＨＣＨＯの反応により生成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ２は、アルキルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ２は、メチルまたはエチルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
還元的切断およびｉｎ ｓｉｔｕ環化は、水素化分解によるか、あるいは酸の存在下でＺｎを用いることにより行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【化９】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【請求項３８】
式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換し、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【化１０】
【化１１】
【化１２】
［ここで、Ｒ５は、請求項３７で定義した通りであり、
Ａは、Ｎ、ＣＨおよびＣＲ６から選択され、ここで、Ｒ６は、ハロゲン、ＯＨおよびＮＨ２から選択されるか、あるいは、Ｒ６は、アルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、それらの各々は、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいか、あるいは、Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＮＲ７Ｒ８およびＳＲ９から選択され、ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｂは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１０、ＳＨ、水素およびハロゲンから選択され、ここで、Ｒ１０は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１１、水素、ハロゲンおよびＳＣＨ３から選択され、ここで、Ｒ１１は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択される］
【請求項３９】
反応は、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド等価体を用いて行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
式（ＸＩ）の化合物は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に変換され、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩＩＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得る、請求項３８に記載の方法。
【化１３】
［ここで、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは、それらの各々を請求項３６で定義した通りであり、５員環内のＮＨは、適当な保護基で保護されていてもよい］
【請求項４１】
請求項３１に記載の方法により式（ＩＩ）の化合物を調製するステップをさらに含み、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）に変換するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【化１４】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【請求項４２】
式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【化１５】
【化１６】
【化１７】
［ここで、Ｒ５は、請求項３７で定義した通りであり、
Ａは、Ｎ、ＣＨおよびＣＲ６から選択され、ここで、Ｒ６は、ハロゲン、ＯＨおよびＮＨ２から選択されるか、あるいは、Ｒ６は、アルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、それらの各々は、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいか、あるいは、Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＮＲ７Ｒ８およびＳＲ９から選択され、ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｂは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１０、ＳＨ、水素およびハロゲンから選択され、ここで、Ｒ１０は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１１、水素、ハロゲンおよびＳＣＨ３から選択され、ここで、Ｒ１１は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択される］
【請求項４３】
（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化１８】
（ｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物を得るための式（２）のニトロンと式（３）のアルケンの１，３−環化付加のステップ、
【化１９】
（ｉｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（５）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップ、
【化２０】
（ｉｉｉ）式（６）の化合物と式（５）の未反応化合物の混合物、または式（６ａ）の化合物と式（５ａ）の未反応化合物の混合物を得るための式（５）の化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解のステップ、
【化２１】
（ｉｖ）式（６）の化合物の式（５）の化合物からの分離、または式（６ａ）の化合物の式（５ａ）の化合物からの分離のステップ、
（ｖ）式（７）の化合物を得るための式（６）もしくは（５ａ）の化合物の還元、および式（７ａ）の化合物を得るための式（６ａ）もしくは（５）の化合物の還元のステップ、
【化２２】
（ｖｉ）式（Ｉ）の化合物を得るための式（７）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換、または式（Ｉａ）の化合物を得るための式（７ａ）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換のステップ
を含む方法。
【請求項４４】
（ｖｉｉ）式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換であって、
【化２３】
二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルまたは二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルによる式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物の処理による変換のステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物は、単離されず、ステップ（ｖｉｉ）において、式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換は、ｉｎ ｓｉｔｕで行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１に記載の方法により調製される（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン。
【請求項４７】
請求項１に記載の方法により調製される（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン。
【請求項４８】
請求項３８に記載の方法により調製される請求項３８に定義されている式（ＸＩＩ）の化合物。
【請求項４９】
請求項３８に記載の方法により調製される請求項３８に定義されている式（ＸＩＩａ）の化合物。
【請求項５０】
式（ＩＩＩ）の化合物。
【化２４】
［ここで、Ｒ１は、請求項１で定義した通りである］
【請求項５１】
式（ＩＶ）の化合物。
【化２５】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義した通りである］
【請求項１】
（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化１】
以下のステップ、すなわち
ステップ（ａ）：ラセミの式（ＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解であって、
【化２】
［ここで、Ｒ１は、ベンジルまたはベンズヒドリルであり、それらの各々は、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよく、Ｒ２は、アリールまたは直鎖もしくは分岐鎖のアルキルもしくはアラルキルであり、それらのいずれも、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシにより置換されていてもよい］
混合物（ｉ）：式（ＩＩＩ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶ）の未反応ピロリジン化合物か、
【化３】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
混合物（ｉｉ）：式（ＩＩＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物および式（ＩＶａ）の未反応ピロリジン化合物のどちらかを得るための加水分解、
【化４】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである］
（ここで、酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素か、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素のどちらかを用いて行われる）
ステップ（ｂ）：混合物（ｉ）における式（ＩＶ）の化合物からの式（ＩＩＩ）の化合物の分離、または混合物（ｉｉ）における式（ＩＶａ）の化合物からの式（ＩＩＩａ）の化合物の分離、および
ステップ（ｃ）：式（ＩＩＩ）の化合物もしくは式（ＩＶａ）の化合物の式（Ｉ）の化合物への変換、または式（ＩＶ）の化合物もしくは式（ＩＩＩａ）の化合物の式（Ｉａ）の化合物への変換
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）は、化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素を用いて混合物（ｉ）を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化合物（ＩＩＩ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約９０％である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）は、化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率を引き起こすことができる酵素を用いて混合物（ｉｉ）を生じさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約８０％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物（ＩＩＩａ）のエナンチオマー過剰率は、少なくとも約９０％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）において使用される酵素は、リパーゼまたはエステラーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酵素はリパーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
リパーゼは、カンジダアンタークチカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）由来のリパーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
酵素はエステラーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
エステラーゼは、ブタ肝臓エステラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）は、式（ＩＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物へ変換するステップである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）は、式（ＩＩＩａ）の化合物から式（Ｉａ）の化合物へ変換するステップである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
変換は、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物を生じさせるために、式（ＩＩＩ）または式（ＩＩＩａ）の化合物を還元するステップを含む方法により行われる、請求項１３または１４に記載の方法。
【化５】
［ここで、Ｒ１は、請求項１で定義した通りである］
【請求項１６】
還元は、水素化リチウムアルミニウムまたはボランを用いて行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ１はベンジルであり、かつ、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の化合物は、そのエナンチオマー過剰率を改善するために再結晶される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物を得るため、式（Ｖ）または式（Ｖａ）の化合物のＲ１基の水素による置換のステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ１基の水素による置換は、水素化分解により行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）における式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）の化合物から分離することは、第１の水不混和性溶媒を用い、式（ＩＶ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を含有する水溶液から式（ＩＶ）の化合物を抽出し、次いで、得られる混合物のｐＨを低下させて式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸塩体を式（ＩＩＩ）の化合物のカルボン酸体に変換し、次いで、得られる混合物を第２の水不混和性溶媒で再度抽出することにより行われる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
水不混和性溶媒は、ジクロロメタンまたはクロロホルムである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の水不混和性溶媒は、酢酸エチルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
式（Ｉ）または式（Ｉａ）の化合物は、式（ＶＩ）または式（ＶＩａ）の３，４−トランス−二置換ピロリジン化合物に変換される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【化６】
［ここで、Ｒ４は、Ｎ保護基である］
【請求項２４】
Ｒ４は、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルまたはアラルコキシカルボニルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ４は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、メトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
式（ＶＩ）または（ＶＩａ）の化合物は、そのエナンチオマー過剰率を改善するために再結晶される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
式（Ｉ）の化合物は、場合により塩基の存在下で、アルコキシカルボニル化剤、アリールオキシカルボニル化剤またはアラルコキシカルボニル化剤による処理によって、式（ＶＩ）の化合物に変換される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
塩基は、トリエチルアミンまたは水酸化ナトリウムである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
式（ＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（ＩＩ）の化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップを含む方法により調製される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【化７】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義した通りである］
【請求項３０】
式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンと式（ＩＸ）のアルケンとの１，３−環化付加により調製される、請求項２９に記載の方法。
【化８】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義した通りである］
【請求項３１】
１，３−環化付加は、式（ＶＩＩＩ）のニトロンを生成させ、次いで、それを、式（ＩＸ）のアルケンとｉｎ ｓｉｔｕで反応させることにより行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ１は、ベンジルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
式（ＶＩＩＩ）のニトロンは、Ｎ−ベンジルヒドロキシルアミンとＨＣＨＯの反応により生成される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ２は、アルキルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
Ｒ２は、メチルまたはエチルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
還元的切断およびｉｎ ｓｉｔｕ環化は、水素化分解によるか、あるいは酸の存在下でＺｎを用いることにより行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【化９】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【請求項３８】
式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物に変換し、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【化１０】
【化１１】
【化１２】
［ここで、Ｒ５は、請求項３７で定義した通りであり、
Ａは、Ｎ、ＣＨおよびＣＲ６から選択され、ここで、Ｒ６は、ハロゲン、ＯＨおよびＮＨ２から選択されるか、あるいは、Ｒ６は、アルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、それらの各々は、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいか、あるいは、Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＮＲ７Ｒ８およびＳＲ９から選択され、ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｂは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１０、ＳＨ、水素およびハロゲンから選択され、ここで、Ｒ１０は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１１、水素、ハロゲンおよびＳＣＨ３から選択され、ここで、Ｒ１１は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択される］
【請求項３９】
反応は、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド等価体を用いて行われる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
式（ＸＩ）の化合物は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に変換され、次いで、式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩＩＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得る、請求項３８に記載の方法。
【化１３】
［ここで、Ａ、Ｂ、ＤおよびＥは、それらの各々を請求項３６で定義した通りであり、５員環内のＮＨは、適当な保護基で保護されていてもよい］
【請求項４１】
請求項３１に記載の方法により式（ＩＩ）の化合物を調製するステップをさらに含み、式（Ｉ）または（Ｉａ）の化合物を式（Ｘ）または（Ｘａ）に変換するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【化１４】
［ここで、Ｒ５は、Ｈ、ＯＨおよびＳＨから選択されるか、またはそれらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキルオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アラルキルチオ、およびアリールチオから選択される］
【請求項４２】
式（Ｘ）または（Ｘａ）の化合物を式（ＸＩ）の化合物と反応させて式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩａ）の化合物を得るステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【化１５】
【化１６】
【化１７】
［ここで、Ｒ５は、請求項３７で定義した通りであり、
Ａは、Ｎ、ＣＨおよびＣＲ６から選択され、ここで、Ｒ６は、ハロゲン、ＯＨおよびＮＨ２から選択されるか、あるいは、Ｒ６は、アルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、それらの各々は、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいか、あるいは、Ｒ６は、ＮＨＲ７、ＮＲ７Ｒ８およびＳＲ９から選択され、ここで、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｂは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１０、ＳＨ、水素およびハロゲンから選択され、ここで、Ｒ１０は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｄは、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨＲ１１、水素、ハロゲンおよびＳＣＨ３から選択され、ここで、Ｒ１１は、それらの各々が、ハロゲン、分岐鎖もしくは直鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アルコキシ、アラルキルオキシまたはアリールオキシにより置換されていてもよいアルキル、アラルキルおよびアリールから選択され、
Ｅは、ＮおよびＣＨから選択される］
【請求項４３】
（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉ）の化合物、または（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン、式（Ｉａ）の化合物を調製するための方法であって、
【化１８】
（ｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物を得るための式（２）のニトロンと式（３）のアルケンの１，３−環化付加のステップ、
【化１９】
（ｉｉ）式（４）の４，５−シス−二置換イソオキサゾリジン化合物のＮ−Ｏ結合の還元的切断、および式（５）の３，４−トランス−二置換ピロリジノン化合物を得るためのｉｎ ｓｉｔｕ環化のステップ、
【化２０】
（ｉｉｉ）式（６）の化合物と式（５）の未反応化合物の混合物、または式（６ａ）の化合物と式（５ａ）の未反応化合物の混合物を得るための式（５）の化合物の酵素触媒によるエナンチオ選択的加水分解のステップ、
【化２１】
（ｉｖ）式（６）の化合物の式（５）の化合物からの分離、または式（６ａ）の化合物の式（５ａ）の化合物からの分離のステップ、
（ｖ）式（７）の化合物を得るための式（６）もしくは（５ａ）の化合物の還元、および式（７ａ）の化合物を得るための式（６ａ）もしくは（５）の化合物の還元のステップ、
【化２２】
（ｖｉ）式（Ｉ）の化合物を得るための式（７）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換、または式（Ｉａ）の化合物を得るための式（７ａ）の化合物における水素によるＣＨ２Ｐｈ基の置換のステップ
を含む方法。
【請求項４４】
（ｖｉｉ）式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換であって、
【化２３】
二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルまたは二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルによる式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物の処理による変換のステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉａ）の化合物は、単離されず、ステップ（ｖｉｉ）において、式（Ｉ）の化合物の式（８）の化合物への変換、または式（Ｉａ）の化合物の式（８ａ）の化合物への変換は、ｉｎ ｓｉｔｕで行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１に記載の方法により調製される（３Ｒ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン。
【請求項４７】
請求項１に記載の方法により調製される（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチルピロリジン。
【請求項４８】
請求項３８に記載の方法により調製される請求項３８に定義されている式（ＸＩＩ）の化合物。
【請求項４９】
請求項３８に記載の方法により調製される請求項３８に定義されている式（ＸＩＩａ）の化合物。
【請求項５０】
式（ＩＩＩ）の化合物。
【化２４】
［ここで、Ｒ１は、請求項１で定義した通りである］
【請求項５１】
式（ＩＶ）の化合物。
【化２５】
［ここで、Ｒ１およびＲ２は、請求項１で定義した通りである］
【公開番号】特開２０１２−２１１１３６（Ｐ２０１２−２１１１３６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０８８０１（Ｐ２０１２−１０８８０１）
【出願日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【分割の表示】特願２００７−５１４９６６（Ｐ２００７−５１４９６６）の分割
【原出願日】平成１７年６月３日（２００５．６．３）
【出願人】（５０００８４０１６）インダストリアル リサーチ リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１日（２０１２．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年５月１０日（２０１２．５．１０）
【分割の表示】特願２００７−５１４９６６（Ｐ２００７−５１４９６６）の分割
【原出願日】平成１７年６月３日（２００５．６．３）
【出願人】（５０００８４０１６）インダストリアル リサーチ リミテッド (8)
【Ｆターム（参考）】
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