３型メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ−３）に結合するポリペプチド、組成物および方法
本発明は、ＴＩＭＰ−３結合組成物、こうした組成物を産生する方法、および多様な状態の治療における使用法を含めた、こうした組成物を使用する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、２００９年７月３１日出願の米国仮出願第６１／２３０，４４５号、および２０１０年７月２２日出願の米国仮出願第６１／３６６，７８３号の優先権を主張し、これらの出願は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表についての言及
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２０１０年７月２７日に作成されたＡ−１４８７−ＷＯ−ＰＣＴ Ｓｅｑ Ｌｉｓｔ．ｔｘｔと題されるファイルとして提供されており、サイズは３９．９ＫＢである。配列表の電子形式の情報は、その全体が本明細書に援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般的に、メタロプロテイナーゼ阻害剤に、そして該阻害剤に結合するタンパク質に関する。特に本発明は、メタロプロテイナーゼ３（「ＴＩＭＰ−３」）の組織阻害剤、および該阻害剤が、スカベンジャー受容体低密度リポタンパク質関連タンパク質１（「ＬＲＰ−１」）に結合する能力に関する。
【背景技術】
【０００４】
結合組織および関節軟骨は、細胞外マトリックス合成および分解の反対の影響による動的平衡に維持される。マトリックスの分解は、主に、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびトロンボスポンジン・モチーフを含むディスインテグリン−メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）を含むメタロプロテイナーゼの酵素作用によってもたらされる。これらの酵素は、多くの天然プロセス（発生、形態形成、骨リモデリング、創傷治癒および血管形成を含む）において重要であるが、レベルの上昇は、関節リウマチおよび変形性関節症を含む結合組織の変性疾患、ならびに癌および心臓血管状態において役割を果たすと考えられる。
【０００５】
メタロプロテイナーゼの内因性阻害剤には、血漿アルファ２−マクログロブリンおよびメタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）が含まれ、このうち、ヒトゲノムには４つがコードされることが知られている。ＴＩＭＰ−３は、すべての主な軟骨分解メタロプロテアーゼを阻害し、そして多数の証拠によって、該阻害剤が軟骨を保護することが示される。軟骨外植片に該タンパク質を添加すると、サイトカイン誘導性の分解が防止され、そして関節内に注射すると、変形性関節症のラット内側半月板断裂モデルにおいて、軟骨損傷が減少する。しかし、ＭＭＰ活性の療法的阻害剤としてのＴＩＭＰ−３開発は、ＴＩＭＰ−３の組換え型の産生が困難であり、そして半減期が短いことによって妨げられてきている。
【０００６】
ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ−１）は、プロテイナーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤のホメオスタシスにおける役割を含めて多様な生物学的役割を持つ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体遺伝子ファミリーのメンバーである。ＬＤＬ受容体遺伝子ファミリーの他のメンバーと同様、ＬＲＰ−１の構造は、細胞外ドメインにおける４つの共通の構造単位で形成され、この単位の各々は、さらに、システイン・リッチ反復、および上皮増殖因子受容体様システイン・リッチ反復を含む、より小さい反復ドメインで構成される。このスカベンジャー受容体構造に関するより詳細な情報は、例えば、ＨｅｒｚおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９（２００１）において入手可能である。
【０００７】
ＬＲＰ−１は、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２／ＴＩＭＰ−２複合体のエンドサイトーシス性クリアランスを仲介することが示されてきている（Ｅｍｏｎａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４９４４；２００４）。さらに、ＣａＰＰＳと称される、ブナ材由来の化学的に硫酸化されたキシロピラノースが、ＴＩＭＰ−３の軟骨レベルを増加させることが示されてきている（Ｔｒｏｅｂｅｒｇら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２２：３５１５；２００８）。この効果は、ＬＲＰ−１の一般的な阻害剤であり、やはり培養軟骨細胞培地中のＴＩＭＰ−３のレベルを増加させる受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の効果との類似性のために、ＬＲＰ−１を介したＴＩＭＰ−３のエンドサイトーシスが遮断されるためであると示唆された。。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＨｅｒｚおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９（２００１）
【非特許文献２】Ｅｍｏｎａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４９４４；２００４
【非特許文献３】Ｔｒｏｅｂｅｒｇら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２２：３５１５；２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当該技術分野において、ＴＩＭＰ−３がＬＲＰ−１と直接相互作用するかどうかを決定し、そして十分な正確さで、いかなるこうした相互作用も定義して、ＴＩＭＰ−３生物学的活性におけるＬＲＰ−１およびＴＩＭＰ−３間のいかなる結合の影響の決定も可能にする必要性がある。さらに、ＴＩＭＰ−３の量を増加させるように、こうした相互作用に特異的に作用する、特にＴＩＭＰ−３生物学的活性に不都合に作用することなく上記のように作用することが可能な剤を同定する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＴＩＭＰ−３に結合し、そしてＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害する、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、抗体またはＬＲＰ−１ペプチドであってもよい。１つの側面において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる（すなわちＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に比較的わずかな干渉しか示さない）。
【００１１】
本発明はさらに、ＴＩＭＰ−３に結合し、そしてＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を、ＴＩＭＰ−３と接触させることによって、細胞外マトリックス中のＴＩＭＰ−３を増加させる方法を提供する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、抗体またはＬＲＰ−１ペプチドであってもよい。１つの側面において、請求するＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる（すなわちＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に比較的わずかな干渉しか示さない）。ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＩＭＰ−３をＴＩＭＰ−３結合タンパク質と接触させ；ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＩＭＰ−３とＴＩＭＰ−３結合タンパク質の接触を達成してもよい。
【００１２】
本発明はまた、マトリックス・メタロプロテイナーゼが有害な役割を果たす状態に罹患している哺乳動物を治療する方法であって、ＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法も提供する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、抗体またはＬＲＰ−１ペプチドであってもよい。１つの側面において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる（すなわちＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に比較的わずかな干渉しか示さない）。状態は、炎症、癌、および細胞外マトリックスの過剰な分解によって特徴付けられる状態からなる群より選択可能であり；例えば、状態は変形性関節症および鬱血性心不全からなる群より選択可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＴＩＭＰ−３に結合するポリペプチド、例えば天然存在ポリペプチド（すなわちＬＲＰ−１ポリペプチド）およびその断片、抗ＴＩＭＰ−３抗体、抗体断片、および抗体誘導体に関する組成物、キット、および方法を提供する。やはり提供されるのは、ＴＩＭＰ−３に結合するポリペプチドのすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにその誘導体および断片、例えば、こうしたＴＩＭＰ−３結合タンパク質のすべてまたは一部をコードする核酸、こうした核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにこうした核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞または細胞株である。提供される方法には、例えば、ＴＩＭＰ−３に結合する分子、例えば抗ＴＩＭＰ−３抗体を作製するか、同定するか、または単離する方法、分子がＴＩＭＰ−３に結合するかどうかを決定する方法、分子がＴＩＭＰ−３活性をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズするかどうかを決定する方法、ならびに分子がＴＩＭＰ−３の集積を促進するかどうかを決定する方法が含まれる（例えば、軟骨細胞様細胞または細胞株の培養において、あるいはｅｘ ｖｉｖｏ軟骨外植片において）。
【００１４】
ＴＩＭＰ−３は、哺乳動物において、多様な細胞または組織によって発現され、そして細胞外マトリックスに存在する；こうして発現されるＴＩＭＰ−３は、本明細書において、「内因性」ＴＩＭＰ−３と称される。哺乳動物において、内因性ＴＩＭＰ−３の量を増加させるか、上昇させるかまたは増進させることが好適であろう、多くの状態が存在する。したがって、やはり本明細書において、ＴＩＭＰ−３に結合する分子を含む薬学的組成物などの組成物を作製する方法、およびＴＩＭＰ−３に結合する分子を含む組成物を被験体に投与するための方法、例えばＴＩＭＰ−３の集積を促進することによって、ＴＩＭＰ−３の内因性の量を増加させることによって、細胞に対するＴＩＭＰ−３の結合を阻害することによって、ＴＩＭＰ−３の内在化を減少させることによって、そして／またはＴＩＭＰ−３の生物学的活性をｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでアゴナイズすることによって、状態を治療するための方法も提供する。
【００１５】
標準的１文字または３文字略語を用いて、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を示す。別に示さない限り、各ポリペプチド配列は、左側にアミノ末端および右側にカルボキシ末端を有し；各一本鎖核酸配列、および各二本鎖核酸配列の上部鎖は、左側に５’末端および右側に３’末端を有する。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列はまた、参照配列とどのように異なるかを説明することによっても記載可能である。
【００１６】
本明細書において、別に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学的および技術的用語は、一般の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は複数のものを含み、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して用いられる術語、ならびにそれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用され、そして論じられる、多様な一般的な参考文献およびより特異的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、本明細書に援用される、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、製造者の指定にしたがって行われる。本明細書記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して用いられる専門用語、ならびにこうした化学の実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に知られるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いてもよい。
【００１７】
以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：
用語「単離分子」は（分子が、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）、その起源または派生供給源によって、（１）天然状態で該分子に付随する、天然に会合する構成要素と関連していないか、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）人の介入なしに天然には存在しない分子である。したがって、化学的に合成されたか、または天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成される分子は、天然に関連する構成要素から「単離されている」であろう。分子はまた、当該技術分野に周知の精製技術を用いた単離によって、天然に会合する構成要素を実質的に含まないようにされうる。当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、分子純度または均一性をアッセイしてもよい。例えば、当該技術分野に周知の技術を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、そしてゲルを染色してポリペプチドを視覚化して、ポリペプチド試料の純度をアッセイしてもよい。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは当該技術分野に周知の精製のための他の手段を用いることによって、より高い解像度を提供してもよい。
【００１８】
本明細書記載の「ＴＩＭＰ−３アゴニスト」は、例えば、ＴＩＭＰ−３が１またはそれより多くのメタロプロテイナーゼを阻害する能力を有意に減少させることなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＩＭＰ−３の量（集積）を増加させることによって、ＴＩＭＰ−３の少なくとも１つの機能を検出可能に増加させる分子である。ＴＩＭＰ−３機能の任意のアッセイが使用可能であり、その例を本明細書に提供する。ＴＩＭＰ−３アゴニストによって増加させうるＴＩＭＰ−３機能の例には、ＭＭＰ−１３を含むマトリックス・メタロプロテイナーゼの阻害が含まれる。例えば、ＴＩＭＰ−３アゴニストは、軟骨外植片、または軟骨細胞培養からのＭＭＰ−１３阻害活性を増加させることも可能であり、あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＩＭＰ−３のレベルを増進させ、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏでＭＭＰ−１３阻害活性を増加させることも可能である。ＴＩＭＰ−３アゴニストのタイプの例には、限定されるわけではないが、ＴＩＭＰ−３結合ポリペプチド、例えばＬＲＰ−１由来のポリペプチド、ならびに抗原結合タンパク質（例えばＴＩＭＰ−３抗原結合タンパク質）、抗体、抗体断片、および抗体誘導体が含まれる。
【００１９】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、各々、ペプチド結合によって互いに連結された２またはそれより多いアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば天然および人工的タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質（mutein）、変異体、および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後、あるいは別の共有的または非共有的修飾タンパク質を含む。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、単量体性または多量体性であってもよい。
【００２０】
用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、対応する全長タンパク質に比較した際、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。断片は、例えば、少なくとも長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸であってもよい。断片はまた、例えば、最大で、長さ１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸であってもよい。断片は、さらに、どちらかまたは両方の端に、１またはそれより多いさらなるアミノ酸、例えば異なる天然存在タンパク質（例えばＦｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工的アミノ酸配列（例えば人工的リンカー配列またはタグタンパク質）由来のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２１】
本発明のポリペプチドには、例えば：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティを改変し、（４）結合アフィニティを改変し、そして（４）他の物理化学特性または機能特性を与えるかまたはこうした特性を修正するように、いずれかの方式で、そしていずれかの理由のために修飾されているポリペプチドが含まれる。類似体には、ポリペプチドの突然変異タンパク質が含まれる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を天然存在配列において（例えば、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外のポリペプチドの部分において）行うことも可能である。コンセンサス配列を用いて、置換するアミノ酸残基を選択してもよく；当業者はさらなるアミノ酸残基もまた置換可能であることを認識する。
【００２２】
「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造特徴を実質的に変化させないものである（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを中断させるか、あるいは親配列を特徴付けるかまたはその機能に必要な他のタイプの二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ監修，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎらＮａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載され、これらは各々、本明細書に援用される。
【００２３】
本発明はまた、ＴＩＭＰ−３結合ポリペプチドの非ペプチド類似体も提供する。非ペプチド類似体は、テンプレート・ペプチドのものに類似の特性を持つ薬剤として、薬学的産業において一般的に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」（「peptide mimetics」または「peptidomimetics」）と称され、例えば、本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓらＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）を参照されたい。療法的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、同等の療法効果または予防効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結により、場合によって置換された１またはそれより多いペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１またはそれより多いアミノ酸を、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定なペプチドを生成することも可能である。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む、制約された（constrained）ペプチドを、当該技術分野に知られる方法（本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））によって生成することも可能であり、これは例えば、ペプチドを環化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによる。
【００２４】
ポリペプチド（例えば抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列に比較して、１またはそれより多いアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入され、該配列から欠失し、そして／または該配列内で置換された、アミノ酸配列を含む。本発明の変異体には融合タンパク質が含まれる。
【００２５】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば別の化学部分（例えばポリエチレングリコール、またはアルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど）へのコンジュゲート化、リン酸化、およびグリコシル化を介して、化学的に修飾されているポリペプチド（例えば抗体）である。別に示さない限り、用語「抗体」には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例を以下に記載する。
【００２６】
「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分、および場合によって、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進するコンホメーションを採用するのを可能にする足場またはフレームワーク部分を含む、タンパク質である。抗原結合タンパク質の例には、抗体、抗体断片（例えば抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体類似体が含まれる。抗原結合タンパク質は、例えば移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含む別のタンパク質足場または人工的足場を含むことも可能である。こうした足場には、限定されるわけではないが、例えば抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された突然変異を含む抗体由来足場、ならびに例えば生体適合性ポリマーを含む完全に合成の足場が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，第５３巻，第１号：１２１−１２９；Ｒｏｑｕｅら，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびにフィブロネクチン構成要素を足場として利用する抗体模倣体に基づく足場を使用してもよい。
【００２７】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然存在免疫グロブリンの構造を有することも可能である。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然存在免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一ポリペプチド鎖の対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する、定常領域を明示する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖と分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、そしてそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２またはそれより多いアミノ酸の「Ｊ」領域で連結され、重鎖はまた、約１０またはそれより多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．監修，第２版 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９））（あらゆる目的のため、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、損なわれていない（intact）免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００２８】
天然存在免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結される、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ一般構造を示す。軽鎖および重鎖はどちらも、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，米国保健社会福祉省，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号，１９９１の定義にしたがう。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸に関する他の番号付け系には、ＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系；Ｌｅｆｒａｎｃら，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５−２０３；２００５）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７−６７０；２００１）が含まれる。
【００２９】
多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から、抗体を得てもよい。こうした抗体をアフィニティ精製に供すると、特定の抗原特異性に関して濃縮可能である。抗体のこうした濃縮調製物は、通常、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する、約１０％未満の抗体で構成される。これらの調製物をアフィニティ精製に数回供すると、抗原に関して特異的結合活性を有する抗体の比率を増加させうる。この方式で調製される抗体は、しばしば、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する抗体、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％で構成されうる。
【００３０】
「抗体」は、別に明記しない限り、損なわれていない免疫グロブリン、または特異的結合に関して、損なわれていない抗体と競合する、その抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない抗体の酵素的切断または化学的切断によって、産生可能である。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、可変領域断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに少なくとも、ポリペプチドへの特異的抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリン部分を含有するポリペプチドが含まれる。
【００３１】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；そしてｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、あるいはＶＨまたはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、第６，６９６，２４５号、米国出願公報第０５／０２０２５１２号、第０４／０２０２９９５号、第０４／００３８２９１号、第０４／０００９５０７号、第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）。
【００３２】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えばアミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続タンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖が、それ自体、折り畳まれ、そして一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６およびＨｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照されたい）。ディアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であって、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するのを可能にするにはあまりにも短く、したがって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補ドメインと対形成するのを可能にするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−２３を参照されたい）。ディアボディの２つのポリペプチド鎖が同一であるならば、その対形成から生じるディアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合部位を持つディアボディを作製することも可能である。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、そして、同じであってもまた異なってもよい、それぞれ、３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【００３３】
Ｋａｂａｔら、上記；Ｌｅｆｒａｎｃら、上記および／またはＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記に記載される系を用いて、所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を同定してもよい。１またはそれより多いＣＤＲを共有的または非共有的のいずれかで分子内に取り込んで、抗原結合タンパク質にすることも可能である。抗原結合タンパク質は、より長いポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能であるし、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（単数または複数）を共有結合させることも可能であるし、または非共有的にＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能である。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が、関心対象の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００３４】
抗原結合タンパク質は、１またはそれより多い結合部位を有してもよい。１より多い結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であっても、また異なってもよい。例えば、天然存在ヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一の結合部位を有し、一方、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００３５】
用語「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１またはそれより多い可変領域および定常領域を有する抗体すべてが含まれる。１つの態様において、可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、多様な方法で調製可能であり、その例を以下に記載し、これらには、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾されたマウスの、関心対象の抗原での免疫を通じたものが含まれる。
【００３６】
ヒト化抗体は、ヒト被験体に投与された際、非ヒト種抗体に比較すると、免疫応答を誘導する可能性がより低く、そして／またはより重度でない免疫応答を誘導するように、１またはそれより多いアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって、非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有する。１つの態様において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中の特定のアミノ酸を突然変異させて、ヒト化抗体を産生する。別の態様において、ヒト抗体由来の定常ドメイン（単数または複数）を、非ヒト種の可変ドメイン（単数または複数）に融合させる。別の態様において、非ヒト抗体の１またはそれより多いＣＤＲ配列中の１またはそれより多いアミノ酸残基を変化させて、ヒト被験体に投与された際、非ヒト抗体のありうる免疫原性を減少させ、ここで抗原へのヒト化抗体の結合が、抗原への非ヒト抗体の結合より有意に劣らないように、変化させるアミノ酸残基は、抗原への抗体の免疫特異的結合にそれほど重要でないか、または作製されるアミノ酸配列への変化が保存的変化であるか、いずれかである。ヒト化抗体をどのように作製するかの例を、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および第５，８７７，２９３号に見出すことも可能である。
【００３７】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１またはそれより多い領域および１またはそれより多い他の抗体由来の１またはそれより多い他の領域を含有する抗体を指す。１つの態様において、１またはそれより多いＣＤＲが、ヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体に由来する。別の態様において、すべてのＣＤＲが、ヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体に由来する。別の態様において、１より多いヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体由来のＣＤＲを混合し、そしてキメラ抗体中でマッチングさせる。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第二のヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第三の抗ＴＩＭＰ−３抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含んでもよい。他の組み合わせが可能であり、そして本発明の態様内に含まれる。
【００３８】
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＴＩＭＰ−３抗体の１つに、ヒト抗体などの１またはそれより多い異なる抗体に、またはヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種由来であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する一方、鎖（単数または複数）の残りは、別の種由来であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体（単数または複数）と同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する。やはり含まれるのは、所望の生物学的活性（すなわちＴＩＭＰ−３に特異的に結合する能力）を示す、こうした抗体の断片である。例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７を参照されたい。
【００３９】
「ＬＲＰ−１阻害抗体」は、本明細書において実施例に記載するものなどのアッセイを用いて、過剰な抗ＴＩＭＰ−３抗体が、相互作用の量を、少なくとも約２０％減少させる場合の、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を阻害する抗体である。多様な態様において、抗原結合タンパク質は、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％減少させる。他の態様において、抗原結合タンパク質は、ＴＩＰ−３の集積を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％増加させる。
【００４０】
いくつかのＬＲＰ−１阻害抗体は、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害する可能性もあり、そしてまた、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に干渉する可能性もある。しかし、いくつかのＬＲＰ−１阻害抗体は、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に不都合に影響を及ぼすことなく、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害し；こうした抗体は、本明細書において、「アゴナイズ性」または「アゴニスト性」抗体と称される。アゴニスト性抗体は、一般的に、ＭＭＰ阻害活性の４０％未満、３０％、２０％、１０％、５％、１％、または１％未満の減少を生じるであろう。
【００４１】
抗体の断片または類似体は、本明細書の解説にしたがって、そして当該技術分野に周知の技術を用いて、一般の当業者によって、容易に調製可能である。断片または類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に存在する。公共のまたは私有の（proprietary）配列データベースに、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを比較することによって、構造ドメインおよび機能ドメインを同定することも可能である。コンピュータ比較法を用いて、既知の構造および／または機能を持つ他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定してもよい。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が知られる。例えばＢｏｗｉｅら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照されたい。
【００４２】
「ＣＤＲ移植抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体由来の１またはそれより多いＣＤＲ、および同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。
【００４３】
「多重特異性抗体」は、１またはそれより多い抗原上の１より多いエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体のサブクラスは、同じまたは異なる抗原上の２つの別個のエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。
【００４４】
抗原結合タンパク質は、１ナノモルまたはそれより低い解離定数で、抗原に結合する場合、抗原（例えばヒトＴＩＭＰ−３）に「特異的に結合する」。
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用して、そして抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性およびアフィニティに寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合タンパク質の部分である。抗原に特異的に結合する抗体に関しては、ＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも部分を含むであろう。
【００４５】
「エピトープ」は、抗原結合タンパク質によって（例えば抗体によって）結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分を含んでもよい（例えばポリペプチド中、ポリペプチドの一次配列においては隣接しないが、ポリペプチドの三次構造および四次構造の背景においては、互いに、抗原結合タンパク質によって結合されるのに十分に近い、アミノ酸残基）。エピトープはまた、抗原結合タンパク質以外の結合タンパク質が結合する分子部分を指す際にも使用可能であり、そして同様に、分子の直鎖、連続、または非連続部分も含んでもよい。
【００４６】
タンパク質配列および三次元構造の分析は、多くのタンパク質が、「単量体ドメイン」と称される多くの別個の単位で構成されることを明らかにしてきた。別個の単量体ドメインタンパク質の大部分は細胞外であるか、または膜結合タンパク質の細胞外部分を構成する。
【００４７】
別個の単量体ドメインの重要な特性は、単独で、または何らかの限定された補助をもってフォールディングする能力である。限定された補助には、シャペロニン（単数または複数）（例えば受容体関連タンパク質（ＲＡＰ））の補助が含まれうる。金属イオン（単数または複数）の存在もまた、限定された補助を提供しうる。単独でフォールディングする能力は、新規のタンパク質環境に挿入された際、ドメインのミスフォールディングを防止する。この特性は、別個の単量体ドメインが進化的に可動性であることを可能にしてきた。その結果、別個のドメインは進化中に分散してきており、そして現在、そうでなければ関連しないタンパク質中に存在する。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインおよび免疫グロブリン様ドメインを含むいくつかのドメインが、多くのタンパク質に存在する一方、他のドメインは限定された数のタンパク質中にしか見られない。
【００４８】
これらのドメインを含有するタンパク質は、多様なプロセス、例えば、細胞輸送体、コレステロール移動、発生および神経伝達に関与するシグナル伝達およびシグナル機能に関与する。Ｈｅｒｚ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２４：１９３（２００１）；ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＢｒｏｗｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３１０（２００１）を参照されたい。別個の単量体ドメインの機能は、しばしば、特異的であるが、また、タンパク質またはポリペプチドの全体の活性にも寄与する。例えば、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン（クラスＡモジュール、補体型反復またはＡドメインとも称される）は、リガンド結合に関与する一方、ビタミンＫ依存性血液凝固タンパク質中に見られるガンマ−カルボキシグルタミン酸（gamma-carboxyglumatic acid）（Ｇｌａ）ドメインは、リン脂質膜への高アフィニティ結合に関与する。他の別個の単量体ドメインには、例えば、肝臓細胞への結合を仲介し、そしてそれによって循環からのこの線維素溶解酵素のクリアランスを制御する組織型プラスミノーゲンアクチベーター中の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、および受容体仲介エンドサイトーシスに関与するＬＤＬ受容体の細胞質テールが含まれる。
【００４９】
個々のタンパク質が１またはそれより多い別個の単量体ドメインを所持する可能性もある。これらのタンパク質はしばしばモザイクタンパク質と呼ばれる。例えば、ＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーは、４つの主な構造ドメイン：システイン・リッチＡドメイン反復、上皮増殖因子前駆体様反復、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する。
【００５０】
ＬＤＬ受容体ファミリーには：１）細胞表面受容体であり；２）細胞外リガンドを認識し；そして３）リソソームによる分解のためにこれらを内在化する；メンバーが含まれる。Ｈｕｓｓａｉｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９：１４１（１９９９）を参照されたい。例えば、いくつかのメンバーには、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬ−Ｒ）、アポリポタンパク質Ｅ受容体２、ＬＤＬＲ関連タンパク質（ＬＲＰまたはＬＲＰ−１）およびメガリンが含まれる。ファミリーメンバーは、以下の特性を有する：１）細胞表面発現；２）Ａドメイン反復からなる細胞外リガンド結合；３）リガンド結合のためのカルシウム要求性；４）受容体関連タンパク質およびアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｅの認識；５）ＹＷＴＤ反復を含有する上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体相同性ドメイン；６）単一の膜貫通領域；および７）多様なリガンドの受容体仲介性エンドサイトーシス。Ｈｕｓｓａｉｎ、上記を参照されたい。しかし、メンバーはいくつかの構造的に似ていないリガンドに結合する。
【００５１】
「ＬＲＰ−１ポリペプチド」または「ＬＲＰ−１ペプチド」は、本明細書において、ＬＲＰ−１の断片、例えばＬＲＰ−１の細胞外ドメイン（または「外部ドメイン」）の断片であることによって、ＬＲＰ−１に関連するポリペプチド（またはペプチド）である。ポリペプチドはＬＲＰ−１の１つの（またはそれより多い）リガンド結合クラスターを含んでもよい（例えば、ＨｅｒｚおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ、上記、および本明細書の実施例を参照されたい）。ポリペプチド（またはペプチド）は、リガンド結合クラスターの一部、例えば別個の単量体ドメイン、例えばＡドメインを含んでもよい。ポリペプチドは、さらに、別個の単量体ドメイン、例えばＡドメインの多量体（例えば、二量体または三量体、あるいはより高次の多量体）からなってもよい。多量体には、１より多い構造的に別個の（すなわち異なるアミノ酸配列を有する）単量体ドメインが含まれてもよいし、または単一の単量体ドメインの多数の反復が含まれてもよいし、または多数の反復単量体ドメインおよび構造的に別個のドメインの両方が含まれてもよい。
【００５２】
「ＬＲＰ−１阻害ポリペプチド」は、本明細書において実施例に記載するものなどのアッセイを用いて、過剰なポリペプチドが、相互作用の量を少なくとも約２０％減少させる場合の、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を阻害するポリペプチドである。多様な態様において、ポリペプチドは、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％減少させる。他の態様において、ポリペプチドは、ＴＩＭＰ−３の集積を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％増加させる。
【００５３】
いくつかのＬＲＰ−１阻害ポリペプチドは、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害することも可能であり、そしてまた、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に干渉することも可能である。しかし、いくつかのＬＲＰ−１阻害ポリペプチドは、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に不都合に影響を及ぼすことなく、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害する；こうしたポリペプチドは、本明細書において、「アゴナイズ性」または「アゴニスト性」ポリペプチドと称される。アゴニスト性ポリペプチドは、一般的に、ＭＭＰ阻害活性の４０％未満、３０％、２０％、１０％、５％、１％または１％未満の減少を生じるであろう。
【００５４】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、デフォルト・パラメータを用い、ＧＡＰコンピュータ・プログラム（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の一部）を用いて、配列を比較することによって決定される。
【００５５】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書全体を通じて交換可能に用いられ、そしてＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えばペプチド核酸および非天然存在ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることも可能である。１つの態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードする、隣接オープンリーディングフレームを含む。
【００５６】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップを導入することなく、そしていずれの配列の５’端または３’端にも、対形成しないヌクレオチドを伴わずに、一方のポリヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であるように、逆平行配向で整列可能であるならば、互いに「相補体」である。ポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で、２つのポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能であるならば、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドの相補体であることなく、該ポリヌクレオチドに相補的であることも可能である。
【００５７】
「ベクター」は、連結された別の核酸を、細胞内に導入するために使用可能な核酸である。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、その内部にさらなる核酸セグメントを連結可能な、直鎖または環状二重鎖ＤＮＡ分子を指す。別のタイプのベクターはウイルスベクター（例えば複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に導入可能である。特定のベクターは、導入された宿主細胞において、自律的に複製可能である（例えば細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）を組み込んで、そしてそれによって宿主ゲノムと一緒に複製させる。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を指示することも可能なベクターのタイプである。
【００５８】
ヌクレオチド配列は、制御配列が該ヌクレオチド配列の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼすならば、該制御配列に「機能可能であるように連結されて」いる。「制御配列」は、機能可能であるように連結されている核酸の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼす核酸である。制御配列は、例えば、制御される核酸に対して直接、あるいは１またはそれより多い他の分子（例えば制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を発揮する。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ、およびＢａｒｏｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載される。
【００５９】
「宿主細胞」は、核酸、例えば本発明の核酸を発現するために使用可能な細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよいし、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母（yeast）または他の真菌）、植物細胞（例えばタバコ（tobacco）またはトマト（tomato）植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのその誘導体および血清不含培地中で増殖する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−２０を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル（African green monkey）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１を参照されたい）、ヒト胚性腎細胞、例えば２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。典型的には、宿主細胞は、その後、宿主細胞で発現可能なポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクションされることが可能な培養細胞である。句「組換え宿主細胞」を用いて、発現しようとする核酸で形質転換されているかまたはトランスフェクションされている宿主細胞を示すことも可能である。宿主細胞はまた、核酸を含むが、機能可能であるように核酸と連結されるように制御配列が宿主細胞に導入されない限り、所望のレベルで該核酸を発現しない細胞であってもよい。用語、宿主細胞は、特定の対象の細胞だけでなく、こうした細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、突然変異または環境的影響によって、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、なお、本明細書において、この用語の範囲内に含まれる。
【００６０】
抗原結合タンパク質
１つの側面において、本発明は、ＴＩＭＰ−３、例えばヒトＴＩＭＰ−３に結合する、抗原結合タンパク質（例えば抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、および抗体変異体）を提供する。
【００６１】
異なる抗原結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３の異なるドメインまたはエピトープに結合するか、あるいは異なる作用機構によって作用することも可能である。例には、限定されるわけではないが、ＴＩＭＰ−３がＬＲＰ−１に結合する能力に干渉するか、またはＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力を阻害する、抗原結合タンパク質が含まれる。さらなる例には、ＴＩＭＰ−３がＬＲＰ−１に結合する能力に干渉するが、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力を阻害しない抗原結合タンパク質（すなわちＴＩＭＰ−３アゴニスト）が含まれる。特定の疾患を治療する際のＴＩＭＰ−３結合性抗原結合タンパク質の特定の作用機構の本明細書の考察は、例示のみであり、そして本明細書に提示する方法は、それに束縛されない。
【００６２】
本発明の範囲内の抗ＴＩＭＰ−３抗体の他の誘導体には、抗ＴＩＭＰ−３抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなどの、他のタンパク質またはポリペプチドとの抗ＴＩＭＰ−３抗体またはその断片の共有または凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであってもよい。抗原結合タンパク質を含有する融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製または同定を促進するために付加されるペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含んでもよい。また、抗原結合タンパク質を、Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるような、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２）に連結してもよい。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは、非常に抗原性であり、そして特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドが所定のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）。
【００６３】
１またはそれより多い抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーをＴＩＭＰ−３アゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合したまたは非共有結合した、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形であることも可能である。２またはそれより多い抗原結合タンパク質を含むオリゴマーが使用のために意図され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
【００６４】
１つの態様は、抗原結合タンパク質に融合したペプチド部分間の共有相互作用または非共有相互作用を介して連結された、多数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーに向けられる。こうしたペプチドは、ペプチド・リンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、ロイシンジッパー、および抗体由来の特定のポリペプチドが、それに付着した抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進可能なペプチドの中にある。
【００６５】
特定の態様において、オリゴマーは、２〜４の抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、上述の型のいずれか、例えば変異体または断片などの、いかなる型であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＴＩＭＰ−３結合活性を有する、抗原結合タンパク質を含む。
【００６６】
１つの態様において、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら，１９９２“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，補遺４，１０．１９．１−１０．１９．１１ページによって記載されてきている。
【００６７】
本発明の１つの態様は、抗ＴＩＭＰ−３抗体のＴＩＭＰ−３結合断片を、抗体のＦｃ領域に融合させることによって生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられる。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、遺伝子融合体を発現させ、そして発現された融合タンパク質を抗体分子とそっくりに集合させて、その際、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にして、二量体を生じることによって、作製可能である。
【００６８】
用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書において、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型および突然変異タンパク質型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除（truncated）型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製が容易であるという利点を提供する。
【００６９】
１つの適切なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少したアフィニティを示す。
【００７０】
他の態様において、抗ＴＩＭＰ−３抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分に対して置換してもよい。
あるいは、オリゴマーは、ペプチド・リンカー（スペーサー・ペプチド）を含むかまたは含まない、多数の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチド・リンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
【００７１】
オリゴマー性抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、そして以来、多様な異なるタンパク質で発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例が、本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され、そして肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Ｈｏｐｐｅら，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載される。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合した抗ＴＩＭＰ−３抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞において発現させて、そして形成される可溶性オリゴマー性抗ＴＩＭＰ−３抗体断片または誘導体を、培養上清から回収する。
【００７２】
１つの側面において、本発明は、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合に干渉する抗原結合タンパク質を提供する。ＴＩＭＰ−３、あるいはその断片、変異体または誘導体に対して、こうした抗原結合タンパク質を作製し、そしてＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合に干渉する能力に関して、慣用的なアッセイでスクリーニングしてもよい。適切なアッセイの例は、本明細書に開示され、そしてこれには、例えば培養中またはｅｘ ｖｉｖｏで、ＬＲＰ−１への結合を阻害する能力に関して、抗原結合タンパク質を試験するアッセイ、またはＴＩＭＰ−３の量を増加させる能力に関して、抗原結合タンパク質を試験するアッセイが含まれる。抗原結合タンパク質を試験する、さらなるアッセイには、ＴＩＭＰ−３ポリペプチドへの既知の抗原結合タンパク質の結合に対して、ＴＩＭＰ−３ポリペプチドへの抗原結合タンパク質の結合を、定性的にまたは定量的に比較するものが含まれ、そのいくつかの例を本明細書に開示する。
【００７３】
別の側面において、本発明は、種選択性を示す抗原結合タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合タンパク質は、１またはそれより多い哺乳動物ＴＩＭＰ−３に、例えばヒトＴＩＭＰ−３に、そしてマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ（gerbil）、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＴＩＭＰ−３の１またはそれより多くに結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、１またはそれより多い霊長類ＴＩＭＰ−３に、例えば、ヒトＴＩＭＰ−３に、そしてカニクイザル（cynomologus）、マーモセット（marmoset）、アカゲザル（rhesus）、タマリン（tamarin）およびチンパンジー（chimpanzee）ＴＩＭＰ−３の１またはそれより多くに結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、タマリンまたはチンパンジーＴＩＭＰ−３に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＴＩＭＰ−３の１またはそれより多くに結合しない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、マーモセットなどの新世界ザル種には結合しない。
【００７４】
別の態様において、抗原結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、哺乳動物ＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、霊長類ＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、非ヒト霊長類、カニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３に、類似の結合アフィニティで、特異的に結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、非ヒト霊長類、カニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３の活性を遮断する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載するようなアッセイにおいて、非ヒト霊長類、カニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３に対して、類似のＩＣ５０またはＥＣ５０を有する。
【００７５】
当該技術分野に周知の方法を用いて、そして本明細書の解説にしたがって、ＴＩＭＰ−３に対する抗原結合タンパク質の選択性を測定してもよい。例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを用いて、選択性を測定してもよい。
【００７６】
慣用的技術によって、本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合断片を産生してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子操作技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた意図される。
【００７７】
さらなる態様には、キメラ抗体、例えば非ヒト（例えばネズミ）モノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。既知の技術によって、こうしたヒト化抗体を調製してもよく、そしてこうした抗体は、ヒトに投与された際、免疫原性が減少しているという利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変ドメイン（あるいはその抗原結合部位のすべてまたは一部）およびヒト抗体由来の定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変ドメイン断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。キメラ抗体およびさらに操作されたモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，Ｌｉｕら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９，Ｌａｒｒｉｃｋら，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，およびＷｉｎｔｅｒら，１９９３，ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されるものが含まれる。１つの態様において、キメラ抗体はＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化するための技術は、例えば米国特許出願第１０／１９４，９７５号（２００３年２月２７日公開）、米国特許第５，８６９，６１９号、第５，２２５，５３９号、第５，８２１，３３７号、第５，８５９，２０５号、Ｐａｄｌａｎら，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−３９，およびＴａｍｕｒａら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２−４１に論じられる。
【００７８】
非ヒト動物において、ヒト抗体または部分的ヒト抗体を生成するための方法が開発されてきている。例えば、１またはそれより多い内因性免疫グロブリン遺伝子が、多様な手段によって不活性化されたマウスが用意されてきている。ヒト免疫グロブリン遺伝子が該マウスに導入され、不活性化されたマウス遺伝子が置換されている。該動物において産生される抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質にコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を取り込む。１つの態様において、ＴＩＭＰ−３ポリペプチドに対して向けられる抗体がトランスジェニックマウスなどの非ヒト動物において生成されるように、該動物をＴＩＭＰ−３ポリペプチドで免疫する。適切な免疫原の一例は、ＴＩＭＰ−３のＬＲＰ−１結合ドメインを含むポリペプチドなどの可溶性ヒトＴＩＭＰ−３、または他の免疫原性断片ＴＩＭＰ−３である。適切な免疫原の別の例は、高レベルのＴＩＭＰ−３を発現している細胞、または該細胞に由来する細胞膜調製物である。
【００７９】
ヒト抗体または部分的ヒト抗体の産生用のトランスジェニック動物の産生および使用のための技術の例が、米国特許第５，８１４，３１８号、第５，５６９，８２５号、および第５，５４５，８０６号、Ｄａｖｉｓら，２００３，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，”Ｌｏ監修 Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ：１９１−２００，Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら，２００２，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−９７，Ｒｕｓｓｅｌら，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６８：１８２０−２６，Ｇａｌｌｏら， ２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４−４０，Ｄａｖｉｓら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８：４２１−２５，Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１：１１−２３，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ３１：３３−４２，Ｇｒｅｅｎら，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ．７：６０７−１４，Ｔｓｕｄａら，１９９７，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４２：４１３−２１，Ｍｅｎｄｅｚら，１９９７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．４：７６１−６３，Ａｒｂｏｎｅｓら，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１：２４７−６０，Ｇｒｅｅｎら，１９９４，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５−５８，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：２５５１−５５．Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら １９９３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：６４７−６５６，Ｃｈｏｉら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−２３，Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１，Ｈａｒｄｉｎｇら，１９９５，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９，Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ中１１３：４９−１０１，Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９５，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８２６，Ｔａｙｌｏｒら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−９５，Ｔａｙｌｏｒら，１９９４，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５７９−９１，Ｔｏｍｉｚｕｋａら，１９９７，Ｎａｔ Ｇｅｎ １６：１３３−４３，Ｔｏｍｉｚｕｋａら，２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：７２２−２７，Ｔｕａｉｌｌｏｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−２４，およびＴｕａｉｌｌｏｎら，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：２９１２−２０に記載される。これらの例および他の例はまた、米国特許出願公報２００７−００９８７１５、２００７年５月３日公開に論じられる。
【００８０】
別の側面において、本発明は、ＴＩＭＰ−３に結合するモノクローナル抗体を提供する。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、免疫スケジュールの完了後に、トランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生してもよい。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、脾臓細胞を不死化してもよい。ハイブリドーマを産生する融合法で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖することが不可能であるようにする酵素不全を有する。マウス融合体で使用するのに適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが含まれ；ラット融合体で使用する細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【００８１】
１つの態様において、動物（例えばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＴＩＭＰ−３免疫原で免疫し；免疫した動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、そしてＴＩＭＰ−３ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株を産生する。こうしたハイブリドーマ細胞株、およびこれらに産生される抗ＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体が、本発明に含まれる。
【００８２】
当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、ハイブリドーマ細胞株に分泌されるモノクローナル抗体を精製してもよい。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、ＴＩＭＰ−３が誘導する活性を遮断する能力などの、特定の特性を持つｍＡｂを同定してもよい。こうしたスクリーニングの例を以下の実施例に提供する。
【００８３】
また、遺伝子免疫と称されるプロセスを用いて、モノクローナル抗体を産生してもよい。例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスベクターなど）内に、関心対象の抗原をコードする核酸を取り込んでもよい。次いで、生じたベクターを用いて、適切な宿主動物（例えば、非肥満糖尿病またはＮＯＤマウス）において、関心対象の抗原に対する免疫応答を発展させる。この技術は、Ｒｉｔｔｅｒら，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ１６（１）：３−１０（２００２）に実質的に記載され、該文献の開示は本明細書に援用される。
【００８４】
１つの側面において、本発明は、本発明の抗ＴＩＭＰ−３抗体の抗原結合断片を提供する。こうした断片は、完全に抗体由来配列からなってもよいし、またはさらなる配列を含んでもよい。抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が含まれる。他の例が、Ｌｕｎｄｅら，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６に提供される。
【００８５】
アミノ酸架橋（短いペプチド・リンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結して、単一ポリペプチド鎖を生じることによって、一本鎖抗体を形成してもよい。こうした一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメイン・ポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチド・リンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって、調製されてきている。２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、生じるポリペプチドは、それ自体、折り畳まれて、抗原結合性単量体を形成することも可能であるし、または多量体（例えば二量体、三量体、または四量体）を形成することも可能である（Ｋｏｒｔｔら，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することも可能である（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体産生のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９；Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４，ｄｅ Ｇｒａａｆら，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載されるものが含まれる。
【００８６】
本発明の抗原結合タンパク質（例えば抗体、抗体断片、および抗体誘導体）は、当該技術分野に知られる定常領域いずれを含んでもよい。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒト・カッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域、例えばヒト・アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域であってもよい。１つの態様において、軽鎖または重鎖定常領域は、天然存在定常領域の断片、誘導体、変異体、または突然変異タンパク質である。
【００８７】
関心対象の抗体から、異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を得るための技術、すなわちサブクラス・スイッチングが知られる。したがって、例えば、ＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体を得ることも可能であり、そして逆も可能である。こうした技術は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を所持するが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性もまた示す、新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードする、クローニングされたＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを、こうした方法において使用してもよい。Ｌａｎｔｔｏら，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６もまた参照されたい。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、本明細書に援用される、Ｂｌｏｏｍら，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７に記載されるようなヒンジ領域中の点突然変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均一性を導きうる、Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減することが望ましい可能性もまたある。
【００８８】
さらに、異なる特性（すなわち結合する抗原に対する多様なアフィニティ）を有する抗原結合タンパク質を得るための技術もまた知られる。チェインシャッフリング（chain shuffling）と呼ばれる１つのこうした技術は、糸状バクテリオファージの表面上に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイすることを伴い、しばしばファージ・ディスプレイと呼ばれる。チェインシャッフリングは、Ｍａｒｋｓら，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に記載されるように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高アフィニティ抗体を調製するのに用いられてきている。
【００８９】
抗体結合部位の中央の相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化もまた、増加したアフィニティを持つ抗体、例えばＳｃｈｉｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１に記載されるように、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対して増加したアフィニティを有する抗体を単離するのに用いられてきている。したがって、こうした技術は、ＴＩＭＰ−３に対する抗体を調製する際に有用である。
【００９０】
１つの態様において、本発明はＴＩＭＰ−３からの低い解離定数を有する抗原結合タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合タンパク質は、１００ｐＭまたはそれより低いＫｄを有する。別の態様において、Ｋｄは１０ｐＭまたはそれより低く；別の態様において、５ｐＭまたはそれより低く、あるいは１ｐＭまたはそれより低い。別の態様において、Ｋｄは、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じである。別の態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じＫｄで、ＴＩＭＰ−３に結合する。
【００９１】
本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質、例えば、２つの異なる抗原結合部位または領域を介して、ＴＩＭＰ−３の２つの異なるエピトープに、またはＴＩＭＰ−３のエピトープおよび別の分子のエピトープに結合する、抗原結合タンパク質をさらに提供する。さらに、本明細書に開示するような二重特異性抗原結合タンパク質は、他の刊行物に言及して、本明細書に記載するものを含めて、本明細書に記載する抗体の１つ由来のＴＩＭＰ−３結合部位および本明細書に記載する別の抗体由来の第二のＴＩＭＰ−３結合領域を含むことも可能である。あるいは、二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する抗体の１つに由来する抗原結合部位、および当該技術分野に知られる別のＴＩＭＰ−３抗体由来、あるいは既知の方法または本明細書に記載する方法によって調製される抗体由来の第二の抗原結合部位を含んでもよい。
【００９２】
二重特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして２００１年４月２０日出願の米国特許出願０９／８３９，６３２（本明細書に援用される）に論じられる。こうした方法には、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７、および他のもの（米国特許第４，４７４，８９３号、米国特許第６，１０６，８３３号）に記載されるようなハイブリッド−ハイブリドーマの使用、ならびに抗体断片の化学的カップリングの使用（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１；Ｇｌｅｎｎｉｅら，１９８７，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７；米国特許第６，０１０，９０２号）が含まれる。さらに、例えばロイシンジッパー部分（すなわち、優先的にヘテロ二量体を形成する、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のもの；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１４８：１５４７）または米国特許第５，５８２，９９６号に記載されるような、他の錠前および鍵の相互作用ドメイン構造を用いることによって、組換え手段を介して、二重特異性抗体を産生可能である。さらなる有用な技術には、Ｋｏｒｔｔら、１９９７、上記；米国特許第５，９５９，０８３号；および米国特許第５，８０７，７０６号に記載されるものが含まれる。
【００９３】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質に関する使用
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３を発現する細胞の存在を検出するアッセイにおいて使用可能である。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質はまた、イムノアフィニティクロマトグラフィーによってＴＩＭＰ−３タンパク質を精製する際にも使用可能である。ＬＲＰ−１およびＴＩＭＰ−３の相互作用をさらに遮断することも可能なＴＩＭＰ−３結合タンパク質を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＩＭＰ−３の集積を増加させ、そして／またはＴＩＭＰ−３の内因性レベルを増進することも可能である。ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に不都合に影響を与えることなく、ＴＩＭＰ−３の集積を増加させるＴＩＭＰ−３結合タンパク質（すなわちＴＩＭＰ−３アゴニストとして）を用いて、ＴＩＭＰ−３の生物学的活性を増加させることも可能である。ＴＩＭＰ−３アゴニストとして機能するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を、限定されるわけではないが、炎症状態を含む、より高いレベルのＴＩＭＰ−３活性が望ましい任意の状態（すなわち、ＭＭＰ、および／またはＴＩＭＰ−３によって阻害される他のプロテイナーゼが役割を果たす状態）を治療する際に使用してもよい。１つの態様において、こうした状態を治療する際に、トランスジェニックマウスの免疫を伴う方法によって生成されるヒト抗ＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体を使用する。
【００９４】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用してもよく、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与して、ＴＩＭＰ−３の集積を増加させ、ＴＩＭＰ−３の内因性レベルを上昇させ、そして／またはＴＩＭＰ−３が誘導する生物学的活性を増進させてもよい。このようにして、その例が本明細書に提供される、ＴＩＭＰ−３阻害可能プロテイナーゼによって引き起こされるかまたは悪化させられる（直接または間接的に）障害を、治療してもよい。１つの態様において、本発明は、ＴＩＭＰ−３が誘導する生物学的活性を増加させるのに有効な量で、その必要がある哺乳動物に、アゴニスト性ＴＩＭＰ−３結合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与する工程を含む療法を提供する。別の態様において、本発明は、ＴＩＭＰ−３の内因性レベルを上昇させるのに有効な量で、その必要がある哺乳動物に、アゴニスト性ＴＩＭＰ−３結合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与する工程を含む療法を提供する。
【００９５】
本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質には、部分的ヒトおよび完全ヒト・モノクローナル抗体、ならびにＬＲＰ−１ポリペプチドまたはペプチドが含まれる。１つの態様は、ＴＩＭＰ−３の活性を少なくとも部分的にアゴナイズする、ヒト・モノクローナル抗体に向けられる。１つの態様において、ＴＩＭＰ−３免疫原でトランスジェニックマウスを免疫することによって、抗体を生成する。別の態様において、免疫原は、ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプチド（例えばＴＩＭＰ−３を発現するよう形質転換またはトランスフェクションされた細胞、あるいはＴＩＭＰ−３を天然に発現する細胞）である。こうした免疫マウスから得られるハイブリドーマ細胞株であって、ＴＩＭＰ−３に結合するモノクローナル抗体を分泌する、前記ハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に提供する。
【００９６】
ヒト抗体、部分的ヒト抗体、またはヒト化抗体は、多くの適用、特にヒト被験体への抗体の投与を伴うものに適切であろうが、特定の適用には、他のタイプの抗体が適切であろう。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えばカニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えばチンパンジー）など）などの抗体産生動物いずれに由来してもよい。
【００９７】
本発明の非ヒト抗体を、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養に基づく適用、あるいは本発明の抗体に対する免疫応答が起こらないか、重要でないか、防止可能であるか、それに関する懸念がないか、またはそれが望ましい、他の適用いずれかにおいて、使用してもよい。１つの態様において、本発明の非ヒト抗体を、非ヒト被験体に投与する。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体において、免疫応答を誘発しない。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体と同じ種由来であり、例えば本発明のマウス抗体をマウスに投与する。
【００９８】
特定の種由来の抗体を、例えば、その種の動物を所望の免疫原（例えばＴＩＭＰ−３を発現している細胞、または可溶性ＴＩＭＰ−３ポリペプチド）で免疫するか、またはその種の抗体を生成するための人工的系（例えば特定の種の抗体を生成するための細菌またはファージ・ディスプレイに基づく系）を用いることによって、あるいは例えば抗体の定常領域を他の種由来の定常領域で置換することにより、１つの種由来の抗体を別の種由来の抗体に変換することによって、あるいは他の種由来の抗体の配列により緊密に似るように、抗体の１またはそれより多いアミノ酸残基を置換することによって、作製してもよい。１つの態様において、抗体は、２またはそれより多い異なる種由来の抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
【００９９】
いくつかの慣用的技術のいずれによって、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を調製してもよい。例えば、当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、天然に該タンパク質を発現する細胞から精製してもよいし（例えば抗体を産生するハイブリドーマから抗体を精製してもよい）、または組換え発現系で産生してもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【０１００】
当該技術分野に知られるいかなる発現系を用いて、本発明の組換えポリペプチドを作製してもよい。一般的に、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで、宿主細胞を形質転換する。使用可能な宿主細胞の中には、原核生物、酵母またはより高次の真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（bacilli）が含まれる。より高次の真核細胞には、昆虫細胞および哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に記載されるような、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク，１９８５）に記載される。
【０１０１】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で形質転換細胞を培養し、そして慣用的なタンパク質精製法によってポリペプチドを回収してもよい。１つのこうした精製法には、例えば結合したＴＩＭＰ−３のすべてまたは一部を有するマトリックス上での、アフィニティクロマトグラフィーの使用が含まれる。本明細書において使用が意図されるポリペプチドには、混入する内因性物質を実質的に含まない、実質的に均質な組換え哺乳動物ＴＩＭＰ−３結合ポリペプチドが含まれる。
【０１０２】
いくつかの既知の技術のいずれによって、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を調製し、そして所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。特定の技術は、関心対象のＴＩＭＰ−３結合タンパク質（例えば抗ＴＩＭＰ−３抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離し、そして組換えＤＮＡ技術を通じて核酸を操作することを伴う。核酸を、関心対象の別の核酸に融合させるか、または改変して（例えば突然変異誘発または他の慣用的技術によって）、例えば、１またはそれより多いアミノ酸残基を付加するか、欠失させるか、または置換してもよい。
【０１０３】
１つの側面において、本発明は、例えばＴＩＭＰ−３の集積を増加させるかまたは内因性ＴＩＭＰ−３のレベルを上昇させることによって、ＴＩＭＰ−３の活性をアゴナイズするＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じ量で、ＴＩＭＰ−３の活性をアゴナイズする。
【０１０４】
１つの態様において、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３に対して１０００ｐＭまたはそれより低い見かけのアフィニティを有する。他の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、５００ｐＭまたはそれより低い、２００ｐＭまたはそれより低い、１００ｐＭまたはそれより低い、あるいは８０ｐＭまたはそれより低い、見かけのアフィニティを示す。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体またはＬＲＰペプチドのものと実質的に同じ見かけのアフィニティを示す。
【０１０５】
別の態様において、本発明は、ＴＩＭＰ−３への結合に関して、本明細書に開示するＴＩＭＰ−３結合タンパク質と競合するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。当該技術分野に周知の方法によって、例えばＥＬＩＳＡなどのアッセイにおけるＴＩＭＰ−３への結合における競合によって、または本明細書に記載する別のアッセイにおける競合によって、こうした競合能を決定してもよい。１つの側面において、ＴＩＭＰ−３への結合に関して、本明細書に開示するポリペプチドと競合するＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、該ポリペプチドと同じエピトープまたは重複する（または隣接する）エピトープに結合する。別の側面において、ＴＩＭＰ−３への結合に関して、本明細書に開示するポリペプチドと競合するＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３の活性をアゴナイズする。
【０１０６】
別の側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えばヒト被験体に投与した際）、少なくとも１日の半減期を有するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。１つの態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、４日またはそれより長い半減期を有する。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、８日またはそれより長い半減期を有する。別の態様において、非誘導体化または非修飾ＴＩＭＰ−３結合タンパク質に比較した際、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質が、より長い半減期を有するように、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を誘導体化するかまたは修飾する。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、本明細書に援用される、２０００年２月２４日公開のＷＯ ００／０９５６０に記載されるような、血清半減期を増加させる１またはそれより多い点突然変異を含有する。
【０１０７】
別の側面において、本発明のポリペプチド（抗原結合タンパク質を含む）は、ポリペプチドの誘導体を含む。誘導体化ポリペプチドは、特定の使用における半減期増加など、ポリペプチドに望ましい特性を与える分子または物質いずれかを含んでもよい。誘導体化ポリペプチドは、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば放射性、比色、抗原性または酵素性分子、検出可能ビーズ（磁気ビーズまたは電子密度が高い（electrodense）（例えば金）ビーズなど）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン））、療法または診断部分（例えば放射性、細胞傷害性、または薬学的活性部分）、あるいは特定の使用（例えばヒト被験体などの被験体への投与、あるいは他のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用）のためのポリペプチドの適合性を増加させる分子を含むことも可能である。１つのこうした例において、例えばＷＯ２００８０６３２９１および／またはＲｏｔｈｅｎｆｌｕｈら，ＮａｔｕｒｅＭａｔｅｒｉａｌｓ ７：２４８（２００８）に開示されるように、関節軟骨組織に特異的に結合するリガンドで、ポリペプチドを誘導体化する。
【０１０８】
ポリペプチドを誘導体化するのに使用可能な分子の例には、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。当該技術分野に周知の技術を用いて、ポリペプチドのアルブミン連結誘導体およびＰＥＧ化誘導体を調製することも可能である。１つの態様において、ポリペプチドをトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体にコンジュゲート化するかまたは別の方式で連結させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン（pyurrolidone））、ポリエチレングリコール、プロプロピレン（propropylene）グリコール・ホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレン・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学薬品で化学的に修飾してもよい（米国特許出願第２００３０１９５１５４号）。
【０１０９】
別の側面において、本発明は、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質を用いて、ＴＩＭＰ−３に結合する分子に関してスクリーニングする方法を提供する。いかなる適切なスクリーニング技術を用いてもよい。１つの態様において、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質が結合するＴＩＭＰ−３分子またはその断片を、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質および別の分子と接触させ、ここで、他の分子が、ＴＩＭＰ−３へのＴＩＭＰ−３結合タンパク質の結合を減少させるならば、該分子はＴＩＭＰ−３に結合する。適切な方法いずれか、例えばＥＬＩＳＡを用いて、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質の結合を検出してもよい。ＴＩＭＰ−３へのＴＩＭＰ−３結合タンパク質の結合の検出は、上に論じるように、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を検出可能に標識することによって、単純化可能である。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合分子をさらに分析して、ＴＩＭＰ−３活性をアゴナイズする（すなわちＴＩＭＰ−３の集積を増加させ、そして／またはＴＩＭＰ−３の内因性レベルを増進する）かどうかを決定する。
【０１１０】
組成物
やはり本発明に含まれるのは、本発明のポリペプチド産物の有効量を、ＴＩＭＰ−３療法（すなわち、ＴＩＭＰ−３の内因性レベルの増加が有用である状態）において有用な、薬学的に許容されうる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと一緒に含む薬学的組成物である。こうした組成物には、多様な緩衝液内容物（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）および膨張性物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加剤；タンパク質へのポリエチレングリコールなどのポリマーの共有結合（上に論じるとおり、例えば本明細書に援用される米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物への、またはリポソーム内への物質の取り込みが含まれる。こうした組成物は、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。例えば、本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン １８０４２）１４３５−１７１２ページを参照されたい。
【０１１１】
一般的に、レシピエントの年齢、体重および状態または疾患の重症度によって、本発明のポリペプチドの有効量を決定する。本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，上記，６９７−７７３ページを参照されたい。典型的には、約０．００１ｇ／ｋｇ体重〜約１ｇ／ｋｇ体重の間の投薬量を用いてもよいが、当業者が認識するであろうように、より多い量またはより少ない量を用いてもよい。局部（すなわち非全身性）適用、例えば局所または関節内適用に関しては、投薬量は、約０．００１ｇ／ｃｍ２〜約１ｇ／ｃｍ２の間であってもよい。投薬は、毎日１回またはそれより多いか、またはより少ない頻度であってもよく、そして本明細書に記載するような他の組成物と組み合わせてもよい。本発明が本明細書に言及する投薬量に限定されないことに注目すべきである。
【０１１２】
関連分野で理解されるように、本発明の分子を含む薬学的組成物を、適応症に適した方式で、被験体に投与する。限定されるわけではないが、非経口、局所、または吸入によるものを含む、いかなる適切な技術によって、薬学的組成物を投与してもよい。注射する場合、薬学的組成物を、例えば、動脈内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射によって、あるいは連続注入によって、投与してもよい。局在化投与、例えば疾患部位または傷害部位での投与が意図され、経皮送達および移植物からの持続放出も同様である。吸入による送達には、例えば、鼻または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル型での吸入等が含まれる。他の代替物には、点眼剤；丸剤、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製物；ならびにローション、ジェル、スプレー、および軟膏などの局所調製物が含まれる。
【０１１３】
細胞外マトリックスおよび組織の動的平衡を維持するため、複数の剤が協調して作用する。平衡が歪んだ状態の治療において、１またはそれより多い他の剤を本発明のポリペプチドと組み合わせて用いてもよい。これらの他の剤を同時投与するか、または連続して投与するか、あるいはその組み合わせで投与してもよい。一般的に、これらの他の剤は、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、マトリックス分解酵素阻害剤、細胞内酵素、細胞接着調節剤、ならびに細胞外マトリックス分解プロテイナーゼおよびその阻害剤の発現を制御する因子からなるリストから選択されてもよい。特定の例を以下に列挙するが、当業者は、さらなる剤、または列挙する剤の他の形（例えば合成的に産生されるもの、組換えＤＮＡ技術を介するもの、ならびにその類似体および誘導体など）を含めて、同等の機能を実行する他の剤を認識するであろう。
【０１１４】
細胞外マトリックス分解の増加またはより特異的な防止が望ましい場合、他の分解阻害剤もまた用いてもよい。アルファ２マクログロブリン、妊娠性血漿タンパク質、オボスタチン、アルファ１−プロテイナーゼ阻害剤、アルファ２−抗プラスミン、アプロチニン、プロテアーゼ・ネキシン−１、プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤（ＰＡＩ）−１、ＰＡＩ−２、ＴＩＭＰ−１、およびＴＩＭＰ−２からなる群より阻害剤を選択してもよい。当業者が認識するであろうように、他のものを用いてもよい。
【０１１５】
細胞内酵素もまた、本発明のポリペプチドと組み合わせて使用可能である。細胞内酵素もまた、細胞外マトリックス分解に影響を及ぼす可能性もあり、そしてこれには、リソソーム（lysozomal）酵素、グリコシダーゼおよびカテプシンが含まれる。
【０１１６】
細胞接着調節剤もまた、本発明のポリペプチドと組み合わせてもよい。例えば、本発明のポリペプチドを用いて、細胞外マトリックス分解の阻害前、阻害中、または阻害後に、細胞外マトリックスへの細胞接着を調節しようと望む可能性もある。細胞外マトリックスへの細胞接着を示してきた細胞には、破骨細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、キラーＴ細胞およびマスト細胞が含まれる。細胞接着調節剤には、「ＲＧＤ」モチーフを含有するペプチド、あるいは類似体または模倣体アンタゴニストまたはアゴニストが含まれる。
【０１１７】
細胞外マトリックス分解プロテイナーゼの発現を制御する因子およびその阻害剤には、サイトカイン、例えばＩＬ−１およびＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、グルココルチコイド、およびレチノイドが含まれる。望ましい効果が、こうした細胞性効果と組み合わせて、本発明のポリペプチドを用いて、細胞外マトリックスの分解を阻害することである場合、細胞増殖および／または分化を達成する他の増殖因子もまた、用いてもよい。例えば、炎症中、細胞外マトリックスの維持（酵素活性の阻害を介して）が望ましいが、好中球の産生が望ましい可能性もある；したがって、Ｇ−ＣＳＦを投与してもよい。他の因子には、エリスロポエチン、インターロイキン・ファミリーメンバー、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ＦＧＦファミリーメンバー、例えばＫＧＦ、ＰＤＧＦ、および他のものが含まれる。インターフェロン、例えばインターフェロン・アルファ、ベータ、ガンマ、またはコンセンサス・インターフェロンの活性がさらに望ましい可能性もある。細胞内剤には、Ｇタンパク質、プロテインキナーゼＣおよびイノシトール・ホスファターゼが含まれる。本発明のポリペプチドの使用は、炎症療法に関与する１またはそれより多い剤を伴って、療法的利点を提供しうる。
【０１１８】
細胞輸送剤もまた使用可能である。例えば、炎症は、細胞外マトリックスの分解、ならびに傷害部位への細胞の移動または輸送を伴う。細胞外マトリックス分解の防止は、こうした細胞輸送を防止しうる。したがって、本発明のポリペプチドを細胞輸送調節剤のアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせて使用すると、炎症治療に望ましい可能性もある。細胞輸送調節剤は、内皮細胞表面受容体（例えばＥ−セレクチンおよびインテグリン）；白血球表面受容体（Ｌ−セレクチン）；ケモカインおよび走化性因子からなるリストより選択可能である。炎症に関与する組成物の概説に関しては、本明細書に援用される、Ｃａｒｌｏｓら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１４：５−２８（１９９０）を参照されたい。
【０１１９】
さらに、組成物には、ｎｅｕ分化因子、「ＮＤＦ」が含まれてもよく、そして治療法には、ＴＩＭＰ−３の投与前の、投与と同時の、または投与後のＮＤＦの投与が含まれてもよい。ＮＤＦは、ＴＩＭＰ−２の産生を刺激することが見出されてきており、そしてＮＤＦ、ＴＩＭＰ−１、−２および／または−３の組み合わせは、腫瘍を治療する際、利点を提供しうる。
【０１２０】
本発明のポリペプチド産物を、検出可能なマーカー物質と会合させる（例えば１２５Ｉで放射標識する）ことによって「標識」して、固形組織、および血液または尿などの液体試料において、ＴＩＭＰ−３の検出および定量化に有用な試薬を提供してもよい。本発明の核酸産物もまた、検出可能マーカー（例えば放射標識および非同位体標識、例えばビオチン）で標識して、そして例えば相当する遺伝子を同定するためのハイブリダイゼーションプロセスにおいて使用してもよい。
【０１２１】
本明細書記載のＴＩＭＰ−３結合組成物は、病因形成を修飾し、そしてマトリックス分解および／または炎症によって特徴付けられる疾患または状態、すなわちメタロプロテイナーゼが有害な役割を果たすものに関して、有益な療法を提供する。ＴＩＭＰ−３結合組成物を、単独で、またはこうした状態を治療する際に用いられる１またはそれより多い剤と組み合わせて使用してもよい。したがって、本発明のＴＩＭＰ−３結合組成物は、メタロプロテイナーゼ活性によって、過剰なマトリックス喪失が引き起こされるいかなる障害の治療にも有用でありうる。本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、コラゲナーゼ、アグリカナーゼ、あるいは他のマトリックス分解または炎症促進酵素（単数または複数）の過剰産生に関連する多様な障害の治療に有用であり、こうした障害には、栄養障害型表皮水疱症、変形性関節症、ライター症候群、偽痛風、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ、強直性脊椎炎、強皮症、歯周病、角膜の潰瘍、上皮の潰瘍、または胃潰瘍を含む潰瘍、術後の創傷治癒、および再狭窄が含まれる。過剰なコラーゲンおよび／またはプロテオグリカン分解が役割を果たす可能性があり、そしてしたがってＴＩＭＰ−３結合タンパク質を適用可能である、他の病的状態には、肺気腫、骨のパジェット病、骨粗鬆症、強皮症、褥瘡におけるような骨または組織の圧迫萎縮、真珠腫、および創傷治癒異常が含まれる。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質をさらに、他の創傷治癒促進剤に対する補助剤として適用して、例えば治癒プロセス中のコラーゲンの代謝回転を調節してもよい。
【０１２２】
多くのメタロプロテイナーゼはまた、炎症促進活性も示し；したがって、さらなる態様には、炎症および／または自己免疫障害を治療する方法が含まれ、こうした障害には、限定されるわけではないが、軟骨炎症、および／または骨分解、関節炎、関節リウマチ、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身開始型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、筋炎（myolitis）、多発性筋炎、皮膚筋炎、変形性関節症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、強皮症、硬化症、原発性硬化性胆管炎、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スティル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患、潰瘍性腸炎、クローン病、セリアック病（非熱帯熱スプルー）、血清陰性関節症と関連する腸疾患、顕微鏡的またはコラーゲン大腸炎、好酸球性胃腸炎、または直腸結腸切除術および回腸肛門吻合術後に生じる嚢炎、膵炎、インスリン依存性糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息（外因性および内因性喘息、ならびに気道の関連慢性炎症性状態、または応答性亢進を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、すなわち慢性気管支炎、肺気腫）、急性呼吸器障害症候群（ＡＲＤＳ）、呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、急性肺傷害、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気管支炎、アレルギー性気管支拡張症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、喘息様障害、サルコイド、反応性気道疾患（または機能障害）症候群、綿肺、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、および肺寄生虫症、ウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ライノウイルス（ＲＶ）およびアデノウイルス）誘導性状態に関連する気道過敏、ギラン−バレー病、グレーブス病、アジソン病、レイノー現象、自己免疫肝炎、ＧＶＨＤ等が含まれる。
【０１２３】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質はまた、ＴＩＭＰ−３の相対的レベルの減少（すなわち、ＴＩＭＰ−３量の減少またはメタロプロテアーゼ量の増加の結果でありうる、メタロプロテアーゼに対する内因性ＴＩＭＰ−３の比の減少）が、例えば心筋虚血、再灌流傷害における、および鬱血性心不全への進行中の、病的影響に関連する症例において、適用を有する。
【０１２４】
ＴＩＭＰ−３が結合組織分解を阻害する能力に基づいて、アゴナイズ性ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、血管形成阻害が、例えば腫瘍発展を防止するかまたは遅延させる際、および寄生虫侵入の防止の際に有用である症例において適用を有する。例えば、腫瘍浸潤および転移の分野において、いくつかの特定の腫瘍の転移能は、コラゲナーゼを合成し、そして分泌する能力の増加と、そして有意な量のメタロプロテイナーゼ阻害剤を合成し、そして分泌する能力がないことと相関する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質はまた、原発性腫瘍の除去中、化学療法および放射線療法中、汚染された骨髄の採取中、ならびに癌性腹水のシャント中の、腫瘍細胞播種を阻害する際にも療法的適用を有する。診断的に、腫瘍標本におけるＴＩＭＰ−３産生の非存在およびその転移能は、予後指標として、ならびにありうる防止療法の指標として、有用である。
【０１２５】
さらに、本発明の組成物および方法は、美容目的のために適用可能であり、この際、結合組織分解の局所阻害は、組織の外見を改変しうる。
ＭＭＰはまた、血液脳関門（ＢＢＢ）を開くための経路の一部として、脳の基底膜および密着結合タンパク質に作用し、脳内への細胞および炎症の可溶性仲介因子の進入を促進する。したがって、本発明の組成物および方法は、ＢＢＢの過剰なまたは不適切な透過化によって特徴付けられる神経系障害の治療に有用でありうる。さらに、ニューロン周囲のマトリックスタンパク質の分解は、接触の喪失および細胞死を生じる可能性もあり；したがって、ＴＩＭＰ−３結合組成物は、神経細胞を取り巻く基底膜を保持することによって、神経細胞を損傷から保護しうる。本発明のＴＩＭＰ−３結合組成物は、傷害、例えば脳虚血に対する神経炎症反応を治療するかまたは軽減する際に有用である。本明細書開示の組成物はまた、炎症が、疾患の根底にある原因である神経変性疾患、例えば多発性硬化症の治療の際に、ならびに多様な型のニューロパシーおよび／またはミオパシー、脊髄傷害、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療の際に有用であるであろう。したがって、本発明の組成物の使用は、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＤＦ、ＳＣＦ、あるいは他の神経細胞増殖または増殖調節因子との同時投与を伴いうる。
【０１２６】
上記のように、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、多様な障害において広い適用を有する。したがって、本明細書に意図される別の態様は、細胞外マトリックスの分解を伴う障害を治療するため、本発明のポリペプチド、および場合によって１またはそれより多いさらなる上記組成物を含むキットである。さらなる態様は、パッケージング材料および前記パッケージング材料内の薬学的剤を含む製品であって、前記薬学的剤が、本発明のポリペプチド（単数または複数）を含有し、そして前記パッケージング材料が：癌、炎症、関節炎（変形性関節症等を含む）、栄養障害性表皮水疱症、歯周病、潰瘍、肺気腫、骨障害、強皮症、創傷治癒、赤血球不全、美容的組織再構築、受精または胚移植調節、および神経細胞障害からなる群より選択される適応症に対して、前記薬学的剤を使用してもよいことを示すラベルを含む、前記製品である。この製品には、場合によって、他の組成物または他の組成物のラベル説明が含まれてもよい。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例は、本発明の特定の態様または特徴を例示する目的のために提供され、そしてその範囲を限定しない。
実施例１
本実施例は、共焦点顕微鏡によって調べた際の、外因性ＴＩＭＰ−３の内在化を記載する。Ａ５４９細胞（ＩＩ型肺胞上皮細胞の特性を持つヒト肺癌由来の連続腫瘍細胞株、野生型またはＬＲＰ−１遺伝子を欠くＡ５４９細胞のいずれか）を、多様な前処理（ヘパリンを含む）を伴いまたは伴わずに、典型的には１μＧ／ｍｌのＴＩＭＰ−３と４℃で３０分間インキュベーションし、次いで洗浄し、固定し、そして蛍光標識抗ＴＩＭＰ−３抗体で染色するか、または洗浄し、そして次いで固定および染色前に、４℃または３７℃でさらにインキュベーションした。また、実質的に本明細書に記載するように、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって、培地中のＴＩＭＰ−３の集積に関しても、細胞をアッセイした。
【０１２８】
ＬＲＰ−１を欠く細胞は、野生型細胞よりも高い度合いで培地中にＴＩＭＰ−３を集積させることが見出された。共焦点顕微鏡分析によって、ＴＩＭＰ−３が細胞表面に結合し、細胞を３７℃でインキュベーションした際に迅速に消滅するが、４℃では消滅せず、そして、クロロキンであらかじめ処理すると、細胞内に集積してリソソーム分解を防止することが示された。さらに、細胞表面へのＴＩＭＰ−３の結合は、ヘパリンの存在下で減少した。
【０１２９】
実施例２
本実施例は、ＬＲＰ−１ペプチドの調製および精製を記載する。ＬＲＰ−１の外部ドメイン由来の多様なペプチドを大腸菌（E. coli）において発現させ、以下に記載するように精製し、そしてプレートに基づくおよびビーズに基づく結合アッセイ両方によって、ＴＩＭＰ−３への結合に関して試験した。ＬＲＰ−１のアミノ酸配列を配列番号１に示し；以下の表１は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列に言及して、発現された多様なペプチドを列挙する。ペプチドは、本明細書において、単量体（例えばＬＡ３、ＬＡ４、ＬＡ５、および単一の数字によって示される他のペプチド）または多量体（例えばＬＡ３−５、ＬＡ５−７、ＬＡ８−１０、および複数の数字によって示される他のペプチド）として言及される。
【０１３０】
表１：ＬＲＰ−１ペプチド
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
大腸菌細菌における標準的組換えタンパク質技術を用いて、ＬＲＰ−１ペプチドを調製する。関心対象の各ペプチドに関して、単一の形質転換大腸菌コロニーから、４０μＧ／ｍＬカナマイシンを含有する３ｍＬの２ｘＹＴ培地（大腸菌の組換え株用の栄養的に豊富な増殖培地）内に培養を接種し、そして飽和するまで、３００ｒｐｍ、３７℃で一晩増殖させる。翌朝、１．８ｍＬの一晩培養を、４０μＧ／ｍＬカナマイシンを含有する２ｘＹＴの５００ｍＬ振盪フラスコ内に接種し、そして振盪しながら３００ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００が０．８〜１．０の間になるまで（約３時間）増殖させる。５００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド；１ｍＭ最終）で培養を誘導し、そして振盪しながら３００ｒｐｍ、３７℃で３時間、増殖を続ける。次いで、培養を５００ｍＬ Ｎａｌｇｅｎｅボトル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に移し、そして８０００ｒｐｍで１２分間遠心分離して、細胞をペレットにする。上清を取り除き、そしてペレットを２０ｍＬの平衡／結合／洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁する。再懸濁した細胞を３０ｍＬ Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ遠心管（ＶＷＲ、ペンシルバニア州ウェストチェスター）内に移し、そして８０℃の水槽中で１５分間加熱することによって溶解する。溶解した細胞を氷水上で約１０分間冷却し、次いで、１８，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。
【０１３３】
平衡／結合／洗浄緩衝液で３回アガロースを洗浄して、エタノールを除去することによって、ペプチドあたり１．５ｍＬのアガロース（緩衝液を含めて総体積３ｍＬ）に関して十分なＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を調製する。３回目の洗浄後、同じ緩衝液を用いて、元来の体積まで、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを再懸濁する。次に、３ｍＬのアガロース／緩衝液混合物を５０ｍＬフラットトップ・スクリューキャップ・ポリプロピレン試験管（ＦａｌｃｏｎＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンノゼより入手可能）に添加する。溶解した細胞をペレットにした後、各タンパク質上清を取り除き、そして３ｍＬ洗浄Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを含有する試験管に添加する。振盪しながら、室温で０．５時間、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースに結合させる。次いで、真空マニホールド（Ｑｉａｇｅｎ）に搭載した使い捨て引力カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）に、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に加えて結合したタンパク質を移す。次に、結合したタンパク質を含むＮｉ−ＮＴＡ樹脂を、洗浄中に樹脂が乾燥しないようにしながら、少なくとも３０カラム体積の平衡／結合／洗浄緩衝液で洗浄する。次いで、洗浄した樹脂を含有するカラムを清浄な１５ｍＬポリプロピレン収集試験管（ＦａｌｃｏｎＴＭ）の最上部に乗せ、そしてタンパク質を２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回（総計４ｍＬ）で溶出させる。次いで、溶出したタンパク質を、レドックス試薬［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２］に加えて１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）および２５０μＭ ２−ヒドロキシエチルジスルフィド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液内に、４℃で一晩透析する。翌日、タンパク質を、レドックス試薬を含まない緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）内に、４℃で３時間透析する。次いで、これを反復する。次いで、０．２ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州イーストヒルズ）を用いて、タンパク質をろ過し、そして次の精製工程まで、４℃で保存する。
【０１３４】
次の工程のため、ペプチドあたり１．３ｍＬのＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（四級アンモニウム強陰イオンを持つイオン交換クロマトグラフィー樹脂；〜１ｍＬ樹脂；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のスラリーを１５ｍＬ使い捨て重力カラム（gravity column）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加する。カラムを１０ｍＬの平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回平衡化して、そして重力によって排出させる。次に、〜３．９ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質を、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ樹脂に穏やかに添加し、そしてフロースルーを１５ｍＬポリプロピレン試験管（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）内に収集する。樹脂を、５ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で５回洗浄する。ＬＲＰ−１ペプチドの単量体または多量体型に関して用いたＮａＣｌ塩勾配（以下を参照されたい）を用いて、樹脂からタンパク質を溶出させ、そして９６ウェル２ｍＬポリプロピレンプレート内に収集する。各ＮａＣｌ濃度に関して、タンパク質あたり１．３ｍＬを２分画用いて溶出を行う。単量体型に関するＮａＣｌ勾配は：［８０ｍＭ、１１０ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ］であり、そして多量体型に関しては：［１００ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２２０ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ］であった。タンパク質が溶出されたら、タンパク質を含有する分画を選択するため、ブラッドフォードアッセイを行う。選択した精製分画のゲルを泳動する−５μＬ／ウェルのＮｉ−ＮＴＡ精製装填タンパク質および１０μＬ／ウェルの溶出Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ分画。タンパク質を含有する分画を選択し、プールし、そして４℃（短期）または−８０℃（長期）で保存する。
【０１３５】
実施例３
本実施例は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）を用いて評価した際の組換えヒトおよびマウスＴＩＭＰ−３へのＬＲＰ−１ペプチドの結合を記載する。
【０１３６】
直接コーティングＴＩＭＰ−３結合ＥＬＩＳＡ：
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（混合親水性／疎水性ドメインを持つ分子に高いアフィニティを持つ９６ウェルポリスチレンプレート；Ｎｕｎｃ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマーク・ロスキレ）を、コーティング緩衝液（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）中で希釈した１００ｎＭヒトまたはマウスＴＩＭＰ−３ １００μＬ／ウェルでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションする。インキュベーション後、コーティング溶液を取り除き、そして２５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）と交換し、そして振盪しながら室温で１時間インキュベーションする。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液１（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）で３回洗浄する。ＬＲＰ−１ペプチドを、別個のポリプロピレン未処理丸底９６ウェルプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）中、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡ、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、１μＭ濃度で開始し、そして次いで８ポイントに関して連続４倍希釈し、最終ポイントを緩衝液のみにして、滴定する。次いで、１００μＬ／ウェルの希釈ＬＲＰ−１ペプチド滴定をＴＩＭＰ−３コーティングプレートに添加し、そして振盪しながら室温で１．５時間結合させる。インキュベーション後、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液２（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。１００μＧ／ｍＬラット抗ＨＡ（クローン３Ｆ１０）−ＨＲＰ（西洋ワサビ（horseradish）ペルオキシダーゼにコンジュゲート化された、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のペプチド配列を認識する高アフィニティ・ラット・モノクローナル抗体）の１：５Ｋ希釈をアッセイ緩衝液中１００μＬ／ウェルで添加し、そしてプレート振盪装置上で室温で１時間インキュベーションする。次いで、アッセイプレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液２で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢおよびＨ２Ｏ２の１：１混合物（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）を添加することによってプレートを現像し、１００μＬ／ウェルの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ）を添加することによって反応を停止し、そしてＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア、バージョン３．１．２を用い、ＯＤ４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）上で読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０１ソフトウェアを用いてデータを分析する。ＴＩＭＰ−３へのＬＲＰ−１ペプチドの結合を結合ＥＣ５０として表わす。
【０１３７】
抗ＴＩＭＰ−３中和抗体を介して提示される、ＴＩＭＰ−３との間接結合ＥＬＩＳＡ：
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレートを、コーティング緩衝液（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ ＣａＣｌ２）中で希釈した１００μＬ／ウェルの１０ｎＭマウス抗ヒトＴＩＭＰ−３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、中和抗体クローン２７７１２８、マウスＴＩＭＰ−３に結合しない）でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションする。インキュベーション後、プレート内容物を廃棄し、そして２５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）をプレートに添加し、これを振盪しながら室温で１時間インキュベーションする。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液１（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）で３回洗浄した後、１００μＬの２０ｎＭ組換えヒトＴＩＭＰ−３を添加する。プレートを室温で１時間インキュベーションする。ＬＲＰ−１ペプチドを先に記載するように滴定し、そして１００μＬ／ウェルの希釈ＬＲＰ−１ペプチド滴定をＴＩＭＰ−３コーティングプレートに添加し、そして振盪しながら室温で１．５時間結合させる。インキュベーション後、プレートを洗浄し、そして実質的に、直接結合ＥＬＩＳＡに関して先に記載するように、ＥＬＩＳＡを行う。
【０１３８】
ＴＩＭＰ−３ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合アッセイ：
実質的に製造者の指示にしたがって、広い範囲の生物学的相互作用および活性のスクリーニングを可能にする、非常に高感度の非放射性均一アッセイ技術であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（発光増幅近接均一アッセイ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）によってもまた、ペプチドを評価した。簡潔には、すべての希釈を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）緩衝液：［４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０］中で作製する。ＬＲＰ−１ペプチドを、別個のポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中、４μＭ濃度で開始し、そして次いで１２ポイントに関して連続３倍希釈し、最終ポイントを緩衝液のみにして、滴定する。最初に、２μＬ／ウェルのタンパク質滴定曲線を、２つ組で、白色小体積３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、英国ストーンハウス）に添加する。次に、２μＬのビオチン化（ＡＦＳ、社内コンジュゲート化（conjmicroGation））組換えヒトまたはマウスＴＩＭＰ−３を、アッセイプレートに１２ｎＭ（または３ｎＭ最終アッセイ濃度）で添加する。最後に、抑えた光の下で、どちらも２０μＧ／ｍＬ（１０μＧ／ｍＬ最終アッセイ濃度）に希釈したストレプトアビジン・ドナー・ビーズ、抗マウスＩｇＧアクセプター・ビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の混合物、および２ｎＭ（１ｎＭ最終濃度）のラット抗ＨＡ（クローン３Ｆ１０）−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をプレートに添加する。８μＬ最終アッセイ体積を含有するプレートを、ＴｏｐＳｅａｌ Ａで覆い（蒸発を防止するため）、１０００ｒｐｍで迅速に回転させ、そして一晩インキュベーションし（光曝露を防止するため、ホイルで覆って）、その後、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）パラメーター（励起６８０ｎＭおよび発光５２０〜６２０ｎｍ）を用いて、Ｆｕｓｉｏｎプレート読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０１ソフトウェアを用いてデータを分析する。ＴＩＭＰ−３への結合を総シグナル（ｃｐｓ）として報告する。いくつかの実験の結果を以下の表２〜３に示す。
【０１３９】
表２：ＥＬＩＳＡおよび／またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）によるＬＲＰ−１ペプチドの結合
【０１４０】
【表２−１】
【０１４１】
【表２−２】
【０１４２】
ＮＤ：未実施
表３：ＴＩＭＰ−３結合ＥＬＩＳＡにおけるＬＲＰ−１ペプチドのＥＣ５０
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
クラスターＩＩ（８リガンド結合ドメインを含有する）およびクラスターＩＶの一部を含む多重外部ドメインＬＲＰ−１ペプチドは、マイクロモル未満のアフィニティでＴＩＭＰ−３に結合した。ＴＩＭＰ−３に結合したペプチドを、蛍光−消光基質を用いて、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害への干渉に関して、そしてＨＴＢ−９４細胞培養におけるＴＩＭＰ−３集積の促進に関して、以下に記載するように試験した。
【０１４５】
実施例４
本実施例は、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に対する、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質（試験分子としても称され、ＬＲＰ−１ペプチド、およびＴＩＭＰ−３に対する抗体を含む）の影響（単数または複数）を測定するのに有用なＭＭＰ−１３阻害アッセイを記載した。最初に、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害の滴定を行って、ＴＩＭＰ−３のＩＣ５０を実験的に決定する。典型的には、ＭＭＰ−１３に対するＴＩＭＰ−３のＩＣ５０は、０．５ｎＭ〜１ｎＭであり、そしてＩＣ５０を用いて、試験分子を性質決定するのに用いる濃度を選択する。簡潔には、試験分子をアッセイ緩衝液中で滴定し、そして黒いポリスチレン９６または３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ドイツ）に添加する。試験分子の濃度は、分子の活性に依存する；例えば、滴定を１０００、２０００または３０００ｎＭで始め、そして滴定のために５倍希釈で用いてもよいが、他のタイプの滴定を用いてもよいし、または単一濃度を試験してもよい。次いで、組換えＴＩＭＰ−３をアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０１％Ｂｒｉｊ３５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ｐＨ７．５）中であらかじめ決定した濃度（例えば３ｎＭが典型的な濃度であるＴＩＭＰ−３のＩＣ７０）に希釈して、試験分子に添加し、そして室温で１０分間回転させる。活性ＭＭＰ−１３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ）をアッセイ緩衝液中で希釈して、１．４６ｎＭの最終アッセイ濃度にし、試験分子滴定／ＴＩＭＰ−３混合物に添加し、そして５０μＬの最終体積中、室温で１０分間インキュベーションする。あるいは、プロ−ＭＭＰ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）をアミノフェニル水銀アセテート（ＡＰＭＡ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ）で、３７℃で２時間活性化し、そしてアッセイに用いた。
【０１４６】
Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光性ＭＭＰ基質またはＭｃａ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光性ペプチド基質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの蛍光性基質を、アッセイ緩衝液中、２０μＭの最終アッセイ濃度に調製し、そしてＭＭＰ−１３酵素／ｈｕＴＩＭＰ−３／試験分子溶液に添加する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ蛍光プレート読み取り装置を用いて、ＭＭＰ−１３活性を動力学的に２０分間測定する。試験される分子の影響を、ＭＭＰ−１３酵素活性の予期される最大ＴＩＭＰ−３阻害のパーセントとして表す。
【０１４７】
また、上記のものと実質的に類似であるが、ＴＩＭＰ−３の非存在下でのアッセイにおけるＭＭＰ−１３活性の直接阻害に関しても、試験分子を分析する。アッセイ緩衝液中の試験分子の滴定を１０００ｎＭで開始し、そして滴定のため、５倍希釈を用いたが、他のタイプの滴定を用いてもよいし、または単一濃度を試験してもよい。活性ＭＭＰ−１３をアッセイ緩衝液中で希釈して、１．４６ｎＭの最終アッセイ濃度を得て、試験分子滴定に添加し、そして５０μＬの最終体積中、室温で１０分間インキュベーションする。蛍光性基質を、アッセイ緩衝液中、２０μＭの最終アッセイ濃度に調製し、そしてＭＭＰ−１３酵素／試験分子溶液に添加する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ蛍光プレート読み取り装置を用いて、ＭＭＰ−１３活性を動力学的に２０分間測定する。試験される分子の影響を、ＭＭＰ−１３酵素活性の減少パーセントとして表す。
【０１４８】
以下の表４は、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害に対する多様なＬＲＰ−１ペプチドの影響を比較する実験セットの結果、ならびにＭＭＰ１３活性に対するその直接の影響を提示する。ＴＩＭＰ−３単独で生じる阻害の９０％より高い阻害を示すペプチドは、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に有意に影響を及ぼさないと見なされた；ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力が１０％またはそれより多く減少したペプチド（すなわち、ＴＩＭＰ−３単独で観察される阻害活性の９０％またはそれ未満を生じるもの）は、ＴＩＭＰ−３の阻害能に負の影響を有すると見なされた。それ自体がＭＭＰ−１３の活性を１０％またはそれより多く減少させるペプチドは、ＭＭＰ−１３活性に有意に影響を及ぼすと見なされた。
【０１４９】
表４：ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害に対する、および／またはＭＭＰ−１３活性に対する、ＬＲＰ−１ペプチドの影響
【０１５０】
【表４−１】
【０１５１】
【表４−２】
【０１５２】
ＮＤ：未実施
注：特定のペプチドはＭＭＰ−１３活性を増加させるようであった；これらを減少％列に負の数字で示す。
【０１５３】
クラスターＩＶ配列は、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害を実質的に損なったが、クラスターＩＩはこの阻害活性に対して最小限の影響しか持たなかった。
【０１５４】
実施例５
本実施例は、培養細胞培地中のＴＩＭＰ−３集積を評価するアッセイを記載する。ＨＴＢ−９４ＴＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州マナサスより入手可能な軟骨細胞株）を、１ｍｌ増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＧ）中、ウェルあたり１ｘ１０＾５細胞で２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションする。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そしてウェルに２５０μＬの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＰＳＧ；以下の表中にＳＦと示す）を補充し、これに試験しようとするポリペプチドまたは対照（例えばヘパリン、１ｍｇ／ｍｌを含有する培地）を添加する。試験しようとするタンパク質を、例えば以下の表に示すように、適切な濃度に希釈し、そして細胞に添加する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でさらに２日間インキュベーションし、第２日に馴化培地（ＣＭ）試料を収集し、そして遠心分離（すなわち１０Ｋ ＲＰＭで５分間）によって清澄化し、そして上清液を収集し、そしてアッセイするまで−２０℃に保存する。製造者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）にしたがって、ウェスタンブロットによって、または標準的ヒトＴＩＭＰ−３ ＥＬＩＳＡを用いることによってのいずれかで、１００μＬ ＣＭ試料に対して分析を行う。
【０１５５】
ウェスタンブロットによる分析によって、ＬＲＰ−１のクラスターＩＩ（Ｃ ＩＩ）由来のポリペプチドが、ＨＴＢ−９４ＴＭ細胞由来の馴化培地中のＴＩＭＰ−３の集積を増進し、クラスターＩ、クラスターＩＩＩおよびクラスターＩＶポリペプチドは有意な集積を生じないことが示された。また、ＣＭをＥＬＩＳＡによっても試験し、そして値を標準曲線に比較することによって、ＴＩＭＰ−３の適切な濃度を決定した；いくつかのこうした実験の結果を以下の表５〜７に示す。
【０１５６】
表５：ＬＲＰ−１クラスターＩおよびクラスターＩＩドメインポリペプチドの存在下でのＴＩＭＰ３の集積
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
表６：ＬＲＰ−１ペプチド（２μＭ）の存在下でのＴＩＭＰ−３の集積
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
表７：ＬＲＰ−１ペプチド（２μＭ）の存在下でのＴＩＭＰ−３の集積
【０１６１】
【表７】
【０１６２】
いくつかのクラスターＩＩペプチドは、ＴＩＭＰ−３が細胞表面に結合するのを防止すると考えられるヘパリンの存在下で見られるものに匹敵する、ＨＴＢ−９４細胞培養中のＴＩＭＰ−３の集積を生じた。
【０１６３】
実施例６：モノクローナル抗体の調製
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭトランスジェニックマウスを免疫することによって、ＴＩＭＰ−３に対する完全ヒト抗体を生成し、用いた系統には、ＸＭＧ２−ＫＬおよびＸＭＧ４−ＫＬ（Ｍｅｎｄｅｚ ＭＪら，Ｎａｔ Ｇｅｎ，１９９７、およびＫｅｌｌｅｒｍａｎら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２）が含まれた。マウスを、特異的免疫応答を示すのに十分な時間、および十分な免疫で（すなわち腹部内への腹腔内注射または尾の基部での皮下注射の交互の注射経路を用いて、最初の４週間に２週間ごとに、その後、同じ交互の注射経路を用いて、最後の６週間に週１回、全部で約２．５ヶ月）、可溶性ＴＩＭＰ３−Ｈｉｓタンパク質で免疫した。ＴＩＭＰ−３ｐＨｉｓコーティングプレートを利用した酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、血清力価を監視した。特異的抗ＴＩＭＰ−３免疫応答を示すマウスを屠殺し、そして抗体生成に用いた。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡ結合スクリーンを用いて、ＴＩＭＰ３に特異的に結合する抗体を同定した。このアッセイのため、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１０μＧ／ｍｌニュートラビジン（ストレプトアビジンの脱グリコシル化型、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可能）で、４℃で一晩コーティングする。次いで、プレートに１μＧ／ｍｌのビオチン化ＴＩＭＰ３ｐＨｉｓを装填する。ＴＩＭＰ−３への結合に関して、陽性と同定された上清（ＴＩＭＰ−３−ポリＨｉｓ免疫キャンペーン由来の８６の陽性結合上清およびＴＩＭＰ−３ｐＨｉｓ／ＫＬＨ免疫キャンペーン由来の３３の陽性結合上清）を、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ１３の阻害への干渉、特異的ＩｇＧ濃度の相対的定量化、および低抗原設定におけるＴＩＭＰ３への相対的アフィニティを含む、いくつかの異なるアッセイにおいて、評価し、そしてランク付けした。実施例５に実質的に記載される培養上清液において、ＴＩＭＰ−３の集積に対する影響に関してもまた、抗体を評価した；結果を以下に示す。
【０１６５】
表８：ＴＩＭＰ−３特異的抗体の存在下でのＴＩＭＰ３の集積
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
先に記載するものと類似のアッセイを用いて、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力への干渉に関して試験する際、抗体１０Ａ７は比較的少ない干渉しか示さず、一方、残りの抗体は、より高い干渉を示した。抗体８Ｆ１、８Ｃ５および１０Ａ７はまた、実質的に先に記載するような共焦点顕微鏡によって観察した際、ＴＩＭＰ３内在化を阻害した。
【０１６８】
実施例７：モノクローナル抗体の調製
受動的にコーティングされたＴＩＭＰ−３または抗ＴＩＭＰ−３ ＭＡＢ９７３１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介して係留されたＴＩＭＰ−３のいずれかを伴うＥＬＩＳＡを用いて、先に記載するハイブリドーマのプールから、ヒトＴＩＭＰ−３に対するさらなるモノクローナル抗体を同定した。実質的に先に記載するようなアッセイを用いて、ＥＬＩＳＡにおいて陽性である抗体もまた、ＴＩＭＰ−３集積に関して試験した。使用済みのハイブリドーマ上清液をＴＩＭＰ−３集積アッセイにおいて評価した際（血清不含培地に緩衝液交換して、ＴＩＭＰ−３集積アッセイに対するバックグラウンド効果を減少させた後）、２６のハイブリドーマが、ＴＩＭＰ−３集積を促進する抗体を分泌すると同定された。これらのハイブリドーマのうち４つはサブクローニング中に失われたが、残りの２２をより大きいスケールで培養し、そしてモノクローナル抗体を精製し、そしてＴＩＭＰ−３集積およびＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害に対するありうる影響に関して（ならびにＭＭＰ−１３自体に対するいかなる直接的な影響に関しても）評価した。
【０１６９】
２２の抗体のうち、いずれも、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に不都合な影響を与えず、また、ＭＭＰ−１３自体に対する影響を持たなかった。ＴＩＭＰ−３集積アッセイにおいて、陰性対照抗体で観察されたものよりも少なくとも約１．５倍高いレベルの、上清液中のＴＩＭＰ−３集積の再現可能で滴定可能な増加に関して、抗体を評価した。さらなる分析および細胞株発展のために４つの抗体を選択し；これらの抗体に対する代表的なＴＩＭＰ−３集積アッセイおよびＭＭＰ−１３阻害アッセイの結果を以下に示す。ＭＭＰ−１３阻害アッセイは、１００μＬアッセイ体積中の１．５ｎＭ ＭＭＰ−１３（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、０．２５ｎＭの精製ＴＩＭＰ−３（いかなる抗体も存在しない場合、ＭＭＰ−１３活性の５４％阻害を生じた）、および２０μＭ Ｍｃａ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光性ペプチド基質（ＥＳ０１０基質、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用した。ＭＭＰ−１３阻害アッセイに関しては、少なくとも特定の度合いで、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害を損なうことが知られる対照Ａｂとして、抗体１０Ａ７が含まれた。
【０１７０】
表９：ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ１３の阻害に対する抗ＴＩＭＰ−３抗体の影響
【０１７１】
【表９】
【０１７２】
これらの結果は、抗体１６Ａ１．１、１８Ｈ１．１、１７Ａ４．１および１８Ｃ１．１が、抗体が最大約８０倍モル過剰となる濃度まで、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力を有意に減少させないことを示す。
【０１７３】
表１０：ＴＩＭＰ−３の集積に対する抗ＴＩＭＰ−３抗体の影響
【０１７４】
【表１０】
【０１７５】
これらの結果は、抗体１６Ａ１．１、１８Ｈ１．１、１７Ａ４．１および１８Ｃ１．１が、上清液中のＴＩＭＰ−３集積を導くことを示す。続く分析によって、抗体１７Ａ４および１８Ｃ１が、同じアミノ酸配列を有することが示された。残りの１８クローンを、将来ありうるさらなる評価のために保存した。
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて、２００９年７月３１日出願の米国仮出願第６１／２３０，４４５号、および２０１０年７月２２日出願の米国仮出願第６１／３６６，７８３号の優先権を主張し、これらの出願は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
配列表についての言及
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２０１０年７月２７日に作成されたＡ−１４８７−ＷＯ−ＰＣＴ Ｓｅｑ Ｌｉｓｔ．ｔｘｔと題されるファイルとして提供されており、サイズは３９．９ＫＢである。配列表の電子形式の情報は、その全体が本明細書に援用される。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般的に、メタロプロテイナーゼ阻害剤に、そして該阻害剤に結合するタンパク質に関する。特に本発明は、メタロプロテイナーゼ３（「ＴＩＭＰ−３」）の組織阻害剤、および該阻害剤が、スカベンジャー受容体低密度リポタンパク質関連タンパク質１（「ＬＲＰ−１」）に結合する能力に関する。
【背景技術】
【０００４】
結合組織および関節軟骨は、細胞外マトリックス合成および分解の反対の影響による動的平衡に維持される。マトリックスの分解は、主に、マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびトロンボスポンジン・モチーフを含むディスインテグリン−メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）を含むメタロプロテイナーゼの酵素作用によってもたらされる。これらの酵素は、多くの天然プロセス（発生、形態形成、骨リモデリング、創傷治癒および血管形成を含む）において重要であるが、レベルの上昇は、関節リウマチおよび変形性関節症を含む結合組織の変性疾患、ならびに癌および心臓血管状態において役割を果たすと考えられる。
【０００５】
メタロプロテイナーゼの内因性阻害剤には、血漿アルファ２−マクログロブリンおよびメタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）が含まれ、このうち、ヒトゲノムには４つがコードされることが知られている。ＴＩＭＰ−３は、すべての主な軟骨分解メタロプロテアーゼを阻害し、そして多数の証拠によって、該阻害剤が軟骨を保護することが示される。軟骨外植片に該タンパク質を添加すると、サイトカイン誘導性の分解が防止され、そして関節内に注射すると、変形性関節症のラット内側半月板断裂モデルにおいて、軟骨損傷が減少する。しかし、ＭＭＰ活性の療法的阻害剤としてのＴＩＭＰ−３開発は、ＴＩＭＰ−３の組換え型の産生が困難であり、そして半減期が短いことによって妨げられてきている。
【０００６】
ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ−１）は、プロテイナーゼおよびプロテイナーゼ阻害剤のホメオスタシスにおける役割を含めて多様な生物学的役割を持つ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体遺伝子ファミリーのメンバーである。ＬＤＬ受容体遺伝子ファミリーの他のメンバーと同様、ＬＲＰ−１の構造は、細胞外ドメインにおける４つの共通の構造単位で形成され、この単位の各々は、さらに、システイン・リッチ反復、および上皮増殖因子受容体様システイン・リッチ反復を含む、より小さい反復ドメインで構成される。このスカベンジャー受容体構造に関するより詳細な情報は、例えば、ＨｅｒｚおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９（２００１）において入手可能である。
【０００７】
ＬＲＰ−１は、Ｐｒｏ−ＭＭＰ−２／ＴＩＭＰ−２複合体のエンドサイトーシス性クリアランスを仲介することが示されてきている（Ｅｍｏｎａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４９４４；２００４）。さらに、ＣａＰＰＳと称される、ブナ材由来の化学的に硫酸化されたキシロピラノースが、ＴＩＭＰ−３の軟骨レベルを増加させることが示されてきている（Ｔｒｏｅｂｅｒｇら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２２：３５１５；２００８）。この効果は、ＬＲＰ−１の一般的な阻害剤であり、やはり培養軟骨細胞培地中のＴＩＭＰ−３のレベルを増加させる受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の効果との類似性のために、ＬＲＰ−１を介したＴＩＭＰ−３のエンドサイトーシスが遮断されるためであると示唆された。。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＨｅｒｚおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：７７９（２００１）
【非特許文献２】Ｅｍｏｎａｒｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５４９４４；２００４
【非特許文献３】Ｔｒｏｅｂｅｒｇら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２２：３５１５；２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当該技術分野において、ＴＩＭＰ−３がＬＲＰ−１と直接相互作用するかどうかを決定し、そして十分な正確さで、いかなるこうした相互作用も定義して、ＴＩＭＰ−３生物学的活性におけるＬＲＰ−１およびＴＩＭＰ−３間のいかなる結合の影響の決定も可能にする必要性がある。さらに、ＴＩＭＰ−３の量を増加させるように、こうした相互作用に特異的に作用する、特にＴＩＭＰ−３生物学的活性に不都合に作用することなく上記のように作用することが可能な剤を同定する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＴＩＭＰ−３に結合し、そしてＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害する、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、抗体またはＬＲＰ−１ペプチドであってもよい。１つの側面において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる（すなわちＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に比較的わずかな干渉しか示さない）。
【００１１】
本発明はさらに、ＴＩＭＰ−３に結合し、そしてＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を、ＴＩＭＰ−３と接触させることによって、細胞外マトリックス中のＴＩＭＰ−３を増加させる方法を提供する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、抗体またはＬＲＰ−１ペプチドであってもよい。１つの側面において、請求するＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる（すなわちＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に比較的わずかな干渉しか示さない）。ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＩＭＰ−３をＴＩＭＰ−３結合タンパク質と接触させ；ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴＩＭＰ−３とＴＩＭＰ−３結合タンパク質の接触を達成してもよい。
【００１２】
本発明はまた、マトリックス・メタロプロテイナーゼが有害な役割を果たす状態に罹患している哺乳動物を治療する方法であって、ＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法も提供する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、抗体またはＬＲＰ−１ペプチドであってもよい。１つの側面において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる（すなわちＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に比較的わずかな干渉しか示さない）。状態は、炎症、癌、および細胞外マトリックスの過剰な分解によって特徴付けられる状態からなる群より選択可能であり；例えば、状態は変形性関節症および鬱血性心不全からなる群より選択可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＴＩＭＰ−３に結合するポリペプチド、例えば天然存在ポリペプチド（すなわちＬＲＰ−１ポリペプチド）およびその断片、抗ＴＩＭＰ−３抗体、抗体断片、および抗体誘導体に関する組成物、キット、および方法を提供する。やはり提供されるのは、ＴＩＭＰ−３に結合するポリペプチドのすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにその誘導体および断片、例えば、こうしたＴＩＭＰ−３結合タンパク質のすべてまたは一部をコードする核酸、こうした核酸を含むプラスミドおよびベクター、ならびにこうした核酸および／またはベクターおよびプラスミドを含む細胞または細胞株である。提供される方法には、例えば、ＴＩＭＰ−３に結合する分子、例えば抗ＴＩＭＰ−３抗体を作製するか、同定するか、または単離する方法、分子がＴＩＭＰ−３に結合するかどうかを決定する方法、分子がＴＩＭＰ−３活性をアゴナイズするかまたはアンタゴナイズするかどうかを決定する方法、ならびに分子がＴＩＭＰ−３の集積を促進するかどうかを決定する方法が含まれる（例えば、軟骨細胞様細胞または細胞株の培養において、あるいはｅｘ ｖｉｖｏ軟骨外植片において）。
【００１４】
ＴＩＭＰ−３は、哺乳動物において、多様な細胞または組織によって発現され、そして細胞外マトリックスに存在する；こうして発現されるＴＩＭＰ−３は、本明細書において、「内因性」ＴＩＭＰ−３と称される。哺乳動物において、内因性ＴＩＭＰ−３の量を増加させるか、上昇させるかまたは増進させることが好適であろう、多くの状態が存在する。したがって、やはり本明細書において、ＴＩＭＰ−３に結合する分子を含む薬学的組成物などの組成物を作製する方法、およびＴＩＭＰ−３に結合する分子を含む組成物を被験体に投与するための方法、例えばＴＩＭＰ−３の集積を促進することによって、ＴＩＭＰ−３の内因性の量を増加させることによって、細胞に対するＴＩＭＰ−３の結合を阻害することによって、ＴＩＭＰ−３の内在化を減少させることによって、そして／またはＴＩＭＰ−３の生物学的活性をｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでアゴナイズすることによって、状態を治療するための方法も提供する。
【００１５】
標準的１文字または３文字略語を用いて、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を示す。別に示さない限り、各ポリペプチド配列は、左側にアミノ末端および右側にカルボキシ末端を有し；各一本鎖核酸配列、および各二本鎖核酸配列の上部鎖は、左側に５’末端および右側に３’末端を有する。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列はまた、参照配列とどのように異なるかを説明することによっても記載可能である。
【００１６】
本明細書において、別に定義しない限り、本発明と関連して用いられる科学的および技術的用語は、一般の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は複数のものを含み、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般的に、本明細書に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと関連して用いられる術語、ならびにそれらの技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、別に示さない限り、一般的に、当該技術分野に周知の慣用法にしたがって、そして本明細書全体で引用され、そして論じられる、多様な一般的な参考文献およびより特異的な参考文献に記載されるように、行われる。例えば、本明細書に援用される、ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、製造者の指定にしたがって行われる。本明細書記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医学的および薬学的化学と関連して用いられる専門用語、ならびにこうした化学の実験法および技術は、当該技術分野に周知であり、そして一般的に知られるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、配合、および送達、ならびに患者の治療には、標準的技術を用いてもよい。
【００１７】
以下の用語は、別に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである：
用語「単離分子」は（分子が、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）、その起源または派生供給源によって、（１）天然状態で該分子に付随する、天然に会合する構成要素と関連していないか、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）人の介入なしに天然には存在しない分子である。したがって、化学的に合成されたか、または天然に由来する細胞とは異なる細胞系において合成される分子は、天然に関連する構成要素から「単離されている」であろう。分子はまた、当該技術分野に周知の精製技術を用いた単離によって、天然に会合する構成要素を実質的に含まないようにされうる。当該技術分野に周知のいくつかの手段によって、分子純度または均一性をアッセイしてもよい。例えば、当該技術分野に周知の技術を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用い、そしてゲルを染色してポリペプチドを視覚化して、ポリペプチド試料の純度をアッセイしてもよい。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは当該技術分野に周知の精製のための他の手段を用いることによって、より高い解像度を提供してもよい。
【００１８】
本明細書記載の「ＴＩＭＰ−３アゴニスト」は、例えば、ＴＩＭＰ−３が１またはそれより多くのメタロプロテイナーゼを阻害する能力を有意に減少させることなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＩＭＰ−３の量（集積）を増加させることによって、ＴＩＭＰ−３の少なくとも１つの機能を検出可能に増加させる分子である。ＴＩＭＰ−３機能の任意のアッセイが使用可能であり、その例を本明細書に提供する。ＴＩＭＰ−３アゴニストによって増加させうるＴＩＭＰ−３機能の例には、ＭＭＰ−１３を含むマトリックス・メタロプロテイナーゼの阻害が含まれる。例えば、ＴＩＭＰ−３アゴニストは、軟骨外植片、または軟骨細胞培養からのＭＭＰ−１３阻害活性を増加させることも可能であり、あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＩＭＰ−３のレベルを増進させ、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏでＭＭＰ−１３阻害活性を増加させることも可能である。ＴＩＭＰ−３アゴニストのタイプの例には、限定されるわけではないが、ＴＩＭＰ−３結合ポリペプチド、例えばＬＲＰ−１由来のポリペプチド、ならびに抗原結合タンパク質（例えばＴＩＭＰ−３抗原結合タンパク質）、抗体、抗体断片、および抗体誘導体が含まれる。
【００１９】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、各々、ペプチド結合によって互いに連結された２またはそれより多いアミノ酸残基を含む分子を指す。これらの用語は、例えば天然および人工的タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質配列のポリペプチド類似体（突然変異タンパク質（mutein）、変異体、および融合タンパク質など）、ならびに翻訳後、あるいは別の共有的または非共有的修飾タンパク質を含む。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、単量体性または多量体性であってもよい。
【００２０】
用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において、対応する全長タンパク質に比較した際、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを指す。断片は、例えば、少なくとも長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸であってもよい。断片はまた、例えば、最大で、長さ１，０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸であってもよい。断片は、さらに、どちらかまたは両方の端に、１またはそれより多いさらなるアミノ酸、例えば異なる天然存在タンパク質（例えばＦｃまたはロイシンジッパードメイン）または人工的アミノ酸配列（例えば人工的リンカー配列またはタグタンパク質）由来のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２１】
本発明のポリペプチドには、例えば：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合アフィニティを改変し、（４）結合アフィニティを改変し、そして（４）他の物理化学特性または機能特性を与えるかまたはこうした特性を修正するように、いずれかの方式で、そしていずれかの理由のために修飾されているポリペプチドが含まれる。類似体には、ポリペプチドの突然変異タンパク質が含まれる。例えば、単数または多数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を天然存在配列において（例えば、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）外のポリペプチドの部分において）行うことも可能である。コンセンサス配列を用いて、置換するアミノ酸残基を選択してもよく；当業者はさらなるアミノ酸残基もまた置換可能であることを認識する。
【００２２】
「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造特徴を実質的に変化させないものである（例えば置換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを中断させるか、あるいは親配列を特徴付けるかまたはその機能に必要な他のタイプの二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野に認識されるポリペプチド二次構造および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ監修，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ監修，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨーク州ニューヨーク（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎらＮａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１）に記載され、これらは各々、本明細書に援用される。
【００２３】
本発明はまた、ＴＩＭＰ−３結合ポリペプチドの非ペプチド類似体も提供する。非ペプチド類似体は、テンプレート・ペプチドのものに類似の特性を持つ薬剤として、薬学的産業において一般的に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」（「peptide mimetics」または「peptidomimetics」）と称され、例えば、本明細書に援用される、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；ならびにＥｖａｎｓらＪ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）を参照されたい。療法的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、同等の療法効果または予防効果を生じることも可能である。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などの模範（ｐａｒａｄｉｇｍ）ポリペプチド（すなわち所望の生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に構造的に類似であるが、当該技術分野に周知の方法によって：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群より選択される連結により、場合によって置換された１またはそれより多いペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１またはそれより多いアミノ酸を、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えばＬ−リジンの代わりにＤ−リジン）で体系的に置換して、より安定なペプチドを生成することも可能である。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む、制約された（constrained）ペプチドを、当該技術分野に知られる方法（本明細書に援用される、ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））によって生成することも可能であり、これは例えば、ペプチドを環化する、分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによる。
【００２４】
ポリペプチド（例えば抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列に比較して、１またはそれより多いアミノ酸残基がアミノ酸配列内に挿入され、該配列から欠失し、そして／または該配列内で置換された、アミノ酸配列を含む。本発明の変異体には融合タンパク質が含まれる。
【００２５】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば別の化学部分（例えばポリエチレングリコール、またはアルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど）へのコンジュゲート化、リン酸化、およびグリコシル化を介して、化学的に修飾されているポリペプチド（例えば抗体）である。別に示さない限り、用語「抗体」には、２つの全長重鎖および２つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例を以下に記載する。
【００２６】
「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分、および場合によって、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進するコンホメーションを採用するのを可能にする足場またはフレームワーク部分を含む、タンパク質である。抗原結合タンパク質の例には、抗体、抗体断片（例えば抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体、および抗体類似体が含まれる。抗原結合タンパク質は、例えば移植されたＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含む別のタンパク質足場または人工的足場を含むことも可能である。こうした足場には、限定されるわけではないが、例えば抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された突然変異を含む抗体由来足場、ならびに例えば生体適合性ポリマーを含む完全に合成の足場が含まれる。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，第５３巻，第１号：１２１−１２９；Ｒｏｑｕｅら，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照されたい。さらに、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびにフィブロネクチン構成要素を足場として利用する抗体模倣体に基づく足場を使用してもよい。
【００２７】
抗原結合タンパク質は、例えば、天然存在免疫グロブリンの構造を有することも可能である。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然存在免疫グロブリンにおいて、各四量体は、２つの同一ポリペプチド鎖の対で構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識に関与する、約１００〜１１０またはそれより多いアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する、定常領域を明示する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖と分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、そしてそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２またはそれより多いアミノ酸の「Ｊ」領域で連結され、重鎖はまた、約１０またはそれより多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．監修，第２版 Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８９））（あらゆる目的のため、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、損なわれていない（intact）免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００２８】
天然存在免疫グロブリン鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結される、比較的保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ一般構造を示す。軽鎖および重鎖はどちらも、Ｎ末端からＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，米国保健社会福祉省，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号，１９９１の定義にしたがう。免疫グロブリン鎖中のアミノ酸に関する他の番号付け系には、ＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系；Ｌｅｆｒａｎｃら，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５−２０３；２００５）およびＡＨｏ（ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７−６７０；２００１）が含まれる。
【００２９】
多様な抗原特異性を有する免疫グロブリンを含有する血清または血漿などの供給源から、抗体を得てもよい。こうした抗体をアフィニティ精製に供すると、特定の抗原特異性に関して濃縮可能である。抗体のこうした濃縮調製物は、通常、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する、約１０％未満の抗体で構成される。これらの調製物をアフィニティ精製に数回供すると、抗原に関して特異的結合活性を有する抗体の比率を増加させうる。この方式で調製される抗体は、しばしば、「単一特異性」と称される。単一特異性抗体調製物は、特定の抗原に関する特異的結合活性を有する抗体、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または９９．９％で構成されうる。
【００３０】
「抗体」は、別に明記しない限り、損なわれていない免疫グロブリン、または特異的結合に関して、損なわれていない抗体と競合する、その抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、あるいは損なわれていない抗体の酵素的切断または化学的切断によって、産生可能である。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、可変領域断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ならびに少なくとも、ポリペプチドへの特異的抗原結合性を与えるのに十分な免疫グロブリン部分を含有するポリペプチドが含まれる。
【００３１】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価断片であり；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を有する二価断片であり；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖ断片は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；そしてｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、あるいはＶＨまたはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、第６，６９６，２４５号、米国出願公報第０５／０２０２５１２号、第０４／０２０２９９５号、第０４／００３８２９１号、第０４／０００９５０７号、第０３／００３９９５８号、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６，１９８９）。
【００３２】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えばアミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続タンパク質鎖を形成する抗体であり、ここでリンカーは、タンパク質鎖が、それ自体、折り畳まれ、そして一価抗原結合部位を形成するのを可能にするのに十分に長い（例えば、Ｂｉｒｄら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６およびＨｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３を参照されたい）。ディアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む二価抗体であって、各ポリペプチド鎖は、同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成するのを可能にするにはあまりにも短く、したがって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補ドメインと対形成するのを可能にするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１−２３を参照されたい）。ディアボディの２つのポリペプチド鎖が同一であるならば、その対形成から生じるディアボディは、２つの同一の抗原結合部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いて、２つの異なる抗原結合部位を持つディアボディを作製することも可能である。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ、３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、そして、同じであってもまた異なってもよい、それぞれ、３つおよび４つの抗原結合部位を形成する抗体である。
【００３３】
Ｋａｂａｔら、上記；Ｌｅｆｒａｎｃら、上記および／またはＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、上記に記載される系を用いて、所定の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）を同定してもよい。１またはそれより多いＣＤＲを共有的または非共有的のいずれかで分子内に取り込んで、抗原結合タンパク質にすることも可能である。抗原結合タンパク質は、より長いポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能であるし、別のポリペプチド鎖にＣＤＲ（単数または複数）を共有結合させることも可能であるし、または非共有的にＣＤＲ（単数または複数）を取り込むことも可能である。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が、関心対象の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００３４】
抗原結合タンパク質は、１またはそれより多い結合部位を有してもよい。１より多い結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であっても、また異なってもよい。例えば、天然存在ヒト免疫グロブリンは、典型的には２つの同一の結合部位を有し、一方、「二重特異性」または「二官能性」抗体は、２つの異なる結合部位を有する。
【００３５】
用語「ヒト抗体」には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１またはそれより多い可変領域および定常領域を有する抗体すべてが含まれる。１つの態様において、可変ドメインおよび定常ドメインのすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、多様な方法で調製可能であり、その例を以下に記載し、これらには、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾されたマウスの、関心対象の抗原での免疫を通じたものが含まれる。
【００３６】
ヒト化抗体は、ヒト被験体に投与された際、非ヒト種抗体に比較すると、免疫応答を誘導する可能性がより低く、そして／またはより重度でない免疫応答を誘導するように、１またはそれより多いアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって、非ヒト種に由来する抗体の配列と異なる配列を有する。１つの態様において、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン中の特定のアミノ酸を突然変異させて、ヒト化抗体を産生する。別の態様において、ヒト抗体由来の定常ドメイン（単数または複数）を、非ヒト種の可変ドメイン（単数または複数）に融合させる。別の態様において、非ヒト抗体の１またはそれより多いＣＤＲ配列中の１またはそれより多いアミノ酸残基を変化させて、ヒト被験体に投与された際、非ヒト抗体のありうる免疫原性を減少させ、ここで抗原へのヒト化抗体の結合が、抗原への非ヒト抗体の結合より有意に劣らないように、変化させるアミノ酸残基は、抗原への抗体の免疫特異的結合にそれほど重要でないか、または作製されるアミノ酸配列への変化が保存的変化であるか、いずれかである。ヒト化抗体をどのように作製するかの例を、米国特許第６，０５４，２９７号、第５，８８６，１５２号、および第５，８７７，２９３号に見出すことも可能である。
【００３７】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１またはそれより多い領域および１またはそれより多い他の抗体由来の１またはそれより多い他の領域を含有する抗体を指す。１つの態様において、１またはそれより多いＣＤＲが、ヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体に由来する。別の態様において、すべてのＣＤＲが、ヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体に由来する。別の態様において、１より多いヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体由来のＣＤＲを混合し、そしてキメラ抗体中でマッチングさせる。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体の軽鎖由来のＣＤＲ１、第二のヒト抗ＴＩＭＰ−３抗体の軽鎖由来のＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第三の抗ＴＩＭＰ−３抗体由来の重鎖由来のＣＤＲを含んでもよい。他の組み合わせが可能であり、そして本発明の態様内に含まれる。
【００３８】
さらに、フレームワーク領域は、同じ抗ＴＩＭＰ−３抗体の１つに、ヒト抗体などの１またはそれより多い異なる抗体に、またはヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の１つの例において、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種由来であるか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体と同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する一方、鎖（単数または複数）の残りは、別の種由来であるか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体（単数または複数）と同一であるか、該抗体に相同であるか、または該抗体に由来する。やはり含まれるのは、所望の生物学的活性（すなわちＴＩＭＰ−３に特異的に結合する能力）を示す、こうした抗体の断片である。例えば米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−０７を参照されたい。
【００３９】
「ＬＲＰ−１阻害抗体」は、本明細書において実施例に記載するものなどのアッセイを用いて、過剰な抗ＴＩＭＰ−３抗体が、相互作用の量を、少なくとも約２０％減少させる場合の、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を阻害する抗体である。多様な態様において、抗原結合タンパク質は、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％減少させる。他の態様において、抗原結合タンパク質は、ＴＩＰ−３の集積を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％増加させる。
【００４０】
いくつかのＬＲＰ−１阻害抗体は、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害する可能性もあり、そしてまた、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に干渉する可能性もある。しかし、いくつかのＬＲＰ−１阻害抗体は、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に不都合に影響を及ぼすことなく、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害し；こうした抗体は、本明細書において、「アゴナイズ性」または「アゴニスト性」抗体と称される。アゴニスト性抗体は、一般的に、ＭＭＰ阻害活性の４０％未満、３０％、２０％、１０％、５％、１％、または１％未満の減少を生じるであろう。
【００４１】
抗体の断片または類似体は、本明細書の解説にしたがって、そして当該技術分野に周知の技術を用いて、一般の当業者によって、容易に調製可能である。断片または類似体のアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界近傍に存在する。公共のまたは私有の（proprietary）配列データベースに、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを比較することによって、構造ドメインおよび機能ドメインを同定することも可能である。コンピュータ比較法を用いて、既知の構造および／または機能を持つ他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定してもよい。既知の三次元構造にフォールディングするタンパク質配列を同定する方法が知られる。例えばＢｏｗｉｅら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４を参照されたい。
【００４２】
「ＣＤＲ移植抗体」は、特定の種またはアイソタイプの抗体由来の１またはそれより多いＣＤＲ、および同じまたは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークを含む抗体である。
【００４３】
「多重特異性抗体」は、１またはそれより多い抗原上の１より多いエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体のサブクラスは、同じまたは異なる抗原上の２つの別個のエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。
【００４４】
抗原結合タンパク質は、１ナノモルまたはそれより低い解離定数で、抗原に結合する場合、抗原（例えばヒトＴＩＭＰ−３）に「特異的に結合する」。
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用して、そして抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性およびアフィニティに寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する抗原結合タンパク質の部分である。抗原に特異的に結合する抗体に関しては、ＣＤＲドメインの少なくとも１つの少なくとも部分を含むであろう。
【００４５】
「エピトープ」は、抗原結合タンパク質によって（例えば抗体によって）結合される分子の部分である。エピトープは、分子の非隣接部分を含んでもよい（例えばポリペプチド中、ポリペプチドの一次配列においては隣接しないが、ポリペプチドの三次構造および四次構造の背景においては、互いに、抗原結合タンパク質によって結合されるのに十分に近い、アミノ酸残基）。エピトープはまた、抗原結合タンパク質以外の結合タンパク質が結合する分子部分を指す際にも使用可能であり、そして同様に、分子の直鎖、連続、または非連続部分も含んでもよい。
【００４６】
タンパク質配列および三次元構造の分析は、多くのタンパク質が、「単量体ドメイン」と称される多くの別個の単位で構成されることを明らかにしてきた。別個の単量体ドメインタンパク質の大部分は細胞外であるか、または膜結合タンパク質の細胞外部分を構成する。
【００４７】
別個の単量体ドメインの重要な特性は、単独で、または何らかの限定された補助をもってフォールディングする能力である。限定された補助には、シャペロニン（単数または複数）（例えば受容体関連タンパク質（ＲＡＰ））の補助が含まれうる。金属イオン（単数または複数）の存在もまた、限定された補助を提供しうる。単独でフォールディングする能力は、新規のタンパク質環境に挿入された際、ドメインのミスフォールディングを防止する。この特性は、別個の単量体ドメインが進化的に可動性であることを可能にしてきた。その結果、別個のドメインは進化中に分散してきており、そして現在、そうでなければ関連しないタンパク質中に存在する。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインおよび免疫グロブリン様ドメインを含むいくつかのドメインが、多くのタンパク質に存在する一方、他のドメインは限定された数のタンパク質中にしか見られない。
【００４８】
これらのドメインを含有するタンパク質は、多様なプロセス、例えば、細胞輸送体、コレステロール移動、発生および神経伝達に関与するシグナル伝達およびシグナル機能に関与する。Ｈｅｒｚ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ２４：１９３（２００１）；ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＢｒｏｗｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３１０（２００１）を参照されたい。別個の単量体ドメインの機能は、しばしば、特異的であるが、また、タンパク質またはポリペプチドの全体の活性にも寄与する。例えば、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン（クラスＡモジュール、補体型反復またはＡドメインとも称される）は、リガンド結合に関与する一方、ビタミンＫ依存性血液凝固タンパク質中に見られるガンマ−カルボキシグルタミン酸（gamma-carboxyglumatic acid）（Ｇｌａ）ドメインは、リン脂質膜への高アフィニティ結合に関与する。他の別個の単量体ドメインには、例えば、肝臓細胞への結合を仲介し、そしてそれによって循環からのこの線維素溶解酵素のクリアランスを制御する組織型プラスミノーゲンアクチベーター中の上皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン、および受容体仲介エンドサイトーシスに関与するＬＤＬ受容体の細胞質テールが含まれる。
【００４９】
個々のタンパク質が１またはそれより多い別個の単量体ドメインを所持する可能性もある。これらのタンパク質はしばしばモザイクタンパク質と呼ばれる。例えば、ＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーは、４つの主な構造ドメイン：システイン・リッチＡドメイン反復、上皮増殖因子前駆体様反復、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する。
【００５０】
ＬＤＬ受容体ファミリーには：１）細胞表面受容体であり；２）細胞外リガンドを認識し；そして３）リソソームによる分解のためにこれらを内在化する；メンバーが含まれる。Ｈｕｓｓａｉｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９：１４１（１９９９）を参照されたい。例えば、いくつかのメンバーには、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬ−Ｒ）、アポリポタンパク質Ｅ受容体２、ＬＤＬＲ関連タンパク質（ＬＲＰまたはＬＲＰ−１）およびメガリンが含まれる。ファミリーメンバーは、以下の特性を有する：１）細胞表面発現；２）Ａドメイン反復からなる細胞外リガンド結合；３）リガンド結合のためのカルシウム要求性；４）受容体関連タンパク質およびアポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｅの認識；５）ＹＷＴＤ反復を含有する上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体相同性ドメイン；６）単一の膜貫通領域；および７）多様なリガンドの受容体仲介性エンドサイトーシス。Ｈｕｓｓａｉｎ、上記を参照されたい。しかし、メンバーはいくつかの構造的に似ていないリガンドに結合する。
【００５１】
「ＬＲＰ−１ポリペプチド」または「ＬＲＰ−１ペプチド」は、本明細書において、ＬＲＰ−１の断片、例えばＬＲＰ−１の細胞外ドメイン（または「外部ドメイン」）の断片であることによって、ＬＲＰ−１に関連するポリペプチド（またはペプチド）である。ポリペプチドはＬＲＰ−１の１つの（またはそれより多い）リガンド結合クラスターを含んでもよい（例えば、ＨｅｒｚおよびＳｔｒｉｃｋｌａｎｄ、上記、および本明細書の実施例を参照されたい）。ポリペプチド（またはペプチド）は、リガンド結合クラスターの一部、例えば別個の単量体ドメイン、例えばＡドメインを含んでもよい。ポリペプチドは、さらに、別個の単量体ドメイン、例えばＡドメインの多量体（例えば、二量体または三量体、あるいはより高次の多量体）からなってもよい。多量体には、１より多い構造的に別個の（すなわち異なるアミノ酸配列を有する）単量体ドメインが含まれてもよいし、または単一の単量体ドメインの多数の反復が含まれてもよいし、または多数の反復単量体ドメインおよび構造的に別個のドメインの両方が含まれてもよい。
【００５２】
「ＬＲＰ−１阻害ポリペプチド」は、本明細書において実施例に記載するものなどのアッセイを用いて、過剰なポリペプチドが、相互作用の量を少なくとも約２０％減少させる場合の、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を阻害するポリペプチドである。多様な態様において、ポリペプチドは、ＬＲＰ−１とＴＩＭＰ−３の相互作用を、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％減少させる。他の態様において、ポリペプチドは、ＴＩＭＰ−３の集積を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％増加させる。
【００５３】
いくつかのＬＲＰ−１阻害ポリペプチドは、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害することも可能であり、そしてまた、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に干渉することも可能である。しかし、いくつかのＬＲＰ−１阻害ポリペプチドは、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に不都合に影響を及ぼすことなく、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合を阻害する；こうしたポリペプチドは、本明細書において、「アゴナイズ性」または「アゴニスト性」ポリペプチドと称される。アゴニスト性ポリペプチドは、一般的に、ＭＭＰ阻害活性の４０％未満、３０％、２０％、１０％、５％、１％または１％未満の減少を生じるであろう。
【００５４】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」は、デフォルト・パラメータを用い、ＧＡＰコンピュータ・プログラム（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）の一部）を用いて、配列を比較することによって決定される。
【００５５】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書全体を通じて交換可能に用いられ、そしてＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体（例えばペプチド核酸および非天然存在ヌクレオチド類似体）を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることも可能である。１つの態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、あるいはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異体をコードする、隣接オープンリーディングフレームを含む。
【００５６】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップを導入することなく、そしていずれの配列の５’端または３’端にも、対形成しないヌクレオチドを伴わずに、一方のポリヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドが、他方のポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチドと反対であるように、逆平行配向で整列可能であるならば、互いに「相補体」である。ポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で、２つのポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能であるならば、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドの相補体であることなく、該ポリヌクレオチドに相補的であることも可能である。
【００５７】
「ベクター」は、連結された別の核酸を、細胞内に導入するために使用可能な核酸である。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、その内部にさらなる核酸セグメントを連結可能な、直鎖または環状二重鎖ＤＮＡ分子を指す。別のタイプのベクターはウイルスベクター（例えば複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）であり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に導入可能である。特定のベクターは、導入された宿主細胞において、自律的に複製可能である（例えば細菌複製起点を含む細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）を組み込んで、そしてそれによって宿主ゲノムと一緒に複製させる。「発現ベクター」は、選択したポリヌクレオチドの発現を指示することも可能なベクターのタイプである。
【００５８】
ヌクレオチド配列は、制御配列が該ヌクレオチド配列の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼすならば、該制御配列に「機能可能であるように連結されて」いる。「制御配列」は、機能可能であるように連結されている核酸の発現（例えば発現のレベル、時期、または位置）に影響を及ぼす核酸である。制御配列は、例えば、制御される核酸に対して直接、あるいは１またはそれより多い他の分子（例えば制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を通じて、その効果を発揮する。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ、およびＢａｒｏｎら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載される。
【００５９】
「宿主細胞」は、核酸、例えば本発明の核酸を発現するために使用可能な細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよいし、または真核生物、例えば単細胞真核生物（例えば酵母（yeast）または他の真菌）、植物細胞（例えばタバコ（tobacco）またはトマト（tomato）植物細胞）、動物細胞（例えばヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞、または昆虫細胞）またはハイブリドーマであってもよい。宿主細胞の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのその誘導体および血清不含培地中で増殖する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１を参照されたい）またはＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−２０を参照されたい）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、アフリカミドリザル（African green monkey）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１を参照されたい）、ヒト胚性腎細胞、例えば２９３、２９３ ＥＢＮＡまたはＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。典型的には、宿主細胞は、その後、宿主細胞で発現可能なポリペプチドをコードする核酸で形質転換またはトランスフェクションされることが可能な培養細胞である。句「組換え宿主細胞」を用いて、発現しようとする核酸で形質転換されているかまたはトランスフェクションされている宿主細胞を示すことも可能である。宿主細胞はまた、核酸を含むが、機能可能であるように核酸と連結されるように制御配列が宿主細胞に導入されない限り、所望のレベルで該核酸を発現しない細胞であってもよい。用語、宿主細胞は、特定の対象の細胞だけでなく、こうした細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。例えば、突然変異または環境的影響によって、続く世代で特定の修飾が起こりうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、なお、本明細書において、この用語の範囲内に含まれる。
【００６０】
抗原結合タンパク質
１つの側面において、本発明は、ＴＩＭＰ−３、例えばヒトＴＩＭＰ−３に結合する、抗原結合タンパク質（例えば抗体、抗体断片、抗体誘導体、抗体突然変異タンパク質、および抗体変異体）を提供する。
【００６１】
異なる抗原結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３の異なるドメインまたはエピトープに結合するか、あるいは異なる作用機構によって作用することも可能である。例には、限定されるわけではないが、ＴＩＭＰ−３がＬＲＰ−１に結合する能力に干渉するか、またはＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力を阻害する、抗原結合タンパク質が含まれる。さらなる例には、ＴＩＭＰ−３がＬＲＰ−１に結合する能力に干渉するが、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力を阻害しない抗原結合タンパク質（すなわちＴＩＭＰ−３アゴニスト）が含まれる。特定の疾患を治療する際のＴＩＭＰ−３結合性抗原結合タンパク質の特定の作用機構の本明細書の考察は、例示のみであり、そして本明細書に提示する方法は、それに束縛されない。
【００６２】
本発明の範囲内の抗ＴＩＭＰ−３抗体の他の誘導体には、抗ＴＩＭＰ−３抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現によるなどの、他のタンパク質またはポリペプチドとの抗ＴＩＭＰ−３抗体またはその断片の共有または凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであってもよい。抗原結合タンパク質を含有する融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製または同定を促進するために付加されるペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含んでもよい。また、抗原結合タンパク質を、Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるような、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２）に連結してもよい。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドは、非常に抗原性であり、そして特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドが所定のポリペプチドに融合される融合タンパク質を調製するのに有用な試薬が、商業的に入手可能である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）。
【００６３】
１またはそれより多い抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーをＴＩＭＰ−３アゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合したまたは非共有結合した、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーの形であることも可能である。２またはそれより多い抗原結合タンパク質を含むオリゴマーが使用のために意図され、一例がホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
【００６４】
１つの態様は、抗原結合タンパク質に融合したペプチド部分間の共有相互作用または非共有相互作用を介して連結された、多数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーに向けられる。こうしたペプチドは、ペプチド・リンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。以下により詳細に記載するように、ロイシンジッパー、および抗体由来の特定のポリペプチドが、それに付着した抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進可能なペプチドの中にある。
【００６５】
特定の態様において、オリゴマーは、２〜４の抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、上述の型のいずれか、例えば変異体または断片などの、いかなる型であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＴＩＭＰ−３結合活性を有する、抗原結合タンパク質を含む。
【００６６】
１つの態様において、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９１，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら，１９９２“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，補遺４，１０．１９．１−１０．１９．１１ページによって記載されてきている。
【００６７】
本発明の１つの態様は、抗ＴＩＭＰ−３抗体のＴＩＭＰ−３結合断片を、抗体のＦｃ領域に融合させることによって生成される２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられる。二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を、適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞において、遺伝子融合体を発現させ、そして発現された融合タンパク質を抗体分子とそっくりに集合させて、その際、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるのを可能にして、二量体を生じることによって、作製可能である。
【００６８】
用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書において、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然型および突然変異タンパク質型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除（truncated）型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティクロマトグラフィーによって精製が容易であるという利点を提供する。
【００６９】
１つの適切なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少したアフィニティを示す。
【００７０】
他の態様において、抗ＴＩＭＰ−３抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、抗体重鎖および／または軽鎖の可変部分に対して置換してもよい。
あるいは、オリゴマーは、ペプチド・リンカー（スペーサー・ペプチド）を含むかまたは含まない、多数の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチド・リンカーの中には、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるものがある。
【００７１】
オリゴマー性抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質で同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９）、そして以来、多様な異なるタンパク質で発見されてきた。既知のロイシンジッパーの中には、二量体化または三量体化する天然存在ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマー性タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例が、本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０３０８に記載され、そして肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーが、Ｈｏｐｐｅら，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１に記載される。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、修飾ロイシンジッパーの使用が、Ｆａｎｓｌｏｗら，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載される。１つのアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合した抗ＴＩＭＰ−３抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞において発現させて、そして形成される可溶性オリゴマー性抗ＴＩＭＰ−３抗体断片または誘導体を、培養上清から回収する。
【００７２】
１つの側面において、本発明は、ＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合に干渉する抗原結合タンパク質を提供する。ＴＩＭＰ−３、あるいはその断片、変異体または誘導体に対して、こうした抗原結合タンパク質を作製し、そしてＬＲＰ−１へのＴＩＭＰ−３の結合に干渉する能力に関して、慣用的なアッセイでスクリーニングしてもよい。適切なアッセイの例は、本明細書に開示され、そしてこれには、例えば培養中またはｅｘ ｖｉｖｏで、ＬＲＰ−１への結合を阻害する能力に関して、抗原結合タンパク質を試験するアッセイ、またはＴＩＭＰ−３の量を増加させる能力に関して、抗原結合タンパク質を試験するアッセイが含まれる。抗原結合タンパク質を試験する、さらなるアッセイには、ＴＩＭＰ−３ポリペプチドへの既知の抗原結合タンパク質の結合に対して、ＴＩＭＰ−３ポリペプチドへの抗原結合タンパク質の結合を、定性的にまたは定量的に比較するものが含まれ、そのいくつかの例を本明細書に開示する。
【００７３】
別の側面において、本発明は、種選択性を示す抗原結合タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合タンパク質は、１またはそれより多い哺乳動物ＴＩＭＰ−３に、例えばヒトＴＩＭＰ−３に、そしてマウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ（gerbil）、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＴＩＭＰ−３の１またはそれより多くに結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、１またはそれより多い霊長類ＴＩＭＰ−３に、例えば、ヒトＴＩＭＰ−３に、そしてカニクイザル（cynomologus）、マーモセット（marmoset）、アカゲザル（rhesus）、タマリン（tamarin）およびチンパンジー（chimpanzee）ＴＩＭＰ−３の１またはそれより多くに結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、タマリンまたはチンパンジーＴＩＭＰ−３に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＴＩＭＰ−３の１またはそれより多くに結合しない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、マーモセットなどの新世界ザル種には結合しない。
【００７４】
別の態様において、抗原結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、哺乳動物ＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、霊長類ＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＴＩＭＰ−３以外の天然存在タンパク質のいずれにも特異的結合を示さない。別の態様において、抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３に特異的に結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、非ヒト霊長類、カニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３に、類似の結合アフィニティで、特異的に結合する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、非ヒト霊長類、カニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３の活性を遮断する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載するようなアッセイにおいて、非ヒト霊長類、カニクイザル、およびヒトＴＩＭＰ−３に対して、類似のＩＣ５０またはＥＣ５０を有する。
【００７５】
当該技術分野に周知の方法を用いて、そして本明細書の解説にしたがって、ＴＩＭＰ−３に対する抗原結合タンパク質の選択性を測定してもよい。例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを用いて、選択性を測定してもよい。
【００７６】
慣用的技術によって、本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合断片を産生してもよい。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子操作技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた意図される。
【００７７】
さらなる態様には、キメラ抗体、例えば非ヒト（例えばネズミ）モノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。既知の技術によって、こうしたヒト化抗体を調製してもよく、そしてこうした抗体は、ヒトに投与された際、免疫原性が減少しているという利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変ドメイン（あるいはその抗原結合部位のすべてまたは一部）およびヒト抗体由来の定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変ドメイン断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。キメラ抗体およびさらに操作されたモノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３，Ｌｉｕら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９，Ｌａｒｒｉｃｋら，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４，およびＷｉｎｔｅｒら，１９９３，ＴＩＰＳ １４：１３９に記載されるものが含まれる。１つの態様において、キメラ抗体はＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化するための技術は、例えば米国特許出願第１０／１９４，９７５号（２００３年２月２７日公開）、米国特許第５，８６９，６１９号、第５，２２５，５３９号、第５，８２１，３３７号、第５，８５９，２０５号、Ｐａｄｌａｎら，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３−３９，およびＴａｍｕｒａら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２−４１に論じられる。
【００７８】
非ヒト動物において、ヒト抗体または部分的ヒト抗体を生成するための方法が開発されてきている。例えば、１またはそれより多い内因性免疫グロブリン遺伝子が、多様な手段によって不活性化されたマウスが用意されてきている。ヒト免疫グロブリン遺伝子が該マウスに導入され、不活性化されたマウス遺伝子が置換されている。該動物において産生される抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質にコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を取り込む。１つの態様において、ＴＩＭＰ−３ポリペプチドに対して向けられる抗体がトランスジェニックマウスなどの非ヒト動物において生成されるように、該動物をＴＩＭＰ−３ポリペプチドで免疫する。適切な免疫原の一例は、ＴＩＭＰ−３のＬＲＰ−１結合ドメインを含むポリペプチドなどの可溶性ヒトＴＩＭＰ−３、または他の免疫原性断片ＴＩＭＰ−３である。適切な免疫原の別の例は、高レベルのＴＩＭＰ−３を発現している細胞、または該細胞に由来する細胞膜調製物である。
【００７９】
ヒト抗体または部分的ヒト抗体の産生用のトランスジェニック動物の産生および使用のための技術の例が、米国特許第５，８１４，３１８号、第５，５６９，８２５号、および第５，５４５，８０６号、Ｄａｖｉｓら，２００３，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ，”Ｌｏ監修 Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ中，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ：１９１−２００，Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら，２００２，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−９７，Ｒｕｓｓｅｌら，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．６８：１８２０−２６，Ｇａｌｌｏら， ２０００，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４−４０，Ｄａｖｉｓら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１８：４２１−２５，Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１：１１−２３，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ３１：３３−４２，Ｇｒｅｅｎら，１９９８，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ．７：６０７−１４，Ｔｓｕｄａら，１９９７，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４２：４１３−２１，Ｍｅｎｄｅｚら，１９９７，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．４：７６１−６３，Ａｒｂｏｎｅｓら，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１：２４７−６０，Ｇｒｅｅｎら，１９９４，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５−５８，Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９０：２５５１−５５．Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら １９９３，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：６４７−６５６，Ｃｈｏｉら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１７−２３，Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−５１，Ｈａｒｄｉｎｇら，１９９５，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−５９，Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ中１１３：４９−１０１，Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９５，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３：６５−９３，Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９９６，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４：８２６，Ｔａｙｌｏｒら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：６２８７−９５，Ｔａｙｌｏｒら，１９９４，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：５７９−９１，Ｔｏｍｉｚｕｋａら，１９９７，Ｎａｔ Ｇｅｎ １６：１３３−４３，Ｔｏｍｉｚｕｋａら，２０００，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：７２２−２７，Ｔｕａｉｌｌｏｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３７２０−２４，およびＴｕａｉｌｌｏｎら，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：２９１２−２０に記載される。これらの例および他の例はまた、米国特許出願公報２００７−００９８７１５、２００７年５月３日公開に論じられる。
【００８０】
別の側面において、本発明は、ＴＩＭＰ−３に結合するモノクローナル抗体を提供する。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、免疫スケジュールの完了後に、トランスジェニック動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって、モノクローナル抗体を産生してもよい。当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、例えば、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生することによって、脾臓細胞を不死化してもよい。ハイブリドーマを産生する融合法で使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、そして所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖することが不可能であるようにする酵素不全を有する。マウス融合体で使用するのに適した細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが含まれ；ラット融合体で使用する細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が含まれる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【００８１】
１つの態様において、動物（例えばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＴＩＭＰ−３免疫原で免疫し；免疫した動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、そしてＴＩＭＰ−３ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株を産生する。こうしたハイブリドーマ細胞株、およびこれらに産生される抗ＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体が、本発明に含まれる。
【００８２】
当該技術分野に知られるいかなる技術を用いて、ハイブリドーマ細胞株に分泌されるモノクローナル抗体を精製してもよい。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、ＴＩＭＰ−３が誘導する活性を遮断する能力などの、特定の特性を持つｍＡｂを同定してもよい。こうしたスクリーニングの例を以下の実施例に提供する。
【００８３】
また、遺伝子免疫と称されるプロセスを用いて、モノクローナル抗体を産生してもよい。例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスベクターなど）内に、関心対象の抗原をコードする核酸を取り込んでもよい。次いで、生じたベクターを用いて、適切な宿主動物（例えば、非肥満糖尿病またはＮＯＤマウス）において、関心対象の抗原に対する免疫応答を発展させる。この技術は、Ｒｉｔｔｅｒら，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ１６（１）：３−１０（２００２）に実質的に記載され、該文献の開示は本明細書に援用される。
【００８４】
１つの側面において、本発明は、本発明の抗ＴＩＭＰ−３抗体の抗原結合断片を提供する。こうした断片は、完全に抗体由来配列からなってもよいし、またはさらなる配列を含んでもよい。抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が含まれる。他の例が、Ｌｕｎｄｅら，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６に提供される。
【００８５】
アミノ酸架橋（短いペプチド・リンカー）を介して、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を連結して、単一ポリペプチド鎖を生じることによって、一本鎖抗体を形成してもよい。こうした一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２つの可変ドメイン・ポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間に、ペプチド・リンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって、調製されてきている。２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、生じるポリペプチドは、それ自体、折り畳まれて、抗原結合性単量体を形成することも可能であるし、または多量体（例えば二量体、三量体、または四量体）を形成することも可能である（Ｋｏｒｔｔら，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することも可能である（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体産生のために開発された技術には、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９；Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４，ｄｅ Ｇｒａａｆら，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載されるものが含まれる。
【００８６】
本発明の抗原結合タンパク質（例えば抗体、抗体断片、および抗体誘導体）は、当該技術分野に知られる定常領域いずれを含んでもよい。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒト・カッパ型またはラムダ型軽鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域、例えばヒト・アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域であってもよい。１つの態様において、軽鎖または重鎖定常領域は、天然存在定常領域の断片、誘導体、変異体、または突然変異タンパク質である。
【００８７】
関心対象の抗体から、異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を得るための技術、すなわちサブクラス・スイッチングが知られる。したがって、例えば、ＩｇＭ抗体からＩｇＧ抗体を得ることも可能であり、そして逆も可能である。こうした技術は、所定の抗体（親抗体）の抗原結合特性を所持するが、親抗体のものと異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性もまた示す、新規抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードする、クローニングされたＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡを、こうした方法において使用してもよい。Ｌａｎｔｔｏら，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６もまた参照されたい。さらに、ＩｇＧ４が望ましい場合、本明細書に援用される、Ｂｌｏｏｍら，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７に記載されるようなヒンジ領域中の点突然変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入して、ＩｇＧ４抗体における不均一性を導きうる、Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を軽減することが望ましい可能性もまたある。
【００８８】
さらに、異なる特性（すなわち結合する抗原に対する多様なアフィニティ）を有する抗原結合タンパク質を得るための技術もまた知られる。チェインシャッフリング（chain shuffling）と呼ばれる１つのこうした技術は、糸状バクテリオファージの表面上に免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーをディスプレイすることを伴い、しばしばファージ・ディスプレイと呼ばれる。チェインシャッフリングは、Ｍａｒｋｓら，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に記載されるように、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高アフィニティ抗体を調製するのに用いられてきている。
【００８９】
抗体結合部位の中央の相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化もまた、増加したアフィニティを持つ抗体、例えばＳｃｈｉｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１に記載されるように、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対して増加したアフィニティを有する抗体を単離するのに用いられてきている。したがって、こうした技術は、ＴＩＭＰ−３に対する抗体を調製する際に有用である。
【００９０】
１つの態様において、本発明はＴＩＭＰ−３からの低い解離定数を有する抗原結合タンパク質を提供する。１つの態様において、抗原結合タンパク質は、１００ｐＭまたはそれより低いＫｄを有する。別の態様において、Ｋｄは１０ｐＭまたはそれより低く；別の態様において、５ｐＭまたはそれより低く、あるいは１ｐＭまたはそれより低い。別の態様において、Ｋｄは、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じである。別の態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じＫｄで、ＴＩＭＰ−３に結合する。
【００９１】
本発明は、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質、例えば、２つの異なる抗原結合部位または領域を介して、ＴＩＭＰ−３の２つの異なるエピトープに、またはＴＩＭＰ−３のエピトープおよび別の分子のエピトープに結合する、抗原結合タンパク質をさらに提供する。さらに、本明細書に開示するような二重特異性抗原結合タンパク質は、他の刊行物に言及して、本明細書に記載するものを含めて、本明細書に記載する抗体の１つ由来のＴＩＭＰ−３結合部位および本明細書に記載する別の抗体由来の第二のＴＩＭＰ−３結合領域を含むことも可能である。あるいは、二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する抗体の１つに由来する抗原結合部位、および当該技術分野に知られる別のＴＩＭＰ−３抗体由来、あるいは既知の方法または本明細書に記載する方法によって調製される抗体由来の第二の抗原結合部位を含んでもよい。
【００９２】
二重特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、そして２００１年４月２０日出願の米国特許出願０９／８３９，６３２（本明細書に援用される）に論じられる。こうした方法には、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７、および他のもの（米国特許第４，４７４，８９３号、米国特許第６，１０６，８３３号）に記載されるようなハイブリッド−ハイブリドーマの使用、ならびに抗体断片の化学的カップリングの使用（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１；Ｇｌｅｎｎｉｅら，１９８７，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７；米国特許第６，０１０，９０２号）が含まれる。さらに、例えばロイシンジッパー部分（すなわち、優先的にヘテロ二量体を形成する、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のもの；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１４８：１５４７）または米国特許第５，５８２，９９６号に記載されるような、他の錠前および鍵の相互作用ドメイン構造を用いることによって、組換え手段を介して、二重特異性抗体を産生可能である。さらなる有用な技術には、Ｋｏｒｔｔら、１９９７、上記；米国特許第５，９５９，０８３号；および米国特許第５，８０７，７０６号に記載されるものが含まれる。
【００９３】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質に関する使用
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、ＴＩＭＰ−３またはＴＩＭＰ−３を発現する細胞の存在を検出するアッセイにおいて使用可能である。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質はまた、イムノアフィニティクロマトグラフィーによってＴＩＭＰ−３タンパク質を精製する際にも使用可能である。ＬＲＰ−１およびＴＩＭＰ−３の相互作用をさらに遮断することも可能なＴＩＭＰ−３結合タンパク質を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＩＭＰ−３の集積を増加させ、そして／またはＴＩＭＰ−３の内因性レベルを増進することも可能である。ＴＩＭＰ−３がＭＭＰを阻害する能力に不都合に影響を与えることなく、ＴＩＭＰ−３の集積を増加させるＴＩＭＰ−３結合タンパク質（すなわちＴＩＭＰ−３アゴニストとして）を用いて、ＴＩＭＰ−３の生物学的活性を増加させることも可能である。ＴＩＭＰ−３アゴニストとして機能するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を、限定されるわけではないが、炎症状態を含む、より高いレベルのＴＩＭＰ−３活性が望ましい任意の状態（すなわち、ＭＭＰ、および／またはＴＩＭＰ−３によって阻害される他のプロテイナーゼが役割を果たす状態）を治療する際に使用してもよい。１つの態様において、こうした状態を治療する際に、トランスジェニックマウスの免疫を伴う方法によって生成されるヒト抗ＴＩＭＰ−３モノクローナル抗体を使用する。
【００９４】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法で使用してもよく、またはｉｎ ｖｉｖｏで投与して、ＴＩＭＰ−３の集積を増加させ、ＴＩＭＰ−３の内因性レベルを上昇させ、そして／またはＴＩＭＰ−３が誘導する生物学的活性を増進させてもよい。このようにして、その例が本明細書に提供される、ＴＩＭＰ−３阻害可能プロテイナーゼによって引き起こされるかまたは悪化させられる（直接または間接的に）障害を、治療してもよい。１つの態様において、本発明は、ＴＩＭＰ−３が誘導する生物学的活性を増加させるのに有効な量で、その必要がある哺乳動物に、アゴニスト性ＴＩＭＰ−３結合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与する工程を含む療法を提供する。別の態様において、本発明は、ＴＩＭＰ−３の内因性レベルを上昇させるのに有効な量で、その必要がある哺乳動物に、アゴニスト性ＴＩＭＰ−３結合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ投与する工程を含む療法を提供する。
【００９５】
本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質には、部分的ヒトおよび完全ヒト・モノクローナル抗体、ならびにＬＲＰ−１ポリペプチドまたはペプチドが含まれる。１つの態様は、ＴＩＭＰ−３の活性を少なくとも部分的にアゴナイズする、ヒト・モノクローナル抗体に向けられる。１つの態様において、ＴＩＭＰ−３免疫原でトランスジェニックマウスを免疫することによって、抗体を生成する。別の態様において、免疫原は、ヒトＴＩＭＰ−３ポリペプチド（例えばＴＩＭＰ−３を発現するよう形質転換またはトランスフェクションされた細胞、あるいはＴＩＭＰ−３を天然に発現する細胞）である。こうした免疫マウスから得られるハイブリドーマ細胞株であって、ＴＩＭＰ−３に結合するモノクローナル抗体を分泌する、前記ハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に提供する。
【００９６】
ヒト抗体、部分的ヒト抗体、またはヒト化抗体は、多くの適用、特にヒト被験体への抗体の投与を伴うものに適切であろうが、特定の適用には、他のタイプの抗体が適切であろう。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えばカニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えばチンパンジー）など）などの抗体産生動物いずれに由来してもよい。
【００９７】
本発明の非ヒト抗体を、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養に基づく適用、あるいは本発明の抗体に対する免疫応答が起こらないか、重要でないか、防止可能であるか、それに関する懸念がないか、またはそれが望ましい、他の適用いずれかにおいて、使用してもよい。１つの態様において、本発明の非ヒト抗体を、非ヒト被験体に投与する。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体において、免疫応答を誘発しない。別の態様において、非ヒト抗体は、非ヒト被験体と同じ種由来であり、例えば本発明のマウス抗体をマウスに投与する。
【００９８】
特定の種由来の抗体を、例えば、その種の動物を所望の免疫原（例えばＴＩＭＰ−３を発現している細胞、または可溶性ＴＩＭＰ−３ポリペプチド）で免疫するか、またはその種の抗体を生成するための人工的系（例えば特定の種の抗体を生成するための細菌またはファージ・ディスプレイに基づく系）を用いることによって、あるいは例えば抗体の定常領域を他の種由来の定常領域で置換することにより、１つの種由来の抗体を別の種由来の抗体に変換することによって、あるいは他の種由来の抗体の配列により緊密に似るように、抗体の１またはそれより多いアミノ酸残基を置換することによって、作製してもよい。１つの態様において、抗体は、２またはそれより多い異なる種由来の抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
【００９９】
いくつかの慣用的技術のいずれによって、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を調製してもよい。例えば、当該技術分野に知られる技術いずれかを用いて、天然に該タンパク質を発現する細胞から精製してもよいし（例えば抗体を産生するハイブリドーマから抗体を精製してもよい）、または組換え発現系で産生してもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８０）；ならびにＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【０１００】
当該技術分野に知られるいかなる発現系を用いて、本発明の組換えポリペプチドを作製してもよい。一般的に、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで、宿主細胞を形質転換する。使用可能な宿主細胞の中には、原核生物、酵母またはより高次の真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス（bacilli）が含まれる。より高次の真核細胞には、昆虫細胞および哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に記載されるような、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株が含まれる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターが、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク，１９８５）に記載される。
【０１０１】
ポリペプチドの発現を促進する条件下で形質転換細胞を培養し、そして慣用的なタンパク質精製法によってポリペプチドを回収してもよい。１つのこうした精製法には、例えば結合したＴＩＭＰ−３のすべてまたは一部を有するマトリックス上での、アフィニティクロマトグラフィーの使用が含まれる。本明細書において使用が意図されるポリペプチドには、混入する内因性物質を実質的に含まない、実質的に均質な組換え哺乳動物ＴＩＭＰ−３結合ポリペプチドが含まれる。
【０１０２】
いくつかの既知の技術のいずれによって、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を調製し、そして所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。特定の技術は、関心対象のＴＩＭＰ−３結合タンパク質（例えば抗ＴＩＭＰ−３抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部）をコードする核酸を単離し、そして組換えＤＮＡ技術を通じて核酸を操作することを伴う。核酸を、関心対象の別の核酸に融合させるか、または改変して（例えば突然変異誘発または他の慣用的技術によって）、例えば、１またはそれより多いアミノ酸残基を付加するか、欠失させるか、または置換してもよい。
【０１０３】
１つの側面において、本発明は、例えばＴＩＭＰ−３の集積を増加させるかまたは内因性ＴＩＭＰ−３のレベルを上昇させることによって、ＴＩＭＰ−３の活性をアゴナイズするＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。別の態様において、抗原結合タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体と実質的に同じ量で、ＴＩＭＰ−３の活性をアゴナイズする。
【０１０４】
１つの態様において、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３に対して１０００ｐＭまたはそれより低い見かけのアフィニティを有する。他の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、５００ｐＭまたはそれより低い、２００ｐＭまたはそれより低い、１００ｐＭまたはそれより低い、あるいは８０ｐＭまたはそれより低い、見かけのアフィニティを示す。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、本明細書において実施例に記載する抗体またはＬＲＰペプチドのものと実質的に同じ見かけのアフィニティを示す。
【０１０５】
別の態様において、本発明は、ＴＩＭＰ−３への結合に関して、本明細書に開示するＴＩＭＰ−３結合タンパク質と競合するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。当該技術分野に周知の方法によって、例えばＥＬＩＳＡなどのアッセイにおけるＴＩＭＰ−３への結合における競合によって、または本明細書に記載する別のアッセイにおける競合によって、こうした競合能を決定してもよい。１つの側面において、ＴＩＭＰ−３への結合に関して、本明細書に開示するポリペプチドと競合するＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、該ポリペプチドと同じエピトープまたは重複する（または隣接する）エピトープに結合する。別の側面において、ＴＩＭＰ−３への結合に関して、本明細書に開示するポリペプチドと競合するＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、ＴＩＭＰ−３の活性をアゴナイズする。
【０１０６】
別の側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えばヒト被験体に投与した際）、少なくとも１日の半減期を有するＴＩＭＰ−３結合タンパク質を提供する。１つの態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、少なくとも３日の半減期を有する。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、４日またはそれより長い半減期を有する。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、８日またはそれより長い半減期を有する。別の態様において、非誘導体化または非修飾ＴＩＭＰ−３結合タンパク質に比較した際、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質が、より長い半減期を有するように、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を誘導体化するかまたは修飾する。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、本明細書に援用される、２０００年２月２４日公開のＷＯ ００／０９５６０に記載されるような、血清半減期を増加させる１またはそれより多い点突然変異を含有する。
【０１０７】
別の側面において、本発明のポリペプチド（抗原結合タンパク質を含む）は、ポリペプチドの誘導体を含む。誘導体化ポリペプチドは、特定の使用における半減期増加など、ポリペプチドに望ましい特性を与える分子または物質いずれかを含んでもよい。誘導体化ポリペプチドは、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば放射性、比色、抗原性または酵素性分子、検出可能ビーズ（磁気ビーズまたは電子密度が高い（electrodense）（例えば金）ビーズなど）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン））、療法または診断部分（例えば放射性、細胞傷害性、または薬学的活性部分）、あるいは特定の使用（例えばヒト被験体などの被験体への投与、あるいは他のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用）のためのポリペプチドの適合性を増加させる分子を含むことも可能である。１つのこうした例において、例えばＷＯ２００８０６３２９１および／またはＲｏｔｈｅｎｆｌｕｈら，ＮａｔｕｒｅＭａｔｅｒｉａｌｓ ７：２４８（２００８）に開示されるように、関節軟骨組織に特異的に結合するリガンドで、ポリペプチドを誘導体化する。
【０１０８】
ポリペプチドを誘導体化するのに使用可能な分子の例には、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。当該技術分野に周知の技術を用いて、ポリペプチドのアルブミン連結誘導体およびＰＥＧ化誘導体を調製することも可能である。１つの態様において、ポリペプチドをトランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体にコンジュゲート化するかまたは別の方式で連結させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体を、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン（pyurrolidone））、ポリエチレングリコール、プロプロピレン（propropylene）グリコール・ホモポリマー、酸化ポリプロピレン／酸化エチレン・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学薬品で化学的に修飾してもよい（米国特許出願第２００３０１９５１５４号）。
【０１０９】
別の側面において、本発明は、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質を用いて、ＴＩＭＰ−３に結合する分子に関してスクリーニングする方法を提供する。いかなる適切なスクリーニング技術を用いてもよい。１つの態様において、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質が結合するＴＩＭＰ−３分子またはその断片を、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質および別の分子と接触させ、ここで、他の分子が、ＴＩＭＰ−３へのＴＩＭＰ−３結合タンパク質の結合を減少させるならば、該分子はＴＩＭＰ−３に結合する。適切な方法いずれか、例えばＥＬＩＳＡを用いて、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質の結合を検出してもよい。ＴＩＭＰ−３へのＴＩＭＰ−３結合タンパク質の結合の検出は、上に論じるように、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を検出可能に標識することによって、単純化可能である。別の態様において、ＴＩＭＰ−３結合分子をさらに分析して、ＴＩＭＰ−３活性をアゴナイズする（すなわちＴＩＭＰ−３の集積を増加させ、そして／またはＴＩＭＰ−３の内因性レベルを増進する）かどうかを決定する。
【０１１０】
組成物
やはり本発明に含まれるのは、本発明のポリペプチド産物の有効量を、ＴＩＭＰ−３療法（すなわち、ＴＩＭＰ−３の内因性レベルの増加が有用である状態）において有用な、薬学的に許容されうる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアーと一緒に含む薬学的組成物である。こうした組成物には、多様な緩衝液内容物（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール）および膨張性物質（例えばラクトース、マンニトール）などの添加剤；タンパク質へのポリエチレングリコールなどのポリマーの共有結合（上に論じるとおり、例えば本明細書に援用される米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物への、またはリポソーム内への物質の取り込みが含まれる。こうした組成物は、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度、およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼすであろう。例えば、本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン １８０４２）１４３５−１７１２ページを参照されたい。
【０１１１】
一般的に、レシピエントの年齢、体重および状態または疾患の重症度によって、本発明のポリペプチドの有効量を決定する。本明細書に援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，上記，６９７−７７３ページを参照されたい。典型的には、約０．００１ｇ／ｋｇ体重〜約１ｇ／ｋｇ体重の間の投薬量を用いてもよいが、当業者が認識するであろうように、より多い量またはより少ない量を用いてもよい。局部（すなわち非全身性）適用、例えば局所または関節内適用に関しては、投薬量は、約０．００１ｇ／ｃｍ２〜約１ｇ／ｃｍ２の間であってもよい。投薬は、毎日１回またはそれより多いか、またはより少ない頻度であってもよく、そして本明細書に記載するような他の組成物と組み合わせてもよい。本発明が本明細書に言及する投薬量に限定されないことに注目すべきである。
【０１１２】
関連分野で理解されるように、本発明の分子を含む薬学的組成物を、適応症に適した方式で、被験体に投与する。限定されるわけではないが、非経口、局所、または吸入によるものを含む、いかなる適切な技術によって、薬学的組成物を投与してもよい。注射する場合、薬学的組成物を、例えば、動脈内、静脈内、筋内、病巣内、腹腔内または皮下経路を介して、ボーラス注射によって、あるいは連続注入によって、投与してもよい。局在化投与、例えば疾患部位または傷害部位での投与が意図され、経皮送達および移植物からの持続放出も同様である。吸入による送達には、例えば、鼻または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル型での吸入等が含まれる。他の代替物には、点眼剤；丸剤、シロップ、ロゼンジまたはチューインガムを含む経口調製物；ならびにローション、ジェル、スプレー、および軟膏などの局所調製物が含まれる。
【０１１３】
細胞外マトリックスおよび組織の動的平衡を維持するため、複数の剤が協調して作用する。平衡が歪んだ状態の治療において、１またはそれより多い他の剤を本発明のポリペプチドと組み合わせて用いてもよい。これらの他の剤を同時投与するか、または連続して投与するか、あるいはその組み合わせで投与してもよい。一般的に、これらの他の剤は、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、マトリックス分解酵素阻害剤、細胞内酵素、細胞接着調節剤、ならびに細胞外マトリックス分解プロテイナーゼおよびその阻害剤の発現を制御する因子からなるリストから選択されてもよい。特定の例を以下に列挙するが、当業者は、さらなる剤、または列挙する剤の他の形（例えば合成的に産生されるもの、組換えＤＮＡ技術を介するもの、ならびにその類似体および誘導体など）を含めて、同等の機能を実行する他の剤を認識するであろう。
【０１１４】
細胞外マトリックス分解の増加またはより特異的な防止が望ましい場合、他の分解阻害剤もまた用いてもよい。アルファ２マクログロブリン、妊娠性血漿タンパク質、オボスタチン、アルファ１−プロテイナーゼ阻害剤、アルファ２−抗プラスミン、アプロチニン、プロテアーゼ・ネキシン−１、プラスミノーゲン・アクチベーター阻害剤（ＰＡＩ）−１、ＰＡＩ−２、ＴＩＭＰ−１、およびＴＩＭＰ−２からなる群より阻害剤を選択してもよい。当業者が認識するであろうように、他のものを用いてもよい。
【０１１５】
細胞内酵素もまた、本発明のポリペプチドと組み合わせて使用可能である。細胞内酵素もまた、細胞外マトリックス分解に影響を及ぼす可能性もあり、そしてこれには、リソソーム（lysozomal）酵素、グリコシダーゼおよびカテプシンが含まれる。
【０１１６】
細胞接着調節剤もまた、本発明のポリペプチドと組み合わせてもよい。例えば、本発明のポリペプチドを用いて、細胞外マトリックス分解の阻害前、阻害中、または阻害後に、細胞外マトリックスへの細胞接着を調節しようと望む可能性もある。細胞外マトリックスへの細胞接着を示してきた細胞には、破骨細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、キラーＴ細胞およびマスト細胞が含まれる。細胞接着調節剤には、「ＲＧＤ」モチーフを含有するペプチド、あるいは類似体または模倣体アンタゴニストまたはアゴニストが含まれる。
【０１１７】
細胞外マトリックス分解プロテイナーゼの発現を制御する因子およびその阻害剤には、サイトカイン、例えばＩＬ−１およびＴＮＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、グルココルチコイド、およびレチノイドが含まれる。望ましい効果が、こうした細胞性効果と組み合わせて、本発明のポリペプチドを用いて、細胞外マトリックスの分解を阻害することである場合、細胞増殖および／または分化を達成する他の増殖因子もまた、用いてもよい。例えば、炎症中、細胞外マトリックスの維持（酵素活性の阻害を介して）が望ましいが、好中球の産生が望ましい可能性もある；したがって、Ｇ−ＣＳＦを投与してもよい。他の因子には、エリスロポエチン、インターロイキン・ファミリーメンバー、ＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＥＧＦ、ＦＧＦファミリーメンバー、例えばＫＧＦ、ＰＤＧＦ、および他のものが含まれる。インターフェロン、例えばインターフェロン・アルファ、ベータ、ガンマ、またはコンセンサス・インターフェロンの活性がさらに望ましい可能性もある。細胞内剤には、Ｇタンパク質、プロテインキナーゼＣおよびイノシトール・ホスファターゼが含まれる。本発明のポリペプチドの使用は、炎症療法に関与する１またはそれより多い剤を伴って、療法的利点を提供しうる。
【０１１８】
細胞輸送剤もまた使用可能である。例えば、炎症は、細胞外マトリックスの分解、ならびに傷害部位への細胞の移動または輸送を伴う。細胞外マトリックス分解の防止は、こうした細胞輸送を防止しうる。したがって、本発明のポリペプチドを細胞輸送調節剤のアゴニストまたはアンタゴニストと組み合わせて使用すると、炎症治療に望ましい可能性もある。細胞輸送調節剤は、内皮細胞表面受容体（例えばＥ−セレクチンおよびインテグリン）；白血球表面受容体（Ｌ−セレクチン）；ケモカインおよび走化性因子からなるリストより選択可能である。炎症に関与する組成物の概説に関しては、本明細書に援用される、Ｃａｒｌｏｓら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１１４：５−２８（１９９０）を参照されたい。
【０１１９】
さらに、組成物には、ｎｅｕ分化因子、「ＮＤＦ」が含まれてもよく、そして治療法には、ＴＩＭＰ−３の投与前の、投与と同時の、または投与後のＮＤＦの投与が含まれてもよい。ＮＤＦは、ＴＩＭＰ−２の産生を刺激することが見出されてきており、そしてＮＤＦ、ＴＩＭＰ−１、−２および／または−３の組み合わせは、腫瘍を治療する際、利点を提供しうる。
【０１２０】
本発明のポリペプチド産物を、検出可能なマーカー物質と会合させる（例えば１２５Ｉで放射標識する）ことによって「標識」して、固形組織、および血液または尿などの液体試料において、ＴＩＭＰ−３の検出および定量化に有用な試薬を提供してもよい。本発明の核酸産物もまた、検出可能マーカー（例えば放射標識および非同位体標識、例えばビオチン）で標識して、そして例えば相当する遺伝子を同定するためのハイブリダイゼーションプロセスにおいて使用してもよい。
【０１２１】
本明細書記載のＴＩＭＰ−３結合組成物は、病因形成を修飾し、そしてマトリックス分解および／または炎症によって特徴付けられる疾患または状態、すなわちメタロプロテイナーゼが有害な役割を果たすものに関して、有益な療法を提供する。ＴＩＭＰ−３結合組成物を、単独で、またはこうした状態を治療する際に用いられる１またはそれより多い剤と組み合わせて使用してもよい。したがって、本発明のＴＩＭＰ−３結合組成物は、メタロプロテイナーゼ活性によって、過剰なマトリックス喪失が引き起こされるいかなる障害の治療にも有用でありうる。本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、コラゲナーゼ、アグリカナーゼ、あるいは他のマトリックス分解または炎症促進酵素（単数または複数）の過剰産生に関連する多様な障害の治療に有用であり、こうした障害には、栄養障害型表皮水疱症、変形性関節症、ライター症候群、偽痛風、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ、強直性脊椎炎、強皮症、歯周病、角膜の潰瘍、上皮の潰瘍、または胃潰瘍を含む潰瘍、術後の創傷治癒、および再狭窄が含まれる。過剰なコラーゲンおよび／またはプロテオグリカン分解が役割を果たす可能性があり、そしてしたがってＴＩＭＰ−３結合タンパク質を適用可能である、他の病的状態には、肺気腫、骨のパジェット病、骨粗鬆症、強皮症、褥瘡におけるような骨または組織の圧迫萎縮、真珠腫、および創傷治癒異常が含まれる。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質をさらに、他の創傷治癒促進剤に対する補助剤として適用して、例えば治癒プロセス中のコラーゲンの代謝回転を調節してもよい。
【０１２２】
多くのメタロプロテイナーゼはまた、炎症促進活性も示し；したがって、さらなる態様には、炎症および／または自己免疫障害を治療する方法が含まれ、こうした障害には、限定されるわけではないが、軟骨炎症、および／または骨分解、関節炎、関節リウマチ、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身開始型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、ＳＥＡ症候群（血清陰性、腱付着部症、関節症症候群）、皮膚筋炎、乾癬性関節炎、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、強皮症、全身性エリテマトーデス、血管炎、筋炎（myolitis）、多発性筋炎、皮膚筋炎、変形性関節症、結節性多発動脈炎、ウェゲナー肉芽腫、動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、サルコイドーシス、強皮症、硬化症、原発性硬化性胆管炎、硬化性胆管炎、シェーグレン症候群、乾癬、尋常性乾癬、滴状乾癬、逆乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アテローム性動脈硬化症、ループス、スティル病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、炎症性腸疾患、潰瘍性腸炎、クローン病、セリアック病（非熱帯熱スプルー）、血清陰性関節症と関連する腸疾患、顕微鏡的またはコラーゲン大腸炎、好酸球性胃腸炎、または直腸結腸切除術および回腸肛門吻合術後に生じる嚢炎、膵炎、インスリン依存性糖尿病、乳腺炎、胆嚢炎、胆管炎、胆管周囲炎、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息（外因性および内因性喘息、ならびに気道の関連慢性炎症性状態、または応答性亢進を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ、すなわち慢性気管支炎、肺気腫）、急性呼吸器障害症候群（ＡＲＤＳ）、呼吸促迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、急性肺傷害、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気管支炎、アレルギー性気管支拡張症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、喘息様障害、サルコイド、反応性気道疾患（または機能障害）症候群、綿肺、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、および肺寄生虫症、ウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ライノウイルス（ＲＶ）およびアデノウイルス）誘導性状態に関連する気道過敏、ギラン−バレー病、グレーブス病、アジソン病、レイノー現象、自己免疫肝炎、ＧＶＨＤ等が含まれる。
【０１２３】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質はまた、ＴＩＭＰ−３の相対的レベルの減少（すなわち、ＴＩＭＰ−３量の減少またはメタロプロテアーゼ量の増加の結果でありうる、メタロプロテアーゼに対する内因性ＴＩＭＰ−３の比の減少）が、例えば心筋虚血、再灌流傷害における、および鬱血性心不全への進行中の、病的影響に関連する症例において、適用を有する。
【０１２４】
ＴＩＭＰ−３が結合組織分解を阻害する能力に基づいて、アゴナイズ性ＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、血管形成阻害が、例えば腫瘍発展を防止するかまたは遅延させる際、および寄生虫侵入の防止の際に有用である症例において適用を有する。例えば、腫瘍浸潤および転移の分野において、いくつかの特定の腫瘍の転移能は、コラゲナーゼを合成し、そして分泌する能力の増加と、そして有意な量のメタロプロテイナーゼ阻害剤を合成し、そして分泌する能力がないことと相関する。ＴＩＭＰ−３結合タンパク質はまた、原発性腫瘍の除去中、化学療法および放射線療法中、汚染された骨髄の採取中、ならびに癌性腹水のシャント中の、腫瘍細胞播種を阻害する際にも療法的適用を有する。診断的に、腫瘍標本におけるＴＩＭＰ−３産生の非存在およびその転移能は、予後指標として、ならびにありうる防止療法の指標として、有用である。
【０１２５】
さらに、本発明の組成物および方法は、美容目的のために適用可能であり、この際、結合組織分解の局所阻害は、組織の外見を改変しうる。
ＭＭＰはまた、血液脳関門（ＢＢＢ）を開くための経路の一部として、脳の基底膜および密着結合タンパク質に作用し、脳内への細胞および炎症の可溶性仲介因子の進入を促進する。したがって、本発明の組成物および方法は、ＢＢＢの過剰なまたは不適切な透過化によって特徴付けられる神経系障害の治療に有用でありうる。さらに、ニューロン周囲のマトリックスタンパク質の分解は、接触の喪失および細胞死を生じる可能性もあり；したがって、ＴＩＭＰ−３結合組成物は、神経細胞を取り巻く基底膜を保持することによって、神経細胞を損傷から保護しうる。本発明のＴＩＭＰ−３結合組成物は、傷害、例えば脳虚血に対する神経炎症反応を治療するかまたは軽減する際に有用である。本明細書開示の組成物はまた、炎症が、疾患の根底にある原因である神経変性疾患、例えば多発性硬化症の治療の際に、ならびに多様な型のニューロパシーおよび／またはミオパシー、脊髄傷害、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療の際に有用であるであろう。したがって、本発明の組成物の使用は、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＮＤＦ、ＳＣＦ、あるいは他の神経細胞増殖または増殖調節因子との同時投与を伴いうる。
【０１２６】
上記のように、本発明のＴＩＭＰ−３結合タンパク質は、多様な障害において広い適用を有する。したがって、本明細書に意図される別の態様は、細胞外マトリックスの分解を伴う障害を治療するため、本発明のポリペプチド、および場合によって１またはそれより多いさらなる上記組成物を含むキットである。さらなる態様は、パッケージング材料および前記パッケージング材料内の薬学的剤を含む製品であって、前記薬学的剤が、本発明のポリペプチド（単数または複数）を含有し、そして前記パッケージング材料が：癌、炎症、関節炎（変形性関節症等を含む）、栄養障害性表皮水疱症、歯周病、潰瘍、肺気腫、骨障害、強皮症、創傷治癒、赤血球不全、美容的組織再構築、受精または胚移植調節、および神経細胞障害からなる群より選択される適応症に対して、前記薬学的剤を使用してもよいことを示すラベルを含む、前記製品である。この製品には、場合によって、他の組成物または他の組成物のラベル説明が含まれてもよい。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例は、本発明の特定の態様または特徴を例示する目的のために提供され、そしてその範囲を限定しない。
実施例１
本実施例は、共焦点顕微鏡によって調べた際の、外因性ＴＩＭＰ−３の内在化を記載する。Ａ５４９細胞（ＩＩ型肺胞上皮細胞の特性を持つヒト肺癌由来の連続腫瘍細胞株、野生型またはＬＲＰ−１遺伝子を欠くＡ５４９細胞のいずれか）を、多様な前処理（ヘパリンを含む）を伴いまたは伴わずに、典型的には１μＧ／ｍｌのＴＩＭＰ−３と４℃で３０分間インキュベーションし、次いで洗浄し、固定し、そして蛍光標識抗ＴＩＭＰ−３抗体で染色するか、または洗浄し、そして次いで固定および染色前に、４℃または３７℃でさらにインキュベーションした。また、実質的に本明細書に記載するように、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって、培地中のＴＩＭＰ−３の集積に関しても、細胞をアッセイした。
【０１２８】
ＬＲＰ−１を欠く細胞は、野生型細胞よりも高い度合いで培地中にＴＩＭＰ−３を集積させることが見出された。共焦点顕微鏡分析によって、ＴＩＭＰ−３が細胞表面に結合し、細胞を３７℃でインキュベーションした際に迅速に消滅するが、４℃では消滅せず、そして、クロロキンであらかじめ処理すると、細胞内に集積してリソソーム分解を防止することが示された。さらに、細胞表面へのＴＩＭＰ−３の結合は、ヘパリンの存在下で減少した。
【０１２９】
実施例２
本実施例は、ＬＲＰ−１ペプチドの調製および精製を記載する。ＬＲＰ−１の外部ドメイン由来の多様なペプチドを大腸菌（E. coli）において発現させ、以下に記載するように精製し、そしてプレートに基づくおよびビーズに基づく結合アッセイ両方によって、ＴＩＭＰ−３への結合に関して試験した。ＬＲＰ−１のアミノ酸配列を配列番号１に示し；以下の表１は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列に言及して、発現された多様なペプチドを列挙する。ペプチドは、本明細書において、単量体（例えばＬＡ３、ＬＡ４、ＬＡ５、および単一の数字によって示される他のペプチド）または多量体（例えばＬＡ３−５、ＬＡ５−７、ＬＡ８−１０、および複数の数字によって示される他のペプチド）として言及される。
【０１３０】
表１：ＬＲＰ−１ペプチド
【０１３１】
【表１】
【０１３２】
大腸菌細菌における標準的組換えタンパク質技術を用いて、ＬＲＰ−１ペプチドを調製する。関心対象の各ペプチドに関して、単一の形質転換大腸菌コロニーから、４０μＧ／ｍＬカナマイシンを含有する３ｍＬの２ｘＹＴ培地（大腸菌の組換え株用の栄養的に豊富な増殖培地）内に培養を接種し、そして飽和するまで、３００ｒｐｍ、３７℃で一晩増殖させる。翌朝、１．８ｍＬの一晩培養を、４０μＧ／ｍＬカナマイシンを含有する２ｘＹＴの５００ｍＬ振盪フラスコ内に接種し、そして振盪しながら３００ｒｐｍ、３７℃で、ＯＤ６００が０．８〜１．０の間になるまで（約３時間）増殖させる。５００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトシド；１ｍＭ最終）で培養を誘導し、そして振盪しながら３００ｒｐｍ、３７℃で３時間、増殖を続ける。次いで、培養を５００ｍＬ Ｎａｌｇｅｎｅボトル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に移し、そして８０００ｒｐｍで１２分間遠心分離して、細胞をペレットにする。上清を取り除き、そしてペレットを２０ｍＬの平衡／結合／洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁する。再懸濁した細胞を３０ｍＬ Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ遠心管（ＶＷＲ、ペンシルバニア州ウェストチェスター）内に移し、そして８０℃の水槽中で１５分間加熱することによって溶解する。溶解した細胞を氷水上で約１０分間冷却し、次いで、１８，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。
【０１３３】
平衡／結合／洗浄緩衝液で３回アガロースを洗浄して、エタノールを除去することによって、ペプチドあたり１．５ｍＬのアガロース（緩衝液を含めて総体積３ｍＬ）に関して十分なＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を調製する。３回目の洗浄後、同じ緩衝液を用いて、元来の体積まで、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを再懸濁する。次に、３ｍＬのアガロース／緩衝液混合物を５０ｍＬフラットトップ・スクリューキャップ・ポリプロピレン試験管（ＦａｌｃｏｎＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンノゼより入手可能）に添加する。溶解した細胞をペレットにした後、各タンパク質上清を取り除き、そして３ｍＬ洗浄Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを含有する試験管に添加する。振盪しながら、室温で０．５時間、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロースに結合させる。次いで、真空マニホールド（Ｑｉａｇｅｎ）に搭載した使い捨て引力カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）に、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に加えて結合したタンパク質を移す。次に、結合したタンパク質を含むＮｉ−ＮＴＡ樹脂を、洗浄中に樹脂が乾燥しないようにしながら、少なくとも３０カラム体積の平衡／結合／洗浄緩衝液で洗浄する。次いで、洗浄した樹脂を含有するカラムを清浄な１５ｍＬポリプロピレン収集試験管（ＦａｌｃｏｎＴＭ）の最上部に乗せ、そしてタンパク質を２ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭイミダゾール、１ｍＭ ＣａＣｌ２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回（総計４ｍＬ）で溶出させる。次いで、溶出したタンパク質を、レドックス試薬［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２］に加えて１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）および２５０μＭ ２−ヒドロキシエチルジスルフィド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液内に、４℃で一晩透析する。翌日、タンパク質を、レドックス試薬を含まない緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２）内に、４℃で３時間透析する。次いで、これを反復する。次いで、０．２ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州イーストヒルズ）を用いて、タンパク質をろ過し、そして次の精製工程まで、４℃で保存する。
【０１３４】
次の工程のため、ペプチドあたり１．３ｍＬのＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ（四級アンモニウム強陰イオンを持つイオン交換クロマトグラフィー樹脂；〜１ｍＬ樹脂；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のスラリーを１５ｍＬ使い捨て重力カラム（gravity column）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に添加する。カラムを１０ｍＬの平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で２回平衡化して、そして重力によって排出させる。次に、〜３．９ｍＬのＮｉ−ＮＴＡ精製タンパク質を、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ樹脂に穏やかに添加し、そしてフロースルーを１５ｍＬポリプロピレン試験管（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）内に収集する。樹脂を、５ｍＬの洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ）で５回洗浄する。ＬＲＰ−１ペプチドの単量体または多量体型に関して用いたＮａＣｌ塩勾配（以下を参照されたい）を用いて、樹脂からタンパク質を溶出させ、そして９６ウェル２ｍＬポリプロピレンプレート内に収集する。各ＮａＣｌ濃度に関して、タンパク質あたり１．３ｍＬを２分画用いて溶出を行う。単量体型に関するＮａＣｌ勾配は：［８０ｍＭ、１１０ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ］であり、そして多量体型に関しては：［１００ｍＭ、１５０ｍＭ、１８０ｍＭ、２２０ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ］であった。タンパク質が溶出されたら、タンパク質を含有する分画を選択するため、ブラッドフォードアッセイを行う。選択した精製分画のゲルを泳動する−５μＬ／ウェルのＮｉ−ＮＴＡ精製装填タンパク質および１０μＬ／ウェルの溶出Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ分画。タンパク質を含有する分画を選択し、プールし、そして４℃（短期）または−８０℃（長期）で保存する。
【０１３５】
実施例３
本実施例は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）を用いて評価した際の組換えヒトおよびマウスＴＩＭＰ−３へのＬＲＰ−１ペプチドの結合を記載する。
【０１３６】
直接コーティングＴＩＭＰ−３結合ＥＬＩＳＡ：
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（混合親水性／疎水性ドメインを持つ分子に高いアフィニティを持つ９６ウェルポリスチレンプレート；Ｎｕｎｃ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、デンマーク・ロスキレ）を、コーティング緩衝液（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）中で希釈した１００ｎＭヒトまたはマウスＴＩＭＰ−３ １００μＬ／ウェルでコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションする。インキュベーション後、コーティング溶液を取り除き、そして２５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）と交換し、そして振盪しながら室温で１時間インキュベーションする。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液１（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）で３回洗浄する。ＬＲＰ−１ペプチドを、別個のポリプロピレン未処理丸底９６ウェルプレート（ＢＤ ＦａｌｃｏｎＴＭ）中、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡ、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、１μＭ濃度で開始し、そして次いで８ポイントに関して連続４倍希釈し、最終ポイントを緩衝液のみにして、滴定する。次いで、１００μＬ／ウェルの希釈ＬＲＰ−１ペプチド滴定をＴＩＭＰ−３コーティングプレートに添加し、そして振盪しながら室温で１．５時間結合させる。インキュベーション後、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液２（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄する。１００μＧ／ｍＬラット抗ＨＡ（クローン３Ｆ１０）−ＨＲＰ（西洋ワサビ（horseradish）ペルオキシダーゼにコンジュゲート化された、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のペプチド配列を認識する高アフィニティ・ラット・モノクローナル抗体）の１：５Ｋ希釈をアッセイ緩衝液中１００μＬ／ウェルで添加し、そしてプレート振盪装置上で室温で１時間インキュベーションする。次いで、アッセイプレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液２で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢおよびＨ２Ｏ２の１：１混合物（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）を添加することによってプレートを現像し、１００μＬ／ウェルの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（ＶＷＲ）を添加することによって反応を停止し、そしてＳＯＦＴｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア、バージョン３．１．２を用い、ＯＤ４５０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）上で読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０１ソフトウェアを用いてデータを分析する。ＴＩＭＰ−３へのＬＲＰ−１ペプチドの結合を結合ＥＣ５０として表わす。
【０１３７】
抗ＴＩＭＰ−３中和抗体を介して提示される、ＴＩＭＰ−３との間接結合ＥＬＩＳＡ：
ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレートを、コーティング緩衝液（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］／１ｍＭ ＣａＣｌ２）中で希釈した１００μＬ／ウェルの１０ｎＭマウス抗ヒトＴＩＭＰ−３抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、中和抗体クローン２７７１２８、マウスＴＩＭＰ−３に結合しない）でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベーションする。インキュベーション後、プレート内容物を廃棄し、そして２５０μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）をプレートに添加し、これを振盪しながら室温で１時間インキュベーションする。次いで、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液１（ＴＢＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＣａＣｌ２）で３回洗浄した後、１００μＬの２０ｎＭ組換えヒトＴＩＭＰ−３を添加する。プレートを室温で１時間インキュベーションする。ＬＲＰ−１ペプチドを先に記載するように滴定し、そして１００μＬ／ウェルの希釈ＬＲＰ−１ペプチド滴定をＴＩＭＰ−３コーティングプレートに添加し、そして振盪しながら室温で１．５時間結合させる。インキュベーション後、プレートを洗浄し、そして実質的に、直接結合ＥＬＩＳＡに関して先に記載するように、ＥＬＩＳＡを行う。
【０１３８】
ＴＩＭＰ−３ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ結合アッセイ：
実質的に製造者の指示にしたがって、広い範囲の生物学的相互作用および活性のスクリーニングを可能にする、非常に高感度の非放射性均一アッセイ技術であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（発光増幅近接均一アッセイ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム）によってもまた、ペプチドを評価した。簡潔には、すべての希釈を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）緩衝液：［４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０］中で作製する。ＬＲＰ−１ペプチドを、別個のポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中、４μＭ濃度で開始し、そして次いで１２ポイントに関して連続３倍希釈し、最終ポイントを緩衝液のみにして、滴定する。最初に、２μＬ／ウェルのタンパク質滴定曲線を、２つ組で、白色小体積３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、英国ストーンハウス）に添加する。次に、２μＬのビオチン化（ＡＦＳ、社内コンジュゲート化（conjmicroGation））組換えヒトまたはマウスＴＩＭＰ−３を、アッセイプレートに１２ｎＭ（または３ｎＭ最終アッセイ濃度）で添加する。最後に、抑えた光の下で、どちらも２０μＧ／ｍＬ（１０μＧ／ｍＬ最終アッセイ濃度）に希釈したストレプトアビジン・ドナー・ビーズ、抗マウスＩｇＧアクセプター・ビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の混合物、および２ｎＭ（１ｎＭ最終濃度）のラット抗ＨＡ（クローン３Ｆ１０）−ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をプレートに添加する。８μＬ最終アッセイ体積を含有するプレートを、ＴｏｐＳｅａｌ Ａで覆い（蒸発を防止するため）、１０００ｒｐｍで迅速に回転させ、そして一晩インキュベーションし（光曝露を防止するため、ホイルで覆って）、その後、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）パラメーター（励起６８０ｎＭおよび発光５２０〜６２０ｎｍ）を用いて、Ｆｕｓｉｏｎプレート読み取り装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０１ソフトウェアを用いてデータを分析する。ＴＩＭＰ−３への結合を総シグナル（ｃｐｓ）として報告する。いくつかの実験の結果を以下の表２〜３に示す。
【０１３９】
表２：ＥＬＩＳＡおよび／またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）によるＬＲＰ−１ペプチドの結合
【０１４０】
【表２−１】
【０１４１】
【表２−２】
【０１４２】
ＮＤ：未実施
表３：ＴＩＭＰ−３結合ＥＬＩＳＡにおけるＬＲＰ−１ペプチドのＥＣ５０
【０１４３】
【表３】
【０１４４】
クラスターＩＩ（８リガンド結合ドメインを含有する）およびクラスターＩＶの一部を含む多重外部ドメインＬＲＰ−１ペプチドは、マイクロモル未満のアフィニティでＴＩＭＰ−３に結合した。ＴＩＭＰ−３に結合したペプチドを、蛍光−消光基質を用いて、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害への干渉に関して、そしてＨＴＢ−９４細胞培養におけるＴＩＭＰ−３集積の促進に関して、以下に記載するように試験した。
【０１４５】
実施例４
本実施例は、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に対する、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質（試験分子としても称され、ＬＲＰ−１ペプチド、およびＴＩＭＰ−３に対する抗体を含む）の影響（単数または複数）を測定するのに有用なＭＭＰ−１３阻害アッセイを記載した。最初に、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害の滴定を行って、ＴＩＭＰ−３のＩＣ５０を実験的に決定する。典型的には、ＭＭＰ−１３に対するＴＩＭＰ−３のＩＣ５０は、０．５ｎＭ〜１ｎＭであり、そしてＩＣ５０を用いて、試験分子を性質決定するのに用いる濃度を選択する。簡潔には、試験分子をアッセイ緩衝液中で滴定し、そして黒いポリスチレン９６または３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、ドイツ）に添加する。試験分子の濃度は、分子の活性に依存する；例えば、滴定を１０００、２０００または３０００ｎＭで始め、そして滴定のために５倍希釈で用いてもよいが、他のタイプの滴定を用いてもよいし、または単一濃度を試験してもよい。次いで、組換えＴＩＭＰ−３をアッセイ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１０μＭ ＺｎＣｌ２、０．０１％Ｂｒｉｊ３５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ｐＨ７．５）中であらかじめ決定した濃度（例えば３ｎＭが典型的な濃度であるＴＩＭＰ−３のＩＣ７０）に希釈して、試験分子に添加し、そして室温で１０分間回転させる。活性ＭＭＰ−１３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ）をアッセイ緩衝液中で希釈して、１．４６ｎＭの最終アッセイ濃度にし、試験分子滴定／ＴＩＭＰ−３混合物に添加し、そして５０μＬの最終体積中、室温で１０分間インキュベーションする。あるいは、プロ−ＭＭＰ−１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）をアミノフェニル水銀アセテート（ＡＰＭＡ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ）で、３７℃で２時間活性化し、そしてアッセイに用いた。
【０１４６】
Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光性ＭＭＰ基質またはＭｃａ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光性ペプチド基質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの蛍光性基質を、アッセイ緩衝液中、２０μＭの最終アッセイ濃度に調製し、そしてＭＭＰ−１３酵素／ｈｕＴＩＭＰ−３／試験分子溶液に添加する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ蛍光プレート読み取り装置を用いて、ＭＭＰ−１３活性を動力学的に２０分間測定する。試験される分子の影響を、ＭＭＰ−１３酵素活性の予期される最大ＴＩＭＰ−３阻害のパーセントとして表す。
【０１４７】
また、上記のものと実質的に類似であるが、ＴＩＭＰ−３の非存在下でのアッセイにおけるＭＭＰ−１３活性の直接阻害に関しても、試験分子を分析する。アッセイ緩衝液中の試験分子の滴定を１０００ｎＭで開始し、そして滴定のため、５倍希釈を用いたが、他のタイプの滴定を用いてもよいし、または単一濃度を試験してもよい。活性ＭＭＰ−１３をアッセイ緩衝液中で希釈して、１．４６ｎＭの最終アッセイ濃度を得て、試験分子滴定に添加し、そして５０μＬの最終体積中、室温で１０分間インキュベーションする。蛍光性基質を、アッセイ緩衝液中、２０μＭの最終アッセイ濃度に調製し、そしてＭＭＰ−１３酵素／試験分子溶液に添加する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ蛍光プレート読み取り装置を用いて、ＭＭＰ−１３活性を動力学的に２０分間測定する。試験される分子の影響を、ＭＭＰ−１３酵素活性の減少パーセントとして表す。
【０１４８】
以下の表４は、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害に対する多様なＬＲＰ−１ペプチドの影響を比較する実験セットの結果、ならびにＭＭＰ１３活性に対するその直接の影響を提示する。ＴＩＭＰ−３単独で生じる阻害の９０％より高い阻害を示すペプチドは、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に有意に影響を及ぼさないと見なされた；ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力が１０％またはそれより多く減少したペプチド（すなわち、ＴＩＭＰ−３単独で観察される阻害活性の９０％またはそれ未満を生じるもの）は、ＴＩＭＰ−３の阻害能に負の影響を有すると見なされた。それ自体がＭＭＰ−１３の活性を１０％またはそれより多く減少させるペプチドは、ＭＭＰ−１３活性に有意に影響を及ぼすと見なされた。
【０１４９】
表４：ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害に対する、および／またはＭＭＰ−１３活性に対する、ＬＲＰ−１ペプチドの影響
【０１５０】
【表４−１】
【０１５１】
【表４−２】
【０１５２】
ＮＤ：未実施
注：特定のペプチドはＭＭＰ−１３活性を増加させるようであった；これらを減少％列に負の数字で示す。
【０１５３】
クラスターＩＶ配列は、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害を実質的に損なったが、クラスターＩＩはこの阻害活性に対して最小限の影響しか持たなかった。
【０１５４】
実施例５
本実施例は、培養細胞培地中のＴＩＭＰ−３集積を評価するアッセイを記載する。ＨＴＢ−９４ＴＭ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、バージニア州マナサスより入手可能な軟骨細胞株）を、１ｍｌ増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＧ）中、ウェルあたり１ｘ１０＾５細胞で２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベーションする。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そしてウェルに２５０μＬの血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０、１％ＰＳＧ；以下の表中にＳＦと示す）を補充し、これに試験しようとするポリペプチドまたは対照（例えばヘパリン、１ｍｇ／ｍｌを含有する培地）を添加する。試験しようとするタンパク質を、例えば以下の表に示すように、適切な濃度に希釈し、そして細胞に添加する。次いで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でさらに２日間インキュベーションし、第２日に馴化培地（ＣＭ）試料を収集し、そして遠心分離（すなわち１０Ｋ ＲＰＭで５分間）によって清澄化し、そして上清液を収集し、そしてアッセイするまで−２０℃に保存する。製造者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）にしたがって、ウェスタンブロットによって、または標準的ヒトＴＩＭＰ−３ ＥＬＩＳＡを用いることによってのいずれかで、１００μＬ ＣＭ試料に対して分析を行う。
【０１５５】
ウェスタンブロットによる分析によって、ＬＲＰ−１のクラスターＩＩ（Ｃ ＩＩ）由来のポリペプチドが、ＨＴＢ−９４ＴＭ細胞由来の馴化培地中のＴＩＭＰ−３の集積を増進し、クラスターＩ、クラスターＩＩＩおよびクラスターＩＶポリペプチドは有意な集積を生じないことが示された。また、ＣＭをＥＬＩＳＡによっても試験し、そして値を標準曲線に比較することによって、ＴＩＭＰ−３の適切な濃度を決定した；いくつかのこうした実験の結果を以下の表５〜７に示す。
【０１５６】
表５：ＬＲＰ−１クラスターＩおよびクラスターＩＩドメインポリペプチドの存在下でのＴＩＭＰ３の集積
【０１５７】
【表５】
【０１５８】
表６：ＬＲＰ−１ペプチド（２μＭ）の存在下でのＴＩＭＰ−３の集積
【０１５９】
【表６】
【０１６０】
表７：ＬＲＰ−１ペプチド（２μＭ）の存在下でのＴＩＭＰ−３の集積
【０１６１】
【表７】
【０１６２】
いくつかのクラスターＩＩペプチドは、ＴＩＭＰ−３が細胞表面に結合するのを防止すると考えられるヘパリンの存在下で見られるものに匹敵する、ＨＴＢ−９４細胞培養中のＴＩＭＰ−３の集積を生じた。
【０１６３】
実施例６：モノクローナル抗体の調製
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅＴＭトランスジェニックマウスを免疫することによって、ＴＩＭＰ−３に対する完全ヒト抗体を生成し、用いた系統には、ＸＭＧ２−ＫＬおよびＸＭＧ４−ＫＬ（Ｍｅｎｄｅｚ ＭＪら，Ｎａｔ Ｇｅｎ，１９９７、およびＫｅｌｌｅｒｍａｎら，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２）が含まれた。マウスを、特異的免疫応答を示すのに十分な時間、および十分な免疫で（すなわち腹部内への腹腔内注射または尾の基部での皮下注射の交互の注射経路を用いて、最初の４週間に２週間ごとに、その後、同じ交互の注射経路を用いて、最後の６週間に週１回、全部で約２．５ヶ月）、可溶性ＴＩＭＰ３−Ｈｉｓタンパク質で免疫した。ＴＩＭＰ−３ｐＨｉｓコーティングプレートを利用した酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、血清力価を監視した。特異的抗ＴＩＭＰ−３免疫応答を示すマウスを屠殺し、そして抗体生成に用いた。
【０１６４】
ＥＬＩＳＡ結合スクリーンを用いて、ＴＩＭＰ３に特異的に結合する抗体を同定した。このアッセイのため、３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１０μＧ／ｍｌニュートラビジン（ストレプトアビジンの脱グリコシル化型、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｓｈｅｒ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可能）で、４℃で一晩コーティングする。次いで、プレートに１μＧ／ｍｌのビオチン化ＴＩＭＰ３ｐＨｉｓを装填する。ＴＩＭＰ−３への結合に関して、陽性と同定された上清（ＴＩＭＰ−３−ポリＨｉｓ免疫キャンペーン由来の８６の陽性結合上清およびＴＩＭＰ−３ｐＨｉｓ／ＫＬＨ免疫キャンペーン由来の３３の陽性結合上清）を、ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ１３の阻害への干渉、特異的ＩｇＧ濃度の相対的定量化、および低抗原設定におけるＴＩＭＰ３への相対的アフィニティを含む、いくつかの異なるアッセイにおいて、評価し、そしてランク付けした。実施例５に実質的に記載される培養上清液において、ＴＩＭＰ−３の集積に対する影響に関してもまた、抗体を評価した；結果を以下に示す。
【０１６５】
表８：ＴＩＭＰ−３特異的抗体の存在下でのＴＩＭＰ３の集積
【０１６６】
【表８】
【０１６７】
先に記載するものと類似のアッセイを用いて、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力への干渉に関して試験する際、抗体１０Ａ７は比較的少ない干渉しか示さず、一方、残りの抗体は、より高い干渉を示した。抗体８Ｆ１、８Ｃ５および１０Ａ７はまた、実質的に先に記載するような共焦点顕微鏡によって観察した際、ＴＩＭＰ３内在化を阻害した。
【０１６８】
実施例７：モノクローナル抗体の調製
受動的にコーティングされたＴＩＭＰ−３または抗ＴＩＭＰ−３ ＭＡＢ９７３１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を介して係留されたＴＩＭＰ−３のいずれかを伴うＥＬＩＳＡを用いて、先に記載するハイブリドーマのプールから、ヒトＴＩＭＰ−３に対するさらなるモノクローナル抗体を同定した。実質的に先に記載するようなアッセイを用いて、ＥＬＩＳＡにおいて陽性である抗体もまた、ＴＩＭＰ−３集積に関して試験した。使用済みのハイブリドーマ上清液をＴＩＭＰ−３集積アッセイにおいて評価した際（血清不含培地に緩衝液交換して、ＴＩＭＰ−３集積アッセイに対するバックグラウンド効果を減少させた後）、２６のハイブリドーマが、ＴＩＭＰ−３集積を促進する抗体を分泌すると同定された。これらのハイブリドーマのうち４つはサブクローニング中に失われたが、残りの２２をより大きいスケールで培養し、そしてモノクローナル抗体を精製し、そしてＴＩＭＰ−３集積およびＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害に対するありうる影響に関して（ならびにＭＭＰ−１３自体に対するいかなる直接的な影響に関しても）評価した。
【０１６９】
２２の抗体のうち、いずれも、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力に不都合な影響を与えず、また、ＭＭＰ−１３自体に対する影響を持たなかった。ＴＩＭＰ−３集積アッセイにおいて、陰性対照抗体で観察されたものよりも少なくとも約１．５倍高いレベルの、上清液中のＴＩＭＰ−３集積の再現可能で滴定可能な増加に関して、抗体を評価した。さらなる分析および細胞株発展のために４つの抗体を選択し；これらの抗体に対する代表的なＴＩＭＰ−３集積アッセイおよびＭＭＰ−１３阻害アッセイの結果を以下に示す。ＭＭＰ−１３阻害アッセイは、１００μＬアッセイ体積中の１．５ｎＭ ＭＭＰ−１３（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、０．２５ｎＭの精製ＴＩＭＰ−３（いかなる抗体も存在しない場合、ＭＭＰ−１３活性の５４％阻害を生じた）、および２０μＭ Ｍｃａ−ＫＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光性ペプチド基質（ＥＳ０１０基質、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用した。ＭＭＰ−１３阻害アッセイに関しては、少なくとも特定の度合いで、ＭＭＰ−１３のＴＩＭＰ−３による阻害を損なうことが知られる対照Ａｂとして、抗体１０Ａ７が含まれた。
【０１７０】
表９：ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ１３の阻害に対する抗ＴＩＭＰ−３抗体の影響
【０１７１】
【表９】
【０１７２】
これらの結果は、抗体１６Ａ１．１、１８Ｈ１．１、１７Ａ４．１および１８Ｃ１．１が、抗体が最大約８０倍モル過剰となる濃度まで、ＴＩＭＰ−３がＭＭＰ−１３を阻害する能力を有意に減少させないことを示す。
【０１７３】
表１０：ＴＩＭＰ−３の集積に対する抗ＴＩＭＰ−３抗体の影響
【０１７４】
【表１０】
【０１７５】
これらの結果は、抗体１６Ａ１．１、１８Ｈ１．１、１７Ａ４．１および１８Ｃ１．１が、上清液中のＴＩＭＰ−３集積を導くことを示す。続く分析によって、抗体１７Ａ４および１８Ｃ１が、同じアミノ酸配列を有することが示された。残りの１８クローンを、将来ありうるさらなる評価のために保存した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＭＰ−３に結合し、そしてＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害する、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質。
【請求項２】
抗体またはＬＲＰ−１ペプチドである、請求項１のＴＩＭＰ−３結合タンパク質。
【請求項３】
ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる、請求項１または請求項２のＴＩＭＰ−３結合タンパク質。
【請求項４】
ＴＩＭＰ−３と、請求項１または請求項２記載のＴＩＭＰ−３結合タンパク質を接触させることによって、細胞外マトリックス中のＴＩＭＰ−３を増加させる方法。
【請求項５】
ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＩＭＰ−３をＴＩＭＰ−３結合タンパク質と接触させる、請求項４の方法。
【請求項６】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＩＭＰ−３をＴＩＭＰ−３結合タンパク質と接触させる、請求項５の方法。
【請求項７】
マトリックス・メタロプロテイナーゼが有害な役割を果たす状態に罹患している哺乳動物を治療する方法であって、請求項１または請求項２記載のＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
状態が、炎症、癌、および細胞外マトリックスの過剰な分解によって特徴付けられる状態からなる群より選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
状態が変形性関節症および鬱血性心不全からなる群より選択される、請求項８の方法。
【請求項１】
ＴＩＭＰ−３に結合し、そしてＬＲＰ−１によるＴＩＭＰ−３の内在化を阻害する、ＴＩＭＰ−３結合タンパク質。
【請求項２】
抗体またはＬＲＰ−１ペプチドである、請求項１のＴＩＭＰ−３結合タンパク質。
【請求項３】
ＴＩＭＰ−３によるＭＭＰ−１３の阻害を３０％未満減少させる、請求項１または請求項２のＴＩＭＰ−３結合タンパク質。
【請求項４】
ＴＩＭＰ−３と、請求項１または請求項２記載のＴＩＭＰ−３結合タンパク質を接触させることによって、細胞外マトリックス中のＴＩＭＰ−３を増加させる方法。
【請求項５】
ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＴＩＭＰ−３をＴＩＭＰ−３結合タンパク質と接触させる、請求項４の方法。
【請求項６】
ＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＩＭＰ−３をＴＩＭＰ−３結合タンパク質と接触させる、請求項５の方法。
【請求項７】
マトリックス・メタロプロテイナーゼが有害な役割を果たす状態に罹患している哺乳動物を治療する方法であって、請求項１または請求項２記載のＴＩＭＰ−３結合タンパク質を哺乳動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
状態が、炎症、癌、および細胞外マトリックスの過剰な分解によって特徴付けられる状態からなる群より選択される、請求項７の方法。
【請求項９】
状態が変形性関節症および鬱血性心不全からなる群より選択される、請求項８の方法。
【公表番号】特表２０１３−５００９８７（Ｐ２０１３−５００９８７Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３０４６（Ｐ２０１２−５２３０４６）
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３７３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４６７１
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４３７３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４６７１
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５００２０３７０９）アムジェン インコーポレイテッド (76)
【Ｆターム（参考）】
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