４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤
【課題】正常なホルモン作用及びカテコールエストロゲンの解毒作用を阻害することなく、４位-カテコールエストロゲンの生成を阻害する優れた乳がん発生予防因子の提供。
【解決手段】下記一般式で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、４位-カテコールエストロゲン生成阻害剤。
（Ｒ1及びＲ2は水酸基又はメトキシ基、Ｒ3は水素原子又は水酸基、Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４。）
【解決手段】下記一般式で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、４位-カテコールエストロゲン生成阻害剤。
（Ｒ1及びＲ2は水酸基又はメトキシ基、Ｒ3は水素原子又は水酸基、Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトキシフラボノイド化合物を有効成分とする４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤に関する。詳しくは、本発明は、正常なホルモン作用及びカテコールエストロゲンの解毒作用を阻害することなく、４位−カテコールエストロゲン生成に関与する代謝酵素（ＣＹＰ１Ｂ１）を特異的に阻害しうる薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（１）乳がんの罹患率、死亡率の増加は、近年際だっている。乳がんはホルモン依存性腫瘍であり、そのリスク要因としては、遺伝的要因の他にカロリーが高く脂肪の多い食事、初潮年齢、閉経年齢、出産経験の有無などがあるが、女性ホルモンであるエストロゲンに暴露される時間が長いほどリスクが高くなると考えられている。
エストロゲン（エストロン、エストラジオール（Ｅ２））は、乳腺組織内で薬物代謝酵素の一つであるチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１）により、それぞれ２位及び４位のカテコール体（２−ＯＨＥ２、４−ＯＨＥ２）へ代謝される。
【０００３】
しかしながら、カテコール体はキノン体へ変換する場合があり、特に４位のカテコール体はキノン体（Ｅ２−３，４Ｑ）となって活性酸素を生じたり、ＤＮＡや染色体チューブリンに付加体を形成したりして、遺伝子突然変異や染色体不安定性を引き起こし、発がん性を示すことが明らかにされた（非特許文献１参照）
【０００４】
正常な乳腺組織内では、カテコール体はメチル化酵素であるカテコールメチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によりメチル化されて安定なメトキシ体となった後、UDP-glucuronosyltransferase（ＵＧＴｓ）によって不活性のグルクロニド（inactive glucuronide）に抱合化され、組織外へ排出される。しかしながら、乳がん組織内ではこの解毒機構が十分に機能せず、正常組織内よりもＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子発現が亢進し、４位のカテコール体の生成が亢進していることが報告されている（非特許文献２参照）。図１にエストロゲン代謝のメカニズムを表す概略図を示す。
【０００５】
（２）また、ホルモン補充療法剤プレマリンに含まれる馬尿より抽出したエキリンやエキレニンも、Ｅ２と同様に代謝されて４位のカテコール体（４−ＯＨＥＱ、４−ＯＨＥＮ）となり、ＤＮＡ付加体を形成する。ホルモン補充療法の副作用として乳がんや子宮がんの発生が問題となっているが、これらの４位のカテコール体がその原因のひとつとして考えられている。
【０００６】
（３）ＣＹＰ１Ｂ１の発現には、ダイオキシンや多環芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）が関与していると考えられている。正常乳腺細胞がダイオキシンやＰＡＨｓなどに暴露されると、それらは脂溶性に富むため、細胞膜を容易に通過し核内レセプターであるaryl hydrocarbon receptor（ＡｈＲ）と結合する。ＡｈＲはｂＨＬＨ−ＰＡＳ型転写因子の構造を持つ受容体型転写因子であり、リガンドに結合することで核内に移行する。核内でＡｈＲ nuclear translocator（Ａｒｎｔ）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子上流の5'-CACGC-3'をコア配列とするＸＲＥ（xenobiotic responsive element）と結合することで標的遺伝子であるＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＵＧＴｓが誘導される。
【０００７】
薬物代謝型ＣＹＰの多くが肝臓で発現しているのに対し、ＣＹＰ１Ｂ１は肝臓では発現しておらず、肺、腎、乳腺や精巣、卵巣、子宮などの生殖器で発現が認められている（非特許文献３参照）。したがって、ダイオキシンやＰＡＨｓなどによる暴露によってこれらの臓器でＣＹＰ１Ｂ１の発現が誘導されると、カテコールエストロゲン生成が亢進され、それがこれらの臓器における発がんのリスク因子となると考えられる。
よって、ＣＹＰ１Ｂ１の働きを特異的に阻害し、４位−カテコールエストロゲンの生成を抑制する物質が見いだされれば、有望な乳がん発生予防因子になりうると考えられる。
【０００８】
（４）ところで、フラボノイドはＣ６−Ｃ３−Ｃ６の基本骨格を持つポリフェノール化合物であり、野菜、ナッツ類、果物やコーヒー、お茶、赤ワインなどの飲料中に存在する。フラボノイドの機能性については多くの報告があるが、生体内でのフラボノイド健康促進機能として、ヒドロキシラジカル、スーパーオキサイドアニオン、過酸化ラジカルの消去活性があり、膜、蛋白質、ＤＮＡへの酸化的ダメージが関与する病気の予防に対し重要な働きをする。
【０００９】
フラボノイドは、冠状動脈性心疾患、肝臓病、多くの癌の発生を減少させ予防することがヒトの疫学調査や動物実験により示されている。また、フラボノイドは、ＣＹＰによる発がん物質（ＢａＰなど）の代謝活性化抑制作用や生成した活性種（フリーラジカル）などを消去することも報告されている（非特許文献４）。また、メトキシフラボノイドのジメトキシフラボンやスチルベンのレスベラトロル（resveratrol）は、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性や遺伝子発現を抑制することが報告されている（非特許文献５、６参照）。
【００１０】
さらに、フラボンの３’にメトキシ基がつき、４’にアミノ基などが置換しているものにＡｈＲへのアンタゴニスト作用があることも報告されている（非特許文献７参照）。しかし一方で、お茶のカテキンである(-)-epigallocatechin-3-gallate（ＥＧＣＧ）は、カテコールエストロゲンの重要な解毒酵素であるＣＯＭＴを競合的に阻害する作用があることがNagaiらによって示された。ＥＧＣＧなどは、カテコール構造を有するためだと考えられる（非特許文献７）。
【００１１】
ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害する化合物として２,４,３’,５’−テトラメチルスチルベン（ＴＭＳ）が報告されているが、この化合物の阻害様式は競合阻害であった（非特許文献８、９）。
Chaudharyらの報告によると、タマリキセチン（tamarixetin）の親化合物のケルセチン（qurcetin）やケムフェロール（kaempherol）、ミリセチン（myricetin）は、１０μＭになるとＣＹＰ１Ａ１とＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を抑制した（非特許文献１０）。ＭＣＦ１０細胞を用いたresveratrolの効果についての報告では、２０μＭ以上でＣＹＰ１Ｂ１のｍＲＮＡの発現を抑制した。Ｅ２を基質とした酵素活性も濃度依存的に阻害が見られていた。しかしながら、ＣＹＰ１Ａ１のｍＲＮＡの発現、ＣＹＰ１Ａ１による酵素活性も同時に抑制していた（非特許文献６）。
乳腺組織ではＣＹＰ１Ａ１も働いており、２位のカテコール体を経てＣＯＭＴによりメトキシ体になった２−ＭｅＯＥ２には、抗がん作用があることが報告されている。また、２−ＭｅＯＥ２は細胞の増殖、チュウブリンの重合、血管新生作用を阻害する効果がある。従って、ＣＹＰ１Ａ１も抑制してしまうとＥ２の解毒代謝機構の一つである２位水酸化とそれに伴うＣＯＭＴによるメトキシ化も抑制してしまい、Ｅ２のホメオスタシスが崩れてしまう。
【００１２】
Doostdarらの報告によると、アカセチン（acacetin）及びジオスメチン（diosmetin）はＣＹＰ１Ａ及びＣＹＰ１Ｂ１に対する阻害作用を示し、ホモエリオディクチオール（homoeriodictyol）はＣＹＰ１Ｂ１に対し特異的に阻害作用を示した。しかし、ホモエリオディクチオールは、０．１μＭ以上の比較的高濃度でしか選択的阻害作用を示さない（非特許文献１１、１２）。
【００１３】
（５）ある種のフラボノイド系化合物がヒトのエストロゲン受容体への結合能を有しエストロゲン活性発現抑制効果を有することも報告されている（特許文献１参照）。フラボノイド系化合物はその他にも、紫外線誘発プロスタグランジンＥ２産生抑制作用（特許文献２参照）、ＴＮＦ−α産生抑制作用（特許文献３参照）など、種々の生理活性を有することが知られている。
【００１４】
乳がん発生予防因子として有用であるためには、それ自身にエストロゲン作用（アゴニスト活性）及びＣＹＰ１Ｂ１を誘導する作用がないことが必要である。しかしながら、ホルモン補充療法時には、エストロゲン活性を抑制してしまうと、ホルモン補充療法の効果が得られなくなる。
【００１５】
（６）そこで、ＣＹＰ１Ｂ１を誘導することなくその作用を特異的に阻害して４位のカテコール体（４位−カテコールエストロゲン）の生成を阻害する作用を低濃度で示し、且つエストロゲンやホルモン補充療法剤等の正常なホルモン作用を阻害せず、またＣＹＰ１Ａ１の酵素活性やＣＯＭＴの解毒作用をも阻害しない優れた乳がん発生予防因子の開発が望まれているが、未だ見いだされていなかった。
【００１６】
【特許文献１】特開２００３−２８３０号公報
【特許文献２】特開２００３−１９２５８８号公報
【特許文献３】特開２００５−２１３１７８号公報
【非特許文献１】Tsuchiya Y, Nakajima M, Yokoi T.: Cytochrom P450-mediated metabolism of estrogens and its regulation in human.: Cancer letter 227(2005)
【非特許文献２】Eleanor G.R, Alaa F.B, Prabu D.D, Jane L.M, James A.E, William W.W, Sheila M.H and Ercole L.C: Relative imbalances in estrogen metabolism and conjugation in breast tissue of women with carcinoma: potential biomarkers of susceptibility to cancer.: Carcinogenesis 24 697-702(2003)
【非特許文献３】土屋裕樹、中島美紀、横井毅． ヒトＣＹＰ１Ｂ１の転写調節機構：発癌とエストロゲンのホメオスタシス：生化学、７６、１５６５−１５６９
【非特許文献４】吉川敏一編集、フラボノイドの医学、講談社、東京 １９９８
【非特許文献５】Wen X, Walle U.Kristina and Walle T: 5,7-Dimethoxyflavone downregulates CYP1A1 expression and Benzo[a]Pyrene-induced DNA binding in Hep G2 cell. Carcinogenesis, 26, 803-809(2005)
【非特許文献６】Chen Z-H, Hurch Y-J, Na H-K, Kim H-H, Chun Y-J, Kim D-H, Kang K-S, Cho M-H and Sur Y-J: Resveratol inhibits TCDD-induced expression of CYP1A1 and CYP1B1 and catechol estrogen-mediated oxidative DNA damage in cultured human mammary epithelial cells. Carcinogenesis, 25(10), 2005-2013(2004)
【非特許文献７】Nagai M, Conney AH, Zhu BT.: Strong inhibitory effects of common tea catechins and bioflavonoids on the O-methylation of catechol estrogens catalyzed by human liver cytosolic catechol-O-methyltransferase. DMD. 32, 497-504(2004)
【非特許文献８】Chun YJ, Ryu SY, Jeong TC, Kim MY.: Mechanism-based inhibition of human cytochrome P450 1A1 by rhapontigenin. DMD. 29 389-93. 2001
【非特許文献９】Chun YJ, Kim S, Kim D, Lee SK, Guengerich FP.: A new selective and potent inhibitor of human cytochrome P450 1B1 and its application to antimutagenesis. Cancer Res. 61 8164-70 (2001)
【非特許文献１０】Chaudhary A and Willett K. L.: Inhibition of human cytochrome CYP1 enzymes by flavonoids of St. John's wort. Toxicology, 217, 194-205(2006)
【非特許文献１１】Doostdar H, Burke MD, Mayer RT: Bioflavonoids: selective substrates and inhibitors for cytochrome P450 CYP1A and CYP1B1. Toxicology, 144, 31-38(2000)
【非特許文献１２】Chun YJ, Kim S: Discovery of Cytochrome P450 1B1 Inhibitors as New Promising Anti-Cancer Agents. Medicinal Research Reviews, Vol. 23, No. 6, 657-668(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、乳がんの発生予防因子の探索を目的とし、正常なホルモン作用及びカテコールエストロゲンの解毒作用を阻害することなく、４位−カテコールエストロゲン生成に関与する代謝酵素（ＣＹＰ１Ｂ１）を特異的に阻害することによって、乳がん発生の重要なリスク因子である４位−カテコールエストロゲンの生成を阻害しうる物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は鋭意検討した結果、特定構造を有するメトキシフラボノイド化合物が、上記課題を解決しうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）に示す４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤及び（５）〜（６）に示すＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤に関する。
（１）下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【００２０】
【化４】
【００２１】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
【００２２】
（２）前記メトキシフラボノイド化合物が、一般式（２）で表されることを特徴とする、（１）記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【００２３】
【化５】
【００２４】
（一般式（２）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。）
【００２５】
（３）前記メトキシフラボノイド化合物が、クリソエリオール、タマリキセチン、及びイソラムネチンからなる群から選択されるものであることを特徴とする、（２）記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
（４）前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、（３）記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
（５）下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【００２６】
【化６】
【００２７】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
（６）前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、（５）記載のＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の一般式（１）で表される特定のメトキシフラボノイド化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害する作用及びそれによって乳がん発生のリスク要因となる４位のカテコールエストロゲンの生成を阻害する作用を有するものであり、以下の作用的特徴を備える。
【００２９】
（１）カテコール構造を有しないフラボノイド化合物であり、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害しＣＯＭＴ及びＣＹＰ１Ａ１の活性を阻害しないため、２位のカテコール体生成及びそれによる細胞内の解毒代謝機構の正常な働きを保つことができ、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えない。
【００３０】
（２）エストロゲンに対するアゴニスト活性は弱く、１μＭ以下の低濃度ではアンタゴニスト活性を有しないので、エストロゲンの正常なホルモン作用を阻害しない。したがって、ホルモン補充療法においてもホルモン投与による効果を犠牲にすることなく該療法の副作用である乳がん、子宮がんの発生を抑制する可能性がある。
【００３１】
（３）それ自身でＣＹＰ１Ｂ１を誘導する作用はほとんどない。
（４）植物成分であるため、安全性に優れている。
よって、安全で且つ極めて優れた乳がん発生予防因子として有用であり、またＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害するので酵素阻害の試薬として利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に、本発明を実施するための最良の形態を説明する。
（１）メトキシフラボノイド化合物
本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤及びＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤は、下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする。
【００３３】
【化７】
【００３４】
上記一般式（１）中、置換基Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。好ましくは、Ｒ1とＲ2の一方は水酸基で他方はメトキシ基である。より好ましくは、Ｒ1がメトキシ基であり、Ｒ2が水酸基である。すなわち、フラボノイド骨格のＢ環の３’位がメトキシ基に置換しているフラボノイド化合物が好ましい。
【００３５】
Ｒ3は水素原子又は水酸基を表し、好ましくは水素原子である。置換基Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。好ましくは、Ｒ4は水酸基であり、ｎは２である。最も好ましくは、Ｒ4は水酸基であってＡ環の５位と７位に置換しているものである。
本発明のメトキシフラボノイド化合物の例を以下に化学式で示す。
【００３６】
【化８】
【００３７】
これらのうち本発明のより好ましいメトキシフラボノイド化合物は、以下の一般式（２）で表されるメトキシフラボノイド化合物である。
【００３８】
【化９】
【００３９】
上記一般式（２）で表されるメトキシフラボノイド化合物の具体例としては、上述した化学式で表される化合物のうち、フラボノイド骨格のＢ環の３’位にメトキシ基が置換しているフラボノイド化合物であるクリソエリオール（Chrysoeriol）とタマリキセチン（Tamarixetin）、及びフラボノイド骨格のＢ環の４’位にメトキシ基が置換しているフラボノイド化合物であるイソラムネチン（Isorhamnetin）とジオスメチン（Diosmetin）が挙げられる。そのうち、より好ましいものはフラボノイド骨格のＢ環の３’位がメトキシ基のクリソエリオールとタマリキセチンであり、特に好ましいものはクリソエリオールである。クリソエリオールは特異的なＣＹＰ１Ｂ１阻害作用及び４位のカテコールエストロゲン生成阻害作用を低濃度で発揮することができ、しかも低濃度（例えば０．１μＭ以下程度）ではＡｈＲに結合せずＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子発現を誘導する可能性が低いことから、本発明のメトキシフラボノイド化合物のなかでも特に好ましい。
【００４０】
（２）ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害作用及び４位のカテコールエストロゲン生成阻害作用
図１に示すように、エストロゲン（17竈-estradiol；Ｅ２）は、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ｂ１により、２位及び４位のカテコール体（２−ＯＨＥ２、４−ＯＨＥ２）へ代謝されるが、正常な乳腺組織内ではこれらのカテコール体はＣＯＭＴの解毒作用によりメトキシ化された後、ＵＧＴｓにより抱合化され組織外へ排出される（図１参照）。
【００４１】
しかしながら、ダイオキシンやＰＡＨｓなどによる暴露によって、ＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子発現が亢進されると、４位のカテコールエストロゲンの生成が亢進する。生成した４位のカテコールエストロゲンは、セミキノン体やキノン体（Ｅ２−３，４Ｑ）への酸化反応を介してフリーラジカルを生成し、ＤＮＡを損傷したり、ＤＮＡ付加体を形成したりして、乳がんや子宮がんを誘発すると考えられている。
【００４２】
薬物代謝酵素であるＣＹＰは、脂溶性低分子化合物の酸化反応に関わるヘムタンパク質性モノオキシゲナーゼである。ＣＹＰはＰＡＨｓ、ヘテロサイクリックアミン、芳香族アミン、ニトロ多環芳香族炭化水素等の代謝的活性化を触媒する。ＰＡＨｓそのものは変異原性を示さないが、ＣＹＰ１Ｂ１によって代謝活性化され、生成したエポキシ体がＤＮＡに結合して遺伝子の突然変異を惹起し、発がんを誘発することが知られている。
【００４３】
ＣＹＰ１Ｂ１は、正常組織に比べて腫瘍組織で高発現しており、発がんとの関連が示唆されているが、ＰＡＨｓ等によりＡｈＲを介して誘導が起こる。またＥ２によっても誘導がかかることが報告されており、これもまた発がんを亢進させる結果となる。ヒト乳がん組織や子宮内膜がん組織では正常と比較して４−ＯＨＥ２が多く検出されている。かくしてＰＡＨｓによる化学発がんでも、ホルモン依存性の癌においても、ＣＹＰ１Ｂ１は癌化を促進する方向へ機能している。
【００４４】
本発明者は、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害して乳がん発生予防因子となりうるものを、いくつかのフラボノイド化合物から探索した結果、上記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を見いだしたものである。
【００４５】
本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤は、エストロゲンから４位のカテコール体（４位−カテコールエストロゲン）への変換において鍵となる酵素であるＣＹＰ１Ｂ１の働きを阻害することにより、４位のカテコールエストロゲンの生成を抑制する作用を有する。
【００４６】
また、本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤は、ＣＹＰ１Ｂ１の阻害作用に加えて、次のような作用的特徴を有する。すなわち、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害しＣＯＭＴ及びＣＹＰ１Ａ１の活性を阻害しないため、抗ガン作用を有する２位のカテコール体生成及びそれによる細胞内の解毒代謝機構の正常な働きを保つことができ、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えない。また、肝臓に多く発現するＣＹＰ３Ａ４の活性も阻害しない。
【００４７】
また、１μＭ以下の低濃度ではエストロゲンに対するアンタゴニスト活性を有しないので、エストロゲンの正常なホルモン作用を阻害しない。したがって、ホルモン補充療法においてはホルモン投与による効果を犠牲にすることなく該療法の副作用である乳がん、子宮がんの発生を抑制する可能性がある。また、乳がん発生のリスク要因であるＣＹＰ１Ｂ１を誘導することもない。よって、目的とするＣＹＰ１Ｂ１のみを選択的に阻害して乳がん発生のリスク要因である４位−カテコールエストロゲンの生成を抑制することができ、極めて優れた乳がん発生抑制因子となりうる。
【００４８】
（３）濃度
本発明のメトキシフラボノイド化合物の上述した優れた特異的ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害作用及び４位−カテコールエストロゲン生成阻害作用は、比較的低濃度で顕著に発揮される。顕著な効果を示す濃度の制限は特にないが、好ましい濃度（血中濃度）の目安としては、０．１μＭ以下である。低濃度でＣＹＰ１Ｂ１に対して特異的に阻害作用を示すので、酵素阻害の試薬としても有用である。特にクリソエリオールが効果を発揮する好ましい濃度範囲は０．０１〜０．１μＭである。クリソエリオールは０．1μＭ以下、より好ましくは０．０５μＭ以下の低濃度で優れた特異的ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害作用及び４位−カテコールエストロゲン生成阻害作用を示す。
【００４９】
（４）入手方法
本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤及びＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤の有効成分である上記一般式（１）で表される特定のメトキシフラボノイド化合物は、試薬として市販されているものを用いることができる。また、エゴマ中に多く含まれるルテオリンのメチル化体であるから、エゴマからルテオリンを抽出し、これをメチル化剤を用いてメチル化することによっても入手可能である。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞
エトキシレゾルフィン（ＥＲ）はＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１のＯ−脱アルキル化反応（ＥＲＯＤ）により蛍光物質であるレゾルフィンへと代謝される。この代謝反応を利用してレゾルフィンを励起させてその蛍光強度を測定することによりＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１の酵素活性を測定することができる（ＥＲＯＤアッセイ）。
また、ＣＹＰ３Ａ４は肝臓で最も発現しているＣＹＰであるが、このＣＹＰ３Ａ４の酵素活性は、ルシフェリン−６’−ベンジルエーテル（luciferin 6' benzyl ether）を基質として、生成したluciferinを測定することにより測定することができる。
本実施例では、メトキシフラボノイド化合物としてクリソエリオール、タマリキセチン、及びイソラムネチンを用い、ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１／３Ａ４の各酵素と上述した基質を用いてメトキシフラボノイド化合物の酵素阻害活性を測定した。
【００５２】
１．実験方法
［ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１酵素阻害活性；ＥＲＯＤアッセイ］
（１）試薬調製
（ｉ）１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
ＮａＣｌ［特級／和光純薬工業］；８．０ｇ
ＫＣｌ［特級／和光純薬工業］；０．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4［特級／和光純薬工業］；０．２ｇ
ＮａＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ［特級／和光純薬工業］；２．４８ｇ
上記の試薬を蒸留水に溶解し、最終容量を１Ｌ（リットル）とした。
【００５３】
（ii）酵素調製液（１ウェル（well）あたり）
０．１Ｍリン酸バッファー；５６μｌ
１Ｍ・ＭｇＣｌ2溶液（ｗａｋｏ）（９７．２ｍｇを１００ｍｌの純水に溶解した）；４μｌ
１ＭＧ−６−Ｐ溶液（オリエンタル酵母）（３０．４ｍｇのＧ−６−Ｐを１ｍｌの純水に溶解した）；４μｌ
０．１ＭＮＡＤＰＨ溶液（オリエンタル酵母）（８８．７ｍｇのＮＡＤＰＨを１ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
０，１ＭＮＡＤＨ溶液（オリエンタル酵母）（７０．９ｍｇのＮＡＤＨを１ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
【００５４】
（iii）２．５ｍＭエトキシレゾルフィン溶液（ＳＩＧＭＡ）
１ｇを２．６４ｍｌＤＭＳＯで溶解した。
（iv）１５μＭエトキシレゾルフィン溶液
上記（iii）３０μｌに対してリン酸バッファー４９７０μｌを加えた；４０μｌ
【００５５】
（ｖ）ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１マイクロゾーム溶液（第一化学）
RecombinantＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１supersome
（１４．２５／１２．９μｇ／０．１Ｍリン酸バッファー１ｍｌ）；４０μｌ
（vi）フラボノイド溶液（フナコシ）
ＤＭＳＯに溶解した最終濃度の１００倍の濃さにしたフラボノイド２μｌをリン酸バッファー４０μｌに溶解した；４０μｌ
【００５６】
（２）検量線用レゾルフィン溶液（ＴＣＩ）
レゾルフィンをＤＭＳＯに溶解し、最終濃度０〜０．２μＭの範囲になるようにリン酸バッファーに添加し、レゾルフィン溶液を作成して９６ウェル（穴）プレートを用いて蛍光プレートリーダーで測定した。
【００５７】
（３）酵素活性測定方法（ＥＲＯＤアッセイ）
９６ウェルプレートにフラボノイド溶液を４０μｌ入れ、酵素調製液を８０μｌ加えた。次にマイクロゾーム溶液を４０μｌ加えて５分間３７℃でインキュベートした後、そこに１５μＭエトキシレゾルフィンを加えて５分間インキュベート後、蛍光プレートリーダーで測定をした（励起５３０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）。
【００５８】
なお、本実験では酵素反応の阻害形式を解析するためにラインウィーバー・バークプロット（Lineweaber-Burk plot）をとったが、これに関してはインキュベート時間を３０分間とした。すなわち、上記ＥＲＯＤアッセイにおいて１５μＭエトキシレゾルフィン溶液を加えた後、３０分間インキュベートした。なお、使用したエトキシレゾルフィンの濃度は０、０．１８６、０．３７４、０．７５、１．５、３及び６μＭであった。
【００５９】
［ＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性］
（１）試薬調製（１wellあたり）
（ｉ）４×ＣＹＰ３Ａ４/リン酸バッファー/Substrate Reaction Mixture
Recombinant CYP3A4 supersome；５．８μｌ
１Ｍリン酸バッファー； ２．５μｌ
Substrate Reaction Mixture； ０．５μｌ
純水； ３．７μｌ
Total； １２．５μｌ
【００６０】
（ii）クリソエリオール溶液；１２．５μｌ
（iii）２×ＮＡＤＰＨ
６５ｍＭ ＮＡＤＰＨ； １ μｌ
１ｍＭ Ｇ−６−Ｐ； １．６５μｌ
１ｍＭ ＭｇＣｌ2； １．６５μｌ
１Ｍリン酸バッファー； １０ μｌ
純水； １０．７ μｌ
Total； ２５ μｌ
【００６１】
（iv）ＬＤＲ溶液
Luciferin Detection Reagent＋P450-Glo Buffer；５０μｌ
【００６２】
（２）ＣＹＰ３Ａ４の酵素測定法
（ｉ）と（ii）を１２．５μｌずつルミノスキャン用ホワイト９６wellプレートに入れて１０分３７℃でインキュベートした。その後、(iii)の溶液を２５μｌ添加後、３０分３７℃でインキュベートした。反応後（iv）の溶液を添加した後、ルミノスキャンで検出した。
【００６３】
２．実験結果
（１）ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１酵素阻害活性の測定結果
ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１（１４．２５／１２．９μｇ）に対してメトキシフラボノイド化合物を０〜０．１μＭ作用させ、ＥＲＯＤアッセイによる阻害活性を測定した結果を図２に示した。図２よりクリソエリオール、タマリキセチン及びイソラムネチンにＣＹＰ１Ｂ１に対する特異的な酵素阻害作用が見られ、ＩＣ５０（酵素活性を５０％阻害する濃度）は、それぞれ０．０２８μＭ、０．０４５μＭ及び０．０４８μＭであった。一方、メチル化されていないケルセチン（quercetin）とルテオリン（luteolin）には、ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１いずれに対しても阻害効果は見られなかった。
【００６４】
クリソエリオールの阻害様式を確認するためにラインウィーバー・バークプロットをとったところ、図３に示したようにクリソエリオールのＣＹＰ１Ｂ１に対する阻害様式は非競合阻害だと考えられる。
【００６５】
図２からフラボノイド骨格のＢ環の３’位がメトキシ基に置換しているクリソエリオールとタマリキセチンに、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に低濃度で阻害する作用が顕著に見られた。フラボノイド骨格のＢ環がメトキシ基に置換していること、特にＢ環の３’位がメトキシ基に置換していることがＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害するのに重要であると考えられる。
【００６６】
（２）ＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性の測定結果
図４にＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性の測定結果を示した。それによれば、クリソエリオールによるＣＹＰ３Ａ４酵素阻害作用は見られなかった。タマリキセチンによる阻害作用もわずかであった。ＣＹＰ３Ａ４は肝臓でよく発現しており、本発明のメトキシフラボノイド化合物がＣＹＰ３Ａ４酵素阻害作用を示さないことから、肝臓における副作用は少ない可能性が示された。
【００６７】
＜実施例２＞
本実施例では、本発明のメトキシフラボノイド化合物のうち、特に実施例１でＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害したクリソエリオールを用いて、Ｅ２から２−ＯＨＥ２及び４−ＯＨＥ２への代謝に対し阻害が起こるかどうかをＧＣ／ＭＳ分析により検討した。
【００６８】
１．実験方法
（１）試薬調製
（ｉ）１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
実施例１の（１）試薬調製（ｉ）に準じて調製した。
【００６９】
（ii）酵素調製液（１チューブ（tube）あたり）
０．１Ｍリン酸バッファー；１１２μｌ
１Ｍ・ＭｇＣｌ2溶液（ｗａｋｏ）（９７．２ｍｇを１００ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
１ＭＧ−６−Ｐ溶液（オリエンタル酵母）（３０．４ｍｇのＧ−６−Ｐを１ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
０．１ＭＮＡＤＰＨ溶液（オリエンタル酵母）（８８．７ｍｇのＮＡＤＰＨを１ｍｌの純水に溶解した）；１６μｌ
０，１ＭＮＡＤＨ溶液（オリエンタル酵母）（７０．９ｍｇのＮＡＤＨを１ｍｌの純水に溶解した）；１６μｌ
【００７０】
（iii）クリソエリオール溶液（フナコシ）
メタノールで調製したクリソエリオールをリン酸バッファーに溶解した；８０μｌ
（iv）Ｅ２溶液
Ｅ２をメタノールで調整し最終濃度２０μＭになるようにリン酸バッファーに添加した；８０μｌ
（ｖ）ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１マイクロゾーム溶液（第一化学）
ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１（１８．４／３８．４μｇ／８００μｌリン酸バッファー）；８０μｌ
【００７１】
（２）酵素反応・２−ＯＨＥ２及び４−ＯＨＥ２の抽出
１５ｍｌチューブにクリソエリオール、酵素調製液、マイクロゾーム溶液を混合し、５分３７℃でプレインキュベートした。５分後、混合液の中にＥ２溶液を入れ４０分インキュベートした。４０分後反応を止めるためにジクロロメタン５ｍｌ添加した。よく振った後、上層をとり、下層のジクロロメタン層に硫酸ナトリウムを添加し、脱水した。ジクロロメタン層の水分が硫酸ナトリウムにより除去され、さらに添加した硫酸ナトリウムがさらさらになったところで溶液をフィルターに通して内部標準物質であるequiline（１μＭ）を５０μｌ加えた。
【００７２】
（３）ＧＣ／ＭＳ分析
脱水したジクロロメタン抽出液を窒素で濃縮し、それにＴＭＳを５０μｌずつ添加後、１時間室温で放置し、ＧＣ／ＭＳで測定した（ＴＭＳ化後は、１日間−１０℃冷凍保存可能）。
【００７３】
（４）ＧＣ／ＭＳ条件
ＧＣ／ＭＳ Agilent.6890
注入口：３００℃
オーブン：１００℃で５分加熱後、１５℃／分で３００℃まで昇温し、３００℃で２０分保持した。
ＳＩＭ：
内部標準−ＴＭＳ：３４０（ｍ／Ｚ）；２２．４２ｍｉｎ
２ＯＨＥ２−ＴＭＳ：５０４（ｍ／Ｚ）；２３．９５ｍｉｎ
４ＯＨＥ２−ＴＭＳ：５０４（ｍ／Ｚ）；２４．５９ｍｉｎ
検出器：３００℃
キャリアー：Ｈｅ，１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム：ＤＢ−５（Agilent）
６０×０．３２ｍｍ×０．２５ｍｍ
【００７４】
（５）統計処理
分散分析を行った後、対照群として指定した1群と多群を比較したDunnett法を用いて検定を行った。
【００７５】
２．実験結果
ＧＣ／ＭＳ分析の結果を図５に示す。クリソエリオールは、ＣＹＰ１Ｂ１による４−ＯＨＥ２の生成を０．０５μＭで６９％抑制したが、ＣＹＰ１Ａ１による２−ＯＨＥ２の生成に対しては抑制作用を示さなかった。この結果は実施例１の結果と同様に、クリソエリオールがＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害することを示している。
【００７６】
＜実施例３＞
エストロゲンのカテコール体である４−ＯＨＥ２および２−ＯＨＥ２は、ＣＯＭＴによりメチル化され無毒化する。肝サイトゾール中にはＣＯＭＴが存在する。本実験では、肝サイトゾール及びドナー基質としてトリチウムラベルしたS-adenosyl-L-methionine（ＳＡＭ）を用いて、４−ＯＨＥ２からメチル化された４−ＭｅＯＥ２を検出するメチレーションアッセイを行い、クリソエリオールがＣＯＭＴの阻害をしないかどうかを確認した。
【００７７】
１．実験方法
（１）試料調製
（ｉ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
ＴＲＩＺＭＡ・ＢＡＳＥ（Ｓｉｇｍａ）６０．５５ｇを４００ｍｌの純水に溶解し、塩酸でｐＨを７．４に調節して５００ｍｌまでメスアップした。
（ii）２４ｍＭ・ＭｇＣｌ2
ＭｇＣｌ2（Ｗａｋｏ）２２８．５ｍｇを１００ｍｌの純水に溶解した。
（iii）２０ｍＭ・ＤＴＴ
ＤＴＴ（DL-dithiothreitol）６０ｍｇを１０ｍｌの純水に溶解した。
（iv）１ｍＭ ｃｏｌｄ・ＳＡＭ（[methyl]-S-adenosyl-L-methionine）
３２ｍＭのＳＡＭ溶液を１ｍＭになるようにエタノールで希釈して、−２０℃で保存した。
【００７８】
（２）メチレーションアッセイ
（ｉ）反応液の組成
下記表１に示す組成で反応液を調製した。
【００７９】
【表１】
【００８０】
（ii）反応方法
ＭｇＣｌ2、ＤＴＴ、ｃｏｌｄ・ＳＡＭを混合したものにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と基質（４−ＯＨＥ２）を添加してＨｏｔ・ＳＡＭを入れた（ネガコンはここまで）。次に、試料を添加したものとしないものに肝サイトゾールを加え３７℃で２０分反応を行った。反応後、ＤＤＷ５００μｌと反応を止めるためのｎ−ヘプタン３ｍｌを加え、ｖｏｒｔｅｘをかけてから遠心を２０００ｒｐｍで１０分行った。その後、上澄を１ｍｌ分注し、シンチバースを４ｍｌ加え、ｖｏｒｔｅｘをかけた後に液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００８１】
２．実験結果
メチレーションアッセイを行った結果、図６に示すようにクリソエリオールにＣＯＭＴ阻害効果は見られなかった。また４−ＯＨＥ２を入れずに反応を行ったところ、クリソエリオール自身がＣＯＭＴによりメトキシ化されることはなかった。
【００８２】
＜実施例４＞
ＭＣＦ７細胞においては、ＣＹＰ１Ａ１よりもＣＹＰ１Ｂ１が発現しており、細胞内でＥ２は代謝され、最終的に２−ＭｅＯＥ２及び４−ＭｅＯＥ２の抱合体となって細胞外へ排泄される。そこで、クリソエリオールの存在下、非存在下で細胞を培養し、ＣＹＰ１Ｂ１が細胞内でも阻害されるかどうか、培地中に排泄された２−ＭｅＯＥ２及び４−ＭｅＯＥ２抱合体量を、竈-glucuronidase/sulfataseによる加水分解後、クーロアレイＨＰＬＣ法により測定した。
【００８３】
１．実験方法
（１）使用した細胞
ＭＣＦ−７：乳癌細胞［乳腺上皮：転移性腫瘍：胸水・腺癌］（69 years）
静岡県立大学大学院生活健康科学研究科生体防御研究室、久留戸涼子先生(Dr. Hanspaul Hagenmaier, Institute of Organic Chemistry, University of Tuebingen, Germany)から分与頂いたものを使用。
【００８４】
（２）使用した培地（培地１Lあたり）
（ｉ）粉末培地（phenol red）
ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）［日水製薬］；９．５ｇ
炭酸水素ナトリウム［特級／和光純薬］；１．５ｇ
L-glutamine［ＳＩＧＭＡ］；０．５８ｇ
カナマイシン［ＩＣＮ］；０．１ｇ
アンピシリン［ＩＣＮ］；０．１ｇ
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）［ＩＣＮ］；１１０ｍｌ
【００８５】
（ii）液体培地（phenol red free medium）
以下に示す組成の培地を調製後、ｐＨ７．６に合わせたのち、組織培養フィルター［半径７５ｍｍ／ポアサイズ０．２μｍ／NALGENE］で滅菌後使用した。
ＤＭＥＭ（phenol red free）［Gibco］；５００ｍｌ
L-glutamine［ＳＩＧＭＡ］；０．２９ｇ
カナマイシン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
アンピシリン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
Charcoal/Dextran treated FBS［Hyclone］；５５ｍｌ
【００８６】
（ii）１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．４）溶液
酢酸アンモニウム（Ｗａｋｏ）５３．９６ｇを７００ｍｌの純水に溶解させた。
（iii）Ａ液
アセトニトリル（関東化学ＨＰＬＣ用）；４５０ｍｌ
メタノール（関東化学ＨＰＬＣ用）；１５０ｍｌ
純水；２１００ｍｌ
１Ｍ酢酸アンモニウム；３００ｍｌ
（iv）Ｂ液
アセトニトリル（関東化学ＨＰＬＣ用）；１５００ｍｌ
メタノール（関東化学ＨＰＬＣ用）；６００ｍｌ
純水；６００ｍｌ
１Ｍ酢酸アンモニウム；３００ｍｌ
【００８７】
（ｖ）スタンダード原液
２０ｍＭ Ｅ２；５．４４ｍｇ
２０ｍＭ ４ＯＨＥ２；５．７６ｍｇ
２０ｍＭ ２ＭｅＯＥ２；６．０４ｍｇ
２０ｍＭ ４ＭｅＯＥ２；６．０４ｍｇ
それぞれをＤＭＳＯ１ｍｌに溶解した。
（vi）スタンダード溶液
上記（ｖ）で調製したスタンダード原液をＢ液で２０倍希釈→１００倍希釈→１００倍希釈の順で最終濃度を１００ｎＭに調製した。
【００８８】
（３）細胞培養
ＭＣＦ７を１×１０4cell／ｃｍ2になるようにＬＰディッシュに播き、５日間培養した。５日後、培地をＤＭＥＭ培地からＥ２フリーのＤＭＥＭ培地に変え、０．０５及び０．１μＭのクリソエリオールを添加し、その１５分後に１μＭのＥ２を添加して２４時間培養した。培地を採取し、遠心を行った後、上清を液体窒素で凍結し、−２０℃で保存した。
【００８９】
（４）抽出
培地２ｍｌに対して２Ｎ酢酸アンモニウムを０．５ｍｌ加えて酸性とし、竈-glucuronidase/sulfatase（ＳＩＧＭＡ）を１０μｌ加えて遮光して３７℃で１７時間酵素処理を行った。その後、ジクロロメタンを２．５ｍｌ加えてボルテックスを３０秒かけ抽出し、３０００ｒｐｍで遠心を３層になるまで行った。上層を別の試験管に移し、下層（ジクロロメタン層）をパスツールで取って目盛付試験管に移し、濃縮遠心エバポレーターにより濃縮した。上層を同様に再抽出し、ジクロロメタン層を最初のジクロロメタン層に加え、完全に乾固した。ＨＰＬＣ移動層Ｂ液を１００μｌ加えボルテックスをかけて溶解した後、３０００ｒｐｍで１５分遠心し、上清をクーロアレイ用バイアルに入れてクーロアレイＨＰＬＣ分析を行った。
【００９０】
（５）定量分析
定量分析は（６）に示すＨＰＬＣ−ＥＣＤ条件下で、ピーク面積を測定することにより行った。
【００９１】
（６）ＨＰＬＣ−ＥＣＤ条件
Column: ESA ODS（4.6×250mm）
Injection Volume:50・ｌ
Temperature:25℃
Detector Potentials：-10,80,170,260,350,440,530,
Gradient solvent: A; acetnitrile, methanol, water, ammonium acetate/ B; acetnitrile, methanol, water, ammonium acetate
Flow rate:1.0ml/min
【００９２】
（７）統計処理
分散分析を行った後、対照群として指定した1群と多群を比較したDunnett法を用いて検定を行った。
【００９３】
２．実験結果
クリソエリオールがＣＹＰ１Ｂ１を細胞内でも選択的に阻害するかどうかについて、培地中に排泄された２−ＭｅＯＥ２及び４−ＭｅＯＥ２抱合体量を、竈-glucuronidase/sulfataseで加水分解後、クーロアレイＨＰＬＣ法により測定して確認した。結果を図７に示した。クリソエリオールは、４−ＭｅＯＥ２の生成を０．０５μＭ、０．１μＭで有意に抑制したが、２−ＭｅＯＥ２の生成に対しては抑制作用を示さなかった。実施例３によりクリソエリオールがＥ２の各カテコール体のメチル化を阻害しなかったので、この結果は実施例１〜２の結果と同じであり、本結果はクリソエリオールが細胞内においてもＣＹＰ１Ｂ１を低濃度で特異的に阻害したことを示している。
【００９４】
＜実施例５＞
本実施例では、本発明のメトキシフラボノイド化合物がそれ自身でエストロゲン作用やＣＹＰ１Ｂ１を誘導する作用がないかどうかを確認した。すなわち、本発明のメトキシフラボノイド化合物のエストロゲンレセプター結合性を検討し、エストロゲンレセプターへのアンタゴニスト又はアゴニスト活性の有無を検討した。
【００９５】
１．実験方法
（１）使用した細胞
ＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ−７；静岡県立大学大学院生活健康科学研究科生体防御研究室、久留戸涼子先生の開発によるものを用いた。ＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ７細胞はＭＣＦ７細胞にgreen-fluorescent-protein reportor vectorが組み込まれており、ＥＲＥにＥ２又はＥ２様物質が結合すると蛍光を発する。
【００９６】
（２）試薬調製
（ｉ）液体培地（phenol red free medium）
ＤＭＥＭ（phenol red free）［Gibco］；５００ｍｌ
L-glutamine［ＳＩＧＭＡ］；０．２９ｇ
カナマイシン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
アンピシリン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
Charcoal/Dextran treated FBS [Hyclone]；５５ｍｌ
（ii）テストサンプル
クリソエリオールをＤＭＳＯに溶解した。
【００９７】
（３）培養・測定方法
ＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ−７細胞を９６ウェル（well）プレートに１×１０4／well播き、細胞が接着するまで４時間インキュベートした。４時間後、１０-8Ｍエストロゲンと種々の濃度のクリソエリオール又はクリソエリオールのみを細胞に添加した。添加してから３日目に細胞にCell counting kitを１０μｌずつ添加し、２時間後に細胞数を測定した（450nm, Reference 630nm）。細胞数を測定後、wellの溶液を取り除き、蛍光をFluorImager SIで測定をした。
【００９８】
２．実験結果
蛍光測定結果を図８に示す。クリソエリオールは、１０-8〜１０-5の濃度でエストロゲンレセプターへの結合活性が上昇していたが、アンタゴニスト作用は見られなかった。
【００９９】
＜実施例６＞
本実施例では、ｌacZ reporter plasmidならびにヒトＡｈＲとＡｈＲ核内輸送酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子組み換え酵母Saccharomyces cerevisiae YCM3を用いたレポータージーンアッセイを行った。ＢａＰなどのリガンドがＡｈＲに結合するとβ−ガラクトシダーゼ（竈-galactosidase）が誘導され、本酵素の活性を測定することによりＡｈＲへの結合性が評価できる。本実験では本発明のメトキシフラボノイド化合物のＡｈＲへの結合性を検討し、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用がないかを確認した。
【０１００】
１．実験方法
（１）使用した酵母
LacZ reporter plasmidならびにヒトＡｈＲとＡｈＲ核内輸送酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子組み換え酵母Saccharomyces cerevisiae YCM３株
【０１０１】
（２）試薬等の調製方法
（ｉ）酵母前培養培地
Ｄ（＋）グルコース；２ｇ
Yeast Nitrogen Base ｗ/0 Amino Acid(BD)；０．６７ｇ
アデニン塩酸塩（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−水和物（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ロイシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ（＋）−リシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
これらを１００ｍｌの純水に溶解した。
【０１０２】
（ii）酵母本培養培地
ガラクトース；２ｇ
Yeast Nitrogen Base ｗ/0 Amino Acid(BD)；０．６７ｇ
アデニン塩酸塩（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−水和物（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ロイシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ（＋）−リシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
これらを１００ｍｌの純水に溶解した。
【０１０３】
（iii）Ｚ−Ｂｕｆｆｅｒ
ＮａＨ2ＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ［特級／和光純薬工業］；４．３００２ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ；１．２４３８ｇ
ＫＣｌ；０．１５１９ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．０４９２ｇ
これらを２００ｍｌの蒸留水に溶解した。
【０１０４】
（iv）溶菌剤
N-Laurosyl cosine solution(SIGMA)；３０ｍｇ
メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）；８１μｌ
Ｚ−Ｂｕｆｆｅｒ；３０ｍｌ
【０１０５】
（ｖ）反応液
Ｚ−ｂｕｆｆｅｒ；１５ｍｌ
メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）；４５μｌ
２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｗａｋｏ）；６０ｍｇ
（vi）クリソエリオール１０〜０．００１μＭ（フナコシ）
各種フラボノイドを１０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解し、−２０℃保存した。それを１０〜０．００１μＭ濃度に調製した。
【０１０６】
（３）測定方法
９６ウェル（Well）プレートにＢａＰとメトキシフラボノイド０．００１〜１０μＭの範囲で添加した。次にガラクトースＳｃに培地を変えた酵母を２００μｌずつ加えて１晩置いた。翌日、培養した酵母の濁度を６３０ｎｍで測定した。そこから３０μｌ取り、別のプレートに溶液を移し、そこに溶菌剤を１２０μｌ添加して１３分インキュベートした。その後、反応液を５０μｌずつ添加し、数分置いた後（色が出てきたら）４５０ｎｍで測定した。
【０１０７】
２．実験結果
図９に示すように、クリソエリオールのＡｈＲ結合活性は非常に弱く、０．１μＭ以下ではアゴニスト作用は全く見られず、１μＭでアンタゴニスト作用も見られなかった。
【０１０８】
上記実施例１〜５の結果から以下のことが明らかとなった。
（１）実施例１で示されたように、本発明のメトキシフラボノイド化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を低濃度で特異的に阻害し、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を阻害しない。
【０１０９】
（２）実施例２において、本発明のメトキシフラボノイド化合物がＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１によるＥ２から２−ＯＨＥ２及び４−ＯＨＥ２への代謝に対し阻害作用を示すかどうかをＧＣ／ＭＳ分析により検討した結果、ＣＹＰ１Ｂ１についてはエトキシレゾルフィンを用いた実施例１の結果と同様の阻害作用が見られ、０．０５μＭで有意に４−ＯＨＥ２の生成を６９％抑制した。ＣＹＰ１Ａ１については、ほとんど影響が見られなかった。なお、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害する化合物として２，３，４，５−テトラメチルスチルベン（ＴＭＳ）が報告されているが、ＴＭＳのＣＹＰ１Ｂ１による４‐ＯＨＥ２生成阻害活性は、ＩＣ５０が０．２５μＭであり、本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤のほうが低濃度で阻害活性を示しており、有効であると考えられる。
【０１１０】
（３）カテコールエストロゲンの重要な解毒酵素であるＣＯＭＴは、カテコールエストロゲンをメチル化するが、クリソエリオールのＣＯＭＴへの影響について、肝サイトゾールを用いたメチレーションアッセイを行った実施例３の結果から、クリソエリオールはＣＯＭＴを阻害せず、同時にクリソエリオール自身がメチル化されることもなかった。カテキン、エピカテキン、ＥＧＣＧ、ケルセチン、フィセチン（fisetin）のようなカテコール構造を有するフラボノイドは、ＣＯＭＴによるカテコールエストロゲンのメチル化を阻害するが、クリソエリオールをはじめとする本発明のメトキシフラボノイド化合物はカテコール構造を持っておらずＣＯＭＴを阻害しないことから、カテコールエストロゲンのメチル化には影響がなくＣＹＰ１Ａ１により生成する２−ＯＨＥ２の代謝を阻害しないため、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えないと思われる。
【０１１１】
（４）実施例４において、ＭＣＦ−７細胞を用いて培地中のカテコールエストロゲン代謝物の解析を行い、クリソエリオールがＣＹＰ１Ｂ１に対して細胞内においても特異的に阻害するかどうかを検討した。その結果、クリソエリオール０．０５μＭ及び０．１μＭをそれぞれ作用させた場合、培地中に排泄された４−ＭｅＯＥ２量が低下したが、２−ＭｅＯＥ２量の低下は見られなかった。このことからクリソエリオールは細胞内においてもＣＹＰ１Ｂ１の酵素に対して特異的に阻害し、細胞内で４−ＯＨＥ２の生成のみを抑制しうると思われる。従って、クリソエリオールをはじめとする本発明のメトキシフラボノイド化合物はＥ２が４位の水酸基の酸化、キノン体の生成を経てＤＮＡ付加体の形成を促進するのを抑制すると思われる。
【０１１２】
（５）実施例５に示すように、クリソエリオールは１μＭ以下ではエストロゲンレセプターに対してアンタゴニスト作用を示さない。高濃度になるにつれてＥ２へのアゴニスト作用をわずかではあるが示した、すなわちわずかにエストロゲン活性が見られた。しかし、Ｅ２に対するアンタゴニスト作用、すなわちエストロゲン活性抑制作用は見られなかった。一方、タマリキセチンにはエストロゲンレセプターへの結合性もＥ２に対するアンタゴニスト作用も見られなかった。従って、本発明のメトキシフラボノイド化合物は弱いエストロゲン様を示すが、エストロゲンレセプターへのＥ２の結合作用に対して低濃度ではアンタゴニスト的に働く可能性は低いと考えられる。
【０１１３】
（６）実施例６に示すように、クリソエリオールはＡｈＲにも低濃度では結合しないことから、クリソエリオール自身はＣＹＰを誘導しないことが示唆された。従ってクリソエリオールはＣＹＰ１Ｂ１によるＥ２から４−ＯＨＥ２の生成を特異的に阻害する因子として有用であると思われる。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明のメトキシフラボノイド化合物は、低濃度でＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害し、乳がんの原因とされる４−ＯＨＥ２の生成を抑制する作用を有する。しかも、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＭＴを阻害しないため細胞内の解毒作用が正常に働き、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えない。また、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を阻害しないため、肝臓における副作用が少ない可能性がある。また、エストロゲンに対するアンタゴニスト活性を有しないので、エストロゲンの正常なホルモン作用を阻害しない。
【０１１５】
したがって、ホルモン補充療法においてもホルモン投与による効果を犠牲にすることなく該療法の副作用である乳がん、子宮がんの発生を抑制することができる。よって、安全で且つ極めて優れた乳がん発生予防因子として有用であり、がん予防・治療の分野への貢献が期待される。また、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素阻害試薬として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】エストロゲン代謝のメカニズムを表す概略図である。
【図２】実施例１のＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１酵素阻害活性（ＥＲＯＤアッセイ）の結果を示すグラフである。
【図３】実施例１のラインウィーバー・バークプロットをとった結果を示すグラフである。
【図４】実施例１のＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例２のＧＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図６】実施例３のメチレーションアッセイの結果を示すグラフである。
【図７】実施例４のクーロアレイＨＰＬＣ法による測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例５のＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ−７細胞の蛍光測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例６のレポータージーンアッセイの結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１１７】
１ エトキシレゾルフィン
２ エトキシレゾルフィン＋クリソエリオール０．０５μＭ
３ エトキシレゾルフィン＋クリソエリオール０．１μＭ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メトキシフラボノイド化合物を有効成分とする４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤に関する。詳しくは、本発明は、正常なホルモン作用及びカテコールエストロゲンの解毒作用を阻害することなく、４位−カテコールエストロゲン生成に関与する代謝酵素（ＣＹＰ１Ｂ１）を特異的に阻害しうる薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（１）乳がんの罹患率、死亡率の増加は、近年際だっている。乳がんはホルモン依存性腫瘍であり、そのリスク要因としては、遺伝的要因の他にカロリーが高く脂肪の多い食事、初潮年齢、閉経年齢、出産経験の有無などがあるが、女性ホルモンであるエストロゲンに暴露される時間が長いほどリスクが高くなると考えられている。
エストロゲン（エストロン、エストラジオール（Ｅ２））は、乳腺組織内で薬物代謝酵素の一つであるチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１）により、それぞれ２位及び４位のカテコール体（２−ＯＨＥ２、４−ＯＨＥ２）へ代謝される。
【０００３】
しかしながら、カテコール体はキノン体へ変換する場合があり、特に４位のカテコール体はキノン体（Ｅ２−３，４Ｑ）となって活性酸素を生じたり、ＤＮＡや染色体チューブリンに付加体を形成したりして、遺伝子突然変異や染色体不安定性を引き起こし、発がん性を示すことが明らかにされた（非特許文献１参照）
【０００４】
正常な乳腺組織内では、カテコール体はメチル化酵素であるカテコールメチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によりメチル化されて安定なメトキシ体となった後、UDP-glucuronosyltransferase（ＵＧＴｓ）によって不活性のグルクロニド（inactive glucuronide）に抱合化され、組織外へ排出される。しかしながら、乳がん組織内ではこの解毒機構が十分に機能せず、正常組織内よりもＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子発現が亢進し、４位のカテコール体の生成が亢進していることが報告されている（非特許文献２参照）。図１にエストロゲン代謝のメカニズムを表す概略図を示す。
【０００５】
（２）また、ホルモン補充療法剤プレマリンに含まれる馬尿より抽出したエキリンやエキレニンも、Ｅ２と同様に代謝されて４位のカテコール体（４−ＯＨＥＱ、４−ＯＨＥＮ）となり、ＤＮＡ付加体を形成する。ホルモン補充療法の副作用として乳がんや子宮がんの発生が問題となっているが、これらの４位のカテコール体がその原因のひとつとして考えられている。
【０００６】
（３）ＣＹＰ１Ｂ１の発現には、ダイオキシンや多環芳香族炭化水素（ＰＡＨｓ）が関与していると考えられている。正常乳腺細胞がダイオキシンやＰＡＨｓなどに暴露されると、それらは脂溶性に富むため、細胞膜を容易に通過し核内レセプターであるaryl hydrocarbon receptor（ＡｈＲ）と結合する。ＡｈＲはｂＨＬＨ−ＰＡＳ型転写因子の構造を持つ受容体型転写因子であり、リガンドに結合することで核内に移行する。核内でＡｈＲ nuclear translocator（Ａｒｎｔ）とヘテロダイマーを形成し、標的遺伝子上流の5'-CACGC-3'をコア配列とするＸＲＥ（xenobiotic responsive element）と結合することで標的遺伝子であるＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＵＧＴｓが誘導される。
【０００７】
薬物代謝型ＣＹＰの多くが肝臓で発現しているのに対し、ＣＹＰ１Ｂ１は肝臓では発現しておらず、肺、腎、乳腺や精巣、卵巣、子宮などの生殖器で発現が認められている（非特許文献３参照）。したがって、ダイオキシンやＰＡＨｓなどによる暴露によってこれらの臓器でＣＹＰ１Ｂ１の発現が誘導されると、カテコールエストロゲン生成が亢進され、それがこれらの臓器における発がんのリスク因子となると考えられる。
よって、ＣＹＰ１Ｂ１の働きを特異的に阻害し、４位−カテコールエストロゲンの生成を抑制する物質が見いだされれば、有望な乳がん発生予防因子になりうると考えられる。
【０００８】
（４）ところで、フラボノイドはＣ６−Ｃ３−Ｃ６の基本骨格を持つポリフェノール化合物であり、野菜、ナッツ類、果物やコーヒー、お茶、赤ワインなどの飲料中に存在する。フラボノイドの機能性については多くの報告があるが、生体内でのフラボノイド健康促進機能として、ヒドロキシラジカル、スーパーオキサイドアニオン、過酸化ラジカルの消去活性があり、膜、蛋白質、ＤＮＡへの酸化的ダメージが関与する病気の予防に対し重要な働きをする。
【０００９】
フラボノイドは、冠状動脈性心疾患、肝臓病、多くの癌の発生を減少させ予防することがヒトの疫学調査や動物実験により示されている。また、フラボノイドは、ＣＹＰによる発がん物質（ＢａＰなど）の代謝活性化抑制作用や生成した活性種（フリーラジカル）などを消去することも報告されている（非特許文献４）。また、メトキシフラボノイドのジメトキシフラボンやスチルベンのレスベラトロル（resveratrol）は、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性や遺伝子発現を抑制することが報告されている（非特許文献５、６参照）。
【００１０】
さらに、フラボンの３’にメトキシ基がつき、４’にアミノ基などが置換しているものにＡｈＲへのアンタゴニスト作用があることも報告されている（非特許文献７参照）。しかし一方で、お茶のカテキンである(-)-epigallocatechin-3-gallate（ＥＧＣＧ）は、カテコールエストロゲンの重要な解毒酵素であるＣＯＭＴを競合的に阻害する作用があることがNagaiらによって示された。ＥＧＣＧなどは、カテコール構造を有するためだと考えられる（非特許文献７）。
【００１１】
ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害する化合物として２,４,３’,５’−テトラメチルスチルベン（ＴＭＳ）が報告されているが、この化合物の阻害様式は競合阻害であった（非特許文献８、９）。
Chaudharyらの報告によると、タマリキセチン（tamarixetin）の親化合物のケルセチン（qurcetin）やケムフェロール（kaempherol）、ミリセチン（myricetin）は、１０μＭになるとＣＹＰ１Ａ１とＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を抑制した（非特許文献１０）。ＭＣＦ１０細胞を用いたresveratrolの効果についての報告では、２０μＭ以上でＣＹＰ１Ｂ１のｍＲＮＡの発現を抑制した。Ｅ２を基質とした酵素活性も濃度依存的に阻害が見られていた。しかしながら、ＣＹＰ１Ａ１のｍＲＮＡの発現、ＣＹＰ１Ａ１による酵素活性も同時に抑制していた（非特許文献６）。
乳腺組織ではＣＹＰ１Ａ１も働いており、２位のカテコール体を経てＣＯＭＴによりメトキシ体になった２−ＭｅＯＥ２には、抗がん作用があることが報告されている。また、２−ＭｅＯＥ２は細胞の増殖、チュウブリンの重合、血管新生作用を阻害する効果がある。従って、ＣＹＰ１Ａ１も抑制してしまうとＥ２の解毒代謝機構の一つである２位水酸化とそれに伴うＣＯＭＴによるメトキシ化も抑制してしまい、Ｅ２のホメオスタシスが崩れてしまう。
【００１２】
Doostdarらの報告によると、アカセチン（acacetin）及びジオスメチン（diosmetin）はＣＹＰ１Ａ及びＣＹＰ１Ｂ１に対する阻害作用を示し、ホモエリオディクチオール（homoeriodictyol）はＣＹＰ１Ｂ１に対し特異的に阻害作用を示した。しかし、ホモエリオディクチオールは、０．１μＭ以上の比較的高濃度でしか選択的阻害作用を示さない（非特許文献１１、１２）。
【００１３】
（５）ある種のフラボノイド系化合物がヒトのエストロゲン受容体への結合能を有しエストロゲン活性発現抑制効果を有することも報告されている（特許文献１参照）。フラボノイド系化合物はその他にも、紫外線誘発プロスタグランジンＥ２産生抑制作用（特許文献２参照）、ＴＮＦ−α産生抑制作用（特許文献３参照）など、種々の生理活性を有することが知られている。
【００１４】
乳がん発生予防因子として有用であるためには、それ自身にエストロゲン作用（アゴニスト活性）及びＣＹＰ１Ｂ１を誘導する作用がないことが必要である。しかしながら、ホルモン補充療法時には、エストロゲン活性を抑制してしまうと、ホルモン補充療法の効果が得られなくなる。
【００１５】
（６）そこで、ＣＹＰ１Ｂ１を誘導することなくその作用を特異的に阻害して４位のカテコール体（４位−カテコールエストロゲン）の生成を阻害する作用を低濃度で示し、且つエストロゲンやホルモン補充療法剤等の正常なホルモン作用を阻害せず、またＣＹＰ１Ａ１の酵素活性やＣＯＭＴの解毒作用をも阻害しない優れた乳がん発生予防因子の開発が望まれているが、未だ見いだされていなかった。
【００１６】
【特許文献１】特開２００３−２８３０号公報
【特許文献２】特開２００３−１９２５８８号公報
【特許文献３】特開２００５−２１３１７８号公報
【非特許文献１】Tsuchiya Y, Nakajima M, Yokoi T.: Cytochrom P450-mediated metabolism of estrogens and its regulation in human.: Cancer letter 227(2005)
【非特許文献２】Eleanor G.R, Alaa F.B, Prabu D.D, Jane L.M, James A.E, William W.W, Sheila M.H and Ercole L.C: Relative imbalances in estrogen metabolism and conjugation in breast tissue of women with carcinoma: potential biomarkers of susceptibility to cancer.: Carcinogenesis 24 697-702(2003)
【非特許文献３】土屋裕樹、中島美紀、横井毅． ヒトＣＹＰ１Ｂ１の転写調節機構：発癌とエストロゲンのホメオスタシス：生化学、７６、１５６５−１５６９
【非特許文献４】吉川敏一編集、フラボノイドの医学、講談社、東京 １９９８
【非特許文献５】Wen X, Walle U.Kristina and Walle T: 5,7-Dimethoxyflavone downregulates CYP1A1 expression and Benzo[a]Pyrene-induced DNA binding in Hep G2 cell. Carcinogenesis, 26, 803-809(2005)
【非特許文献６】Chen Z-H, Hurch Y-J, Na H-K, Kim H-H, Chun Y-J, Kim D-H, Kang K-S, Cho M-H and Sur Y-J: Resveratol inhibits TCDD-induced expression of CYP1A1 and CYP1B1 and catechol estrogen-mediated oxidative DNA damage in cultured human mammary epithelial cells. Carcinogenesis, 25(10), 2005-2013(2004)
【非特許文献７】Nagai M, Conney AH, Zhu BT.: Strong inhibitory effects of common tea catechins and bioflavonoids on the O-methylation of catechol estrogens catalyzed by human liver cytosolic catechol-O-methyltransferase. DMD. 32, 497-504(2004)
【非特許文献８】Chun YJ, Ryu SY, Jeong TC, Kim MY.: Mechanism-based inhibition of human cytochrome P450 1A1 by rhapontigenin. DMD. 29 389-93. 2001
【非特許文献９】Chun YJ, Kim S, Kim D, Lee SK, Guengerich FP.: A new selective and potent inhibitor of human cytochrome P450 1B1 and its application to antimutagenesis. Cancer Res. 61 8164-70 (2001)
【非特許文献１０】Chaudhary A and Willett K. L.: Inhibition of human cytochrome CYP1 enzymes by flavonoids of St. John's wort. Toxicology, 217, 194-205(2006)
【非特許文献１１】Doostdar H, Burke MD, Mayer RT: Bioflavonoids: selective substrates and inhibitors for cytochrome P450 CYP1A and CYP1B1. Toxicology, 144, 31-38(2000)
【非特許文献１２】Chun YJ, Kim S: Discovery of Cytochrome P450 1B1 Inhibitors as New Promising Anti-Cancer Agents. Medicinal Research Reviews, Vol. 23, No. 6, 657-668(2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、乳がんの発生予防因子の探索を目的とし、正常なホルモン作用及びカテコールエストロゲンの解毒作用を阻害することなく、４位−カテコールエストロゲン生成に関与する代謝酵素（ＣＹＰ１Ｂ１）を特異的に阻害することによって、乳がん発生の重要なリスク因子である４位−カテコールエストロゲンの生成を阻害しうる物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は鋭意検討した結果、特定構造を有するメトキシフラボノイド化合物が、上記課題を解決しうることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（４）に示す４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤及び（５）〜（６）に示すＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤に関する。
（１）下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【００２０】
【化４】
【００２１】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
【００２２】
（２）前記メトキシフラボノイド化合物が、一般式（２）で表されることを特徴とする、（１）記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【００２３】
【化５】
【００２４】
（一般式（２）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。）
【００２５】
（３）前記メトキシフラボノイド化合物が、クリソエリオール、タマリキセチン、及びイソラムネチンからなる群から選択されるものであることを特徴とする、（２）記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
（４）前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、（３）記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
（５）下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【００２６】
【化６】
【００２７】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
（６）前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、（５）記載のＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の一般式（１）で表される特定のメトキシフラボノイド化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害する作用及びそれによって乳がん発生のリスク要因となる４位のカテコールエストロゲンの生成を阻害する作用を有するものであり、以下の作用的特徴を備える。
【００２９】
（１）カテコール構造を有しないフラボノイド化合物であり、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害しＣＯＭＴ及びＣＹＰ１Ａ１の活性を阻害しないため、２位のカテコール体生成及びそれによる細胞内の解毒代謝機構の正常な働きを保つことができ、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えない。
【００３０】
（２）エストロゲンに対するアゴニスト活性は弱く、１μＭ以下の低濃度ではアンタゴニスト活性を有しないので、エストロゲンの正常なホルモン作用を阻害しない。したがって、ホルモン補充療法においてもホルモン投与による効果を犠牲にすることなく該療法の副作用である乳がん、子宮がんの発生を抑制する可能性がある。
【００３１】
（３）それ自身でＣＹＰ１Ｂ１を誘導する作用はほとんどない。
（４）植物成分であるため、安全性に優れている。
よって、安全で且つ極めて優れた乳がん発生予防因子として有用であり、またＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害するので酵素阻害の試薬として利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に、本発明を実施するための最良の形態を説明する。
（１）メトキシフラボノイド化合物
本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤及びＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤は、下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする。
【００３３】
【化７】
【００３４】
上記一般式（１）中、置換基Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。好ましくは、Ｒ1とＲ2の一方は水酸基で他方はメトキシ基である。より好ましくは、Ｒ1がメトキシ基であり、Ｒ2が水酸基である。すなわち、フラボノイド骨格のＢ環の３’位がメトキシ基に置換しているフラボノイド化合物が好ましい。
【００３５】
Ｒ3は水素原子又は水酸基を表し、好ましくは水素原子である。置換基Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。好ましくは、Ｒ4は水酸基であり、ｎは２である。最も好ましくは、Ｒ4は水酸基であってＡ環の５位と７位に置換しているものである。
本発明のメトキシフラボノイド化合物の例を以下に化学式で示す。
【００３６】
【化８】
【００３７】
これらのうち本発明のより好ましいメトキシフラボノイド化合物は、以下の一般式（２）で表されるメトキシフラボノイド化合物である。
【００３８】
【化９】
【００３９】
上記一般式（２）で表されるメトキシフラボノイド化合物の具体例としては、上述した化学式で表される化合物のうち、フラボノイド骨格のＢ環の３’位にメトキシ基が置換しているフラボノイド化合物であるクリソエリオール（Chrysoeriol）とタマリキセチン（Tamarixetin）、及びフラボノイド骨格のＢ環の４’位にメトキシ基が置換しているフラボノイド化合物であるイソラムネチン（Isorhamnetin）とジオスメチン（Diosmetin）が挙げられる。そのうち、より好ましいものはフラボノイド骨格のＢ環の３’位がメトキシ基のクリソエリオールとタマリキセチンであり、特に好ましいものはクリソエリオールである。クリソエリオールは特異的なＣＹＰ１Ｂ１阻害作用及び４位のカテコールエストロゲン生成阻害作用を低濃度で発揮することができ、しかも低濃度（例えば０．１μＭ以下程度）ではＡｈＲに結合せずＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子発現を誘導する可能性が低いことから、本発明のメトキシフラボノイド化合物のなかでも特に好ましい。
【００４０】
（２）ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害作用及び４位のカテコールエストロゲン生成阻害作用
図１に示すように、エストロゲン（17竈-estradiol；Ｅ２）は、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ１Ｂ１により、２位及び４位のカテコール体（２−ＯＨＥ２、４−ＯＨＥ２）へ代謝されるが、正常な乳腺組織内ではこれらのカテコール体はＣＯＭＴの解毒作用によりメトキシ化された後、ＵＧＴｓにより抱合化され組織外へ排出される（図１参照）。
【００４１】
しかしながら、ダイオキシンやＰＡＨｓなどによる暴露によって、ＣＹＰ１Ｂ１の遺伝子発現が亢進されると、４位のカテコールエストロゲンの生成が亢進する。生成した４位のカテコールエストロゲンは、セミキノン体やキノン体（Ｅ２−３，４Ｑ）への酸化反応を介してフリーラジカルを生成し、ＤＮＡを損傷したり、ＤＮＡ付加体を形成したりして、乳がんや子宮がんを誘発すると考えられている。
【００４２】
薬物代謝酵素であるＣＹＰは、脂溶性低分子化合物の酸化反応に関わるヘムタンパク質性モノオキシゲナーゼである。ＣＹＰはＰＡＨｓ、ヘテロサイクリックアミン、芳香族アミン、ニトロ多環芳香族炭化水素等の代謝的活性化を触媒する。ＰＡＨｓそのものは変異原性を示さないが、ＣＹＰ１Ｂ１によって代謝活性化され、生成したエポキシ体がＤＮＡに結合して遺伝子の突然変異を惹起し、発がんを誘発することが知られている。
【００４３】
ＣＹＰ１Ｂ１は、正常組織に比べて腫瘍組織で高発現しており、発がんとの関連が示唆されているが、ＰＡＨｓ等によりＡｈＲを介して誘導が起こる。またＥ２によっても誘導がかかることが報告されており、これもまた発がんを亢進させる結果となる。ヒト乳がん組織や子宮内膜がん組織では正常と比較して４−ＯＨＥ２が多く検出されている。かくしてＰＡＨｓによる化学発がんでも、ホルモン依存性の癌においても、ＣＹＰ１Ｂ１は癌化を促進する方向へ機能している。
【００４４】
本発明者は、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害して乳がん発生予防因子となりうるものを、いくつかのフラボノイド化合物から探索した結果、上記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を見いだしたものである。
【００４５】
本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤は、エストロゲンから４位のカテコール体（４位−カテコールエストロゲン）への変換において鍵となる酵素であるＣＹＰ１Ｂ１の働きを阻害することにより、４位のカテコールエストロゲンの生成を抑制する作用を有する。
【００４６】
また、本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤は、ＣＹＰ１Ｂ１の阻害作用に加えて、次のような作用的特徴を有する。すなわち、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害しＣＯＭＴ及びＣＹＰ１Ａ１の活性を阻害しないため、抗ガン作用を有する２位のカテコール体生成及びそれによる細胞内の解毒代謝機構の正常な働きを保つことができ、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えない。また、肝臓に多く発現するＣＹＰ３Ａ４の活性も阻害しない。
【００４７】
また、１μＭ以下の低濃度ではエストロゲンに対するアンタゴニスト活性を有しないので、エストロゲンの正常なホルモン作用を阻害しない。したがって、ホルモン補充療法においてはホルモン投与による効果を犠牲にすることなく該療法の副作用である乳がん、子宮がんの発生を抑制する可能性がある。また、乳がん発生のリスク要因であるＣＹＰ１Ｂ１を誘導することもない。よって、目的とするＣＹＰ１Ｂ１のみを選択的に阻害して乳がん発生のリスク要因である４位−カテコールエストロゲンの生成を抑制することができ、極めて優れた乳がん発生抑制因子となりうる。
【００４８】
（３）濃度
本発明のメトキシフラボノイド化合物の上述した優れた特異的ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害作用及び４位−カテコールエストロゲン生成阻害作用は、比較的低濃度で顕著に発揮される。顕著な効果を示す濃度の制限は特にないが、好ましい濃度（血中濃度）の目安としては、０．１μＭ以下である。低濃度でＣＹＰ１Ｂ１に対して特異的に阻害作用を示すので、酵素阻害の試薬としても有用である。特にクリソエリオールが効果を発揮する好ましい濃度範囲は０．０１〜０．１μＭである。クリソエリオールは０．1μＭ以下、より好ましくは０．０５μＭ以下の低濃度で優れた特異的ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害作用及び４位−カテコールエストロゲン生成阻害作用を示す。
【００４９】
（４）入手方法
本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤及びＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤の有効成分である上記一般式（１）で表される特定のメトキシフラボノイド化合物は、試薬として市販されているものを用いることができる。また、エゴマ中に多く含まれるルテオリンのメチル化体であるから、エゴマからルテオリンを抽出し、これをメチル化剤を用いてメチル化することによっても入手可能である。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定されるものではない。
【００５１】
＜実施例１＞
エトキシレゾルフィン（ＥＲ）はＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１のＯ−脱アルキル化反応（ＥＲＯＤ）により蛍光物質であるレゾルフィンへと代謝される。この代謝反応を利用してレゾルフィンを励起させてその蛍光強度を測定することによりＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１の酵素活性を測定することができる（ＥＲＯＤアッセイ）。
また、ＣＹＰ３Ａ４は肝臓で最も発現しているＣＹＰであるが、このＣＹＰ３Ａ４の酵素活性は、ルシフェリン−６’−ベンジルエーテル（luciferin 6' benzyl ether）を基質として、生成したluciferinを測定することにより測定することができる。
本実施例では、メトキシフラボノイド化合物としてクリソエリオール、タマリキセチン、及びイソラムネチンを用い、ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１／３Ａ４の各酵素と上述した基質を用いてメトキシフラボノイド化合物の酵素阻害活性を測定した。
【００５２】
１．実験方法
［ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１酵素阻害活性；ＥＲＯＤアッセイ］
（１）試薬調製
（ｉ）１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
ＮａＣｌ［特級／和光純薬工業］；８．０ｇ
ＫＣｌ［特級／和光純薬工業］；０．２ｇ
ＫＨ2ＰＯ4［特級／和光純薬工業］；０．２ｇ
ＮａＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ［特級／和光純薬工業］；２．４８ｇ
上記の試薬を蒸留水に溶解し、最終容量を１Ｌ（リットル）とした。
【００５３】
（ii）酵素調製液（１ウェル（well）あたり）
０．１Ｍリン酸バッファー；５６μｌ
１Ｍ・ＭｇＣｌ2溶液（ｗａｋｏ）（９７．２ｍｇを１００ｍｌの純水に溶解した）；４μｌ
１ＭＧ−６−Ｐ溶液（オリエンタル酵母）（３０．４ｍｇのＧ−６−Ｐを１ｍｌの純水に溶解した）；４μｌ
０．１ＭＮＡＤＰＨ溶液（オリエンタル酵母）（８８．７ｍｇのＮＡＤＰＨを１ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
０，１ＭＮＡＤＨ溶液（オリエンタル酵母）（７０．９ｍｇのＮＡＤＨを１ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
【００５４】
（iii）２．５ｍＭエトキシレゾルフィン溶液（ＳＩＧＭＡ）
１ｇを２．６４ｍｌＤＭＳＯで溶解した。
（iv）１５μＭエトキシレゾルフィン溶液
上記（iii）３０μｌに対してリン酸バッファー４９７０μｌを加えた；４０μｌ
【００５５】
（ｖ）ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１マイクロゾーム溶液（第一化学）
RecombinantＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１supersome
（１４．２５／１２．９μｇ／０．１Ｍリン酸バッファー１ｍｌ）；４０μｌ
（vi）フラボノイド溶液（フナコシ）
ＤＭＳＯに溶解した最終濃度の１００倍の濃さにしたフラボノイド２μｌをリン酸バッファー４０μｌに溶解した；４０μｌ
【００５６】
（２）検量線用レゾルフィン溶液（ＴＣＩ）
レゾルフィンをＤＭＳＯに溶解し、最終濃度０〜０．２μＭの範囲になるようにリン酸バッファーに添加し、レゾルフィン溶液を作成して９６ウェル（穴）プレートを用いて蛍光プレートリーダーで測定した。
【００５７】
（３）酵素活性測定方法（ＥＲＯＤアッセイ）
９６ウェルプレートにフラボノイド溶液を４０μｌ入れ、酵素調製液を８０μｌ加えた。次にマイクロゾーム溶液を４０μｌ加えて５分間３７℃でインキュベートした後、そこに１５μＭエトキシレゾルフィンを加えて５分間インキュベート後、蛍光プレートリーダーで測定をした（励起５３０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）。
【００５８】
なお、本実験では酵素反応の阻害形式を解析するためにラインウィーバー・バークプロット（Lineweaber-Burk plot）をとったが、これに関してはインキュベート時間を３０分間とした。すなわち、上記ＥＲＯＤアッセイにおいて１５μＭエトキシレゾルフィン溶液を加えた後、３０分間インキュベートした。なお、使用したエトキシレゾルフィンの濃度は０、０．１８６、０．３７４、０．７５、１．５、３及び６μＭであった。
【００５９】
［ＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性］
（１）試薬調製（１wellあたり）
（ｉ）４×ＣＹＰ３Ａ４/リン酸バッファー/Substrate Reaction Mixture
Recombinant CYP3A4 supersome；５．８μｌ
１Ｍリン酸バッファー； ２．５μｌ
Substrate Reaction Mixture； ０．５μｌ
純水； ３．７μｌ
Total； １２．５μｌ
【００６０】
（ii）クリソエリオール溶液；１２．５μｌ
（iii）２×ＮＡＤＰＨ
６５ｍＭ ＮＡＤＰＨ； １ μｌ
１ｍＭ Ｇ−６−Ｐ； １．６５μｌ
１ｍＭ ＭｇＣｌ2； １．６５μｌ
１Ｍリン酸バッファー； １０ μｌ
純水； １０．７ μｌ
Total； ２５ μｌ
【００６１】
（iv）ＬＤＲ溶液
Luciferin Detection Reagent＋P450-Glo Buffer；５０μｌ
【００６２】
（２）ＣＹＰ３Ａ４の酵素測定法
（ｉ）と（ii）を１２．５μｌずつルミノスキャン用ホワイト９６wellプレートに入れて１０分３７℃でインキュベートした。その後、(iii)の溶液を２５μｌ添加後、３０分３７℃でインキュベートした。反応後（iv）の溶液を添加した後、ルミノスキャンで検出した。
【００６３】
２．実験結果
（１）ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１酵素阻害活性の測定結果
ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１（１４．２５／１２．９μｇ）に対してメトキシフラボノイド化合物を０〜０．１μＭ作用させ、ＥＲＯＤアッセイによる阻害活性を測定した結果を図２に示した。図２よりクリソエリオール、タマリキセチン及びイソラムネチンにＣＹＰ１Ｂ１に対する特異的な酵素阻害作用が見られ、ＩＣ５０（酵素活性を５０％阻害する濃度）は、それぞれ０．０２８μＭ、０．０４５μＭ及び０．０４８μＭであった。一方、メチル化されていないケルセチン（quercetin）とルテオリン（luteolin）には、ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１いずれに対しても阻害効果は見られなかった。
【００６４】
クリソエリオールの阻害様式を確認するためにラインウィーバー・バークプロットをとったところ、図３に示したようにクリソエリオールのＣＹＰ１Ｂ１に対する阻害様式は非競合阻害だと考えられる。
【００６５】
図２からフラボノイド骨格のＢ環の３’位がメトキシ基に置換しているクリソエリオールとタマリキセチンに、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に低濃度で阻害する作用が顕著に見られた。フラボノイド骨格のＢ環がメトキシ基に置換していること、特にＢ環の３’位がメトキシ基に置換していることがＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害するのに重要であると考えられる。
【００６６】
（２）ＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性の測定結果
図４にＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性の測定結果を示した。それによれば、クリソエリオールによるＣＹＰ３Ａ４酵素阻害作用は見られなかった。タマリキセチンによる阻害作用もわずかであった。ＣＹＰ３Ａ４は肝臓でよく発現しており、本発明のメトキシフラボノイド化合物がＣＹＰ３Ａ４酵素阻害作用を示さないことから、肝臓における副作用は少ない可能性が示された。
【００６７】
＜実施例２＞
本実施例では、本発明のメトキシフラボノイド化合物のうち、特に実施例１でＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害したクリソエリオールを用いて、Ｅ２から２−ＯＨＥ２及び４−ＯＨＥ２への代謝に対し阻害が起こるかどうかをＧＣ／ＭＳ分析により検討した。
【００６８】
１．実験方法
（１）試薬調製
（ｉ）１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．４）
実施例１の（１）試薬調製（ｉ）に準じて調製した。
【００６９】
（ii）酵素調製液（１チューブ（tube）あたり）
０．１Ｍリン酸バッファー；１１２μｌ
１Ｍ・ＭｇＣｌ2溶液（ｗａｋｏ）（９７．２ｍｇを１００ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
１ＭＧ−６−Ｐ溶液（オリエンタル酵母）（３０．４ｍｇのＧ−６−Ｐを１ｍｌの純水に溶解した）；８μｌ
０．１ＭＮＡＤＰＨ溶液（オリエンタル酵母）（８８．７ｍｇのＮＡＤＰＨを１ｍｌの純水に溶解した）；１６μｌ
０，１ＭＮＡＤＨ溶液（オリエンタル酵母）（７０．９ｍｇのＮＡＤＨを１ｍｌの純水に溶解した）；１６μｌ
【００７０】
（iii）クリソエリオール溶液（フナコシ）
メタノールで調製したクリソエリオールをリン酸バッファーに溶解した；８０μｌ
（iv）Ｅ２溶液
Ｅ２をメタノールで調整し最終濃度２０μＭになるようにリン酸バッファーに添加した；８０μｌ
（ｖ）ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１マイクロゾーム溶液（第一化学）
ＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１（１８．４／３８．４μｇ／８００μｌリン酸バッファー）；８０μｌ
【００７１】
（２）酵素反応・２−ＯＨＥ２及び４−ＯＨＥ２の抽出
１５ｍｌチューブにクリソエリオール、酵素調製液、マイクロゾーム溶液を混合し、５分３７℃でプレインキュベートした。５分後、混合液の中にＥ２溶液を入れ４０分インキュベートした。４０分後反応を止めるためにジクロロメタン５ｍｌ添加した。よく振った後、上層をとり、下層のジクロロメタン層に硫酸ナトリウムを添加し、脱水した。ジクロロメタン層の水分が硫酸ナトリウムにより除去され、さらに添加した硫酸ナトリウムがさらさらになったところで溶液をフィルターに通して内部標準物質であるequiline（１μＭ）を５０μｌ加えた。
【００７２】
（３）ＧＣ／ＭＳ分析
脱水したジクロロメタン抽出液を窒素で濃縮し、それにＴＭＳを５０μｌずつ添加後、１時間室温で放置し、ＧＣ／ＭＳで測定した（ＴＭＳ化後は、１日間−１０℃冷凍保存可能）。
【００７３】
（４）ＧＣ／ＭＳ条件
ＧＣ／ＭＳ Agilent.6890
注入口：３００℃
オーブン：１００℃で５分加熱後、１５℃／分で３００℃まで昇温し、３００℃で２０分保持した。
ＳＩＭ：
内部標準−ＴＭＳ：３４０（ｍ／Ｚ）；２２．４２ｍｉｎ
２ＯＨＥ２−ＴＭＳ：５０４（ｍ／Ｚ）；２３．９５ｍｉｎ
４ＯＨＥ２−ＴＭＳ：５０４（ｍ／Ｚ）；２４．５９ｍｉｎ
検出器：３００℃
キャリアー：Ｈｅ，１ｍｌ／ｍｉｎ
カラム：ＤＢ−５（Agilent）
６０×０．３２ｍｍ×０．２５ｍｍ
【００７４】
（５）統計処理
分散分析を行った後、対照群として指定した1群と多群を比較したDunnett法を用いて検定を行った。
【００７５】
２．実験結果
ＧＣ／ＭＳ分析の結果を図５に示す。クリソエリオールは、ＣＹＰ１Ｂ１による４−ＯＨＥ２の生成を０．０５μＭで６９％抑制したが、ＣＹＰ１Ａ１による２−ＯＨＥ２の生成に対しては抑制作用を示さなかった。この結果は実施例１の結果と同様に、クリソエリオールがＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害することを示している。
【００７６】
＜実施例３＞
エストロゲンのカテコール体である４−ＯＨＥ２および２−ＯＨＥ２は、ＣＯＭＴによりメチル化され無毒化する。肝サイトゾール中にはＣＯＭＴが存在する。本実験では、肝サイトゾール及びドナー基質としてトリチウムラベルしたS-adenosyl-L-methionine（ＳＡＭ）を用いて、４−ＯＨＥ２からメチル化された４−ＭｅＯＥ２を検出するメチレーションアッセイを行い、クリソエリオールがＣＯＭＴの阻害をしないかどうかを確認した。
【００７７】
１．実験方法
（１）試料調製
（ｉ）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
ＴＲＩＺＭＡ・ＢＡＳＥ（Ｓｉｇｍａ）６０．５５ｇを４００ｍｌの純水に溶解し、塩酸でｐＨを７．４に調節して５００ｍｌまでメスアップした。
（ii）２４ｍＭ・ＭｇＣｌ2
ＭｇＣｌ2（Ｗａｋｏ）２２８．５ｍｇを１００ｍｌの純水に溶解した。
（iii）２０ｍＭ・ＤＴＴ
ＤＴＴ（DL-dithiothreitol）６０ｍｇを１０ｍｌの純水に溶解した。
（iv）１ｍＭ ｃｏｌｄ・ＳＡＭ（[methyl]-S-adenosyl-L-methionine）
３２ｍＭのＳＡＭ溶液を１ｍＭになるようにエタノールで希釈して、−２０℃で保存した。
【００７８】
（２）メチレーションアッセイ
（ｉ）反応液の組成
下記表１に示す組成で反応液を調製した。
【００７９】
【表１】
【００８０】
（ii）反応方法
ＭｇＣｌ2、ＤＴＴ、ｃｏｌｄ・ＳＡＭを混合したものにＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）と基質（４−ＯＨＥ２）を添加してＨｏｔ・ＳＡＭを入れた（ネガコンはここまで）。次に、試料を添加したものとしないものに肝サイトゾールを加え３７℃で２０分反応を行った。反応後、ＤＤＷ５００μｌと反応を止めるためのｎ−ヘプタン３ｍｌを加え、ｖｏｒｔｅｘをかけてから遠心を２０００ｒｐｍで１０分行った。その後、上澄を１ｍｌ分注し、シンチバースを４ｍｌ加え、ｖｏｒｔｅｘをかけた後に液体シンチレーションカウンターで測定した。
【００８１】
２．実験結果
メチレーションアッセイを行った結果、図６に示すようにクリソエリオールにＣＯＭＴ阻害効果は見られなかった。また４−ＯＨＥ２を入れずに反応を行ったところ、クリソエリオール自身がＣＯＭＴによりメトキシ化されることはなかった。
【００８２】
＜実施例４＞
ＭＣＦ７細胞においては、ＣＹＰ１Ａ１よりもＣＹＰ１Ｂ１が発現しており、細胞内でＥ２は代謝され、最終的に２−ＭｅＯＥ２及び４−ＭｅＯＥ２の抱合体となって細胞外へ排泄される。そこで、クリソエリオールの存在下、非存在下で細胞を培養し、ＣＹＰ１Ｂ１が細胞内でも阻害されるかどうか、培地中に排泄された２−ＭｅＯＥ２及び４−ＭｅＯＥ２抱合体量を、竈-glucuronidase/sulfataseによる加水分解後、クーロアレイＨＰＬＣ法により測定した。
【００８３】
１．実験方法
（１）使用した細胞
ＭＣＦ−７：乳癌細胞［乳腺上皮：転移性腫瘍：胸水・腺癌］（69 years）
静岡県立大学大学院生活健康科学研究科生体防御研究室、久留戸涼子先生(Dr. Hanspaul Hagenmaier, Institute of Organic Chemistry, University of Tuebingen, Germany)から分与頂いたものを使用。
【００８４】
（２）使用した培地（培地１Lあたり）
（ｉ）粉末培地（phenol red）
ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）［日水製薬］；９．５ｇ
炭酸水素ナトリウム［特級／和光純薬］；１．５ｇ
L-glutamine［ＳＩＧＭＡ］；０．５８ｇ
カナマイシン［ＩＣＮ］；０．１ｇ
アンピシリン［ＩＣＮ］；０．１ｇ
非働化牛胎児血清（ＦＢＳ）［ＩＣＮ］；１１０ｍｌ
【００８５】
（ii）液体培地（phenol red free medium）
以下に示す組成の培地を調製後、ｐＨ７．６に合わせたのち、組織培養フィルター［半径７５ｍｍ／ポアサイズ０．２μｍ／NALGENE］で滅菌後使用した。
ＤＭＥＭ（phenol red free）［Gibco］；５００ｍｌ
L-glutamine［ＳＩＧＭＡ］；０．２９ｇ
カナマイシン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
アンピシリン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
Charcoal/Dextran treated FBS［Hyclone］；５５ｍｌ
【００８６】
（ii）１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．４）溶液
酢酸アンモニウム（Ｗａｋｏ）５３．９６ｇを７００ｍｌの純水に溶解させた。
（iii）Ａ液
アセトニトリル（関東化学ＨＰＬＣ用）；４５０ｍｌ
メタノール（関東化学ＨＰＬＣ用）；１５０ｍｌ
純水；２１００ｍｌ
１Ｍ酢酸アンモニウム；３００ｍｌ
（iv）Ｂ液
アセトニトリル（関東化学ＨＰＬＣ用）；１５００ｍｌ
メタノール（関東化学ＨＰＬＣ用）；６００ｍｌ
純水；６００ｍｌ
１Ｍ酢酸アンモニウム；３００ｍｌ
【００８７】
（ｖ）スタンダード原液
２０ｍＭ Ｅ２；５．４４ｍｇ
２０ｍＭ ４ＯＨＥ２；５．７６ｍｇ
２０ｍＭ ２ＭｅＯＥ２；６．０４ｍｇ
２０ｍＭ ４ＭｅＯＥ２；６．０４ｍｇ
それぞれをＤＭＳＯ１ｍｌに溶解した。
（vi）スタンダード溶液
上記（ｖ）で調製したスタンダード原液をＢ液で２０倍希釈→１００倍希釈→１００倍希釈の順で最終濃度を１００ｎＭに調製した。
【００８８】
（３）細胞培養
ＭＣＦ７を１×１０4cell／ｃｍ2になるようにＬＰディッシュに播き、５日間培養した。５日後、培地をＤＭＥＭ培地からＥ２フリーのＤＭＥＭ培地に変え、０．０５及び０．１μＭのクリソエリオールを添加し、その１５分後に１μＭのＥ２を添加して２４時間培養した。培地を採取し、遠心を行った後、上清を液体窒素で凍結し、−２０℃で保存した。
【００８９】
（４）抽出
培地２ｍｌに対して２Ｎ酢酸アンモニウムを０．５ｍｌ加えて酸性とし、竈-glucuronidase/sulfatase（ＳＩＧＭＡ）を１０μｌ加えて遮光して３７℃で１７時間酵素処理を行った。その後、ジクロロメタンを２．５ｍｌ加えてボルテックスを３０秒かけ抽出し、３０００ｒｐｍで遠心を３層になるまで行った。上層を別の試験管に移し、下層（ジクロロメタン層）をパスツールで取って目盛付試験管に移し、濃縮遠心エバポレーターにより濃縮した。上層を同様に再抽出し、ジクロロメタン層を最初のジクロロメタン層に加え、完全に乾固した。ＨＰＬＣ移動層Ｂ液を１００μｌ加えボルテックスをかけて溶解した後、３０００ｒｐｍで１５分遠心し、上清をクーロアレイ用バイアルに入れてクーロアレイＨＰＬＣ分析を行った。
【００９０】
（５）定量分析
定量分析は（６）に示すＨＰＬＣ−ＥＣＤ条件下で、ピーク面積を測定することにより行った。
【００９１】
（６）ＨＰＬＣ−ＥＣＤ条件
Column: ESA ODS（4.6×250mm）
Injection Volume:50・ｌ
Temperature:25℃
Detector Potentials：-10,80,170,260,350,440,530,
Gradient solvent: A; acetnitrile, methanol, water, ammonium acetate/ B; acetnitrile, methanol, water, ammonium acetate
Flow rate:1.0ml/min
【００９２】
（７）統計処理
分散分析を行った後、対照群として指定した1群と多群を比較したDunnett法を用いて検定を行った。
【００９３】
２．実験結果
クリソエリオールがＣＹＰ１Ｂ１を細胞内でも選択的に阻害するかどうかについて、培地中に排泄された２−ＭｅＯＥ２及び４−ＭｅＯＥ２抱合体量を、竈-glucuronidase/sulfataseで加水分解後、クーロアレイＨＰＬＣ法により測定して確認した。結果を図７に示した。クリソエリオールは、４−ＭｅＯＥ２の生成を０．０５μＭ、０．１μＭで有意に抑制したが、２−ＭｅＯＥ２の生成に対しては抑制作用を示さなかった。実施例３によりクリソエリオールがＥ２の各カテコール体のメチル化を阻害しなかったので、この結果は実施例１〜２の結果と同じであり、本結果はクリソエリオールが細胞内においてもＣＹＰ１Ｂ１を低濃度で特異的に阻害したことを示している。
【００９４】
＜実施例５＞
本実施例では、本発明のメトキシフラボノイド化合物がそれ自身でエストロゲン作用やＣＹＰ１Ｂ１を誘導する作用がないかどうかを確認した。すなわち、本発明のメトキシフラボノイド化合物のエストロゲンレセプター結合性を検討し、エストロゲンレセプターへのアンタゴニスト又はアゴニスト活性の有無を検討した。
【００９５】
１．実験方法
（１）使用した細胞
ＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ−７；静岡県立大学大学院生活健康科学研究科生体防御研究室、久留戸涼子先生の開発によるものを用いた。ＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ７細胞はＭＣＦ７細胞にgreen-fluorescent-protein reportor vectorが組み込まれており、ＥＲＥにＥ２又はＥ２様物質が結合すると蛍光を発する。
【００９６】
（２）試薬調製
（ｉ）液体培地（phenol red free medium）
ＤＭＥＭ（phenol red free）［Gibco］；５００ｍｌ
L-glutamine［ＳＩＧＭＡ］；０．２９ｇ
カナマイシン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
アンピシリン［ＩＣＮ］；０．０５ｇ
Charcoal/Dextran treated FBS [Hyclone]；５５ｍｌ
（ii）テストサンプル
クリソエリオールをＤＭＳＯに溶解した。
【００９７】
（３）培養・測定方法
ＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ−７細胞を９６ウェル（well）プレートに１×１０4／well播き、細胞が接着するまで４時間インキュベートした。４時間後、１０-8Ｍエストロゲンと種々の濃度のクリソエリオール又はクリソエリオールのみを細胞に添加した。添加してから３日目に細胞にCell counting kitを１０μｌずつ添加し、２時間後に細胞数を測定した（450nm, Reference 630nm）。細胞数を測定後、wellの溶液を取り除き、蛍光をFluorImager SIで測定をした。
【００９８】
２．実験結果
蛍光測定結果を図８に示す。クリソエリオールは、１０-8〜１０-5の濃度でエストロゲンレセプターへの結合活性が上昇していたが、アンタゴニスト作用は見られなかった。
【００９９】
＜実施例６＞
本実施例では、ｌacZ reporter plasmidならびにヒトＡｈＲとＡｈＲ核内輸送酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子組み換え酵母Saccharomyces cerevisiae YCM3を用いたレポータージーンアッセイを行った。ＢａＰなどのリガンドがＡｈＲに結合するとβ−ガラクトシダーゼ（竈-galactosidase）が誘導され、本酵素の活性を測定することによりＡｈＲへの結合性が評価できる。本実験では本発明のメトキシフラボノイド化合物のＡｈＲへの結合性を検討し、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用がないかを確認した。
【０１００】
１．実験方法
（１）使用した酵母
LacZ reporter plasmidならびにヒトＡｈＲとＡｈＲ核内輸送酵素をコードする遺伝子を含む遺伝子組み換え酵母Saccharomyces cerevisiae YCM３株
【０１０１】
（２）試薬等の調製方法
（ｉ）酵母前培養培地
Ｄ（＋）グルコース；２ｇ
Yeast Nitrogen Base ｗ/0 Amino Acid(BD)；０．６７ｇ
アデニン塩酸塩（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−水和物（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ロイシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ（＋）−リシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
これらを１００ｍｌの純水に溶解した。
【０１０２】
（ii）酵母本培養培地
ガラクトース；２ｇ
Yeast Nitrogen Base ｗ/0 Amino Acid(BD)；０．６７ｇ
アデニン塩酸塩（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ヒスチジン塩酸塩−水和物（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ−ロイシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
Ｌ（＋）−リシン（Ｗａｋｏ）；０．０１ｇ
これらを１００ｍｌの純水に溶解した。
【０１０３】
（iii）Ｚ−Ｂｕｆｆｅｒ
ＮａＨ2ＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ［特級／和光純薬工業］；４．３００２ｇ
ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ；１．２４３８ｇ
ＫＣｌ；０．１５１９ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．０４９２ｇ
これらを２００ｍｌの蒸留水に溶解した。
【０１０４】
（iv）溶菌剤
N-Laurosyl cosine solution(SIGMA)；３０ｍｇ
メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）；８１μｌ
Ｚ−Ｂｕｆｆｅｒ；３０ｍｌ
【０１０５】
（ｖ）反応液
Ｚ−ｂｕｆｆｅｒ；１５ｍｌ
メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）；４５μｌ
２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｗａｋｏ）；６０ｍｇ
（vi）クリソエリオール１０〜０．００１μＭ（フナコシ）
各種フラボノイドを１０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解し、−２０℃保存した。それを１０〜０．００１μＭ濃度に調製した。
【０１０６】
（３）測定方法
９６ウェル（Well）プレートにＢａＰとメトキシフラボノイド０．００１〜１０μＭの範囲で添加した。次にガラクトースＳｃに培地を変えた酵母を２００μｌずつ加えて１晩置いた。翌日、培養した酵母の濁度を６３０ｎｍで測定した。そこから３０μｌ取り、別のプレートに溶液を移し、そこに溶菌剤を１２０μｌ添加して１３分インキュベートした。その後、反応液を５０μｌずつ添加し、数分置いた後（色が出てきたら）４５０ｎｍで測定した。
【０１０７】
２．実験結果
図９に示すように、クリソエリオールのＡｈＲ結合活性は非常に弱く、０．１μＭ以下ではアゴニスト作用は全く見られず、１μＭでアンタゴニスト作用も見られなかった。
【０１０８】
上記実施例１〜５の結果から以下のことが明らかとなった。
（１）実施例１で示されたように、本発明のメトキシフラボノイド化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を低濃度で特異的に阻害し、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を阻害しない。
【０１０９】
（２）実施例２において、本発明のメトキシフラボノイド化合物がＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１によるＥ２から２−ＯＨＥ２及び４−ＯＨＥ２への代謝に対し阻害作用を示すかどうかをＧＣ／ＭＳ分析により検討した結果、ＣＹＰ１Ｂ１についてはエトキシレゾルフィンを用いた実施例１の結果と同様の阻害作用が見られ、０．０５μＭで有意に４−ＯＨＥ２の生成を６９％抑制した。ＣＹＰ１Ａ１については、ほとんど影響が見られなかった。なお、ＣＹＰ１Ｂ１を特異的に阻害する化合物として２，３，４，５−テトラメチルスチルベン（ＴＭＳ）が報告されているが、ＴＭＳのＣＹＰ１Ｂ１による４‐ＯＨＥ２生成阻害活性は、ＩＣ５０が０．２５μＭであり、本発明のカテコールエストロゲン生成阻害剤のほうが低濃度で阻害活性を示しており、有効であると考えられる。
【０１１０】
（３）カテコールエストロゲンの重要な解毒酵素であるＣＯＭＴは、カテコールエストロゲンをメチル化するが、クリソエリオールのＣＯＭＴへの影響について、肝サイトゾールを用いたメチレーションアッセイを行った実施例３の結果から、クリソエリオールはＣＯＭＴを阻害せず、同時にクリソエリオール自身がメチル化されることもなかった。カテキン、エピカテキン、ＥＧＣＧ、ケルセチン、フィセチン（fisetin）のようなカテコール構造を有するフラボノイドは、ＣＯＭＴによるカテコールエストロゲンのメチル化を阻害するが、クリソエリオールをはじめとする本発明のメトキシフラボノイド化合物はカテコール構造を持っておらずＣＯＭＴを阻害しないことから、カテコールエストロゲンのメチル化には影響がなくＣＹＰ１Ａ１により生成する２−ＯＨＥ２の代謝を阻害しないため、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えないと思われる。
【０１１１】
（４）実施例４において、ＭＣＦ−７細胞を用いて培地中のカテコールエストロゲン代謝物の解析を行い、クリソエリオールがＣＹＰ１Ｂ１に対して細胞内においても特異的に阻害するかどうかを検討した。その結果、クリソエリオール０．０５μＭ及び０．１μＭをそれぞれ作用させた場合、培地中に排泄された４−ＭｅＯＥ２量が低下したが、２−ＭｅＯＥ２量の低下は見られなかった。このことからクリソエリオールは細胞内においてもＣＹＰ１Ｂ１の酵素に対して特異的に阻害し、細胞内で４−ＯＨＥ２の生成のみを抑制しうると思われる。従って、クリソエリオールをはじめとする本発明のメトキシフラボノイド化合物はＥ２が４位の水酸基の酸化、キノン体の生成を経てＤＮＡ付加体の形成を促進するのを抑制すると思われる。
【０１１２】
（５）実施例５に示すように、クリソエリオールは１μＭ以下ではエストロゲンレセプターに対してアンタゴニスト作用を示さない。高濃度になるにつれてＥ２へのアゴニスト作用をわずかではあるが示した、すなわちわずかにエストロゲン活性が見られた。しかし、Ｅ２に対するアンタゴニスト作用、すなわちエストロゲン活性抑制作用は見られなかった。一方、タマリキセチンにはエストロゲンレセプターへの結合性もＥ２に対するアンタゴニスト作用も見られなかった。従って、本発明のメトキシフラボノイド化合物は弱いエストロゲン様を示すが、エストロゲンレセプターへのＥ２の結合作用に対して低濃度ではアンタゴニスト的に働く可能性は低いと考えられる。
【０１１３】
（６）実施例６に示すように、クリソエリオールはＡｈＲにも低濃度では結合しないことから、クリソエリオール自身はＣＹＰを誘導しないことが示唆された。従ってクリソエリオールはＣＹＰ１Ｂ１によるＥ２から４−ＯＨＥ２の生成を特異的に阻害する因子として有用であると思われる。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明のメトキシフラボノイド化合物は、低濃度でＣＹＰ１Ｂ１の酵素活性を特異的に阻害し、乳がんの原因とされる４−ＯＨＥ２の生成を抑制する作用を有する。しかも、ＣＹＰ１Ａ１及びＣＯＭＴを阻害しないため細胞内の解毒作用が正常に働き、エストロゲンの細胞内でのホメオスタシスに影響を与えない。また、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性を阻害しないため、肝臓における副作用が少ない可能性がある。また、エストロゲンに対するアンタゴニスト活性を有しないので、エストロゲンの正常なホルモン作用を阻害しない。
【０１１５】
したがって、ホルモン補充療法においてもホルモン投与による効果を犠牲にすることなく該療法の副作用である乳がん、子宮がんの発生を抑制することができる。よって、安全で且つ極めて優れた乳がん発生予防因子として有用であり、がん予防・治療の分野への貢献が期待される。また、ＣＹＰ１Ｂ１の酵素阻害試薬として利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】エストロゲン代謝のメカニズムを表す概略図である。
【図２】実施例１のＣＹＰ１Ａ１／１Ｂ１酵素阻害活性（ＥＲＯＤアッセイ）の結果を示すグラフである。
【図３】実施例１のラインウィーバー・バークプロットをとった結果を示すグラフである。
【図４】実施例１のＣＹＰ３Ａ４酵素阻害活性の測定結果を示すグラフである。
【図５】実施例２のＧＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図６】実施例３のメチレーションアッセイの結果を示すグラフである。
【図７】実施例４のクーロアレイＨＰＬＣ法による測定結果を示すグラフである。
【図８】実施例５のＥＲＥ−ＧＦＰ−ＭＣＦ−７細胞の蛍光測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例６のレポータージーンアッセイの結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１１７】
１ エトキシレゾルフィン
２ エトキシレゾルフィン＋クリソエリオール０．０５μＭ
３ エトキシレゾルフィン＋クリソエリオール０．１μＭ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【化１】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
【請求項２】
前記メトキシフラボノイド化合物が、一般式（２）で表されることを特徴とする、請求項１記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【化２】
（一般式（２）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。）
【請求項３】
前記メトキシフラボノイド化合物が、クリソエリオール、タマリキセチン、及びイソラムネチンからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項２記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【請求項４】
前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、請求項３記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【請求項５】
下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【化３】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
【請求項６】
前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、請求項５記載のＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【化１】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
【請求項２】
前記メトキシフラボノイド化合物が、一般式（２）で表されることを特徴とする、請求項１記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【化２】
（一般式（２）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。）
【請求項３】
前記メトキシフラボノイド化合物が、クリソエリオール、タマリキセチン、及びイソラムネチンからなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項２記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【請求項４】
前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、請求項３記載の４位−カテコールエストロゲン生成阻害剤。
【請求項５】
下記一般式（１）で表されるメトキシフラボノイド化合物を有効成分とする、ＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【化３】
（一般式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立して水酸基又はメトキシ基を表し、Ｒ1とＲ2の少なくとも一方はメトキシ基である。Ｒ3は水素原子又は水酸基を表す。Ｒ4は水酸基又はメトキシ基を表し、ｎは０〜４である。）
【請求項６】
前記メトキシフラボノイド化合物がクリソエリオールであることを特徴とする、請求項５記載のＣＹＰ１Ｂ１活性阻害剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−２９１０４０（Ｐ２００７−２９１０４０Ａ）
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２２９９８（Ｐ２００６−１２２９９８）
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２７日（２００６．４．２７）
【出願人】（８０２００００２０）財団法人浜松科学技術研究振興会 (63)
【Ｆターム（参考）】
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