本発明の開示は、植物中の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子をターゲッティングする改変ジンクフィンガータンパク質に、ならびに遺伝子発現、遺伝子不活性化および標的化遺伝子修飾を変調するに際してのこのようなジンクフィンガータンパク質の使用方法に関する。特に本開示は、ＥＰＳＰＳ遺伝子の標的化切断および変更のためのジンクフィンガーヌクレアーゼに関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
当該ＥＰＳＰＳ標的ゲノム領域と結合する非天然ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、1つまたは複数の改変ジンクフィンガー結合ドメインを含むＺＦＰ。
【請求項２】
1つまたは複数の機能的ドメインを含む融合タンパク質である請求項１記載のＺＦＰ。
【請求項３】
転写抑制因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、転写活性因子およびヒストンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される1つまたは複数の機能的ドメインを含む請求項２記載のＺＦＰ。
【請求項４】
当該ＥＰＳＰＳ標的ゲノム領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である請求項３記載のＺＦＰであって、前記ＺＦＮが1つまたは複数の改変ジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインを含むＺＦＰ。
【請求項５】
1つまたは複数のＥＰＳＰＳパラロガスまたはオルソロガス遺伝子配列を切断する請求項４記載のＺＦＮ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の1つまたは複数のジンクフィンガータンパク質（ＺＥＰ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む植物宿主細胞。
【請求項８】
1つまたは複数のポリヌクレオチドで安定的にトランスフェクトされる請求項７記載の植物宿主細胞。
【請求項９】
1つまたは複数のポリヌクレオチドで一時的にトランスフェクトされる請求項７記載の植物宿主細胞。
【請求項１０】
植物細胞中の1つまたは複数のＥＰＳＰＳ遺伝子の切断方法であって、以下の：
植物細胞中に請求項６記載の1つまたは複数のポリヌクレオチドを導入すること；そして
細胞中で1つまたは複数のＺＦＮを発現すること（この場合、ＺＦＮは1つまたは複数のＥＰＳＰＳ遺伝子を切断する）
を包含する方法。
【請求項１１】
少なくとも１つのポリヌクレオチドが植物細胞中に安定的にトランスフェクトされる請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのポリヌクレオチドが一時的に植物細胞中にトランスフェクトされる請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
植物細胞中のすべてのＥＰＳＰＳパラロガス遺伝子が切断される請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
植物細胞中の1つまたは複数のＥＰＳＰＳパラロガス遺伝子が切断される請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
第一および第二ＤＮＡ配列を含むドナーベクターであって、
前記第一配列が第三配列と相同であり、前記第二配列が第四配列と相同であり；そして
前記第三および第四配列が染色体ＥＰＳＰＳ ＤＮＡ配列である
ドナーベクター。
【請求項１６】
第三および第四配列の近接縁が連続している請求項１５記載のドナーベクター。
【請求項１７】
第三および第四配列の近接縁が少なくとも１つのヌクレオチド対により分離される請求項１５記載のドナーベクター。
【請求項１８】
第三および第四配列が外因性配列である請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクター。
【請求項１９】
第三および第四配列が内因性配列である請求項１５〜１７のいずれかに記載のベクター。
【請求項２０】
第五配列をさらに含む請求項１５〜１９のいずれかに記載のベクターであって、前記第五配列が、以下の：
（ａ）第一および第二配列間に差し挟まれ；そして
（ｂ）外因性核酸配列である
ベクター。
【請求項２１】
第五配列が選択可能マーカーをコードする配列を含む請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
選択可能マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、イクオリン、ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニレートシンターゼからなる群から選択される請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
第五配列が、選択可能マーカー以外のタンパク質をコードする配列；1つまたは複数の転写調節配列；タンパク質ターゲッティングを増強するかまたは低減する1つまたは複数の配列；タンパク質の一部をコードする1つまたは複数の配列；低分子干渉ＲＮＡ；およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される配列を含む請求項２０記載のベクター。
【請求項２４】
第五配列が、除草剤グリホサートに対する植物の耐性を増大する突然変異体ＥＰＳＰＳ染色体配列をコードする配列を含む請求項２３記載のベクター。
【請求項２５】
植物細胞のゲノム中への外因性核酸配列の導入方法であって、以下の：
請求項１５〜２４のいずれかに記載のドナーベクターの存在下で、細胞中で1つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を発現するステップ；
を包含し；
この場合、ＺＦＮが第三または第四配列のいずれかの３キロ塩基対内の染色体ＤＮＡ中のＥＰＳＰＳ遺伝子を切断し；
したがって、ステップ（ｂ）における染色体ＤＮＡの切断が相同組換えによるゲノム中へのドナーベクターの組入れを刺激する
こと包含する方法。
【請求項２６】
植物細胞中の外因性核酸配列の生成物の発現方法であって、以下の：
外因性配列の生成物が植物細胞中で発現されるよう、請求項２５記載の方法に従って外因性配列を導入するステップ
を包含する方法。
【請求項２７】
請求項２５または２６記載の方法に従って得られるトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項２８】
植物細胞のゲノムにおける分子内相同組換えの刺激方法であって、以下の：
ＺＦＮがＤＮＡセグメントを切断し、分子内相同組換えを刺激するよう、植物細胞においてＥＰＳＰＳ遺伝子および第二配列と相同である第一配列を含むＤＮＡセグメントの存在下で植物細胞中に請求項４〜６のいずれかに記載のＺＦＮを導入するステップ
を包含する方法。
【請求項２９】
相同組換えが内因性ＤＮＡセグメント内の欠失を生じる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
欠失配列が、ＥＰＳＰＳ遺伝子の全部または一部をコードする配列および選択可能マーカーの全部または一部をコードする配列からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
欠失ＤＮＡが外因性配列に取って代わられる請求項２９記載の方法であって、以下の：
細胞中にポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、以下の：
（ａ）第四および第五配列（ここで、前記第四配列は第一配列に近接した非欠失配列と相同であり、前記第五配列は第二配列に近接した非欠失配列と相同である）；ならびに
（ｂ）外因性配列
を含むステップ
をさらに包含する方法。
【請求項３２】
外因性配列が選択可能マーカーである請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
選択可能マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、イクオリン、ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニレートシンターゼからなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
外因性配列がＥＰＳＰＳ遺伝子配列である請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
ＥＰＳＰＳ遺伝子配列が突然変異を含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
突然変異が除草剤グリコサートに対する植物の耐性を増大する請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
植物細胞のゲノムからのＥＰＳＰＳ遺伝子配列の欠失方法であって、以下の：
細胞中で請求項４記載の第一および第二ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を発現するステップであって、前記第一ＺＦＮがＥＳＰＳ遺伝子中の第一切断部位で切断し、前記第二ＺＦＮがＥＳＰＳ遺伝子中の第二切断部位で切断し、前記ＥＰＳＰＳ遺伝子配列が前記第一切断部位および前記第二切断部位間に位置し、前記第一および第二切断部位の切断が前記ＥＰＳＰＳ遺伝子配列の欠失を生じるステップ
を包含する方法。
【請求項３８】
ＥＰＳＰＳ遺伝子配列が第一および第二切断部位の非相同末端結合により欠失される請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
第一および第二切断部位が少なくとも１００ヌクレオチドにより分離される請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
植物細胞が外因性ＥＳＰＳ配列を含むトランスジェニック植物細胞である請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
ＥＰＳＰＳ遺伝子の発現の変調方法であって、以下の：
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞中のＺＦＰを発現するステップであって、前記ＺＦＰがＥＰＳＰＳ遺伝子中の標的部位と結合し、それによりＥＰＳＰＳ遺伝子の発現を変調するステップ
を包含する方法。
【請求項４２】
ＺＦＰがＥＰＳＰＳ遺伝子の転写を増大する請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
ＺＦＰが除草剤グリホサートに対する植物の耐性を増大する請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
ＺＦＰがＥＰＳＰＳ遺伝子の転写を低減する請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
ＺＦＰが除草剤グリホサートに対する植物の耐性を低減する請求項４４記載の方法。

【図１】

【図２−１】

【図２−２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図３Ｄ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９】

【図１０】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１４Ｄ】

【図１４Ｅ】

【公表番号】特表２０１０−５３９９３０（Ｐ２０１０−５３９９３０Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２６９３９（Ｐ２０１０−５２６９３９）
【出願日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１０８９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０４２１６４
【国際公開日】平成２１年４月２日（２００９．４．２）
【出願人】（３９００３９１９２）ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Ｄｏｗ　ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ　ＬＬＣ
【出願人】（５０８２４１２００）サンガモ　バイオサイエンシーズ，　インコーポレイテッド (28)
【Ｆターム（参考）】