Notice: Undefined variable: fterm_desc_sub in /mnt/www/biblio_conv.php on line 353
5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ遺伝子をターゲッティングする改変ジンクフィンガータンパク質
説明

5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ遺伝子をターゲッティングする改変ジンクフィンガータンパク質

本発明の開示は、植物中の5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS)遺伝子をターゲッティングする改変ジンクフィンガータンパク質に、ならびに遺伝子発現、遺伝子不活性化および標的化遺伝子修飾を変調するに際してのこのようなジンクフィンガータンパク質の使用方法に関する。特に本開示は、EPSPS遺伝子の標的化切断および変更のためのジンクフィンガーヌクレアーゼに関する。


Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/disp_n7.php on line 301

【特許請求の範囲】
【請求項1】
当該EPSPS標的ゲノム領域と結合する非天然ジンクフィンガータンパク質(ZFP)であって、1つまたは複数の改変ジンクフィンガー結合ドメインを含むZFP。
【請求項2】
1つまたは複数の機能的ドメインを含む融合タンパク質である請求項1記載のZFP。
【請求項3】
転写抑制因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、転写活性因子およびヒストンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される1つまたは複数の機能的ドメインを含む請求項2記載のZFP。
【請求項4】
当該EPSPS標的ゲノム領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)である請求項3記載のZFPであって、前記ZFNが1つまたは複数の改変ジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインを含むZFP。
【請求項5】
1つまたは複数のEPSPSパラロガスまたはオルソロガス遺伝子配列を切断する請求項4記載のZFN。
【請求項6】
請求項1〜5のいずれかに記載の1つまたは複数のジンクフィンガータンパク質(ZEP)をコードするポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項6記載の1つまたは複数のポリヌクレオチドを含む植物宿主細胞。
【請求項8】
1つまたは複数のポリヌクレオチドで安定的にトランスフェクトされる請求項7記載の植物宿主細胞。
【請求項9】
1つまたは複数のポリヌクレオチドで一時的にトランスフェクトされる請求項7記載の植物宿主細胞。
【請求項10】
植物細胞中の1つまたは複数のEPSPS遺伝子の切断方法であって、以下の:
植物細胞中に請求項6記載の1つまたは複数のポリヌクレオチドを導入すること;そして
細胞中で1つまたは複数のZFNを発現すること(この場合、ZFNは1つまたは複数のEPSPS遺伝子を切断する)
を包含する方法。
【請求項11】
少なくとも1つのポリヌクレオチドが植物細胞中に安定的にトランスフェクトされる請求項10記載の方法。
【請求項12】
少なくとも1つのポリヌクレオチドが一時的に植物細胞中にトランスフェクトされる請求項10記載の方法。
【請求項13】
植物細胞中のすべてのEPSPSパラロガス遺伝子が切断される請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
植物細胞中の1つまたは複数のEPSPSパラロガス遺伝子が切断される請求項10〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
第一および第二DNA配列を含むドナーベクターであって、
前記第一配列が第三配列と相同であり、前記第二配列が第四配列と相同であり;そして
前記第三および第四配列が染色体EPSPS DNA配列である
ドナーベクター。
【請求項16】
第三および第四配列の近接縁が連続している請求項15記載のドナーベクター。
【請求項17】
第三および第四配列の近接縁が少なくとも1つのヌクレオチド対により分離される請求項15記載のドナーベクター。
【請求項18】
第三および第四配列が外因性配列である請求項15〜17のいずれかに記載のベクター。
【請求項19】
第三および第四配列が内因性配列である請求項15〜17のいずれかに記載のベクター。
【請求項20】
第五配列をさらに含む請求項15〜19のいずれかに記載のベクターであって、前記第五配列が、以下の:
(a)第一および第二配列間に差し挟まれ;そして
(b)外因性核酸配列である
ベクター。
【請求項21】
第五配列が選択可能マーカーをコードする配列を含む請求項20記載のベクター。
【請求項22】
選択可能マーカーが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β−グルクロニダーゼ(GUS)、ホスフィノトリシンN−アセチルトランスフェラーゼ(PAT、BAR)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、イクオリン、EPSPシンターゼ、ニトリラーゼ、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、ジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニレートシンターゼからなる群から選択される請求項21記載のベクター。
【請求項23】
第五配列が、選択可能マーカー以外のタンパク質をコードする配列;1つまたは複数の転写調節配列;タンパク質ターゲッティングを増強するかまたは低減する1つまたは複数の配列;タンパク質の一部をコードする1つまたは複数の配列;低分子干渉RNA;およびマイクロRNAからなる群から選択される配列を含む請求項20記載のベクター。
【請求項24】
第五配列が、除草剤グリホサートに対する植物の耐性を増大する突然変異体EPSPS染色体配列をコードする配列を含む請求項23記載のベクター。
【請求項25】
植物細胞のゲノム中への外因性核酸配列の導入方法であって、以下の:
請求項15〜24のいずれかに記載のドナーベクターの存在下で、細胞中で1つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を発現するステップ;
を包含し;
この場合、ZFNが第三または第四配列のいずれかの3キロ塩基対内の染色体DNA中のEPSPS遺伝子を切断し;
したがって、ステップ(b)における染色体DNAの切断が相同組換えによるゲノム中へのドナーベクターの組入れを刺激する
こと包含する方法。
【請求項26】
植物細胞中の外因性核酸配列の生成物の発現方法であって、以下の:
外因性配列の生成物が植物細胞中で発現されるよう、請求項25記載の方法に従って外因性配列を導入するステップ
を包含する方法。
【請求項27】
請求項25または26記載の方法に従って得られるトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項28】
植物細胞のゲノムにおける分子内相同組換えの刺激方法であって、以下の:
ZFNがDNAセグメントを切断し、分子内相同組換えを刺激するよう、植物細胞においてEPSPS遺伝子および第二配列と相同である第一配列を含むDNAセグメントの存在下で植物細胞中に請求項4〜6のいずれかに記載のZFNを導入するステップ
を包含する方法。
【請求項29】
相同組換えが内因性DNAセグメント内の欠失を生じる請求項28記載の方法。
【請求項30】
欠失配列が、EPSPS遺伝子の全部または一部をコードする配列および選択可能マーカーの全部または一部をコードする配列からなる群から選択される請求項29記載の方法。
【請求項31】
欠失DNAが外因性配列に取って代わられる請求項29記載の方法であって、以下の:
細胞中にポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、以下の:
(a)第四および第五配列(ここで、前記第四配列は第一配列に近接した非欠失配列と相同であり、前記第五配列は第二配列に近接した非欠失配列と相同である);ならびに
(b)外因性配列
を含むステップ
をさらに包含する方法。
【請求項32】
外因性配列が選択可能マーカーである請求項31記載の方法。
【請求項33】
選択可能マーカーが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、β−グルクロニダーゼ(GUS)、ホスフィノトリシンN−アセチルトランスフェラーゼ(PAT、BAR)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、イクオリン、EPSPシンターゼ、ニトリラーゼ、アセトラクターゼシンターゼ(ALS)、ジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)、ダラポンデハロゲナーゼおよびアントラニレートシンターゼからなる群から選択される請求項32記載の方法。
【請求項34】
外因性配列がEPSPS遺伝子配列である請求項31記載の方法。
【請求項35】
EPSPS遺伝子配列が突然変異を含む請求項34記載の方法。
【請求項36】
突然変異が除草剤グリコサートに対する植物の耐性を増大する請求項35記載の方法。
【請求項37】
植物細胞のゲノムからのEPSPS遺伝子配列の欠失方法であって、以下の:
細胞中で請求項4記載の第一および第二ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を発現するステップであって、前記第一ZFNがESPS遺伝子中の第一切断部位で切断し、前記第二ZFNがESPS遺伝子中の第二切断部位で切断し、前記EPSPS遺伝子配列が前記第一切断部位および前記第二切断部位間に位置し、前記第一および第二切断部位の切断が前記EPSPS遺伝子配列の欠失を生じるステップ
を包含する方法。
【請求項38】
EPSPS遺伝子配列が第一および第二切断部位の非相同末端結合により欠失される請求項37記載の方法。
【請求項39】
第一および第二切断部位が少なくとも100ヌクレオチドにより分離される請求項37または38記載の方法。
【請求項40】
植物細胞が外因性ESPS配列を含むトランスジェニック植物細胞である請求項37記載の方法。
【請求項41】
EPSPS遺伝子の発現の変調方法であって、以下の:
請求項1〜3のいずれかに記載の細胞中のZFPを発現するステップであって、前記ZFPがEPSPS遺伝子中の標的部位と結合し、それによりEPSPS遺伝子の発現を変調するステップ
を包含する方法。
【請求項42】
ZFPがEPSPS遺伝子の転写を増大する請求項41記載の方法。
【請求項43】
ZFPが除草剤グリホサートに対する植物の耐性を増大する請求項42記載の方法。
【請求項44】
ZFPがEPSPS遺伝子の転写を低減する請求項41記載の方法。
【請求項45】
ZFPが除草剤グリホサートに対する植物の耐性を低減する請求項44記載の方法。

【図1】
image rotate

【図2−1】
image rotate

【図2−2】
image rotate

【図3A】
image rotate

【図3B】
image rotate

【図3C】
image rotate

【図3D】
image rotate

【図4】
image rotate

【図5】
image rotate

【図6】
image rotate

【図7A】
image rotate

【図7B】
image rotate

【図8A】
image rotate

【図8B】
image rotate

【図8C】
image rotate

【図9】
image rotate

【図10】
image rotate

【図11A】
image rotate

【図11B】
image rotate

【図12A】
image rotate

【図12B】
image rotate

【図13A】
image rotate

【図13B】
image rotate

【図14A】
image rotate

【図14B】
image rotate

【図14C】
image rotate

【図14D】
image rotate

【図14E】
image rotate


【公表番号】特表2010−539930(P2010−539930A)
【公表日】平成22年12月24日(2010.12.24)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2010−526939(P2010−526939)
【出願日】平成20年9月25日(2008.9.25)
【国際出願番号】PCT/US2008/011089
【国際公開番号】WO2009/042164
【国際公開日】平成21年4月2日(2009.4.2)
【出願人】(390039192)ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー (20)
【氏名又は名称原語表記】Dow AgroSciences LLC
【出願人】(508241200)サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド (28)
【Fターム(参考)】