５９位にアミノ酸置換を有するインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の類似体
本発明は、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の新規類似体、前記の類似体を含有する医薬組成物、ならびにＩＧＦ−１受容体に仲介される病気、例えば低身長の処置、糖尿病療法、神経変性疾患の処置、および軟骨の修復のための前記の類似体の使用に関する。より詳細には、本発明は５９位にアミノ酸置換を有するＩＧＦ−１の新規類似体、例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:1)、および本明細書で定められる他の置換（単数または複数）に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の新規類似体、前記の類似体を含有する医薬組成物、ならびにＩＧＦ−１受容体に仲介される病気、例えば低身長の処置、糖尿病療法、神経変性疾患の処置、および軟骨の修復のための前記の類似体の使用に関する。より詳細には、本発明は５９位にアミノ酸置換を有するＩＧＦ−１の新規類似体、例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH、および本明細書で定められる他の置換（単数または複数）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−１は、インスリン様および分裂促進的増殖の生物学的活性を有する７０アミノ酸のポリペプチドホルモンである。このホルモンは、筋骨格系、肝臓、腎臓、腸、神経系組織、心臓、および肺を含む様々な組織において細胞の増殖を増進する。
【０００３】
野生型ＩＧＦ−１は、３個の鎖内ジスルフィド架橋を有する次のアミノ酸配列を有し、ここで残基対A6およびA48、A47およびA52、ならびにA18およびA61の側鎖はそれぞれジスルフィド結合を形成している(SEQ ID NO:50)：
【０００４】
【化１】
【０００５】
ＩＧＦ−１は多種多様な体組織に存在するが、それは通常はそれがＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合した不活性な形で見付かる。６種類の関連するＩＧＦＢＰが知られており、ＩＧＦＢＰ１〜ＩＧＦＢＰ６と名付けられている。例えば、Holly and Martin, “インスリン様増殖因子結合タンパク質：それらの精製、分析および制御の方法論的観点の総説” Growth Regul., 4(補遺1):20-30 (1994)を参照。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−１の作用に対して阻害性および／または刺激性の作用を及ぼすことにより、ＩＧＦ−１の制御において重要な役割を果たしている。例えば、循環するＩＧＦ−１の約９０％はＩＧＦＢＰ−３および酸に不安定なサブユニット(submit)を含有する３分子複合体で存在する。そのような複合体内のＩＧＦ−１は表面受容体に結合することができず、従って生物学的に不活性である。また、３分子複合体内に存在するＩＧＦ−１は複合体化していないＩＧＦ−１よりも実質的に長い半減期を有する。
【０００６】
ＩＧＦ−１の作用の混乱は、神経変性障害、例えば運動ニューロン疾患（すなわち、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、）筋ジストロフィーおよび多発性硬化症、軟骨障害、例えば骨関節炎、骨疾患、例えば骨粗鬆症、炎症性障害、例えばリウマチ性関節炎、器官に対する、例えば心臓、脳、または肝臓に対する虚血傷害等を含む多くの生理障害の一因となっている可能性がある。
【０００７】
当業者には周知であるように、ＩＧＦ−１の既知の、および可能性のある用途は様々であり、多数である。例えば、いくつかの研究は、神経変性の病気の処置のための可能性のある療法剤としてのＩＧＦ−１の用途に関して報告している。例えば、Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989); Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995); Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997); Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997); Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998)を参照。ＩＧＦ−１療法は、ＡＬＳ、発作、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、急性外傷性傷害および外傷、老化、疾患、または傷害と関係する他の障害を含む多数の神経学的な病気において示されてきた。例えば米国特許第５，０９３，１３７号；第５，６５２，２１４号；第５，７０３，０４５号；国際公開番号ＷＯ９０／１４８３およびＷＯ９３／０２６９５を参照。
【０００８】
様々な他の病気に関するＩＧＦ−１療法の使用が多くの刊行物において言及されてきた。例えば、Schalch et al., “Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors”、Spencer編(Elsevier、ニューヨーク), pp. 705-714 (1991); Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994);およびLangford et al., Eur. J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993)（例えばインスリン抵抗性状態および糖尿病に言及している）;およびO’Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993)（例えば低減した腎機能に言及している）を参照。米国特許第７，２５８，８６４号（低身長に言及している）；米国特許第５，１１０，６０４号および米国特許第５，４２７，７７８号（傷の治癒に言及している）；米国特許第５，１２６，３２４号（心臓障害および成長遅延に言及している）；米国特許第５，３６８，８５８号（例えば軟骨の欠陥または病変に言及している）；米国特許第５，５４３，４４１号および米国特許第５，５５０，１８８号（組織の増大に言及している）；米国特許第５，６８６，４２５号（例えば瘢痕組織、局在型の筋機能障害、および尿失禁に言及している）；ならびに米国特許第５，６５６，５９８号（例えば骨の成長に言及している）も参照。国際公開番号ＷＯ９１／１２０１８（例えば腸障害に言及している）；ＷＯ９２／０９３０１およびＷＯ９２／１４４８０（例えば傷の治癒に言及している）；ＷＯ９３／０８８２８（例えば虚血、低酸素症、または神経変性と関係するニューロンの損傷に言及している）；ＷＯ９４／１６７２２（例えばインスリン抵抗性に言及している）；ＷＯ９６／０２５６５Ａ１（例えば骨形成の促進に関する、および骨再形成の制御に関するＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ複合体に言及している）；米国特許出願公開番号２００３／０１００５０５（例えば骨粗鬆症に言及している）；ならびに米国特許出願公開番号２００５／００４３２４０（肥満に言及している）も参照。
【０００９】
ＩＧＦ−１療法は多くの生理学的適応に関して用いられてきたが、結果は時々予測不能であった。短期の有益な作用は時々持続せず（例えばMiller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)参照）、特に高い用量および／または長期の投与の結果として望ましくない副作用がもたらされる可能性がある（例えばJabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994);Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)参照）。高レベルのＩＧＦ−１は前立腺癌の危険性を増大させることも報告されている（Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)）。
【００１０】
従って、当技術において、ＩＧＦ−１および／またはインスリン様増殖因子結合タンパク質に結合する他のタンパク質に応答性の病気を処置するためのよりよい方法に関する必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，０９３，１３７号
【特許文献２】米国特許第５，６５２，２１４号
【特許文献３】米国特許第５，７０３，０４５号
【特許文献４】国際公開番号ＷＯ９０／１４８３
【特許文献５】国際公開番号ＷＯ９３／０２６９５
【特許文献６】米国特許第７，２５８，８６４号
【特許文献７】米国特許第５，１１０，６０４号
【特許文献８】米国特許第５，４２７，７７８号
【特許文献９】米国特許第５，１２６，３２４号
【特許文献１０】米国特許第５，３６８，８５８号
【特許文献１１】米国特許第５，５４３，４４１号
【特許文献１２】米国特許第５，５５０，１８８号
【特許文献１３】米国特許第５，６８６，４２５号
【特許文献１４】米国特許第５，６５６，５９８号
【特許文献１５】国際公開番号ＷＯ９１／１２０１８
【特許文献１６】国際公開番号ＷＯ９２／０９３０１
【特許文献１７】国際公開番号ＷＯ９２／１４４８０
【特許文献１８】国際公開番号ＷＯ９３／０８８２８
【特許文献１９】国際公開番号ＷＯ９４／１６７２２
【特許文献２０】国際公開番号ＷＯ９６／０２５６５Ａ１
【特許文献２１】米国特許出願公開番号２００３／０１００５０５
【特許文献２２】米国特許出願公開番号２００５／００４３２４０
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Holly and Martin, “インスリン様増殖因子結合タンパク質：それらの生成、分析および制御の方法論的観点の総説” Growth Regul., 4(補遺1):20-30 (1994)
【非特許文献２】Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989)
【非特許文献３】Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995)
【非特許文献４】Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995)
【非特許文献５】Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996)
【非特許文献６】Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997)
【非特許文献７】Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997)
【非特許文献８】Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998)
【非特許文献９】Schalch et al., “Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors”、Spencer編(Elsevier、ニューヨーク), pp. 705-714 (1991)
【非特許文献１０】Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994)
【非特許文献１１】Langford et al., Eur. J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993)
【非特許文献１２】O’Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993)
【非特許文献１３】Miller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)
【非特許文献１４】Jabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994)
【非特許文献１５】Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)
【非特許文献１６】Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)
【発明の概要】
【００１３】
本発明の発明者らにより発見されたように、化学的に不安定であり、容易に酸化され得る野生型ＩＧＦ−１の５９位のメチオニン残基を本明細書で記述するように他のアミノ酸で置き換えることにより（例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH）、結果として得られるＩＧＦ−１の類似体は化学的により安定であり、従って生成、精製、保管等の間により酸化を受けにくい。
【００１４】
１観点において、本発明は次の式（Ｉ）のＩＧＦ−１のペプチド変種（すなわち類似体）に向けられており、
H-A-1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59-A60-A61-A62-A63-A64-A65-A66-A67-A68-A69-A70-A71-R1
（Ｉ）
ここで:
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A2はPro、Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、Lysであり、または欠失しており;
A3はGlu、Ala、Asp、Glnであり、または欠失しており;
A4はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Serであり;
A5はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A6はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A7はGly、Ala、Asn、Asp、GlnまたはGluであり;
A8はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A9はGlu、Ala、Asp、またはGlnであり;
A10はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A11はVal、Ala、Ile、またはLeuであり;
A12はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A13はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A14はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A15はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A16はPhe、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Trp、またはTyrであり;
A17はVal、Ala、IleまたはLeuであり;
A18はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A19はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A20はAsp、Ala、Asn、Gln、またはGluであり;
A21はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A22はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A23はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A24はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A25はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A26はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Ser、またはThrであり;
A27はLys、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはProであり;
A28はPro、Ala、Arg、またはLysであり;
A29はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A30はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A31はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A32はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A33はSer、Ala、Thr、またはValであり;
A34はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A35はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A36はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A37はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A38はAla、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A39はPro、Ala、Arg、またはGluであり;
A40はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A41はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A42はGly、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A43はIle、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A44はVal、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはLysであり;
A45はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A46はGlu、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A47はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A48はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A49はPhe、Ala、Arg、Ile、Leu、Lys、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A50はArg、Ala、Lys、Ser、またはThrであり;
A51はSer、Aib、Ala、Arg、Lys、またはThrであり;
A52はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A53はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Lys、Ser、またはThrであり;
A54はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A55はArg、Ala、Ile、Leu、Lys、Phe、Trp、Tyr、またはValであり;
A56はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A57はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A58はGlu、Acc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A59はAcc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Nle、Ser、D-Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A60はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A61はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A62はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A63はPro、D-Pro、Ala、Ser、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leu、Ala、Ile、Valであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Pro、Alaであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Ala、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A71はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Lys、Ser、Thrであり、または欠失しており；そして
R1はOHまたはNH2であり;
ただし、
残基対A6およびA48、A47およびA52、ならびにA18およびA61の側鎖はそれぞれジスルフィド結合を形成しており；そして
さらに、A59がLeu、Ile、Nle、Thr、またはValのいずれかである場合、その類似体は本明細書で定めるような少なくとも１個の追加のアミノ酸置換または付加を含有する。
【００１５】
式（Ｉ）において、好ましいアミノ酸置換および付加は以下のように定められる：
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGlyであり、または欠失しており;
A2はPro、Lysであり、または欠失しており;
A3はGluであり、または欠失しており;
A4はThrであり;
A5はLeuであり;
A6はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A7はGlyであり;
A8はAlaであり;
A9はGluであり;
A10はLeuであり;
A11はValであり;
A12はAspであり;
A13はAlaであり;
A14はLeuであり;
A15はGlnであり;
A16はPheであり;
A17はValであり;
A18はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A19はGlyであり;
A20はAspであり;
A21はArgであり;
A22はGlyであり;
A23はPheであり;
A24はTyrであり;
A25はPheであり;
A26はAsnであり;
A27はLys、Arg、またはProであり;
A28はProまたはLysであり;
A29はThrであり;
A30はGlyであり;
A31はTyrであり;
A32はGlyであり;
A33はSerであり;
A34はSerであり;
A35はSerであり;
A36はArgであり;
A37はArgであり;
A38はAlaであり;
A39はProであり;
A40はGlnであり;
A41はThrであり;
A42はGlyであり;
A43はIleであり;
A44はValであり;
A45はAspであり;
A46はGluであり;
A47はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A48はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A49はPhe、Arg、Leu、またはThrであり;
A50はArgまたはSerであり;
A51はSer、Aib、Arg、またはThrであり;
A52はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A53はAsp、Arg、またはSerであり;
A54はLeuまたはA6cであり;
A55はArgまたはTyrであり;
A56はArgまたはGlnであり;
A57はLeuであり;
A58はGluまたはArgであり;
A59はA6c、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Nle、Ser、D-Ser、Trp、またはTyrであり;
A60はTyrまたはPheであり;
A61はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A62はAlaまたはAsnであり;
A63はPro、D-Pro、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leuであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Argであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Proであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Argであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Gluであり、または欠失しており；そして
A71はAsp、Glu、Lys、Serであり、または欠失している。
【００１６】
式（Ｉ）に含まれる化合物の部分集合は、A59がAsnである化合物を含む。
式（Ｉ）に含まれる化合物の別の部分集合は、A59がLeuである化合物を含み、ここで前記の化合物はArg27、Arg65、Arg68、Leu49、β-Me-Cys47、β-Me-Cys52、Thr51、Thr69、Asp71、Glu71、Lys71、およびSer71からなるグループから選択される少なくとも１個の追加のアミノ酸置換または付加を含有する。
【００１７】
式（Ｉ）に含まれる化合物のさらに別の部分集合は、A59がNleである化合物を含み、ここで前記の化合物はAib51、Aib67、Aib69、A6c54、N-Me-Cys47、N-Me-Cys48、Pen52、およびPen61からなるグループから選択される少なくとも１個の追加のアミノ酸置換を含有する。
【００１８】
式（Ｉ）に含まれる化合物のさらに別の部分集合は、A59がIleである化合物を含み、ここで前記の化合物はArg58、Arg49、Arg51、およびArg53からなるグループから選択される少なくとももう１個のアミノ酸置換を含有する。
【００１９】
式（Ｉ）に含まれる化合物のさらに別の部分集合は、A59がArg、Asp、A6c、Gln、Glu、Ser、Trp、またはTyrである化合物を含む。
式（Ｉ）の好ましい化合物は以下のものである：
実施例１： (Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)
実施例２： (Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)
実施例３： (Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)
実施例４： (Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)
実施例５： (Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)
実施例６： (Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)
実施例７： (Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)
実施例８： (Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
実施例９： (Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)
実施例１０： (Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)
実施例１１： (Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)
実施例１２： (Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)
実施例１３： (Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)
実施例１４： (Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)
実施例１５： (Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１６： (Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１７： (Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１８： (Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１９： (Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２０： (Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２１： (Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２２： (Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２３： (Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
実施例２４： (Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
実施例２５： (Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
実施例２６： (β-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
実施例２７： (β-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
実施例２８： (Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
実施例２９： (Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
実施例３０： (Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
実施例３１： (Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
実施例３２： (Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)
実施例３３： (Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
実施例３４： (N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
実施例３５： (Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
実施例３６： (N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
実施例３７： (Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
実施例３８： (hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
実施例３９： (Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
実施例４０： (Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
実施例４１： (Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)
実施例４２： (A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
実施例４３： (Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
実施例４４： (Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
実施例４５： (Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)
実施例４６： (Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
実施例４７： (A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
実施例４８： (Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
実施例４９： (Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)
実施例５０： (Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)
実施例５１： (Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
実施例５２： (Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
実施例５３： (Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)
実施例５４： (Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46)および
実施例５５： (Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:47)。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本出願は以下の一般に理解されている略語を用いる：
Acc: 1-アミノ-1-シクロ(C3-C9)アルキルカルボン酸
Accには以下のものが含まれる:
A3c: 1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸
A4c: 1-アミノ-1-シクロブタンカルボン酸
A5c: 1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸
A6c: 1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸
Aib: α-アミノイソ酪酸
AlaまたはA: アラニン
ArgまたはR: アルギニン
AsnまたはN: アスパラギン
AspまたはD: アスパラギン酸
CysまたはC: システイン
シスチン: システインのジスルフィド２量体
hCys: ホモシステイン
β-Me-Cys: ベータ-メチル-システイン、すなわち、(2S, 3S)-2-アミノ-3-メルカプト酪酸
N-Me-Cys: N-メチル-システイン
GlnまたはQ: グルタミン
GluまたはE: グルタミン酸
GlyまたはG: グリシン
IleまたはI: イソロイシン
LeuまたはL: ロイシン
des-Leu: 欠失したLeu
LysまたはK: リシン
des-Lys: 欠失したLys
MetまたはM: メチオニン
Nle: ノルロイシン
Pen: ペニシラミン
PheまたはF: フェニルアラニン
ProまたはP: プロリン
SerまたはS: セリン
ThrまたはT: スレオニン
TrpまたはW: トリプトファン
TyrまたはY: チロシン
ValまたはV: バリン。
【００２１】
この開示における全てのアミノ酸の略語（例えばAla）は-NR-CR’(R”)-CO-の構造を表しており、ここでR’およびR”はそれぞれ独立して水素またはアミノ酸の側鎖（例えば、Alaに関してはR’ = HおよびR” = CH3）であり、ここで、プロリン、すなわち
【００２２】
【化２】
【００２３】
を除いてR = HまたはCH3である。
この発明のペプチドは別の形式、例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:1)によっても表され、それはカッコの間に置かれた天然の配列から置換されたアミノ酸（すなわち、野生型ＩＧＦ−１の５９位のMetの代わりにAsn）を有する。カッコ内に見出される範囲は、その類似体において見出されるアミノ酸を表す。例えば、“IGF-1(4-68)-OH”(SEQ ID NO:48)は、その類似体が野生型ＩＧＦ−１に関するペプチド配列に対応するアミノ酸４〜６８で構成されることを示す。“IGF-1(1-70)-NH2”(SEQ ID NO:49)における“NH2”は、そのペプチドのＣ末端がアミド化されていることを示す。“IGF-1(1-70)”または“IGF-1(1-70)-OH”は、そのＣ末端が遊離酸であることを示す(SEQ ID NO:50)。
【００２４】
本明細書において用いられる特定の他の略語を以下のように定義する：
Act: アセトニトリル
Boc: tert-ブチルオキシカルボニル
BSA: ウシ血清アルブミン
DCM: ジクロロメタン
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMEM: ダルベッコ変法イーグル培地
DMF: ジメチルホルムアミド
DTT: ジチオスレイトール(dithiothrieitol)
ESI: エレクトロスプレーイオン化
FCS: ウシ胎児血清
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU: 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
LC-MS: 液体クロマトグラフィー質量分析
MPAA: 4-メルカプトフェニル酢酸
NMP: N-メチルピロリジノン
OtBu: O-tert-ブチルエステル
Pbf: 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
QC: 品質管理
tBu: tert-ブチル
TCA: トリクロロ酢酸
TCEP トリス-2-カルボキシエチル-ホスフィン
TIS: トリイソプロピルシラン
TFA: トリフルオロ酢酸
Tris: 2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール
Trt: トリチル
UV分光法: 紫外分光法。
【００２５】
“アルキル”は１個以上の炭素原子を含有する炭化水素基を指し、ここで多数の炭素原子は、もし存在するならば、単結合によりつながっている。その例にはメチル、エチル、プロピル、およびブチルが含まれるが、それらに限定されない。アルキル炭化水素基は直鎖であってよく、または１個以上の分枝もしくは環式基を含有していてよく、その例にはイソプロピルおよびtertブチルが含まれるが、それらに限定されない。
【００２６】
“置換されたアルキル”は、炭化水素基の１個以上の水素原子が、ハロゲン、OH、CN、SH、NH2、NHCH3、NO2、１〜６個のハロゲンで置換された(C1-2)アルキル、CF3、OCH3、OCF3、および(CH2)0-4-COOHからなるグループから選択される１個以上の置換基で置き換えられているアルキルを指す。異なる態様において、１、２、３または４個の置換基が存在する。
【００２７】
“アリール”は、共役パイ電子系を有する少なくとも１個の環を有し、３個までの共役した、または縮合した環系を含有する、場合により置換された芳香族基を指す。アリールには炭素環式アリール、ヘテロ環式アリールおよびビアリール基が含まれる。好ましくは、アリールは５または６員環である。ヘテロ環式アリールに関して好ましい原子は、１個以上の硫黄、酸素および／または窒素である。アリールの例には、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、インドール、キノリン、2-イミダゾール、および9-アントラセンが含まれる。アリールの置換基は、-C1-20アルキル、-C1-20アルコキシ、ハロゲン、-OH、-CN、-SH、-NH2、-NO2、ハロゲンで置換された-C1-20アルキル、-CF3、-OCF3、および-(CH2)0-20-COOHからなるグループから選択される。異なる態様において、アリールは０、１、２、３または４個の置換基を含有する。
【００２８】
“アルキル−アリール”は、“アリール”に結合した“アルキル”を指す。
合成手順
本発明の例示したＩＧＦ−１の類似体は、第１工程であるペプチド断片合成、第２工程であるライゲーション、および第３工程であるフォールディングにより調製された。以下の合成手順は、どのようにして熟練した化学者が本発明の例示したＩＧＦ−１の類似体のいずれか１種類を調製することを可能にするかを説明する。
【００２９】
Ａ） (Gln56、Asn59)hIGF-1(48-70)-OH、すなわち、Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Arg-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-OH (SEQ ID NO:51)のペプチド断片合成
Fmocに基づく固相ペプチド合成を用いて、Liberty Peptide Synthesizer (CEM；米国ノースキャロライナ州マシューズ)上で、マイクロ波支援を用いて表題のペプチド断片を組み立てた。最初の１４残基の断片、すなわち、ｈＩＧＦ−１の残基５７〜７０、またはＣ末端酸ペプチドを、Fmoc-Ala-Wang樹脂(0.72 meq/g)を用いて0.1 mmoleスケールで合成した。次いで得られたペプチド断片を、伸長および識別のために、４つの0.25 mmoleのバッチに分けた。1.36 gの樹脂試料を50-mLコニカルチューブの中に、15 mLのDMFおよびDCMの１：１溶液と共に置き、それを合成機中の所定の位置の中に入れた。次いでその樹脂を、合成機の自動化されたプロセスにより反応容器に移した。1.0-mmoleスケールでの合成のための標準的なLibertyプロトコルを用いた。そのプロトコルには、DMF中の0.1M HOBtを含有する20% ピペリジン20 mLを用いた処理によるＮ末端のFmoc保護基の除去が含まれていた。マイクロ波電力（４５ワット、最大温度７５℃）および窒素による泡立て（３秒間オン、７秒間オフ）の最初の脱保護の工程は３０秒間続いた。反応容器から液体を排出し(drained)、DMFで数回、完全に洗浄した。次いで、成長するペプチドに添加される次のアミノ酸（サイクル１）である、DMF中0.2Mのストック溶液として調製された(Fmoc-Ser(tBu)-OH)を添加した(15 mL、3当量)。6.0 mLのDMF中0.45M (3当量)HBTUを添加し、続いて3.0 mLのNMP中2M (6当量) DIPEAを添加した。カップリングの工程は、マイクロ波電力（２０ワット、最大温度７５℃）および脱保護工程におけるものと同程度の窒素による泡立てを用いて５分間の期間の間行った。次いで反応容器から液体を排出して廃棄し、カップリングの工程を繰り返した。
【００３０】
Fmoc-Cys(Trt)-OHに関するカップリングプロトコルは、標準的なプロトコルをわずかに修正したバージョンであった。Cys残基に関して、最初の２分間はマイクロ波を適用しなかった。続いて４分間のマイクロ波のセッション（２０ワット、最大温度５０℃）を行った。シークエンス全体を通して二重カップリングの方法を用いて、全てのアミノ酸を同様に導入した。表題ペプチド断片に関する最初のSerに続く合成サイクルは以下の通りであった：サイクル2、Fmoc-Lys(Boc)-OH; サイクル3、Fmoc-Ala-OH; サイクル4、Fmoc-Pro-OH; サイクル5、Fmoc-Lys(Boc)-OH; サイクル6、Fmoc-Leu-OH; サイクル7、Fmoc-Pro-OH; サイクル8、Fmoc-Ala-OH; サイクル9、Fmoc-Cys(Trt)-OH; サイクル10、Fmoc-Tyr(tBu)-OH; サイクル11、Fmoc-Asn(Trt)-OH; サイクル12、Fmoc-Glu(OtBu)-OH;およびサイクル13、Fmoc-Leu-OH。
【００３１】
一度最初のペプチド断片が完成したら、DMFを溶媒として用いてその樹脂を50-mLコニカルチューブに戻した。その樹脂を手作業で均等に４つの試料に分け、それを４本の50-mLコニカルチューブの中に入れ、次いでそれを合成機の中に戻した。表題ペプチドの残りの部分を、0.25-mmoleスケールで合成した。用いたプロトコルはより大きいスケールでの合成に関して用いられたプロトコルと同じであったが、より少ない量の試薬を用いた。Ｎ末端Fmoc保護基の除去は、10 mLのDMF中20%ピペリジンおよび0.1M HOBtを含有する溶液を用いた処理で構成されていた。窒素による泡立て（３秒間オン、７秒間オフ）を伴うマイクロ波電力（４５ワット、最大温度７５℃）の最初の脱保護の工程は３０秒間続いた。次いで反応容器から液体を排出し、DMFで数回、完全に洗浄した。次いで、DMF中0.2Mのストック溶液として調製された次のアミノ酸（サイクル１４）を、成長するペプチドに導入した(Fmoc-Gln(tBu)-OH)(5.0 mL、4当量)。次いで2.0 mLのDMF中HBTUの0.45M溶液(4当量)を添加し、続いて1.0 mLのNMP中DIPEAの2M溶液(8当量)を添加した。
【００３２】
Fmoc-Cys(Trt)-OHおよびFmoc-Arg(Pbf)-OHに関するカップリングプロトコルは、標準的なプロトコルをわずかに修正したバージョンであった。Cys残基のカップリングに関して、最初に、最初の２分間はマイクロ波電力をオフにし、次いで４分間オンにした（２０ワット、最大温度５０℃）。Arg残基のカップリングに関して、最初のカップリングではマイクロ波電力を用いなかったが、２番目の標準的なカップリング工程が必要であった。サイクル１４、１６および２１は、カップリングの工程のすぐ後でキャッピングの手順を用い、それは共にNMP中の0.015M HOBTを含有する0.5M無水酢酸7 mlおよび2M DIPEA 2 mlを添加し、一方で多段階マイクロ波プロトコル（最大温度６５℃で５０ワットを３０秒間、次いで電力無しを３０秒間、最大温度６５℃で５０ワットを３０秒間、次いで電力無しを３０秒間）を利用することを含んでいた。表題ペプチド断片に関するGlnの後の合成サイクルは以下の通りであった：サイクル15、Fmoc-Arg(Pbf)-OH; サイクル16、Leu-OH; サイクル17、Fmoc-Asp(OtBu)-OH; サイクル18、Fmoc-Cys(Trt)-OH; サイクル19、Fmoc-Ser(tBu)-OH; サイクル20、Fmoc-Arg(Pbf)-OH; サイクル21、Fmoc-Phe-OH;およびサイクル22、Fmoc-Cys(Trt)-OH。
【００３３】
ペプチドのバックボーンの完成の後、Ｎ末端のFmoc保護基を除去し、樹脂を再度DMFで洗浄した。次いで移動用の溶媒としてDMFを用いて樹脂を50-mLコニカルチューブに戻した。
【００３４】
その樹脂を焼結ガラスフリットを有する反応容器の中に移した。DMFを除去し、樹脂をDCMで大規模に(extensively)洗浄した。そのペプチド断片を、以下の試薬を用いた処理により切断および脱保護した：5% TIS : 5%水: 90% TFA。反応を一定の振盪の下で室温で３時間進行させた。次いでその溶液を濾過して50-mLコニカルチューブの中に入れた。窒素ガス流を用いた蒸発によりTFAを低減させた。40 mLの冷エチルエーテルの添加およびそれに続く冷却遠心機(Sorvall Legend RT; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)内での４℃において3000 rpmで３０分間の遠心分離により、ペプチド断片を沈殿させた。得られたペレットを0.1% TFA水中で溶解させた後、C18逆相カラム(Luna、10μｍ、250×21.2 mmカラム)を備えた分取ＨＰＣＬにより、10 mL/分の流速で５０分間にわたる0〜60％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を利用して精製した。その精製されたペプチド断片を、1mL/分の流速で３０分間にわたる5〜80％アセトニトリル(0.08% TFA)の勾配を用いるＨＰＬＣ(Luna C18、３μｍ、4.6×100 mmカラム)により、および質量分析(LCQ Advantage; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)により分析した。そのペプチド断片を続いて凍結乾燥させ、将来の使用のために−５０℃で保管した。
【００３５】
Ｂ） hIGF-1(1-47)-チオエステル、すなわち、Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-Cys-チオエステル-プロピオニル-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52)のペプチド断片合成
Ｎ末端ペプチド断片、すなわち、ｈＩＧＦ−１の残基１〜４７を、固相ペプチド合成に基づくＢｏｃ化学を用いて組み立てた。標準的なFastBocプロトコルを動かすように修正されたＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機(Applied Biosystems；米国カリフォルニア州フォスターシティ)を、0.5-mmoleスケールでの合成のために利用した。0.645 mgの0.77 meq/gのTampal樹脂を含有する反応容器を合成機の上に置いた。樹脂を膨潤させるため、DMFを導入した。ABI FastBoc 0.5プロトコルを用いて断片を精製した。それぞれのサイクルは、ニート(neat) TFAを用いたＮ末端Boc保護基の脱ブロッキング(deblocking)およびそれに続く大規模なDMF洗浄で構成されていた。次いでそれぞれのアミノ酸の予め包装された2.0-mmole (4当量)のカートリッジを0.40M HBTUおよびDMF中で溶解させた。それぞれのアミノ酸が完全に溶解した後、その溶液を自動的に活性化容器に移した。DIPEA溶液(ニート)を活性化容器に導入し、延長された期間の間樹脂に曝露した。その反応容器を空にし、樹脂をDMFで洗浄した。Arg/Asnカートリッジに関して、溶解性を確実にするために延長された活性化時間が必要であった。加えて、Gln残基のカップリングの直後に付加されたあらゆるアミノ酸は、脱ブロッキングプロトコルの前および後の両方でDCMにより洗浄された。そのカップリング時間は３０分間であった。表題ペプチド断片に関して以下のアミノ酸を用いた：Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Asp(cHex)-OH、Boc-Glu(cHex)-OH、Boc-Asn(Xan)-OH、Boc-Cys(4Me-Bzl)-OH、Boc-Lys(ClZ)-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Ser(OBzl)-OH、Boc-Thr(OBzl)-OH、およびBoc-Tyr(BrZ)-OH。
【００３６】
最後のカップリングサイクルの後、樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させた。10 mLのフッ化水素およびアニソールによる処理を用いてペプチド断片を脱保護し、樹脂から切り離した。反応を７０分間進行させ、その時点で窒素の流れによりフッ化水素を吹き飛ばした。残留物をエーテルで洗浄し、次いでそのペプチドを10〜15 mlのTFA中で溶解させた。そのTFAを濾過して40 mLの冷エチルエーテルの中に入れ、続いて冷却遠心機(Sorvall Legend RT; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)内で４℃において3000 rpmで３０分間遠心分離することにより、ペプチド断片を沈殿させた。得られたペレットを0.1% TFA水中で溶解させ、C18逆相カラム(Luna、10μｍ、250×21.2 mmカラム)を備えた分取ＨＰＣＬにより、10 mL/分の流速で１２０分間にわたる20〜40％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を利用して精製した。その精製されたペプチド断片を、1 mL/分の流速で３０分間の5〜80％アセトニトリル(0.08% TFA)の勾配を用いるＨＰＬＣ(Luna C18、３μｍ、4.6×100 mmカラム)により、および質量分析(LCQ Advantage; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)により分析した。そのペプチド断片を続いて凍結乾燥させ、将来の使用のために−５０℃で保管した。
【００３７】
Ｃ）一般的なライゲーションの手順
完全長のｈＩＧＦ−１類似体を化学的ライゲーション法により構築し、それはＮ末端のチオエステル断片、例えばhIGF-1(1-47)-S-(CH2)2C(O)-Leu-NH2(SEQ ID NO:52)およびそのＮ末端にシステイン残基を含有するＣ末端の断片、例えば(Gln56、Asn59)hIGF-1(48-70)-OH (SEQ ID NO:51)の間で自然に起こる。
【００３８】
表題ペプチドに関するプロセスを開始するため、5.5 mgのＣ末端ｈＩＧＦ−１断片を、1.5-mLエッペンドルフチューブ中で、ライゲーション緩衝液(200mMリン酸ナトリウム、pH 8.5、6M塩酸グアニジン)中で溶解させた。この溶液に、100μＬのTCEP溶液(40 mg/mL)を添加し、その混合物をボルテックスした。その混合物を、6.5 mgのＮ末端ｈＩＧＦ−１チオエステル断片を含有する２番目のエッペンドルフチューブに移した。反応物を完全に混合した。少量の試料(5μＬ)を取り出し、LC-MS (LCQ Deca XP;Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)により分析した。その反応混合物に、100μＬのMPAA溶液(20 mg/mL)を添加し、続いて混合した。LC-MSを用いて反応の進行を追跡するため、定期的に試料(5μＬ)を抜き取った。おおよそ３．５時間後、その反応がほぼ完了した際に、9.5 mLの0.1% TFA水の添加によりその混合物を停止し(quenched)、希釈した。ライゲーション生成物を、SemiPrep-HPLC (Vydac 218TP101510、C18、10〜15μｍ、10×250 mm)により、5mL/分の流速で４０分間にわたる5〜80％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて精製した。生成物のピークを凍結乾燥し、−５０℃で保管した。フォールディングされていないライゲーション生成物の質量を、物理的測定により決定した。
【００３９】
Ｄ） 実施例１４、すなわち、(Gln56、Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:14)に関する一般的なフォールディングの手順（グルタチオン酸化還元対）
上記の工程Ｃ）のライゲーションプロセスにより調製されたタンパク質を、ライゲーション緩衝液(200mMリン酸ナトリウム、pH 8.5、6M塩酸グアニジン)中で溶解させて1 mg/mLの濃度にした。次いでフォールディング緩衝液(100mMトリス、pH 8.5、1mM酸化型グルタチオン、10mM還元型グルタチオン)を添加して、最終的なタンパク質濃度を0.25 mg/mLにした。３時間かけてフォールディングプロセスを起こさせた。その後、反応混合物がｐＨ３以下に達するまでTFAを滴加することにより、反応を停止した。次いで生成物をSemiPrep-HPLC (Vydac 218TP101510、C18、10〜15μｍ、10×250 mmカラム)により、5 mL/分の流速で４０分間にわたる5〜60％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて精製した。生成物を凍結乾燥した。生成物を0.1% TFA水中で再溶解させ、次いで280 nmの吸光度を測定する(NanoDrop ND1000分光光度計)ことにより、タンパク質含有量を決定した。次いでそのタンパク質をＱＣに関して分析した(HPLCおよびMS)。
【００４０】
Ｅ） 実施例７、すなわち、(Ser-Gly1、Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:7)からの(グリオキシリル(glyoxylyl)-Gly1、Asn59)hIGF-1 (1-70)-OH (SEQ ID NO:53)の形成のための酸化の手順
フォールディングされたｈＩＧＦ−１類似体の質量を、0.1% TFA水中での280 nmの吸光度(NanoDrop ND1000分光光度計)により決定した。上記の工程Ｄ）のフォールディングプロセスにより調製されたタンパク質を50mMイミダゾール緩衝液(pH 7.0)中で再溶解させ、終濃度2 mg/mL (2.66×10-4M)にした。イミダゾール緩衝液中で溶解させた過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4) (4当量)を添加し、得られた溶液を穏やかに混合した。反応を室温で、さらなる撹拌無しで進行させた。５分後、10当量のエチレングリコールの添加により反応を停止した。その混合物を室温で１５分間静置した。その混合物を0.1% TFA水で希釈して10 mLの終体積にした。次いで生成物をSemiPrep-HPLC (Vydac 218TP101510、C18、10〜15μｍ、10×250 mmカラム)により、5 mL/分の流速で４０分間の5〜60％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて精製した。次いで生成物を凍結乾燥し、必要になるまで−５０℃で保管した。
【００４１】
Ｆ） 実施例２７、すなわち、(β-Me-Cys47、Leu59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:19)に関する合成手順
表題タンパク質を、hIGF(1-46)-チオ-プロピオニル-Leu-NH2 (SEQ ID NO:54)およびＣ末端断片、すなわち、(β-Me-Cys47、Leu59)hIGF-1(47-70) (SEQ ID NO:55)を用いた自然な化学的ライゲーションにより組み立てた。タンパク質のチオエステル(7.4 mg、1.45μmole)およびＣ末端断片(3.8 mg、1.38μmole)をライゲーション緩衝液(200mMリン酸ナトリウム中6M塩酸グアニジン、pH 8.5、400μＬ)およびTCEP (80μＬ、40 mg/mL、pH 7)中で溶解させた。MPAA触媒を添加した(80μＬ、20 mg/mL、pH 7)。反応の進行を、Luna C18(2)カラム(5μｍ、4.6×100 mm)を有するLCQ Deca XP LC-MS (Thermo Finnigan)上で、３０分間の5〜80%アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて監視した。dH2O、0.1% TFA (v/v)を用いて反応を停止して1:10希釈した。粗製の混合物を遠心分離し、1.0-μｍガラスフィルターを通過させて全てのMPAA沈殿物を除去した。完全長タンパク質を、Vydac C18 (10μｍ、10×250 mm)上で5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配を用いて精製した。タンパク質をＵＶ分光法(NanoDrop ND1000分光光度計)により定量化し、将来の使用のために凍結乾燥した。
【００４２】
保管したタンパク質(1.8 mg、235 nmole)を、pH 8.5を有する200mM H2PO4-、6Mグアニジウム-HCl溶液中で溶解させて1.0 mg/mLの濃度にした。フォールディング緩衝液(100mMトリス、10mMグルタチオン、1mM酸化型グルタチオン、pH 8.5)をその溶液に、250 μg/mLの最終的なタンパク質濃度が得られるまで添加した。その混合物を室温で保温し、一方でＨＰＬＣにより監視した。（安定したＨＰＬＣプロフィールにより可視化されるように）一度平衡に達したら、酢酸またはTFAのどちらかの中で攪拌して溶液をpH 3にすることにより、反応を停止した。その溶液を、まず1.0-μｍガラスフィルター、次いでセミ分取(semi-preparative)カラムを用いて精製した。
【００４３】
そのフォールディングされたタンパク質を、5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配を用いて精製した。タンパク質をＵＶにより定量化し(NanoDrop ND1000分光光度計)、凍結乾燥した。おおよそ92μｇの精製された生成物が得られ、これは5％の収率に相当する。タンパク質の質量をFinnigan LCQ Advantage MAX MSで確かめた。
【００４４】
Ｇ） 実施例３６、すなわち、(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:28)に関する合成手順
表題タンパク質を、hIGF-1(1-47)-チオ-プロピオニル-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52)およびＣ末端断片、すなわち、(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(48-70) (SEQ ID NO:56)を用いた自然な化学的ライゲーションを利用して組み立てた。タンパク質のチオエステル(4.3 mg、824 nmole)およびＣ末端断片(2.1 mg、790 nmole)をライゲーション緩衝液(400μＬ、200mMリン酸ナトリウム中6M塩酸グアニジン、pH 8.5)およびTCEP (80μＬ、40 mg/mL、pH 7)中で溶解させた。MPAA触媒を添加した(80μＬ、20 mg/mL、pH 7)。反応の進行を、３０分間の5〜80%アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を有する、Luna C18(2)カラム(5μｍ、4.6×100 mm)を有するFinnigan LCQ Deca XP LC-MSを用いて監視した。dH2O、0.1% TFA (v/v)を用いて反応を停止して1:10希釈した。粗製の混合物を遠心分離し、1.0μｍガラスフィルターを通過させて全てのMPAA沈殿物を除去した。完全長タンパク質を、Vydac C18 (10μｍ、10×250 mm)を用いて、5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配で精製した。タンパク質をＵＶにより定量化し(NanoDrop ND1000分光光度計)、将来の使用のために凍結乾燥した。
【００４５】
保管したタンパク質を、200mM H2PO4-、6Mグアニジウム-HCl溶液(pH 8.5)を用いて、1.0 mg/mLの濃度が得られるまで溶解させた。フォールディング緩衝液(100mMトリス、10mMグルタチオン、1mM酸化型グルタチオン、pH 8.5)をその溶液に、250 μg/mLの最終的なタンパク質濃度が得られるまで添加した。その混合物を室温で保温し、一方でＨＰＬＣにより監視した。（安定したＨＰＬＣプロフィールにより可視化されるように）一度平衡に達したら、酢酸またはTFAのどちらかを用いて反応を停止し、pH 3にした。その溶液を、まず1.0-μｍガラスフィルター、次いでセミ分取カラムを用いて精製した。
【００４６】
そのフォールディングされたタンパク質を、5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配を用いて精製した。タンパク質をＵＶにより定量化し(NanoDrop ND1000分光光度計)、凍結乾燥した。おおよそ0.415 mgの精製された生成物が得られ、これは10.6％の収率に相当する。タンパク質の質量をFinnigan LCQ Advantage MAX MSで確かめた。
【００４７】
当業者は、本発明の他のペプチドを、上記の実施例で開示された合成手順に類似した合成手順を用いて調製することができる。本明細書において例示されている化合物に関する物理的データを表１に示す。
【００４８】
表１
【００４９】
【表１−１】
【００５０】
【表１−２】
【００５１】
機能アッセイ
Ａ）インビトロＩＧＦ−１受容体結合アッセイ
天然のＩＧＦ−１受容体を発現するヒトMCF-7細胞の、20 mlの氷冷した50mM Tris-HCl中でのBrinkman Polytron (米国ニューヨーク州ウエストバリー)を用いたホモジナイゼーション(設定6、15秒間)により、放射性リガンド結合試験のための膜を調製した。ホモジネートを遠心分離(39,000 g / 10分間)により２回洗浄し、最終的なペレットを2.5mM MgCl2および0.1% BSAを含有する50mM Tris-HCl中で再懸濁した。
【００５２】
アッセイのため、分割量(aliquots)を0.05nM [125I]IGF-1と共に保温した。時には未標識の競合する試験ペプチドが含まれた。最終的なアッセイ体積は0.25 mlであった。120分間の保温(20℃)期間の後、結合した[125I]IGF-1(約2000 Ci/mmol、Perkin Elmer Life Sciences、米国マサチューセッツ州ボストン)を、3000 rpmで１０分間の遠心分離により、遊離の放射性粒子から分離した。上清をデカントし、ペレット中に捕えられた放射性粒子をガンマ分光法(Wallac LKB、米国メリーランド州ゲイザースバーグ)により計数した。特異的な結合を、結合した総[125I]IGF-1から100nM IGF-1の存在下で結合した[125I]IGF-1を引いたものとして定義した。
【００５３】
本明細書で例示した化合物に関するインビトロＩＧＦ−１受容体結合データ（すなわちIC50値）を表２に示す。
Ｂ）インビトロＩＧＦ−１生理活性アッセイ
マウス3T3/R細胞（米国カリフォルニア州ロサンゼルスにあるUCLAのDr. E. Rozengurtから得た）を２４ウェルプレートで培養し(DMEM + 10% FCS)、２日間培養状態を維持した。
【００５４】
アッセイのため、培地を除去し、血清を含まないDMEMで１回洗浄した。次いで２４時間血清を欠乏させた。欠乏の後、[3H]チミジンおよびＩＧＦ−１ペプチドを添加した。次いで細胞を３７℃で２４時間培養した。
【００５５】
培養の終了時点で、培地を吸引した。次いで細胞を氷冷した0.9% NaCl溶液で洗浄した。次いで氷冷した5% TCA溶液を添加し、４℃で３０分間保温した。TCAを吸引し、ウェルを95%エタノールと共に４時間保温した。次いで培地を放射活性計数のために液体シンチレーションバイアルに移した。
【００５６】
本明細書において例示されている化合物に関するインビトロＩＧＦ−１生理活性データ（すなわち、EC50値）も表２に示す。
Ｃ）U2OS細胞におけるインスリン受容体交差反応性に関するＩＧＦ−１ペプチドのインビトロスクリーニング
U2OS細胞(カタログ# 93-0466C3、DiscoveRX Corporation、米国カリフォルニア州フリモント)を、アッセイの１６時間前に、９６ウェルポリ-D-リシンプレートにおいて血清を含まないアッセイ培地中で6×105細胞/mLで蒔いた。野生型インスリン(カタログ# 10908、Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)、野生型ＩＧＦ−１(Increlex（登録商標）、Tercica、Inc.、米国カリフォルニア州ブリスベーン)、または本出願で開示した試験ＩＧＦ−１ペプチドを、10μＭ(マイクロモーラー)〜0.15ｎｍ(ナノモーラー)の用量範囲で添加し、５％ＣＯ２で３７℃において３時間培養した。PathHunter（商標）試薬(カタログ# 93-001、DiscoveRX)を製造業者の説明書に従って調製し、それぞれのウェルに添加した。プレートを室温で１時間保温した。Envision 2104マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer、Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム)上で発光を読み取った。それぞれの試験ペプチドの活性を分析し、最大／最小（最大／最小）値として報告した。本明細書において例示されている化合物に関するインビトロインスリン受容体交差反応性データ（すなわち最大／最小値）も表２に示す。
【００５７】
本明細書において例示されている化合物の多くが、4.59 nMのIC50値、3.75 nMのEC50値、および2.1の最大／最小値を有する野生型ＩＧＦ−１よりも有意に強力であることが分かった。
【００５８】
表２
【００５９】
【表２−１】
【００６０】
【表２−２】
【００６１】
投与
この発明のＩＧＦ−１の類似体は、医薬的に許容できる塩類の形で提供することができる。そのような塩類の例には、有機酸（例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはパモ酸(pamoic acid)）、無機酸（例えば塩酸、硫酸、またはリン酸）およびポリマー性の酸（例えばタンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー類）により形成される塩類が含まれるが、それらに限定されない。
【００６２】
本発明のペプチドの塩を作る典型的な方法は当技術で周知であり、標準的な塩交換の方法により成し遂げることができる。例えば、本発明のペプチドのTFA塩（TFA塩は分取HPLCを用いてTFAを含有する緩衝溶液で溶離することによるペプチドの精製の結果得られる）は別の塩に、例えばそのペプチドを少量の0.25 N酢酸水溶液中で溶解することにより酢酸塩に変換された。得られた溶液をSemiPrep HPLCカラム(Zorbax, 300 SB, C-8)に適用する。そのカラムを、（１）0.1N酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）0.25N酢酸水溶液で０．５時間、および（３）4 ml/分の流速における直線勾配(３０分間にわたる20%〜100%の溶液B）（溶液Aは0.25 N酢酸水溶液であり、溶液Bは80：20比率のアセトニトリル/水中0.25 N酢酸である）を用いて溶離する。ペプチドを含有する画分を集め、凍結乾燥させる。
【００６３】
この発明の組成物中の有効成分の用量は異なっていてよい；しかし、有効成分の量は適切な剤形が得られるようなものである必要がある。選択される用量は、望まれる療法的作用に、投与経路に、および処置の期間に依存する。投与は熟練した有能な医師により容易に決定される。
【００６４】
この発明の化合物は、経口、非経口（例えば筋内、腹膜内、静脈内または皮下の注射、または埋め込み）、経鼻、膣内、直腸内、舌下、または局所的投与経路により投与することができ、それぞれの投与経路に適した剤形を提供するために医薬的に許容できるキャリヤーと共に配合することができる。
【００６５】
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、有効化合物は少なくとも１種類の不活性な医薬的に許容できるキャリヤー、例えばスクロース、ラクトースまたはデンプンと混合される。そのような剤形はそのような不活性な希釈剤以外の追加の物質、例えば潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも含むことができ、それが通常の慣習である。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その剤形は緩衝剤も含んでいてよい。錠剤および丸剤はさらに腸溶コーティングを用いて調製することができる。
【００６６】
経口投与のための液体剤形には、当技術で一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水を含有する、医薬的に許容できる乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルおよび同様のものが含まれるが、それらに限定されない。そのような不活性な希釈剤の他に、組成物は補助剤、例えば湿潤剤、乳濁化および懸濁化剤、ならびに甘味料、香味料および香料も含むことができる。
【００６７】
非経口投与のためのこの発明に従う製剤には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、乳濁液および同様のものが含まれるが、それらに限定されない。非水性溶媒またはビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油およびトウモロコシ油、ゼラチン、ならびに注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルが含まれる。そのような剤形は補助剤、例えば保存、湿潤、乳濁化および分散剤も含んでいてよい。製剤は例えば細菌を保持するフィルターを通す濾過により、組成物に滅菌剤を組み込むことにより、組成物を照射することにより、および／または組成物を加熱することにより滅菌されてよい。本明細書で記述した新規ＩＧＦ−１類似体を含有する医薬組成物は、滅菌水または何らかの他の無菌の注射可能な媒体に使用の直前に溶解させることができる無菌の固体組成物の形で製造することもできる。
【００６８】
直腸内または膣内投与のための組成物は好ましくは坐剤であり、それは有効物質に加えて賦形剤、例えばカカオ脂(coca butter)または坐剤ワックスを含有していてよい。
経鼻または舌下投与のための組成物も、当技術で周知の標準的な賦形剤を用いて調製される。
【００６９】
さらに、この発明の化合物は徐放性組成物、例えば下記の特許および特許出願において記述されている徐放性組成物で投与することができる。米国特許第５，６７２，６５９号は、生理活性薬剤およびポリエステルを含む徐放性組成物を教示する。米国特許第５，５９５，７６０号は、生理活性薬剤をゲル化可能な(gelable)形で含む徐放性組成物を教示する。米国特許第５，８２１，２２１号は、生理活性薬剤およびキトサンを含むポリマー性徐放性組成物を教示する。米国特許第５，９１６，８８３号は、生理活性薬剤およびシクロデキストリンを含む徐放性組成物を教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３８５３６号は、生理活性薬剤の吸収性徐放性組成物を教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０４９１６号は、療法剤、例えばペプチドを含む微粒子を水中油プロセスで作るためのプロセスを教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９１６６号は、療法剤、例えばペプチドおよびリン酸化ポリマーを含む複合体を教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２５８２６号は、療法剤、例えばペプチドおよび重合可能ではないラクトンを有するポリマーを含む複合体を教示する。
【００７０】
さらに、米国特許第７，２５８，８６４号において開示されている発明は、インスリン様増殖因子−１欠損症（ＩＧＦＤ）を有する対象を処置するための方法であって、ヒトの小児の対象に有効量の修飾されていないＩＧＦ−１を投与することを含む方法を特徴とし、ここで、その対象は以下のように特性付けられ：ａ）ＩＧＦ−１による処置の時点で、またはＩＧＦ−１による最初の処置の前に、対応する年齢および性別に関する通常の平均値よりも少なくとも約２標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびにｂ）ＩＧＦ−１による処置の時点で、またはＩＧＦ−１による最初の処置の前に、通常の平均レベルの少なくとも約−１ＳＤ下のＩＧＦ−１の血中レベルを有している、または有していた；ここで、その対象はラロン症候群または部分的成長ホルモン不感性症候群を有しておらず、ここで、前記の投与はその対象においてＩＧＦＤを処置するのに有効である。
【００７１】
同様に、ＷＯ２００６／１３０７６９において開示されている発明は、特発性低身長（ＩＳＳ）を有する対象を処置するための方法であって、部分的な内因性成長ホルモン活性またはシグナル伝達により特性付けられるＩＳＳを患うヒトの小児の対象にその対象において成長を促進するのに有効な量のＩＧＦ−１を投与することを含む方法を特徴とし、ここで、その対象はさらに以下のように特性付けられる：ａ）ＩＧＦ−１による処置の時点で、またはＩＧＦ−１による最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関する通常の平均身長よりも少なくとも約２．０標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびにｂ）同じ年齢および性別の対象に関して少なくとも通常であるＧＨおよびＩＧＦ−１の血中レベルを有している。
【００７２】
さらに、本明細書で開示した新規類似体は単独で、または熟練した医師により決定される別の療法剤との組み合わせで投与することができる。
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語はこの発明が属する技術の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。また、本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献をそれぞれそのまま本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）の新規類似体、前記の類似体を含有する医薬組成物、ならびにＩＧＦ−１受容体に仲介される病気、例えば低身長の処置、糖尿病療法、神経変性疾患の処置、および軟骨の修復のための前記の類似体の使用に関する。より詳細には、本発明は５９位にアミノ酸置換を有するＩＧＦ−１の新規類似体、例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH、および本明細書で定められる他の置換（単数または複数）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＧＦ−１は、インスリン様および分裂促進的増殖の生物学的活性を有する７０アミノ酸のポリペプチドホルモンである。このホルモンは、筋骨格系、肝臓、腎臓、腸、神経系組織、心臓、および肺を含む様々な組織において細胞の増殖を増進する。
【０００３】
野生型ＩＧＦ−１は、３個の鎖内ジスルフィド架橋を有する次のアミノ酸配列を有し、ここで残基対A6およびA48、A47およびA52、ならびにA18およびA61の側鎖はそれぞれジスルフィド結合を形成している(SEQ ID NO:50)：
【０００４】
【化１】
【０００５】
ＩＧＦ−１は多種多様な体組織に存在するが、それは通常はそれがＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に結合した不活性な形で見付かる。６種類の関連するＩＧＦＢＰが知られており、ＩＧＦＢＰ１〜ＩＧＦＢＰ６と名付けられている。例えば、Holly and Martin, “インスリン様増殖因子結合タンパク質：それらの精製、分析および制御の方法論的観点の総説” Growth Regul., 4(補遺1):20-30 (1994)を参照。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−１の作用に対して阻害性および／または刺激性の作用を及ぼすことにより、ＩＧＦ−１の制御において重要な役割を果たしている。例えば、循環するＩＧＦ−１の約９０％はＩＧＦＢＰ−３および酸に不安定なサブユニット(submit)を含有する３分子複合体で存在する。そのような複合体内のＩＧＦ−１は表面受容体に結合することができず、従って生物学的に不活性である。また、３分子複合体内に存在するＩＧＦ−１は複合体化していないＩＧＦ−１よりも実質的に長い半減期を有する。
【０００６】
ＩＧＦ−１の作用の混乱は、神経変性障害、例えば運動ニューロン疾患（すなわち、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、）筋ジストロフィーおよび多発性硬化症、軟骨障害、例えば骨関節炎、骨疾患、例えば骨粗鬆症、炎症性障害、例えばリウマチ性関節炎、器官に対する、例えば心臓、脳、または肝臓に対する虚血傷害等を含む多くの生理障害の一因となっている可能性がある。
【０００７】
当業者には周知であるように、ＩＧＦ−１の既知の、および可能性のある用途は様々であり、多数である。例えば、いくつかの研究は、神経変性の病気の処置のための可能性のある療法剤としてのＩＧＦ−１の用途に関して報告している。例えば、Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989); Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995); Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997); Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997); Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998)を参照。ＩＧＦ−１療法は、ＡＬＳ、発作、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、急性外傷性傷害および外傷、老化、疾患、または傷害と関係する他の障害を含む多数の神経学的な病気において示されてきた。例えば米国特許第５，０９３，１３７号；第５，６５２，２１４号；第５，７０３，０４５号；国際公開番号ＷＯ９０／１４８３およびＷＯ９３／０２６９５を参照。
【０００８】
様々な他の病気に関するＩＧＦ−１療法の使用が多くの刊行物において言及されてきた。例えば、Schalch et al., “Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors”、Spencer編(Elsevier、ニューヨーク), pp. 705-714 (1991); Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994);およびLangford et al., Eur. J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993)（例えばインスリン抵抗性状態および糖尿病に言及している）;およびO’Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993)（例えば低減した腎機能に言及している）を参照。米国特許第７，２５８，８６４号（低身長に言及している）；米国特許第５，１１０，６０４号および米国特許第５，４２７，７７８号（傷の治癒に言及している）；米国特許第５，１２６，３２４号（心臓障害および成長遅延に言及している）；米国特許第５，３６８，８５８号（例えば軟骨の欠陥または病変に言及している）；米国特許第５，５４３，４４１号および米国特許第５，５５０，１８８号（組織の増大に言及している）；米国特許第５，６８６，４２５号（例えば瘢痕組織、局在型の筋機能障害、および尿失禁に言及している）；ならびに米国特許第５，６５６，５９８号（例えば骨の成長に言及している）も参照。国際公開番号ＷＯ９１／１２０１８（例えば腸障害に言及している）；ＷＯ９２／０９３０１およびＷＯ９２／１４４８０（例えば傷の治癒に言及している）；ＷＯ９３／０８８２８（例えば虚血、低酸素症、または神経変性と関係するニューロンの損傷に言及している）；ＷＯ９４／１６７２２（例えばインスリン抵抗性に言及している）；ＷＯ９６／０２５６５Ａ１（例えば骨形成の促進に関する、および骨再形成の制御に関するＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ複合体に言及している）；米国特許出願公開番号２００３／０１００５０５（例えば骨粗鬆症に言及している）；ならびに米国特許出願公開番号２００５／００４３２４０（肥満に言及している）も参照。
【０００９】
ＩＧＦ−１療法は多くの生理学的適応に関して用いられてきたが、結果は時々予測不能であった。短期の有益な作用は時々持続せず（例えばMiller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)参照）、特に高い用量および／または長期の投与の結果として望ましくない副作用がもたらされる可能性がある（例えばJabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994);Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)参照）。高レベルのＩＧＦ−１は前立腺癌の危険性を増大させることも報告されている（Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)）。
【００１０】
従って、当技術において、ＩＧＦ−１および／またはインスリン様増殖因子結合タンパク質に結合する他のタンパク質に応答性の病気を処置するためのよりよい方法に関する必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，０９３，１３７号
【特許文献２】米国特許第５，６５２，２１４号
【特許文献３】米国特許第５，７０３，０４５号
【特許文献４】国際公開番号ＷＯ９０／１４８３
【特許文献５】国際公開番号ＷＯ９３／０２６９５
【特許文献６】米国特許第７，２５８，８６４号
【特許文献７】米国特許第５，１１０，６０４号
【特許文献８】米国特許第５，４２７，７７８号
【特許文献９】米国特許第５，１２６，３２４号
【特許文献１０】米国特許第５，３６８，８５８号
【特許文献１１】米国特許第５，５４３，４４１号
【特許文献１２】米国特許第５，５５０，１８８号
【特許文献１３】米国特許第５，６８６，４２５号
【特許文献１４】米国特許第５，６５６，５９８号
【特許文献１５】国際公開番号ＷＯ９１／１２０１８
【特許文献１６】国際公開番号ＷＯ９２／０９３０１
【特許文献１７】国際公開番号ＷＯ９２／１４４８０
【特許文献１８】国際公開番号ＷＯ９３／０８８２８
【特許文献１９】国際公開番号ＷＯ９４／１６７２２
【特許文献２０】国際公開番号ＷＯ９６／０２５６５Ａ１
【特許文献２１】米国特許出願公開番号２００３／０１００５０５
【特許文献２２】米国特許出願公開番号２００５／００４３２４０
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Holly and Martin, “インスリン様増殖因子結合タンパク質：それらの生成、分析および制御の方法論的観点の総説” Growth Regul., 4(補遺1):20-30 (1994)
【非特許文献２】Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989)
【非特許文献３】Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995)
【非特許文献４】Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995)
【非特許文献５】Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996)
【非特許文献６】Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997)
【非特許文献７】Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997)
【非特許文献８】Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998)
【非特許文献９】Schalch et al., “Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors”、Spencer編(Elsevier、ニューヨーク), pp. 705-714 (1991)
【非特許文献１０】Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994)
【非特許文献１１】Langford et al., Eur. J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993)
【非特許文献１２】O’Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993)
【非特許文献１３】Miller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)
【非特許文献１４】Jabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994)
【非特許文献１５】Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)
【非特許文献１６】Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)
【発明の概要】
【００１３】
本発明の発明者らにより発見されたように、化学的に不安定であり、容易に酸化され得る野生型ＩＧＦ−１の５９位のメチオニン残基を本明細書で記述するように他のアミノ酸で置き換えることにより（例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH）、結果として得られるＩＧＦ−１の類似体は化学的により安定であり、従って生成、精製、保管等の間により酸化を受けにくい。
【００１４】
１観点において、本発明は次の式（Ｉ）のＩＧＦ−１のペプチド変種（すなわち類似体）に向けられており、
H-A-1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59-A60-A61-A62-A63-A64-A65-A66-A67-A68-A69-A70-A71-R1
（Ｉ）
ここで:
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A2はPro、Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、Lysであり、または欠失しており;
A3はGlu、Ala、Asp、Glnであり、または欠失しており;
A4はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Serであり;
A5はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A6はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A7はGly、Ala、Asn、Asp、GlnまたはGluであり;
A8はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A9はGlu、Ala、Asp、またはGlnであり;
A10はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A11はVal、Ala、Ile、またはLeuであり;
A12はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A13はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A14はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A15はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A16はPhe、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Trp、またはTyrであり;
A17はVal、Ala、IleまたはLeuであり;
A18はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A19はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A20はAsp、Ala、Asn、Gln、またはGluであり;
A21はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A22はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A23はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A24はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A25はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A26はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Ser、またはThrであり;
A27はLys、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはProであり;
A28はPro、Ala、Arg、またはLysであり;
A29はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A30はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A31はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A32はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A33はSer、Ala、Thr、またはValであり;
A34はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A35はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A36はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A37はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A38はAla、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A39はPro、Ala、Arg、またはGluであり;
A40はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A41はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A42はGly、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A43はIle、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A44はVal、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはLysであり;
A45はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A46はGlu、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A47はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A48はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A49はPhe、Ala、Arg、Ile、Leu、Lys、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A50はArg、Ala、Lys、Ser、またはThrであり;
A51はSer、Aib、Ala、Arg、Lys、またはThrであり;
A52はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A53はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Lys、Ser、またはThrであり;
A54はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A55はArg、Ala、Ile、Leu、Lys、Phe、Trp、Tyr、またはValであり;
A56はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A57はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A58はGlu、Acc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A59はAcc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Nle、Ser、D-Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A60はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A61はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A62はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A63はPro、D-Pro、Ala、Ser、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leu、Ala、Ile、Valであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Pro、Alaであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Ala、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A71はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Lys、Ser、Thrであり、または欠失しており；そして
R1はOHまたはNH2であり;
ただし、
残基対A6およびA48、A47およびA52、ならびにA18およびA61の側鎖はそれぞれジスルフィド結合を形成しており；そして
さらに、A59がLeu、Ile、Nle、Thr、またはValのいずれかである場合、その類似体は本明細書で定めるような少なくとも１個の追加のアミノ酸置換または付加を含有する。
【００１５】
式（Ｉ）において、好ましいアミノ酸置換および付加は以下のように定められる：
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGlyであり、または欠失しており;
A2はPro、Lysであり、または欠失しており;
A3はGluであり、または欠失しており;
A4はThrであり;
A5はLeuであり;
A6はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A7はGlyであり;
A8はAlaであり;
A9はGluであり;
A10はLeuであり;
A11はValであり;
A12はAspであり;
A13はAlaであり;
A14はLeuであり;
A15はGlnであり;
A16はPheであり;
A17はValであり;
A18はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A19はGlyであり;
A20はAspであり;
A21はArgであり;
A22はGlyであり;
A23はPheであり;
A24はTyrであり;
A25はPheであり;
A26はAsnであり;
A27はLys、Arg、またはProであり;
A28はProまたはLysであり;
A29はThrであり;
A30はGlyであり;
A31はTyrであり;
A32はGlyであり;
A33はSerであり;
A34はSerであり;
A35はSerであり;
A36はArgであり;
A37はArgであり;
A38はAlaであり;
A39はProであり;
A40はGlnであり;
A41はThrであり;
A42はGlyであり;
A43はIleであり;
A44はValであり;
A45はAspであり;
A46はGluであり;
A47はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A48はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A49はPhe、Arg、Leu、またはThrであり;
A50はArgまたはSerであり;
A51はSer、Aib、Arg、またはThrであり;
A52はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A53はAsp、Arg、またはSerであり;
A54はLeuまたはA6cであり;
A55はArgまたはTyrであり;
A56はArgまたはGlnであり;
A57はLeuであり;
A58はGluまたはArgであり;
A59はA6c、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Nle、Ser、D-Ser、Trp、またはTyrであり;
A60はTyrまたはPheであり;
A61はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A62はAlaまたはAsnであり;
A63はPro、D-Pro、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leuであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Argであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Proであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Argであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Gluであり、または欠失しており；そして
A71はAsp、Glu、Lys、Serであり、または欠失している。
【００１６】
式（Ｉ）に含まれる化合物の部分集合は、A59がAsnである化合物を含む。
式（Ｉ）に含まれる化合物の別の部分集合は、A59がLeuである化合物を含み、ここで前記の化合物はArg27、Arg65、Arg68、Leu49、β-Me-Cys47、β-Me-Cys52、Thr51、Thr69、Asp71、Glu71、Lys71、およびSer71からなるグループから選択される少なくとも１個の追加のアミノ酸置換または付加を含有する。
【００１７】
式（Ｉ）に含まれる化合物のさらに別の部分集合は、A59がNleである化合物を含み、ここで前記の化合物はAib51、Aib67、Aib69、A6c54、N-Me-Cys47、N-Me-Cys48、Pen52、およびPen61からなるグループから選択される少なくとも１個の追加のアミノ酸置換を含有する。
【００１８】
式（Ｉ）に含まれる化合物のさらに別の部分集合は、A59がIleである化合物を含み、ここで前記の化合物はArg58、Arg49、Arg51、およびArg53からなるグループから選択される少なくとももう１個のアミノ酸置換を含有する。
【００１９】
式（Ｉ）に含まれる化合物のさらに別の部分集合は、A59がArg、Asp、A6c、Gln、Glu、Ser、Trp、またはTyrである化合物を含む。
式（Ｉ）の好ましい化合物は以下のものである：
実施例１： (Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)
実施例２： (Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)
実施例３： (Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)
実施例４： (Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)
実施例５： (Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)
実施例６： (Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)
実施例７： (Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)
実施例８： (Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
実施例９： (Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)
実施例１０： (Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)
実施例１１： (Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)
実施例１２： (Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)
実施例１３： (Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)
実施例１４： (Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)
実施例１５： (Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１６： (Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１７： (Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１８： (Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例１９： (Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２０： (Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２１： (Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２２： (Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;
実施例２３： (Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
実施例２４： (Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
実施例２５： (Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
実施例２６： (β-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
実施例２７： (β-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
実施例２８： (Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
実施例２９： (Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
実施例３０： (Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
実施例３１： (Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
実施例３２： (Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)
実施例３３： (Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
実施例３４： (N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
実施例３５： (Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
実施例３６： (N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
実施例３７： (Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
実施例３８： (hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
実施例３９： (Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
実施例４０： (Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
実施例４１： (Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)
実施例４２： (A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
実施例４３： (Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
実施例４４： (Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
実施例４５： (Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)
実施例４６： (Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
実施例４７： (A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
実施例４８： (Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
実施例４９： (Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)
実施例５０： (Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)
実施例５１： (Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
実施例５２： (Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
実施例５３： (Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)
実施例５４： (Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46)および
実施例５５： (Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:47)。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本出願は以下の一般に理解されている略語を用いる：
Acc: 1-アミノ-1-シクロ(C3-C9)アルキルカルボン酸
Accには以下のものが含まれる:
A3c: 1-アミノ-1-シクロプロパンカルボン酸
A4c: 1-アミノ-1-シクロブタンカルボン酸
A5c: 1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸
A6c: 1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸
Aib: α-アミノイソ酪酸
AlaまたはA: アラニン
ArgまたはR: アルギニン
AsnまたはN: アスパラギン
AspまたはD: アスパラギン酸
CysまたはC: システイン
シスチン: システインのジスルフィド２量体
hCys: ホモシステイン
β-Me-Cys: ベータ-メチル-システイン、すなわち、(2S, 3S)-2-アミノ-3-メルカプト酪酸
N-Me-Cys: N-メチル-システイン
GlnまたはQ: グルタミン
GluまたはE: グルタミン酸
GlyまたはG: グリシン
IleまたはI: イソロイシン
LeuまたはL: ロイシン
des-Leu: 欠失したLeu
LysまたはK: リシン
des-Lys: 欠失したLys
MetまたはM: メチオニン
Nle: ノルロイシン
Pen: ペニシラミン
PheまたはF: フェニルアラニン
ProまたはP: プロリン
SerまたはS: セリン
ThrまたはT: スレオニン
TrpまたはW: トリプトファン
TyrまたはY: チロシン
ValまたはV: バリン。
【００２１】
この開示における全てのアミノ酸の略語（例えばAla）は-NR-CR’(R”)-CO-の構造を表しており、ここでR’およびR”はそれぞれ独立して水素またはアミノ酸の側鎖（例えば、Alaに関してはR’ = HおよびR” = CH3）であり、ここで、プロリン、すなわち
【００２２】
【化２】
【００２３】
を除いてR = HまたはCH3である。
この発明のペプチドは別の形式、例えば(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:1)によっても表され、それはカッコの間に置かれた天然の配列から置換されたアミノ酸（すなわち、野生型ＩＧＦ−１の５９位のMetの代わりにAsn）を有する。カッコ内に見出される範囲は、その類似体において見出されるアミノ酸を表す。例えば、“IGF-1(4-68)-OH”(SEQ ID NO:48)は、その類似体が野生型ＩＧＦ−１に関するペプチド配列に対応するアミノ酸４〜６８で構成されることを示す。“IGF-1(1-70)-NH2”(SEQ ID NO:49)における“NH2”は、そのペプチドのＣ末端がアミド化されていることを示す。“IGF-1(1-70)”または“IGF-1(1-70)-OH”は、そのＣ末端が遊離酸であることを示す(SEQ ID NO:50)。
【００２４】
本明細書において用いられる特定の他の略語を以下のように定義する：
Act: アセトニトリル
Boc: tert-ブチルオキシカルボニル
BSA: ウシ血清アルブミン
DCM: ジクロロメタン
DIPEA: ジイソプロピルエチルアミン
DMEM: ダルベッコ変法イーグル培地
DMF: ジメチルホルムアミド
DTT: ジチオスレイトール(dithiothrieitol)
ESI: エレクトロスプレーイオン化
FCS: ウシ胎児血清
Fmoc: 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HBTU: 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
HOBt: N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC: 高速液体クロマトグラフィー
LC-MS: 液体クロマトグラフィー質量分析
MPAA: 4-メルカプトフェニル酢酸
NMP: N-メチルピロリジノン
OtBu: O-tert-ブチルエステル
Pbf: 2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
QC: 品質管理
tBu: tert-ブチル
TCA: トリクロロ酢酸
TCEP トリス-2-カルボキシエチル-ホスフィン
TIS: トリイソプロピルシラン
TFA: トリフルオロ酢酸
Tris: 2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-1,3-プロパンジオール
Trt: トリチル
UV分光法: 紫外分光法。
【００２５】
“アルキル”は１個以上の炭素原子を含有する炭化水素基を指し、ここで多数の炭素原子は、もし存在するならば、単結合によりつながっている。その例にはメチル、エチル、プロピル、およびブチルが含まれるが、それらに限定されない。アルキル炭化水素基は直鎖であってよく、または１個以上の分枝もしくは環式基を含有していてよく、その例にはイソプロピルおよびtertブチルが含まれるが、それらに限定されない。
【００２６】
“置換されたアルキル”は、炭化水素基の１個以上の水素原子が、ハロゲン、OH、CN、SH、NH2、NHCH3、NO2、１〜６個のハロゲンで置換された(C1-2)アルキル、CF3、OCH3、OCF3、および(CH2)0-4-COOHからなるグループから選択される１個以上の置換基で置き換えられているアルキルを指す。異なる態様において、１、２、３または４個の置換基が存在する。
【００２７】
“アリール”は、共役パイ電子系を有する少なくとも１個の環を有し、３個までの共役した、または縮合した環系を含有する、場合により置換された芳香族基を指す。アリールには炭素環式アリール、ヘテロ環式アリールおよびビアリール基が含まれる。好ましくは、アリールは５または６員環である。ヘテロ環式アリールに関して好ましい原子は、１個以上の硫黄、酸素および／または窒素である。アリールの例には、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、インドール、キノリン、2-イミダゾール、および9-アントラセンが含まれる。アリールの置換基は、-C1-20アルキル、-C1-20アルコキシ、ハロゲン、-OH、-CN、-SH、-NH2、-NO2、ハロゲンで置換された-C1-20アルキル、-CF3、-OCF3、および-(CH2)0-20-COOHからなるグループから選択される。異なる態様において、アリールは０、１、２、３または４個の置換基を含有する。
【００２８】
“アルキル−アリール”は、“アリール”に結合した“アルキル”を指す。
合成手順
本発明の例示したＩＧＦ−１の類似体は、第１工程であるペプチド断片合成、第２工程であるライゲーション、および第３工程であるフォールディングにより調製された。以下の合成手順は、どのようにして熟練した化学者が本発明の例示したＩＧＦ−１の類似体のいずれか１種類を調製することを可能にするかを説明する。
【００２９】
Ａ） (Gln56、Asn59)hIGF-1(48-70)-OH、すなわち、Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Arg-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-OH (SEQ ID NO:51)のペプチド断片合成
Fmocに基づく固相ペプチド合成を用いて、Liberty Peptide Synthesizer (CEM；米国ノースキャロライナ州マシューズ)上で、マイクロ波支援を用いて表題のペプチド断片を組み立てた。最初の１４残基の断片、すなわち、ｈＩＧＦ−１の残基５７〜７０、またはＣ末端酸ペプチドを、Fmoc-Ala-Wang樹脂(0.72 meq/g)を用いて0.1 mmoleスケールで合成した。次いで得られたペプチド断片を、伸長および識別のために、４つの0.25 mmoleのバッチに分けた。1.36 gの樹脂試料を50-mLコニカルチューブの中に、15 mLのDMFおよびDCMの１：１溶液と共に置き、それを合成機中の所定の位置の中に入れた。次いでその樹脂を、合成機の自動化されたプロセスにより反応容器に移した。1.0-mmoleスケールでの合成のための標準的なLibertyプロトコルを用いた。そのプロトコルには、DMF中の0.1M HOBtを含有する20% ピペリジン20 mLを用いた処理によるＮ末端のFmoc保護基の除去が含まれていた。マイクロ波電力（４５ワット、最大温度７５℃）および窒素による泡立て（３秒間オン、７秒間オフ）の最初の脱保護の工程は３０秒間続いた。反応容器から液体を排出し(drained)、DMFで数回、完全に洗浄した。次いで、成長するペプチドに添加される次のアミノ酸（サイクル１）である、DMF中0.2Mのストック溶液として調製された(Fmoc-Ser(tBu)-OH)を添加した(15 mL、3当量)。6.0 mLのDMF中0.45M (3当量)HBTUを添加し、続いて3.0 mLのNMP中2M (6当量) DIPEAを添加した。カップリングの工程は、マイクロ波電力（２０ワット、最大温度７５℃）および脱保護工程におけるものと同程度の窒素による泡立てを用いて５分間の期間の間行った。次いで反応容器から液体を排出して廃棄し、カップリングの工程を繰り返した。
【００３０】
Fmoc-Cys(Trt)-OHに関するカップリングプロトコルは、標準的なプロトコルをわずかに修正したバージョンであった。Cys残基に関して、最初の２分間はマイクロ波を適用しなかった。続いて４分間のマイクロ波のセッション（２０ワット、最大温度５０℃）を行った。シークエンス全体を通して二重カップリングの方法を用いて、全てのアミノ酸を同様に導入した。表題ペプチド断片に関する最初のSerに続く合成サイクルは以下の通りであった：サイクル2、Fmoc-Lys(Boc)-OH; サイクル3、Fmoc-Ala-OH; サイクル4、Fmoc-Pro-OH; サイクル5、Fmoc-Lys(Boc)-OH; サイクル6、Fmoc-Leu-OH; サイクル7、Fmoc-Pro-OH; サイクル8、Fmoc-Ala-OH; サイクル9、Fmoc-Cys(Trt)-OH; サイクル10、Fmoc-Tyr(tBu)-OH; サイクル11、Fmoc-Asn(Trt)-OH; サイクル12、Fmoc-Glu(OtBu)-OH;およびサイクル13、Fmoc-Leu-OH。
【００３１】
一度最初のペプチド断片が完成したら、DMFを溶媒として用いてその樹脂を50-mLコニカルチューブに戻した。その樹脂を手作業で均等に４つの試料に分け、それを４本の50-mLコニカルチューブの中に入れ、次いでそれを合成機の中に戻した。表題ペプチドの残りの部分を、0.25-mmoleスケールで合成した。用いたプロトコルはより大きいスケールでの合成に関して用いられたプロトコルと同じであったが、より少ない量の試薬を用いた。Ｎ末端Fmoc保護基の除去は、10 mLのDMF中20%ピペリジンおよび0.1M HOBtを含有する溶液を用いた処理で構成されていた。窒素による泡立て（３秒間オン、７秒間オフ）を伴うマイクロ波電力（４５ワット、最大温度７５℃）の最初の脱保護の工程は３０秒間続いた。次いで反応容器から液体を排出し、DMFで数回、完全に洗浄した。次いで、DMF中0.2Mのストック溶液として調製された次のアミノ酸（サイクル１４）を、成長するペプチドに導入した(Fmoc-Gln(tBu)-OH)(5.0 mL、4当量)。次いで2.0 mLのDMF中HBTUの0.45M溶液(4当量)を添加し、続いて1.0 mLのNMP中DIPEAの2M溶液(8当量)を添加した。
【００３２】
Fmoc-Cys(Trt)-OHおよびFmoc-Arg(Pbf)-OHに関するカップリングプロトコルは、標準的なプロトコルをわずかに修正したバージョンであった。Cys残基のカップリングに関して、最初に、最初の２分間はマイクロ波電力をオフにし、次いで４分間オンにした（２０ワット、最大温度５０℃）。Arg残基のカップリングに関して、最初のカップリングではマイクロ波電力を用いなかったが、２番目の標準的なカップリング工程が必要であった。サイクル１４、１６および２１は、カップリングの工程のすぐ後でキャッピングの手順を用い、それは共にNMP中の0.015M HOBTを含有する0.5M無水酢酸7 mlおよび2M DIPEA 2 mlを添加し、一方で多段階マイクロ波プロトコル（最大温度６５℃で５０ワットを３０秒間、次いで電力無しを３０秒間、最大温度６５℃で５０ワットを３０秒間、次いで電力無しを３０秒間）を利用することを含んでいた。表題ペプチド断片に関するGlnの後の合成サイクルは以下の通りであった：サイクル15、Fmoc-Arg(Pbf)-OH; サイクル16、Leu-OH; サイクル17、Fmoc-Asp(OtBu)-OH; サイクル18、Fmoc-Cys(Trt)-OH; サイクル19、Fmoc-Ser(tBu)-OH; サイクル20、Fmoc-Arg(Pbf)-OH; サイクル21、Fmoc-Phe-OH;およびサイクル22、Fmoc-Cys(Trt)-OH。
【００３３】
ペプチドのバックボーンの完成の後、Ｎ末端のFmoc保護基を除去し、樹脂を再度DMFで洗浄した。次いで移動用の溶媒としてDMFを用いて樹脂を50-mLコニカルチューブに戻した。
【００３４】
その樹脂を焼結ガラスフリットを有する反応容器の中に移した。DMFを除去し、樹脂をDCMで大規模に(extensively)洗浄した。そのペプチド断片を、以下の試薬を用いた処理により切断および脱保護した：5% TIS : 5%水: 90% TFA。反応を一定の振盪の下で室温で３時間進行させた。次いでその溶液を濾過して50-mLコニカルチューブの中に入れた。窒素ガス流を用いた蒸発によりTFAを低減させた。40 mLの冷エチルエーテルの添加およびそれに続く冷却遠心機(Sorvall Legend RT; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)内での４℃において3000 rpmで３０分間の遠心分離により、ペプチド断片を沈殿させた。得られたペレットを0.1% TFA水中で溶解させた後、C18逆相カラム(Luna、10μｍ、250×21.2 mmカラム)を備えた分取ＨＰＣＬにより、10 mL/分の流速で５０分間にわたる0〜60％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を利用して精製した。その精製されたペプチド断片を、1mL/分の流速で３０分間にわたる5〜80％アセトニトリル(0.08% TFA)の勾配を用いるＨＰＬＣ(Luna C18、３μｍ、4.6×100 mmカラム)により、および質量分析(LCQ Advantage; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)により分析した。そのペプチド断片を続いて凍結乾燥させ、将来の使用のために−５０℃で保管した。
【００３５】
Ｂ） hIGF-1(1-47)-チオエステル、すなわち、Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-Cys-チオエステル-プロピオニル-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52)のペプチド断片合成
Ｎ末端ペプチド断片、すなわち、ｈＩＧＦ−１の残基１〜４７を、固相ペプチド合成に基づくＢｏｃ化学を用いて組み立てた。標準的なFastBocプロトコルを動かすように修正されたＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機(Applied Biosystems；米国カリフォルニア州フォスターシティ)を、0.5-mmoleスケールでの合成のために利用した。0.645 mgの0.77 meq/gのTampal樹脂を含有する反応容器を合成機の上に置いた。樹脂を膨潤させるため、DMFを導入した。ABI FastBoc 0.5プロトコルを用いて断片を精製した。それぞれのサイクルは、ニート(neat) TFAを用いたＮ末端Boc保護基の脱ブロッキング(deblocking)およびそれに続く大規模なDMF洗浄で構成されていた。次いでそれぞれのアミノ酸の予め包装された2.0-mmole (4当量)のカートリッジを0.40M HBTUおよびDMF中で溶解させた。それぞれのアミノ酸が完全に溶解した後、その溶液を自動的に活性化容器に移した。DIPEA溶液(ニート)を活性化容器に導入し、延長された期間の間樹脂に曝露した。その反応容器を空にし、樹脂をDMFで洗浄した。Arg/Asnカートリッジに関して、溶解性を確実にするために延長された活性化時間が必要であった。加えて、Gln残基のカップリングの直後に付加されたあらゆるアミノ酸は、脱ブロッキングプロトコルの前および後の両方でDCMにより洗浄された。そのカップリング時間は３０分間であった。表題ペプチド断片に関して以下のアミノ酸を用いた：Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Asp(cHex)-OH、Boc-Glu(cHex)-OH、Boc-Asn(Xan)-OH、Boc-Cys(4Me-Bzl)-OH、Boc-Lys(ClZ)-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Ser(OBzl)-OH、Boc-Thr(OBzl)-OH、およびBoc-Tyr(BrZ)-OH。
【００３６】
最後のカップリングサイクルの後、樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させた。10 mLのフッ化水素およびアニソールによる処理を用いてペプチド断片を脱保護し、樹脂から切り離した。反応を７０分間進行させ、その時点で窒素の流れによりフッ化水素を吹き飛ばした。残留物をエーテルで洗浄し、次いでそのペプチドを10〜15 mlのTFA中で溶解させた。そのTFAを濾過して40 mLの冷エチルエーテルの中に入れ、続いて冷却遠心機(Sorvall Legend RT; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)内で４℃において3000 rpmで３０分間遠心分離することにより、ペプチド断片を沈殿させた。得られたペレットを0.1% TFA水中で溶解させ、C18逆相カラム(Luna、10μｍ、250×21.2 mmカラム)を備えた分取ＨＰＣＬにより、10 mL/分の流速で１２０分間にわたる20〜40％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を利用して精製した。その精製されたペプチド断片を、1 mL/分の流速で３０分間の5〜80％アセトニトリル(0.08% TFA)の勾配を用いるＨＰＬＣ(Luna C18、３μｍ、4.6×100 mmカラム)により、および質量分析(LCQ Advantage; Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)により分析した。そのペプチド断片を続いて凍結乾燥させ、将来の使用のために−５０℃で保管した。
【００３７】
Ｃ）一般的なライゲーションの手順
完全長のｈＩＧＦ−１類似体を化学的ライゲーション法により構築し、それはＮ末端のチオエステル断片、例えばhIGF-1(1-47)-S-(CH2)2C(O)-Leu-NH2(SEQ ID NO:52)およびそのＮ末端にシステイン残基を含有するＣ末端の断片、例えば(Gln56、Asn59)hIGF-1(48-70)-OH (SEQ ID NO:51)の間で自然に起こる。
【００３８】
表題ペプチドに関するプロセスを開始するため、5.5 mgのＣ末端ｈＩＧＦ−１断片を、1.5-mLエッペンドルフチューブ中で、ライゲーション緩衝液(200mMリン酸ナトリウム、pH 8.5、6M塩酸グアニジン)中で溶解させた。この溶液に、100μＬのTCEP溶液(40 mg/mL)を添加し、その混合物をボルテックスした。その混合物を、6.5 mgのＮ末端ｈＩＧＦ−１チオエステル断片を含有する２番目のエッペンドルフチューブに移した。反応物を完全に混合した。少量の試料(5μＬ)を取り出し、LC-MS (LCQ Deca XP;Thermo Fisher、米国カリフォルニア州サンノゼ)により分析した。その反応混合物に、100μＬのMPAA溶液(20 mg/mL)を添加し、続いて混合した。LC-MSを用いて反応の進行を追跡するため、定期的に試料(5μＬ)を抜き取った。おおよそ３．５時間後、その反応がほぼ完了した際に、9.5 mLの0.1% TFA水の添加によりその混合物を停止し(quenched)、希釈した。ライゲーション生成物を、SemiPrep-HPLC (Vydac 218TP101510、C18、10〜15μｍ、10×250 mm)により、5mL/分の流速で４０分間にわたる5〜80％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて精製した。生成物のピークを凍結乾燥し、−５０℃で保管した。フォールディングされていないライゲーション生成物の質量を、物理的測定により決定した。
【００３９】
Ｄ） 実施例１４、すなわち、(Gln56、Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:14)に関する一般的なフォールディングの手順（グルタチオン酸化還元対）
上記の工程Ｃ）のライゲーションプロセスにより調製されたタンパク質を、ライゲーション緩衝液(200mMリン酸ナトリウム、pH 8.5、6M塩酸グアニジン)中で溶解させて1 mg/mLの濃度にした。次いでフォールディング緩衝液(100mMトリス、pH 8.5、1mM酸化型グルタチオン、10mM還元型グルタチオン)を添加して、最終的なタンパク質濃度を0.25 mg/mLにした。３時間かけてフォールディングプロセスを起こさせた。その後、反応混合物がｐＨ３以下に達するまでTFAを滴加することにより、反応を停止した。次いで生成物をSemiPrep-HPLC (Vydac 218TP101510、C18、10〜15μｍ、10×250 mmカラム)により、5 mL/分の流速で４０分間にわたる5〜60％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて精製した。生成物を凍結乾燥した。生成物を0.1% TFA水中で再溶解させ、次いで280 nmの吸光度を測定する(NanoDrop ND1000分光光度計)ことにより、タンパク質含有量を決定した。次いでそのタンパク質をＱＣに関して分析した(HPLCおよびMS)。
【００４０】
Ｅ） 実施例７、すなわち、(Ser-Gly1、Asn59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:7)からの(グリオキシリル(glyoxylyl)-Gly1、Asn59)hIGF-1 (1-70)-OH (SEQ ID NO:53)の形成のための酸化の手順
フォールディングされたｈＩＧＦ−１類似体の質量を、0.1% TFA水中での280 nmの吸光度(NanoDrop ND1000分光光度計)により決定した。上記の工程Ｄ）のフォールディングプロセスにより調製されたタンパク質を50mMイミダゾール緩衝液(pH 7.0)中で再溶解させ、終濃度2 mg/mL (2.66×10-4M)にした。イミダゾール緩衝液中で溶解させた過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4) (4当量)を添加し、得られた溶液を穏やかに混合した。反応を室温で、さらなる撹拌無しで進行させた。５分後、10当量のエチレングリコールの添加により反応を停止した。その混合物を室温で１５分間静置した。その混合物を0.1% TFA水で希釈して10 mLの終体積にした。次いで生成物をSemiPrep-HPLC (Vydac 218TP101510、C18、10〜15μｍ、10×250 mmカラム)により、5 mL/分の流速で４０分間の5〜60％アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて精製した。次いで生成物を凍結乾燥し、必要になるまで−５０℃で保管した。
【００４１】
Ｆ） 実施例２７、すなわち、(β-Me-Cys47、Leu59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:19)に関する合成手順
表題タンパク質を、hIGF(1-46)-チオ-プロピオニル-Leu-NH2 (SEQ ID NO:54)およびＣ末端断片、すなわち、(β-Me-Cys47、Leu59)hIGF-1(47-70) (SEQ ID NO:55)を用いた自然な化学的ライゲーションにより組み立てた。タンパク質のチオエステル(7.4 mg、1.45μmole)およびＣ末端断片(3.8 mg、1.38μmole)をライゲーション緩衝液(200mMリン酸ナトリウム中6M塩酸グアニジン、pH 8.5、400μＬ)およびTCEP (80μＬ、40 mg/mL、pH 7)中で溶解させた。MPAA触媒を添加した(80μＬ、20 mg/mL、pH 7)。反応の進行を、Luna C18(2)カラム(5μｍ、4.6×100 mm)を有するLCQ Deca XP LC-MS (Thermo Finnigan)上で、３０分間の5〜80%アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を用いて監視した。dH2O、0.1% TFA (v/v)を用いて反応を停止して1:10希釈した。粗製の混合物を遠心分離し、1.0-μｍガラスフィルターを通過させて全てのMPAA沈殿物を除去した。完全長タンパク質を、Vydac C18 (10μｍ、10×250 mm)上で5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配を用いて精製した。タンパク質をＵＶ分光法(NanoDrop ND1000分光光度計)により定量化し、将来の使用のために凍結乾燥した。
【００４２】
保管したタンパク質(1.8 mg、235 nmole)を、pH 8.5を有する200mM H2PO4-、6Mグアニジウム-HCl溶液中で溶解させて1.0 mg/mLの濃度にした。フォールディング緩衝液(100mMトリス、10mMグルタチオン、1mM酸化型グルタチオン、pH 8.5)をその溶液に、250 μg/mLの最終的なタンパク質濃度が得られるまで添加した。その混合物を室温で保温し、一方でＨＰＬＣにより監視した。（安定したＨＰＬＣプロフィールにより可視化されるように）一度平衡に達したら、酢酸またはTFAのどちらかの中で攪拌して溶液をpH 3にすることにより、反応を停止した。その溶液を、まず1.0-μｍガラスフィルター、次いでセミ分取(semi-preparative)カラムを用いて精製した。
【００４３】
そのフォールディングされたタンパク質を、5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配を用いて精製した。タンパク質をＵＶにより定量化し(NanoDrop ND1000分光光度計)、凍結乾燥した。おおよそ92μｇの精製された生成物が得られ、これは5％の収率に相当する。タンパク質の質量をFinnigan LCQ Advantage MAX MSで確かめた。
【００４４】
Ｇ） 実施例３６、すなわち、(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:28)に関する合成手順
表題タンパク質を、hIGF-1(1-47)-チオ-プロピオニル-Leu-NH2 (SEQ ID NO:52)およびＣ末端断片、すなわち、(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(48-70) (SEQ ID NO:56)を用いた自然な化学的ライゲーションを利用して組み立てた。タンパク質のチオエステル(4.3 mg、824 nmole)およびＣ末端断片(2.1 mg、790 nmole)をライゲーション緩衝液(400μＬ、200mMリン酸ナトリウム中6M塩酸グアニジン、pH 8.5)およびTCEP (80μＬ、40 mg/mL、pH 7)中で溶解させた。MPAA触媒を添加した(80μＬ、20 mg/mL、pH 7)。反応の進行を、３０分間の5〜80%アセトニトリル(0.1% TFA)の勾配を有する、Luna C18(2)カラム(5μｍ、4.6×100 mm)を有するFinnigan LCQ Deca XP LC-MSを用いて監視した。dH2O、0.1% TFA (v/v)を用いて反応を停止して1:10希釈した。粗製の混合物を遠心分離し、1.0μｍガラスフィルターを通過させて全てのMPAA沈殿物を除去した。完全長タンパク質を、Vydac C18 (10μｍ、10×250 mm)を用いて、5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配で精製した。タンパク質をＵＶにより定量化し(NanoDrop ND1000分光光度計)、将来の使用のために凍結乾燥した。
【００４５】
保管したタンパク質を、200mM H2PO4-、6Mグアニジウム-HCl溶液(pH 8.5)を用いて、1.0 mg/mLの濃度が得られるまで溶解させた。フォールディング緩衝液(100mMトリス、10mMグルタチオン、1mM酸化型グルタチオン、pH 8.5)をその溶液に、250 μg/mLの最終的なタンパク質濃度が得られるまで添加した。その混合物を室温で保温し、一方でＨＰＬＣにより監視した。（安定したＨＰＬＣプロフィールにより可視化されるように）一度平衡に達したら、酢酸またはTFAのどちらかを用いて反応を停止し、pH 3にした。その溶液を、まず1.0-μｍガラスフィルター、次いでセミ分取カラムを用いて精製した。
【００４６】
そのフォールディングされたタンパク質を、5mL/分の流速で４０分間の5〜60％Ｂ直線勾配を用いて精製した。タンパク質をＵＶにより定量化し(NanoDrop ND1000分光光度計)、凍結乾燥した。おおよそ0.415 mgの精製された生成物が得られ、これは10.6％の収率に相当する。タンパク質の質量をFinnigan LCQ Advantage MAX MSで確かめた。
【００４７】
当業者は、本発明の他のペプチドを、上記の実施例で開示された合成手順に類似した合成手順を用いて調製することができる。本明細書において例示されている化合物に関する物理的データを表１に示す。
【００４８】
表１
【００４９】
【表１−１】
【００５０】
【表１−２】
【００５１】
機能アッセイ
Ａ）インビトロＩＧＦ−１受容体結合アッセイ
天然のＩＧＦ−１受容体を発現するヒトMCF-7細胞の、20 mlの氷冷した50mM Tris-HCl中でのBrinkman Polytron (米国ニューヨーク州ウエストバリー)を用いたホモジナイゼーション(設定6、15秒間)により、放射性リガンド結合試験のための膜を調製した。ホモジネートを遠心分離(39,000 g / 10分間)により２回洗浄し、最終的なペレットを2.5mM MgCl2および0.1% BSAを含有する50mM Tris-HCl中で再懸濁した。
【００５２】
アッセイのため、分割量(aliquots)を0.05nM [125I]IGF-1と共に保温した。時には未標識の競合する試験ペプチドが含まれた。最終的なアッセイ体積は0.25 mlであった。120分間の保温(20℃)期間の後、結合した[125I]IGF-1(約2000 Ci/mmol、Perkin Elmer Life Sciences、米国マサチューセッツ州ボストン)を、3000 rpmで１０分間の遠心分離により、遊離の放射性粒子から分離した。上清をデカントし、ペレット中に捕えられた放射性粒子をガンマ分光法(Wallac LKB、米国メリーランド州ゲイザースバーグ)により計数した。特異的な結合を、結合した総[125I]IGF-1から100nM IGF-1の存在下で結合した[125I]IGF-1を引いたものとして定義した。
【００５３】
本明細書で例示した化合物に関するインビトロＩＧＦ−１受容体結合データ（すなわちIC50値）を表２に示す。
Ｂ）インビトロＩＧＦ−１生理活性アッセイ
マウス3T3/R細胞（米国カリフォルニア州ロサンゼルスにあるUCLAのDr. E. Rozengurtから得た）を２４ウェルプレートで培養し(DMEM + 10% FCS)、２日間培養状態を維持した。
【００５４】
アッセイのため、培地を除去し、血清を含まないDMEMで１回洗浄した。次いで２４時間血清を欠乏させた。欠乏の後、[3H]チミジンおよびＩＧＦ−１ペプチドを添加した。次いで細胞を３７℃で２４時間培養した。
【００５５】
培養の終了時点で、培地を吸引した。次いで細胞を氷冷した0.9% NaCl溶液で洗浄した。次いで氷冷した5% TCA溶液を添加し、４℃で３０分間保温した。TCAを吸引し、ウェルを95%エタノールと共に４時間保温した。次いで培地を放射活性計数のために液体シンチレーションバイアルに移した。
【００５６】
本明細書において例示されている化合物に関するインビトロＩＧＦ−１生理活性データ（すなわち、EC50値）も表２に示す。
Ｃ）U2OS細胞におけるインスリン受容体交差反応性に関するＩＧＦ−１ペプチドのインビトロスクリーニング
U2OS細胞(カタログ# 93-0466C3、DiscoveRX Corporation、米国カリフォルニア州フリモント)を、アッセイの１６時間前に、９６ウェルポリ-D-リシンプレートにおいて血清を含まないアッセイ培地中で6×105細胞/mLで蒔いた。野生型インスリン(カタログ# 10908、Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)、野生型ＩＧＦ−１(Increlex（登録商標）、Tercica、Inc.、米国カリフォルニア州ブリスベーン)、または本出願で開示した試験ＩＧＦ−１ペプチドを、10μＭ(マイクロモーラー)〜0.15ｎｍ(ナノモーラー)の用量範囲で添加し、５％ＣＯ２で３７℃において３時間培養した。PathHunter（商標）試薬(カタログ# 93-001、DiscoveRX)を製造業者の説明書に従って調製し、それぞれのウェルに添加した。プレートを室温で１時間保温した。Envision 2104マルチラベルプレートリーダー(PerkinElmer、Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム)上で発光を読み取った。それぞれの試験ペプチドの活性を分析し、最大／最小（最大／最小）値として報告した。本明細書において例示されている化合物に関するインビトロインスリン受容体交差反応性データ（すなわち最大／最小値）も表２に示す。
【００５７】
本明細書において例示されている化合物の多くが、4.59 nMのIC50値、3.75 nMのEC50値、および2.1の最大／最小値を有する野生型ＩＧＦ−１よりも有意に強力であることが分かった。
【００５８】
表２
【００５９】
【表２−１】
【００６０】
【表２−２】
【００６１】
投与
この発明のＩＧＦ−１の類似体は、医薬的に許容できる塩類の形で提供することができる。そのような塩類の例には、有機酸（例えば酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはパモ酸(pamoic acid)）、無機酸（例えば塩酸、硫酸、またはリン酸）およびポリマー性の酸（例えばタンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸−ポリグリコール酸のコポリマー類）により形成される塩類が含まれるが、それらに限定されない。
【００６２】
本発明のペプチドの塩を作る典型的な方法は当技術で周知であり、標準的な塩交換の方法により成し遂げることができる。例えば、本発明のペプチドのTFA塩（TFA塩は分取HPLCを用いてTFAを含有する緩衝溶液で溶離することによるペプチドの精製の結果得られる）は別の塩に、例えばそのペプチドを少量の0.25 N酢酸水溶液中で溶解することにより酢酸塩に変換された。得られた溶液をSemiPrep HPLCカラム(Zorbax, 300 SB, C-8)に適用する。そのカラムを、（１）0.1N酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）0.25N酢酸水溶液で０．５時間、および（３）4 ml/分の流速における直線勾配(３０分間にわたる20%〜100%の溶液B）（溶液Aは0.25 N酢酸水溶液であり、溶液Bは80：20比率のアセトニトリル/水中0.25 N酢酸である）を用いて溶離する。ペプチドを含有する画分を集め、凍結乾燥させる。
【００６３】
この発明の組成物中の有効成分の用量は異なっていてよい；しかし、有効成分の量は適切な剤形が得られるようなものである必要がある。選択される用量は、望まれる療法的作用に、投与経路に、および処置の期間に依存する。投与は熟練した有能な医師により容易に決定される。
【００６４】
この発明の化合物は、経口、非経口（例えば筋内、腹膜内、静脈内または皮下の注射、または埋め込み）、経鼻、膣内、直腸内、舌下、または局所的投与経路により投与することができ、それぞれの投与経路に適した剤形を提供するために医薬的に許容できるキャリヤーと共に配合することができる。
【００６５】
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸剤、粉末および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、有効化合物は少なくとも１種類の不活性な医薬的に許容できるキャリヤー、例えばスクロース、ラクトースまたはデンプンと混合される。そのような剤形はそのような不活性な希釈剤以外の追加の物質、例えば潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムも含むことができ、それが通常の慣習である。カプセル、錠剤および丸剤の場合、その剤形は緩衝剤も含んでいてよい。錠剤および丸剤はさらに腸溶コーティングを用いて調製することができる。
【００６６】
経口投与のための液体剤形には、当技術で一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水を含有する、医薬的に許容できる乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルおよび同様のものが含まれるが、それらに限定されない。そのような不活性な希釈剤の他に、組成物は補助剤、例えば湿潤剤、乳濁化および懸濁化剤、ならびに甘味料、香味料および香料も含むことができる。
【００６７】
非経口投与のためのこの発明に従う製剤には、無菌の水溶液または非水溶液、懸濁液、乳濁液および同様のものが含まれるが、それらに限定されない。非水性溶媒またはビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油およびトウモロコシ油、ゼラチン、ならびに注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルが含まれる。そのような剤形は補助剤、例えば保存、湿潤、乳濁化および分散剤も含んでいてよい。製剤は例えば細菌を保持するフィルターを通す濾過により、組成物に滅菌剤を組み込むことにより、組成物を照射することにより、および／または組成物を加熱することにより滅菌されてよい。本明細書で記述した新規ＩＧＦ−１類似体を含有する医薬組成物は、滅菌水または何らかの他の無菌の注射可能な媒体に使用の直前に溶解させることができる無菌の固体組成物の形で製造することもできる。
【００６８】
直腸内または膣内投与のための組成物は好ましくは坐剤であり、それは有効物質に加えて賦形剤、例えばカカオ脂(coca butter)または坐剤ワックスを含有していてよい。
経鼻または舌下投与のための組成物も、当技術で周知の標準的な賦形剤を用いて調製される。
【００６９】
さらに、この発明の化合物は徐放性組成物、例えば下記の特許および特許出願において記述されている徐放性組成物で投与することができる。米国特許第５，６７２，６５９号は、生理活性薬剤およびポリエステルを含む徐放性組成物を教示する。米国特許第５，５９５，７６０号は、生理活性薬剤をゲル化可能な(gelable)形で含む徐放性組成物を教示する。米国特許第５，８２１，２２１号は、生理活性薬剤およびキトサンを含むポリマー性徐放性組成物を教示する。米国特許第５，９１６，８８３号は、生理活性薬剤およびシクロデキストリンを含む徐放性組成物を教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３８５３６号は、生理活性薬剤の吸収性徐放性組成物を教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０４９１６号は、療法剤、例えばペプチドを含む微粒子を水中油プロセスで作るためのプロセスを教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９１６６号は、療法剤、例えばペプチドおよびリン酸化ポリマーを含む複合体を教示する。ＰＣＴ公開第ＷＯ００／２５８２６号は、療法剤、例えばペプチドおよび重合可能ではないラクトンを有するポリマーを含む複合体を教示する。
【００７０】
さらに、米国特許第７，２５８，８６４号において開示されている発明は、インスリン様増殖因子−１欠損症（ＩＧＦＤ）を有する対象を処置するための方法であって、ヒトの小児の対象に有効量の修飾されていないＩＧＦ−１を投与することを含む方法を特徴とし、ここで、その対象は以下のように特性付けられ：ａ）ＩＧＦ−１による処置の時点で、またはＩＧＦ−１による最初の処置の前に、対応する年齢および性別に関する通常の平均値よりも少なくとも約２標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびにｂ）ＩＧＦ−１による処置の時点で、またはＩＧＦ−１による最初の処置の前に、通常の平均レベルの少なくとも約−１ＳＤ下のＩＧＦ−１の血中レベルを有している、または有していた；ここで、その対象はラロン症候群または部分的成長ホルモン不感性症候群を有しておらず、ここで、前記の投与はその対象においてＩＧＦＤを処置するのに有効である。
【００７１】
同様に、ＷＯ２００６／１３０７６９において開示されている発明は、特発性低身長（ＩＳＳ）を有する対象を処置するための方法であって、部分的な内因性成長ホルモン活性またはシグナル伝達により特性付けられるＩＳＳを患うヒトの小児の対象にその対象において成長を促進するのに有効な量のＩＧＦ−１を投与することを含む方法を特徴とし、ここで、その対象はさらに以下のように特性付けられる：ａ）ＩＧＦ−１による処置の時点で、またはＩＧＦ−１による最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関する通常の平均身長よりも少なくとも約２．０標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびにｂ）同じ年齢および性別の対象に関して少なくとも通常であるＧＨおよびＩＧＦ−１の血中レベルを有している。
【００７２】
さらに、本明細書で開示した新規類似体は単独で、または熟練した医師により決定される別の療法剤との組み合わせで投与することができる。
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的な用語はこの発明が属する技術の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。また、本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献をそれぞれそのまま本明細書に援用する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩、
H-A-1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59-A60-A61-A62-A63-A64-A65-A66-A67-A68-A69-A70-A71-R1
(I)
ここで：
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A2はPro、Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、Lysであり、または欠失しており;
A3はGlu、Ala、Asp、Glnであり、または欠失しており;
A4はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Serであり;
A5はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A6はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A7はGly、Ala、Asn、Asp、GlnまたはGluであり;
A8はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A9はGlu、Ala、Asp、またはGlnであり;
A10はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A11はVal、Ala、Ile、またはLeuであり;
A12はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A13はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A14はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A15はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A16はPhe、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Trp、またはTyrであり;
A17はVal、Ala、IleまたはLeuであり;
A18はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A19はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A20はAsp、Ala、Asn、Gln、またはGluであり;
A21はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A22はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A23はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A24はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A25はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A26はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Ser、またはThrであり;
A27はLys、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはProであり;
A28はPro、Ala、Arg、またはLysであり;
A29はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A30はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A31はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A32はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A33はSer、Ala、Thr、またはValであり;
A34はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A35はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A36はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A37はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A38はAla、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A39はPro、Ala、Arg、またはGluであり;
A40はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A41はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A42はGly、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A43はIle、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A44はVal、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはLysであり;
A45はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A46はGlu、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A47はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A48はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A49はPhe、Ala、Arg、Ile、Leu、Lys、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A50はArg、Ala、Lys、Ser、またはThrであり;
A51はSer、Aib、Ala、Arg、Lys、またはThrであり;
A52はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A53はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Lys、Ser、またはThrであり;
A54はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A55はArg、Ala、Ile、Leu、Lys、Phe、Trp、Tyr、またはValであり;
A56はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A57はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A58はGlu、Acc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A59はAcc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Nle、Ser、D-Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A60はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A61はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A62はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A63はPro、D-Pro、Ala、Ser、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leu、Ala、Ile、Valであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Pro、Alaであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Ala、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A71はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Lys、Ser、Thrであり、または欠失しており;そして
R1はOHまたはNH2であり;
ただし、
残基対A6およびA48、A47およびA52、ならびにA18およびA61の側鎖はそれぞれジスルフィド結合を形成しており；そして
さらに、A59がLeu、Ile、Nle、Thr、またはValのいずれかである場合、その類似体は少なくとも１個の追加のアミノ酸置換または付加を含有する。
【請求項２】
請求項１に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩、ここで
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGlyであり、または欠失しており;
A2はPro、Lysであり、または欠失しており;
A3はGluであり、または欠失しており;
A4はThrであり;
A5はLeuであり;
A6はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A7はGlyであり;
A8はAlaであり;
A9はGluであり;
A10はLeuであり;
A11はValであり;
A12はAspであり;
A13はAlaであり;
A14はLeuであり;
A15はGlnであり;
A16はPheであり;
A17はValであり;
A18はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A19はGlyであり;
A20はAspであり;
A21はArgであり;
A22はGlyであり;
A23はPheであり;
A24はTyrであり;
A25はPheであり;
A26はAsnであり;
A27はLys、Arg、またはProであり;
A28はProまたはLysであり;
A29はThrであり;
A30はGlyであり;
A31はTyrであり;
A32はGlyであり;
A33はSerであり;
A34はSerであり;
A35はSerであり;
A36はArgであり;
A37はArgであり;
A38はAlaであり;
A39はProであり;
A40はGlnであり;
A41はThrであり;
A42はGlyであり;
A43はIleであり;
A44はValであり;
A45はAspであり;
A46はGluであり;
A47はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A48はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A49はPhe、Arg、Leu、またはThrであり;
A50はArgまたはSerであり;
A51はSer、Aib、Arg、またはThrであり;
A52はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A53はAsp、Arg、またはSerであり;
A54はLeuまたはA6cであり;
A55はArgまたはTyrであり;
A56はArgまたはGlnであり;
A57はLeuであり;
A58はGluまたはArgであり;
A59はA6c、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Nle、Ser、D-Ser、Trp、またはTyrであり;
A60はTyrまたはPheであり;
A61はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A62はAlaまたはAsnであり;
A63はPro、D-Pro、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leuであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Argであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Proであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Argであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Gluであり、または欠失しており；そして
A71はAsp、Glu、Lys、Serであり、または欠失している。
【請求項３】
請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)
(Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)
(Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)
(Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)
(Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)
(Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
(Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)
(Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)
(Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)
(Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)
(Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)
(Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)
(Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;
(Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
(Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
(Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
(β-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
(β-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
(Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)
(Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
(N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
(Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
(hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
(Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
(Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
(Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)
(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
(Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
(Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
(Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)
(Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
(A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
(Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
(Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)
(Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)
(Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
(Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
(Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)
(Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46)もしくは
(Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:47)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項４】
A59がAsnである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項５】
請求項４に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)
(Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)
(Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)
(Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)
(Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)
(Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
(Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)
(Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)
(Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)
(Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)
(Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)
(Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)
(Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;もしくは
(Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:47)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項６】
A59がLeuである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項７】
前記の少なくとももう１個のアミノ酸置換または付加がArg27、Arg65、Arg68、Leu49、β-Me-Cys47、β-Me-Cys52、Thr51、Thr69、Asp71、Glu71、Lys71、およびSer71からなるグループから選択される、請求項６に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
(Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
(Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
(β-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
(β-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
(Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)もしくは
(Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項９】
A59がNleである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１０】
前記の少なくとももう１個のアミノ酸置換がAib51、Aib67、Aib69、Pen52、Pen61、A6c54、N-Me-Cys47、およびN-Me-Cys48からなるグループから選択される、請求項９に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
(Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
(hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
(Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
(Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
(Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)もしくは
(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１２】
A59がIleである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１３】
前記の少なくとももう１個のアミノ酸置換がArg49、Arg51、Arg53、およびArg58からなるグループから選択される、請求項１２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１４】
請求項１２または請求項１３に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
(Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
(Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)もしくは
(Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１５】
A59がArg、Asp、A6c、Gln、Glu、Ser、Trp、またはTyrである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
(Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
(Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)
(Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)
(Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
(Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
(Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)もしくは
(Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１７】
有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
さらに医薬的に許容できるキャリヤーを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
それを必要とする対象においてＩＧＦ−１受容体から作動薬作用を引き出す方法であって、前記の対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＩＧＦ−１受容体結合により仲介される病気または疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２１】
インスリン受容体結合により仲介される病気または疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２２】
インスリン様増殖因子の１種類以上のインスリン様増殖因子結合タンパク質への結合を阻害することにより病気または疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２３】
前記の病気または疾患が、低身長、肥満、体重の減少、悪液質、食欲不振、神経変性障害、線維症と関連する病気、軟骨障害、骨疾患、炎症性障害、腸障害、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、ラブソン・メンデンホール症候群、網膜症、先端巨大症、線維筋過形成、および心障害からなるグループから選択される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
低身長の処置を必要とする前記の対象がインスリン様増殖因子−１欠損症（ＩＧＦＤ）を有するヒトの小児の対象であり、前記の投与がヒトの小児の対象においてＩＧＦＤを処置するのに有効である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記のヒトの小児の対象が以下：
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関する通常の平均身長よりも少なくとも約２．０標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびに
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別のヒトの小児の対象に関する通常の平均レベルの少なくとも約−１ＳＤ下のＩＧＦ−１の血中レベルを有している、または有していた；
のように特性付けられる、前記方法。
【請求項２６】
特発性低身長（ＩＳＳ）を有する対象を処置するための方法であって、部分的な内因性成長ホルモン活性またはシグナル伝達により特性付けられるＩＳＳを患うヒトの小児の対象にその対象において成長を促進するのに有効な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含み、その対象がさらに以下：
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関する通常の平均身長よりも少なくとも約２．０標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびに
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関して少なくとも通常であるＧＨおよびＩＧＦ−１の血中レベルを有している；
のように特性付けられる、前記方法。
【請求項２７】
前記の神経変性障害がＡＬＳ、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病性ニューロパシー、脱髄性末梢ニューロパシー、パーキンソン病、アルツハイマー病、および外傷性脊髄損傷の後遺症からなるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記の軟骨障害が骨関節炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記の骨疾患が骨粗鬆症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記の炎症性障害がリウマチ性関節炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記の糖尿病がＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記の心障害がアテローム性動脈硬化症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記の線維症と関連する病気が硬変、全身性硬化症、または甲状腺眼症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
式（Ｉ）のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩、
H-A-1-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A12-A13-A14-A15-A16-A17-A18-A19-A20-A21-A22-A23-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30-A31-A32-A33-A34-A35-A36-A37-A38-A39-A40-A41-A42-A43-A44-A45-A46-A47-A48-A49-A50-A51-A52-A53-A54-A55-A56-A57-A58-A59-A60-A61-A62-A63-A64-A65-A66-A67-A68-A69-A70-A71-R1
(I)
ここで：
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A2はPro、Ala、Arg、Asp、Gln、Glu、Lysであり、または欠失しており;
A3はGlu、Ala、Asp、Glnであり、または欠失しており;
A4はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Serであり;
A5はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A6はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A7はGly、Ala、Asn、Asp、GlnまたはGluであり;
A8はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A9はGlu、Ala、Asp、またはGlnであり;
A10はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A11はVal、Ala、Ile、またはLeuであり;
A12はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A13はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A14はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A15はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A16はPhe、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Trp、またはTyrであり;
A17はVal、Ala、IleまたはLeuであり;
A18はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A19はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A20はAsp、Ala、Asn、Gln、またはGluであり;
A21はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A22はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A23はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A24はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A25はPhe、Ala、Trp、またはTyrであり;
A26はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Ser、またはThrであり;
A27はLys、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはProであり;
A28はPro、Ala、Arg、またはLysであり;
A29はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A30はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A31はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A32はGly、Ala、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A33はSer、Ala、Thr、またはValであり;
A34はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A35はSer、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはThrであり;
A36はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A37はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A38はAla、Asn、Asp、Gln、またはGluであり;
A39はPro、Ala、Arg、またはGluであり;
A40はGln、Ala、Asn、Asp、またはGluであり;
A41はThr、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはSerであり;
A42はGly、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A43はIle、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A44はVal、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはLysであり;
A45はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、またはLysであり;
A46はGlu、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A47はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A48はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A49はPhe、Ala、Arg、Ile、Leu、Lys、Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A50はArg、Ala、Lys、Ser、またはThrであり;
A51はSer、Aib、Ala、Arg、Lys、またはThrであり;
A52はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A53はAsp、Ala、Arg、Asn、Gln、Glu、Lys、Ser、またはThrであり;
A54はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A55はArg、Ala、Ile、Leu、Lys、Phe、Trp、Tyr、またはValであり;
A56はArg、Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、またはLysであり;
A57はLeu、Acc、Ala、Ile、またはValであり;
A58はGlu、Acc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、またはLysであり;
A59はAcc、Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Lys、Nle、Ser、D-Ser、Thr、Trp、Tyr、またはValであり;
A60はTyr、Ala、Phe、またはTrpであり;
A61はCys、D-Cys、hCys、D-hCys、β-Me-Cys、D-β-Me-Cys、N-Me-Cys、D-N-Me-Cys、Ala、Pen、またはD-Penであり;
A62はAla、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、またはValであり;
A63はPro、D-Pro、Ala、Ser、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leu、Ala、Ile、Valであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Pro、Alaであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Ala、Arg、Ile、Leu、Valであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Ala、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Asn、Asp、Gln、Gluであり、または欠失しており;
A71はAsn、Ala、Asp、Gln、Glu、Lys、Ser、Thrであり、または欠失しており;そして
R1はOHまたはNH2であり;
ただし、
残基対A6およびA48、A47およびA52、ならびにA18およびA61の側鎖はそれぞれジスルフィド結合を形成しており；そして
さらに、A59がLeu、Ile、Nle、Thr、またはValのいずれかである場合、その類似体は少なくとも１個の追加のアミノ酸置換または付加を含有する。
【請求項２】
請求項１に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩、ここで
A-1はMet、Serであり、または欠失しており;
A1はGlyであり、または欠失しており;
A2はPro、Lysであり、または欠失しており;
A3はGluであり、または欠失しており;
A4はThrであり;
A5はLeuであり;
A6はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A7はGlyであり;
A8はAlaであり;
A9はGluであり;
A10はLeuであり;
A11はValであり;
A12はAspであり;
A13はAlaであり;
A14はLeuであり;
A15はGlnであり;
A16はPheであり;
A17はValであり;
A18はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A19はGlyであり;
A20はAspであり;
A21はArgであり;
A22はGlyであり;
A23はPheであり;
A24はTyrであり;
A25はPheであり;
A26はAsnであり;
A27はLys、Arg、またはProであり;
A28はProまたはLysであり;
A29はThrであり;
A30はGlyであり;
A31はTyrであり;
A32はGlyであり;
A33はSerであり;
A34はSerであり;
A35はSerであり;
A36はArgであり;
A37はArgであり;
A38はAlaであり;
A39はProであり;
A40はGlnであり;
A41はThrであり;
A42はGlyであり;
A43はIleであり;
A44はValであり;
A45はAspであり;
A46はGluであり;
A47はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A48はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A49はPhe、Arg、Leu、またはThrであり;
A50はArgまたはSerであり;
A51はSer、Aib、Arg、またはThrであり;
A52はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A53はAsp、Arg、またはSerであり;
A54はLeuまたはA6cであり;
A55はArgまたはTyrであり;
A56はArgまたはGlnであり;
A57はLeuであり;
A58はGluまたはArgであり;
A59はA6c、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Ile、Leu、Nle、Ser、D-Ser、Trp、またはTyrであり;
A60はTyrまたはPheであり;
A61はCys、hCys、β-Me-Cys、N-Me-Cys、またはPenであり;
A62はAlaまたはAsnであり;
A63はPro、D-Pro、Thrであり、または欠失しており;
A64はLeu、D-Leu、des-Leuであり、または欠失しており;
A65はLys、D-Lys、des-Lys、Argであり、または欠失しており;
A66はPro、D-Proであり、または欠失しており;
A67はAla、D-Ala、Aibであり、または欠失しており;
A68はLys、D-Lys、Argであり、または欠失しており;
A69はSer、D-Ser、Aib、Thrであり、または欠失しており;
A70はAla、D-Ala、Gluであり、または欠失しており；そして
A71はAsp、Glu、Lys、Serであり、または欠失している。
【請求項３】
請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)
(Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)
(Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)
(Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)
(Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)
(Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
(Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)
(Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)
(Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)
(Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)
(Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)
(Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)
(Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;
(Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
(Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
(Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
(β-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
(β-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
(Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)
(Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
(N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
(Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
(hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
(Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
(Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
(Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)
(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
(Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
(Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
(Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)
(Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
(A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
(Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
(Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)
(Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)
(Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
(Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
(Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)
(Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46)もしくは
(Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:47)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項４】
A59がAsnである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項５】
請求項４に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)
(Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)
(Asn59)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)
(Pro27, Lys28, Asn59)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)
(Ser53, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)
(Ser-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)
(Asn59, Thr63, des-Leu64, des-Lys65, Glu70)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)
(Tyr55, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)
(Thr49, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)
(Asn59, 62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)
(Asn59, Phe60)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)
(Ser50, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)
(Gln56, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)
(Asn59, D-Pro63)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Leu64)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys65)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Pro66)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala67)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Lys68)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ser69)hIGF-1(1-70)-OH;
(Asn59, D-Ala70)hIGF-1(1-70)-OH;もしくは
(Met-Gly1, Asn59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:47)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項６】
A59がLeuである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項７】
前記の少なくとももう１個のアミノ酸置換または付加がArg27、Arg65、Arg68、Leu49、β-Me-Cys47、β-Me-Cys52、Thr51、Thr69、Asp71、Glu71、Lys71、およびSer71からなるグループから選択される、請求項６に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Arg27, 65, 68, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)
(Leu59, Arg65, 68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)
(Leu49, 59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)
(β-Me-Cys52, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)
(β-Me-Cys47, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)
(Leu59, Glu71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:20)
(Leu59, Asp71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)
(Leu59, Lys71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)
(Leu59, Ser71)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)
(Leu59, Thr69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)もしくは
(Thr51, Leu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項９】
A59がNleである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１０】
前記の少なくとももう１個のアミノ酸置換がAib51、Aib67、Aib69、Pen52、Pen61、A6c54、N-Me-Cys47、およびN-Me-Cys48からなるグループから選択される、請求項９に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１１】
請求項９または請求項１０に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(N-Me-Cys47, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)
(Nle59, Aib69)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)
(N-Me-Cys48, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)
(Nle59, Aib67)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)
(hCys52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:30)
(Aib51, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:31)
(Pen52, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)
(Nle59, Pen61)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)もしくは
(A6c54, Nle59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１２】
A59がIleである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１３】
前記の少なくとももう１個のアミノ酸置換がArg49、Arg51、Arg53、およびArg58からなるグループから選択される、請求項１２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１４】
請求項１２または請求項１３に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(Arg53, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)
(Arg49, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)
(Arg51, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)もしくは
(Arg58, Ile59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１５】
A59がArg、Asp、A6c、Gln、Glu、Ser、Trp、またはTyrである、請求項２に記載のＩＧＦ−１の類似体、またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＩＧＦ−１の類似体、ここで、前記類似体は以下のものである：
(A6c59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)
(Asp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)
(Trp59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)
(Ser59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)
(Tyr59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)
(Glu59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)
(Gln59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)もしくは
(Arg59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46)
またはその医薬的に許容できる塩。
【請求項１７】
有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
さらに医薬的に許容できるキャリヤーを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
それを必要とする対象においてＩＧＦ−１受容体から作動薬作用を引き出す方法であって、前記の対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項２０】
ＩＧＦ−１受容体結合により仲介される病気または疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２１】
インスリン受容体結合により仲介される病気または疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２２】
インスリン様増殖因子の１種類以上のインスリン様増殖因子結合タンパク質への結合を阻害することにより病気または疾患を処置するための方法であって、それを必要とする対象に療法上有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２３】
前記の病気または疾患が、低身長、肥満、体重の減少、悪液質、食欲不振、神経変性障害、線維症と関連する病気、軟骨障害、骨疾患、炎症性障害、腸障害、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、ラブソン・メンデンホール症候群、網膜症、先端巨大症、線維筋過形成、および心障害からなるグループから選択される、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
低身長の処置を必要とする前記の対象がインスリン様増殖因子−１欠損症（ＩＧＦＤ）を有するヒトの小児の対象であり、前記の投与がヒトの小児の対象においてＩＧＦＤを処置するのに有効である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記のヒトの小児の対象が以下：
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関する通常の平均身長よりも少なくとも約２．０標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびに
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別のヒトの小児の対象に関する通常の平均レベルの少なくとも約−１ＳＤ下のＩＧＦ−１の血中レベルを有している、または有していた；
のように特性付けられる、前記方法。
【請求項２６】
特発性低身長（ＩＳＳ）を有する対象を処置するための方法であって、部分的な内因性成長ホルモン活性またはシグナル伝達により特性付けられるＩＳＳを患うヒトの小児の対象にその対象において成長を促進するのに有効な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を投与することを含み、その対象がさらに以下：
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関する通常の平均身長よりも少なくとも約２．０標準偏差（ＳＤ）下である身長を有している、または有していた、ならびに
その対象が、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の類似体または請求項１７もしくは請求項１８に記載の医薬組成物を用いる処置の時点で、またはそれを用いる最初の処置の前に、同じ年齢および性別の対象に関して少なくとも通常であるＧＨおよびＩＧＦ−１の血中レベルを有している；
のように特性付けられる、前記方法。
【請求項２７】
前記の神経変性障害がＡＬＳ、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病性ニューロパシー、脱髄性末梢ニューロパシー、パーキンソン病、アルツハイマー病、および外傷性脊髄損傷の後遺症からなるグループから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記の軟骨障害が骨関節炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記の骨疾患が骨粗鬆症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記の炎症性障害がリウマチ性関節炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記の糖尿病がＩ型糖尿病またはＩＩ型糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記の心障害がアテローム性動脈硬化症である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記の線維症と関連する病気が硬変、全身性硬化症、または甲状腺眼症である、請求項２３に記載の方法。
【公表番号】特表２０１２−５３３６２２（Ｐ２０１２−５３３６２２Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２１６２３（Ｐ２０１２−５２１６２３）
【出願日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１０７２
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０９１２０４６９）イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ (51)
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【住所又は居所原語表記】６５ Ｑｕａｉ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｇｏｒｓｅ，Ｆ−９２１００ Ｂｏｕｌｏｇｎｅ Ｂｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２０６２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１１０７２
【国際公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【出願人】（５０９１２０４６９）イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ (51)
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【住所又は居所原語表記】６５ Ｑｕａｉ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｇｏｒｓｅ，Ｆ−９２１００ Ｂｏｕｌｏｇｎｅ Ｂｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
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