６−ホスホグルコン酸脱水素酵素含有試薬及び６−ホスホグルコン酸脱水素酵素安定化方法
【課題】 ６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤を含有する試薬を提供すること、及び６ＰＧＤＨ安定化剤を用いて６ＰＧＤＨを安定化する方法を提供すること。
【解決手段】 ６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素と、水溶性化合物、還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、前記酸素酸のチオ酸、前記酸素酸または前記チオ酸の塩、およびアミノエチルアミノエタノールからなる群より選択される少なくとも一つとを含有する６ＰＧＤＨ含有試薬。
【解決手段】 ６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素と、水溶性化合物、還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、前記酸素酸のチオ酸、前記酸素酸または前記チオ酸の塩、およびアミノエチルアミノエタノールからなる群より選択される少なくとも一つとを含有する６ＰＧＤＨ含有試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６ＰＧＤＨとする）を含有する試薬及び試薬中の６ＰＧＤＨを安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
６ＰＧＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）などの補酵素の存在下で６−ホスホグルコン酸（以下、６ＰＧとする）を脱水し、還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）又は還元型ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）を生成する反応を触媒する酵素である。この触媒作用を利用して、６ＰＧＤＨは臨床検査用試薬等に用いられている（例えば、特許文献１）。
【０００３】
しかしながら試薬中の６ＰＧＤＨは不安定であり、試薬の保存中に酵素としての活性が著しく低下する。このため、試薬中の６ＰＧＤＨの失活を抑制し、安定化することのできる技術の開発が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２５０６９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨを安定化する物質（以下、６ＰＧＤＨ安定化剤とする）を含有する試薬を提供すること、及び６ＰＧＤＨ安定化剤を用いて６ＰＧＤＨを安定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素と、以下の群から選択される少なくとも一つの６ＰＧＤＨ安定化剤を含有する試薬を提供する：
下記式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）で表される水溶性化合物；
下記式（ＩＩ）
【０００８】
【化２】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）で表される水溶性化合物；
下記式（ＩＩＩ）
【０００９】
【化３】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【００１０】
【化４】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）で表される水溶性化合物；
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸；
前記酸素酸のチオ酸；
前記酸素酸または前記チオ酸の塩；および
アミノエチルアミノエタノール。
【００１１】
また、本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つの６ＰＧＤＨ安定化剤とを含有し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を実質的に含有しない、６ＰＧＤＨ含有試薬を提供する。
【００１２】
また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素の存在下において、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、上記の６ＰＧＤＨ安定化剤のうち少なくとも一つとを共存させることにより、６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の実質的不存在下で、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つとを共存させることにより、６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤を含む試薬を提供することができる。また、試薬中の６ＰＧＤＨを安定化する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本実施形態の６ＰＧＤＨ含有試薬は、６ＰＧＤＨと６ＰＧＤＨ安定化剤とを含有する。６ＰＧＤＨ安定化剤とは、６ＰＧＤＨ含有試薬中で６ＰＧＤＨと共存させることにより６ＰＧＤＨの失活を抑制し、保存安定性を向上させることのできる物質を指す。本明細書においては「６ＰＧＤＨ安定化剤」は、６ＰＧＤＨ安定化剤の塩なども含む。６ＰＧＤＨ安定化剤の塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩等）、有機酸塩（シュウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等）、塩基付加塩（ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等）などが挙げられる。
【００１６】
６ＰＧＤＨは、酵素反応の際にNADやNADPのような補酵素が必要である。補酵素は６ＰＧＤＨ含有試薬に含有させてもよいし、６ＰＧＤＨ含有試薬とは別容器に収容してもよい。
【００１７】
６ＰＧＤＨがＮＡＤやＮＡＤＰのような補酵素と共存する場合は、補酵素が６ＰＧＤＨを不安定化させる。試薬溶液中ではＮＡＤやＮＡＤＰが分解してＡＤＰリボースが生成する。生成したＡＤＰリボースの一部は、酸化されてアルデヒドとなり、このアルデヒド基が６ＰＧＤＨを不安定化させていると考えられる。この補酵素は強い不安定化効果をもたらすため、補酵素の存在下で６ＰＧＤＨを安定化させるためには、補酵素の不安定化効果を低減する化合物を用いることができる。補酵素の不安定化効果を低減させるためには、アルコールの酸化により生成したアルデヒドの影響を低減できるような物質が好適に用いられる。このような物質として、還元性を有する化合物が挙げられる。特に、還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、この酸素酸のチオ酸、この酸素酸またはチオ酸の塩、アミノ基を有する化合物などが有効である。アミノ基を有する化合物としては、上記式（Ｉ）や（ＩＩＩ）の構造を有する化合物が例示される。また、分子内に電気陰性度の高い窒素、酸素、硫黄などの元素が連結した構造（ＮＨ２−Ｎや、ＮＨ−Ｏ−など）を有する分子も有効である。このような物質としては、上記式（ＩＩ）や（ＩＩＩ）の構造を有する化合物が例示される。
【００１８】
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸およびそのチオ酸としては、スルホキシル酸〔H２SO２〕、亜硫酸〔H２SO３〕、チオ亜硫酸〔H２S２O２〕、チオ硫酸〔H２S２O３〕、亜ジチオン酸〔H２S２O４〕、二亜硫酸〔H２S２O５〕、ジチオン酸〔H２S２O６〕、二硫酸〔H２S２O７〕、ポリチオン酸〔H２SXO４（Xは3以上の整数）〕などが挙げられる。
【００１９】
上記酸素酸の塩およびチオ酸の塩としては、具体的には亜硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4）2ＳＯ3〕、亜硫酸カリウム〔Ｋ2ＳＯ3〕、亜硫酸カルシウム〔ＣａＳＯ3〕、亜硫酸水素アンモニウム〔ＮＨ4ＨＳＯ3〕、亜硫酸水素ナトリウム〔ＮａＨＳＯ3〕、亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ2ＳＯ3〕、亜硫酸バリウム〔ＢａＳＯ3〕、亜硫酸ビスマス〔Ｂｉ2（ＳＯ3）3〕、亜硫酸水素カリウム〔ＫＨＳＯ3〕、チオ硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3〕、チオ硫酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ3〕、チオ硫酸バリウム〔ＢａＳ2Ｏ3〕、チオ硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ2Ｏ3〕、チオ硫酸カルシウム〔ＣａＳ2Ｏ3〕、チオ硫酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ3〕、亜ジチオン酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ4〕、亜ジチオン酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ4〕、亜ジチオン酸カルシウム〔ＣａＳ2Ｏ4〕、二亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ5〕、二亜硫酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ5〕、二亜硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ2Ｏ5〕、二亜硫酸カルシウム〔ＣａＳ2Ｏ5〕、ジチオン酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ6〕、二硫酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ7〕、二硫酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ7〕、四チオン酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ4Ｏ6〕などが例示される。
【００２０】
また、以下のような式（I）〜（III）に表されるような水溶性化合物も好適に用いられる。
【００２１】
【化５】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）
【００２２】
【化６】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）
【００２３】
【化７】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【００２４】
【化８】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）
【００２５】
ここで、上記式（II）および（III）における低級アルキルとは、直鎖または分岐状の炭素数１〜６のアルキル（たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等）であり、置換基を有していてもよい。
上記式（ＩＩ）における低級アルケニルとは、直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルケニル（たとえば、ビニル、アリル、イソプロペニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル等）であり、置換基を有していてもよい。
上記式（ＩＩ）における低級アルカノイルとしては、直鎖もしくは分岐状の炭素数１〜６のアルカノイル（たとえば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロイル、ペンタノイル等）であり、置換基を有していてもよい。
置換基としては、たとえばヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、アミノなどが挙げられる。
【００２６】
上記式（I）で表される化合物は、R2またはR3のNH２が補酵素のアルデヒドによる不安定化効果を低減させると推測される。また、この化合物はR2またはR3にSHを有しているため、これが直接６ＰＧＤＨを安定化させる効果もあると考えられる。。
【００２７】
上記式（I）で表される化合物としては、下記表１に挙げられる化合物が例示される。
【００２８】
【表１】
【００２９】
上記式（ＩＩ）で表される化合物としては、下記表２に挙げられる化合物が例示される。
【００３０】
【表２】
【００３１】
上記式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、下記表３に挙げられる化合物が例示される。
【００３２】
【表３】
【００３３】
上記の他に、アミノエチルアミノエタノールも補酵素の６ＰＧＤＨに対する不安定化効果を低減させることができる。
【００３４】
６ＰＧＤＨと、補酵素とを別々の容器に収容した場合は、補酵素によって６ＰＧＤＨが不安定となることはない。しかし、元来６ＰＧＤＨは不安定な酵素であるため、補酵素を実質的に含有しない溶液中でも酵素活性が低下する。補酵素の実質的不存在下では、上述したような補酵素存在下で６ＰＧＤＨを安定化する物質では満足な６ＰＧＤＨ安定化効果を得ることができない。このため、６ＰＧＤＨを安定化するために６ＰＧＤＨに直接作用して６ＰＧＤＨの失活を抑制することのできる物質を用いることができる。このような作用を有する物質としては、ＳＨ基を有する化合物（以下、ＳＨ化合物とする）が挙げられる。６ＰＧＤＨは溶液中で酸化されて活性が減少するため、還元性を有するＳＨ化合物を作用させることにより、失活を抑制することができると考えられる。
【００３５】
補酵素の実質的不存在下で６ＰＧＤＨを安定化することのできるＳＨ化合物としては、ＳＨ基を有していれば特に限定されないが、たとえばＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、チオグリセロール、β−メルカプトプロピオン酸、システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）等が挙げられる。
【００３６】
また、上記以外の物質で、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）などのキレート剤や、ＰＩＰＥＳやＡＤＡなどの緩衝剤も６ＰＧＤＨを安定化することができる。溶液中に不純物として金属イオンが含まれているとこれが原因となって６ＰＧＤＨが不安定化することがあるため、上記のようなキレート効果を有する物質も有効であると考えられる。
【００３７】
上述の６ＰＧＤＨ安定化剤は、単独で用いてもよいし併用してもよい。
【００３８】
試薬中の６ＰＧＤＨ安定化剤の濃度としては、６ＰＧＤＨを安定化できる濃度であれば特に限定されない。
【００３９】
本実施形態で用いることのできる６ＰＧＤＨは、バクテリア、酵母、動植物などに由来するものであってもよく、遺伝子組み換え技術を用いて生成されたものであってもよい。
【００４０】
６ＰＧＤＨ含有試薬の溶液状態におけるｐＨとしては、６ＰＧＤＨを不安定化させるｐＨでなければ特に限定されないが、５〜８であることが好ましい。このｐＨを維持するために、試薬に緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、例えばトリス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤などを用いることができる。
【００４１】
本実施形態の６ＰＧＤＨ含有試薬は臨床検査に用いることができる。生体から採取した試料あるいはこれを前処理した試料に６ＰＧＤＨ含有試薬を混合し、吸光度の変化などをモニターして試料中の特定の物質の定量や特定の酵素の活性測定などを行うことができる。
試料としては、例えば、血清、血漿、血液、髄液、尿、精液などが挙げられるが、血漿又は血清を用いることが好ましい。
【００４２】
６ＰＧＤＨ含有試薬を用いて定量又は活性測定し得る物質としては、反応系に６ＰＧＤＨの基質である６ＰＧを用いていれば特に限定されない。定量し得る物質としては、例えば、中性脂肪、無機リン酸、ラクトース、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュークロース、グルコース、フルクトース、マンノース、クレアチンリン酸、Ｇ６Ｐ、フルクトース−６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトース−２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコースなどが挙げられる。また、活性測定し得る物質としては、例えば、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ＣＫのアイソザイム（例えば、ＣＫＭＢなど）、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミログルコシダーゼ、インベルターゼ、トランスアルドラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、フルクトースジフォスファターゼなどの酵素が挙げられる。
【００４３】
上記のうち、ＣＫの活性測定に用いられる６ＰＧＤＨ含有試薬について以下に説明する。
ＣＫとは二つのサブユニットからなる二量体のリン酸化酵素である。ＣＫのサブユニットにはＢ型（脳型）及びＭ型（筋型）の二種類が存在する。ＣＫには、二種類のサブユニットの組み合わせによって三種類のアイソザイム（ＣＫＭＭ、ＣＫＭＢ及びＣＫＢＢ）が存在し、ＣＫＭＭは骨格筋に多く含まれ、ＣＫＭＢは心筋に多く含まれ、ＣＫＢＢは脳に多く含まれる。心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの疾患によって疾患の原因部位に存在するＣＫアイソザイムが血液中に逸脱するため、臨床検査において血清などの試料に含まれるＣＫアイソザイムの活性値は上記疾患を診断する際の重要な指標となる。ＣＫ活性の測定に供される試料としては、血清や血漿などを用いることができる。
【００４４】
ＣＫ活性測定用試薬には、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤の他に、緩衝剤、ＳＨ化合物、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、Ｇ６ＰＤＨ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、マグネシウムイオン及びクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。
【００４５】
試料とＣＫ活性測定用試薬とを混合すると、試料に含まれるＣＫがＳＨ化合物によって活性化される（ＳＨ化合物は補酵素不存在下で６ＰＧＤＨを安定化するだけでなく、ＣＫを活性化する作用を有する）。ＣＫは血液中に逸脱すると不活性化するため、ＣＫの活性を測定するためには先ずＳＨ化合物によってＣＫを活性化する必要がある。ＳＨ化合物としては、ＣＫを活性化できるものであれば特に限定されないが、例えば、ＮＡＣ、システアミン、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン、βメルカプトプロピオン酸、２ＭＥ及びチオグリセロールなどを用いることができる。これらの化合物は、二種類以上を組み合わせて用いてもよいし、単独で用いてもよい。ＳＨ基を有する化合物の試薬中の濃度は、５〜２５０ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜４０ｍＭである。
【００４６】
ＣＫを含む試料に上記成分を含むＣＫ活性測定用試薬を添加することにより、図１に示すような反応系が構築される。図１において、ＳＨ化合物によって活性化されたＣＫは、クレアチンリン酸及びＡＤＰからクレアチン及びＡＴＰを生成する反応を触媒する（反応１）。試薬に含まれるＨＫ又はＧＫは、試薬に含まれるグルコース及び反応１で生成したＡＴＰからＧ６Ｐ及びＡＤＰを生成させる(反応２)。さらに試薬に含まれるＧ６ＰＤＨは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ及び反応２で生成したＧ６Ｐから６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ）及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応３）。次に、試薬に含まれる６ＰＧＤＨは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ及び反応３で生成した６ＰＧから二酸化炭素、リブロース−５−リン酸及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応４）。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが生成すると試料と６ＰＧＤＨ含有試薬との混合液の波長３４０ｎｍ付近での吸光度が上昇する。この吸光度の上昇をモニターすることにより、試料中のＣＫの活性を測定することができる。
【００４７】
ＣＫ活性測定用試薬は二種類以上の試薬からなる試薬キットであることが好ましい。第一試薬及び第二試薬からなるＣＫ活性測定用試薬キットは、緩衝剤、ＡＤＰ、グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ＨＫ又はＧＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ＳＨ化合物、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤を含む第一試薬と、クレアチンリン酸を含む第二試薬とからなることが好ましい。
【００４８】
第一試薬、第二試薬及び第三試薬からなるＣＫ活性測定用試薬キットは、緩衝剤、ＡＤＰ、グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ＨＫ又はＧＫ、Ｇ６ＰＤＨ及びＳＨ化合物を含む第一試薬と、クレアチンリン酸を含む第二試薬と、６ＰＧＤＨと６ＰＧＤＨ安定化剤とを含む第三試薬とからなることが好ましい。
【００４９】
上記成分の他に、防腐剤、キレート剤などを適宜試薬に添加してもよい。防腐剤としては例えばアジ化ナトリウムなどを用いることができる。キレート剤は試料中の金属イオンによるＣＫ活性の阻害を抑制するために用いられ、具体的にはＥＤＴＡなどを用いることができる。
【００５０】
また、界面活性作用を有する化合物を試薬に添加してもよい。例えば、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、アルブミンなどを用いることができ、具体的にはトライトン類（Union Carbide Chemicals and Plastics Co.の登録商標）、エマルゲン類（花王（株）の登録商標）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを用いることができる。
【００５１】
試料にはアデニレートキナーゼが含まれていることがある。アデニレートキナーゼは特に溶血試料に多く含まれており、ＣＫの活性測定に悪影響を及ぼす。この悪影響を回避するため、試薬にアデニレートキナーゼの作用を阻害する阻害剤を加えることが好ましい。阻害剤の種類としてはアデニレートキナーゼの作用を阻害するものであれば特に限定されないが、例えばアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）やＰ１Ｐ５ジアデノシン−５’−ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）などを用いることができる。
【００５２】
さらに、ダブルカイネティック法で活性測定することにより、アデニレートキナーゼなどの測定対象ではない酵素の悪影響を回避することも可能である。ダブルカイネティック法では、先ずアデニレートキナーゼなどの酵素の活性を測定し、その後クレアチンリン酸を添加し、ＣＫによる酵素反応を開始させて試料に含まれるキナーゼの活性（ＣＫの活性とアデニレートキナーゼなどの酵素の活性との和）を測定する。これらの測定結果の差がＣＫの活性値となる。
【００５３】
なお、上述のＣＫ活性測定用試薬キットを構成する何れかの試薬に、ＣＫのＭ型サブユニットを特異的に認識する抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ抗体とする）を含有させることにより、試料中のＣＫＭＢの活性を測定することが可能となる(Wurzburg et al., 1977, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15:131-135)。抗ＣＫ−Ｍ抗体を試薬に含有させると、試料中のＣＫアイソザイムのうち、ＣＫＭＭのＭ型サブユニットに抗ＣＫ−Ｍ抗体が結合し、ＣＫＭＭ活性が完全に阻害される。また、試料中のＣＫＢＢの活性は無視できるほど小さい。ＣＫＭＢのＭ型サブユニットにも抗ＣＫ−Ｍ抗体が結合するが、Ｂ型サブユニットには結合しないため、ＣＫＭＢのＢ型サブユニットの活性を測定し、これを二倍することによりＣＫＭＢ活性として算出することができる。抗ＣＫ−Ｍ抗体は、第一試薬に含有させることが好ましい。抗ＣＫ−Ｍ抗体としては、Ｍ型サブユニットを特異的に認識する抗体であればポリクローナル抗体やモノクローナル抗体でもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。
【００５４】
以下、実施例及び比較例を示して、６ＰＧＤＨ安定化剤の６ＰＧＤＨ安定化効果を分析した。以下の実施例及び比較例において、６ＰＧＤＨの活性測定は、６ＰＧＤＨを含む試薬４．５μｌに、基質溶液２７０μｌ（０．７ｍｇ／ｍｌの塩化マグネシウム６水和物、０．３ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰ及び０．９ｍｇ／ｍｌの６ＰＧを含む）を添加して３４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行われた。
【００５５】
（比較例１）
下記組成を含むＣＫ活性測定用の第一試薬〜第三試薬を調製した。
＜第一試薬＞
イミダゾール緩衝剤 １４４ｍＭ（ｐＨ６．６）
ＮＡＣ ２０ｍＭ
ＥＤＴＡ ２．５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／ｌ
＜第二試薬＞
クレアチンリン酸 １５０ｍＭ
＜第三試薬＞
６ＰＧＤＨ ２００Ｕ／ｌ
イミダゾール緩衝剤 １４４ｍＭ（ｐＨ６．６）
【００５６】
本実施例では、上記のうち、第三試薬に含まれる６ＰＧＤＨの安定化を評価したため、第三試薬のみを用いた。比較例１及び実施例１においては、この第三試薬を対照試薬とした。この対照試薬を４℃で３日間保存し、６ＰＧＤＨの活性を測定した。
【００５７】
次に、対照試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００５８】
また、対照試薬である上記第三試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ アミノグアニジン
２０ｍＭ アセトヒドラジン
２０ｍＭ ヒドラジン
２０ｍＭ ヒドロキシルアミン
２０ｍＭ セミカルバジド
１．２ｇ／Ｌ βＮＡＤＰ
２．４ｇ／Ｌ βＮＡＤＰ
３．６ｇ／Ｌ βＮＡＤＰ
【００５９】
次に、上記の試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００６０】
（実施例１）
比較例１で調製した対照試薬に６ＰＧＤＨ安定化剤として以下に示すいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
４２．５ｍＭ チオグリセロール
８５ｍＭ チオグリセロール
２０ｍＭ βメルカプトプロピオン酸
２０ｍＭ システイン
２０ｍＭ システイン及び１０ｍＭ チオグリセロール
２０ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ ２ＭＥ
２ｍＭ ＣｙＤＴＡ
また、１４４ｍＭのイミダゾール緩衝剤ではなく、６ＰＧＤＨ安定化剤として１４４ｍＭのＰＩＰＥＳを用いること以外は比較例１の対照試薬と同様にして試薬を調製した。
１４４ｍＭのイミダゾール緩衝剤ではなく、６ＰＧＤＨ安定化剤として１４４ｍＭのＡＤＡを用いること以外は、比較例１の対照試薬と同様にして試薬を調製した。
【００６１】
これらの試薬を４℃３日間静置した後、６ＰＧＤＨ活性を測定した。次に、これらの試薬を３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨ残存活性を測定した。
【００６２】
比較例１および実施例１で測定された残存活性を表４に示す。残存活性は、４℃３日間静置した後に測定した６ＰＧＤＨ活性を１００％としたときの百分率で表される。
【００６３】
【表４】
【００６４】
表1より、対照試薬（添加物なし）の場合は温度負荷後、６ＰＧＤＨ活性が温度負荷前に比べて７６．１％に減少していた。
また、対照試薬にＮＡＤＰを加えた場合は温度負荷後６ＰＧＤＨ活性が著しく低下した。このことより、ＮＡＤＰには強い６ＰＧＤＨ不安定化効果があることが確認された。
【００６５】
ＮＡＤＰの不安定化効果を抑制して６ＰＧＤＨを安定化させる物質である、比較例１の添加物は、ＮＡＤＰが含まれない対照試薬中では６ＰＧＤＨを安定化する効果は認められなかった。
【００６６】
実施例１で用いた６ＰＧＤＨ安定化剤を添加した場合は温度負荷後も６ＰＧＤＨ残存活性が１００％に近い値を示した。
以上より、これらの添加物（ＳＨ化合物、ＣｙＤＴＡ、ＰＩＰＥＳおよびＡＤＡ）は、ＮＡＤＰの実質的不存在下で６ＰＧＤＨの保存安定性を向上できることがわかった。
【００６７】
（比較例２）
２００Ｕ／ｌの６ＰＧＤＨと、１４４ｍＭのイミダゾール緩衝剤（ｐＨ６．６）と、１．２ｇ／ｌのＮＡＤＰとを含む対照試薬を調製した。この試薬を４℃３日間静置し、６ＰＧＤＨ活性を測定した。次に、この試薬を３７℃で３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００６８】
また、本比較例の対照試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ ＮＡＣ
４０ｍＭ ＮＡＣ
４２．５ｍＭ チオグリセロール
８５ｍＭ チオグリセロール
２０ｍＭ βメルカプトプロピオン酸
２０ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ ２ＭＥ
【００６９】
次に、上記の試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００７０】
（実施例２）
比較例２で調製した対照試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ ヒドロキシルアミン
２０ｍＭ システイン
２０ｍＭ システイン及び１０ｍＭ チオグリセロール
【００７１】
次に、上記の試薬に対して比較例２と同様に温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００７２】
比較例２及び実施例２で測定された６ＰＧＤＨ残存活性を表５に示す。な残存活性は、対照試薬を４℃３日間静置した後に測定した６ＰＧＤＨ活性を１００％としたときの百分率で表される。
【００７３】
【表５】
【００７４】
表5より、ＮＡＤＰの存在下では比較例２のＳＨ化合物を添加しても６ＰＧＤＨの活性は低下し、ほとんど６ＰＧＤＨ安定化効果は得られなかった。しかし、実施例２のようにＳＨ化合物であっても、アミノ基を有するシステインを添加すると、高い残存活性が得られ、６ＰＧＤＨを安定化できることがわかった。また、上記式（ＩＩ）で表される化合物の一つであるヒドロキシルアミンはシステインを添加した場合よりもさらに高い残存活性が得られ、６ＰＧＤＨの保存安定性をより向上できることがわかった。
【００７５】
（比較例３）
下記組成を含むＣＫ活性測定用の第一試薬及び第二試薬を調製した。
＜第一試薬＞
イミダゾール緩衝剤 １４４ｍＭ（ｐＨ６．６）
ＥＤＴＡ ２．５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／ｌ
６ＰＧＤＨ ２００Ｕ／ｌ
＜第二試薬＞
クレアチンリン酸 １５０ｍＭ
【００７６】
ここでは、上記のうち、第一試薬に含まれる６ＰＧＤＨの安定化を評価したため、第一試薬のみを用いた。比較例３及び実施例３においては、この第一試薬を対照試薬とした。
【００７７】
この対照試薬を４℃３日間静置した後、６ＰＧＤＨ活性を測定した。次にこの試薬を３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００７８】
また、本比較例の対照試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン
４０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン
２０ｍＭ メルカプトエタノール
４０ｍＭ メルカプトエタノール
２０ｍＭ システイン酸
４０ｍＭ システイン酸
【００７９】
次に、上記の試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００８０】
（実施例３）
比較例３で調製した対照試薬に６ＰＧＤＨ安定化剤として以下に示すいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ アミノグアニジン
３０ｍＭ アミノグアニジン
４０ｍＭ アミノグアニジン
２０ｍＭ システイン
４０ｍＭ システイン
２０ｍＭ ヒドロキシルアミン
４０ｍＭ ヒドロキシルアミン
２０ｍＭ Ｎ−メチルヒドロキシルアミン
４０ｍＭ Ｎ−メチルヒドロキシルアミン
２０ｍＭ Ｏ−メチルヒドロキシルアミン
４０ｍＭ Ｏ−メチルヒドロキシルアミン
２０ｍＭ カルボキシメトキシルアミン
４０ｍＭ カルボキシメトキシルアミン
２０ｍＭ アセトヒドラジド
４０ｍＭ アセトヒドラジド
２０ｍＭ セミカルバジド
４０ｍＭ セミカルバジド
２０ｍＭ ヒドラジン
４０ｍＭ ヒドラジン
２０ｍＭ システアミン
４０ｍＭ システアミン
２０ｍＭ 亜硫酸ナトリウム
４０ｍＭ 亜硫酸ナトリウム
２０ｍＭ アミノエチルアミノエタノール
４０ｍＭ アミノエチルアミノエタノール
【００８１】
これらの試薬を４℃３日間静置して６ＰＧＤＨ活性を測定した。次に、これらの試薬に比較例３と同様にして温度負荷をかけ、温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００８２】
比較例３及び実施例３で測定した残存活性を表6に示す。残存活性は、４℃３日間静置した後に測定した６ＰＧＤＨ活性を１００％としたときの百分率で表される。
【００８３】
【表６】
【００８４】
表6より、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで表される実施例３の６ＰＧＤＨ安定化剤を添加すると、対照試薬の６ＰＧＤＨ残存活性に比べて高い残存活性を示した。また、アミノエチルアミノエタノールや、還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とするオキソ酸の塩である亜硫酸ナトリウムを用いた場合も高い残存活性を示した。以上より、これらの物質は試薬中の６ＰＧＤＨの保存安定性を向上できることがわかった。
【００８５】
比較例3のＮ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、２ＭＥ、およびシステイン酸のいずれかを添加した場合の残存活性は、対照試薬の残存活性とほとんど変わらない値であった。以上より、これらの物質は６ＰＧＤＨを安定化することができなかった。
【００８６】
Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミンは、上記式（ＩＩ）の構造式と類似しているが、式中のＮに結合している水素原子がエチル基に置換された構造を有する。このことより、式（ＩＩ）の構造を有する化合物においては、−ＮＨ−Ｏ−がＮＡＤＰの６ＰＧＤＨ不安定化効果を抑制し、６ＰＧＤＨを安定化していると考えられる。
２ＭＥはＳＨ化合物であるため、ＮＡＤＰ不存在下では６ＰＧＤＨ安定化効果を有する（実施例1参照）が、表6からもわかるようにＮＡＤＰ存在下では６ＰＧＤＨを安定化することができなかった。２ＭＥは、上記式（Ｉ）の構造式と類似しているが、アミノ基を有していない点で相違する。また、システイン酸は、上記式（Ｉ）の構造式と類似しているが、ＳＨを有していない点で相違する。
このことより、式（Ｉ）の構造を有する化合物においては、分子内のＳＨとアミノ基とがＮＡＤＰの６ＰＧＤＨ不安定化効果を抑制し、６ＰＧＤＨを安定化していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＣＫ活性測定の反応系を示した模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６ＰＧＤＨとする）を含有する試薬及び試薬中の６ＰＧＤＨを安定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
６ＰＧＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）などの補酵素の存在下で６−ホスホグルコン酸（以下、６ＰＧとする）を脱水し、還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）又は還元型ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）を生成する反応を触媒する酵素である。この触媒作用を利用して、６ＰＧＤＨは臨床検査用試薬等に用いられている（例えば、特許文献１）。
【０００３】
しかしながら試薬中の６ＰＧＤＨは不安定であり、試薬の保存中に酵素としての活性が著しく低下する。このため、試薬中の６ＰＧＤＨの失活を抑制し、安定化することのできる技術の開発が望まれている。
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２５０６９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨを安定化する物質（以下、６ＰＧＤＨ安定化剤とする）を含有する試薬を提供すること、及び６ＰＧＤＨ安定化剤を用いて６ＰＧＤＨを安定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素と、以下の群から選択される少なくとも一つの６ＰＧＤＨ安定化剤を含有する試薬を提供する：
下記式（Ｉ）
【０００７】
【化１】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）で表される水溶性化合物；
下記式（ＩＩ）
【０００８】
【化２】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）で表される水溶性化合物；
下記式（ＩＩＩ）
【０００９】
【化３】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【００１０】
【化４】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）で表される水溶性化合物；
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸；
前記酸素酸のチオ酸；
前記酸素酸または前記チオ酸の塩；および
アミノエチルアミノエタノール。
【００１１】
また、本発明は、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つの６ＰＧＤＨ安定化剤とを含有し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を実質的に含有しない、６ＰＧＤＨ含有試薬を提供する。
【００１２】
また、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素の存在下において、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、上記の６ＰＧＤＨ安定化剤のうち少なくとも一つとを共存させることにより、６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の実質的不存在下で、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つとを共存させることにより、６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤を含む試薬を提供することができる。また、試薬中の６ＰＧＤＨを安定化する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本実施形態の６ＰＧＤＨ含有試薬は、６ＰＧＤＨと６ＰＧＤＨ安定化剤とを含有する。６ＰＧＤＨ安定化剤とは、６ＰＧＤＨ含有試薬中で６ＰＧＤＨと共存させることにより６ＰＧＤＨの失活を抑制し、保存安定性を向上させることのできる物質を指す。本明細書においては「６ＰＧＤＨ安定化剤」は、６ＰＧＤＨ安定化剤の塩なども含む。６ＰＧＤＨ安定化剤の塩としては、無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩等）、有機酸塩（シュウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等）、塩基付加塩（ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等）などが挙げられる。
【００１６】
６ＰＧＤＨは、酵素反応の際にNADやNADPのような補酵素が必要である。補酵素は６ＰＧＤＨ含有試薬に含有させてもよいし、６ＰＧＤＨ含有試薬とは別容器に収容してもよい。
【００１７】
６ＰＧＤＨがＮＡＤやＮＡＤＰのような補酵素と共存する場合は、補酵素が６ＰＧＤＨを不安定化させる。試薬溶液中ではＮＡＤやＮＡＤＰが分解してＡＤＰリボースが生成する。生成したＡＤＰリボースの一部は、酸化されてアルデヒドとなり、このアルデヒド基が６ＰＧＤＨを不安定化させていると考えられる。この補酵素は強い不安定化効果をもたらすため、補酵素の存在下で６ＰＧＤＨを安定化させるためには、補酵素の不安定化効果を低減する化合物を用いることができる。補酵素の不安定化効果を低減させるためには、アルコールの酸化により生成したアルデヒドの影響を低減できるような物質が好適に用いられる。このような物質として、還元性を有する化合物が挙げられる。特に、還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、この酸素酸のチオ酸、この酸素酸またはチオ酸の塩、アミノ基を有する化合物などが有効である。アミノ基を有する化合物としては、上記式（Ｉ）や（ＩＩＩ）の構造を有する化合物が例示される。また、分子内に電気陰性度の高い窒素、酸素、硫黄などの元素が連結した構造（ＮＨ２−Ｎや、ＮＨ−Ｏ−など）を有する分子も有効である。このような物質としては、上記式（ＩＩ）や（ＩＩＩ）の構造を有する化合物が例示される。
【００１８】
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸およびそのチオ酸としては、スルホキシル酸〔H２SO２〕、亜硫酸〔H２SO３〕、チオ亜硫酸〔H２S２O２〕、チオ硫酸〔H２S２O３〕、亜ジチオン酸〔H２S２O４〕、二亜硫酸〔H２S２O５〕、ジチオン酸〔H２S２O６〕、二硫酸〔H２S２O７〕、ポリチオン酸〔H２SXO４（Xは3以上の整数）〕などが挙げられる。
【００１９】
上記酸素酸の塩およびチオ酸の塩としては、具体的には亜硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4）2ＳＯ3〕、亜硫酸カリウム〔Ｋ2ＳＯ3〕、亜硫酸カルシウム〔ＣａＳＯ3〕、亜硫酸水素アンモニウム〔ＮＨ4ＨＳＯ3〕、亜硫酸水素ナトリウム〔ＮａＨＳＯ3〕、亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ2ＳＯ3〕、亜硫酸バリウム〔ＢａＳＯ3〕、亜硫酸ビスマス〔Ｂｉ2（ＳＯ3）3〕、亜硫酸水素カリウム〔ＫＨＳＯ3〕、チオ硫酸アンモニウム〔（ＮＨ4）2Ｓ2Ｏ3〕、チオ硫酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ3〕、チオ硫酸バリウム〔ＢａＳ2Ｏ3〕、チオ硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ2Ｏ3〕、チオ硫酸カルシウム〔ＣａＳ2Ｏ3〕、チオ硫酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ3〕、亜ジチオン酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ4〕、亜ジチオン酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ4〕、亜ジチオン酸カルシウム〔ＣａＳ2Ｏ4〕、二亜硫酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ5〕、二亜硫酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ5〕、二亜硫酸マグネシウム〔ＭｇＳ2Ｏ5〕、二亜硫酸カルシウム〔ＣａＳ2Ｏ5〕、ジチオン酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ6〕、二硫酸カリウム〔Ｋ2Ｓ2Ｏ7〕、二硫酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ2Ｏ7〕、四チオン酸ナトリウム〔Ｎａ2Ｓ4Ｏ6〕などが例示される。
【００２０】
また、以下のような式（I）〜（III）に表されるような水溶性化合物も好適に用いられる。
【００２１】
【化５】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）
【００２２】
【化６】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）
【００２３】
【化７】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【００２４】
【化８】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）
【００２５】
ここで、上記式（II）および（III）における低級アルキルとは、直鎖または分岐状の炭素数１〜６のアルキル（たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等）であり、置換基を有していてもよい。
上記式（ＩＩ）における低級アルケニルとは、直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルケニル（たとえば、ビニル、アリル、イソプロペニル、４−ペンテニル、５−ヘキセニル等）であり、置換基を有していてもよい。
上記式（ＩＩ）における低級アルカノイルとしては、直鎖もしくは分岐状の炭素数１〜６のアルカノイル（たとえば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、ピバロイル、ペンタノイル等）であり、置換基を有していてもよい。
置換基としては、たとえばヒドロキシ、カルボキシ、ハロゲン、アミノなどが挙げられる。
【００２６】
上記式（I）で表される化合物は、R2またはR3のNH２が補酵素のアルデヒドによる不安定化効果を低減させると推測される。また、この化合物はR2またはR3にSHを有しているため、これが直接６ＰＧＤＨを安定化させる効果もあると考えられる。。
【００２７】
上記式（I）で表される化合物としては、下記表１に挙げられる化合物が例示される。
【００２８】
【表１】
【００２９】
上記式（ＩＩ）で表される化合物としては、下記表２に挙げられる化合物が例示される。
【００３０】
【表２】
【００３１】
上記式（ＩＩＩ）で表される化合物としては、下記表３に挙げられる化合物が例示される。
【００３２】
【表３】
【００３３】
上記の他に、アミノエチルアミノエタノールも補酵素の６ＰＧＤＨに対する不安定化効果を低減させることができる。
【００３４】
６ＰＧＤＨと、補酵素とを別々の容器に収容した場合は、補酵素によって６ＰＧＤＨが不安定となることはない。しかし、元来６ＰＧＤＨは不安定な酵素であるため、補酵素を実質的に含有しない溶液中でも酵素活性が低下する。補酵素の実質的不存在下では、上述したような補酵素存在下で６ＰＧＤＨを安定化する物質では満足な６ＰＧＤＨ安定化効果を得ることができない。このため、６ＰＧＤＨを安定化するために６ＰＧＤＨに直接作用して６ＰＧＤＨの失活を抑制することのできる物質を用いることができる。このような作用を有する物質としては、ＳＨ基を有する化合物（以下、ＳＨ化合物とする）が挙げられる。６ＰＧＤＨは溶液中で酸化されて活性が減少するため、還元性を有するＳＨ化合物を作用させることにより、失活を抑制することができると考えられる。
【００３５】
補酵素の実質的不存在下で６ＰＧＤＨを安定化することのできるＳＨ化合物としては、ＳＨ基を有していれば特に限定されないが、たとえばＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、チオグリセロール、β−メルカプトプロピオン酸、システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）等が挙げられる。
【００３６】
また、上記以外の物質で、シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）などのキレート剤や、ＰＩＰＥＳやＡＤＡなどの緩衝剤も６ＰＧＤＨを安定化することができる。溶液中に不純物として金属イオンが含まれているとこれが原因となって６ＰＧＤＨが不安定化することがあるため、上記のようなキレート効果を有する物質も有効であると考えられる。
【００３７】
上述の６ＰＧＤＨ安定化剤は、単独で用いてもよいし併用してもよい。
【００３８】
試薬中の６ＰＧＤＨ安定化剤の濃度としては、６ＰＧＤＨを安定化できる濃度であれば特に限定されない。
【００３９】
本実施形態で用いることのできる６ＰＧＤＨは、バクテリア、酵母、動植物などに由来するものであってもよく、遺伝子組み換え技術を用いて生成されたものであってもよい。
【００４０】
６ＰＧＤＨ含有試薬の溶液状態におけるｐＨとしては、６ＰＧＤＨを不安定化させるｐＨでなければ特に限定されないが、５〜８であることが好ましい。このｐＨを維持するために、試薬に緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、例えばトリス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤などを用いることができる。
【００４１】
本実施形態の６ＰＧＤＨ含有試薬は臨床検査に用いることができる。生体から採取した試料あるいはこれを前処理した試料に６ＰＧＤＨ含有試薬を混合し、吸光度の変化などをモニターして試料中の特定の物質の定量や特定の酵素の活性測定などを行うことができる。
試料としては、例えば、血清、血漿、血液、髄液、尿、精液などが挙げられるが、血漿又は血清を用いることが好ましい。
【００４２】
６ＰＧＤＨ含有試薬を用いて定量又は活性測定し得る物質としては、反応系に６ＰＧＤＨの基質である６ＰＧを用いていれば特に限定されない。定量し得る物質としては、例えば、中性脂肪、無機リン酸、ラクトース、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュークロース、グルコース、フルクトース、マンノース、クレアチンリン酸、Ｇ６Ｐ、フルクトース−６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトース−２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコースなどが挙げられる。また、活性測定し得る物質としては、例えば、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、ＣＫのアイソザイム（例えば、ＣＫＭＢなど）、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミログルコシダーゼ、インベルターゼ、トランスアルドラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、フルクトースジフォスファターゼなどの酵素が挙げられる。
【００４３】
上記のうち、ＣＫの活性測定に用いられる６ＰＧＤＨ含有試薬について以下に説明する。
ＣＫとは二つのサブユニットからなる二量体のリン酸化酵素である。ＣＫのサブユニットにはＢ型（脳型）及びＭ型（筋型）の二種類が存在する。ＣＫには、二種類のサブユニットの組み合わせによって三種類のアイソザイム（ＣＫＭＭ、ＣＫＭＢ及びＣＫＢＢ）が存在し、ＣＫＭＭは骨格筋に多く含まれ、ＣＫＭＢは心筋に多く含まれ、ＣＫＢＢは脳に多く含まれる。心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの疾患によって疾患の原因部位に存在するＣＫアイソザイムが血液中に逸脱するため、臨床検査において血清などの試料に含まれるＣＫアイソザイムの活性値は上記疾患を診断する際の重要な指標となる。ＣＫ活性の測定に供される試料としては、血清や血漿などを用いることができる。
【００４４】
ＣＫ活性測定用試薬には、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤の他に、緩衝剤、ＳＨ化合物、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、Ｇ６ＰＤＨ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、マグネシウムイオン及びクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。
【００４５】
試料とＣＫ活性測定用試薬とを混合すると、試料に含まれるＣＫがＳＨ化合物によって活性化される（ＳＨ化合物は補酵素不存在下で６ＰＧＤＨを安定化するだけでなく、ＣＫを活性化する作用を有する）。ＣＫは血液中に逸脱すると不活性化するため、ＣＫの活性を測定するためには先ずＳＨ化合物によってＣＫを活性化する必要がある。ＳＨ化合物としては、ＣＫを活性化できるものであれば特に限定されないが、例えば、ＮＡＣ、システアミン、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン、βメルカプトプロピオン酸、２ＭＥ及びチオグリセロールなどを用いることができる。これらの化合物は、二種類以上を組み合わせて用いてもよいし、単独で用いてもよい。ＳＨ基を有する化合物の試薬中の濃度は、５〜２５０ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜４０ｍＭである。
【００４６】
ＣＫを含む試料に上記成分を含むＣＫ活性測定用試薬を添加することにより、図１に示すような反応系が構築される。図１において、ＳＨ化合物によって活性化されたＣＫは、クレアチンリン酸及びＡＤＰからクレアチン及びＡＴＰを生成する反応を触媒する（反応１）。試薬に含まれるＨＫ又はＧＫは、試薬に含まれるグルコース及び反応１で生成したＡＴＰからＧ６Ｐ及びＡＤＰを生成させる(反応２)。さらに試薬に含まれるＧ６ＰＤＨは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ及び反応２で生成したＧ６Ｐから６−ホスホグルコン酸（６ＰＧ）及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応３）。次に、試薬に含まれる６ＰＧＤＨは、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ及び反応３で生成した６ＰＧから二酸化炭素、リブロース−５−リン酸及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応４）。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが生成すると試料と６ＰＧＤＨ含有試薬との混合液の波長３４０ｎｍ付近での吸光度が上昇する。この吸光度の上昇をモニターすることにより、試料中のＣＫの活性を測定することができる。
【００４７】
ＣＫ活性測定用試薬は二種類以上の試薬からなる試薬キットであることが好ましい。第一試薬及び第二試薬からなるＣＫ活性測定用試薬キットは、緩衝剤、ＡＤＰ、グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ＨＫ又はＧＫ、Ｇ６ＰＤＨ、ＳＨ化合物、６ＰＧＤＨ及び６ＰＧＤＨ安定化剤を含む第一試薬と、クレアチンリン酸を含む第二試薬とからなることが好ましい。
【００４８】
第一試薬、第二試薬及び第三試薬からなるＣＫ活性測定用試薬キットは、緩衝剤、ＡＤＰ、グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ＨＫ又はＧＫ、Ｇ６ＰＤＨ及びＳＨ化合物を含む第一試薬と、クレアチンリン酸を含む第二試薬と、６ＰＧＤＨと６ＰＧＤＨ安定化剤とを含む第三試薬とからなることが好ましい。
【００４９】
上記成分の他に、防腐剤、キレート剤などを適宜試薬に添加してもよい。防腐剤としては例えばアジ化ナトリウムなどを用いることができる。キレート剤は試料中の金属イオンによるＣＫ活性の阻害を抑制するために用いられ、具体的にはＥＤＴＡなどを用いることができる。
【００５０】
また、界面活性作用を有する化合物を試薬に添加してもよい。例えば、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤、アルブミンなどを用いることができ、具体的にはトライトン類（Union Carbide Chemicals and Plastics Co.の登録商標）、エマルゲン類（花王（株）の登録商標）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などを用いることができる。
【００５１】
試料にはアデニレートキナーゼが含まれていることがある。アデニレートキナーゼは特に溶血試料に多く含まれており、ＣＫの活性測定に悪影響を及ぼす。この悪影響を回避するため、試薬にアデニレートキナーゼの作用を阻害する阻害剤を加えることが好ましい。阻害剤の種類としてはアデニレートキナーゼの作用を阻害するものであれば特に限定されないが、例えばアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）やＰ１Ｐ５ジアデノシン−５’−ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）などを用いることができる。
【００５２】
さらに、ダブルカイネティック法で活性測定することにより、アデニレートキナーゼなどの測定対象ではない酵素の悪影響を回避することも可能である。ダブルカイネティック法では、先ずアデニレートキナーゼなどの酵素の活性を測定し、その後クレアチンリン酸を添加し、ＣＫによる酵素反応を開始させて試料に含まれるキナーゼの活性（ＣＫの活性とアデニレートキナーゼなどの酵素の活性との和）を測定する。これらの測定結果の差がＣＫの活性値となる。
【００５３】
なお、上述のＣＫ活性測定用試薬キットを構成する何れかの試薬に、ＣＫのＭ型サブユニットを特異的に認識する抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ抗体とする）を含有させることにより、試料中のＣＫＭＢの活性を測定することが可能となる(Wurzburg et al., 1977, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15:131-135)。抗ＣＫ−Ｍ抗体を試薬に含有させると、試料中のＣＫアイソザイムのうち、ＣＫＭＭのＭ型サブユニットに抗ＣＫ−Ｍ抗体が結合し、ＣＫＭＭ活性が完全に阻害される。また、試料中のＣＫＢＢの活性は無視できるほど小さい。ＣＫＭＢのＭ型サブユニットにも抗ＣＫ−Ｍ抗体が結合するが、Ｂ型サブユニットには結合しないため、ＣＫＭＢのＢ型サブユニットの活性を測定し、これを二倍することによりＣＫＭＢ活性として算出することができる。抗ＣＫ−Ｍ抗体は、第一試薬に含有させることが好ましい。抗ＣＫ−Ｍ抗体としては、Ｍ型サブユニットを特異的に認識する抗体であればポリクローナル抗体やモノクローナル抗体でもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。
【００５４】
以下、実施例及び比較例を示して、６ＰＧＤＨ安定化剤の６ＰＧＤＨ安定化効果を分析した。以下の実施例及び比較例において、６ＰＧＤＨの活性測定は、６ＰＧＤＨを含む試薬４．５μｌに、基質溶液２７０μｌ（０．７ｍｇ／ｍｌの塩化マグネシウム６水和物、０．３ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＰ及び０．９ｍｇ／ｍｌの６ＰＧを含む）を添加して３４０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行われた。
【００５５】
（比較例１）
下記組成を含むＣＫ活性測定用の第一試薬〜第三試薬を調製した。
＜第一試薬＞
イミダゾール緩衝剤 １４４ｍＭ（ｐＨ６．６）
ＮＡＣ ２０ｍＭ
ＥＤＴＡ ２．５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／ｌ
＜第二試薬＞
クレアチンリン酸 １５０ｍＭ
＜第三試薬＞
６ＰＧＤＨ ２００Ｕ／ｌ
イミダゾール緩衝剤 １４４ｍＭ（ｐＨ６．６）
【００５６】
本実施例では、上記のうち、第三試薬に含まれる６ＰＧＤＨの安定化を評価したため、第三試薬のみを用いた。比較例１及び実施例１においては、この第三試薬を対照試薬とした。この対照試薬を４℃で３日間保存し、６ＰＧＤＨの活性を測定した。
【００５７】
次に、対照試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００５８】
また、対照試薬である上記第三試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ アミノグアニジン
２０ｍＭ アセトヒドラジン
２０ｍＭ ヒドラジン
２０ｍＭ ヒドロキシルアミン
２０ｍＭ セミカルバジド
１．２ｇ／Ｌ βＮＡＤＰ
２．４ｇ／Ｌ βＮＡＤＰ
３．６ｇ／Ｌ βＮＡＤＰ
【００５９】
次に、上記の試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００６０】
（実施例１）
比較例１で調製した対照試薬に６ＰＧＤＨ安定化剤として以下に示すいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
４２．５ｍＭ チオグリセロール
８５ｍＭ チオグリセロール
２０ｍＭ βメルカプトプロピオン酸
２０ｍＭ システイン
２０ｍＭ システイン及び１０ｍＭ チオグリセロール
２０ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ ２ＭＥ
２ｍＭ ＣｙＤＴＡ
また、１４４ｍＭのイミダゾール緩衝剤ではなく、６ＰＧＤＨ安定化剤として１４４ｍＭのＰＩＰＥＳを用いること以外は比較例１の対照試薬と同様にして試薬を調製した。
１４４ｍＭのイミダゾール緩衝剤ではなく、６ＰＧＤＨ安定化剤として１４４ｍＭのＡＤＡを用いること以外は、比較例１の対照試薬と同様にして試薬を調製した。
【００６１】
これらの試薬を４℃３日間静置した後、６ＰＧＤＨ活性を測定した。次に、これらの試薬を３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨ残存活性を測定した。
【００６２】
比較例１および実施例１で測定された残存活性を表４に示す。残存活性は、４℃３日間静置した後に測定した６ＰＧＤＨ活性を１００％としたときの百分率で表される。
【００６３】
【表４】
【００６４】
表1より、対照試薬（添加物なし）の場合は温度負荷後、６ＰＧＤＨ活性が温度負荷前に比べて７６．１％に減少していた。
また、対照試薬にＮＡＤＰを加えた場合は温度負荷後６ＰＧＤＨ活性が著しく低下した。このことより、ＮＡＤＰには強い６ＰＧＤＨ不安定化効果があることが確認された。
【００６５】
ＮＡＤＰの不安定化効果を抑制して６ＰＧＤＨを安定化させる物質である、比較例１の添加物は、ＮＡＤＰが含まれない対照試薬中では６ＰＧＤＨを安定化する効果は認められなかった。
【００６６】
実施例１で用いた６ＰＧＤＨ安定化剤を添加した場合は温度負荷後も６ＰＧＤＨ残存活性が１００％に近い値を示した。
以上より、これらの添加物（ＳＨ化合物、ＣｙＤＴＡ、ＰＩＰＥＳおよびＡＤＡ）は、ＮＡＤＰの実質的不存在下で６ＰＧＤＨの保存安定性を向上できることがわかった。
【００６７】
（比較例２）
２００Ｕ／ｌの６ＰＧＤＨと、１４４ｍＭのイミダゾール緩衝剤（ｐＨ６．６）と、１．２ｇ／ｌのＮＡＤＰとを含む対照試薬を調製した。この試薬を４℃３日間静置し、６ＰＧＤＨ活性を測定した。次に、この試薬を３７℃で３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００６８】
また、本比較例の対照試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ ＮＡＣ
４０ｍＭ ＮＡＣ
４２．５ｍＭ チオグリセロール
８５ｍＭ チオグリセロール
２０ｍＭ βメルカプトプロピオン酸
２０ｍＭ ＤＴＴ
２０ｍＭ ２ＭＥ
【００６９】
次に、上記の試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００７０】
（実施例２）
比較例２で調製した対照試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ ヒドロキシルアミン
２０ｍＭ システイン
２０ｍＭ システイン及び１０ｍＭ チオグリセロール
【００７１】
次に、上記の試薬に対して比較例２と同様に温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００７２】
比較例２及び実施例２で測定された６ＰＧＤＨ残存活性を表５に示す。な残存活性は、対照試薬を４℃３日間静置した後に測定した６ＰＧＤＨ活性を１００％としたときの百分率で表される。
【００７３】
【表５】
【００７４】
表5より、ＮＡＤＰの存在下では比較例２のＳＨ化合物を添加しても６ＰＧＤＨの活性は低下し、ほとんど６ＰＧＤＨ安定化効果は得られなかった。しかし、実施例２のようにＳＨ化合物であっても、アミノ基を有するシステインを添加すると、高い残存活性が得られ、６ＰＧＤＨを安定化できることがわかった。また、上記式（ＩＩ）で表される化合物の一つであるヒドロキシルアミンはシステインを添加した場合よりもさらに高い残存活性が得られ、６ＰＧＤＨの保存安定性をより向上できることがわかった。
【００７５】
（比較例３）
下記組成を含むＣＫ活性測定用の第一試薬及び第二試薬を調製した。
＜第一試薬＞
イミダゾール緩衝剤 １４４ｍＭ（ｐＨ６．６）
ＥＤＴＡ ２．５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／ｌ
６ＰＧＤＨ ２００Ｕ／ｌ
＜第二試薬＞
クレアチンリン酸 １５０ｍＭ
【００７６】
ここでは、上記のうち、第一試薬に含まれる６ＰＧＤＨの安定化を評価したため、第一試薬のみを用いた。比較例３及び実施例３においては、この第一試薬を対照試薬とした。
【００７７】
この対照試薬を４℃３日間静置した後、６ＰＧＤＨ活性を測定した。次にこの試薬を３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００７８】
また、本比較例の対照試薬に下記のいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン
４０ｍＭ Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン
２０ｍＭ メルカプトエタノール
４０ｍＭ メルカプトエタノール
２０ｍＭ システイン酸
４０ｍＭ システイン酸
【００７９】
次に、上記の試薬に対して３７℃３日間静置して温度負荷をかけた。温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００８０】
（実施例３）
比較例３で調製した対照試薬に６ＰＧＤＨ安定化剤として以下に示すいずれかの物質を添加し、試薬を調製した。
２０ｍＭ アミノグアニジン
３０ｍＭ アミノグアニジン
４０ｍＭ アミノグアニジン
２０ｍＭ システイン
４０ｍＭ システイン
２０ｍＭ ヒドロキシルアミン
４０ｍＭ ヒドロキシルアミン
２０ｍＭ Ｎ−メチルヒドロキシルアミン
４０ｍＭ Ｎ−メチルヒドロキシルアミン
２０ｍＭ Ｏ−メチルヒドロキシルアミン
４０ｍＭ Ｏ−メチルヒドロキシルアミン
２０ｍＭ カルボキシメトキシルアミン
４０ｍＭ カルボキシメトキシルアミン
２０ｍＭ アセトヒドラジド
４０ｍＭ アセトヒドラジド
２０ｍＭ セミカルバジド
４０ｍＭ セミカルバジド
２０ｍＭ ヒドラジン
４０ｍＭ ヒドラジン
２０ｍＭ システアミン
４０ｍＭ システアミン
２０ｍＭ 亜硫酸ナトリウム
４０ｍＭ 亜硫酸ナトリウム
２０ｍＭ アミノエチルアミノエタノール
４０ｍＭ アミノエチルアミノエタノール
【００８１】
これらの試薬を４℃３日間静置して６ＰＧＤＨ活性を測定した。次に、これらの試薬に比較例３と同様にして温度負荷をかけ、温度負荷後、６ＰＧＤＨの残存活性を測定した。
【００８２】
比較例３及び実施例３で測定した残存活性を表6に示す。残存活性は、４℃３日間静置した後に測定した６ＰＧＤＨ活性を１００％としたときの百分率で表される。
【００８３】
【表６】
【００８４】
表6より、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで表される実施例３の６ＰＧＤＨ安定化剤を添加すると、対照試薬の６ＰＧＤＨ残存活性に比べて高い残存活性を示した。また、アミノエチルアミノエタノールや、還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とするオキソ酸の塩である亜硫酸ナトリウムを用いた場合も高い残存活性を示した。以上より、これらの物質は試薬中の６ＰＧＤＨの保存安定性を向上できることがわかった。
【００８５】
比較例3のＮ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、２ＭＥ、およびシステイン酸のいずれかを添加した場合の残存活性は、対照試薬の残存活性とほとんど変わらない値であった。以上より、これらの物質は６ＰＧＤＨを安定化することができなかった。
【００８６】
Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミンは、上記式（ＩＩ）の構造式と類似しているが、式中のＮに結合している水素原子がエチル基に置換された構造を有する。このことより、式（ＩＩ）の構造を有する化合物においては、−ＮＨ−Ｏ−がＮＡＤＰの６ＰＧＤＨ不安定化効果を抑制し、６ＰＧＤＨを安定化していると考えられる。
２ＭＥはＳＨ化合物であるため、ＮＡＤＰ不存在下では６ＰＧＤＨ安定化効果を有する（実施例1参照）が、表6からもわかるようにＮＡＤＰ存在下では６ＰＧＤＨを安定化することができなかった。２ＭＥは、上記式（Ｉ）の構造式と類似しているが、アミノ基を有していない点で相違する。また、システイン酸は、上記式（Ｉ）の構造式と類似しているが、ＳＨを有していない点で相違する。
このことより、式（Ｉ）の構造を有する化合物においては、分子内のＳＨとアミノ基とがＮＡＤＰの６ＰＧＤＨ不安定化効果を抑制し、６ＰＧＤＨを安定化していると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＣＫ活性測定の反応系を示した模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素と、
下記式（Ｉ）
【化１】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩ）
【化２】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩＩ）
【化３】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【化４】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）で表される水溶性化合物、
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、
前記酸素酸のチオ酸、
前記酸素酸または前記チオ酸の塩、および
アミノエチルアミノエタノールからなる群より選択される少なくとも一つとを含有する６ＰＧＤＨ含有試薬。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表される水溶性化合物が、システインまたはシステアミンであり、前記式（ＩＩ）で表される水溶性化合物が、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、またはカルボキシメトキシルアミンであり、前記式（III）で表される化合物が、アミノグアニジン、アセトヒドラジド、セミカルバジド、ヒドラジン、またはヒドロキシルアミンであり、前記酸素酸が亜硫酸である、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をさらに含む、請求項１または２に記載の６ＰＧＤＨ含有試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の６ＰＧＤＨ含有試薬と、
クレアチンリン酸を含む試薬とを備える試薬キット。
【請求項５】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つとを含有し、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を実質的に含有しない、
６ＰＧＤＨ含有試薬。
【請求項６】
前記SH基を有する化合物が、N-アセチル−L-システイン、チオグリセロール、β−メルカプトプロピオン酸、システイン、ジチオスレイトール（DTT）、および２−メルカプトエタノールからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項５記載の試薬。
【請求項７】
ＳＨ基を有する化合物と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）と、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼと、グルコースと、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを含む試薬と、
クレアチンリン酸を含む試薬と、
請求項５または６記載の試薬とを備える試薬キット。
【請求項８】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素の存在下において、
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
下記式（Ｉ）
【化５】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩ）
【化６】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩＩ）
【化７】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【化８】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）で表される水溶性化合物、
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、
前記酸素酸のチオ酸、
前記酸素酸または前記チオ酸の塩、および
アミノエチルアミノエタノールからなる群より選択される少なくとも一つとを共存させることにより、前記６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法。
【請求項９】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の実質的不存在下で、
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つとを共存させることにより、前記６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法。
【請求項１】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素と、
下記式（Ｉ）
【化１】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩ）
【化２】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩＩ）
【化３】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【化４】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）で表される水溶性化合物、
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、
前記酸素酸のチオ酸、
前記酸素酸または前記チオ酸の塩、および
アミノエチルアミノエタノールからなる群より選択される少なくとも一つとを含有する６ＰＧＤＨ含有試薬。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表される水溶性化合物が、システインまたはシステアミンであり、前記式（ＩＩ）で表される水溶性化合物が、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、またはカルボキシメトキシルアミンであり、前記式（III）で表される化合物が、アミノグアニジン、アセトヒドラジド、セミカルバジド、ヒドラジン、またはヒドロキシルアミンであり、前記酸素酸が亜硫酸である、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース及びアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）をさらに含む、請求項１または２に記載の６ＰＧＤＨ含有試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の６ＰＧＤＨ含有試薬と、
クレアチンリン酸を含む試薬とを備える試薬キット。
【請求項５】
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つとを含有し、
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を実質的に含有しない、
６ＰＧＤＨ含有試薬。
【請求項６】
前記SH基を有する化合物が、N-アセチル−L-システイン、チオグリセロール、β−メルカプトプロピオン酸、システイン、ジチオスレイトール（DTT）、および２−メルカプトエタノールからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項５記載の試薬。
【請求項７】
ＳＨ基を有する化合物と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）と、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼと、グルコースと、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とを含む試薬と、
クレアチンリン酸を含む試薬と、
請求項５または６記載の試薬とを備える試薬キット。
【請求項８】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）からなる群より選択される少なくとも一つの補酵素の存在下において、
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
下記式（Ｉ）
【化５】
（Ｒ１は水素原子、ＣＨ３、またはＳＯ３Ｈ；Ｒ２は、ＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、またはＮＨ２であり、Ｒ３はＳＨ、ＣＨ２ＳＨ、ＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ４は水素原子、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＨ２、ＯＣＨ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、またはＣＯＯＣ２Ｈ５である。ただし、Ｒ２がＳＨまたはＣＨ２ＳＨの場合、Ｒ３はＮＨ２、ＮＨＣＯＮＨ２、またはＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２の場合、Ｒ３はＳＨ、またはＣＨ２ＳＨである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩ）
【化６】
（Ｒ５およびＲ６は同一または異なって、水素原子、NH２、低級アルキル、シクロアルキル、低級アルケニル、アラルキル、アリール、低級アルカノイル、アロイル、シンナミル、またはシンナモイルである）で表される水溶性化合物、
下記式（ＩＩＩ）
【化７】
（Ｒ７およびＲ８は同一または異なって、水素原子、低級アルキル、アリル、ＣＨＯ、Ｃ（ＮＨ）ＮＨＮＨ２、ＣOＣＨ３、ＣＨ３ＯＣＯ、Ｃ２Ｈ５ＯＣＯまたは下記式（ＩＶ）
【化８】
（R９は硫黄原子、酸素原子、NHまたはNNH２であり、R１０は低級アルキル、NH２、NHNH２、CONH２、またはCONHNH２である）で表される基である）で表される水溶性化合物、
還元性を有し且つ硫黄原子を中心原子とする酸素酸、
前記酸素酸のチオ酸、
前記酸素酸または前記チオ酸の塩、および
アミノエチルアミノエタノールからなる群より選択される少なくとも一つとを共存させることにより、前記６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法。
【請求項９】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）の実質的不存在下で、
６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６ＰＧＤＨ）と、
シクロヘキシルジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)（ＰＩＰＥＳ）、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid（ＡＤＡ）、およびＳＨ基を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一つとを共存させることにより、前記６ＰＧＤＨを安定化させる６ＰＧＤＨ安定化方法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１１１０４５（Ｐ２００７−１１１０４５Ａ）
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５９１９３（Ｐ２００６−２５９１９３）
【出願日】平成１８年９月２５日（２００６．９．２５）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１０日（２００７．５．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２５日（２００６．９．２５）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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