６−置換−Δ６−プレグナンの真菌酸化による１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造方法
６−置換−Δ６−プレグナンの真菌酸化による１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造方法が開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンを真菌酸化して式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を生成し、続いて式IIIの１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを製造するための化学的脱炭酸反応段階に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン（ノメゲストロール(nomegestrol)）及び関連する式IIIの分子は、薬理学的に活性な１９−ノルステロイドを合成するための有用なステロイド中間体である。例えば、１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン（ノメゲストロール）は、女性の健康ステロイドである酢酸ノメゲストロール（１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１７アセテート）の合成に使用することができる。
【０００３】
米国特許第４,２８４,７２０号は、アンドロスタン又はプレグナン系列の１０−メチルステロイドをニグロスポラ属(Nigrospora)の真菌培養物を用いる発酵によって対応する１９−ヒドロキシステロイドに変換することを開示している。
【０００４】
１９−ノル−ステロイドは１９−ヒドロキシステロイドから化学的に合成されてきた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一般的に、本発明は、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンを真菌酸化して式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を生成するための実用的方法、続いて式IIIの１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを製造するための化学的脱炭酸反応段階を提供する。
【０００６】
すなわち、本発明は、式Ｉ
【化１】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の６−置換−Δ６−プレグナンを、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの１９炭素を酸化できるニグロスポラ属の種を含む生物変換反応培養物と接触させることを含む：
【０００７】
式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの真菌酸化による式II
【化２】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造方法を提供する。
【０００８】
定義
以下の定義及び説明は明細書及び請求項の両者を含めて、この書類全体を通して用いられる用語のためのものである。
全ての温度は摂氏度である。
「ｒ.ｐ.ｍ.」は毎分の回転数を指す。
「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを指す。
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指す。
「ｐｓｉｇ」は平方インチゲージ当たりのポンドを指す。
「ＲＯ」は逆浸透を指す。
【０００９】
溶剤混合物が用いられる場合、溶剤の比は容量／容量(v/v)である。溶剤への固体の溶解性が用いられる場合、用いられる固体と溶剤との比は重量／容量(wt/v)である。
【００１０】
一般的に、本発明は、式Ｉ
【化３】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の６−置換−Δ6−プレグナンを真菌酸化による、式II
【化２】
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は式ＩのＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4と同一である）の１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造に関する。
【００１１】
式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの１９炭素を酸化できるニグロスポラ属の全ての糸状菌を、式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造に使用することができる。実施例１の手順は、ニグロスポラ属の特定の糸状菌が、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナン
の１９炭素を酸化できるかどうかを決定するために使用することができる。
【００１２】
続いて、式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を回収し、そして化学的に脱炭酸反応させて式III
【化５】
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は式ＩのＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4と同一である）の１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを製造することができる。
【００１３】
本発明者らは、式Ｉの６−置換−Δ6−プレグナンと、ニグロスポラの特定の菌株、特にニグロスポラ・スフェリカ(Nigrospora sphaerica) ATCC 12772、ニグロスポラ・ゴルレンコアヌム(Nigrospora gorlenkoanum) ATCC 24718 及びニグロスポラ・オリゼ(Nigrospora oryzae) ATCC 42775 との接触が式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を生成したことを見出した。
【００１４】
本発明の方法において、生物変換反応培地は界面活性剤及び高レベルの炭素源を含む。界面活性剤は、非イオンアミド、非イオンエステル、例えばエトキシル化アルキルフェノール及びポリオキシエチレンソルビタンエステル、乳化ろう、非イオンエトキシル化物、トリスチリルフェノールエトキシル化物、アルコールエトキシル化物、例えばオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、エトキシル化メルカプタン、キャップドエトキシル化物、ブロックコポリマー及び逆コポリマーを包含する非イオン洗剤からなる群から選択される。好ましくは、エトキシル化アルキルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンエステル又はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールが界面活性剤として用いられる。使用される非イオン洗剤濃度は、約０.１ｍＬ／Ｌ又は０.１ｇ／Ｌ〜約４ｍＬ／Ｌ又は４ｇ／Ｌであってよいが、典型的には約１ｍＬ／Ｌ又は１ｇ／Ｌ〜約２ｍＬ／Ｌ又は２ｇ／Ｌである。
【００１５】
炭素源は、単糖、二糖、三糖、多糖加水分解物及び糖アルコールからなる群から選択される。典型的には、グルコースが炭素源として用いられる。炭素源の濃度は、約２ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌであってよいが、典型的には約５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌである。
【００１６】
好ましくは、真菌を、当技術分野で認められた任意の手順を用いて、好気性条件下の深部培養で生育させ、そして酸化反応をその場で行わせる。所望のニグロスポラ属真菌を、当業者に公知の条件、方法、炭素源及び窒素源を用いて培養する。一般的に、真菌１９−酸化に備えて、一次及び二次増殖性種培養手順が用いられる。別法として、一次増殖性種培養物を、真菌１９−酸化の生物変換反応培地に接種するために直接用いることができる。
【００１７】
一次増殖性種培養物を、約２０℃〜約３７℃（好ましくは約２８℃）及び約３.０〜約７.５のｐＨで約２４〜約９６時間（好ましくは約４８〜７２時間）の期間インキュベートする。二次増殖性種培地に、約０.００６％〜約０.２５％[v/v]、しかし典型的には約０.０１２％〜約０.１％[v/v]の一次増殖性種培養物を接種し、そして約２０℃〜約３７℃（好ましくは約２８℃）で約３６〜約７２時間（好ましくは約４８〜６０時間）の期間インキュベートする。二次種培地のｐＨは約３.０〜約７.５であってよいが、好ましくは約５.０〜約７.０である。二次増殖性種培地と同一でも異なってもよい生物変換反応培地に、約１％〜約１０％[v/v]（好ましくは約３％〜約５％）の二次増殖性種培養物を接種する。約１２〜約７２時間（好ましくは約１６〜約２４時間）の初期インキュベーション期間の後、式Ｉのステロイド基質、好ましくは微粉末化物を生物変換反応培養物に加える。式Ｉの微粉末化ステロイド基質は、乾燥粉末又は水性スラリーとして、一度の添加、一連の添加又は連続供給のいずれかとして添加することができる。式Ｉの微粉末化ステロイド基質を１ｇ／Ｌより高い、より好ましくは２ｇ／Ｌより高い、よりいっそう好ましくは４ｇ／Ｌより高い濃度で用いることが好ましい。式Ｉのステロイド基質から式IIの１９−酸化生成物を形成するための生物変換反応を約１〜約９日間、しかし典型的には約２〜約６日間進行させる。変換反応は当業者に公知のクロマトグラフィー方法、例えばＨＰＬＣにより監視することができる。好適なＨＰＬＣ方法は実施例１に提供されている。
【００１８】
式Ｉのステロイド基質から式IIの１９−酸化生成物を生成する生物変換反応が終了したとき、当技術分野で認められた多数の手順の何れか一つを用いて式IIの化合物を回収することができる。好ましくは、全体の又は濾過した発酵物を、式IIの生成物が酸形態になるまでｐＨを下方に調節することにより、水非混和性有機溶剤、例えば塩化メチレンで抽出する。次いで、水非混和性有機溶剤を蒸発により濃縮する。次いで、式IIのカルボン酸生成物がイオン化されるまでｐＨを上方に調節する（ｐＨ８〜９）ことにより、式IIの生成物を水中に抽出する。この水性抽出物を水混和性溶剤、例えばメタノールで希釈し、そして式IIの生成物が酸形態になるまでｐＨを下方に調節する（ｐＨ３〜４）。式IIの粗生成物を水混和性溶剤の蒸発により徐々に結晶化させる。
【００１９】
式IIのステロイド化合物を化学的に脱炭酸反応させて式IIIのステロイド化合物を製造することができる。脱炭酸反応段階は当業者に公知の条件及び試薬を用いて行われる。一般的に、式IIの化合物を酸触媒と共に極性溶剤に溶解する。この混合物を加熱して所望の脱炭酸反応を生じさせる。典型的には、該カルボン酸を、水性メタノール中の塩酸の触媒量を用いて還流下に約３０分間処理して、所望の脱炭酸反応を行う。しかしながら、該溶剤及び酸は決定的に重要ではない。カルボン酸基質及び酸触媒の両者を溶解する全ての溶剤が適している。好ましい溶剤は、ピリジン、ピコリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジエチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、又はその水性混合物を包含する。メタノールが最も好ましい溶剤である。式IIの化合物を約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは約１００〜３００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解する。
【００２０】
適当な酸触媒は４.９未満のｐＫａを有する酸である。このような酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、氷酢酸、リン酸、ベンゼンスルホン酸、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、クエン酸、ジクロロ酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸及びトリクロロ酢酸を包含する。メタノール中の酸の最終濃度は０.００１Ｎ（ｐＨ３）〜０.１Ｎ（ｐＨ１）、好ましくは約０.０１Ｎ（ｐＨ２）である。反応混合物を４０℃〜８０℃（好ましくは約５０〜６０℃）に約１〜約２４時間（好ましくは４〜１２時間）加熱する。式IIIの化合物は、この反応混合
物から当技術で認められた多数の手順の任意の一つを用いて回収することができる；好ましい手順は蒸発濃縮及び／又は冷却による結晶化である。
【００２１】
脱炭酸反応は２段階で行うこともできる；最初に３−ケト−Δ5(10)中間体を与える脱炭酸反応、次いで化合物（III）への異性化。３−ケト−Δ5(10)中間体への脱炭酸反応は、ＤＭＳＯ中で室温（１５〜２５℃）において１６時間攪拌することにより行うことができる。次いで３−ケト−Δ5(10)中間体を、上記のように４.９未満のｐＫａの酸で処理することにより化合物IIIに異性化させる。
【実施例】
【００２２】
さらなる詳述がなくても、当業者は上記の説明を用いて本発明を最大限に実施できると信じられる。下記の詳細な実施例は種々の化合物をどのように製造するか及び／又は本発明の種々の方法をどのように実施するかを説明するものであり、そして単に説明的なものであると解釈すべきであって、前記の開示を限定するものとは決して解釈すべきではない。当業者は、反応体並びに反応条件及び技術の両者に関する上記手順からの適切な変更を即座に認めるであろう。
【００２３】
実施例１
４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への変換反応を、ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 の深部培養を用いて行い、次いで１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンに脱炭酸反応させる。
【００２４】
（Ａ）一次種培養期
ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 の凍結した増殖性細胞を解凍し、ジャガイモ−デキストロース−寒天プレート（ＰＤＡ）に移し、２８℃で７２時間インキュベートする。単一菌糸プラグ（直径６〜７ｍｍ）を用いて、１００ｍＬの一次種培地を含むシリコン処理した５００ｍＬの斑点付き振盪フラスコに接種する。一次種培地は（１リットルのＲＯ水当たり）：デキストリン５０ｇ；ダイズ粉３５ｇ；グルコース５ｇ；塩化コバルト六水和物２ｍｇ；シリコーン消泡剤（ＳＡＧ４７１）０.５ｍＬからなる；前滅菌ｐＨ７.０〜７.２、水酸化ナトリウム（２Ｎ）で調節。一次種培地を含む振盪フラスコを、オートクレーブを用いて１２１℃で３０分間滅菌する。ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 を、２７０ｒ.ｐ.ｍ.（２'' 軌道ストローク）に設定した制御環境インキュベーター−シェーカーを用いて２８℃で４８時間インキュベートする。
【００２５】
（Ｂ）二次種培養期
１００ミリリットルの二次種培地をシリコン処理した５００ｍＬの斑点付き振盪フラスコ中で、０.２ｍＬの増殖性一次種培養物（０.２％[v/v]の接種率）を用いて接種する。二次種培地は（１リットルのＲＯ水当たり）：グルコース３０ｇ；ダイズ粉１２.５ｇ；トウモロコシ浸漬固体１０ｇ；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール０.２５ｍＬ；シリコーン消泡剤（ＳＡＧ４７１）０.５ｍＬからなる；前滅菌ｐＨ６.５〜６.６、水酸化ナトリウム（２Ｎ）で調節。二次種培地を含む振盪フラスコを、オートクレーブを用いて１２１℃で３０分間滅菌する。ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 を、２７０ｒ.ｐ.ｍ.（２'' 軌道ストローク）に設定した制御環境インキュベーター−シェーカーを用いて２８℃で約５２時間インキュベートする。
【００２６】
（Ｃ）ステロイドの生物変換反応
１００ミリリットルのステロイド生物変換反応培地を、５ｍＬの増殖性二次種培養物（５％[v/v]の接種率）を用いて接種する。ステロイド生物変換反応培地は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを０.２５ｍＬ／Ｌから２ｍＬ／Ｌに増加した以外は本質的に二次種培地と同一である。約２２時間のインキュベーション後に、最少量０.２％[v/v]のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール中にスラリー化した０.５ｇの微粉末化４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンを、１００ｍＬの発酵物に加える。
【００２７】
生物変換反応培養物を、毎日基準で１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸についてＨＰＬＣを用いてアッセイする。１００ミリリットルの全発酵物を３ｍＬの温アセトニトリルで抽出する。細胞を水性アセトニトリル混合物から遠心（３,０００ｘｇで１０分間）により分離し、５μＬの抽出物をＨＰＬＣカラム上に注入する。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである：Ｃ１８逆相カラム（１５０×４.６ｍｍ）を備えたＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓクロマトグラフ；カラム温度３０℃；移動相（定組成）アセトニトリル／０.２５％リン酸（５５／４５[v/v]）；流速＝０.５ｍＬ／分；検出２８７ｎｍ；実行時間＝２０分。４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への生物変換反応は約２日間で終了する。
【００２８】
（Ｄ）回収及び脱炭酸反応の手順
五つの１００ｍＬ発酵物から収穫した全発酵物を、ｐＨを４に下方調節することにより２５０ｍＬの塩化メチレンで抽出する。廃発酵物をさらに２００ｍＬの塩化メチレンで再抽出する。濃い塩化メチレン抽出物を遠心により回収し、次いでプールし、精製し、蒸発により約５０ｍＬに濃縮する。次いで、生成物である１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を、ｐＨを９に上方調節することにより５０ｍＬの水中に抽出する。この濃い水溶液を５０ｍＬの水で希釈し、ｐＨを４に下方調節する。メタノールの蒸発により粗生成物を結晶化させる。水性スラリーから固体を濾過により回収し、１５ｍＬの水で洗浄し、乾燥して、１.２２ｇの粗結晶性１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を得る。
【００２９】
１.２２ｇの粗１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を、０.１ｍＬの８５％リン酸を含む４ｍＬのメタノールに溶解し、反応混合物を５５℃に加熱する。反応混合物を、毎時基準で粗１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンについてＨＰＬＣを用いてアッセイする。５マイクロリットルの反応混合物を１ｍＬのアセトニトリル中に希釈し、５μＬをＨＰＬＣカラム上に注入する。ＨＰＬＣの条件は上記のとおりである。１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸から１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンへの脱炭酸反応は約４時間で終了する。反応混合物を −１０℃に冷却し、結晶を濾過し、１ｍＬの −１０℃メタノールで洗浄して、０．７２ｇの純度９９.４％の１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンを得る。
【００３０】
実施例２
４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への変換を、ニグロスポラ・ゴルレンコアヌム ATCC 24718 の深部培養を用いて行い、次いで脱炭酸反応させて１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンにする。
【００３１】
実施例１に記載した条件下で、１.１８ｇの粗結晶性１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を生成させる。次いで、この材料を０．７５ｇの純度９９.７％の１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンに変換する。
【００３２】
実施例３
４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への変換を、ニグロスポラ・オリゼ ATCC 42775 の深部培養を用いて行い、次いで脱炭酸反応させて１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンにする。
【００３３】
実施例１に記載した条件下で、１.２０ｇの粗結晶性１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を生成させる。次いで、この材料を０．６５ｇの純度９９.２％の１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンに変換する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンを真菌酸化して式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を生成し、続いて式IIIの１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを製造するための化学的脱炭酸反応段階に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン（ノメゲストロール(nomegestrol)）及び関連する式IIIの分子は、薬理学的に活性な１９−ノルステロイドを合成するための有用なステロイド中間体である。例えば、１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン（ノメゲストロール）は、女性の健康ステロイドである酢酸ノメゲストロール（１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１７アセテート）の合成に使用することができる。
【０００３】
米国特許第４,２８４,７２０号は、アンドロスタン又はプレグナン系列の１０−メチルステロイドをニグロスポラ属(Nigrospora)の真菌培養物を用いる発酵によって対応する１９−ヒドロキシステロイドに変換することを開示している。
【０００４】
１９−ノル−ステロイドは１９−ヒドロキシステロイドから化学的に合成されてきた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一般的に、本発明は、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンを真菌酸化して式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を生成するための実用的方法、続いて式IIIの１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを製造するための化学的脱炭酸反応段階を提供する。
【０００６】
すなわち、本発明は、式Ｉ
【化１】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の６−置換−Δ６−プレグナンを、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの１９炭素を酸化できるニグロスポラ属の種を含む生物変換反応培養物と接触させることを含む：
【０００７】
式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの真菌酸化による式II
【化２】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造方法を提供する。
【０００８】
定義
以下の定義及び説明は明細書及び請求項の両者を含めて、この書類全体を通して用いられる用語のためのものである。
全ての温度は摂氏度である。
「ｒ.ｐ.ｍ.」は毎分の回転数を指す。
「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィーを指す。
「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指す。
「ｐｓｉｇ」は平方インチゲージ当たりのポンドを指す。
「ＲＯ」は逆浸透を指す。
【０００９】
溶剤混合物が用いられる場合、溶剤の比は容量／容量(v/v)である。溶剤への固体の溶解性が用いられる場合、用いられる固体と溶剤との比は重量／容量(wt/v)である。
【００１０】
一般的に、本発明は、式Ｉ
【化３】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の６−置換−Δ6−プレグナンを真菌酸化による、式II
【化２】
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は式ＩのＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4と同一である）の１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造に関する。
【００１１】
式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの１９炭素を酸化できるニグロスポラ属の全ての糸状菌を、式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造に使用することができる。実施例１の手順は、ニグロスポラ属の特定の糸状菌が、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナン
の１９炭素を酸化できるかどうかを決定するために使用することができる。
【００１２】
続いて、式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を回収し、そして化学的に脱炭酸反応させて式III
【化５】
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は式ＩのＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4と同一である）の１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを製造することができる。
【００１３】
本発明者らは、式Ｉの６−置換−Δ6−プレグナンと、ニグロスポラの特定の菌株、特にニグロスポラ・スフェリカ(Nigrospora sphaerica) ATCC 12772、ニグロスポラ・ゴルレンコアヌム(Nigrospora gorlenkoanum) ATCC 24718 及びニグロスポラ・オリゼ(Nigrospora oryzae) ATCC 42775 との接触が式IIの１９−ノル−１０β−カルボン酸を生成したことを見出した。
【００１４】
本発明の方法において、生物変換反応培地は界面活性剤及び高レベルの炭素源を含む。界面活性剤は、非イオンアミド、非イオンエステル、例えばエトキシル化アルキルフェノール及びポリオキシエチレンソルビタンエステル、乳化ろう、非イオンエトキシル化物、トリスチリルフェノールエトキシル化物、アルコールエトキシル化物、例えばオクチルフェノキシポリエトキシエタノール、エトキシル化メルカプタン、キャップドエトキシル化物、ブロックコポリマー及び逆コポリマーを包含する非イオン洗剤からなる群から選択される。好ましくは、エトキシル化アルキルフェノール、ポリオキシエチレンソルビタンエステル又はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールが界面活性剤として用いられる。使用される非イオン洗剤濃度は、約０.１ｍＬ／Ｌ又は０.１ｇ／Ｌ〜約４ｍＬ／Ｌ又は４ｇ／Ｌであってよいが、典型的には約１ｍＬ／Ｌ又は１ｇ／Ｌ〜約２ｍＬ／Ｌ又は２ｇ／Ｌである。
【００１５】
炭素源は、単糖、二糖、三糖、多糖加水分解物及び糖アルコールからなる群から選択される。典型的には、グルコースが炭素源として用いられる。炭素源の濃度は、約２ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌであってよいが、典型的には約５ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌである。
【００１６】
好ましくは、真菌を、当技術分野で認められた任意の手順を用いて、好気性条件下の深部培養で生育させ、そして酸化反応をその場で行わせる。所望のニグロスポラ属真菌を、当業者に公知の条件、方法、炭素源及び窒素源を用いて培養する。一般的に、真菌１９−酸化に備えて、一次及び二次増殖性種培養手順が用いられる。別法として、一次増殖性種培養物を、真菌１９−酸化の生物変換反応培地に接種するために直接用いることができる。
【００１７】
一次増殖性種培養物を、約２０℃〜約３７℃（好ましくは約２８℃）及び約３.０〜約７.５のｐＨで約２４〜約９６時間（好ましくは約４８〜７２時間）の期間インキュベートする。二次増殖性種培地に、約０.００６％〜約０.２５％[v/v]、しかし典型的には約０.０１２％〜約０.１％[v/v]の一次増殖性種培養物を接種し、そして約２０℃〜約３７℃（好ましくは約２８℃）で約３６〜約７２時間（好ましくは約４８〜６０時間）の期間インキュベートする。二次種培地のｐＨは約３.０〜約７.５であってよいが、好ましくは約５.０〜約７.０である。二次増殖性種培地と同一でも異なってもよい生物変換反応培地に、約１％〜約１０％[v/v]（好ましくは約３％〜約５％）の二次増殖性種培養物を接種する。約１２〜約７２時間（好ましくは約１６〜約２４時間）の初期インキュベーション期間の後、式Ｉのステロイド基質、好ましくは微粉末化物を生物変換反応培養物に加える。式Ｉの微粉末化ステロイド基質は、乾燥粉末又は水性スラリーとして、一度の添加、一連の添加又は連続供給のいずれかとして添加することができる。式Ｉの微粉末化ステロイド基質を１ｇ／Ｌより高い、より好ましくは２ｇ／Ｌより高い、よりいっそう好ましくは４ｇ／Ｌより高い濃度で用いることが好ましい。式Ｉのステロイド基質から式IIの１９−酸化生成物を形成するための生物変換反応を約１〜約９日間、しかし典型的には約２〜約６日間進行させる。変換反応は当業者に公知のクロマトグラフィー方法、例えばＨＰＬＣにより監視することができる。好適なＨＰＬＣ方法は実施例１に提供されている。
【００１８】
式Ｉのステロイド基質から式IIの１９−酸化生成物を生成する生物変換反応が終了したとき、当技術分野で認められた多数の手順の何れか一つを用いて式IIの化合物を回収することができる。好ましくは、全体の又は濾過した発酵物を、式IIの生成物が酸形態になるまでｐＨを下方に調節することにより、水非混和性有機溶剤、例えば塩化メチレンで抽出する。次いで、水非混和性有機溶剤を蒸発により濃縮する。次いで、式IIのカルボン酸生成物がイオン化されるまでｐＨを上方に調節する（ｐＨ８〜９）ことにより、式IIの生成物を水中に抽出する。この水性抽出物を水混和性溶剤、例えばメタノールで希釈し、そして式IIの生成物が酸形態になるまでｐＨを下方に調節する（ｐＨ３〜４）。式IIの粗生成物を水混和性溶剤の蒸発により徐々に結晶化させる。
【００１９】
式IIのステロイド化合物を化学的に脱炭酸反応させて式IIIのステロイド化合物を製造することができる。脱炭酸反応段階は当業者に公知の条件及び試薬を用いて行われる。一般的に、式IIの化合物を酸触媒と共に極性溶剤に溶解する。この混合物を加熱して所望の脱炭酸反応を生じさせる。典型的には、該カルボン酸を、水性メタノール中の塩酸の触媒量を用いて還流下に約３０分間処理して、所望の脱炭酸反応を行う。しかしながら、該溶剤及び酸は決定的に重要ではない。カルボン酸基質及び酸触媒の両者を溶解する全ての溶剤が適している。好ましい溶剤は、ピリジン、ピコリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジエチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、又はその水性混合物を包含する。メタノールが最も好ましい溶剤である。式IIの化合物を約１０ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ（好ましくは約１００〜３００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解する。
【００２０】
適当な酸触媒は４.９未満のｐＫａを有する酸である。このような酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、氷酢酸、リン酸、ベンゼンスルホン酸、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、クエン酸、ジクロロ酢酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸及びトリクロロ酢酸を包含する。メタノール中の酸の最終濃度は０.００１Ｎ（ｐＨ３）〜０.１Ｎ（ｐＨ１）、好ましくは約０.０１Ｎ（ｐＨ２）である。反応混合物を４０℃〜８０℃（好ましくは約５０〜６０℃）に約１〜約２４時間（好ましくは４〜１２時間）加熱する。式IIIの化合物は、この反応混合
物から当技術で認められた多数の手順の任意の一つを用いて回収することができる；好ましい手順は蒸発濃縮及び／又は冷却による結晶化である。
【００２１】
脱炭酸反応は２段階で行うこともできる；最初に３−ケト−Δ5(10)中間体を与える脱炭酸反応、次いで化合物（III）への異性化。３−ケト−Δ5(10)中間体への脱炭酸反応は、ＤＭＳＯ中で室温（１５〜２５℃）において１６時間攪拌することにより行うことができる。次いで３−ケト−Δ5(10)中間体を、上記のように４.９未満のｐＫａの酸で処理することにより化合物IIIに異性化させる。
【実施例】
【００２２】
さらなる詳述がなくても、当業者は上記の説明を用いて本発明を最大限に実施できると信じられる。下記の詳細な実施例は種々の化合物をどのように製造するか及び／又は本発明の種々の方法をどのように実施するかを説明するものであり、そして単に説明的なものであると解釈すべきであって、前記の開示を限定するものとは決して解釈すべきではない。当業者は、反応体並びに反応条件及び技術の両者に関する上記手順からの適切な変更を即座に認めるであろう。
【００２３】
実施例１
４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への変換反応を、ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 の深部培養を用いて行い、次いで１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンに脱炭酸反応させる。
【００２４】
（Ａ）一次種培養期
ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 の凍結した増殖性細胞を解凍し、ジャガイモ−デキストロース−寒天プレート（ＰＤＡ）に移し、２８℃で７２時間インキュベートする。単一菌糸プラグ（直径６〜７ｍｍ）を用いて、１００ｍＬの一次種培地を含むシリコン処理した５００ｍＬの斑点付き振盪フラスコに接種する。一次種培地は（１リットルのＲＯ水当たり）：デキストリン５０ｇ；ダイズ粉３５ｇ；グルコース５ｇ；塩化コバルト六水和物２ｍｇ；シリコーン消泡剤（ＳＡＧ４７１）０.５ｍＬからなる；前滅菌ｐＨ７.０〜７.２、水酸化ナトリウム（２Ｎ）で調節。一次種培地を含む振盪フラスコを、オートクレーブを用いて１２１℃で３０分間滅菌する。ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 を、２７０ｒ.ｐ.ｍ.（２'' 軌道ストローク）に設定した制御環境インキュベーター−シェーカーを用いて２８℃で４８時間インキュベートする。
【００２５】
（Ｂ）二次種培養期
１００ミリリットルの二次種培地をシリコン処理した５００ｍＬの斑点付き振盪フラスコ中で、０.２ｍＬの増殖性一次種培養物（０.２％[v/v]の接種率）を用いて接種する。二次種培地は（１リットルのＲＯ水当たり）：グルコース３０ｇ；ダイズ粉１２.５ｇ；トウモロコシ浸漬固体１０ｇ；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール０.２５ｍＬ；シリコーン消泡剤（ＳＡＧ４７１）０.５ｍＬからなる；前滅菌ｐＨ６.５〜６.６、水酸化ナトリウム（２Ｎ）で調節。二次種培地を含む振盪フラスコを、オートクレーブを用いて１２１℃で３０分間滅菌する。ニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 を、２７０ｒ.ｐ.ｍ.（２'' 軌道ストローク）に設定した制御環境インキュベーター−シェーカーを用いて２８℃で約５２時間インキュベートする。
【００２６】
（Ｃ）ステロイドの生物変換反応
１００ミリリットルのステロイド生物変換反応培地を、５ｍＬの増殖性二次種培養物（５％[v/v]の接種率）を用いて接種する。ステロイド生物変換反応培地は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを０.２５ｍＬ／Ｌから２ｍＬ／Ｌに増加した以外は本質的に二次種培地と同一である。約２２時間のインキュベーション後に、最少量０.２％[v/v]のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール中にスラリー化した０.５ｇの微粉末化４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンを、１００ｍＬの発酵物に加える。
【００２７】
生物変換反応培養物を、毎日基準で１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸についてＨＰＬＣを用いてアッセイする。１００ミリリットルの全発酵物を３ｍＬの温アセトニトリルで抽出する。細胞を水性アセトニトリル混合物から遠心（３,０００ｘｇで１０分間）により分離し、５μＬの抽出物をＨＰＬＣカラム上に注入する。ＨＰＬＣの条件は下記のとおりである：Ｃ１８逆相カラム（１５０×４.６ｍｍ）を備えたＳｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓクロマトグラフ；カラム温度３０℃；移動相（定組成）アセトニトリル／０.２５％リン酸（５５／４５[v/v]）；流速＝０.５ｍＬ／分；検出２８７ｎｍ；実行時間＝２０分。４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への生物変換反応は約２日間で終了する。
【００２８】
（Ｄ）回収及び脱炭酸反応の手順
五つの１００ｍＬ発酵物から収穫した全発酵物を、ｐＨを４に下方調節することにより２５０ｍＬの塩化メチレンで抽出する。廃発酵物をさらに２００ｍＬの塩化メチレンで再抽出する。濃い塩化メチレン抽出物を遠心により回収し、次いでプールし、精製し、蒸発により約５０ｍＬに濃縮する。次いで、生成物である１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を、ｐＨを９に上方調節することにより５０ｍＬの水中に抽出する。この濃い水溶液を５０ｍＬの水で希釈し、ｐＨを４に下方調節する。メタノールの蒸発により粗生成物を結晶化させる。水性スラリーから固体を濾過により回収し、１５ｍＬの水で洗浄し、乾燥して、１.２２ｇの粗結晶性１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を得る。
【００２９】
１.２２ｇの粗１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を、０.１ｍＬの８５％リン酸を含む４ｍＬのメタノールに溶解し、反応混合物を５５℃に加熱する。反応混合物を、毎時基準で粗１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンについてＨＰＬＣを用いてアッセイする。５マイクロリットルの反応混合物を１ｍＬのアセトニトリル中に希釈し、５μＬをＨＰＬＣカラム上に注入する。ＨＰＬＣの条件は上記のとおりである。１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸から１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンへの脱炭酸反応は約４時間で終了する。反応混合物を −１０℃に冷却し、結晶を濾過し、１ｍＬの −１０℃メタノールで洗浄して、０．７２ｇの純度９９.４％の１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンを得る。
【００３０】
実施例２
４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への変換を、ニグロスポラ・ゴルレンコアヌム ATCC 24718 の深部培養を用いて行い、次いで脱炭酸反応させて１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンにする。
【００３１】
実施例１に記載した条件下で、１.１８ｇの粗結晶性１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を生成させる。次いで、この材料を０．７５ｇの純度９９.７％の１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンに変換する。
【００３２】
実施例３
４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンから１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸への変換を、ニグロスポラ・オリゼ ATCC 42775 の深部培養を用いて行い、次いで脱炭酸反応させて１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンにする。
【００３３】
実施例１に記載した条件下で、１.２０ｇの粗結晶性１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオン１０β−カルボン酸を生成させる。次いで、この材料を０．６５ｇの純度９９.２％の１９−ノル−４,６−プレグナジエン−６−メチル−１７α−オール−３,２０−ジオンに変換する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ（ＯＲ）Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の６−置換−Δ６−プレグナンを、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの１９炭素を酸化できるニグロスポラ属の種を含む生物変換反応培地と接触させることを含む、
式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの真菌酸化による、式II
【化２】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ（ＯＲ）Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3である）
の１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造方法。
【請求項２】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772、ニグロスポラ・ゴルレンコアヌム ATCC 24718 及びニグロスポラ・オリゼ ATCC 42775 から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・ゴルレンコアヌム ATCC 24718 である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・オリゼ ATCC 42775 である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ5が −ＣＨＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ5が −ＣＨ2ＯＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ5がＣＨ3である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
式IIの化合物を適当な溶剤中で４.９未満のｐＫａの酸で処理する段階を含む、式IIの化合物を脱炭酸反応させて式III
【化３】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
４.９未満のｐＫａの酸が塩酸であり、そして適当な溶剤がメタノールである、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ（ＯＲ）Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の６−置換−Δ６−プレグナンを、式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの１９炭素を酸化できるニグロスポラ属の種を含む生物変換反応培地と接触させることを含む、
式Ｉの６−置換−Δ６−プレグナンの真菌酸化による、式II
【化２】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ（ＯＲ）Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3である）
の１９−ノル−１０β−カルボン酸の製造方法。
【請求項２】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772、ニグロスポラ・ゴルレンコアヌム ATCC 24718 及びニグロスポラ・オリゼ ATCC 42775 から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・スフェリカ ATCC 12772 である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・ゴルレンコアヌム ATCC 24718 である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ニグロスポラ属の種がニグロスポラ・オリゼ ATCC 42775 である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ5が −ＣＨＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ5が −ＣＨ2ＯＨである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ5がＣＨ3である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
式IIの化合物を適当な溶剤中で４.９未満のｐＫａの酸で処理する段階を含む、式IIの化合物を脱炭酸反応させて式III
【化３】
（式中：
Ｒ1はＨ、ＯＨ、Ｒ−Ｃ(Ｏ)Ｏ−、−ＣＨ2ＯＣＨ3、ＣＨ3ＣＨ(ＯＲ)Ｏ−からなる群から選択され；
ＲはＣ1−Ｃ8アルキル基であり；
Ｒ2はＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3−から選択され；
Ｒ3はＨ又はＣＨ2＝であり、
Ｒ4は−ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ3であり、
Ｒ5は−ＣＨＯ、−ＣＨ2ＯＨ又はＣＨ3である）
の１９−ノル−６−置換−Δ6−プレグナンを生成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
４.９未満のｐＫａの酸が塩酸であり、そして適当な溶剤がメタノールである、請求項９に記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５１５５１８（Ｐ２００６−５１５５１８Ａ）
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００３０１（Ｐ２００６−５００３０１）
【出願日】平成１６年１月９日（２００４．１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００１０７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５６１２
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（５０４３９６３７９）ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー (130)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月９日（２００４．１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００１０７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５６１２
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（５０４３９６３７９）ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー (130)
【Ｆターム（参考）】
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