Ａβ産生へのＢＲＩ蛋白の効果
【課題】細胞によるＡＰＰ（アミロイド前駆体タンパク）からのＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する方法、ならびに、アルツハイマー病を有する被験体を治療および処置する方法の提供。
【解決手段】ＢＲＩ２フラグメント、ＢＲＩ３フラグメント、それらの模倣体あるいはフリンの蛋白質を含む医薬組成物、もしくはＢＲＩ２フラグメント、ＢＲＩ３フラグメント、フリンの蛋白質をコード化するベクターを含む医薬組成物。
【解決手段】ＢＲＩ２フラグメント、ＢＲＩ３フラグメント、それらの模倣体あるいはフリンの蛋白質を含む医薬組成物、もしくはＢＲＩ２フラグメント、ＢＲＩ３フラグメント、フリンの蛋白質をコード化するベクターを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦協賛研究開発に関する陳述
米国政府は本発明において、支払い済みのライセンスを有し、限られた条件下、ＮＩＨにより承認されたＡＧ２２０２４−９５２６４５６２号およびＡＧ２１５８８−９５２６４８７８号の支払いにより準備されるような合理的な状況において、本特許権者が他者にライセンスを付与することを要求する権利を有する。
【０００２】
（１）本発明の分野
本発明は一般的に、アルツハイマー病におけるＡβ産生の制御（コントロール）に関する。より具体的には、本発明は、Ｃ９９のγ−セクレターゼ開裂ならびにＡβおよび／またはＡＰＰの細胞内（ドメイン、ＡＩＤ）の放出を阻害するためのＢＲＩ蛋白の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２）関連技術の記述
参考文献
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【０００４】
アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）は、普遍的なＩ型（タイプＩ）膜貫通蛋白（Kangら、１９８７年；Tanziら、１９８７年）であり、一連の蛋白溶解現象（SelkoeおよびKopan、２００３年；SisodiaおよびSt.George-Hyslop、２００２年）を受ける。ＡＰＰはまず、原形質膜または細胞内小器官において、β−セクレターゼにより開裂される（Vassarら、１９９９年）。その外部ドメインが、細胞外に（ｓＡＰＰβ）、もしくは、細胞内区画の管腔（ルーメン）中に放出される一方、９９アミノ酸（Ｃ９９）のＣＯＯＨ−末端フラグメントは膜に結合したままである。第２の、膜内蛋白溶解現象において、γ−セクレターゼにより、ややｌａｘ部位（サイト）特異的にＣ９９が開裂される。２種のペプチドが、１：１化学量論比で放出され、そのアミロイド原性Ａβペプチドは、４０および４２アミノ酸の２種の主要な種（それぞれ、Ａβ４０およびＡβ４２）からなり、細胞内産物は、ＡＰＰ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ（ＡＩＤもしくはＡＩＣＤ）と名付けられ、非常に短命であり、ごく最近に（Passerら、２０００年；CaoおよびSudhof、２００１年；Cupersら、２００１年）同定されている。代わりの蛋白溶解経路において、ＡＰＰはまず、α−セクレターゼにより、Ａβ配列中においてプロセシングされ、可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）外部ドメイン、および、８３アミノ酸（Ｃ８３）の膜結合ＣＯＯＨ−末端フラグメントに至る。Ｃ８３も、γ−セクレターゼにより、Ｐ３およびＡＩＤペプチドへと開裂される。Ａβがアルツハイマー病の病理に関わる一方、ＡＩＤが殆どのＡＰＰシグナル伝達機能を媒介する。ＡＤにおけるＡＰＰプロセシングに関する病理的な役割が、ＡＰＰにおける突然変異（Ｇｏａｔｅら、１９９１）、およびγ−セクレターゼの重要な構成であるＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ（プレセリニン）（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９５；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、１９９５ａ，ｂ；Ｒｏｇａｅｖら、１９９５）が、ＡＤの常染色体優性家族形を引き起こすという知見により確認されている。これゆえ、この生物学的および病理学的重要さにより、どのようにＡＰＰ開裂が規制されているのか理解する必要がある。本発明は、この必要性を課題とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明者らは、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３がＡＰＰからのＡβおよびＡＰＰ細胞内部位（ドメイン、ＡＩＤ）産生を阻害することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これゆえ、ある実施形態において、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する方法に関する。該方法は、該細胞をＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させることを含む。
【０００７】
他の実施形態において、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を抑制、阻害、または予防する更なる方法に関する。該方法は、該細胞をフリン（ｆｕｒｉｎ）と、該細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させることを含む。
【０００８】
加えて、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を治療する方法に関する。該方法は、該被験体に、被験体におけるアルツハイマー病を治療するのに有効な量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む。
【０００９】
更なる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を治療する他の方法に関する。該方法は、該被験体に、被験体におけるアルツハイマー病を治療するのに有効な量のフリンを投与することを含む。
【００１０】
本発明は、化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかを決定する方法にも関する。該方法は、化合物を、機能しているγ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含む膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含む。これらの実施形態において、化合物が、もしγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である。
【００１１】
更なる実施形態において、本発明は、精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中にて含む組成物に関する。
【００１２】
更なる実施形態において、本発明は、精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物に関する。
【００１３】
本発明は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物にも関する。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、フリンをコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウェスタン・ブロットの図式および写真であり、ＢＲＩ２が、ＡＰＰリガンドであることを確立している。パネルａ：使用されたＢＲＩ２構築体の略図である。これら構築体が、１（アミノ酸１〜２６６、全長）および２（アミノ酸１〜１３１）と付番されている。 パネルｂ−ｄは、指し示された蛋白を発現しているＨｅＬａ細胞からの総溶解物（ＴＬ）および抗ＦＬＡＧ免疫沈降（ＩＰαＦＬＡＧ）のウェスタン・ブロット（ＷＢ）が、ＢＲＩ２／ＡＰＰ会合の特異性を示し、相互作用部位を地図化（マッピング）することを示す。ｐｃは、empty vector（ｐｃＤＮＡ３．１）を示す。；番号１および２が、ａで示されたＢＲＩ２構築体を指し示し；＊が、抑えられなかった抗ＦＬＡＧ抗体を指し示し；ｍ．が、成熟したグリコシル化された形態のＡＰＰを示す。；一方、ｉ．が、対応する未熟なグリコシル化されなかったＡＰＰを示す。ウェスタン・ブロットに関して、αＡＰＰが、モノクローナル抗体２２Ｃ１１を表し、一方、αＡＰＰｃｔが、ＡＰＰのＣ−末端に対して惹起されたウサギポリクローナルである。 パネルｅ：ＡＰＰおよびＢＲＩ２両方を用いてトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の溶解物が、ウサギポリクローナルコントロール（ＲＰ）もしくはαＡＰＰ−ｃｔと共に沈澱された実験のウェスタン・ブロットである。免疫沈降および総溶解物が、αＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１もしくはαＦＬＡＧを用いてブロットされた。ＢＲＩ２が、〜１７ｋＤａのＢＲＩ２のＮ−末端フラグメント（ＢＲＩ２ｎｔ）同様、αＡＰＰｃｔにより、ＡＰＰと共に沈澱された。
【図２】内因性ＡＰＰおよびＢＲＩ２が、成人脳において相互作用することを確立するウェスタン・ブロットの写真である。 パネルａ：ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞からの溶解物が、ニワトリのコントロールの抗体（レーン３）、市販のニワトリのαＢＲＩ２抗体（レーン６）、蛋白Ａ／Ｇビーズ単独（レーン９）、コントロールのウサギポリクローナル抗体（レーン１２）、ウサギポリクローナルＥＮ３αＢＲＩ２抗体（レーン１５）、区別できるウサギαＢＲＩ２血清（レーン１８）、およびマウスαＢＲＩ２ポリクローナル抗体（レーン２１）と共に沈澱された。総溶解物（Ｌ）、上清（Ｓ）、および沈澱（Ｐ）が、ゲル濾過され、αＦＬＡＧを用いて調べられた。ＥＮ３だけが、ＢＲＩ２を沈澱させることができた。〜１７および１４ｋＤａのＢＲＩ２ｎｔフラグメントは沈澱しなかったが、これは、ＥＮ３により認識されるエピトープが、Ｃ−末端からＢｒｉｃｈｏｓドメインであるためである。 パネルｂ：総脳ホモジェネートが、コントロールのウサギポリクローナル（ＲＰ）、αＡＰＰｃｔ、もしくはＥＮ３と共に免疫沈降された。総脳溶解物（Ｔ．Ｌ．）および免疫沈澱が、αＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１（上のパネル）もしくはαＡＰＰｃｔ（下のパネル）を用いてブロットされた。
【図３】ＢＲＩ２が、セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを規制することを確立しているウェスタン・ブロットの図および写真である。 パネルａ−ｃ：ＢＲＩ２が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４駆動ルシフェラーゼ活性を、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ、およびＨＥＫ２９３細胞において抑える。細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃ）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２、ＢＲＩ２1ー131もしくはＢＡＣＥと共に、同時トランスフェクションされた。データは、empty vectorでトランスフェクションされた細胞において測定されたルシフェラーゼ活性の％として表現されている。ＢＲＩ２、ＢＡＣＥ、およびｐｃによりトランスフェクションされた細胞が、同様な濃度（レベル）のＡＰＰ−Ｇａｌ４を発現する（図示せず）。エラーバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 パネルｄ：細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃ）、もしくはＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされた。ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いてトランスフェクションされた細胞が次いで、指し示された比で、ＢＲＩ２もしくはｐｃ．ＤＮＡ３．１によりトランスフェクションされた細胞と混合された。サンプルが、ルシフェラーゼ活性に関して、上記したとおり、トランスフェクションおよび混合の２４時間後、解析された。 パネルｅ−ｆ：ＢＲＩ２は、Ａβ４０／Ａβ４２産生を阻害する。安定にＡＰＰを発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ＡＰＰ）が、empty vector（ｐｃ）、ＢＡＣＥ、もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされ、培地中に分泌されたＡβ４０およびＡβ４２が、ＥＬＩＳＡにより測定された。Ａβ量が、トランスフェクションされた細胞の溶解物の蛋白含量により、規格化された。エラーバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 パネルｇ：トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞に関しての、４種の独立の実験の代表たるパルス追跡実験。ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、empty vector（ベクター）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされた。代謝標識された細胞の溶解物が、αＡＰＰｃｔと共に沈澱された。各レーン上の数字が、これら細胞が追跡された時間を指し示す（ｃ）。ＢＲＩ２発現が、Ｃ８３産生を減らす一方、劇的に、Ｃ９９生成を増やす。 パネルｈ：同様にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞の、条件を整えられた培地が４時間の標識後収集され、ｐ２１もしくは６Ｅ１０と共に沈澱された。ｓＡＰＰα量が、ＢＲＩ２により減った一方、総ｓＡＰＰ（ｓＡＰＰα＋ｓＡＰＰβ）は有意な変化を示さず、これはｓＡＰＰβ産生の増加、および、αからβセクレターゼに至るＡＰＰプロセシングの変化（シフト）を指し示している。 パネルｉ：細胞が、ＡＰＬＰ２を用いて、ｐｃ．ＤＮＡ３．１もしくはＢＲＩ２と共にトランスフェクションされた。トランスフェクション２４時間後、細胞が、ウェスタン・ブロットにより、ＢＲＩ２およびＡＰＬＰ２ペプチドに関して、解析された。
【図４】ウェスタン・ブロットの写真であり、ＢＲＩ２の最初の１０２アミノ酸が、Ｃ９９の効率的な開裂を阻害するのに必要であること、ならびに、同一領域が、ＢＲＩ２の、ＡＰＰのＣ９９に対する結合に必要であることを確立している。左のパネルが、γ３０細胞からの総溶解物（ＴＬ）のウェスタン・ブロットを示し、γ３０細胞は安定にＡＰＰを発現し、empty vector（ｖｅｃ）、ｍｙｃのタグを付けた全長ＢＲＩ２1−266（ＢＲＩ２）、もしくは、種々のｍｙｃのタグを付けたＢＲＩ２Ｃ−末端欠損体を用いてトランスフェクションされた（当該構築体によりコードされたアミノ酸により指し示した）。右のパネルが、対応している溶解物の、抗ｍｙｃ免疫沈澱（ｍｙｃ ＩＰ）を示す。ＨＣが、この免疫沈降において使用されたｍｙｃ抗体の重鎖を指し示す。
【図５】ＡＰＰ−Ｇａｌ４駆動ルシフェラーゼ活性のグラフであり、ＢＲＩ２の最初の１０２アミノ酸が全て、ＡＩＤ産生を阻害するのに必要であることを確立している。ＨＥＫ２９３細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いて、empty vector、もしくは、ｍｙｃのタグを付けた全長ＢＲＩ２、もしくは、種々のＢＲＩ２Ｃ−末端欠損構築体と共にトランスフェクションされた（当該構築体によりカバーされたアミノ酸範囲により指し示した）。データが、該empty vectorを用いてトランスフェクションされた細胞において測定されたルシフェラーゼ活性の％として、表現されている。エラーバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。
【図６】ＢＲＩ２が、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ分泌を阻害することを確立しているウェスタン・ブロットの写真である。ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、empty vector（−）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２（＋）を用いて、トランスフェクションされた。ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβが、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中において４時間条件を整えられたトランスフェクションされた細胞培養から、検出された。ＡＰＰおよびＢＲＩ２発現が、該トランスフェクションされた細胞の総溶解物のウェスタン・ブロットにより、確認された。ＡＰＰ発現が、有意に変化しない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は一部、本発明者らの、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３がＡＰＰからのＡβ産生を阻害するとの発見に基づいている。ＡＰＰ細胞内部位（ドメイン）（ＡＩＤ）は、Ａβと付随して産生されるので、Ａβ産生を阻害すれば、ＡＩＤ産生をも阻害する。いかなる特定のメカニズムにも拘束されないが、このＡβ産生阻害は、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３による、β−セクレターゼによるＡＰＰおよびγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂阻害により、Ｃ９９産生およびＣ９９からのＡβ放出を阻害していると考えられる。実施例参照。
【００１７】
これゆえ、ある実施形態において、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する方法に関する。該方法は、該細胞をＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するのに有効な量で、接触させることを含む。
【００１８】
これらの実施形態において、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３は、脊椎動物の内在性膜蛋白であり、「内在性膜蛋白２Ｂ」および「内在性膜蛋白」としてもそれぞれ知られている。これらの蛋白のヒトの野生型の形態は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有し、ｃＤＮＡ配列が、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ＮＭ０２１９９９（ＢＲＩ２）、ならびに、ＮＭ０３０９２６、ＮＭ００１０１２５１６、およびＮＭ００１０１２５１４（３種の転写変異体のＢＲＩ３）として共に提供された。加えて、マカク（Ｍａｃａｑｕｅ）に関するＢＲＩ２アミノ酸配列およびマウスに関するＢＲＩ３アミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｑ６０ＨＣ１およびＮＰ０７１８６２として、それぞれ知られている。このならびに他の既知のＢＲＩ２およびＢＲＩ３情報を用いれば、当業者であれば、日常の方法を使用して、任意の脊椎動物に関しても、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３配列を決定できる。任意の脊椎動物のＢＲＩ２およびＢＲＩ３蛋白も、少なくとも８０％ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ相同なアミノ酸配列を有すると期待されるであろう。
【００１９】
本発明者らは、遺伝子的にＢＲＩ２蛋白の部分を合成して、アミノ酸１〜１０２のみからなるＢＲＩ２蛋白が、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するに充分であることも決定した。実施例１および２参照。
【００２０】
本方法において使用されたＢＲＩ２またはＢＲＩ３は、ペプチド模倣体をも含み得る。本明細書に使用される場合、ペプチド模倣体とは、ある１種の蛋白における天然の親種のアミノ酸を模倣可能である化合物であり、当該ペプチド模倣体でのアミノ酸の置換が、当該蛋白の活性に有意に影響を及ぼさない。ペプチド模倣体を含んでいる蛋白は一般的に、プロテアーゼの良くない基質であり、その天然蛋白に比較されると、より長い期間の時間、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性であることが予想される。多くの非加水分解性ペプチド結合類似体が、このような結合を含有するペプチド合成の手順と共に、当業界において知られている。非加水分解性結合は、−ＣＨ2ＮＨ、−ＣＯＣＨ2、−ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）、−ＣＨ2Ｏ、ＣＨ2Ｓを包含する。加えて、ペプチド模倣体含有ペプチドは、より低アレルゲン性たり得、全体的により高いバイオアベイラビリティーを示し得る。当業者であれば、ペプチド模倣体を含む蛋白の設計および合成が、過度の実験を必要としないと理解する。例えば、Ｒｉｐｋａら（１９９８年）；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら（１９９７年）；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）参照。
【００２１】
これゆえ、これらの方法の好ましい実施形態において、細胞が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２と等価なアミノ酸配列、及び／又はペプチド模倣体を含むＢＲＩ２またはＢＲＩ３と接触させられることであって、ここで、該ＢＲＩ２蛋白及びＢＲＩ３蛋白は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。
【００２２】
他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、天然蛋白である。ある好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、ヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３に、８０％相同性を超えて類似している。それらの実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有し、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列、尚より好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９８％相同的なアミノ酸配列を有する。最も好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に１００％相同的である。
【００２３】
これらの方法においてＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、これらの蛋白のわずか最初の１０２アミノ酸からなり得るので、本明細書において使用される場合、「ＢＲＩ２」もしくは「ＢＲＩ３」は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で規定されたような、完全長ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白よりも小さい蛋白を包含する。これゆえ、これら蛋白は、２５０、２００、１５０、もしくは１２５個のアミノ酸および／またはペプチド模倣体よりも少なくてよい。他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含む。
【００２４】
本明細書において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は更なる有用な部分、例えば、当該蛋白の持続放出もしくは抑制された分解を可能とする足場、つまりＰＥＧのような部分、または、ある特定の型の細胞に対する標的化を可能とする核酸配列のような部分をも更に含み得る。
【００２５】
これらの方法において、細胞は、ＢＲＩ２、ＢＲＩ３、またはＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体と接触され得る。本明細書において使用された場合、模倣体とは、天然物ペプチド（ここではＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３）の生物学的作用を模倣できる任意のペプチドもしくは非ペプチド化合物に言及し、しばしば、当該模倣体が、当該天然物ペプチドの基本構造を模倣する基本構造を有するか、および／または、当該天然物ペプチドの突出した生物学的特性を有するためである。模倣体は：天然物ペプチドとの類似性する側鎖のない等の原型からの実質的な修飾を持つペプチド（このような修飾は例えば、分解に対する感受性を減少させることがある）；抗イデオタイプおよび／または触媒抗体もしくはこれらのフラグメント；単離された蛋白の非蛋白部分（例えば、炭水化物の構造体）；あるいは、例えば、コンビナトリアルケミストリーを通じて同定された核酸および薬剤などの、合成もしくは天然有機分子を包含し得るが、これらに限定されない。このような模倣体が、当業界において既知の種々の方法を使用して、設計、選択、および／または、別の方法で同定され得る。薬剤設計（ドラッグデザイン）の種々の方法が、本発明において有用な模倣体もしくは他の治療化合物を設計（デザイン）するのに有用であり、Ｍａｕｌｉｋら、１９９７年において開示されており、本明細書においてその全体が援用されている。
【００２６】
これらの方法は、いずれの特定細胞を用いる使用にも限定されないが、当該細胞が、Ａβおよび／またはＡＩＤを産生できることを条件とする。これらの方法と共に利用され得る細胞の非限定例は、ニューロン（神経細胞）、ならびに、ＡＰＰを、天然に、もしくは、遺伝子操作を通して発現する本質的に任意の他の哺乳類細胞でもある（実施例参照）。当該細胞は、神経様、もしくは、神経へと分化することができるもの（例えば、幹細胞）でもよい。ある好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類中に存在する。好ましくは、該哺乳類は、アルツハイマー病の実験モデル、もしくは、ヒトである。他の好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類、好ましくは、ヒトのニューロンである。最も好ましい実施形態において、該ヒトがアルツハイマー病を有するか、または、アルツハイマー病を獲得してしまうリスクがある、例えばアルツハイマー病に対する遺伝素質を持つヒトである。
【００２７】
本細胞は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体と、任意の既知の方法によって接触され得る。実施例は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体を直接適用すること、または、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体を、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が、例えば、循環系を通って、もしくは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して、該細胞に辿り着くように、該細胞を停留させている哺乳類に投与する包含する。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が蛋白である場合（つまり、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白）、細胞は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の少なくとも１部分をコード化する核酸配列を含むウィルスベクターのようなベクターと接触され得、ここで、当該核酸によりコード化されたＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の翻訳が、この接触を有効化させる。特に、当該ベクターが本細胞に入っていくことができる場合、後者の方法が好ましい方法である（例えば、細胞のウィルス感染）。
【００２８】
ＢＲＩ２およびＢＲＩ３はフリンによりプロセシングされ、その産物がＣ９９プロセシング阻害を引き起こす。これゆえ、細胞におけるフリンの増加も、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する。
【００２９】
これゆえ、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する更なる方法にも関する。該方法は、細胞をフリンと、細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させることを含む。
【００３０】
フリン、つまり塩基性アミノ酸対開裂酵素は、細胞膜貫通Ｉ型蛋白原蛋白変換酵素（Ｔｈｏｍａｓ、２００２）である。ヒト野生型プレプロフリン（preprofurin）は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有し、ｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ００２５６９として与えられている。その成熟蛋白は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３もしくはこれのアミノ酸１０８〜７９４を有する。加えて、マウスに関するフリンのアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ０３５１７６として知られている。脊椎動物のフリンについて、このおよび他の既知の情報を用いれば、当業者であれば、フリン配列を、任意の脊椎動物に関しても、通常の方法を使用して決定できる。任意の脊椎動物フリン蛋白も、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１０８〜７９４に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有すると予期される。好ましい実施形態において、フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、最も好ましい実施形態において、フリンはヒトフリンである。
【００３１】
本明細書におけるフリンはまた、更なる有用な部分、例えば、当該蛋白の持続放出もしくは抑えられた分解を可能とする足場もしくはＰＥＧのような部分であるか、または、ある特定の型の細胞に対する標的化を可能とする核酸配列のような部分を含み得る。
【００３２】
これらの方法において、細胞が、天然フリンの活性を促進する化合物、例えばプロフリンをフリンに変換するペプチダーゼ、または、ＢＲＩ蛋白が存在している部位（サイト）へのフリン輸送を促進する化合物と接触され得る。しかしながら、好ましい実施形態において、例えば、フリンが（例えば、循環系を通じて、もしくは、ＢＢＢを通過して）該細胞に辿り着くように、細胞を停留させている哺乳類にフリン蛋白を投与することにより、細胞がフリン蛋白と接触する。より好ましい実施形態において、フリンが、フリン蛋白をコード化している核酸配列を含むベクターから発現される。好ましくは、これらのベクターは、細胞に感染し、そして、フリン蛋白をｉｎ ｓｉｔｕで産生するウィルスベクターである。
【００３３】
これらの方法は、いずれの特定細胞を用いる使用にも限定されないが、細胞が、Ａβおよび／またはＡＩＤを産生することができることを条件とする。これらの方法と共に利用され得る細胞の非限定例は、ニューロン、および、天然もしくは遺伝子操作を通してＡＰＰを発現する本質的に任意の他の哺乳類細胞でもある（実施例参照）。当該細胞は、神経様でもあり得、もしくは、ニューロンへと分化することもできる（例えば、幹細胞）。ある好ましい実施形態において、該細胞は、生存哺乳類内にある。好ましくは、該哺乳類は、アルツハイマー病実験モデル、もしくは、ヒトである。他の好ましい実施形態において、細胞は、生存哺乳類の、好ましくはヒトのニューロンである。最も好ましい実施形態において、ヒトがアルツハイマー病を有するか、または、アルツハイマー病を獲得してしまうリスクがある、例えば、アルツハイマー病に対する遺伝素因を有するヒトである。
【００３４】
他の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を処置する方法に関する。該方法は、被験体に、アルツハイマー病を被験体において処置するのに有効量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む。
【００３５】
これらの方法において、被験体は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＢＲＩ２蛋白配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヒトＢＲＩ３蛋白配列のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を投与される。これらの実施形態において、該ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を、それぞれ有する。他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、天然起源蛋白である。
【００３６】
これらの方法において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が、直接被験体の脳に投与され得る。あるいは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を、哺乳類のＢＢＢを通過させるような様式で投与される。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体は、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が被験体のＢＢＢを通過できる能力を促進させる医薬組成物中においても製剤化され得る。
【００３７】
他に制限がなければ、医薬組成物は、本明細書において記載された任意の実施形態においても、過度の実験なしに、ヒトなどの哺乳類に対する投与用に、特定の適用に対し必要に応じて製剤化され得る。加えて、適正な用量のこれら組成物は、過度の実験なしに、標準的な用量−応答プロトコールを使用して、求められ得る。
【００３８】
従って、口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用に設計された組成物は、過度の実験なしに、当業界においてよく知られた手段により、例えば、不活性稀釈剤を用いてもしくは食用の担体を用いて、調製され得る。組成物は、ゼラチンカプセル中に入れられるか、もしくは、錠剤へと圧縮されてよい。経口治療投与目的に、本発明の医薬組成物が、賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウェハウス、チュウイングガム等の形態で使用されてよい。
【００３９】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ等が、バインダー、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。バインダーの幾つかの例として、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例は、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤の幾つかの例として、アルギン酸、コーンスターチ等を包含する。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。ある１つの例の潤滑剤は、コロイド状二酸化硅素である。甘味料の幾つかの例として、スクロース、サッカリン等を包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料等を包含する。これらの種々の組成物を調製するのに使用される材料は、医薬として純粋(pure)であり、使用量において非毒性であるべきである。
【００４０】
本発明の組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜内、もしくは皮下注射によるように、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を溶液もしくは懸濁中に取り込ませることにより達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、食塩水、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してよい。非経口製剤は、例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。酢酸塩（アセテート）、クエン酸塩（シトレート）、もしくは燐酸塩（ホスフェート）のような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウム（食塩）もしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口調製品は、アンプル、使い捨てシリンジ、または、ガラスもしくはプラスチックでできた多数回用量バイアル中に入れられてよい。
【００４１】
直腸投与は、本医薬組成物を、直腸もしくは大腸中に投与することを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して、達成され得る。坐薬製剤は容易に、当業界において既知の方法により、調製され得る。例えば、坐薬製剤が、グリセリンを約１２０℃に加熱し、本組成物を該グリセリンに溶解させ、この加熱したグリセリンを混合し、この後精製水が加えられてよく、この熱い混合物を坐薬の型中に注いで調製され得る。
【００４２】
経皮投与は、本組成物の、皮膚を通しての経皮吸収を包含する。経皮製剤は、パッチ（よく知られたニコチンパッチなど）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏等を包含する。
【００４３】
本発明は、本哺乳類に、治療有効量の本組成物を経鼻投与することを包含する。本明細書において使用された場合、「経鼻投与すること」もしくは「経鼻投与」は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に投与することを包含する。本明細書において使用された場合、組成物の経鼻投与用医薬組成物は、例えば、鼻スプレー、点鼻剤、懸濁、ゲル、外用剤、クリーム、もしくは粉末として投与されるべく、よく知られた方法により調製された治療有効量の本組成物を包含する。本組成物の投与は、鼻タンポンもしくは鼻スポンジを使用して行われてもよい。
【００４４】
更なる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を治療する他の方法に関する。これら方法は、被験体に、アルツハイマー病を被験体において治療するに有効な量のフリンを投与することを含む。これらの実施形態において、被験体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１０８〜７９４の配列を有するヒトフリンに等価なアミノ酸及び／又はペプチド模倣体を含むフリン（該フリンは少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。）を投与することを含む。他の好ましい実施形態において、フリンは、天然起源蛋白であり、例えば、ヒトフリンである。
【００４５】
フリンは、これらの実施形態において、直接、被験体の脳に投与され得る。あるいは、フリンは、この化合物が、哺乳類のＢＢＢを通過できるような様式で投与され得る。フリンは、フリンの、被験体のＢＢＢを通過できる能力を高める医薬組成物中で製剤化され得る。
【００４６】
確立された模倣体を同定するための方法を使用して、当業者は、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害する化合物を同定することにより、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体を同定できる。こうして、本発明は、ある化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかどうか決定する方法にも関する。該方法は、該化合物を、機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含む膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含む。これらの実施形態において、γ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、該化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である。
【００４７】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、任意の既知の方法によって、例えば、実施例において記載された方法により決定され得る。このような方法は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体がＡβおよび／またはＡＩＤの減少を引き起こす所で、Ａβおよび／またはＡＩＤ放出を、例えばＡβおよび／またはＡＩＤ特異的抗体を使用して測定することを包含する。Ｃ９９阻害は、模倣体がＣ９９の増加を引き起こす所で、Ｃ９９の変化を測定することによっても求められ得る（実施例参照）。
【００４８】
実施例においても確立されたとおり、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３によるＣ９９開裂阻害は、Ｃ８３およびｓＡＰＰαの存在の減少を引き起こし、ｓＡＰＰβの存在の増加を引き起こす。こうして、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体が、Ｃ８３およびｓＡＰＰαの減少、ならびに、ｓＡＰＰβの増加を引き起こす。
【００４９】
上の決定は、任意の既知の方法によってなされ得る。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ、質量分析、もしくはウェスタンブロットを包含する。当業界において知られているとおり、ウェスタンブロットが、ＥＬＩＳＡよりも明確な化合物の同定を可能とするが、より多くの時間を消費し厄介な手順である。
【００５０】
これらの方法は、評価されるべき任意の特定の化合物にも限定されない。例えば、ランダムな化合物のライブラリーが評価され得る。好ましくは、しかしながら、化合物が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の一部分を模倣して設計（デザイン）されている。このような化合物は、例えば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の一部分の３次元構造および／または電荷を模倣して設計され得る。あるいは、化合物がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３アミノ酸配列を模倣するように、化合物はペプチド模倣体を含み得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、Ｃ９９を含む膜結合蛋白は、アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）であり、例えば、ＡＰＰを発現する細胞において生じる。
【００５２】
これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、試験管中において）において実施され得る。好ましくは、しかしながら、機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含む膜結合蛋白は生存細胞中に存在する。このような生存細胞の非限定例は、実施例１のように、レポーター遺伝子（レポータージーン、例えば、ルシフェラーゼ）の転写を、γ−セクレターゼによる遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰ開裂時に活性化させる遺伝子構築体を含むものである。これらの実施形態において、該遺伝子導入ＡＰＰは、好ましくは、当該遺伝子導入ＡＰＰの細胞質部位（ドメイン）で更にＧａｌ４を含む（実施例参照）。
【００５３】
該方法が生存細胞を利用する場合、機能しているγ−セクレターゼおよびＡＰＰを発現する任意の細胞が使用され得る。そのような生存細胞の非限定例は、神経細胞、または、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、もしくはＮ２ａ細胞のような、遺伝子導入ＡＰＰを産生する細胞を包含する。実施例参照。
【００５４】
更なる実施形態において、本発明は、精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物に関する。好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するヒトＢＲＩ２蛋白、または、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、任意の数のアミノ酸および／またはペプチド模倣体をも含み得、その全長の蛋白から１０２個に至るまでのアミノ酸のアミノ酸および／またはペプチド模倣体、例えば、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、あるいは、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体が挙げられる。
【００５５】
ある幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な前記賦形剤は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、被験体のＢＢＢを通過できる能力を高める。他の実施形態において、本組成物は、ユニットドーズの形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。
【００５６】
本発明は加えて、精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物に関する。好ましくは、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該フリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。好ましくは、該フリンは天然起源蛋白である。
【００５７】
幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な前記賦形剤は、フリンの、本被験体のＢＢＢを通過できる能力を高める。他の実施形態において、本組成物が、単位（ユニット）用量の形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。
【００５８】
本発明は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物にも関する。好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するヒトＢＲＩ２蛋白もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含み、ここで、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、医薬として許容可能な賦形剤は、該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる能力を増強させる。他の実施形態において、本組成物が、ユニットドーズ（単位用量）の形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。これらの実施形態は、如何なる特定のベクターにも限定されない。しかしながら、好ましい実施形態において、該ベクターはウィルスである。
【００５９】
本発明は、フリンをコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤において含む組成物にも関する。好ましくは、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態において、該フリンが、天然起源蛋白である。幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な賦形剤が、該フリンの、被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる能力を増強させる。他の実施形態において、本組成物が、ユニットドーズ（単位用量）の形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。好ましくは、該ベクターはウィルスである。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態が、以降の実施例で記載されている。本願請求項の範囲内の他の実施形態が、本明細書において開示されたとおりの本発明の特定もしくは実施の考慮から、当業者に明らかとされる。本明細書が、本実施例と共に、例示としてのみ考慮されるものと意図されており、本発明の範囲および精神が本願請求項により示されており、本実施例に続く。
【実施例】
【００６１】
実施例１．家族性痴呆ＢＲＩ２遺伝子によりコード化された蛋白が、ＡＰＰと結合し、Ａβ産生を阻害する
実施例のまとめ
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最もよくある老人性痴呆であり、アミロイド斑、血管性アミロイド、神経原繊維のもつれ、および、進行性神経変性により特徴付けられている。アミロイドは主に、Ａβペプチドにより構成されており、これは、セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）プロセシングに由来する。そのＡＰＰの細胞内ドメイン（ＡＩＤ）は、Ａβと共に放出されるが、それがアポトーシスおよび転写を調節するため、シグナル伝達機能を有する。その生物学的および病理学的重要さにもかかわらず、ＡＰＰプロセシングを規制している機序（メカニズム）が、良く理解されていない。膜結合蛋白が、セクレターゼによるＮｏｔｃｈ開裂および転写活性細胞内フラグメントの放出を促進させる。ＡＰＰとＮｏｔｃｈシグナル伝達との間の顕著な類似度を考慮して、我々は、ＡＰＰプロセシングが同様に規制されていると仮定した。ここで、本発明者らは、ＢＲＩ２たるＩＩ型膜蛋白が、ＡＰＰと相互作用することを示す。おもしろいことに、ＡβのＮＨ2−末端部分に対応している１７アミノ酸が、この相互作用に必要である。更に、ＢＲＩ２発現が、ＡＰＰプロセシングを規制し、結果、ＡβおよびＡＩＤ濃度（レベル）が抑えられた。総じて、これらの知見が、ＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用を、Ａβ産生を阻害するＡＰＰプロセシングの規制機序（メカニズム）として特徴付ける。特記すべきは、ＢＲＩ２突然変異が、家族性英国痴呆症（ＦＢＤ）および家族性デンマーク痴呆症（ＦＤＤ）を引き起こし、これらは、臨床的および病理学的に、ＡＤに似ている。ＢＲＩ２病原突然変異が、ＡＰＰプロセシングに関するＢＲＩ２の規制機能を変更するとの知見が、ＡＰＰ開裂の異常規制を、ＡＤ、ＦＤＤ、およびＦＢＤに共通な病原機序（メカニズム）として明示する。
【００６２】
序論
他のγ−セクレターゼ基質の開裂が膜結合リガンドにより規制されているので、本発明者らは、ＡＰＰと結合し、そのプロセシングを規制する膜内在性蛋白の存在を仮定した。ここで、我々は、ＢＲＩ２（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｉｊｄｅｒら、１９９６）たるＩＩ型膜蛋白を記載し、本記載を実行する。
【００６３】
実験手順
γ３０細胞が、Ｋｉｍｂｅｒｌｙら（２００３年）に記載されたとおり、抗生物質および１０％牛胎児血清を用いて補充されたＤＭＥＭにおいて維持された。
【００６４】
スプリット−ユビキチンイースト２種ハイブリッドスクリーニング
該スプリット−ユビキチンのシステムが、膜内在性蛋白間の相互作用を分析する（Ｓｔａｇｌｊａｒら、１９９８）ための魅力的な代替法を提供する。該スプリット−ユビキチンのシステムおよびヒトの脳ライブラリーが、Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ（チューリッヒ、スイス）から購入された。該スクリーニングが、製造元のプロトコルに従い実施された。端的に言えば、ヒトＡＰＰ（アミノ酸１〜６９５）、ヒトＡＰＰ（アミノ酸１〜６６４；ＡＰＰＮｃａｓ）、もしくはヒトＡＰＬＰ２がそれぞれ、ｐＴＭＶ４、ｐＡＭＢＶ４、ｐＡＭＢＶ４バイト（bait)ベクター中にクローン化され、ユビキチンのＣ末端側の半分（Ｃｕｂ）に融合され、レポーターフラグメントが続くＡＰＰファミリーのバイト(bait)蛋白を得た（ＬｅｘＡ、ＶＰ１６に融合されたＤＮＡ結合蛋白、転写活性化）。ヒトの脳ライブラリーが、変異したユビキチン（ＮｕｂＧ）のＮ−末端側半分において融合された蛋白を発現する。各ライブラリーに関して、本発明者らは、およそ５×１０6種の形質転換体をスクリーニングした。ＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−Ｃｕｂと相互作用できる蛋白をコードしているクローンが、ＮｕｂＧ：Ｃｕｂ相互作用を促進させ、次いで、ユビキチン特異的プロテアーゼ（１種もしくは複数種）の動員、ＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−Ｃｕｂバイトの開裂、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６転写因子の放出、および、これら２種のレポーター遺伝子（ＬａｃＺおよびＨＩＳ３）の転写活性化を伴う。ライブラリーのプラスミドが、ＨＩＳ３およびＬａｃＺ陽性イースト形質転換体から回収され、Ｎ−末端ＦＬＡＧタグを有するｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化され、直接、下記されたとおり、免疫沈降により、ＡＰＰとの相互作用できる能力をテストした。両レポーター遺伝子の共通の活性化因子を求めてのスクリーニングが、結果、Ｆｅ６５（Ｚａｍｂｒａｎｏら、１９９７）のような、既知のＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−結合蛋白の同定に至った。
【００６５】
プラスミド
全長ＢＲＩ２およびＢＲＩ２1―131が、２種のハイブリッドクローンから、ＰＣＲにより増幅され、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｍａｔｓｕｄａら、２００１）中にクローン化された。哺乳類発現ベクターＡＰＰたるＡＰＰＮｃａｓが記載されている（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）。ｍｙｃ−タグが、シグナル配列ＡｐｏＥＲ２後に挿入され、ｐＥＦ−ＢＯＳ中にクローン化された。ＢＡＣＥが、ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングされることにより、マウスの脳ｃＤＮＡからクローン化され、Ｃ−末側でｍｙｃのタグ化された。
【００６６】
抗体
以下の抗体が、使用されている：
αＦＬＡＧ（マウスモノクローナルＭ２、Ｓｉｇｍａ）；
αＡＰＰマウスモノクローナル２２Ｃ１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ
ｌａｂｓ）およびｐ２−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；
αｍｙｃ（マウスモノクローナル９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ウサギポリクローナル抗体αＡＰＰｃｔ（ＺＭＤ．３１６、Ｚｙｍｅｄ）（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）；
ニワトリコントロール抗体（ＩｇＹ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ニワトリαＢＲＩ２（ＩｇＹ、ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）；
ウサギポリクローナルコントロール抗体（ＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ＥＮ３（Ｐｉｃｋｆｏｒｄら、２００３）（ウサギポリクローナル抗体）；
ウサギαＢＲＩ２（Ｊｏｒｇｅ Ｇｈｉｓｏ博士からの好意）；
マウスポリクローナルが、ヒトＢＲＩ２の細胞質尾部を含むペプチドに対して生じた。抗ＡＰＬＰ１および抗ＡＰＬＰ２Ｃ−末端側ウサギポリクローナル抗体が、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入された。
【００６７】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３、ＡＰＰ安定発現ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３ＡＰＰ）、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ細胞が、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ2中に３７℃で維持された。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）もしくはＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ）がトランスフェクションに使用された。
【００６８】
免疫沈降法およびウェスタン・ブロット
他に記されない限り、全ての免疫沈降法の手順が、４℃において実施された。トランスフェクションされた細胞が、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ） Ａ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］中において、３０分間溶解され、これら溶解物が、２０，０００ｇにおいて、１０分間清澄化された。ＦＬＡＧの免疫沈降法に関して、これら清澄化された溶解物が、２０μＬのＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と、２時間混合され、３回、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを用いて洗浄された。該沈澱が、６０μＬの２×ＳＤＳサンプル緩衝液で煮沸され、ウェスタン・ブロットに付された。他の免疫沈降法に関して、清澄化された溶解物が、抗体と共に、１時間インキュベートされ、２０μＬの蛋白Ａ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合され、洗浄され、上のとおり加工された。ヒトの脳（Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓ博士からの寛大な好意）が、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有しているＢｕｆｆｅｒ Ａ中で、Ｄｏｕｎｃｅ ホモジナイザーを使用して、均一化された。該蛋白が終夜、５ｍｇ／ｍＬにおける当該蛋白濃度で抽出された。抽出された蛋白が、２０，０００ｇにおいて、１時間清澄化された。その上清が、指示抗体と１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックされた蛋白Ａ／Ｇビーズとインキュベートされた。沈澱は、上記のとおり、洗浄され、加工された。
【００６９】
代謝標識
ｐｃＤＮＡ３もしくはＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、メチオニンおよびシステイン無しに、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清が補充ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、２時間インキュベートされた。細胞が次いで３０分、［35Ｓ］標識メチオニンおよびシステイン（ＩＣＮ）をこの培養培地に加えることにより標識された。該標識された細胞が念入りに洗浄され、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清を用いて補われたＤＭＥＭ中において、指示された期間追跡された。この追跡後、細胞が溶解され、αＡＰＰｃｔと共に、上記したとおり、免疫沈降された。標識された細胞が培地から、２０，０００ｇ１０分間の遠心により清澄化され、次いで、指示抗体と共に、免疫沈降された。
【００７０】
ルシフェラーゼ・アッセイ
（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００３）に記載されるように、アッセイが実施されたが、ＡＰＰ−Ｇａｌ４融合（Ｇｉａｎｎｉら、２００３）がＧａｌ４源として使用されたことを除く。ルシフェラーゼ活性が、同時トランスフェクションされたβ−ガラクトシダーゼ活性により標準化され、このトランスフェクション効率をモニターした。
【００７１】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、ｐｃＤＮＡ３もしくはＢＲＩ２でトランスフェクションされた。このトランスフェクションの２４時間後、該細胞が２４時間訓化され(conditioned)、前記培地中のＡβ４０およびＡβ４２が、ヒトＡβＥＬＩＳＡキット（ＫＭＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、その製造元のプロトコルに従いつつ、測定された。トランスフェクションされた細胞が溶解され、上記のとおり清澄化され、抽出された蛋白量が使用されて、ＥＬＩＳＡにより検出されたＡβ量を標準化した。
【００７２】
蛋白決定
蛋白濃度が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白アッセイにより（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＢＳＡを標準として求められた。
【００７３】
結果および議論
膜結合蛋白がＡＰＰプロセシングを規制するかどうかテストするために、本発明者らは、スプリットユビキチンシステムを使用して、膜蛋白間の相互作用を同定した。ＡＰＰファミリー蛋白と相互作用する蛋白に関するヒト脳ｃＤＮＡライブラリースクリーニングが、ＢＲＩ２（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｉｊｄｅｒら、１９９６）およびＢＲＩ３（Ｖｉｄａｌら、２００１）（示さず）、Ｂｒｉｃｈｏｓ部位（ドメイン）を含有するＩＩ型膜蛋白遺伝子ファミリーメンバーの同定に至った。ＢＲＩ蛋白の機能は知られていないが、ＢＲＩ２の突然変異が、ＦＢＤ（Ｖｉｄａｌら、１９９９）およびＦＤＤ（Ｖｉｄａｌら、２０００）を有する患者に見出されている。記すべきことに、ＦＢＤおよびＦＤＤにおける神経病理学的知見が、実質プレアミロイド沈着（ＦＢＤおよびＦＤＤ）および斑（ＦＢＤ）、神経原繊維のほつれ、コンゴレッド親和性アミロイド血管障害（ＣＡＡ）、および神経変性を包含し、ＡＤに似ている。これゆえ、ＢＲＩ２における突然変異が、ＡＤ様の家族性痴呆症を引き起こすので、本発明者ら更に、このＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用の生理学的関連を研究した。
【００７４】
このＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用を哺乳類細胞において評価するために、ＨｅＬａ細胞が、ＢＲＩ２およびＡＰＰ構築体と共に、同時トランスフェクションされた（図１ａ）。αＦＬＡＧ抗体との細胞溶解物の免疫沈降は、ＢＲＩ２が、全長ＡＰＰ（図１ｂおよびｄ）、Ｃ９９（図１ｂおよびｄ）、およびＡＰＰＮｃａｓと相互作用したことを示したが、このことは、Ｃ８３でなく（図１ｂおよびｄ）、ＡＰＰ（図１ｃ）の細胞内領域の殆どの欠損を表す。ＡＰＰが、ダブレットとして、描かれている。下方のＡＰＰのバンドが、非グリコシル化未成熟ＡＰＰを表し；上方の形が代わりに、グリコシル化成熟ＡＰＰから構成されている。記すべきことに、このグリコシル化成熟した形のＡＰＰおよびＡＰＰＮｃａｓだけが、ＢＲＩ２と相互作用した（図１ｂ、ｃ、およびｄ）。ＢＲＩ２過剰発現が劇的に、Ｃ９９量を増加させることも、記されるべきである（図１ｂおよび１ｄ）。この知見の意義が後で展開される。
【００７５】
ＢＲＩ２外側部位（ドメイン）の殆どの欠損が、ＡＰＰに対する結合を廃しなかった（ＢＲＩ２1―131、図１ｄ）。αＡＰＰ抗体を用いる逆免疫沈降が、ＡＰＰがＢＲＩ２を免疫沈降させることを明らかにした（図１ｅ）。加えて、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞において検出された蛋白溶解〜１７ｋＤａのＢＲＩ２のＮＨ2−末端フラグメント（ＢＲＩ２ｎｔ、ＢＲＩ２1-131にサイズが似ている）も、ＡＰＰと共に沈澱された（図１ｅ）。これらの相互作用の特異性が更に、ＢＲＩ２が、もう１種別のＩ型膜統合蛋白たるＡｐｏＥＲ２に結合しなかった（図１ｃ）との証拠により、裏付けられた。これらの知見が、ＡＰＰの細胞質内尾部およびＡＰＰの殆どおよびＢＲＩ２外部ドメインが、ＢＲＩ２／ＡＰＰ相互作用に可欠である一方、ＡＰＰの外部ドメインにおける１７アミノ酸の領域（その膜貫通領域に近く、そのＮＨ2−末端Ａβ配列を含有する）が、この結合に必須であることを証拠付ける。これらのデータが強く、ＢＲＩ２およびＡＰＰがｉｎ ｔｒａｎｓ（つまり、区別される膜上で発現された受容体／リガンドとして）において相互作用しないが、むしろ、分子複合体を細胞膜において形成することを示唆する。
【００７６】
ＡＰＰおよびＢＲＩ２が両方、成熟神経組織において発現されている。本発明者らはこれゆえ、ＡＰＰも、ＢＲＩ２と、成人ヒト脳において相互作用するかを決定しようとした。まず、本発明者らは、４種の抗ＢＲＩ２抗体をテストし、これらがヒトＢＲＩ２を免疫沈降できるかを決定した。これらのテストに関して、ＨｅＬａ細胞が、ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされ、これら４種のＢＲＩ２抗体およびコントロールと共に免疫沈降された。図２ａで示されたとおり、ＥＮ３抗ＢＲＩ２抗体だけが、ＢＲＩ２を沈澱させることができた。次に、本発明者らは、ヒトの脳のホモジェネートを調製し、αＡＰＰｃｔ抗体もしくはＥＮ３を用いた免疫沈降を実施した。図２ｂで示されたとおり、Ｃ９９（およびより大きいＣＯＯＨ−末端ＡＰＰフラグメント）が、抗ＡＰＰおよびＥＮ３両方と沈澱された一方、Ｃ９９は、ウサギポリクローナルＩｇＧと沈澱されなかった。おもしろいことに、この場合においても、Ｃ８３が、ＢＲＩ２と沈澱しなかったが、αＡＰＰｃｔにより沈澱した。更に、全長ＡＰＰも、低濃度（レベル）ではあるが、ＥＮ３により沈澱した。総じて、これらの実験が、内因性ＡＰＰおよびＢＲＩ２が、成人ヒト脳において関連することを指し示す。加えて、これらが、ＢＲＩ２が好ましくは、Ｃ８３とでなく、Ｃ９９およびより大きいＡＰＰのＣ−末端フラグメントと相互作用することを示す。
【００７７】
図１ｂおよび１ｄにおいて示されたとおり、ＢＲＩ２構築体の発現が、不変に、Ｃ９９の濃度（レベル）の上昇に至る。このＣ９９濃度（レベル）の劇的な上昇が、ＡＰＰプロセシングへのＢＲＩ２の効果に依存しているらしい。これに関して直接テストするために、本発明者は、ＦＬＡＧのタグをされたＢＲＩ２を、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、およびＮ２ａ細胞において、ＡＰＰ−Ｇａｌ４、Ｇａｌ４プロモーター制御下のルシフェラーゼレポーター、およびβ−ガラクトシダーゼ構築体と共に、発現させた。ＡＰＰ−Ｇａｌ４は、ＡＰＰ細胞質部位（ドメイン）に対する、イースト転写因子Ｇａｌ４の融合体である。ＡＰＰ−Ｇａｌ４のγ−開裂が、ＡＩＤ−Ｇａｌ４を、細胞膜から核に放出させ、引き続いてのルシフェラーゼ転写の活性化を伴う（Ｇｉａｎｎｉら、２００３）。図３ａで示されたとおり、ＢＲＩ２がルシフェラーゼ活性を３種全ての細胞株で抑え、これが、ＡＩＤ形成阻害を示唆している。代わりに、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）トランスフェクションが、結果、ＡＩＤ放出の増加に至ったが、予測されたとおりであった（図３ｂ）。ＢＲＩ２1―131変異体（なおＡＰＰと相互作用し、上昇したＣ９９濃度（レベル）を生じる（図１ｄ））は、ＡＩＤ放出も阻害する（図３ｃ）。最後に、混合実験は、ＢＲＩ２がＡＩＤ−Ｇａｌ４放出を抑制するには、ＡＰＰ−Ｇａｌ４と共に、同一細胞において、同時発現されなくてはならないことを示す。つまり、ＢＲＩ２を発現している細胞を、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を発現している細胞と混合すると、ＡＩＤ放出に影響を及ぼさない（図３ｄ）。このことが更に、ＢＲＩ２およびＡＰＰが、ｉｎ ｔｒａｎｓよりもむしろｉｎ ｃｉｓにおいて相互作用することを示唆する。
【００７８】
この系（システム）を更に確認するために、本発明者らは、ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３の条件を整えられた培地におけるＡβを測定しており、ＢＲＩ２が有意に、Ａβ４０およびＡβ４２濃度（レベル）を減少させた（図３ｂ）ことを見出している。さらに、ＢＡＣＥトランスフェクションが、Ａβ４０およびＡβ４２分泌を増加させた（図３ｆ）。
【００７９】
ＢＲＩ２によるＡＩＤおよびＡβ産生の阻害は、ＢＲＩ２発現が、γ−セクレターゼによるＡＰＰの開裂を抑えることを示唆する。しかしながら、ＢＲＩ２が、ＡＰＰのβ−およびα−開裂を調節することも、可能である。上で議論されたとおり、β−もしくはα−セクレターゼによるＡＰＰの開裂がそれぞれ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、上清中において放出する。ｓＡＰＰαもしくはｓＡＰＰβの量の増加が、α−もしくはβ−開裂の増加を指し示す一方、ｓＡＰＰαもしくはｓＡＰＰβの減少が、α−もしくはβ−開裂の減少に反映する。こうして、ＢＲＩ２がα−もしくはβ−セクレターゼに影響を及ぼすかどうか決定するために、本発明者らは、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ量を測定した。これらの同一の実験において、本発明者らは、Ｃ９９およびＣ８３の細胞内濃度（レベル）も測定した。ＨＥＫ２９３−ＡＰＰ細胞が、ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２もしくはベクターコントロールを用いて、トランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞が、［35Ｓ］メチオニン−システインを用いて３０分間、パルス標識され、次いで、０、１、２、および４時間、３７℃において追跡された（図３ｃ）。細胞溶解物が、αＡＰＰ−ｃｔ抗体と共に、各時点において免疫沈降された（図３ｃ）。分泌されたＡＰＰ（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ）を測定するために、上清が、４時間標識され、抗ＡＰＰ抗体Ｐ２１（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ両方を沈澱させる）もしくは６Ｅ１０（ｓＡＰＰαだけを沈澱させる）と共に沈澱された細胞から回収された（図３ｄ）。ＢＲＩ２トランスフェクションが、結果、Ｃ８３（図３ｃ）およびｓＡＰＰα（図３ｄ）の量の減少に至った。逆に、Ｃ９９（図３ｃ）およびｓＡＰＰβ（図３ｄ）濃度（レベル）が、増加した。特記すべきことに、ＢＲＩ２が、αＡＰＰ−ｃｔ抗体により、全時点において、免疫共沈降された（co-immunoprecipitated）。こうして、ＢＲＩ２発現が、α−セクレターゼによるＡＰＰ開裂を抑える一方、β−セクレターゼによるそのプロセシングを上昇させる。γ−セクレターゼの同時阻害およびＡＰＰのβ−開裂の増加が、Ｃ９９濃度（レベル）の劇的な増加を説明する。
【００８０】
ＡＰＰは、ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２を包含する蛋白ファミリーのある一員である。ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２も、γ−セクレターゼの基質であり（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）、数多くのγ−セクレターゼの基質の中でも、ＡＰＰに対するより多くの配列の類似性を保有するものである。従って、ＢＲＩ２が、一般的にγ−セクレターゼに影響を及ぼすのか、特異的にＡＰＰのγ−開裂を阻害するのかテストするために、本発明者らは、ＢＲＩ２を、ＡＰＬＰ１もしくはＡＰＬＰ２を用いてトランスフェクションした。抗ＡＰＬＰ１もしくは抗ＡＰＬＰ２Ｃ末端抗体を使用してのウェスタン・ブロットは、ＢＲＩ２発現がＡＰＬＰ１（図示せず）およびＡＰＬＰ２（図３ｉ）のＣ末端フラグメントの蓄積を促進させないことを指し示す。この結果が、ＢＲＩ２が特異的に、他のγ−基質ではなく、ＡＰＰへのγ−活性をブロックするとの観念を裏付ける。
【００８１】
総じて、これらの研究は、ＢＲＩ２およびＡＰＰが多分子複合体を細胞膜において形成することを示唆する。このような複合体におけるＡＰＰおよびＢＲＩ２の化学量論量が、調査されなければならず、ＢＲＩ２およびＡＰＰが他の蛋白を含む構造において見出されるかどうか未知である一方、本発明者らのデータが、ＢＲＩ２がＡＰＰプロセシングの内因性制御因子（レギュレーター）として機能することを示唆する。より具体的に、本発明者らはここに、ＢＲＩ２発現がＡＰＰのα−およびγ−両方の開裂を減らすことを見出した。これらの機能に相応しい詳細な分子機序（分子レベルでのメカニズム）が直接述べられなければならないが、ＢＲＩ２が、α−およびγ−開裂部位を含んでいるＡＰＰの領域と相互作用するとの知見はＢＲＩ２が物理的に、これら２種の標的配列を、これらセクレターゼからマスクすることをほのめかす。
【００８２】
最近、ＢＲＩ２における突然変異が、ＦＢＤ（Ｖｉｄａｌら、１９９９）およびＦＤＤ（Ｖｉｄａｌら、２０００）患者において見出されている。野生型および突然変異体ＢＲＩ２両方が、フリンによりプロセシングされており（Ｋｉｍら、１９９９）、このプロセシングがＣ末端ペプチドの分泌に至る。フリンによる野生型ＢＲＩ２の開裂が、１７アミノ酸（ａａ）長のペプチドを放出させる。ＦＢＤ患者において、ＢＲＩ２の停止（ストップ）コドンでの点突然変異が、３’−非翻訳領域の解読、および、余分な１１アミノ酸をＣ末端において含有するＢＲＩ２分子の合成に至る。フリンによるこの突然変異したＢＲＩ２の開裂が、より長いペプチドたるＡＢｒｉペプチドを生成させ、これがアミロイド繊維として沈着される。デンマーク家族性において、正常停止コドンの１コドン前の１０−ｎｔ複製物の存在が通常より大きな蛋白前駆体（そのアミロイドサブユニットが最後の３４Ｃ末端アミノ酸を含む。）を発生させるＢＲＩ２配列でのフレームシフトを生じる。ＡＢｒｉおよびＡＤａｎアミロイドの沈着が、これらの痴呆の病原と考えられている。しかしながら、ＢＲＩ２が、ＡＰＰプロセシングを規制するとの知見が、魅惑的であり、変更されたＡＰＰプロセシングも、ＦＢＤおよびＦＤＤにおける病原要因であるとの思索を促進させる。この仮定と一致して、ＦＤＤ患者において、上昇した濃度（レベル）のＡβ４２沈着が、ＣＡＡ病巣において、ＡＤａｎと共に検出されている。
【００８３】
実施例２．ＡＰＰプロセシングへのＢＲＩ２の効果に関する更なる研究
実施例１で記載された方法を使用して、最初の、８０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１１７、および１３１アミノ酸からなるＢＲＩ２欠損構築体の効果が、測定された。図４（左パネル）で示されたとおり、９９アミノ酸よりも大きいトランケーションだけが、総溶解物におけるＣ９９の蓄積を示したが、このことが、Ｃ９９の更なるプロセシングの阻害を指し示す。最初の９６および９９アミノ酸からなる欠損構築体が、遙かにより乏しい阻害効果を示し、８０および９３（アミノ酸）からなるものが、該阻害を示さなかった。Ｃ９９プロセシングへのＢＲＩ２のこの阻害効果は、図４に示すとおり（右のパネル）、ＢＲＩ２トランケーションのＣ９９および全長ＡＰＰに対する結合に対応した。同一セットの欠損構築体が、ＡＩＤ産生へのそれらの効果を求めるのに使用された。ＡＰＰ−Ｇａｌ４駆動ルシフェラーゼ活性の結果（図５）が更に、最初の９９アミノ酸を越えるアミノ酸を含むＢＲＩ２構築体が、ＡＩＤ産生の効率的な阻害に必要とされているとの結論を裏付ける。
【００８４】
実施例１は、ｓＡＰＰαがＢＲＩ２存在下に抑えられていることを確立させ、ＢＲＩ２がα−セクレターゼを阻害することを指し示している。更なる実験が実施され、ｓＡＰＰβ産生へのＢＲＩ２の効果を究明した。図６で示されたとおり、ｓＡＰＰβ産生も、ＢＲＩ２存在下に抑えられており、ＢＲＩ２がβ−セクレターゼを阻害することを指し示している。
【００８５】
上に鑑みると、本発明の幾つかの利点が達成されており、他の利点が得られたことが分かる。
【００８６】
本発明範囲から逸脱することなく、上の方法および組成物において種々の変更がなされ得るので、上の記載において含有され、添付の図面において示された全事項が、例示として、限定している意味ではなく解釈されると意図されている。
【００８７】
本明細書において引用された全文献が、本明細書において援用される。本明細書における文献に関する議論が単に、それらの著者によりなされた主張を要約すると意図されており、いずれの文献も、先行技術を構成するとは、全く認められていない。出願人は、これら引用された文献の精確さおよび適切さに挑む権利を確保する。
【００８８】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−ヒトＢＲＩ２アミノ酸配列 GenBank Q9Y287
1 mvkvtfhsal aqkeakkdep ksgeealiip pdavavdckd pddwpvgqr rawcwcmcfg
61 lafmlagvil ggaylykyfa lqpddvyycg ikyikddvil nepsadapaa lyqtieenik
121 ifeeeevefi svpvpefads dpanivhdfh kkltayldln ldkcyvipln tsivmpprnl
181 lellinikag tylpqsylih ebmvitdrie nidhlgffiy rlchdketyk lqrretikgi
241 qkreasncfa irhfenkfav etlics
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−ヒトＢＲＩ３アミノ酸配列 GenBank Q9NOX7.
1 mvkisfqpav agikgdkadk asasapapas ateilltpar eeqppqhrsk rggsvggvcy
61 lsmgmwlhn glvfasvyiy ryfflaqlar dnffrcgvly edslssqvrt qmeleedvki
121 yldenyerin vpvpqfgggd padiihdfqr gltayhdisl dkcyvielnt tivlpprnfw
181 ellmnvkrgt ylpqtyiiqe emwtehvsd kealgsfiyh lcngkdtyrl rrratrrrin
241 krgakncnai rhfentfVve tlicgw
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−ヒトフリン前原蛋白 GenBank NP002560
1 melrpwllwv vaatgtlvll aadaqgqkvf tntwavripg gpavansvar khgflnlgqi
61 fgdyyhfwhr gvtkrslsph rprhsrlqre pqvqwleqqv akrrtkrdvy qeptdpkfpq
121 qwylsgvtqr dlnvkaawaq gytghgiws ilddgieknh pdlagnydpg asfdvndqdp
181 dpqprytqmn dnrhgtrcag evaavanngv cgvgvaynar iggvrmldge vtdavearsl
241 glnpnhihiy saswgpeddg ktvdgparla eeaffrgvsq grgglgsifv wasgnggreh
301 dscncdgytn siytlsissa tqfgnvpwys eacsstlatt yssgnqnekq ivttdlrqkc
361 teshtgtsas aplaagiial tleanknltw rdmqhlwqt skpahhiand watngvgrkv
421 shsygyglld agamvalaqn wttvapqrkc iidiltepkd igkrlevrkt vtaclgepnh
481 itrlehaqar ltlsynrrgd laihlvspmg trstllaarp hdysadgfhd wafmtthswd
541 edpsgewvle ientseanny gtltkftlvl ygtapeglpv ppessgcktl tssqacwce
601 egfslhqksc vqhcppgfap qvldthyste ndvetirasv capchascat cqgpaltdcl
661 scpshasldp veqtcsrqsq ssresppqqq pprlppevea gqrlragllp shlpewagl
721 scafivlvfv tvflvlqlrs gfsfrgvkvy tmdrglisyk glppeawqee cpsdseedeg
781 rgertafikd qsal
【技術分野】
【０００１】
連邦協賛研究開発に関する陳述
米国政府は本発明において、支払い済みのライセンスを有し、限られた条件下、ＮＩＨにより承認されたＡＧ２２０２４−９５２６４５６２号およびＡＧ２１５８８−９５２６４８７８号の支払いにより準備されるような合理的な状況において、本特許権者が他者にライセンスを付与することを要求する権利を有する。
【０００２】
（１）本発明の分野
本発明は一般的に、アルツハイマー病におけるＡβ産生の制御（コントロール）に関する。より具体的には、本発明は、Ｃ９９のγ−セクレターゼ開裂ならびにＡβおよび／またはＡＰＰの細胞内（ドメイン、ＡＩＤ）の放出を阻害するためのＢＲＩ蛋白の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２）関連技術の記述
参考文献
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【０００４】
アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）は、普遍的なＩ型（タイプＩ）膜貫通蛋白（Kangら、１９８７年；Tanziら、１９８７年）であり、一連の蛋白溶解現象（SelkoeおよびKopan、２００３年；SisodiaおよびSt.George-Hyslop、２００２年）を受ける。ＡＰＰはまず、原形質膜または細胞内小器官において、β−セクレターゼにより開裂される（Vassarら、１９９９年）。その外部ドメインが、細胞外に（ｓＡＰＰβ）、もしくは、細胞内区画の管腔（ルーメン）中に放出される一方、９９アミノ酸（Ｃ９９）のＣＯＯＨ−末端フラグメントは膜に結合したままである。第２の、膜内蛋白溶解現象において、γ−セクレターゼにより、ややｌａｘ部位（サイト）特異的にＣ９９が開裂される。２種のペプチドが、１：１化学量論比で放出され、そのアミロイド原性Ａβペプチドは、４０および４２アミノ酸の２種の主要な種（それぞれ、Ａβ４０およびＡβ４２）からなり、細胞内産物は、ＡＰＰ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ（ＡＩＤもしくはＡＩＣＤ）と名付けられ、非常に短命であり、ごく最近に（Passerら、２０００年；CaoおよびSudhof、２００１年；Cupersら、２００１年）同定されている。代わりの蛋白溶解経路において、ＡＰＰはまず、α−セクレターゼにより、Ａβ配列中においてプロセシングされ、可溶性ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）外部ドメイン、および、８３アミノ酸（Ｃ８３）の膜結合ＣＯＯＨ−末端フラグメントに至る。Ｃ８３も、γ−セクレターゼにより、Ｐ３およびＡＩＤペプチドへと開裂される。Ａβがアルツハイマー病の病理に関わる一方、ＡＩＤが殆どのＡＰＰシグナル伝達機能を媒介する。ＡＤにおけるＡＰＰプロセシングに関する病理的な役割が、ＡＰＰにおける突然変異（Ｇｏａｔｅら、１９９１）、およびγ−セクレターゼの重要な構成であるＰｒｅｓｅｎｉｌｉｎ（プレセリニン）（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９５；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄら、１９９５ａ，ｂ；Ｒｏｇａｅｖら、１９９５）が、ＡＤの常染色体優性家族形を引き起こすという知見により確認されている。これゆえ、この生物学的および病理学的重要さにより、どのようにＡＰＰ開裂が規制されているのか理解する必要がある。本発明は、この必要性を課題とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明者らは、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３がＡＰＰからのＡβおよびＡＰＰ細胞内部位（ドメイン、ＡＩＤ）産生を阻害することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これゆえ、ある実施形態において、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する方法に関する。該方法は、該細胞をＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させることを含む。
【０００７】
他の実施形態において、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を抑制、阻害、または予防する更なる方法に関する。該方法は、該細胞をフリン（ｆｕｒｉｎ）と、該細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させることを含む。
【０００８】
加えて、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を治療する方法に関する。該方法は、該被験体に、被験体におけるアルツハイマー病を治療するのに有効な量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む。
【０００９】
更なる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を治療する他の方法に関する。該方法は、該被験体に、被験体におけるアルツハイマー病を治療するのに有効な量のフリンを投与することを含む。
【００１０】
本発明は、化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかを決定する方法にも関する。該方法は、化合物を、機能しているγ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含む膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含む。これらの実施形態において、化合物が、もしγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である。
【００１１】
更なる実施形態において、本発明は、精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中にて含む組成物に関する。
【００１２】
更なる実施形態において、本発明は、精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物に関する。
【００１３】
本発明は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物にも関する。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、フリンをコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ウェスタン・ブロットの図式および写真であり、ＢＲＩ２が、ＡＰＰリガンドであることを確立している。パネルａ：使用されたＢＲＩ２構築体の略図である。これら構築体が、１（アミノ酸１〜２６６、全長）および２（アミノ酸１〜１３１）と付番されている。 パネルｂ−ｄは、指し示された蛋白を発現しているＨｅＬａ細胞からの総溶解物（ＴＬ）および抗ＦＬＡＧ免疫沈降（ＩＰαＦＬＡＧ）のウェスタン・ブロット（ＷＢ）が、ＢＲＩ２／ＡＰＰ会合の特異性を示し、相互作用部位を地図化（マッピング）することを示す。ｐｃは、empty vector（ｐｃＤＮＡ３．１）を示す。；番号１および２が、ａで示されたＢＲＩ２構築体を指し示し；＊が、抑えられなかった抗ＦＬＡＧ抗体を指し示し；ｍ．が、成熟したグリコシル化された形態のＡＰＰを示す。；一方、ｉ．が、対応する未熟なグリコシル化されなかったＡＰＰを示す。ウェスタン・ブロットに関して、αＡＰＰが、モノクローナル抗体２２Ｃ１１を表し、一方、αＡＰＰｃｔが、ＡＰＰのＣ−末端に対して惹起されたウサギポリクローナルである。 パネルｅ：ＡＰＰおよびＢＲＩ２両方を用いてトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の溶解物が、ウサギポリクローナルコントロール（ＲＰ）もしくはαＡＰＰ−ｃｔと共に沈澱された実験のウェスタン・ブロットである。免疫沈降および総溶解物が、αＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１もしくはαＦＬＡＧを用いてブロットされた。ＢＲＩ２が、〜１７ｋＤａのＢＲＩ２のＮ−末端フラグメント（ＢＲＩ２ｎｔ）同様、αＡＰＰｃｔにより、ＡＰＰと共に沈澱された。
【図２】内因性ＡＰＰおよびＢＲＩ２が、成人脳において相互作用することを確立するウェスタン・ブロットの写真である。 パネルａ：ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞からの溶解物が、ニワトリのコントロールの抗体（レーン３）、市販のニワトリのαＢＲＩ２抗体（レーン６）、蛋白Ａ／Ｇビーズ単独（レーン９）、コントロールのウサギポリクローナル抗体（レーン１２）、ウサギポリクローナルＥＮ３αＢＲＩ２抗体（レーン１５）、区別できるウサギαＢＲＩ２血清（レーン１８）、およびマウスαＢＲＩ２ポリクローナル抗体（レーン２１）と共に沈澱された。総溶解物（Ｌ）、上清（Ｓ）、および沈澱（Ｐ）が、ゲル濾過され、αＦＬＡＧを用いて調べられた。ＥＮ３だけが、ＢＲＩ２を沈澱させることができた。〜１７および１４ｋＤａのＢＲＩ２ｎｔフラグメントは沈澱しなかったが、これは、ＥＮ３により認識されるエピトープが、Ｃ−末端からＢｒｉｃｈｏｓドメインであるためである。 パネルｂ：総脳ホモジェネートが、コントロールのウサギポリクローナル（ＲＰ）、αＡＰＰｃｔ、もしくはＥＮ３と共に免疫沈降された。総脳溶解物（Ｔ．Ｌ．）および免疫沈澱が、αＡＰＰモノクローナル抗体２２Ｃ１１（上のパネル）もしくはαＡＰＰｃｔ（下のパネル）を用いてブロットされた。
【図３】ＢＲＩ２が、セクレターゼによるＡＰＰプロセシングを規制することを確立しているウェスタン・ブロットの図および写真である。 パネルａ−ｃ：ＢＲＩ２が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４駆動ルシフェラーゼ活性を、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ、およびＨＥＫ２９３細胞において抑える。細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃ）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２、ＢＲＩ２1ー131もしくはＢＡＣＥと共に、同時トランスフェクションされた。データは、empty vectorでトランスフェクションされた細胞において測定されたルシフェラーゼ活性の％として表現されている。ＢＲＩ２、ＢＡＣＥ、およびｐｃによりトランスフェクションされた細胞が、同様な濃度（レベル）のＡＰＰ−Ｇａｌ４を発現する（図示せず）。エラーバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 パネルｄ：細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４、ｐｃＤＮＡ３．１（ｐｃ）、もしくはＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされた。ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いてトランスフェクションされた細胞が次いで、指し示された比で、ＢＲＩ２もしくはｐｃ．ＤＮＡ３．１によりトランスフェクションされた細胞と混合された。サンプルが、ルシフェラーゼ活性に関して、上記したとおり、トランスフェクションおよび混合の２４時間後、解析された。 パネルｅ−ｆ：ＢＲＩ２は、Ａβ４０／Ａβ４２産生を阻害する。安定にＡＰＰを発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ＡＰＰ）が、empty vector（ｐｃ）、ＢＡＣＥ、もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされ、培地中に分泌されたＡβ４０およびＡβ４２が、ＥＬＩＳＡにより測定された。Ａβ量が、トランスフェクションされた細胞の溶解物の蛋白含量により、規格化された。エラーバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。 パネルｇ：トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞に関しての、４種の独立の実験の代表たるパルス追跡実験。ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、empty vector（ベクター）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされた。代謝標識された細胞の溶解物が、αＡＰＰｃｔと共に沈澱された。各レーン上の数字が、これら細胞が追跡された時間を指し示す（ｃ）。ＢＲＩ２発現が、Ｃ８３産生を減らす一方、劇的に、Ｃ９９生成を増やす。 パネルｈ：同様にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞の、条件を整えられた培地が４時間の標識後収集され、ｐ２１もしくは６Ｅ１０と共に沈澱された。ｓＡＰＰα量が、ＢＲＩ２により減った一方、総ｓＡＰＰ（ｓＡＰＰα＋ｓＡＰＰβ）は有意な変化を示さず、これはｓＡＰＰβ産生の増加、および、αからβセクレターゼに至るＡＰＰプロセシングの変化（シフト）を指し示している。 パネルｉ：細胞が、ＡＰＬＰ２を用いて、ｐｃ．ＤＮＡ３．１もしくはＢＲＩ２と共にトランスフェクションされた。トランスフェクション２４時間後、細胞が、ウェスタン・ブロットにより、ＢＲＩ２およびＡＰＬＰ２ペプチドに関して、解析された。
【図４】ウェスタン・ブロットの写真であり、ＢＲＩ２の最初の１０２アミノ酸が、Ｃ９９の効率的な開裂を阻害するのに必要であること、ならびに、同一領域が、ＢＲＩ２の、ＡＰＰのＣ９９に対する結合に必要であることを確立している。左のパネルが、γ３０細胞からの総溶解物（ＴＬ）のウェスタン・ブロットを示し、γ３０細胞は安定にＡＰＰを発現し、empty vector（ｖｅｃ）、ｍｙｃのタグを付けた全長ＢＲＩ２1−266（ＢＲＩ２）、もしくは、種々のｍｙｃのタグを付けたＢＲＩ２Ｃ−末端欠損体を用いてトランスフェクションされた（当該構築体によりコードされたアミノ酸により指し示した）。右のパネルが、対応している溶解物の、抗ｍｙｃ免疫沈澱（ｍｙｃ ＩＰ）を示す。ＨＣが、この免疫沈降において使用されたｍｙｃ抗体の重鎖を指し示す。
【図５】ＡＰＰ−Ｇａｌ４駆動ルシフェラーゼ活性のグラフであり、ＢＲＩ２の最初の１０２アミノ酸が全て、ＡＩＤ産生を阻害するのに必要であることを確立している。ＨＥＫ２９３細胞が、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を用いて、empty vector、もしくは、ｍｙｃのタグを付けた全長ＢＲＩ２、もしくは、種々のＢＲＩ２Ｃ−末端欠損構築体と共にトランスフェクションされた（当該構築体によりカバーされたアミノ酸範囲により指し示した）。データが、該empty vectorを用いてトランスフェクションされた細胞において測定されたルシフェラーゼ活性の％として、表現されている。エラーバーが、３回の独立した実験に関する±ＳＤを表す。
【図６】ＢＲＩ２が、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ分泌を阻害することを確立しているウェスタン・ブロットの写真である。ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、empty vector（−）もしくはＦＬＡＧ−ＢＲＩ２（＋）を用いて、トランスフェクションされた。ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβが、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中において４時間条件を整えられたトランスフェクションされた細胞培養から、検出された。ＡＰＰおよびＢＲＩ２発現が、該トランスフェクションされた細胞の総溶解物のウェスタン・ブロットにより、確認された。ＡＰＰ発現が、有意に変化しない。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は一部、本発明者らの、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３がＡＰＰからのＡβ産生を阻害するとの発見に基づいている。ＡＰＰ細胞内部位（ドメイン）（ＡＩＤ）は、Ａβと付随して産生されるので、Ａβ産生を阻害すれば、ＡＩＤ産生をも阻害する。いかなる特定のメカニズムにも拘束されないが、このＡβ産生阻害は、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３による、β−セクレターゼによるＡＰＰおよびγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂阻害により、Ｃ９９産生およびＣ９９からのＡβ放出を阻害していると考えられる。実施例参照。
【００１７】
これゆえ、ある実施形態において、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する方法に関する。該方法は、該細胞をＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するのに有効な量で、接触させることを含む。
【００１８】
これらの実施形態において、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３は、脊椎動物の内在性膜蛋白であり、「内在性膜蛋白２Ｂ」および「内在性膜蛋白」としてもそれぞれ知られている。これらの蛋白のヒトの野生型の形態は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有し、ｃＤＮＡ配列が、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ＮＭ０２１９９９（ＢＲＩ２）、ならびに、ＮＭ０３０９２６、ＮＭ００１０１２５１６、およびＮＭ００１０１２５１４（３種の転写変異体のＢＲＩ３）として共に提供された。加えて、マカク（Ｍａｃａｑｕｅ）に関するＢＲＩ２アミノ酸配列およびマウスに関するＢＲＩ３アミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｑ６０ＨＣ１およびＮＰ０７１８６２として、それぞれ知られている。このならびに他の既知のＢＲＩ２およびＢＲＩ３情報を用いれば、当業者であれば、日常の方法を使用して、任意の脊椎動物に関しても、ＢＲＩ２およびＢＲＩ３配列を決定できる。任意の脊椎動物のＢＲＩ２およびＢＲＩ３蛋白も、少なくとも８０％ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ相同なアミノ酸配列を有すると期待されるであろう。
【００１９】
本発明者らは、遺伝子的にＢＲＩ２蛋白の部分を合成して、アミノ酸１〜１０２のみからなるＢＲＩ２蛋白が、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するに充分であることも決定した。実施例１および２参照。
【００２０】
本方法において使用されたＢＲＩ２またはＢＲＩ３は、ペプチド模倣体をも含み得る。本明細書に使用される場合、ペプチド模倣体とは、ある１種の蛋白における天然の親種のアミノ酸を模倣可能である化合物であり、当該ペプチド模倣体でのアミノ酸の置換が、当該蛋白の活性に有意に影響を及ぼさない。ペプチド模倣体を含んでいる蛋白は一般的に、プロテアーゼの良くない基質であり、その天然蛋白に比較されると、より長い期間の時間、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて活性であることが予想される。多くの非加水分解性ペプチド結合類似体が、このような結合を含有するペプチド合成の手順と共に、当業界において知られている。非加水分解性結合は、−ＣＨ2ＮＨ、−ＣＯＣＨ2、−ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ、−ＣＨ2ＣＨ（ＯＨ）、−ＣＨ2Ｏ、ＣＨ2Ｓを包含する。加えて、ペプチド模倣体含有ペプチドは、より低アレルゲン性たり得、全体的により高いバイオアベイラビリティーを示し得る。当業者であれば、ペプチド模倣体を含む蛋白の設計および合成が、過度の実験を必要としないと理解する。例えば、Ｒｉｐｋａら（１９９８年）；Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら（１９９７年）；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９年）参照。
【００２１】
これゆえ、これらの方法の好ましい実施形態において、細胞が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２と等価なアミノ酸配列、及び／又はペプチド模倣体を含むＢＲＩ２またはＢＲＩ３と接触させられることであって、ここで、該ＢＲＩ２蛋白及びＢＲＩ３蛋白は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。
【００２２】
他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、天然蛋白である。ある好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、ヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３に、８０％相同性を超えて類似している。それらの実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９０％相同的なアミノ酸配列を有し、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９５％相同的なアミノ酸配列、尚より好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に少なくとも９８％相同的なアミノ酸配列を有する。最も好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２それぞれの少なくとも一部分に１００％相同的である。
【００２３】
これらの方法においてＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、これらの蛋白のわずか最初の１０２アミノ酸からなり得るので、本明細書において使用される場合、「ＢＲＩ２」もしくは「ＢＲＩ３」は、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で規定されたような、完全長ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白よりも小さい蛋白を包含する。これゆえ、これら蛋白は、２５０、２００、１５０、もしくは１２５個のアミノ酸および／またはペプチド模倣体よりも少なくてよい。他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含む。
【００２４】
本明細書において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は更なる有用な部分、例えば、当該蛋白の持続放出もしくは抑制された分解を可能とする足場、つまりＰＥＧのような部分、または、ある特定の型の細胞に対する標的化を可能とする核酸配列のような部分をも更に含み得る。
【００２５】
これらの方法において、細胞は、ＢＲＩ２、ＢＲＩ３、またはＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体と接触され得る。本明細書において使用された場合、模倣体とは、天然物ペプチド（ここではＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３）の生物学的作用を模倣できる任意のペプチドもしくは非ペプチド化合物に言及し、しばしば、当該模倣体が、当該天然物ペプチドの基本構造を模倣する基本構造を有するか、および／または、当該天然物ペプチドの突出した生物学的特性を有するためである。模倣体は：天然物ペプチドとの類似性する側鎖のない等の原型からの実質的な修飾を持つペプチド（このような修飾は例えば、分解に対する感受性を減少させることがある）；抗イデオタイプおよび／または触媒抗体もしくはこれらのフラグメント；単離された蛋白の非蛋白部分（例えば、炭水化物の構造体）；あるいは、例えば、コンビナトリアルケミストリーを通じて同定された核酸および薬剤などの、合成もしくは天然有機分子を包含し得るが、これらに限定されない。このような模倣体が、当業界において既知の種々の方法を使用して、設計、選択、および／または、別の方法で同定され得る。薬剤設計（ドラッグデザイン）の種々の方法が、本発明において有用な模倣体もしくは他の治療化合物を設計（デザイン）するのに有用であり、Ｍａｕｌｉｋら、１９９７年において開示されており、本明細書においてその全体が援用されている。
【００２６】
これらの方法は、いずれの特定細胞を用いる使用にも限定されないが、当該細胞が、Ａβおよび／またはＡＩＤを産生できることを条件とする。これらの方法と共に利用され得る細胞の非限定例は、ニューロン（神経細胞）、ならびに、ＡＰＰを、天然に、もしくは、遺伝子操作を通して発現する本質的に任意の他の哺乳類細胞でもある（実施例参照）。当該細胞は、神経様、もしくは、神経へと分化することができるもの（例えば、幹細胞）でもよい。ある好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類中に存在する。好ましくは、該哺乳類は、アルツハイマー病の実験モデル、もしくは、ヒトである。他の好ましい実施形態において、本細胞は、生存哺乳類、好ましくは、ヒトのニューロンである。最も好ましい実施形態において、該ヒトがアルツハイマー病を有するか、または、アルツハイマー病を獲得してしまうリスクがある、例えばアルツハイマー病に対する遺伝素質を持つヒトである。
【００２７】
本細胞は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体と、任意の既知の方法によって接触され得る。実施例は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体を直接適用すること、または、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体を、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が、例えば、循環系を通って、もしくは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して、該細胞に辿り着くように、該細胞を停留させている哺乳類に投与する包含する。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が蛋白である場合（つまり、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白）、細胞は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の少なくとも１部分をコード化する核酸配列を含むウィルスベクターのようなベクターと接触され得、ここで、当該核酸によりコード化されたＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の翻訳が、この接触を有効化させる。特に、当該ベクターが本細胞に入っていくことができる場合、後者の方法が好ましい方法である（例えば、細胞のウィルス感染）。
【００２８】
ＢＲＩ２およびＢＲＩ３はフリンによりプロセシングされ、その産物がＣ９９プロセシング阻害を引き起こす。これゆえ、細胞におけるフリンの増加も、Ａβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する。
【００２９】
これゆえ、本発明は、細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防する更なる方法にも関する。該方法は、細胞をフリンと、細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、または予防するのに有効な量で接触させることを含む。
【００３０】
フリン、つまり塩基性アミノ酸対開裂酵素は、細胞膜貫通Ｉ型蛋白原蛋白変換酵素（Ｔｈｏｍａｓ、２００２）である。ヒト野生型プレプロフリン（preprofurin）は、アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３を有し、ｃＤＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＭ００２５６９として与えられている。その成熟蛋白は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３もしくはこれのアミノ酸１０８〜７９４を有する。加えて、マウスに関するフリンのアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ０３５１７６として知られている。脊椎動物のフリンについて、このおよび他の既知の情報を用いれば、当業者であれば、フリン配列を、任意の脊椎動物に関しても、通常の方法を使用して決定できる。任意の脊椎動物フリン蛋白も、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１０８〜７９４に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有すると予期される。好ましい実施形態において、フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み、最も好ましい実施形態において、フリンはヒトフリンである。
【００３１】
本明細書におけるフリンはまた、更なる有用な部分、例えば、当該蛋白の持続放出もしくは抑えられた分解を可能とする足場もしくはＰＥＧのような部分であるか、または、ある特定の型の細胞に対する標的化を可能とする核酸配列のような部分を含み得る。
【００３２】
これらの方法において、細胞が、天然フリンの活性を促進する化合物、例えばプロフリンをフリンに変換するペプチダーゼ、または、ＢＲＩ蛋白が存在している部位（サイト）へのフリン輸送を促進する化合物と接触され得る。しかしながら、好ましい実施形態において、例えば、フリンが（例えば、循環系を通じて、もしくは、ＢＢＢを通過して）該細胞に辿り着くように、細胞を停留させている哺乳類にフリン蛋白を投与することにより、細胞がフリン蛋白と接触する。より好ましい実施形態において、フリンが、フリン蛋白をコード化している核酸配列を含むベクターから発現される。好ましくは、これらのベクターは、細胞に感染し、そして、フリン蛋白をｉｎ ｓｉｔｕで産生するウィルスベクターである。
【００３３】
これらの方法は、いずれの特定細胞を用いる使用にも限定されないが、細胞が、Ａβおよび／またはＡＩＤを産生することができることを条件とする。これらの方法と共に利用され得る細胞の非限定例は、ニューロン、および、天然もしくは遺伝子操作を通してＡＰＰを発現する本質的に任意の他の哺乳類細胞でもある（実施例参照）。当該細胞は、神経様でもあり得、もしくは、ニューロンへと分化することもできる（例えば、幹細胞）。ある好ましい実施形態において、該細胞は、生存哺乳類内にある。好ましくは、該哺乳類は、アルツハイマー病実験モデル、もしくは、ヒトである。他の好ましい実施形態において、細胞は、生存哺乳類の、好ましくはヒトのニューロンである。最も好ましい実施形態において、ヒトがアルツハイマー病を有するか、または、アルツハイマー病を獲得してしまうリスクがある、例えば、アルツハイマー病に対する遺伝素因を有するヒトである。
【００３４】
他の実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を処置する方法に関する。該方法は、被験体に、アルツハイマー病を被験体において処置するのに有効量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む。
【００３５】
これらの方法において、被験体は好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＢＲＩ２蛋白配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヒトＢＲＩ３蛋白配列のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を投与される。これらの実施形態において、該ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を、それぞれ有する。他の好ましい実施形態において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、天然起源蛋白である。
【００３６】
これらの方法において、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくは模倣体が、直接被験体の脳に投与され得る。あるいは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を、哺乳類のＢＢＢを通過させるような様式で投与される。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体は、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が被験体のＢＢＢを通過できる能力を促進させる医薬組成物中においても製剤化され得る。
【００３７】
他に制限がなければ、医薬組成物は、本明細書において記載された任意の実施形態においても、過度の実験なしに、ヒトなどの哺乳類に対する投与用に、特定の適用に対し必要に応じて製剤化され得る。加えて、適正な用量のこれら組成物は、過度の実験なしに、標準的な用量−応答プロトコールを使用して、求められ得る。
【００３８】
従って、口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用に設計された組成物は、過度の実験なしに、当業界においてよく知られた手段により、例えば、不活性稀釈剤を用いてもしくは食用の担体を用いて、調製され得る。組成物は、ゼラチンカプセル中に入れられるか、もしくは、錠剤へと圧縮されてよい。経口治療投与目的に、本発明の医薬組成物が、賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁、シロップ、ウェハウス、チュウイングガム等の形態で使用されてよい。
【００３９】
錠剤、ピル、カプセル、トローチ等が、バインダー、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料をも含有してよい。バインダーの幾つかの例として、微結晶セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例は、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤の幾つかの例として、アルギン酸、コーンスターチ等を包含する。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。ある１つの例の潤滑剤は、コロイド状二酸化硅素である。甘味料の幾つかの例として、スクロース、サッカリン等を包含する。香料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料等を包含する。これらの種々の組成物を調製するのに使用される材料は、医薬として純粋(pure)であり、使用量において非毒性であるべきである。
【００４０】
本発明の組成物は容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜内、もしくは皮下注射によるように、非経口投与され得る。非経口投与は、本発明の組成物を溶液もしくは懸濁中に取り込ませることにより達成され得る。このような溶液もしくは懸濁は、注射用水、食塩水、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤をも包含してよい。非経口製剤は、例えばベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えばアスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート剤をも包含してよい。酢酸塩（アセテート）、クエン酸塩（シトレート）、もしくは燐酸塩（ホスフェート）のような緩衝剤、ならびに、塩化ナトリウム（食塩）もしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も、加えられてよい。本非経口調製品は、アンプル、使い捨てシリンジ、または、ガラスもしくはプラスチックでできた多数回用量バイアル中に入れられてよい。
【００４１】
直腸投与は、本医薬組成物を、直腸もしくは大腸中に投与することを包含する。これは、坐薬もしくは浣腸を使用して、達成され得る。坐薬製剤は容易に、当業界において既知の方法により、調製され得る。例えば、坐薬製剤が、グリセリンを約１２０℃に加熱し、本組成物を該グリセリンに溶解させ、この加熱したグリセリンを混合し、この後精製水が加えられてよく、この熱い混合物を坐薬の型中に注いで調製され得る。
【００４２】
経皮投与は、本組成物の、皮膚を通しての経皮吸収を包含する。経皮製剤は、パッチ（よく知られたニコチンパッチなど）、外用薬、クリーム、ゲル、軟膏等を包含する。
【００４３】
本発明は、本哺乳類に、治療有効量の本組成物を経鼻投与することを包含する。本明細書において使用された場合、「経鼻投与すること」もしくは「経鼻投与」は、本組成物を、患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に投与することを包含する。本明細書において使用された場合、組成物の経鼻投与用医薬組成物は、例えば、鼻スプレー、点鼻剤、懸濁、ゲル、外用剤、クリーム、もしくは粉末として投与されるべく、よく知られた方法により調製された治療有効量の本組成物を包含する。本組成物の投与は、鼻タンポンもしくは鼻スポンジを使用して行われてもよい。
【００４４】
更なる実施形態において、本発明は、アルツハイマー病を有する被験体を治療する他の方法に関する。これら方法は、被験体に、アルツハイマー病を被験体において治療するに有効な量のフリンを投与することを含む。これらの実施形態において、被験体は、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸１０８〜７９４の配列を有するヒトフリンに等価なアミノ酸及び／又はペプチド模倣体を含むフリン（該フリンは少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。）を投与することを含む。他の好ましい実施形態において、フリンは、天然起源蛋白であり、例えば、ヒトフリンである。
【００４５】
フリンは、これらの実施形態において、直接、被験体の脳に投与され得る。あるいは、フリンは、この化合物が、哺乳類のＢＢＢを通過できるような様式で投与され得る。フリンは、フリンの、被験体のＢＢＢを通過できる能力を高める医薬組成物中で製剤化され得る。
【００４６】
確立された模倣体を同定するための方法を使用して、当業者は、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害する化合物を同定することにより、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体を同定できる。こうして、本発明は、ある化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかどうか決定する方法にも関する。該方法は、該化合物を、機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含む膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物が、Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含む。これらの実施形態において、γ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、該化合物が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である。
【００４７】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、任意の既知の方法によって、例えば、実施例において記載された方法により決定され得る。このような方法は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体がＡβおよび／またはＡＩＤの減少を引き起こす所で、Ａβおよび／またはＡＩＤ放出を、例えばＡβおよび／またはＡＩＤ特異的抗体を使用して測定することを包含する。Ｃ９９阻害は、模倣体がＣ９９の増加を引き起こす所で、Ｃ９９の変化を測定することによっても求められ得る（実施例参照）。
【００４８】
実施例においても確立されたとおり、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３によるＣ９９開裂阻害は、Ｃ８３およびｓＡＰＰαの存在の減少を引き起こし、ｓＡＰＰβの存在の増加を引き起こす。こうして、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体が、Ｃ８３およびｓＡＰＰαの減少、ならびに、ｓＡＰＰβの増加を引き起こす。
【００４９】
上の決定は、任意の既知の方法によってなされ得る。好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ、質量分析、もしくはウェスタンブロットを包含する。当業界において知られているとおり、ウェスタンブロットが、ＥＬＩＳＡよりも明確な化合物の同定を可能とするが、より多くの時間を消費し厄介な手順である。
【００５０】
これらの方法は、評価されるべき任意の特定の化合物にも限定されない。例えば、ランダムな化合物のライブラリーが評価され得る。好ましくは、しかしながら、化合物が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の一部分を模倣して設計（デザイン）されている。このような化合物は、例えば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の一部分の３次元構造および／または電荷を模倣して設計され得る。あるいは、化合物がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３アミノ酸配列を模倣するように、化合物はペプチド模倣体を含み得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、Ｃ９９を含む膜結合蛋白は、アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）であり、例えば、ＡＰＰを発現する細胞において生じる。
【００５２】
これらの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、試験管中において）において実施され得る。好ましくは、しかしながら、機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含む膜結合蛋白は生存細胞中に存在する。このような生存細胞の非限定例は、実施例１のように、レポーター遺伝子（レポータージーン、例えば、ルシフェラーゼ）の転写を、γ−セクレターゼによる遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰ開裂時に活性化させる遺伝子構築体を含むものである。これらの実施形態において、該遺伝子導入ＡＰＰは、好ましくは、当該遺伝子導入ＡＰＰの細胞質部位（ドメイン）で更にＧａｌ４を含む（実施例参照）。
【００５３】
該方法が生存細胞を利用する場合、機能しているγ−セクレターゼおよびＡＰＰを発現する任意の細胞が使用され得る。そのような生存細胞の非限定例は、神経細胞、または、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、もしくはＮ２ａ細胞のような、遺伝子導入ＡＰＰを産生する細胞を包含する。実施例参照。
【００５４】
更なる実施形態において、本発明は、精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物に関する。好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するヒトＢＲＩ２蛋白、または、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、任意の数のアミノ酸および／またはペプチド模倣体をも含み得、その全長の蛋白から１０２個に至るまでのアミノ酸のアミノ酸および／またはペプチド模倣体、例えば、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体、あるいは、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体が挙げられる。
【００５５】
ある幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な前記賦形剤は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、被験体のＢＢＢを通過できる能力を高める。他の実施形態において、本組成物は、ユニットドーズの形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。
【００５６】
本発明は加えて、精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物に関する。好ましくは、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該フリンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。好ましくは、該フリンは天然起源蛋白である。
【００５７】
幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な前記賦形剤は、フリンの、本被験体のＢＢＢを通過できる能力を高める。他の実施形態において、本組成物が、単位（ユニット）用量の形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。
【００５８】
本発明は、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物にも関する。好ましくは、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有するヒトＢＲＩ２蛋白もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含み、ここで、ＢＲＩ２蛋白およびＢＲＩ３蛋白が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２にそれぞれ少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、医薬として許容可能な賦形剤は、該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる能力を増強させる。他の実施形態において、本組成物が、ユニットドーズ（単位用量）の形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。これらの実施形態は、如何なる特定のベクターにも限定されない。しかしながら、好ましい実施形態において、該ベクターはウィルスである。
【００５９】
本発明は、フリンをコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤において含む組成物にも関する。好ましくは、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態において、該フリンが、天然起源蛋白である。幾つかの実施形態において、医薬として許容可能な賦形剤が、該フリンの、被験体の血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる能力を増強させる。他の実施形態において、本組成物が、ユニットドーズ（単位用量）の形態で、アルツハイマー病治療用に製剤化される。好ましくは、該ベクターはウィルスである。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態が、以降の実施例で記載されている。本願請求項の範囲内の他の実施形態が、本明細書において開示されたとおりの本発明の特定もしくは実施の考慮から、当業者に明らかとされる。本明細書が、本実施例と共に、例示としてのみ考慮されるものと意図されており、本発明の範囲および精神が本願請求項により示されており、本実施例に続く。
【実施例】
【００６１】
実施例１．家族性痴呆ＢＲＩ２遺伝子によりコード化された蛋白が、ＡＰＰと結合し、Ａβ産生を阻害する
実施例のまとめ
アルツハイマー病（ＡＤ）は、最もよくある老人性痴呆であり、アミロイド斑、血管性アミロイド、神経原繊維のもつれ、および、進行性神経変性により特徴付けられている。アミロイドは主に、Ａβペプチドにより構成されており、これは、セクレターゼによるβ−アミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）プロセシングに由来する。そのＡＰＰの細胞内ドメイン（ＡＩＤ）は、Ａβと共に放出されるが、それがアポトーシスおよび転写を調節するため、シグナル伝達機能を有する。その生物学的および病理学的重要さにもかかわらず、ＡＰＰプロセシングを規制している機序（メカニズム）が、良く理解されていない。膜結合蛋白が、セクレターゼによるＮｏｔｃｈ開裂および転写活性細胞内フラグメントの放出を促進させる。ＡＰＰとＮｏｔｃｈシグナル伝達との間の顕著な類似度を考慮して、我々は、ＡＰＰプロセシングが同様に規制されていると仮定した。ここで、本発明者らは、ＢＲＩ２たるＩＩ型膜蛋白が、ＡＰＰと相互作用することを示す。おもしろいことに、ＡβのＮＨ2−末端部分に対応している１７アミノ酸が、この相互作用に必要である。更に、ＢＲＩ２発現が、ＡＰＰプロセシングを規制し、結果、ＡβおよびＡＩＤ濃度（レベル）が抑えられた。総じて、これらの知見が、ＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用を、Ａβ産生を阻害するＡＰＰプロセシングの規制機序（メカニズム）として特徴付ける。特記すべきは、ＢＲＩ２突然変異が、家族性英国痴呆症（ＦＢＤ）および家族性デンマーク痴呆症（ＦＤＤ）を引き起こし、これらは、臨床的および病理学的に、ＡＤに似ている。ＢＲＩ２病原突然変異が、ＡＰＰプロセシングに関するＢＲＩ２の規制機能を変更するとの知見が、ＡＰＰ開裂の異常規制を、ＡＤ、ＦＤＤ、およびＦＢＤに共通な病原機序（メカニズム）として明示する。
【００６２】
序論
他のγ−セクレターゼ基質の開裂が膜結合リガンドにより規制されているので、本発明者らは、ＡＰＰと結合し、そのプロセシングを規制する膜内在性蛋白の存在を仮定した。ここで、我々は、ＢＲＩ２（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｉｊｄｅｒら、１９９６）たるＩＩ型膜蛋白を記載し、本記載を実行する。
【００６３】
実験手順
γ３０細胞が、Ｋｉｍｂｅｒｌｙら（２００３年）に記載されたとおり、抗生物質および１０％牛胎児血清を用いて補充されたＤＭＥＭにおいて維持された。
【００６４】
スプリット−ユビキチンイースト２種ハイブリッドスクリーニング
該スプリット−ユビキチンのシステムが、膜内在性蛋白間の相互作用を分析する（Ｓｔａｇｌｊａｒら、１９９８）ための魅力的な代替法を提供する。該スプリット−ユビキチンのシステムおよびヒトの脳ライブラリーが、Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ（チューリッヒ、スイス）から購入された。該スクリーニングが、製造元のプロトコルに従い実施された。端的に言えば、ヒトＡＰＰ（アミノ酸１〜６９５）、ヒトＡＰＰ（アミノ酸１〜６６４；ＡＰＰＮｃａｓ）、もしくはヒトＡＰＬＰ２がそれぞれ、ｐＴＭＶ４、ｐＡＭＢＶ４、ｐＡＭＢＶ４バイト（bait)ベクター中にクローン化され、ユビキチンのＣ末端側の半分（Ｃｕｂ）に融合され、レポーターフラグメントが続くＡＰＰファミリーのバイト(bait)蛋白を得た（ＬｅｘＡ、ＶＰ１６に融合されたＤＮＡ結合蛋白、転写活性化）。ヒトの脳ライブラリーが、変異したユビキチン（ＮｕｂＧ）のＮ−末端側半分において融合された蛋白を発現する。各ライブラリーに関して、本発明者らは、およそ５×１０6種の形質転換体をスクリーニングした。ＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−Ｃｕｂと相互作用できる蛋白をコードしているクローンが、ＮｕｂＧ：Ｃｕｂ相互作用を促進させ、次いで、ユビキチン特異的プロテアーゼ（１種もしくは複数種）の動員、ＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−Ｃｕｂバイトの開裂、ＬｅｘＡ−ＶＰ１６転写因子の放出、および、これら２種のレポーター遺伝子（ＬａｃＺおよびＨＩＳ３）の転写活性化を伴う。ライブラリーのプラスミドが、ＨＩＳ３およびＬａｃＺ陽性イースト形質転換体から回収され、Ｎ−末端ＦＬＡＧタグを有するｐｃＤＮＡ３．１中にクローン化され、直接、下記されたとおり、免疫沈降により、ＡＰＰとの相互作用できる能力をテストした。両レポーター遺伝子の共通の活性化因子を求めてのスクリーニングが、結果、Ｆｅ６５（Ｚａｍｂｒａｎｏら、１９９７）のような、既知のＡＰＰ／ＡＰＬＰ２−結合蛋白の同定に至った。
【００６５】
プラスミド
全長ＢＲＩ２およびＢＲＩ２1―131が、２種のハイブリッドクローンから、ＰＣＲにより増幅され、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ（Ｍａｔｓｕｄａら、２００１）中にクローン化された。哺乳類発現ベクターＡＰＰたるＡＰＰＮｃａｓが記載されている（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）。ｍｙｃ−タグが、シグナル配列ＡｐｏＥＲ２後に挿入され、ｐＥＦ−ＢＯＳ中にクローン化された。ＢＡＣＥが、ｐｃＤＮＡ３ｍｙｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングされることにより、マウスの脳ｃＤＮＡからクローン化され、Ｃ−末側でｍｙｃのタグ化された。
【００６６】
抗体
以下の抗体が、使用されている：
αＦＬＡＧ（マウスモノクローナルＭ２、Ｓｉｇｍａ）；
αＡＰＰマウスモノクローナル２２Ｃ１１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ
ｌａｂｓ）およびｐ２−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；
αｍｙｃ（マウスモノクローナル９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ウサギポリクローナル抗体αＡＰＰｃｔ（ＺＭＤ．３１６、Ｚｙｍｅｄ）（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）；
ニワトリコントロール抗体（ＩｇＹ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ニワトリαＢＲＩ２（ＩｇＹ、ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）；
ウサギポリクローナルコントロール抗体（ＩｇＧ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
ＥＮ３（Ｐｉｃｋｆｏｒｄら、２００３）（ウサギポリクローナル抗体）；
ウサギαＢＲＩ２（Ｊｏｒｇｅ Ｇｈｉｓｏ博士からの好意）；
マウスポリクローナルが、ヒトＢＲＩ２の細胞質尾部を含むペプチドに対して生じた。抗ＡＰＬＰ１および抗ＡＰＬＰ２Ｃ−末端側ウサギポリクローナル抗体が、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入された。
【００６７】
細胞培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３、ＡＰＰ安定発現ＨＥＫ２９３（ＨＥＫ２９３ＡＰＰ）、ＨｅＬａ、Ｎ２ａ細胞が、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ2中に３７℃で維持された。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）もしくはＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ）がトランスフェクションに使用された。
【００６８】
免疫沈降法およびウェスタン・ブロット
他に記されない限り、全ての免疫沈降法の手順が、４℃において実施された。トランスフェクションされた細胞が、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ） Ａ［２０ｍＭのＨｅｐｅｓ／ＮａＯＨ ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］中において、３０分間溶解され、これら溶解物が、２０，０００ｇにおいて、１０分間清澄化された。ＦＬＡＧの免疫沈降法に関して、これら清澄化された溶解物が、２０μＬのＦＬＡＧ−Ｍ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と、２時間混合され、３回、Ｂｕｆｆｅｒ Ａを用いて洗浄された。該沈澱が、６０μＬの２×ＳＤＳサンプル緩衝液で煮沸され、ウェスタン・ブロットに付された。他の免疫沈降法に関して、清澄化された溶解物が、抗体と共に、１時間インキュベートされ、２０μＬの蛋白Ａ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）と混合され、洗浄され、上のとおり加工された。ヒトの脳（Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓ博士からの寛大な好意）が、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有しているＢｕｆｆｅｒ Ａ中で、Ｄｏｕｎｃｅ ホモジナイザーを使用して、均一化された。該蛋白が終夜、５ｍｇ／ｍＬにおける当該蛋白濃度で抽出された。抽出された蛋白が、２０，０００ｇにおいて、１時間清澄化された。その上清が、指示抗体と１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックされた蛋白Ａ／Ｇビーズとインキュベートされた。沈澱は、上記のとおり、洗浄され、加工された。
【００６９】
代謝標識
ｐｃＤＮＡ３もしくはＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、メチオニンおよびシステイン無しに、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清が補充ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、２時間インキュベートされた。細胞が次いで３０分、［35Ｓ］標識メチオニンおよびシステイン（ＩＣＮ）をこの培養培地に加えることにより標識された。該標識された細胞が念入りに洗浄され、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％牛胎児血清を用いて補われたＤＭＥＭ中において、指示された期間追跡された。この追跡後、細胞が溶解され、αＡＰＰｃｔと共に、上記したとおり、免疫沈降された。標識された細胞が培地から、２０，０００ｇ１０分間の遠心により清澄化され、次いで、指示抗体と共に、免疫沈降された。
【００７０】
ルシフェラーゼ・アッセイ
（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００３）に記載されるように、アッセイが実施されたが、ＡＰＰ−Ｇａｌ４融合（Ｇｉａｎｎｉら、２００３）がＧａｌ４源として使用されたことを除く。ルシフェラーゼ活性が、同時トランスフェクションされたβ−ガラクトシダーゼ活性により標準化され、このトランスフェクション効率をモニターした。
【００７１】
酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）
ＨＥＫ２９３ＡＰＰ細胞が、ｐｃＤＮＡ３もしくはＢＲＩ２でトランスフェクションされた。このトランスフェクションの２４時間後、該細胞が２４時間訓化され(conditioned)、前記培地中のＡβ４０およびＡβ４２が、ヒトＡβＥＬＩＳＡキット（ＫＭＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、その製造元のプロトコルに従いつつ、測定された。トランスフェクションされた細胞が溶解され、上記のとおり清澄化され、抽出された蛋白量が使用されて、ＥＬＩＳＡにより検出されたＡβ量を標準化した。
【００７２】
蛋白決定
蛋白濃度が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ蛋白アッセイにより（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＢＳＡを標準として求められた。
【００７３】
結果および議論
膜結合蛋白がＡＰＰプロセシングを規制するかどうかテストするために、本発明者らは、スプリットユビキチンシステムを使用して、膜蛋白間の相互作用を同定した。ＡＰＰファミリー蛋白と相互作用する蛋白に関するヒト脳ｃＤＮＡライブラリースクリーニングが、ＢＲＩ２（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｉｊｄｅｒら、１９９６）およびＢＲＩ３（Ｖｉｄａｌら、２００１）（示さず）、Ｂｒｉｃｈｏｓ部位（ドメイン）を含有するＩＩ型膜蛋白遺伝子ファミリーメンバーの同定に至った。ＢＲＩ蛋白の機能は知られていないが、ＢＲＩ２の突然変異が、ＦＢＤ（Ｖｉｄａｌら、１９９９）およびＦＤＤ（Ｖｉｄａｌら、２０００）を有する患者に見出されている。記すべきことに、ＦＢＤおよびＦＤＤにおける神経病理学的知見が、実質プレアミロイド沈着（ＦＢＤおよびＦＤＤ）および斑（ＦＢＤ）、神経原繊維のほつれ、コンゴレッド親和性アミロイド血管障害（ＣＡＡ）、および神経変性を包含し、ＡＤに似ている。これゆえ、ＢＲＩ２における突然変異が、ＡＤ様の家族性痴呆症を引き起こすので、本発明者ら更に、このＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用の生理学的関連を研究した。
【００７４】
このＢＲＩ２−ＡＰＰ相互作用を哺乳類細胞において評価するために、ＨｅＬａ細胞が、ＢＲＩ２およびＡＰＰ構築体と共に、同時トランスフェクションされた（図１ａ）。αＦＬＡＧ抗体との細胞溶解物の免疫沈降は、ＢＲＩ２が、全長ＡＰＰ（図１ｂおよびｄ）、Ｃ９９（図１ｂおよびｄ）、およびＡＰＰＮｃａｓと相互作用したことを示したが、このことは、Ｃ８３でなく（図１ｂおよびｄ）、ＡＰＰ（図１ｃ）の細胞内領域の殆どの欠損を表す。ＡＰＰが、ダブレットとして、描かれている。下方のＡＰＰのバンドが、非グリコシル化未成熟ＡＰＰを表し；上方の形が代わりに、グリコシル化成熟ＡＰＰから構成されている。記すべきことに、このグリコシル化成熟した形のＡＰＰおよびＡＰＰＮｃａｓだけが、ＢＲＩ２と相互作用した（図１ｂ、ｃ、およびｄ）。ＢＲＩ２過剰発現が劇的に、Ｃ９９量を増加させることも、記されるべきである（図１ｂおよび１ｄ）。この知見の意義が後で展開される。
【００７５】
ＢＲＩ２外側部位（ドメイン）の殆どの欠損が、ＡＰＰに対する結合を廃しなかった（ＢＲＩ２1―131、図１ｄ）。αＡＰＰ抗体を用いる逆免疫沈降が、ＡＰＰがＢＲＩ２を免疫沈降させることを明らかにした（図１ｅ）。加えて、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞において検出された蛋白溶解〜１７ｋＤａのＢＲＩ２のＮＨ2−末端フラグメント（ＢＲＩ２ｎｔ、ＢＲＩ２1-131にサイズが似ている）も、ＡＰＰと共に沈澱された（図１ｅ）。これらの相互作用の特異性が更に、ＢＲＩ２が、もう１種別のＩ型膜統合蛋白たるＡｐｏＥＲ２に結合しなかった（図１ｃ）との証拠により、裏付けられた。これらの知見が、ＡＰＰの細胞質内尾部およびＡＰＰの殆どおよびＢＲＩ２外部ドメインが、ＢＲＩ２／ＡＰＰ相互作用に可欠である一方、ＡＰＰの外部ドメインにおける１７アミノ酸の領域（その膜貫通領域に近く、そのＮＨ2−末端Ａβ配列を含有する）が、この結合に必須であることを証拠付ける。これらのデータが強く、ＢＲＩ２およびＡＰＰがｉｎ ｔｒａｎｓ（つまり、区別される膜上で発現された受容体／リガンドとして）において相互作用しないが、むしろ、分子複合体を細胞膜において形成することを示唆する。
【００７６】
ＡＰＰおよびＢＲＩ２が両方、成熟神経組織において発現されている。本発明者らはこれゆえ、ＡＰＰも、ＢＲＩ２と、成人ヒト脳において相互作用するかを決定しようとした。まず、本発明者らは、４種の抗ＢＲＩ２抗体をテストし、これらがヒトＢＲＩ２を免疫沈降できるかを決定した。これらのテストに関して、ＨｅＬａ細胞が、ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされ、これら４種のＢＲＩ２抗体およびコントロールと共に免疫沈降された。図２ａで示されたとおり、ＥＮ３抗ＢＲＩ２抗体だけが、ＢＲＩ２を沈澱させることができた。次に、本発明者らは、ヒトの脳のホモジェネートを調製し、αＡＰＰｃｔ抗体もしくはＥＮ３を用いた免疫沈降を実施した。図２ｂで示されたとおり、Ｃ９９（およびより大きいＣＯＯＨ−末端ＡＰＰフラグメント）が、抗ＡＰＰおよびＥＮ３両方と沈澱された一方、Ｃ９９は、ウサギポリクローナルＩｇＧと沈澱されなかった。おもしろいことに、この場合においても、Ｃ８３が、ＢＲＩ２と沈澱しなかったが、αＡＰＰｃｔにより沈澱した。更に、全長ＡＰＰも、低濃度（レベル）ではあるが、ＥＮ３により沈澱した。総じて、これらの実験が、内因性ＡＰＰおよびＢＲＩ２が、成人ヒト脳において関連することを指し示す。加えて、これらが、ＢＲＩ２が好ましくは、Ｃ８３とでなく、Ｃ９９およびより大きいＡＰＰのＣ−末端フラグメントと相互作用することを示す。
【００７７】
図１ｂおよび１ｄにおいて示されたとおり、ＢＲＩ２構築体の発現が、不変に、Ｃ９９の濃度（レベル）の上昇に至る。このＣ９９濃度（レベル）の劇的な上昇が、ＡＰＰプロセシングへのＢＲＩ２の効果に依存しているらしい。これに関して直接テストするために、本発明者は、ＦＬＡＧのタグをされたＢＲＩ２を、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、およびＮ２ａ細胞において、ＡＰＰ−Ｇａｌ４、Ｇａｌ４プロモーター制御下のルシフェラーゼレポーター、およびβ−ガラクトシダーゼ構築体と共に、発現させた。ＡＰＰ−Ｇａｌ４は、ＡＰＰ細胞質部位（ドメイン）に対する、イースト転写因子Ｇａｌ４の融合体である。ＡＰＰ−Ｇａｌ４のγ−開裂が、ＡＩＤ−Ｇａｌ４を、細胞膜から核に放出させ、引き続いてのルシフェラーゼ転写の活性化を伴う（Ｇｉａｎｎｉら、２００３）。図３ａで示されたとおり、ＢＲＩ２がルシフェラーゼ活性を３種全ての細胞株で抑え、これが、ＡＩＤ形成阻害を示唆している。代わりに、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）トランスフェクションが、結果、ＡＩＤ放出の増加に至ったが、予測されたとおりであった（図３ｂ）。ＢＲＩ２1―131変異体（なおＡＰＰと相互作用し、上昇したＣ９９濃度（レベル）を生じる（図１ｄ））は、ＡＩＤ放出も阻害する（図３ｃ）。最後に、混合実験は、ＢＲＩ２がＡＩＤ−Ｇａｌ４放出を抑制するには、ＡＰＰ−Ｇａｌ４と共に、同一細胞において、同時発現されなくてはならないことを示す。つまり、ＢＲＩ２を発現している細胞を、ＡＰＰ−Ｇａｌ４を発現している細胞と混合すると、ＡＩＤ放出に影響を及ぼさない（図３ｄ）。このことが更に、ＢＲＩ２およびＡＰＰが、ｉｎ ｔｒａｎｓよりもむしろｉｎ ｃｉｓにおいて相互作用することを示唆する。
【００７８】
この系（システム）を更に確認するために、本発明者らは、ＢＲＩ２を用いてトランスフェクションされたＨＥＫ２９３の条件を整えられた培地におけるＡβを測定しており、ＢＲＩ２が有意に、Ａβ４０およびＡβ４２濃度（レベル）を減少させた（図３ｂ）ことを見出している。さらに、ＢＡＣＥトランスフェクションが、Ａβ４０およびＡβ４２分泌を増加させた（図３ｆ）。
【００７９】
ＢＲＩ２によるＡＩＤおよびＡβ産生の阻害は、ＢＲＩ２発現が、γ−セクレターゼによるＡＰＰの開裂を抑えることを示唆する。しかしながら、ＢＲＩ２が、ＡＰＰのβ−およびα−開裂を調節することも、可能である。上で議論されたとおり、β−もしくはα−セクレターゼによるＡＰＰの開裂がそれぞれ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、上清中において放出する。ｓＡＰＰαもしくはｓＡＰＰβの量の増加が、α−もしくはβ−開裂の増加を指し示す一方、ｓＡＰＰαもしくはｓＡＰＰβの減少が、α−もしくはβ−開裂の減少に反映する。こうして、ＢＲＩ２がα−もしくはβ−セクレターゼに影響を及ぼすかどうか決定するために、本発明者らは、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ量を測定した。これらの同一の実験において、本発明者らは、Ｃ９９およびＣ８３の細胞内濃度（レベル）も測定した。ＨＥＫ２９３−ＡＰＰ細胞が、ＦＬＡＧ−ＢＲＩ２もしくはベクターコントロールを用いて、トランスフェクションされた。トランスフェクションされた細胞が、［35Ｓ］メチオニン−システインを用いて３０分間、パルス標識され、次いで、０、１、２、および４時間、３７℃において追跡された（図３ｃ）。細胞溶解物が、αＡＰＰ−ｃｔ抗体と共に、各時点において免疫沈降された（図３ｃ）。分泌されたＡＰＰ（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ）を測定するために、上清が、４時間標識され、抗ＡＰＰ抗体Ｐ２１（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ両方を沈澱させる）もしくは６Ｅ１０（ｓＡＰＰαだけを沈澱させる）と共に沈澱された細胞から回収された（図３ｄ）。ＢＲＩ２トランスフェクションが、結果、Ｃ８３（図３ｃ）およびｓＡＰＰα（図３ｄ）の量の減少に至った。逆に、Ｃ９９（図３ｃ）およびｓＡＰＰβ（図３ｄ）濃度（レベル）が、増加した。特記すべきことに、ＢＲＩ２が、αＡＰＰ−ｃｔ抗体により、全時点において、免疫共沈降された（co-immunoprecipitated）。こうして、ＢＲＩ２発現が、α−セクレターゼによるＡＰＰ開裂を抑える一方、β−セクレターゼによるそのプロセシングを上昇させる。γ−セクレターゼの同時阻害およびＡＰＰのβ−開裂の増加が、Ｃ９９濃度（レベル）の劇的な増加を説明する。
【００８０】
ＡＰＰは、ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２を包含する蛋白ファミリーのある一員である。ＡＰＬＰ１およびＡＰＬＰ２も、γ−セクレターゼの基質であり（Ｓｃｈｅｉｎｆｅｌｄら、２００２）、数多くのγ−セクレターゼの基質の中でも、ＡＰＰに対するより多くの配列の類似性を保有するものである。従って、ＢＲＩ２が、一般的にγ−セクレターゼに影響を及ぼすのか、特異的にＡＰＰのγ−開裂を阻害するのかテストするために、本発明者らは、ＢＲＩ２を、ＡＰＬＰ１もしくはＡＰＬＰ２を用いてトランスフェクションした。抗ＡＰＬＰ１もしくは抗ＡＰＬＰ２Ｃ末端抗体を使用してのウェスタン・ブロットは、ＢＲＩ２発現がＡＰＬＰ１（図示せず）およびＡＰＬＰ２（図３ｉ）のＣ末端フラグメントの蓄積を促進させないことを指し示す。この結果が、ＢＲＩ２が特異的に、他のγ−基質ではなく、ＡＰＰへのγ−活性をブロックするとの観念を裏付ける。
【００８１】
総じて、これらの研究は、ＢＲＩ２およびＡＰＰが多分子複合体を細胞膜において形成することを示唆する。このような複合体におけるＡＰＰおよびＢＲＩ２の化学量論量が、調査されなければならず、ＢＲＩ２およびＡＰＰが他の蛋白を含む構造において見出されるかどうか未知である一方、本発明者らのデータが、ＢＲＩ２がＡＰＰプロセシングの内因性制御因子（レギュレーター）として機能することを示唆する。より具体的に、本発明者らはここに、ＢＲＩ２発現がＡＰＰのα−およびγ−両方の開裂を減らすことを見出した。これらの機能に相応しい詳細な分子機序（分子レベルでのメカニズム）が直接述べられなければならないが、ＢＲＩ２が、α−およびγ−開裂部位を含んでいるＡＰＰの領域と相互作用するとの知見はＢＲＩ２が物理的に、これら２種の標的配列を、これらセクレターゼからマスクすることをほのめかす。
【００８２】
最近、ＢＲＩ２における突然変異が、ＦＢＤ（Ｖｉｄａｌら、１９９９）およびＦＤＤ（Ｖｉｄａｌら、２０００）患者において見出されている。野生型および突然変異体ＢＲＩ２両方が、フリンによりプロセシングされており（Ｋｉｍら、１９９９）、このプロセシングがＣ末端ペプチドの分泌に至る。フリンによる野生型ＢＲＩ２の開裂が、１７アミノ酸（ａａ）長のペプチドを放出させる。ＦＢＤ患者において、ＢＲＩ２の停止（ストップ）コドンでの点突然変異が、３’−非翻訳領域の解読、および、余分な１１アミノ酸をＣ末端において含有するＢＲＩ２分子の合成に至る。フリンによるこの突然変異したＢＲＩ２の開裂が、より長いペプチドたるＡＢｒｉペプチドを生成させ、これがアミロイド繊維として沈着される。デンマーク家族性において、正常停止コドンの１コドン前の１０−ｎｔ複製物の存在が通常より大きな蛋白前駆体（そのアミロイドサブユニットが最後の３４Ｃ末端アミノ酸を含む。）を発生させるＢＲＩ２配列でのフレームシフトを生じる。ＡＢｒｉおよびＡＤａｎアミロイドの沈着が、これらの痴呆の病原と考えられている。しかしながら、ＢＲＩ２が、ＡＰＰプロセシングを規制するとの知見が、魅惑的であり、変更されたＡＰＰプロセシングも、ＦＢＤおよびＦＤＤにおける病原要因であるとの思索を促進させる。この仮定と一致して、ＦＤＤ患者において、上昇した濃度（レベル）のＡβ４２沈着が、ＣＡＡ病巣において、ＡＤａｎと共に検出されている。
【００８３】
実施例２．ＡＰＰプロセシングへのＢＲＩ２の効果に関する更なる研究
実施例１で記載された方法を使用して、最初の、８０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１１７、および１３１アミノ酸からなるＢＲＩ２欠損構築体の効果が、測定された。図４（左パネル）で示されたとおり、９９アミノ酸よりも大きいトランケーションだけが、総溶解物におけるＣ９９の蓄積を示したが、このことが、Ｃ９９の更なるプロセシングの阻害を指し示す。最初の９６および９９アミノ酸からなる欠損構築体が、遙かにより乏しい阻害効果を示し、８０および９３（アミノ酸）からなるものが、該阻害を示さなかった。Ｃ９９プロセシングへのＢＲＩ２のこの阻害効果は、図４に示すとおり（右のパネル）、ＢＲＩ２トランケーションのＣ９９および全長ＡＰＰに対する結合に対応した。同一セットの欠損構築体が、ＡＩＤ産生へのそれらの効果を求めるのに使用された。ＡＰＰ−Ｇａｌ４駆動ルシフェラーゼ活性の結果（図５）が更に、最初の９９アミノ酸を越えるアミノ酸を含むＢＲＩ２構築体が、ＡＩＤ産生の効率的な阻害に必要とされているとの結論を裏付ける。
【００８４】
実施例１は、ｓＡＰＰαがＢＲＩ２存在下に抑えられていることを確立させ、ＢＲＩ２がα−セクレターゼを阻害することを指し示している。更なる実験が実施され、ｓＡＰＰβ産生へのＢＲＩ２の効果を究明した。図６で示されたとおり、ｓＡＰＰβ産生も、ＢＲＩ２存在下に抑えられており、ＢＲＩ２がβ−セクレターゼを阻害することを指し示している。
【００８５】
上に鑑みると、本発明の幾つかの利点が達成されており、他の利点が得られたことが分かる。
【００８６】
本発明範囲から逸脱することなく、上の方法および組成物において種々の変更がなされ得るので、上の記載において含有され、添付の図面において示された全事項が、例示として、限定している意味ではなく解釈されると意図されている。
【００８７】
本明細書において引用された全文献が、本明細書において援用される。本明細書における文献に関する議論が単に、それらの著者によりなされた主張を要約すると意図されており、いずれの文献も、先行技術を構成するとは、全く認められていない。出願人は、これら引用された文献の精確さおよび適切さに挑む権利を確保する。
【００８８】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−ヒトＢＲＩ２アミノ酸配列 GenBank Q9Y287
1 mvkvtfhsal aqkeakkdep ksgeealiip pdavavdckd pddwpvgqr rawcwcmcfg
61 lafmlagvil ggaylykyfa lqpddvyycg ikyikddvil nepsadapaa lyqtieenik
121 ifeeeevefi svpvpefads dpanivhdfh kkltayldln ldkcyvipln tsivmpprnl
181 lellinikag tylpqsylih ebmvitdrie nidhlgffiy rlchdketyk lqrretikgi
241 qkreasncfa irhfenkfav etlics
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２−ヒトＢＲＩ３アミノ酸配列 GenBank Q9NOX7.
1 mvkisfqpav agikgdkadk asasapapas ateilltpar eeqppqhrsk rggsvggvcy
61 lsmgmwlhn glvfasvyiy ryfflaqlar dnffrcgvly edslssqvrt qmeleedvki
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181 ellmnvkrgt ylpqtyiiqe emwtehvsd kealgsfiyh lcngkdtyrl rrratrrrin
241 krgakncnai rhfentfVve tlicgw
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−ヒトフリン前原蛋白 GenBank NP002560
1 melrpwllwv vaatgtlvll aadaqgqkvf tntwavripg gpavansvar khgflnlgqi
61 fgdyyhfwhr gvtkrslsph rprhsrlqre pqvqwleqqv akrrtkrdvy qeptdpkfpq
121 qwylsgvtqr dlnvkaawaq gytghgiws ilddgieknh pdlagnydpg asfdvndqdp
181 dpqprytqmn dnrhgtrcag evaavanngv cgvgvaynar iggvrmldge vtdavearsl
241 glnpnhihiy saswgpeddg ktvdgparla eeaffrgvsq grgglgsifv wasgnggreh
301 dscncdgytn siytlsissa tqfgnvpwys eacsstlatt yssgnqnekq ivttdlrqkc
361 teshtgtsas aplaagiial tleanknltw rdmqhlwqt skpahhiand watngvgrkv
421 shsygyglld agamvalaqn wttvapqrkc iidiltepkd igkrlevrkt vtaclgepnh
481 itrlehaqar ltlsynrrgd laihlvspmg trstllaarp hdysadgfhd wafmtthswd
541 edpsgewvle ientseanny gtltkftlvl ygtapeglpv ppessgcktl tssqacwce
601 egfslhqksc vqhcppgfap qvldthyste ndvetirasv capchascat cqgpaltdcl
661 scpshasldp veqtcsrqsq ssresppqqq pprlppevea gqrlragllp shlpewagl
721 scafivlvfv tvflvlqlrs gfsfrgvkvy tmdrglisyk glppeawqee cpsdseedeg
781 rgertafikd qsal
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防する方法であって、該細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防するのに有効な量で、該細胞を、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、ＢＲＩ２またはＢＲＩ３と接触し、ここでＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２と等価なアミノ酸及び／又はペプチド模倣体を含み、かつ、該ＢＲＩ２蛋白及び該ＢＲＩ３蛋白は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が天然起源蛋白である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項２の方法。
【請求項５】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に少なくとも９５％相同なアミノ酸配列を有する、請求項２の方法。
【請求項６】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有する、請求項２の方法。
【請求項７】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に１００％相同である、請求項２の方法。
【請求項８】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項９】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項１０】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項１１】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項１２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含む、請求項２の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、ＢＲＩ２と接触される、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ＢＲＩ３と接触される、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体と接触される、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記細胞が神経細胞である、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、神経様であるか、もしくは神経へ分化可能である、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、生存動物中に存在する、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、生存動物中の神経細胞である、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、生存ヒトに存在する、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の少なくとも一部分をコード化する核酸配列を含むベクターと接触される、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが、前記細胞に感染するウィルスベクターである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防する方法であって、該細胞を、該細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防するに有効な量でフリンと接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記フリンがヒトフリンである、請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記細胞がフリン蛋白と接触される、請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記フリン蛋白が、当該フリン蛋白をコード化する核酸配列を含むベクターにより発現される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記細胞が神経細胞である、請求項２３の方法。
【請求項３１】
前記細胞が神経様であるか、もしくは、神経へ分化することができる、請求項２３の方法。
【請求項３２】
前記細胞が生存動物に存在する、請求項２３の方法。
【請求項３３】
前記細胞が生存動物における神経細胞である、請求項２３の方法。
【請求項３４】
前記細胞が生存するヒトに存在する、請求項２３の方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に、該被験体のアルツハイマー病を治療するのに有効な量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
前記被験体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＢＲＩ２蛋白配列、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヒトＢＲＩ３蛋白配列のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を投与され、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が天然起源蛋白である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記被験体がＢＲＩ２を投与される、請求項３５の方法。
【請求項３９】
前記被験体がＢＲＩ３を投与される、請求項３５の方法。
【請求項４０】
前記被験体がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体を投与される、請求項３５の方法。
【請求項４１】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が直接、前記被験体の脳に投与される、請求項３５の方法。
【請求項４２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体の、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める医薬組成物で製剤化される、請求項３５の方法。
【請求項４３】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体は、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が前記哺乳類の血液脳関門を通過できるように投与される、請求項３５の方法。
【請求項４４】
アルツハイマー病を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に、該被験体のアルツハイマー病を治療するのに有効な量のフリンを投与することを含む、方法。
【請求項４５】
前記被験体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むフリンを投与され、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記フリンが天然起源蛋白である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
前記フリンが直接、前記被験体の脳に投与される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
前記フリンは、当該フリンの、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める医薬組成物で製剤化される、請求項４４の方法。
【請求項４９】
前記フリンは、該化合物が前記哺乳類の血液脳関門を通過できるように投与される、請求項４４の方法。
【請求項５０】
化合物がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかを決定する方法であって：該方法は、
該化合物を、機能しているγ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含む膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物がＡβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含み、ここで、該化合物が、もしγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である、方法。
【請求項５１】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がＡβおよび／またはＡＩＤの放出を阻害するかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５２】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がＣ９９の存在の増加を引き起こすかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５３】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がＣ８３の存在の減少を引き起こすかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５４】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がｓＡＰＰαの存在の減少を引き起こすかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５５】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がｓＡＰＰβ存在の増加を引き起こすかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５６】
前記方法が、ＥＬＩＳＡを利用してペプチドを定量する、請求項５０の方法。
【請求項５７】
前記方法が質量分析を利用する、請求項５０の方法。
【請求項５８】
前記方法が、ウェスタン・ブロットを利用して、ペプチドを同定および／または定量する、請求項５０の方法。
【請求項５９】
前記化合物が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の一部分を模倣するよう設計されている、請求項５０の方法。
【請求項６０】
前記化合物が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の前記部分の３次元構造および／または電荷を模倣する、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白が、ＢＲＩ２蛋白である、請求項５９の方法。
【請求項６２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白が、ＢＲＩ３蛋白である、請求項５９の方法。
【請求項６３】
Ｃ９９を含む前記膜結合蛋白がアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）である、請求項５０の方法。
【請求項６４】
前記の機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含む膜結合蛋白が、生存細胞に存在する、請求項５０の方法。
【請求項６５】
前記生存細胞が、γ−セクレターゼによる遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰ開裂時、レポーター遺伝子の転写を活性化させる遺伝子構築体を含む、請求項５０の方法。
【請求項６６】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項６５の方法。
【請求項６７】
前記遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰが更に、Ｇａｌ４を当該遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰの細胞質部位（ドメイン）で含む、請求項６５の方法。
【請求項６８】
前記生存哺乳類細胞が神経細胞である、請求項６４の方法。
【請求項６９】
前記生存哺乳類細胞が、遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰを産生する、請求項６４の方法。
【請求項７０】
前記生存哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、もしくはＮ２ａ細胞由来である、請求項６９の方法。
【請求項７１】
精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項７２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項７１の組成物。
【請求項７３】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がＢＲＩ２である、請求項７１の組成物。
【請求項７４】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がＢＲＩ３である、請求項７１の組成物。
【請求項７５】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７６】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７７】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７８】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７９】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項７１の組成物。
【請求項８０】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病治療のために製剤化される、請求項７１の組成物。
【請求項８１】
精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項８２】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項８１の組成物。
【請求項８３】
前記フリンが天然起源蛋白である、請求項８１の組成物。
【請求項８４】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記フリンの、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項８１の組成物。
【請求項８５】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病治療のために製剤化される、請求項８１の組成物。
【請求項８６】
ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項８７】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含み、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項８６の組成物。
【請求項８８】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項８６の組成物。
【請求項８９】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病を治療するために製剤化される、請求項８６の組成物。
【請求項９０】
前記ベクターがウィルスである、請求項８６の組成物。
【請求項９１】
フリンをコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項９２】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸を含み、ここで、該フリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項９１の組成物。
【請求項９３】
前記フリンが天然起源蛋白である、請求項９１の組成物。
【請求項９４】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記フリンの、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項９１の組成物。
【請求項９５】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病治療のために製剤化される、請求項９１の組成物。
【請求項１】
細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防する方法であって、該細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防するのに有効な量で、該細胞を、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が、ＢＲＩ２またはＢＲＩ３と接触し、ここでＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２と等価なアミノ酸及び／又はペプチド模倣体を含み、かつ、該ＢＲＩ２蛋白及び該ＢＲＩ３蛋白は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が天然起源蛋白である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に少なくとも９０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項２の方法。
【請求項５】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に少なくとも９５％相同なアミノ酸配列を有する、請求項２の方法。
【請求項６】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を有する、請求項２の方法。
【請求項７】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の少なくとも一部分に１００％相同である、請求項２の方法。
【請求項８】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項９】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項１０】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項１１】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項２の方法。
【請求項１２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含む、請求項２の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、ＢＲＩ２と接触される、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、ＢＲＩ３と接触される、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体と接触される、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記細胞が神経細胞である、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、神経様であるか、もしくは神経へ分化可能である、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、生存動物中に存在する、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、生存動物中の神経細胞である、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、生存ヒトに存在する、請求項１の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の少なくとも一部分をコード化する核酸配列を含むベクターと接触される、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記ベクターが、前記細胞に感染するウィルスベクターである、請求項２１の方法。
【請求項２３】
細胞によるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防する方法であって、該細胞を、該細胞におけるＡβおよび／またはＡＩＤ産生を、抑制、阻害、もしくは予防するに有効な量でフリンと接触させることを含む、方法。
【請求項２４】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記フリンがヒトフリンである、請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記細胞がフリン蛋白と接触される、請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記フリン蛋白が、当該フリン蛋白をコード化する核酸配列を含むベクターにより発現される、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記細胞が神経細胞である、請求項２３の方法。
【請求項３１】
前記細胞が神経様であるか、もしくは、神経へ分化することができる、請求項２３の方法。
【請求項３２】
前記細胞が生存動物に存在する、請求項２３の方法。
【請求項３３】
前記細胞が生存動物における神経細胞である、請求項２３の方法。
【請求項３４】
前記細胞が生存するヒトに存在する、請求項２３の方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に、該被験体のアルツハイマー病を治療するのに有効な量のＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体を投与することを含む、方法。
【請求項３６】
前記被験体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヒトＢＲＩ２蛋白配列、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のヒトＢＲＩ３蛋白配列のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を投与され、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が天然起源蛋白である、請求項３６の方法。
【請求項３８】
前記被験体がＢＲＩ２を投与される、請求項３５の方法。
【請求項３９】
前記被験体がＢＲＩ３を投与される、請求項３５の方法。
【請求項４０】
前記被験体がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３模倣体を投与される、請求項３５の方法。
【請求項４１】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が直接、前記被験体の脳に投与される、請求項３５の方法。
【請求項４２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体の、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める医薬組成物で製剤化される、請求項３５の方法。
【請求項４３】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体は、当該ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３もしくはこれらの模倣体が前記哺乳類の血液脳関門を通過できるように投与される、請求項３５の方法。
【請求項４４】
アルツハイマー病を有する被験体を治療する方法であって、該被験体に、該被験体のアルツハイマー病を治療するのに有効な量のフリンを投与することを含む、方法。
【請求項４５】
前記被験体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含むフリンを投与され、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記フリンが天然起源蛋白である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
前記フリンが直接、前記被験体の脳に投与される、請求項４４の方法。
【請求項４８】
前記フリンは、当該フリンの、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める医薬組成物で製剤化される、請求項４４の方法。
【請求項４９】
前記フリンは、該化合物が前記哺乳類の血液脳関門を通過できるように投与される、請求項４４の方法。
【請求項５０】
化合物がＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体であるかを決定する方法であって：該方法は、
該化合物を、機能しているγ−セクレターゼ、および、Ｃ９９を含む膜結合蛋白と組み合わせ、次いで、該化合物がＡβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂を阻害するかどうか決定することを含み、ここで、該化合物が、もしγ−セクレターゼによるＣ９９の開裂を阻害すれば、ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の模倣体である、方法。
【請求項５１】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がＡβおよび／またはＡＩＤの放出を阻害するかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５２】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がＣ９９の存在の増加を引き起こすかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５３】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がＣ８３の存在の減少を引き起こすかどうか決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５４】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がｓＡＰＰαの存在の減少を引き起こすかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５５】
Ａβおよび／またはＡＩＤを放出するＣ９９の開裂の阻害が、前記化合物がｓＡＰＰβ存在の増加を引き起こすかを決定することにより決定される、請求項５０の方法。
【請求項５６】
前記方法が、ＥＬＩＳＡを利用してペプチドを定量する、請求項５０の方法。
【請求項５７】
前記方法が質量分析を利用する、請求項５０の方法。
【請求項５８】
前記方法が、ウェスタン・ブロットを利用して、ペプチドを同定および／または定量する、請求項５０の方法。
【請求項５９】
前記化合物が、配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２をそれぞれ有するヒトＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白のアミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含むＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の一部分を模倣するよう設計されている、請求項５０の方法。
【請求項６０】
前記化合物が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白の前記部分の３次元構造および／または電荷を模倣する、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白が、ＢＲＩ２蛋白である、請求項５９の方法。
【請求項６２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３蛋白が、ＢＲＩ３蛋白である、請求項５９の方法。
【請求項６３】
Ｃ９９を含む前記膜結合蛋白がアミロイド前駆体蛋白（ＡＰＰ）である、請求項５０の方法。
【請求項６４】
前記の機能しているγ−セクレターゼおよびＣ９９を含む膜結合蛋白が、生存細胞に存在する、請求項５０の方法。
【請求項６５】
前記生存細胞が、γ−セクレターゼによる遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰ開裂時、レポーター遺伝子の転写を活性化させる遺伝子構築体を含む、請求項５０の方法。
【請求項６６】
前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項６５の方法。
【請求項６７】
前記遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰが更に、Ｇａｌ４を当該遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰの細胞質部位（ドメイン）で含む、請求項６５の方法。
【請求項６８】
前記生存哺乳類細胞が神経細胞である、請求項６４の方法。
【請求項６９】
前記生存哺乳類細胞が、遺伝子導入（トランスジェニック）ＡＰＰを産生する、請求項６４の方法。
【請求項７０】
前記生存哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、もしくはＮ２ａ細胞由来である、請求項６９の方法。
【請求項７１】
精製ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３を、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項７２】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項７１の組成物。
【請求項７３】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がＢＲＩ２である、請求項７１の組成物。
【請求項７４】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３がＢＲＩ３である、請求項７１の組成物。
【請求項７５】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、２５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７６】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、２００よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７７】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、１５０よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７８】
前記ＢＩＲ２もしくはＢＲＩ３が、１２５よりも少ないアミノ酸および／またはペプチド模倣体からなる、請求項７１の組成物。
【請求項７９】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項７１の組成物。
【請求項８０】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病治療のために製剤化される、請求項７１の組成物。
【請求項８１】
精製フリンを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項８２】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸および／またはペプチド模倣体を含み、ここで、該フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項８１の組成物。
【請求項８３】
前記フリンが天然起源蛋白である、請求項８１の組成物。
【請求項８４】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記フリンの、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項８１の組成物。
【請求項８５】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病治療のために製剤化される、請求項８１の組成物。
【請求項８６】
ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３をコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項８７】
前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の配列を有するヒトＢＲＩ２蛋白、もしくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列を有するヒトＢＲＩ３蛋白の、アミノ酸１〜１０２に等価なアミノ酸を含み、ここで、該ＢＲＩ２蛋白および該ＢＲＩ３蛋白がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を有する、請求項８６の組成物。
【請求項８８】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記ＢＲＩ２もしくはＢＲＩ３の、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項８６の組成物。
【請求項８９】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病を治療するために製剤化される、請求項８６の組成物。
【請求項９０】
前記ベクターがウィルスである、請求項８６の組成物。
【請求項９１】
フリンをコード化するベクターを、医薬として許容可能な賦形剤中に含む組成物。
【請求項９２】
前記フリンが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列１０８〜７９４を有するヒトフリンに等価なアミノ酸を含み、ここで、該フリンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を持つ、請求項９１の組成物。
【請求項９３】
前記フリンが天然起源蛋白である、請求項９１の組成物。
【請求項９４】
医薬として許容可能な前記賦形剤が、前記フリンの、前記被験体の血液脳関門を通過できる能力を高める、請求項９１の組成物。
【請求項９５】
前記組成物が、ユニットドーズの形態でアルツハイマー病治療のために製剤化される、請求項９１の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−８２７２１（Ｐ２０１３−８２７２１Ａ）
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２７３０３０（Ｐ２０１２−２７３０３０）
【出願日】平成２４年１２月１４日（２０１２．１２．１４）
【分割の表示】特願２００８−５１７０５４（Ｐ２００８−５１７０５４）の分割
【原出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【出願人】（５９１０５４１７４）イェシバ・ユニバーシティ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＹＥＳＨＩＶＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２７３０３０（Ｐ２０１２−２７３０３０）
【出願日】平成２４年１２月１４日（２０１２．１２．１４）
【分割の表示】特願２００８−５１７０５４（Ｐ２００８−５１７０５４）の分割
【原出願日】平成１８年６月１４日（２００６．６．１４）
【出願人】（５９１０５４１７４）イェシバ・ユニバーシティ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＹＥＳＨＩＶＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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