Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓマーカーに基づくリウマチ性心疾患についての診断法および治療法
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；ＧＡＳ）と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を有する患者の同定、およびＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者の同定の分野に属する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを予防および処置するための方法および組成物も提供する。一局面において、患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法が提供され、この方法は、ａ）患者に由来する生物学的試料を少なくとも１つのＧＡＳ抗原と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップなどを包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；ＧＡＳ）感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を有する患者の同定、およびＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者の同定の分野に属する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを予防および処置するための方法および組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト病原体であるＡ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＧＡＳ）は、通常の咽頭炎の主要な原因であると広く認識されている。この細菌による感染症は、さらに重度の侵襲性疾患、ならびに非化膿性自己免疫性続発症を結果としてもたらしうる。急性リウマチ熱（ＡＲＦ）は、未処置のＧＡＳ感染後に、０．１〜３％の個体において発症する、多病巣性自己免疫疾患である。
【０００３】
ＡＲＦは、１９４４年に初めて公表されたＪｏｎｅｓ基準の改定版により診断されている。最新のＪｏｎｅｓ基準によれば、ＧＡＳ感染の証拠と共に、２つの主要基準（移動性多発性関節炎、心臓炎、皮下結節、有縁性紅斑、シデナム舞踏病）、または１つの主要基準に加えた２つの副次基準（発熱、関節痛、赤血球沈降速度（ｅｒｙｔｈｏｃｙｔｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）またはＣ反応性タンパク質値の上昇、白血球増多症、心臓ブロックの特徴を示すＥＣＧ所見）が存在すれば、ＡＲＦの診断がなされうる。
【０００４】
ＡＲＦの臨床的に重要な主要な続発症は、リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）である。ＲＨＤは、重篤な心病変をもたらす場合があり、死亡または心弁置換に至る、心筋炎または弁膜炎を伴う。発展途上国全体において、ＲＨＤは、依然として、＜５０歳の個体における後天的心疾患の主要な原因である。先進諸国では、ＧＡＳ感染症を処置するための抗生剤が入手可能であるために、ＡＲＦおよびＲＨＤはそれほど一般的ではない。しかし、１９８０年代の半ば、米国の複数の地域でＡＲＦおよびＲＨＤの再流行が報告され、ユタ州、ソルトレークシティー周辺の山間地域で遷延した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在のところ、ＡＲＦの診断後に患者がＲＨＤを発症しているかどうかを確認するには、ＥＣＧ検査および心エコー図などの検査が用いられている。現在のところ、ＧＡＳ感染の結果として、ＲＨＤを有するか、またはＲＨＤを発症するリスクがある個体を同定するために実施可能なアッセイは存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＧＡＳ感染の結果として、ＲＨＤを有するか、またはＲＨＤを発症するリスクがある個体を同定する方法に関する。本発明はまた、このような方法において用いうるタンパク質アレイにも関する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを予防および処置するための方法および組成物も提供する。
【０００７】
診断法
本発明は、患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）患者に由来する生物学的試料を少なくとも１つのＧＡＳ抗原と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該患者に由来する該生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性を、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性と比較するステップであって、ここで、
健常個体に由来する該対照の生物学的試料と比較して、該患者に由来する該生物学的試料における反応性が低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示すステップを含む、方法を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する方法、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）患者に由来する生物学的試料を、
配列番号１（ＧＡＳ５）
配列番号２（ＧＡＳ５Ｆ）
配列番号３（ＧＡＳ２５）
配列番号４（ＧＡＳ４０）
配列番号５（ＧＡＳ５７）
配列番号６（ＧＡＳ９７）
配列番号７（ＧＡＳ３８０）および
配列番号８（ＳｐｅＡ）
のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原
またはその機能的同等物と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、該患者に由来する該生物学的試料中の任意の抗体の反応性を評価するステップと、
ｃ）ステップｂ）における反応性を、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の反応性と比較するステップであって、ここで、
該患者に由来する該生物学的試料における反応性が、健常な個体に由来する該対照の生物学的試料における反応性と比較して低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示すステップを含む、方法を提供する。
【０００９】
「リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）」という用語は、僧帽弁および／または大動脈弁に対する損傷、心筋炎、ならびに心膜炎を含め、急性リウマチ熱の後に続いて心臓が罹患する状態を対象とする。
【００１０】
ＲＨＤに罹患している患者に由来する血清試料、および健常個体に由来する血清試料を解析したところ、ＲＨＤに罹患している患者に由来する血清が示す、ある種のＧＡＳ抗原との反応性が、健常患者に由来する血清が示す反応性と比較して著明に低いという驚くべき知見がもたらされた。これらの知見は、ＧＡＳ抗原との反応性を用いて、健常個体に由来する血清と、ＲＨＤを患う患者に由来する血清とを識別しうるという第１の証拠をもたらす。具体的には、ＲＨＤ患者に由来する血清が示す、以下の表１で同定されている８つのＧＡＳ抗原との反応性は低いことが判明している。
【００１１】
【表１】
したがって、患者試料における、これら８つのＧＡＳ抗原に対する反応性が、健常個体に由来する対照試料における反応性と比較して低いことの検出を用いて、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを診断することもでき、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが増大した患者を同定することもできる。逆に、患者試料におけるこれら８つのＧＡＳ抗原に対する抗体反応性が、健常個体に由来する対照試料において示される反応性と同様であることの検出は、その患者がＲＨＤを患っておらず、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが小さいことを示す。
【００１２】
本発明の方法は、患者に由来する生物学的試料を、上記で列挙したＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つすべて、またはその機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１３】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの２つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１および２；配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号１および５；配列番号２および３；配列番号２および４；配列番号２および５；配列番号３および４；配列番号３および５；配列番号４および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。該方法はまた、該試料を、配列番号１および６；配列番号１および７；配列番号１および８；配列番号２および６；配列番号２および７；配列番号２および８；配列番号３および６；配列番号３および７；配列番号３および８；配列番号４および６；配列番号４および７；配列番号４および８；配列番号５および６；配列番号５および７；配列番号５および８；配列番号６および７；配列番号６および８、または配列番号７および８、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップも含みうる。
【００１４】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの３つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの３つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。例えば、該方法は、該試料を、配列番号１、２、および３；配列番号１、３、および４；配列番号１、４、および５；配列番号２、３、および４；配列番号２、４、および５；配列番号３、４、および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１５】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの４つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの４つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。例えば、該方法は、該試料を、配列番号１、２、３および４；配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１６】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの５つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの５つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。例えば、該方法は、該試料を、配列番号１、２、３、４、および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１７】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの６つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの６つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。
【００１８】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの７つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、２、３、４、５、６および７；配列番号１、３、４、５、６、７および８；配列番号１、２、４、５、６，７および８；配列番号１、２、３、５、６、７および８；配列番号１、２、３、４、６，７および８；配列番号１、２、３、４、５、７および８；配列番号１、２、３、４、５，６および８；またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１９】
代替的に、患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原の８つすべて、すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８、またはこれらの機能的同等物と接触させることもできる。
【００２０】
患者に由来する生物学的試料において、これらのＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つすべて、またはこれらの機能的同等物に結合した抗体の反応性を、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の、これらのＧＡＳ抗原に結合する抗体の反応性と比較する。健常個体に由来する対照の生物学的試料を、患者の生物学的試料と同じＧＡＳ抗原の組合せと接触させる。一般に、これらのＧＡＳ抗原の組合せに結合した抗体の平均の反応性は、健常個体に由来する対照の生物学的試料において既に決定されている。当技術分野では、抗体の反応性を評価するのに適する方法が公知であるが、以下ではこれらについてより詳細に記載する。
【００２１】
抗体の検出：
上記で説明した本発明の方法はすべて、抗体の反応性の評価、すなわち、ＧＡＳ抗原に結合した抗体の検出、およびこれらの抗体の力価の検出を含む。抗原に結合した抗体を検出する方法、および抗体力価を決定する方法は当業者に周知であり、任意のこのような方法を用いることができる。
【００２２】
例えば、１つ以上のＧＡＳ抗原（または機能的同等物）を、以下に記載するアレイの表面など、表面上における既知の位置に固定化させることができる。固定化させた抗原は、該固定化された抗原と共に、該抗原に対する、該試料中に存在する任意の抗体の結合を可能とする条件下で、インキュベートすることができる。適切なインキュベーション期間は、約１時間でありうる。洗浄して結合しなかったいかなる抗体も除去した後で、該抗原に結合した抗体の検出は、該抗原に結合し、それを認識する実体を用いて達成することができる。
【００２３】
例えば、上記で説明した方法のうちのいずれにおいても、ＧＡＳ抗原に結合した任意の抗体の反応性を評価するステップは、生物学的試料およびＧＡＳ抗原を、標識した抗ＩｇＧ抗体などの、標識した二次抗体と、該固定化されたＧＡＳ抗原に結合した、該生物学的試料中の任意の抗体に対する、該二次抗体の結合に適する条件下で、接触させるステップを含みうる。
【００２４】
抗ＩｇＧ抗体などの二次抗体は蛍光標識または酵素標識で標識することができ、それにより、該二次抗体の結合が、そしてかように、生物学的試料中のＧＡＳ抗原に対する抗体の存在が、該標識を検出することにより検出される。標識が蛍光標識である場合は、蛍光強度の比較を用いて、相対的な抗体反応性を評価し、これにより、対照の生物学的試料より低い抗体反応性を示す、特定の患者試料が存在するかどうかを決定することができる。バックグラウンドの蛍光強度は、約５，０００であることを予測することができる。標準偏差を考慮に入れると、少なくとも１５，０００の蛍光強度が、ＧＡＳ抗原に結合した抗体が試料中に存在することを示しうる。少なくとも３０，０００の蛍光強度は高い反応性を示すものとみなされ、そのことは、試料中でＧＡＳ抗原に結合した抗体が高力価であることを示す。したがって、本発明の一部の態様では、１５，０００〜３０，０００の間の蛍光強度が、ＲＨＤと関連する可能性がある、低い反応性を示しうる。
【００２５】
上記で説明した方法は、以下により詳細に記載されるアレイなど、タンパク質アレイ上で実施することもでき、標準的なＥＬＩＳＡまたはドットブロット技法を用いて実施することもできる。
【００２６】
生物学的試料：
本発明の方法において調べうる生物学的試料は、ＧＡＳ抗原に対する抗体を含有することが公知である任意の試料でありうる。適切な試料の例は、唾液試料、血液試料、または血清試料である。特に、試料は、血清試料でありうる。
【００２７】
患者由来の生物学的試料は、ヒト患者に由来する。ヒト患者は、成人の場合もあり、約１２〜約１８歳の青年の場合もあり、１２歳未満の小児の場合もある。患者は、移動性多発性関節炎、心臓炎、皮下結節、有縁性紅斑、シデナム舞踏病、発熱、関節痛、赤血球沈降速度またはＣ反応性タンパク質の上昇、白血球増多症、または心臓ブロックの特徴を示すＥＣＧ所見を含めた、急性リウマチ性疾患の臨床症状を示しうる。患者は、進行中のＧＡＳ感染の証拠を示しうる。場合によって、患者は、進行中のＧＡＳ感染および急性リウマチ性疾患について無症候でありうる。
【００２８】
対照の生物学的試料は、患者に由来する生物学的試料と同等の地理的位置出身の健常個体に由来しうる。
【００２９】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。本発明の方法は、患者から生物学的試料を得るステップをさらに含みうる。
【００３０】
タンパク質アレイ：
複数のＧＡＳ抗原に対する同時的な生物学的試料のスクリーニングを容易にするためには、本発明の方法において用いられるＧＡＳ抗原を、１つ以上のタンパク質アレイ上に提示することができる。例えば、各ＧＡＳ抗原を個別のアレイ上に提示することもでき、単一のアレイにより、複数のＧＡＳ抗原を同時に提示することもできる。本発明のさらなる態様によれば、タンパク質アレイが提供される。これらのアレイは、上記で説明した方法のうちのいずれにおいて用いるのにも適する。
【００３１】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含むタンパク質アレイを提供する。
【００３２】
タンパク質アレイは、これらのＧＡＳ抗原のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つすべて、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３３】
アレイが、ＧＡＳ抗原のうちの２つを含む場合、該アレイは、配列番号１および２；配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号１および５；配列番号２および３；配列番号２および４；配列番号２および５；配列番号３および４；配列番号３および５；配列番号４および５のアミノ酸配列を含む抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。代替的に、アレイは、配列番号１および６；配列番号１および７；配列番号１および８；配列番号２および６；配列番号２および７；配列番号２および８；配列番号３および６；配列番号３および７；配列番号３および８；配列番号４および６；配列番号４および７；配列番号４および８；配列番号５および６；配列番号５および７；配列番号５および８；配列番号６および７；配列番号６および８、または配列番号７および８のアミノ酸配列を含む抗原、またはこれらの機能的同等物も含みうる。
【００３４】
アレイが、３つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの３つによる任意の組合せを含みうる。例えば、アレイは、配列番号１、２、および３；配列番号１、３、および４；配列番号１、４、および５；配列番号２、３、および４；配列番号２、４、および５；配列番号３、４、および５のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３５】
アレイが、４つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの４つによる任意の組合せを含みうる。例えば、アレイは、配列番号１、２、３および４；配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３６】
アレイが、５つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの５つによる任意の組合せを含みうる。例えば、アレイは、配列番号１、２、３、４、および５のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３７】
アレイが、６つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの６つによる任意の組合せを含みうる。
【００３８】
アレイが、７つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６および７；配列番号１、３、４、５、６，７および８；配列番号１、２、４、５、６、７および８；配列番号１、２、３、５、６、７および８；配列番号１、２、３、４、６、７および８；配列番号１、２、３、４、５、７および８；配列番号１、２、３、４、５、６および８のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３９】
代替的に、アレイは、ＧＡＳ抗原の８つすべて、すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００４０】
タンパク質アレイは、さらなるＧＡＳ抗原を含みうる。
【００４１】
本発明の方法では、当技術分野において公知の任意の種類のタンパク質アレイを用いることができる。タンパク質アレイの作製については、Ｃｒｅｔｉｃｈ，Ｍ．、Ｄａｍｉｎ Ｆ．ら（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２３， ７７〜８８ （２００６））およびＺｈｕ，Ｈ ＆ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７：５５〜６３（２００３））において記載されている。
【００４２】
例えば、タンパク質アレイは、それに１つ以上の抗原が固定されるスライドガラスでありうる。その最も単純な形態において、アレイは、顕微鏡用のスライドガラスを、アミノシラン（Ａｎｓｏｒｇｅ、Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ）によりコーティングし、抗原を含有する溶液を該スライドに添加し、乾燥させるだけで調製される、１つの抗原だけを提示するスライドガラスでありうる。抗原によりコーティングするための、アミノシランによりコーティングされたスライドは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社およびＰｉｅｒｃｅ社から購入することができる。
【００４３】
代替的に、アレイは、複数の抗原を提示しうる。例えば、ニトロセルロースでコーティングしたスライドに、複数のＧＡＳ抗原をナノリットルずつスポットすることができる。このようなアレイは、各ＧＡＳ抗原を多連（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）で提示しうる。このようなアレイ内における抗原スポットは、直径が約１５０μｍであり、約０．３５ｎｇのタンパク質を含有しうる。
【００４４】
他の種類のタンパク質アレイは、３Ｄゲルパッドおよびマイクロウェルアレイを包含する。当業者には明らかである通り、いまだ構想されてはいないが、将来的に考案される種類のタンパク質アレイは、多分、本発明に従って用いるのに適することが分かるであろう。
【００４５】
本発明は、本発明によるタンパク質アレイと、ＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を有するか、またはＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を発症するリスクがある患者の診断に該アレイを用いるための指示書を含むキットをさらに提供する。
【００４６】
ＲＨＤを処置および予防するための方法および組成物
現在のところ、ＡＲＦを有すると診断されたすべての患者には、診断後少なくとも５年間にわたり、その後におけるＧＡＳ感染のリスクおよびＲＨＤの発症を低減するために、抗生剤による予防法（一般には、ペニシリン）が推奨されている。どの患者にＲＨＤのリスクがあり、どの患者にはＲＨＤのリスクがないかを同定することにより、ＡＲＦを有すると診断された患者の医学的処置の調整が可能となる。
【００４７】
本発明は、患者が、本発明の方法により、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを患っているか、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが増大していると同定される場合、該患者を抗生剤で処置できるようにする。逆に、患者が、本発明の方法によりＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが小さいと同定される場合、抗生剤処置は不要でありうる。
【００４８】
本発明者らによる、健常個体に由来する血清が、上記で論じた、ＧＡＳ抗原との高い反応性を示すことの認識は、これらのＧＡＳ抗原に対する抗体が、ＲＨＤの発症を予防するのに防御的な役割を果たしうることを示唆する。したがって、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含む組成物を提供する。本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む組成物も提供する。これらの組成物は、免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物でありうる。
【００４９】
さらなる態様によれば、本発明が、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防する方法であって、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防を必要とする患者に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明は、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防に用いられる、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物をさらに提供する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するための医薬品の製造における、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物の使用も提供する。代替的に、これらのＧＡＳ抗原をコードする核酸分子も用いることができる。
【００５０】
本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防する方法であって、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防を必要とする患者に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を投与するステップを含む方法も提供する。本発明は、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するのに用いるための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体をさらに提供する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するための医薬品の製造における、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体の使用も提供する。
【００５１】
本発明の抗体は、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ以上のアフィニティーでＧＡＳ抗原に特異的に結合することが典型的である。「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子も、ポリペプチドに結合することが可能なそれらの断片も包含する。これらには、ハイブリッド（キメラ）抗体分子［１、２］；Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片およびＦｖ分子；非共有結合によるヘテロ二量体［３、４］；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［５］；二量体抗体断片構築物および三量体抗体断片構築物；ミニボディー［６、７］；ヒト化抗体分子［８〜１０］；ならびにこのような分子から得られる任意の機能的断片のほか、ファージディスプレイなど、従来にない工程により得られる抗体が含まれる。一部の実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。当技術分野では、モノクローナル抗体を得る方法が周知である。一部の実施形態では、抗体がヒト化抗体または完全ヒト抗体である。
【００５２】
本発明の処置組成物および処置法は、上記で論じたＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてを用いる場合もあり、これらのＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてに特異的に結合する抗体を用いる場合もある。ＧＡＳ抗原の組合せ、およびこれらの抗原に特異的に結合する抗体を用いることができる。
【００５３】
本発明のこれらの態様による処置組成物および処置法において用いうるＧＡＳ抗原の組合せの例には、配列番号１および２；配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号１および５；配列番号２および３；配列番号２および４；配列番号２および５；配列番号３および４；配列番号３および５；配列番号４および５；配列番号１および６；配列番号１および７；配列番号１および８；配列番号２および６；配列番号２および７；配列番号２および８；配列番号３および６；配列番号３および７；配列番号３および８；配列番号４および６；配列番号４および７；配列番号４および８；配列番号５および６；配列番号５および７；配列番号５および８；配列番号６および７；配列番号６および８、または配列番号７および８；配列番号１、２および３；配列番号１、３および４；配列番号１、４および５；配列番号２、３および４；配列番号２、４および５；配列番号３、４および５；配列番号１、２、３および４；配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５；配列番号１、２、３、４および５；配列番号１、２、３、４、５、６、および７；配列番号１、３、４、５、６、７および８；配列番号１、２、４、５、６、７および８；配列番号１、２、３、５、６、７および８；配列番号１、２、３、４、６、７および８；配列番号１、２、３、４、５、７および８；配列番号１、２、３、４、５、６および８；またはこれらの機能的同等物が含まれる。これらのＧＡＳ抗原の組合せに結合する抗体もまた用いることができる。
【００５４】
上記で論じた組成物および方法は、ＧＡＳ感染一般を処置および予防するのに有用であり得るほか、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置および予防するのにも有用でありうる。
【００５５】
ＲＨＤを処置および予防するための組成物の処方
上記で詳述した通り、本発明の組成物は、ワクチンとしても有用でありうる。本発明によるワクチンは、予防的な（すなわち、感染を予防するため）場合もあり、治療的な（すなわち、感染を処置するため）場合もあるが、予防的な場合が典型的である。
【００５６】
したがって、組成物は、薬学的に許容されうる。組成物は通常、抗原に加えた成分を包含する、例えば、組成物は、１つ以上の薬学的なキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）を包含することが典型的である。
【００５７】
組成物は一般に、水性形態でヒトに投与される。しかし、投与前に、組成物を非水性形態とすることもできる。例えば、あるワクチンは、水性形態で製造され、次いでまた、水性形態で充填および分配および投与もなされるが、他のワクチンは、製造の過程で凍結乾燥され、使用の時点で水性形態へと復元される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤など、乾燥製剤でありうる。
【００５８】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの防腐剤を包含しうる。しかし、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（すなわち、水銀物質が５μｇ／ｍｌ未満である）、例えば、チオメルサールを含まないものとすることが好ましい。水銀を含有しないワクチンがより典型的である。防腐剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００５９】
熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を包含しうる。このような薬剤のさらなる詳細については、以下に示す。
【００６０】
張度を制御するためには、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれることが典型的である。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が一般的に使用され、これは、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ）で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００６１】
組成物は、一般的には、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、より頻繁には、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を持つであろう。さらに典型的には、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にあるであろう。
【００６２】
組成物には、１種類以上の種類のバッファーが含まれ得る。典型的なバッファーとしては、リン酸塩バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ホウ酸塩バッファー、コハク酸塩バッファー、ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含むもの）、またはクエン酸塩バッファーが挙げられる。バッファーは、典型的には、５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【００６３】
組成物のｐＨは、一般的には、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間であろう。
【００６４】
組成物は、典型的には滅菌されている。組成物は典型的には非発熱性でもある。例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な基準）が含まれ、例えば、１用量あたり＜０．１ＥＵが含まれる。組成物にはしばしばグルテンが含まれない。
【００６５】
組成物には、１回の免疫化のための材料が含まれる場合があり、また、複数回の免疫化のための材料が含まれる場合もある（すなわち、「複数用量の」キット）。複数用量の構成においては、保存剤が含められることが典型的である。複数用量の組成物に保存剤を含めることの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、物質を取り出すための無菌のアダプターを持つ容器の中に入れられる場合もある。
【００６６】
ヒト用のワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投薬体積で投与されるが、その半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が子供に投与される場合もある。
【００６７】
本発明の組成物にはまた、１種類以上の種類の免疫調節因子が含まれる場合もある。免疫調節因子の１つ以上に、しばしば１つ以上のアジュバントが含まれる。アジュバントには、以下でさらに議論されるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれ得る。
【００６８】
本発明の組成物において使用することができるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．無機物を含む組成物
本発明においてアジュバントとしての使用に適している無機物を含む組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）が挙げられる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献１１の中で開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、これらの塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、無定形など）をとる。これらの塩への吸着が頻繁に使用される。無機物を含む組成物はまた、金属塩の粒子として処方される場合がある［１２］。
【００６９】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これらの名称は便宜上であるが、便宜のためだけに使用される。なぜなら、これは、存在する実際の化合物の正確な記載ではないからである（例えば、参考文献１３の第９章を参照のこと）。本発明では、アジュバントとして一般的に使用されている、「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントの任意のものを使用することができる。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常は、少なくとも一部が結晶である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合には、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含まれる。これらは沈殿によって得ることができ、沈殿の間の反応条件と濃度が、塩の中のホスフェートでのヒドロキシルの置換の程度に影響を及ぼす。
【００７０】
繊維状の形態（例えば、透過型電子顕微鏡写真で見られるようなもの）が、水酸化アルミニウムアジュバントについての典型である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には、約１１であり、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００７１】
リン酸アルミニウムアジュバントは、一般的には、０．３〜１．２の間、例えば、０．８〜１．２の間、典型的には、０．９５±０．１のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。リン酸アルミニウムは、特に、ヒドロキシリン酸塩については、一般的には無定形であろう。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる無定形のヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的には粒子状であろう（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られる平板様の形態）。いずれかの抗原吸着後の粒子についての典型的な直径は、０．５μｍ〜２０μｍの範囲（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり、０．７ｍｇ〜１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００７２】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ）は、ホスフェートでのヒドロキシルの置換の程度と逆の関係にあり、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件と反応物の濃度に応じて変わり得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のホスフェートイオンの濃度を変えることによって（より多くのホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはバッファー（例えば、ヒスチジンバッファー）を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）も変化させられる。本発明にしたがって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的には、４．０〜７．０の間、例えば、５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有するであろう。
【００７３】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液には、バッファー（例えば、リン酸塩バッファー、またはヒスチジンバッファー、またはＴｒｉｓバッファー）が含まれ得るが、これは、必ずしもそうである必要はない。懸濁液は、しばしば滅菌されており、発熱物質が含まれない。懸濁液には、遊離の水性のホスフェートイオンが含まれる場合があり、例えば、１．０ｍＭ〜２０ｍＭの間、例えば、５ｍＭ〜１５ｍＭの間、例えば、約１０ｍＭの濃度で存在する。懸濁液にはまた、塩化ナトリウムも含まれる場合がある。
【００７４】
本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多く存在し得、例えば、少なくとも２：１の重量比、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などで存在し得る。
【００７５】
哺乳動物に投与される組成物中でのＡｌ＋＋＋の濃度は、典型的には、１０ｍｇ／ｍｌ未満であり、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【００７６】
特に、Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの糖抗原を包含する組成物では、リン酸アルミニウムが特に好ましく、典型的なアジュバントは、Ａｌ３＋を０．６ｍｇ／ｍｌで包含し、ＰＯ４／Ａｌのモル比が０．８４〜０．９２である、アモルファスのアルミニウムヒドロキシホスフェートである。低用量のリン酸アルミニウム、例えば、投与１回当たり１コンジュゲート当たり５０〜１００μｇのＡｌ３＋による吸着を用いることができる。組成物中に１つより多いコンジュゲートが存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。
【００７７】
Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとしての使用に適している油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９［参考文献１３の第１０章；参考文献１４もまた参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用して１ミクロン未満の粒子になるように処方された、５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０、および０．５％のＳｐａｎ ８５）が挙げられる。完全なフロイトのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全なフロイトのアジュバント（ＩＦＡ）もまた使用される場合がある。
【００７８】
様々な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、これらには、典型的には、少なくとも１種類の油、および少なくとも１種類の界面活性剤が含まれ、この油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝可能）であり、かつ生体適合性である。エマルジョンの中の油滴は、一般的には、５μｍ未満の直径であり、理想的には１ミクロン未満の直径であり、これらの小さい大きさは、安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーを用いて得ることができる。２２０ｎｍ未満の大きさの液滴が好ましい。なぜなら、これらは、濾過滅菌を行うことができるからである。
【００７９】
エマルジョンには、油、例えば、動物（例えば、魚）を供給源とするものまたは植物を供給源とするものが含まれ得る。植物油についての供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦などのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６個〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油の中には自然界においては存在しないが、堅果油および種子油由来の適切な出発材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳汁由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、鹸化、および他の手段についての手順は当該分野で周知である。ほとんどの魚には、容易に回収することができる代謝可能な油が含まれている。例えば、タラの肝油、サメの肝油、およびクジラの油（例えば、鯨ろう）が、本明細書中で使用することができる魚の油のいくつかの例である。多数の分枝鎖の油が、５個の炭素のイソプレン単位で生化学的に合成され、これは、一般的には、テルペノイドと呼ばれる。サメの肝油には、スクアレンとして知られている、分枝不飽和テルペノイドである、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン（これは、本明細書中では特に好ましい）が含まれる。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）もまた好ましい油である。スクアレンとスクアランを含む魚の油は、商業的な供給業者から容易に入手することができ、また、当該分野で公知の方法によって得ることもできる。他の好ましい油はトコフェロールである（下記を参照のこと）。油の混合物を使用することができる。
【００８０】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、例えば、少なくとも１５、例えば、少なくとも１６のＨＬＢを持つ。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない界面活性剤とともに使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎｓと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキサイド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰り返し回数が様々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびに、ソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般的に知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンを含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００８１】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））との組み合わせもまた適している。別の有用な組み合わせには、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステル、および／またはオクトキシノールが含まれる。
【００８２】
界面活性剤（重量％）の好ましい量は以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）０．０１％〜１％、特に、約０．１％；オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１％〜０．１％、特に、０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％〜２０％、例えば、０．１％〜１０％、および特に、０．１％〜１％、または約０．５％。
【００８３】
好ましいエマルジョンアジュバントは、＜１μｍの平均の液滴の大きさを持ち、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはそれ未満である。これらの液滴の大きさは、マイクロフルイダイゼーションのような技術によって簡単に得ることができる。
【００８４】
本発明に有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５の１ミクロン未満のエマルジョン。このエマルジョンの組成は、体積で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比率は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、参考文献１８の第１０章および参考文献１９の第１２章にさらに詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として知られている［１５〜１７］。ＭＦ５９エマルジョンには、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファーが含まれることが有利である。
【００８５】
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）のエマルジョン。エマルジョンには、リン酸緩衝化生理食塩水が含まれ得る。これにはまた、Ｓｐａｎ ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含まれ得る。これらのエマルジョンは、２％〜１０％のスクアレン、２％〜１０％のトコフェロール、および０．３％〜３％のＴｗｅｅｎ ８０が含まれ得、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は、典型的には、≦１である。なぜなら、これによってより安定なエマルジョンが提供されるからである。スクアレンとＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の体積比または約１１：５の重量比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ ８０を溶解させて、２％の溶液とし、その後、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、その後、この混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られるエマルジョンは、１ミクロン未満の油滴を有し得、例えば、１００ｎｍ〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有し得る。エマルジョンはまた、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ−ＭＰＬ）も包含しうる。この種の別の有用なエマルジョンは、ヒトへの投与１回当たり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含みうる［２０］。
【００８６】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）もまた含まれ得る。このエマルジョンには、リン酸塩バッファーが含まれる場合がある。
【００８７】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンには、これらの３種類の成分が、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）が含まれ得、そしてこれらの濃度には、抗原に由来するこれらの成分の任意の寄与が含まれるはずである。このエマルジョンにはまた、スクアレンも含まれる場合がある。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬも含まれ得る（下記を参照のこと）。水相には、リン酸塩バッファーが含まれ得る。
【００８８】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）の中に処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてはスレオニル−ＭＤＰとともに使用されている［２１］（０．０５％〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。これはまた、「ＡＦ」アジュバントと同様に、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用することもできる［２２］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【００８９】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、一般的に熱可逆性であり、そして／または、２００ｎｍ未満の大きさを持つ油滴を少なくとも９０％（体積で）含む［２３］。このエマルジョンにはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖、例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；および／またはアルキルポリグリコシドの１つ以上が含まれ得る。このエマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［２４］。そのようなエマルジョンは凍結乾燥させられ得る。
【００９０】
・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［２５］。アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチン中でのこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ））、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【００９１】
・０．５％〜５０％の油、０．１％〜１０％のリン脂質、および０．０５％〜５％の非イオン性界面活性剤を含むエマルジョン。参考文献２６に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。１ミクロン未満の液滴の大きさが有利である。
【００９２】
・代謝不可能な油（例えば、軽鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１種類の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ
８０）の１ミクロン未満の水中油型エマルジョン。添加物，例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−脂質親和性結合体（例えば、参考文献２７に記載されている、グルクロン酸のカルボキシル基を介するデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって得られるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが含まれ得る。
【００９３】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がへリックスミセルとして会合しているエマルジョン［２８］。
【００９４】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２９］。
【００９５】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２９］。
【００９６】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは、送達時に、即座に抗原と混合することができ、したがって、アジュバントと抗原は、使用時の最終的な処方の準備として、パッケージされたワクチンまたは分配されたワクチンの中に別々に保たれ得る。他の実施形態では、エマルジョンは、製造の際に抗原と混合され、したがって、組成物は、液体のアジュバント添加された形態でパッケージされる。抗原は、一般的には、ワクチンが２種類の液体を混合することによって最終的に調製されるように、水性の形態であろう。混合される２種類の液体の体積比は様々であり得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般的には、約１：１である。成分の濃度が特定のエマルジョンについての上記の記載の中にある場合には、これらの濃度は、典型的には、未希釈の組成物についての濃度であり、したがって、抗原溶液との混合後の濃度は下がるであろう。
【００９７】
組成物にトコフェロールが含まれる場合は、α、β、γ、δ、ε、またはζのいずれのトコフェロールも使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、様々な塩および／または異性体）をとることができる。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールのいずれを使用することもできる。トコフェロールは、高齢のヒト（例えば、６０歳以上）に使用されるワクチンに含められることが有利である。なぜなら、ビタミンＥが、この患者のグループにおいて免疫応答に対してポジティブな影響を有することが報告されているからである［３０］。これらはまた、エマルジョンの安定化を助けることができる、抗酸化特性も持つ［３１］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協働することが明らかにされている。
【００９８】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１３の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、多種多様な植物種の樹皮、葉、茎、根、およびさらには花でも見られる、ステロールグリコシドとトリテルペノイドグリコシドの不均質なグループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルヴェール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））由来のサポニンはまた、商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、ならびに、脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。
【００９９】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含む、これらの技術を使用した特異的な精製された画分が同定されている。一部の場合において、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献３２に開示されている。サポニン処方物にはまた、コレステロールのようなステロールも含まれ得る［３３］。
【０１００】
サポニンとコレステロールの組み合わせを、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特有の粒子を形成させるために使用することができる［参考文献１３の第２３章］。ＩＳＣＯＭにはまた、典型的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）も含まれる。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭの中で使用することができる。一部の実施形態において、ＩＳＣＯＭには、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上が含まれる。ＩＳＣＯＭについては、参考文献３３〜３５の中でさらに記載されている。状況に応じて、ＩＳＣＯＭＳには、追加の界面活性剤は含まれない場合がある［３６］。
【０１０１】
サポニン系のアジュバントの開発についての概要は、参考文献３７および３８の中で見ることができる。
【０１０２】
Ｄ．ヴィロソームおよびウイルス様粒子
ヴィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においては、アジュバントとして使用することができる。これらの構造には、一般的には、状況に応じてリン脂質と組み合わされたか、またはリン脂質と一緒に処方された、ウイルスに由来する１種類以上の種類のタンパク質が含まれる。これらは、一般的には、非病原性、非複製性であり、一般的には、天然のウイルスゲノムは全く含まれない。ウイルスタンパク質は、組み換えによって生産することができ、また、完全なウイルスから単離することもできる。ヴィロソームまたはＶＬＰにおける使用に適しているこれらのウイルスタンパク質としては、以下に由来するタンパク質が挙げられる：インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、外被タンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）。ＶＬＰは、参考文献３９〜４４の中でさらに議論されている。ヴィロソームは、例えば、参考文献４５の中でさらに議論されている。
【０１０３】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰ−リボシル化毒素、ならびにそれらの無毒化誘導体が挙げられる。
【０１０４】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）の、４、５、または６のアシル化された鎖を有するものの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」の形態は、参考文献４６に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小さい粒子」は、０．２２μｍの膜を通して濾過滅菌するためには十分に小さい［４６］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）が挙げられる［４７、４８］。
【０１０５】
リピドＡ誘導体には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献４９および５０に記載されている。
【０１０６】
本発明においてアジュバントとしての使用に適している免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンに結合させられたホスフェートによって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡ、およびパリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１０７】
ＣｐＧ’には、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチドの修飾／アナログが含まれ得、そしてこれは、二本鎖であってもまた一本鎖であってもよい。参考文献５１、５２、および５３には、可能なアナログでの置換、例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献５４〜５９の中でさらに議論されている。
【０１０８】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）に特異的であり得る［６０］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫応答を誘導することについて特異的である場合があり、また、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのように、Ｂ細胞応答を誘導することについてより特異的である場合もある。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮとＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献６１〜６３で議論されている。一部の実施形態において、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【０１０９】
他の実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために利用しやすいように構築される。状況に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、「イムノマー」を形成させるために、それらの３’末端に結合させることができる。例えば、参考文献６０、および６４〜６６を参照のこと。
【０１１０】
有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、これは、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。別のものはＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列を使用する代わりに、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することができ［６７］、そしてこれらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ピリミジンが多く含まれる場合がある。例えば、これには、２つ以上の連続するチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献６７に開示されているように、ＴＴＴＴ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。例えば、これには、２つ以上の連続するシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献６７に開示されているように、ＣＣＣＣ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。これらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激オリゴヌクレオチドには、典型的には、少なくとも２０個のヌクレオチドが含まれるであろう。これらには、１００個未満のヌクレオチドが含まれ得る。
【０１１１】
免疫刺激オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として知られている［６８］。したがって、本発明とともに使用されるアジュバントには、以下の混合物が含まれ得る：（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、ジヌクレオチドを形成させるためにイノシンに連結させられたシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの間）、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（単数または複数）を含むオリゴペプチド（例えば、５アミノ酸〜２０アミノ酸の間）のようなポリカチオン性ポリマー。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号４２７）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号４２６）を含むペプチドであり得る。オリゴヌクレオチドおよびポリマーは、例えば、参考文献６９および７０で開示されている複合体を形成しうる。
【０１１２】
細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体を、本発明においてアジュバントとして使用することができる。一部の実施形態において、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性腸毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。無毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献７１に記載されており、そして非経口アジュバントとしての使用は参考文献７２に記載されている。毒素または類毒素は、典型的にはホロ毒素の形態であり、これには、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方が含まれる。一部の実施形態において、Ａサブユニットには、無毒化変異が含まれ、しばしばＢサブユニットは変異していない。一部の実施形態において、アジュバントは、無毒化されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、参考文献７３〜８０の中で見ることができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［８１］。アミノ酸の置換についての数字での言及は、典型的には、その全体が引用により具体的に本明細書中に組み入れられる、参考文献８２に示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１１３】
Ｆ．ヒトの免疫調節因子
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているヒトの免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［８３］など）［８４］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節因子はＩＬ−１２である。
【０１１４】
Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［８５］、または粘膜接着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライド、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る［８６］。
【０１１５】
Ｈ．マイクロ粒子
マイクロ粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生体分解性であり、かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とともに形成させられるマイクロ粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、一部の実施形態において、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、例えば直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、状況に応じて、負に荷電した表面を持つように（例えば、ＳＤＳで）処理されるか、または正に荷電した表面を持つように（例えば、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理される。
【０１１６】
Ｉ．リポソーム（参考文献１３の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適しているリポソーム処方物の例は、参考文献８７〜８９に記載されている。
【０１１７】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルの処方物
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［９０］。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせられたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［９１］、ならびに少なくとも一種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせられたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［９２］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１１８】
Ｋ．ホスファゼン
例えば、参考文献９３および９４に記載されているホスファゼン｛例えば、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）｝を使用することができる。
【０１１９】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１２０】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［９５、９６］、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［９７］、およびそれらのアナログ、ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。免疫刺激性のイミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献９８〜１０２の中で見ることができる。
【０１２１】
Ｎ．置換された尿素
アジュバントとして有用な置換された尿素としては、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ
８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ ８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、「ＥＲ ８０３０２２」、または「ＥＲ ８０４０５７」のような、参考文献１０３において定義されているような、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、あるいはそれらの塩が挙げられ：
【０１２２】
【化１】
例えば、以下である：
【０１２３】
【化２】
Ｏ．さらなるアジュバント
本発明とともに使用することができるさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられる：
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９［１０４、１０５］。
【０１２４】
・参考文献１０６の中で開示されているもののような、チオセミカルバゾン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１０６の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１２５】
・参考文献１０７に開示されているもののような、トリプタントリン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１０７の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１２６】
・以下のようなヌクレオシドアナログ：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１２７】
【化３】
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１０８〜１１１に開示されている化合物ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１１１］。
【０１２８】
・以下を含む、参考文献１１２に開示されている化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１１３、１１４］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１１５］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンザゾール化合物［１１６］。
【０１２９】
・ホスフェートを含む非環式骨格に対して連結させられた脂質を含む化合物（例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４）［１１７、１１８］：
・ポリオキシドニウムポリマー［１１９、１２０］または他のＮ−酸化ポリエチレンピペラジン誘導体。
【０１３０】
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１２１］。
【０１３１】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１２２］あるいはその薬学的に許容される塩または誘導体、例えば、以下の式を持つもの：
【０１３２】
【化４】
式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖である、非置換または置換の、飽和したまたは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群より選択される。例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなど。
【０１３３】
・ＣＤ１ｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１２３〜１３０］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
【０１３４】
・γイヌリン［１３１］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
【０１３５】
【化５】
アジュバントの組み合わせ
本発明にはまた、上記で同定されたアジュバントの１つ以上の組み合わせが含まれる場合もある。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１３２］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１３３］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（状況に応じて＋ステロール）［１３４］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［１３５］；（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０（商標）、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ（１ミクロン未満のエマルジョンになるようにマイクロフルイダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンが生じるようにボルテックスされるかのいずれか）；（７）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種類以上の細菌細胞壁成分を含む、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１種類以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
【０１３６】
免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献１３の第７章に開示されている。
【０１３７】
水酸化アルミニウムアジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が典型的であり、抗原は、一般的には、これらの塩に吸着される。リン酸カルシウムが別の典型的なアジュバントである。他のアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントとの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとａｌｕｍ、またはレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とａｌｕｍの組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを使用することができる。
【０１３８】
本発明の組成物は、細胞に媒介される免疫応答と、体液性の免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫応答は、長期間持続する（例えば、中和）抗体、および肺炎球菌に曝されると直ちに反応することができる細胞に媒介される免疫を誘導し得る。
【０１３９】
Ｔ細胞の２つのタイプ（ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞）は、一般的には、細胞媒介性の免疫と体液性免疫を開始および／または増大させるために必要であると考えられている。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現することができ、一般的には、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれている。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識するか、またはそれと相互作用することができる。
【０１４０】
ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現することができ、一般的には、Ｔへルパー細胞と呼ばれている。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与している他の細胞を活性化させることができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、さらに、それらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なる、以下のような２種類の機能的に異なるサブセットに分類することができる：ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型。
【０１４１】
活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫（抗原特異的ＣＴＬの生産の増大を含む）を増強し、したがって、細胞内感染に応答することにおいて特に有用である。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βの１つ以上を分泌することができる。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化させることによって、局所炎症反応を生じ得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２でＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって、免疫応答を拡大させるようにも作用し得る。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１４２】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体の生産を増強させ、したがって、細胞外感染に応答することにおいて有用である。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の１つ以上を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答によっては、さらなる防御のための、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産が生じ得る。
【０１４３】
増強された免疫応答には、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の１つ以上が含まれ得る。
【０１４４】
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−β）の１つ以上の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増大、あるいはＩｇＧ２ａの生産の増大の１つ以上が含まれ得る。一部の実施形態において、増強されたＴＨ１免疫応答には、ＩｇＧ２ａの生産の増大が含まれるであろう。
【０１４５】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比較して、ＩｇＧ２ａの生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン処方物、ヴィロソーム、およびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド）が、本発明での使用において典型的なＴＨ１アジュバントである。
【０１４６】
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）の１つ以上の増加、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産の増大の１つ以上が含まれ得る。一部の実施形態において、増強されたＴＨ２免疫応答には、ＩｇＧ１の生産の増大が含まれるであろう。
【０１４７】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比較して、ＩｇＧ１の生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ２アジュバントとしては、例えば、無機物を含む組成物、オイルエマルジョン、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられ得る。無機物を含む組成物（例えば、アルミニウム塩）が、本発明での使用において典型的なＴＨ２アジュバントである。
【０１４８】
一部の実施形態において、本発明に、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物が含まれる。しばしば、そのような組成物は、増強されたＴＨ１応答と増強されたＴＨ２応答を誘発する、すなわち、アジュバントを用いない免疫化と比較して、ＩｇＧ１の生産とＩｇＧ２ａの生産の両方の増大を誘発する。一般的には、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一のアジュバントでの免疫化と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバントだけでの免疫化、またはＴＨ２アジュバントだけでの免疫化と比較して）、ＴＨ１免疫応答の増大および／またはＴＨ２免疫応答の増大を誘発する。
【０１４９】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。免疫応答により、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答の一方または両方が提供され得る。
【０１５０】
増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。免疫応答により、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜免疫応答の一方または両方が提供され得る。典型的には、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。典型的には、粘膜免疫応答には、ＩｇＡの生産の増大が含まれる。
【０１５１】
上記組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射前の、液体媒体中の溶液または懸濁液に適している固体形態（例えば、凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）もまた、調製することができる。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリーム剤、または散剤として調製される場合もある。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤またはカプセル剤として、噴霧剤として、あるいはシロップ剤として（状況に応じて、香味づけされたもの）調製される場合もある。組成物は、肺投与のために、例えば、微粉末を使用する吸入剤または噴霧剤として、調製される場合もある。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製される場合もある。組成物は、鼻腔内投与、耳投与、または眼投与のために、例えば、滴剤として調製され得る。組成物は、組み合わせられた組成物が哺乳動物への投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。そのようなキットには、液体形態の中にある１つ以上の抗原と、１つ以上の凍結乾燥させられた抗原とが含まれる場合がある。
【０１５２】
組成物が、使用前に即座に調製され（例えば、１種類の成分が凍結乾燥させられた形態で存在する場合）、そしてキットとして提示される場合には、このキットには２つのバイアルが含まれるか、または、キットには、１つの既に充填された注射器と１つのバイアルが含まれ、ここで、注射器の内容物は、注射前にバイアルの内容物を再度活性化させるために使用される場合もある。
【０１５３】
ワクチンとして使用される組成物には、免疫学的有効量の抗原（単数または複数）、ならびに、任意の他の成分が必要に応じて含まれる。「免疫学的有効量」によっては、単回用量または一連のものの一部としてのいずれかでの個体へのその量の投与が、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況についての処置を行う医師による評価、および他の関連する要因に応じて様々である。この量は、日常的に行われている試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に入るであろうと予想される。組成物中に１つより多い抗原を含ませる場合は、２つの抗原は、互いと同じ用量で存在させることもでき、異なる用量で存在させることもできる。
【０１５４】
上記の通り、組成物は、温度保護剤を包含する場合があるが、この成分は、アジュバント組成物（特に、アルミニウム塩など、鉱物アジュバントを含有する組成物）において特に有用でありうる。参考文献１３６に記載されている通り、液体の温度保護剤を、水性のワクチン組成物に添加して、その凝固点を低下させる、例えば、凝固点を０℃より下まで低下させることができる。したがって、組成物は０℃より下でも保存しうるが、その凝固点を超えて保存しながら、熱による分解を阻止することもできる。温度保護剤はまた、鉱物塩によるアジュバントが、凍結および融解後に凝結または沈殿しないように保護しながら組成物を凍結させることも可能とし、また、高温、例えば、４０℃を超えた温度で組成物を保護することも可能である。液体の温度保護剤が、最終混合物の容量で１〜８０％を形成するように、水性の出発ワクチン（ｓｔａｒｔｉｎｇ ａｑｕｅｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）と液体の温度保護剤とを混合することができる。適切な温度保護剤は、ヒトへの投与に安全であり、水中で容易に混和性／可溶性であるものとし、組成物中の他の成分（例えば、抗原およびアジュバント）を損なわないものとする。例として、グリセリン、プロピレングリコール、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。適切なＰＥＧは、平均分子量が２００〜２０，０００Ｄａの範囲でありうる。一実施形態では、ポリエチレングリコールの平均分子量が、約３００Ｄａ（「ＰＥＧ−３００」）でありうる。
【０１５５】
本発明は、（ｉ）１つ以上の抗原と；（ｉｉ）温度保護剤とを含む組成物を提供する。この組成物は、（ｉ）１つ以上の抗原を含む水性組成物を、（ｉｉ）温度保護剤と混合することにより形成することができる。次いで、混合物を、例えば、０℃より下、０〜２０℃、２０〜３５℃、３５〜５５℃、またはそれを超える温度で保存することができる。混合物は、液体形態で保存することもでき、凍結形態で保存することもできる。混合物は、凍結乾燥させることができる。代替的に、（ｉ）１つ以上の抗原を含む乾燥組成物を、（ｉｉ）温度保護剤を含む液体組成物と混合することによっても組成物を形成することができる。従って、成分（ｉｉ）を用いて、成分（ｉ）を復元することができる。
【０１５６】
（機能的同等物）
上記で説明した、本発明の方法、タンパク質アレイおよび医療上の使用において用い得るＧＡＳ抗原を同定するのに用いられる配列番号は、これらのＧＡＳ抗原の全長配列である。
【０１５７】
本発明の方法、タンパク質アレイおよび医療上の使用は、これらの全長ＧＡＳ抗原の使用に限定されるものではなく、これらのＧＡＳ抗原のうちのいずれかに対する、任意の「機能的同等物」もまた包含する。
【０１５８】
本明細書で用いられる「機能的同等物」という用語は、生物学的試料中に存在する、全長ＧＡＳ抗原に対する抗体と相互作用する能力を保持し、したがって、全長ＧＡＳ抗原の代わりに用い得る、配列表に示される全長配列を有するＧＡＳ抗原の改変体を包含することを意図する。
【０１５９】
したがって、「機能的同等物」という用語は、配列表に示される配列を有する全長ＧＡＳ抗原の断片を包含する。このような断片は、全長ＧＡＳ抗原に結合する抗体に結合する能力を保持しうる。本発明の機能的同等物は、全長ＧＡＳ抗原に対して生成された抗体に、少なくとも１０−７Ｍのアフィニティーで結合しうる。
【０１６０】
断片は、全長ＧＡＳ抗原配列のうち少なくともｎの連続アミノ酸を包含し、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。断片は、全長ＧＡＳ抗原配列に由来するエピトープを含みうる。さらなる断片は、全長配列のＣ末端に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上の）アミノ酸、および／または全長配列のＮ末端に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上の）アミノ酸を欠く場合がある。例えば、本発明の方法およびアレイにおいて用い得る断片には、全長ＧＡＳ抗原において存在するリーダー配列および／または膜貫通配列を欠いている断片が含まれる。
【０１６１】
本発明の方法およびアレイにおいて用い得る断片のさらなる例には、Ｎ末端断片が含まれる。このような断片の例には、配列番号９（これは、配列番号５における配列のＮ末端断片である）に示すアミノ酸配列、ならびに配列番号１０（これは、配列番号４のＮ末端断片である）に示すアミノ酸配列が含まれる。
【０１６２】
「機能的同等物」という用語はまた、アミノ酸置換を有する全長ＧＡＳタンパク質の改変体、ならびにこのような改変体の断片も包含する。改変体は、本明細書に記載の全長ＧＡＳ抗原配列に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有しうる。改変体は、配列表で示されるＧＡＳ抗原配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含有しうる。このような置換の典型は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの間；または芳香環残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間における置換である。
【０１６３】
「機能的同等物」という用語は、ＧＡＳ抗原に化学的または遺伝学的に連結されたさらなる実体を包含する融合タンパク質を含めて、ＧＡＳ抗原のより長鎖の改変体もさらに包含する。例えば、ＧＡＳ抗原を、タンパク質アレイ上においてその位置を特定することを容易にするか、またはそれが抗体に結合した場合の検出を容易にする標識に結合させることができる。このような標識の例には、放射性同位体、蛍光分子、または酵素など、分析により検出可能な試薬が含まれる。代替的に、ＧＡＳ抗原を、ヒスチジンドメインまたはＧＳＴドメインなど、その最初の精製を容易にするドメインに融合させることもできる。
【０１６４】
「機能的同等物」という用語はまた、ＧＡＳ抗原と構造的に類似し、全長ＧＡＳ抗原に対する抗体に結合する能力を保持する、上記で説明したＧＡＳ抗原の模倣体、改変体、および断片も包含する。
【０１６５】
（一般）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘだけからなる場合もあり、さらなる何かを包含する場合、例えば、Ｘ＋Ｙである場合もある。
【０１６６】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略することができる。
【０１６７】
数値ｘとの関連における「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１６８】
別段に言明しない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む過程は、特定の混合順序を要求しない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いと混合し、次いで、この混合物を、第３の成分などと混合することができる。
【０１６９】
ポリペプチド配列間における同一性は、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１というパラメータを伴う、アファインギャップ検索を用いる、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）内に実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、血清が回収された、リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を有する患者、およびイエメン人健常血液ドナー（ＹＨＤ）の年齢分布を示す図である。研究のために選択された、年齢を適合させた血清試料を示す。
【図２Ａ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図２Ｂ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図２Ｃ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図２Ｄ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図３】図３は、ＧＡＳ抗原に対して高い反応（ＭＦＩ＞３００００）を示す、イエメン人（Ｙｅｍｉｎｉｔｅ）健常ドナーによる血清およびイタリア人健常ドナーによる血清の百分率を示す図である。反応の降順で抗原を表わす。
【図４−１】図４は、年齢を適合させて選択したヒト血清であるＹＨＤ血清４０例（図４における濃いグレー）およびＲＨＤ血清４３例（図４における薄いグレー）の免疫反応性の比較を示す図である。２つの血清群の抗原認識パターンを規定するため、正規化ＦＩ（ＭＦＩ）値を、専用ソフトウェア（ＴＩＧＲ Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ））を用いる目的変数なしの二次元階層クラスタリングにかけ、その結果として、高度に認識された抗原の２つの主要な群（図４Ａにおける、また、図４Ｂにも示される、群１および群２）が同定された。このクラスタリング解析により、血清が高い反応性（左側）〜低い反応性（右側）に区分された。主に健常ドナーに由来する血清を含む高反応性群（図４左側のＡ）、および低い反応性を示し、主にＲＨＤ患者に由来する血清を含む第２の群（図４の群Ｂ）の２つの主要な血清群を識別しうる。
【図４−２】図４は、年齢を適合させて選択したヒト血清であるＹＨＤ血清４０例（図４における濃いグレー）およびＲＨＤ血清４３例（図４における薄いグレー）の免疫反応性の比較を示す図である。２つの血清群の抗原認識パターンを規定するため、正規化ＦＩ（ＭＦＩ）値を、専用ソフトウェア（ＴＩＧＲ Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ））を用いる目的変数なしの二次元階層クラスタリングにかけ、その結果として、高度に認識された抗原の２つの主要な群（図４Ａにおける、また、図４Ｂにも示される、群１および群２）が同定された。このクラスタリング解析により、血清が高い反応性（左側）〜低い反応性（右側）に区分された。主に健常ドナーに由来する血清を含む高反応性群（図４左側のＡ）、および低い反応性を示し、主にＲＨＤ患者に由来する血清を含む第２の群（図４の群Ｂ）の２つの主要な血清群を識別しうる。
【図５−１】図５は、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（ＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均によるクラスター解析を適用したことを示す図である。同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤを含んだことから、ある抗原群がチップに存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【図５−２】図５は、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（ＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均によるクラスター解析を適用したことを示す図である。同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤを含んだことから、ある抗原群がチップに存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【図５−３】図５は、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（ＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均によるクラスター解析を適用したことを示す図である。同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤを含んだことから、ある抗原群がチップに存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【図６】図６は、健常者とＲＨＤ患者とを識別することを可能にする、抗原クラスターの同定を示す図である。一次元階層クラスタリング解析を用いて、図６のＫＡ１クラスターに由来する血清を、それらの認識プロファイルに基づき、異なる抗原群へとさらに分類したところ、２つの血清クラスターであるＨＳ１（紫色のボックス）およびＨＳ２（青色のボックス）を定義することが可能となった。２つのクラスターの各々において存在するかまた存在しない健常血清および患者血清の数を、図６Ｂで報告する。ＹＨＤの大半が、反応性が高い青色のＨＳ２クラスターにおいて見出されうるのに対し、ＲＨＤ血清の大半は、反応性が低い紫色のＨＳ１クラスターにおいて見出される。この種の検査を用いて、２つの血清集団を識別する能力を、特異度および感度の点で規定した（図６Ｃ）。この具体的な抗原群については、０．７３および０．６９の特異度値および感度値が得られた。図６Ｃはまた、特異度および感度を最大とする（値を１とする）理論的理想型の例も示す。
【図７−１】図７は、図６で説明した解析を、他の抗原クラスター：ＫＡ５（Ｂ）、ＫＡ９（Ｃ）、ＫＡ１０（Ｄ）、ＫＡ５＋Ｍ９（Ｅ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０（Ｆ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｇ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｈ）、ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｉ）にも適用した。特異度値および感度値を、各クラスターについて示す。
【図７−２】図７は、図６で説明した解析を、他の抗原クラスター：ＫＡ５（Ｂ）、ＫＡ９（Ｃ）、ＫＡ１０（Ｄ）、ＫＡ５＋Ｍ９（Ｅ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０（Ｆ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｇ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｈ）、ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｉ）にも適用した。特異度値および感度値を、各クラスターについて示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
序論
本発明者らは、１３０の組換えＧＡＳタンパク質抗原を含有するタンパク質マイクロアレイを開発した。該チップは、咽頭炎患者において高度な抗体反応を誘発する抗原を選択するための器具であったが、また、チック病を有する患者に由来する血清中のＧＡＳ抗原に対する高度の反応を明らかにすることも可能とし、感受性の個体における、ＧＡＳ抗原に依存する自己抗体の誘導が、チック障害の発症に関与しうることを強力に裏付けた（Ｂｏｍｂａｃｉ Ｍら、２００９年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、４巻、７頁：ｅ６３３２．ｄｏｉ：１０．１３７１）。
【０１７２】
本明細書において、本発明者らは、このタンパク質マイクロアレイを用いて、ＲＨＤ患者および健常ドナーにおいて、この２つの集団を識別することを可能とする抗原認識パターンを同定することを目的として、１３０の組換えＧＡＳタンパク質に対する免疫反応を解析した。この手法により、健常ドナーには高度に認識されるが、ＲＨＤ患者には高度には認識されない抗原クラスターが同定されたが、これにより、診断検査のための基礎を確定することができる。
【０１７３】
材料と方法
ヒト血清
リウマチ性心疾患患者の血清は、ＲＨＤの臨床症状を示す、出身が中東地域の国（イエメン）である１１〜４０歳の男性患者または女性患者６０人から回収した。
【０１７４】
抗ＧＡＳ抗体力価は、年齢および地理的な出自を含めたいくつかの因子により変化することが公知である。実際、健常者における抗ＧＡＳ抗体力価は、小児早期において低く、５〜１５歳の小児においてピークまで上昇し、青年後期および成人早期において低下し、次いで、それ以後は一定となる。この理由で、同じ年齢範囲（１７〜４０歳）の群を用いてリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）血清群と対照のイエメン人健常ドナー（ＹＨＤ）群との比較を実施したが、このため、対照の血清が入手できなかった１１〜１６歳のＲＨＤ患者の血清は除外した。この比較で用いた最終的な血清数はＹＨＤ群が４０例およびＲＨＤが４３例であった。
【０１７５】
図１は、入手可能な２つの集団および本研究のために選択した集団についての分布解析を示す。
【０１７６】
加えて、かつての西欧人口において、ＧＡＳ感染に対する抗生剤予防がより高度に用いられたことを考慮に入れ、イタリア人健常ドナー（ＩＨＤ）から回収した血清２０例を、健常イエメン人とのさらなる比較のために用いた。
【０１７７】
すべての血清試料は、ＲＨＤの診断または瀉血のための日常的な医療管理の過程で得られた残余物であり、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌａ Ｓａｐｉｅｎｚａ、Ｒｏｍｅにより利用可能とされたものであった。
【０１７８】
ＧＡＳタンパク質マイクロアレイ
主にＧＡＳ ＳＦ３７０ Ｍ１ゲノムから選択された１３０の組換えタンパク質をニトロセルロースチップ上に沈着させることにより、タンパク質アレイを生成させた（チップセットアップの詳細については、図２を参照されたい）。
【０１７９】
チップを、異なる血清と共にインキュベートし、沈着させた各タンパク質に結合した全ＩｇＧを、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧで検出し、結果として得られる蛍光強度（ＦＩ）値を測定することにより、反応性を評価した。各スライドについて、基準曲線として用いる、Ｓ字型に調整した標準ＩｇＧ曲線との対比で、タンパク質のＭＦＩ値を正規化した（図２）。
【０１８０】
ＭＦＩ値が、バックグラウンド値に標準偏差の２倍を加えた値に対応する１５，０００以上である場合に、被験血清による抗原認識を陽性とみなした。ＭＦＩ値が３０，０００以上である場合を、高度な反応とみなした。患者に由来する血清１２０例（イタリア人健常ドナー（ＩＨＤ）による血清２０例、イエメン人健常ドナー（ＹＨＤ）による血清４０例、およびイエメン人ＲＨＤ患者（ＲＨＤ）による血清６０例）により、アレイをプローブした。
【０１８１】
結果
健常ドナーに由来する血清によって認識されるＧＡＳ抗原：抗体反応はイタリア人よりイエメン人において高度である
イエメン人健常血液ドナーに由来する血清４０例およびイタリア人健常ドナーに由来する血清２０例を用いて、２つの異なる地域に属する集団における抗ＧＡＳ抗体反応を調査した。図３は、ＧＡＳ抗原に対する反応が高度な健常ドナー血清の百分率を報告する。示される通り、バックグラウンドの抗連鎖球菌属抗体反応は、高度に認識された抗原の数の点でも、高度に陽性な血清の数の点でも、イタリア人試料よりイエメン人試料においてはるかに高度である。
【０１８２】
健常イエメン人とイエメン人ＲＨＤ患者とで示差的なＧＡＳ抗原の免疫反応
本発明者らは、年齢を適合させて選択したヒト血清であるＹＨＤ血清４０例（図４における濃いグレー）およびＲＨＤ血清４３例（図４における薄いグレー）の免疫反応性を比較した。２つの血清群の抗原認識パターンを規定するため、正規化ＦＩ（ＭＦＩ）値を、専用ソフトウェア（ＴＩＧＲ Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ））を用いる目的変数なしの（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）二次元階層クラスタリングにかけた。
【０１８３】
抗体による認識プロファイルをクラスタリングして検査することにより、高度に認識された抗原の２つの主要な群（図４における群１および群２）が同定された。群１には、ＧＡＳ５Ｆ（分泌タンパク質と推定される）、ＧＡＳ２５（ストレプトリシンＯ前駆体）、ＧＡＳ４０（表面排除タンパク質と推定される）、Ｍ１、ＧＡＳ１７９（エステラーゼと推定される）、ＧＡＳ９７（免疫原性の分泌タンパク質前駆体の相同体）、ＧＡＳ１９３（免疫原性の分泌タンパク質前駆体）が含まれた。群２には、５つの異なるＭタンパク質（Ｍ１２、Ｍ２３、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ９）、ＧＡＳ５７（細胞エンベローププロテイナーゼと推定される）、ＧＡＳ３８０（仮説的タンパク質）、およびＳｐｅＩが含まれた。
【０１８４】
さらに、図４に示す通り、このクラスタリング解析により、血清が、高い反応性（左側）〜低い反応性（右側）に区分された。実際、主に健常ドナーに由来する血清を含む高反応性群（図４左側のＡ）、および低い反応性を示し、主にＲＨＤ患者に由来する血清が含まれる第２の群（図４の群Ｂ）の２つの主要な血清群を識別しうる。
【０１８５】
次いで、本発明者らは、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（図５のＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均（ｋ−ｍｅａｎ）によるクラスター解析を適用した。ｋ平均によるクラスタリングとは、平均が最も近接するクラスターに各観察が属するｋ個のクラスターへと、ｎ個の観察を分割することを目的とする統計的方法である。それらがいずれもデータ中の天然クラスター（ｎａｔｕｒａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ）の中心を見出そうと試みる点で、ｋ平均によるクラスタリングは、ガウスの混合（ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）についての期待値最大化アルゴリズムと類似する。
【０１８６】
図５に示す通り、同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスタリングは、一次元的であった、すなわち、抗原の分類について意図するものであり、血清の分類について意図するものではなかったが、クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤ血清を含むことが観察されたことは興味深い。この観察からは、ある抗原群がチップ内に存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【０１８７】
次いで、本発明者らは、健常者と心臓病患者とを識別することを可能とするこの抗原群を、より正確な様式で定義しようと試みた。この目的で、一次元階層クラスタリング解析を用いて、血清を、それらの認識プロファイルに基づき、異なる抗原群へとさらに分類した。
【０１８８】
まず、図５のクラスターＫＡ１中に含まれる抗原群にこの種の解析を適用したところ、図６Ａの紫色のボックス（ＨＳ１）および青色のボックス（ＨＳ２）に対応する、第１の階層レベルにおける２つの血清クラスターであるＨＳ１およびＨＳ２を定義することが可能となった。２つのクラスターの各々において存在するかまたは存在しない健常血清および患者血清の数を、図６Ｂで報告する。示される通り、ＹＨＤ血清の大半が、反応性が高い青色のＨＳ２クラスターにおいて見出されうるのに対し、ＲＨＤ血清の大半は、反応性が低い紫色のＨＳ１クラスターにおいて見出される。この種の検査を用いて、２つの血清集団を識別する能力を、特異度および感度の点で規定した。図６Ｃは、特異度および感度を最大とする（値を１とする）理論的理想型の例を示す。示される通り、この具体的な抗原群について、本発明者らは、０．７３および０．６９の特異度値および感度値を得た。
【０１８９】
同じ種類の解析を、クラスターＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０、およびＫＡ５＋Ｍ９中の抗原にも適用した。また、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７、ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７を含めた、他の抗原群にも、同じ種類の解析を適用した。結果を図７Ａ〜Ｉにまとめる。
【０１９０】
示される通り、最高の特異度値および感度値をもたらすクラスターが、クラスターＫＡ１中の抗原（ＧＡＳ５、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５Ｆ、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ９７、ＧＡＳ３８０、およびＳｐｅＡ）、ならびにＧＡＳ５抗原、ＧＡＳ２５抗原、ＧＡＳ４０抗原、およびＧＡＳ５７抗原を含んだのに対し、最低値は、ＧＡＳ抗原のＭバリアントが含まれるクラスターについて得られた。
【０１９１】
考察
本発明者らは、ＧＡＳ５抗原、ＧＡＳ２５抗原、ＧＡＳ４０抗原、およびＧＡＳ５７抗原を用いてこの種の解析を行えば、ＲＨＤをより正確に診断するための基礎が確定され、ＡＲＦを有する患者が、ＲＨＤを発症する可能性があるかどうかを予測することが可能となり、したがって、医療従事者が、ＡＲＦ患者に最適な予防治療について決定するための指針が得られると考えている。
【０１９２】
【化６】
【０１９３】
【化７】
【０１９４】
【化８】
【０１９５】
【化９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；ＧＡＳ）感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を有する患者の同定、およびＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者の同定の分野に属する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを予防および処置するための方法および組成物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト病原体であるＡ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＧＡＳ）は、通常の咽頭炎の主要な原因であると広く認識されている。この細菌による感染症は、さらに重度の侵襲性疾患、ならびに非化膿性自己免疫性続発症を結果としてもたらしうる。急性リウマチ熱（ＡＲＦ）は、未処置のＧＡＳ感染後に、０．１〜３％の個体において発症する、多病巣性自己免疫疾患である。
【０００３】
ＡＲＦは、１９４４年に初めて公表されたＪｏｎｅｓ基準の改定版により診断されている。最新のＪｏｎｅｓ基準によれば、ＧＡＳ感染の証拠と共に、２つの主要基準（移動性多発性関節炎、心臓炎、皮下結節、有縁性紅斑、シデナム舞踏病）、または１つの主要基準に加えた２つの副次基準（発熱、関節痛、赤血球沈降速度（ｅｒｙｔｈｏｃｙｔｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）またはＣ反応性タンパク質値の上昇、白血球増多症、心臓ブロックの特徴を示すＥＣＧ所見）が存在すれば、ＡＲＦの診断がなされうる。
【０００４】
ＡＲＦの臨床的に重要な主要な続発症は、リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）である。ＲＨＤは、重篤な心病変をもたらす場合があり、死亡または心弁置換に至る、心筋炎または弁膜炎を伴う。発展途上国全体において、ＲＨＤは、依然として、＜５０歳の個体における後天的心疾患の主要な原因である。先進諸国では、ＧＡＳ感染症を処置するための抗生剤が入手可能であるために、ＡＲＦおよびＲＨＤはそれほど一般的ではない。しかし、１９８０年代の半ば、米国の複数の地域でＡＲＦおよびＲＨＤの再流行が報告され、ユタ州、ソルトレークシティー周辺の山間地域で遷延した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在のところ、ＡＲＦの診断後に患者がＲＨＤを発症しているかどうかを確認するには、ＥＣＧ検査および心エコー図などの検査が用いられている。現在のところ、ＧＡＳ感染の結果として、ＲＨＤを有するか、またはＲＨＤを発症するリスクがある個体を同定するために実施可能なアッセイは存在しない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＧＡＳ感染の結果として、ＲＨＤを有するか、またはＲＨＤを発症するリスクがある個体を同定する方法に関する。本発明はまた、このような方法において用いうるタンパク質アレイにも関する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを予防および処置するための方法および組成物も提供する。
【０００７】
診断法
本発明は、患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）患者に由来する生物学的試料を少なくとも１つのＧＡＳ抗原と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該患者に由来する該生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性を、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性と比較するステップであって、ここで、
健常個体に由来する該対照の生物学的試料と比較して、該患者に由来する該生物学的試料における反応性が低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示すステップを含む、方法を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する方法、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）患者に由来する生物学的試料を、
配列番号１（ＧＡＳ５）
配列番号２（ＧＡＳ５Ｆ）
配列番号３（ＧＡＳ２５）
配列番号４（ＧＡＳ４０）
配列番号５（ＧＡＳ５７）
配列番号６（ＧＡＳ９７）
配列番号７（ＧＡＳ３８０）および
配列番号８（ＳｐｅＡ）
のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原
またはその機能的同等物と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、該患者に由来する該生物学的試料中の任意の抗体の反応性を評価するステップと、
ｃ）ステップｂ）における反応性を、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の反応性と比較するステップであって、ここで、
該患者に由来する該生物学的試料における反応性が、健常な個体に由来する該対照の生物学的試料における反応性と比較して低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示すステップを含む、方法を提供する。
【０００９】
「リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）」という用語は、僧帽弁および／または大動脈弁に対する損傷、心筋炎、ならびに心膜炎を含め、急性リウマチ熱の後に続いて心臓が罹患する状態を対象とする。
【００１０】
ＲＨＤに罹患している患者に由来する血清試料、および健常個体に由来する血清試料を解析したところ、ＲＨＤに罹患している患者に由来する血清が示す、ある種のＧＡＳ抗原との反応性が、健常患者に由来する血清が示す反応性と比較して著明に低いという驚くべき知見がもたらされた。これらの知見は、ＧＡＳ抗原との反応性を用いて、健常個体に由来する血清と、ＲＨＤを患う患者に由来する血清とを識別しうるという第１の証拠をもたらす。具体的には、ＲＨＤ患者に由来する血清が示す、以下の表１で同定されている８つのＧＡＳ抗原との反応性は低いことが判明している。
【００１１】
【表１】
したがって、患者試料における、これら８つのＧＡＳ抗原に対する反応性が、健常個体に由来する対照試料における反応性と比較して低いことの検出を用いて、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを診断することもでき、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが増大した患者を同定することもできる。逆に、患者試料におけるこれら８つのＧＡＳ抗原に対する抗体反応性が、健常個体に由来する対照試料において示される反応性と同様であることの検出は、その患者がＲＨＤを患っておらず、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが小さいことを示す。
【００１２】
本発明の方法は、患者に由来する生物学的試料を、上記で列挙したＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つすべて、またはその機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１３】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの２つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１および２；配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号１および５；配列番号２および３；配列番号２および４；配列番号２および５；配列番号３および４；配列番号３および５；配列番号４および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。該方法はまた、該試料を、配列番号１および６；配列番号１および７；配列番号１および８；配列番号２および６；配列番号２および７；配列番号２および８；配列番号３および６；配列番号３および７；配列番号３および８；配列番号４および６；配列番号４および７；配列番号４および８；配列番号５および６；配列番号５および７；配列番号５および８；配列番号６および７；配列番号６および８、または配列番号７および８、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップも含みうる。
【００１４】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの３つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの３つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。例えば、該方法は、該試料を、配列番号１、２、および３；配列番号１、３、および４；配列番号１、４、および５；配列番号２、３、および４；配列番号２、４、および５；配列番号３、４、および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１５】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの４つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの４つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。例えば、該方法は、該試料を、配列番号１、２、３および４；配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１６】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの５つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの５つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。例えば、該方法は、該試料を、配列番号１、２、３、４、および５、またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１７】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの６つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のＧＡＳ抗原のうちの６つによる任意の組合せと接触させるステップを含みうる。
【００１８】
患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原のうちの７つと接触させる場合、該方法は、該試料を、配列番号１、２、３、４、５、６および７；配列番号１、３、４、５、６、７および８；配列番号１、２、４、５、６，７および８；配列番号１、２、３、５、６、７および８；配列番号１、２、３、４、６，７および８；配列番号１、２、３、４、５、７および８；配列番号１、２、３、４、５，６および８；またはこれらの機能的同等物と接触させるステップを含みうる。
【００１９】
代替的に、患者に由来する生物学的試料を、ＧＡＳ抗原の８つすべて、すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８、またはこれらの機能的同等物と接触させることもできる。
【００２０】
患者に由来する生物学的試料において、これらのＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つすべて、またはこれらの機能的同等物に結合した抗体の反応性を、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の、これらのＧＡＳ抗原に結合する抗体の反応性と比較する。健常個体に由来する対照の生物学的試料を、患者の生物学的試料と同じＧＡＳ抗原の組合せと接触させる。一般に、これらのＧＡＳ抗原の組合せに結合した抗体の平均の反応性は、健常個体に由来する対照の生物学的試料において既に決定されている。当技術分野では、抗体の反応性を評価するのに適する方法が公知であるが、以下ではこれらについてより詳細に記載する。
【００２１】
抗体の検出：
上記で説明した本発明の方法はすべて、抗体の反応性の評価、すなわち、ＧＡＳ抗原に結合した抗体の検出、およびこれらの抗体の力価の検出を含む。抗原に結合した抗体を検出する方法、および抗体力価を決定する方法は当業者に周知であり、任意のこのような方法を用いることができる。
【００２２】
例えば、１つ以上のＧＡＳ抗原（または機能的同等物）を、以下に記載するアレイの表面など、表面上における既知の位置に固定化させることができる。固定化させた抗原は、該固定化された抗原と共に、該抗原に対する、該試料中に存在する任意の抗体の結合を可能とする条件下で、インキュベートすることができる。適切なインキュベーション期間は、約１時間でありうる。洗浄して結合しなかったいかなる抗体も除去した後で、該抗原に結合した抗体の検出は、該抗原に結合し、それを認識する実体を用いて達成することができる。
【００２３】
例えば、上記で説明した方法のうちのいずれにおいても、ＧＡＳ抗原に結合した任意の抗体の反応性を評価するステップは、生物学的試料およびＧＡＳ抗原を、標識した抗ＩｇＧ抗体などの、標識した二次抗体と、該固定化されたＧＡＳ抗原に結合した、該生物学的試料中の任意の抗体に対する、該二次抗体の結合に適する条件下で、接触させるステップを含みうる。
【００２４】
抗ＩｇＧ抗体などの二次抗体は蛍光標識または酵素標識で標識することができ、それにより、該二次抗体の結合が、そしてかように、生物学的試料中のＧＡＳ抗原に対する抗体の存在が、該標識を検出することにより検出される。標識が蛍光標識である場合は、蛍光強度の比較を用いて、相対的な抗体反応性を評価し、これにより、対照の生物学的試料より低い抗体反応性を示す、特定の患者試料が存在するかどうかを決定することができる。バックグラウンドの蛍光強度は、約５，０００であることを予測することができる。標準偏差を考慮に入れると、少なくとも１５，０００の蛍光強度が、ＧＡＳ抗原に結合した抗体が試料中に存在することを示しうる。少なくとも３０，０００の蛍光強度は高い反応性を示すものとみなされ、そのことは、試料中でＧＡＳ抗原に結合した抗体が高力価であることを示す。したがって、本発明の一部の態様では、１５，０００〜３０，０００の間の蛍光強度が、ＲＨＤと関連する可能性がある、低い反応性を示しうる。
【００２５】
上記で説明した方法は、以下により詳細に記載されるアレイなど、タンパク質アレイ上で実施することもでき、標準的なＥＬＩＳＡまたはドットブロット技法を用いて実施することもできる。
【００２６】
生物学的試料：
本発明の方法において調べうる生物学的試料は、ＧＡＳ抗原に対する抗体を含有することが公知である任意の試料でありうる。適切な試料の例は、唾液試料、血液試料、または血清試料である。特に、試料は、血清試料でありうる。
【００２７】
患者由来の生物学的試料は、ヒト患者に由来する。ヒト患者は、成人の場合もあり、約１２〜約１８歳の青年の場合もあり、１２歳未満の小児の場合もある。患者は、移動性多発性関節炎、心臓炎、皮下結節、有縁性紅斑、シデナム舞踏病、発熱、関節痛、赤血球沈降速度またはＣ反応性タンパク質の上昇、白血球増多症、または心臓ブロックの特徴を示すＥＣＧ所見を含めた、急性リウマチ性疾患の臨床症状を示しうる。患者は、進行中のＧＡＳ感染の証拠を示しうる。場合によって、患者は、進行中のＧＡＳ感染および急性リウマチ性疾患について無症候でありうる。
【００２８】
対照の生物学的試料は、患者に由来する生物学的試料と同等の地理的位置出身の健常個体に由来しうる。
【００２９】
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。本発明の方法は、患者から生物学的試料を得るステップをさらに含みうる。
【００３０】
タンパク質アレイ：
複数のＧＡＳ抗原に対する同時的な生物学的試料のスクリーニングを容易にするためには、本発明の方法において用いられるＧＡＳ抗原を、１つ以上のタンパク質アレイ上に提示することができる。例えば、各ＧＡＳ抗原を個別のアレイ上に提示することもでき、単一のアレイにより、複数のＧＡＳ抗原を同時に提示することもできる。本発明のさらなる態様によれば、タンパク質アレイが提供される。これらのアレイは、上記で説明した方法のうちのいずれにおいて用いるのにも適する。
【００３１】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含むタンパク質アレイを提供する。
【００３２】
タンパク質アレイは、これらのＧＡＳ抗原のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つすべて、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３３】
アレイが、ＧＡＳ抗原のうちの２つを含む場合、該アレイは、配列番号１および２；配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号１および５；配列番号２および３；配列番号２および４；配列番号２および５；配列番号３および４；配列番号３および５；配列番号４および５のアミノ酸配列を含む抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。代替的に、アレイは、配列番号１および６；配列番号１および７；配列番号１および８；配列番号２および６；配列番号２および７；配列番号２および８；配列番号３および６；配列番号３および７；配列番号３および８；配列番号４および６；配列番号４および７；配列番号４および８；配列番号５および６；配列番号５および７；配列番号５および８；配列番号６および７；配列番号６および８、または配列番号７および８のアミノ酸配列を含む抗原、またはこれらの機能的同等物も含みうる。
【００３４】
アレイが、３つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの３つによる任意の組合せを含みうる。例えば、アレイは、配列番号１、２、および３；配列番号１、３、および４；配列番号１、４、および５；配列番号２、３、および４；配列番号２、４、および５；配列番号３、４、および５のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３５】
アレイが、４つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの４つによる任意の組合せを含みうる。例えば、アレイは、配列番号１、２、３および４；配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３６】
アレイが、５つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの５つによる任意の組合せを含みうる。例えば、アレイは、配列番号１、２、３、４、および５のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３７】
アレイが、６つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８のＧＡＳ抗原のうちの６つによる任意の組合せを含みうる。
【００３８】
アレイが、７つのＧＡＳ抗原を含む場合、該アレイは、配列番号１、２、３、４、５、６および７；配列番号１、３、４、５、６，７および８；配列番号１、２、４、５、６、７および８；配列番号１、２、３、５、６、７および８；配列番号１、２、３、４、６、７および８；配列番号１、２、３、４、５、７および８；配列番号１、２、３、４、５、６および８のＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００３９】
代替的に、アレイは、ＧＡＳ抗原の８つすべて、すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７、および８、またはこれらの機能的同等物を含みうる。
【００４０】
タンパク質アレイは、さらなるＧＡＳ抗原を含みうる。
【００４１】
本発明の方法では、当技術分野において公知の任意の種類のタンパク質アレイを用いることができる。タンパク質アレイの作製については、Ｃｒｅｔｉｃｈ，Ｍ．、Ｄａｍｉｎ Ｆ．ら（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２３， ７７〜８８ （２００６））およびＺｈｕ，Ｈ ＆ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ７：５５〜６３（２００３））において記載されている。
【００４２】
例えば、タンパク質アレイは、それに１つ以上の抗原が固定されるスライドガラスでありうる。その最も単純な形態において、アレイは、顕微鏡用のスライドガラスを、アミノシラン（Ａｎｓｏｒｇｅ、Ｆａｕｌｓｔｉｃｈ）によりコーティングし、抗原を含有する溶液を該スライドに添加し、乾燥させるだけで調製される、１つの抗原だけを提示するスライドガラスでありうる。抗原によりコーティングするための、アミノシランによりコーティングされたスライドは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社およびＰｉｅｒｃｅ社から購入することができる。
【００４３】
代替的に、アレイは、複数の抗原を提示しうる。例えば、ニトロセルロースでコーティングしたスライドに、複数のＧＡＳ抗原をナノリットルずつスポットすることができる。このようなアレイは、各ＧＡＳ抗原を多連（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）で提示しうる。このようなアレイ内における抗原スポットは、直径が約１５０μｍであり、約０．３５ｎｇのタンパク質を含有しうる。
【００４４】
他の種類のタンパク質アレイは、３Ｄゲルパッドおよびマイクロウェルアレイを包含する。当業者には明らかである通り、いまだ構想されてはいないが、将来的に考案される種類のタンパク質アレイは、多分、本発明に従って用いるのに適することが分かるであろう。
【００４５】
本発明は、本発明によるタンパク質アレイと、ＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を有するか、またはＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を発症するリスクがある患者の診断に該アレイを用いるための指示書を含むキットをさらに提供する。
【００４６】
ＲＨＤを処置および予防するための方法および組成物
現在のところ、ＡＲＦを有すると診断されたすべての患者には、診断後少なくとも５年間にわたり、その後におけるＧＡＳ感染のリスクおよびＲＨＤの発症を低減するために、抗生剤による予防法（一般には、ペニシリン）が推奨されている。どの患者にＲＨＤのリスクがあり、どの患者にはＲＨＤのリスクがないかを同定することにより、ＡＲＦを有すると診断された患者の医学的処置の調整が可能となる。
【００４７】
本発明は、患者が、本発明の方法により、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを患っているか、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが増大していると同定される場合、該患者を抗生剤で処置できるようにする。逆に、患者が、本発明の方法によりＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクが小さいと同定される場合、抗生剤処置は不要でありうる。
【００４８】
本発明者らによる、健常個体に由来する血清が、上記で論じた、ＧＡＳ抗原との高い反応性を示すことの認識は、これらのＧＡＳ抗原に対する抗体が、ＲＨＤの発症を予防するのに防御的な役割を果たしうることを示唆する。したがって、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物を含む組成物を提供する。本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはこれらの機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む組成物も提供する。これらの組成物は、免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物でありうる。
【００４９】
さらなる態様によれば、本発明が、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防する方法であって、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防を必要とする患者に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物を投与するステップを含む方法を提供する。本発明は、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防に用いられる、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物をさらに提供する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するための医薬品の製造における、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物の使用も提供する。代替的に、これらのＧＡＳ抗原をコードする核酸分子も用いることができる。
【００５０】
本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防する方法であって、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防を必要とする患者に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体を投与するステップを含む方法も提供する。本発明は、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するのに用いるための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体をさらに提供する。本発明はまた、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するための医薬品の製造における、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物に特異的に結合する少なくとも１つの抗体の使用も提供する。
【００５１】
本発明の抗体は、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ以上のアフィニティーでＧＡＳ抗原に特異的に結合することが典型的である。「抗体」という用語は、完全な免疫グロブリン分子も、ポリペプチドに結合することが可能なそれらの断片も包含する。これらには、ハイブリッド（キメラ）抗体分子［１、２］；Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片およびＦｖ分子；非共有結合によるヘテロ二量体［３、４］；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［５］；二量体抗体断片構築物および三量体抗体断片構築物；ミニボディー［６、７］；ヒト化抗体分子［８〜１０］；ならびにこのような分子から得られる任意の機能的断片のほか、ファージディスプレイなど、従来にない工程により得られる抗体が含まれる。一部の実施形態では、抗体が、モノクローナル抗体である。当技術分野では、モノクローナル抗体を得る方法が周知である。一部の実施形態では、抗体がヒト化抗体または完全ヒト抗体である。
【００５２】
本発明の処置組成物および処置法は、上記で論じたＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてを用いる場合もあり、これらのＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つすべてに特異的に結合する抗体を用いる場合もある。ＧＡＳ抗原の組合せ、およびこれらの抗原に特異的に結合する抗体を用いることができる。
【００５３】
本発明のこれらの態様による処置組成物および処置法において用いうるＧＡＳ抗原の組合せの例には、配列番号１および２；配列番号１および３；配列番号１および４；配列番号１および５；配列番号２および３；配列番号２および４；配列番号２および５；配列番号３および４；配列番号３および５；配列番号４および５；配列番号１および６；配列番号１および７；配列番号１および８；配列番号２および６；配列番号２および７；配列番号２および８；配列番号３および６；配列番号３および７；配列番号３および８；配列番号４および６；配列番号４および７；配列番号４および８；配列番号５および６；配列番号５および７；配列番号５および８；配列番号６および７；配列番号６および８、または配列番号７および８；配列番号１、２および３；配列番号１、３および４；配列番号１、４および５；配列番号２、３および４；配列番号２、４および５；配列番号３、４および５；配列番号１、２、３および４；配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５；配列番号１、２、３、４および５；配列番号１、２、３、４、５、６、および７；配列番号１、３、４、５、６、７および８；配列番号１、２、４、５、６、７および８；配列番号１、２、３、５、６、７および８；配列番号１、２、３、４、６、７および８；配列番号１、２、３、４、５、７および８；配列番号１、２、３、４、５、６および８；またはこれらの機能的同等物が含まれる。これらのＧＡＳ抗原の組合せに結合する抗体もまた用いることができる。
【００５４】
上記で論じた組成物および方法は、ＧＡＳ感染一般を処置および予防するのに有用であり得るほか、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置および予防するのにも有用でありうる。
【００５５】
ＲＨＤを処置および予防するための組成物の処方
上記で詳述した通り、本発明の組成物は、ワクチンとしても有用でありうる。本発明によるワクチンは、予防的な（すなわち、感染を予防するため）場合もあり、治療的な（すなわち、感染を処置するため）場合もあるが、予防的な場合が典型的である。
【００５６】
したがって、組成物は、薬学的に許容されうる。組成物は通常、抗原に加えた成分を包含する、例えば、組成物は、１つ以上の薬学的なキャリア（複数可）および／または賦形剤（複数可）を包含することが典型的である。
【００５７】
組成物は一般に、水性形態でヒトに投与される。しかし、投与前に、組成物を非水性形態とすることもできる。例えば、あるワクチンは、水性形態で製造され、次いでまた、水性形態で充填および分配および投与もなされるが、他のワクチンは、製造の過程で凍結乾燥され、使用の時点で水性形態へと復元される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤など、乾燥製剤でありうる。
【００５８】
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの防腐剤を包含しうる。しかし、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（すなわち、水銀物質が５μｇ／ｍｌ未満である）、例えば、チオメルサールを含まないものとすることが好ましい。水銀を含有しないワクチンがより典型的である。防腐剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
【００５９】
熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を包含しうる。このような薬剤のさらなる詳細については、以下に示す。
【００６０】
張度を制御するためには、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）が含まれることが典型的である。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が一般的に使用され、これは、１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの間（例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ）で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【００６１】
組成物は、一般的には、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、より頻繁には、２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を持つであろう。さらに典型的には、２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にあるであろう。
【００６２】
組成物には、１種類以上の種類のバッファーが含まれ得る。典型的なバッファーとしては、リン酸塩バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ホウ酸塩バッファー、コハク酸塩バッファー、ヒスチジンバッファー（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを含むもの）、またはクエン酸塩バッファーが挙げられる。バッファーは、典型的には、５ｍＭ〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【００６３】
組成物のｐＨは、一般的には、５．０〜８．１の間、より典型的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間であろう。
【００６４】
組成物は、典型的には滅菌されている。組成物は典型的には非発熱性でもある。例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な基準）が含まれ、例えば、１用量あたり＜０．１ＥＵが含まれる。組成物にはしばしばグルテンが含まれない。
【００６５】
組成物には、１回の免疫化のための材料が含まれる場合があり、また、複数回の免疫化のための材料が含まれる場合もある（すなわち、「複数用量の」キット）。複数用量の構成においては、保存剤が含められることが典型的である。複数用量の組成物に保存剤を含めることの代わりに（またはそれに加えて）、組成物は、物質を取り出すための無菌のアダプターを持つ容器の中に入れられる場合もある。
【００６６】
ヒト用のワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投薬体積で投与されるが、その半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が子供に投与される場合もある。
【００６７】
本発明の組成物にはまた、１種類以上の種類の免疫調節因子が含まれる場合もある。免疫調節因子の１つ以上に、しばしば１つ以上のアジュバントが含まれる。アジュバントには、以下でさらに議論されるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれ得る。
【００６８】
本発明の組成物において使用することができるアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
Ａ．無機物を含む組成物
本発明においてアジュバントとしての使用に適している無機物を含む組成物としては、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）が挙げられる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献１１の中で開示されている「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、これらの塩は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、無定形など）をとる。これらの塩への吸着が頻繁に使用される。無機物を含む組成物はまた、金属塩の粒子として処方される場合がある［１２］。
【００６９】
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これらの名称は便宜上であるが、便宜のためだけに使用される。なぜなら、これは、存在する実際の化合物の正確な記載ではないからである（例えば、参考文献１３の第９章を参照のこと）。本発明では、アジュバントとして一般的に使用されている、「水酸化物」アジュバントまたは「リン酸塩」アジュバントの任意のものを使用することができる。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常は、少なくとも一部が結晶である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合には、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）も含まれる。これらは沈殿によって得ることができ、沈殿の間の反応条件と濃度が、塩の中のホスフェートでのヒドロキシルの置換の程度に影響を及ぼす。
【００７０】
繊維状の形態（例えば、透過型電子顕微鏡写真で見られるようなもの）が、水酸化アルミニウムアジュバントについての典型である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には、約１１であり、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８ｍｇ〜２．６ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００７１】
リン酸アルミニウムアジュバントは、一般的には、０．３〜１．２の間、例えば、０．８〜１．２の間、典型的には、０．９５±０．１のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。リン酸アルミニウムは、特に、ヒドロキシリン酸塩については、一般的には無定形であろう。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する、０．６ｍｇのＡｌ３＋／ｍｌで含まれる無定形のヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、一般的には粒子状であろう（例えば、透過型電子顕微鏡写真において見られる平板様の形態）。いずれかの抗原吸着後の粒子についての典型的な直径は、０．５μｍ〜２０μｍの範囲（例えば、約５μｍ〜１０μｍ）である。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり、０．７ｍｇ〜１．５ｍｇのタンパク質の吸着能力が報告されている。
【００７２】
リン酸アルミニウムの電荷ゼロ点（ＰＺＣ）は、ホスフェートでのヒドロキシルの置換の程度と逆の関係にあり、この置換の程度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件と反応物の濃度に応じて変わり得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離のホスフェートイオンの濃度を変えることによって（より多くのホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはバッファー（例えば、ヒスチジンバッファー）を加えることによって（ＰＺＣをより塩基性にする）も変化させられる。本発明にしたがって使用されるリン酸アルミニウムは、一般的には、４．０〜７．０の間、例えば、５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有するであろう。
【００７３】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液には、バッファー（例えば、リン酸塩バッファー、またはヒスチジンバッファー、またはＴｒｉｓバッファー）が含まれ得るが、これは、必ずしもそうである必要はない。懸濁液は、しばしば滅菌されており、発熱物質が含まれない。懸濁液には、遊離の水性のホスフェートイオンが含まれる場合があり、例えば、１．０ｍＭ〜２０ｍＭの間、例えば、５ｍＭ〜１５ｍＭの間、例えば、約１０ｍＭの濃度で存在する。懸濁液にはまた、塩化ナトリウムも含まれる場合がある。
【００７４】
本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物よりも多く存在し得、例えば、少なくとも２：１の重量比、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などで存在し得る。
【００７５】
哺乳動物に投与される組成物中でのＡｌ＋＋＋の濃度は、典型的には、１０ｍｇ／ｍｌ未満であり、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【００７６】
特に、Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの糖抗原を包含する組成物では、リン酸アルミニウムが特に好ましく、典型的なアジュバントは、Ａｌ３＋を０．６ｍｇ／ｍｌで包含し、ＰＯ４／Ａｌのモル比が０．８４〜０．９２である、アモルファスのアルミニウムヒドロキシホスフェートである。低用量のリン酸アルミニウム、例えば、投与１回当たり１コンジュゲート当たり５０〜１００μｇのＡｌ３＋による吸着を用いることができる。組成物中に１つより多いコンジュゲートが存在する場合、すべてのコンジュゲートを吸着させる必要はない。
【００７７】
Ｂ．油エマルジョン
本発明においてアジュバントとしての使用に適している油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えば、ＭＦ５９［参考文献１３の第１０章；参考文献１４もまた参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用して１ミクロン未満の粒子になるように処方された、５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０、および０．５％のＳｐａｎ ８５）が挙げられる。完全なフロイトのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全なフロイトのアジュバント（ＩＦＡ）もまた使用される場合がある。
【００７８】
様々な水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、これらには、典型的には、少なくとも１種類の油、および少なくとも１種類の界面活性剤が含まれ、この油（単数または複数）および界面活性剤（単数または複数）は、生体分解性（代謝可能）であり、かつ生体適合性である。エマルジョンの中の油滴は、一般的には、５μｍ未満の直径であり、理想的には１ミクロン未満の直径であり、これらの小さい大きさは、安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーを用いて得ることができる。２２０ｎｍ未満の大きさの液滴が好ましい。なぜなら、これらは、濾過滅菌を行うことができるからである。
【００７９】
エマルジョンには、油、例えば、動物（例えば、魚）を供給源とするものまたは植物を供給源とするものが含まれ得る。植物油についての供給源としては、堅果、種子および穀粒が挙げられる。ピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、小麦、オート麦、ライ麦、米、テフ、ライ小麦などのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６個〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油の中には自然界においては存在しないが、堅果油および種子油由来の適切な出発材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳汁由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な、分離、精製、鹸化、および他の手段についての手順は当該分野で周知である。ほとんどの魚には、容易に回収することができる代謝可能な油が含まれている。例えば、タラの肝油、サメの肝油、およびクジラの油（例えば、鯨ろう）が、本明細書中で使用することができる魚の油のいくつかの例である。多数の分枝鎖の油が、５個の炭素のイソプレン単位で生化学的に合成され、これは、一般的には、テルペノイドと呼ばれる。サメの肝油には、スクアレンとして知られている、分枝不飽和テルペノイドである、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン（これは、本明細書中では特に好ましい）が含まれる。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）もまた好ましい油である。スクアレンとスクアランを含む魚の油は、商業的な供給業者から容易に入手することができ、また、当該分野で公知の方法によって得ることもできる。他の好ましい油はトコフェロールである（下記を参照のこと）。油の混合物を使用することができる。
【００８０】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、例えば、少なくとも１５、例えば、少なくとも１６のＨＬＢを持つ。本発明は、以下を含むがこれらに限定されない界面活性剤とともに使用することができる：ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎｓと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商標名で販売されている、エチレンオキサイド（ＥＯ）、プロピレンオキサイド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキサイド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；オクトキシノール（これは、エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰り返し回数が様々であり得、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびに、ソルビタンエステル（ＳＰＡＮとして一般的に知られている）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョンを含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。
【００８１】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））との組み合わせもまた適している。別の有用な組み合わせには、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステル、および／またはオクトキシノールが含まれる。
【００８２】
界面活性剤（重量％）の好ましい量は以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）０．０１％〜１％、特に、約０．１％；オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）０．００１％〜０．１％、特に、０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％〜２０％、例えば、０．１％〜１０％、および特に、０．１％〜１％、または約０．５％。
【００８３】
好ましいエマルジョンアジュバントは、＜１μｍの平均の液滴の大きさを持ち、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、またはそれ未満である。これらの液滴の大きさは、マイクロフルイダイゼーションのような技術によって簡単に得ることができる。
【００８４】
本発明に有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５の１ミクロン未満のエマルジョン。このエマルジョンの組成は、体積で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比率は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、参考文献１８の第１０章および参考文献１９の第１２章にさらに詳細に記載されているように、「ＭＦ５９」として知られている［１５〜１７］。ＭＦ５９エマルジョンには、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファーが含まれることが有利である。
【００８５】
・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）のエマルジョン。エマルジョンには、リン酸緩衝化生理食塩水が含まれ得る。これにはまた、Ｓｐａｎ ８５（例えば、１％）および／またはレシチンも含まれ得る。これらのエマルジョンは、２％〜１０％のスクアレン、２％〜１０％のトコフェロール、および０．３％〜３％のＴｗｅｅｎ ８０が含まれ得、そしてスクアレン：トコフェロールの重量比は、典型的には、≦１である。なぜなら、これによってより安定なエマルジョンが提供されるからである。スクアレンとＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の体積比または約１１：５の重量比で存在し得る。１つのそのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ ８０を溶解させて、２％の溶液とし、その後、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、その後、この混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られるエマルジョンは、１ミクロン未満の油滴を有し得、例えば、１００ｎｍ〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有し得る。エマルジョンはまた、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ−ＭＰＬ）も包含しうる。この種の別の有用なエマルジョンは、ヒトへの投与１回当たり、０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含みうる［２０］。
【００８６】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）もまた含まれ得る。このエマルジョンには、リン酸塩バッファーが含まれる場合がある。
【００８７】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。エマルジョンには、これらの３種類の成分が、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）が含まれ得、そしてこれらの濃度には、抗原に由来するこれらの成分の任意の寄与が含まれるはずである。このエマルジョンにはまた、スクアレンも含まれる場合がある。このエマルジョンにはまた、３ｄ−ＭＰＬも含まれ得る（下記を参照のこと）。水相には、リン酸塩バッファーが含まれ得る。
【００８８】
・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）の中に処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達媒体であり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてはスレオニル−ＭＤＰとともに使用されている［２１］（０．０５％〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。これはまた、「ＡＦ」アジュバントと同様に、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用することもできる［２２］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【００８９】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル、例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ ８０」）を含むエマルジョン。このエマルジョンは、一般的に熱可逆性であり、そして／または、２００ｎｍ未満の大きさを持つ油滴を少なくとも９０％（体積で）含む［２３］。このエマルジョンにはまた、アルジトール；凍結防止剤（例えば、糖、例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロース）；および／またはアルキルポリグリコシドの１つ以上が含まれ得る。このエマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［２４］。そのようなエマルジョンは凍結乾燥させられ得る。
【００９０】
・スクアレン、ポロキサマー１０５、およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［２５］。アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチン中でのこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％のスクアレン、４％のポロキサマー１０５（プルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ））、および２％のＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（Ｂｉｓ−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【００９１】
・０．５％〜５０％の油、０．１％〜１０％のリン脂質、および０．０５％〜５％の非イオン性界面活性剤を含むエマルジョン。参考文献２６に記載されているように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。１ミクロン未満の液滴の大きさが有利である。
【００９２】
・代謝不可能な油（例えば、軽鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１種類の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ
８０）の１ミクロン未満の水中油型エマルジョン。添加物，例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−脂質親和性結合体（例えば、参考文献２７に記載されている、グルクロン酸のカルボキシル基を介するデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって得られるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが含まれ得る。
【００９３】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がへリックスミセルとして会合しているエマルジョン［２８］。
【００９４】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２９］。
【００９５】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２９］。
【００９６】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは、送達時に、即座に抗原と混合することができ、したがって、アジュバントと抗原は、使用時の最終的な処方の準備として、パッケージされたワクチンまたは分配されたワクチンの中に別々に保たれ得る。他の実施形態では、エマルジョンは、製造の際に抗原と混合され、したがって、組成物は、液体のアジュバント添加された形態でパッケージされる。抗原は、一般的には、ワクチンが２種類の液体を混合することによって最終的に調製されるように、水性の形態であろう。混合される２種類の液体の体積比は様々であり得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般的には、約１：１である。成分の濃度が特定のエマルジョンについての上記の記載の中にある場合には、これらの濃度は、典型的には、未希釈の組成物についての濃度であり、したがって、抗原溶液との混合後の濃度は下がるであろう。
【００９７】
組成物にトコフェロールが含まれる場合は、α、β、γ、δ、ε、またはζのいずれのトコフェロールも使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、様々な塩および／または異性体）をとることができる。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールのいずれを使用することもできる。トコフェロールは、高齢のヒト（例えば、６０歳以上）に使用されるワクチンに含められることが有利である。なぜなら、ビタミンＥが、この患者のグループにおいて免疫応答に対してポジティブな影響を有することが報告されているからである［３０］。これらはまた、エマルジョンの安定化を助けることができる、抗酸化特性も持つ［３１］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩はコハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協働することが明らかにされている。
【００９８】
Ｃ．サポニン処方物［参考文献１３の第２２章］
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用することができる。サポニンは、多種多様な植物種の樹皮、葉、茎、根、およびさらには花でも見られる、ステロールグリコシドとトリテルペノイドグリコシドの不均質なグループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルヴェール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））由来のサポニンはまた、商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント処方物には、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）、ならびに、脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が含まれる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）として販売されている。
【００９９】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含む、これらの技術を使用した特異的な精製された画分が同定されている。一部の場合において、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は、参考文献３２に開示されている。サポニン処方物にはまた、コレステロールのようなステロールも含まれ得る［３３］。
【０１００】
サポニンとコレステロールの組み合わせを、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる特有の粒子を形成させるために使用することができる［参考文献１３の第２３章］。ＩＳＣＯＭにはまた、典型的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）も含まれる。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭの中で使用することができる。一部の実施形態において、ＩＳＣＯＭには、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ、およびＱＨＣの１つ以上が含まれる。ＩＳＣＯＭについては、参考文献３３〜３５の中でさらに記載されている。状況に応じて、ＩＳＣＯＭＳには、追加の界面活性剤は含まれない場合がある［３６］。
【０１０１】
サポニン系のアジュバントの開発についての概要は、参考文献３７および３８の中で見ることができる。
【０１０２】
Ｄ．ヴィロソームおよびウイルス様粒子
ヴィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においては、アジュバントとして使用することができる。これらの構造には、一般的には、状況に応じてリン脂質と組み合わされたか、またはリン脂質と一緒に処方された、ウイルスに由来する１種類以上の種類のタンパク質が含まれる。これらは、一般的には、非病原性、非複製性であり、一般的には、天然のウイルスゲノムは全く含まれない。ウイルスタンパク質は、組み換えによって生産することができ、また、完全なウイルスから単離することもできる。ヴィロソームまたはＶＬＰにおける使用に適しているこれらのウイルスタンパク質としては、以下に由来するタンパク質が挙げられる：インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（例えば、外被タンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）。ＶＬＰは、参考文献３９〜４４の中でさらに議論されている。ヴィロソームは、例えば、参考文献４５の中でさらに議論されている。
【０１０３】
Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド、およびＡＤＰ−リボシル化毒素、ならびにそれらの無毒化誘導体が挙げられる。
【０１０４】
ＬＰＳの非毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３ ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）の、４、５、または６のアシル化された鎖を有するものの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」の形態は、参考文献４６に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小さい粒子」は、０．２２μｍの膜を通して濾過滅菌するためには十分に小さい［４６］。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）が挙げられる［４７、４８］。
【０１０５】
リピドＡ誘導体には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４が含まれる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献４９および５０に記載されている。
【０１０６】
本発明においてアジュバントとしての使用に適している免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列（グアノシンに結合させられたホスフェートによって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡ、およびパリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１０７】
ＣｐＧ’には、ホスホロチオエート修飾のようなヌクレオチドの修飾／アナログが含まれ得、そしてこれは、二本鎖であってもまた一本鎖であってもよい。参考文献５１、５２、および５３には、可能なアナログでの置換、例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献５４〜５９の中でさらに議論されている。
【０１０８】
ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）に特異的であり得る［６０］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのように、Ｔｈ１免疫応答を誘導することについて特異的である場合があり、また、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのように、Ｂ細胞応答を誘導することについてより特異的である場合もある。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮとＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献６１〜６３で議論されている。一部の実施形態において、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【０１０９】
他の実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために利用しやすいように構築される。状況に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、「イムノマー」を形成させるために、それらの３’末端に結合させることができる。例えば、参考文献６０、および６４〜６６を参照のこと。
【０１１０】
有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、これは、ＰｒｏＭｕｎｅ（商標）（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知である。別のものはＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列を使用する代わりに、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列を使用することができ［６７］、そしてこれらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激性オリゴヌクレオチドには、ピリミジンが多く含まれる場合がある。例えば、これには、２つ以上の連続するチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献６７に開示されているように、ＴＴＴＴ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。例えば、これには、２つ以上の連続するシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献６７に開示されているように、ＣＣＣＣ）が含まれ得、そして／またはこれは、＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を含むヌクレオチド組成を持ち得る。これらのオリゴヌクレオチドには、メチル化されていないＣｐＧモチーフは含まれない場合がある。免疫刺激オリゴヌクレオチドには、典型的には、少なくとも２０個のヌクレオチドが含まれるであろう。これらには、１００個未満のヌクレオチドが含まれ得る。
【０１１１】
免疫刺激オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として知られている［６８］。したがって、本発明とともに使用されるアジュバントには、以下の混合物が含まれ得る：（ｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、ジヌクレオチドを形成させるためにイノシンに連結させられたシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの間）、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの（および好ましくは、複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（単数または複数）を含むオリゴペプチド（例えば、５アミノ酸〜２０アミノ酸の間）のようなポリカチオン性ポリマー。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号４２７）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオン性ポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号４２６）を含むペプチドであり得る。オリゴヌクレオチドおよびポリマーは、例えば、参考文献６９および７０で開示されている複合体を形成しうる。
【０１１２】
細菌のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体を、本発明においてアジュバントとして使用することができる。一部の実施形態において、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性腸毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。無毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献７１に記載されており、そして非経口アジュバントとしての使用は参考文献７２に記載されている。毒素または類毒素は、典型的にはホロ毒素の形態であり、これには、ＡサブユニットとＢサブユニットの両方が含まれる。一部の実施形態において、Ａサブユニットには、無毒化変異が含まれ、しばしばＢサブユニットは変異していない。一部の実施形態において、アジュバントは、無毒化されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２である。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、参考文献７３〜８０の中で見ることができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［８１］。アミノ酸の置換についての数字での言及は、典型的には、その全体が引用により具体的に本明細書中に組み入れられる、参考文献８２に示されるＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１１３】
Ｆ．ヒトの免疫調節因子
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているヒトの免疫調節因子としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［８３］など）［８４］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節因子はＩＬ−１２である。
【０１１４】
Ｇ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［８５］、または粘膜接着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライド、およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る［８６］。
【０１１５】
Ｈ．マイクロ粒子
マイクロ粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生体分解性であり、かつ非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とともに形成させられるマイクロ粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、一部の実施形態において、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、例えば直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、状況に応じて、負に荷電した表面を持つように（例えば、ＳＤＳで）処理されるか、または正に荷電した表面を持つように（例えば、陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）処理される。
【０１１６】
Ｉ．リポソーム（参考文献１３の第１３章および第１４章）
アジュバントとしての使用に適しているリポソーム処方物の例は、参考文献８７〜８９に記載されている。
【０１１７】
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルの処方物
本発明での使用に適しているアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［９０］。そのような処方物としては、さらに、オクトキシノールと組み合わせられたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［９１］、ならびに少なくとも一種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせられたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［９２］が挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１１８】
Ｋ．ホスファゼン
例えば、参考文献９３および９４に記載されているホスファゼン｛例えば、ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）｝を使用することができる。
【０１１９】
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１２０】
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明においてアジュバントとしての使用に適しているイミダゾキノロン化合物の例としては、イミキモド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８３７」）［９５、９６］、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［９７］、およびそれらのアナログ、ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）が挙げられる。免疫刺激性のイミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献９８〜１０２の中で見ることができる。
【０１２１】
Ｎ．置換された尿素
アジュバントとして有用な置換された尿素としては、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ
８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ ８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、「ＥＲ ８０３０２２」、または「ＥＲ ８０４０５７」のような、参考文献１０３において定義されているような、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、あるいはそれらの塩が挙げられ：
【０１２２】
【化１】
例えば、以下である：
【０１２３】
【化２】
Ｏ．さらなるアジュバント
本発明とともに使用することができるさらなるアジュバントとしては、以下が挙げられる：
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９［１０４、１０５］。
【０１２４】
・参考文献１０６の中で開示されているもののような、チオセミカルバゾン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１０６の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１２５】
・参考文献１０７に開示されているもののような、トリプタントリン化合物。活性化合物を処方する、製造する、およびスクリーニングする方法もまた、参考文献１０７の中で記載されている。チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生産のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に特に有効である。
【０１２６】
・以下のようなヌクレオシドアナログ：（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１２７】
【化３】
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１０８〜１１１に開示されている化合物ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１１１］。
【０１２８】
・以下を含む、参考文献１１２に開示されている化合物：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１１３、１１４］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１１５］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物およびベンザゾール化合物［１１６］。
【０１２９】
・ホスフェートを含む非環式骨格に対して連結させられた脂質を含む化合物（例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４）［１１７、１１８］：
・ポリオキシドニウムポリマー［１１９、１２０］または他のＮ−酸化ポリエチレンピペラジン誘導体。
【０１３０】
・メチルイノシン５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［１２１］。
【０１３１】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１２２］あるいはその薬学的に許容される塩または誘導体、例えば、以下の式を持つもの：
【０１３２】
【化４】
式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝鎖である、非置換または置換の、飽和したまたは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群より選択される。例として以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなど。
【０１３３】
・ＣＤ１ｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１２３〜１３０］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
【０１３４】
・γイヌリン［１３１］またはその誘導体、例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ）。
【０１３５】
【化５】
アジュバントの組み合わせ
本発明にはまた、上記で同定されたアジュバントの１つ以上の組み合わせが含まれる場合もある。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用することができる：（１）サポニンと水中油型エマルジョン［１３２］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１３３］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（状況に応じて＋ステロール）［１３４］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［１３５］；（６）１０％のスクアラン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０（商標）、５％のプルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ（１ミクロン未満のエマルジョンになるようにマイクロフルイダイズされるか、またはより大きな粒子サイズのエマルジョンが生じるようにボルテックスされるかのいずれか）；（７）２％のスクアレン、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０、ならびにモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１種類以上の細菌細胞壁成分を含む、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１種類以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
【０１３６】
免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献１３の第７章に開示されている。
【０１３７】
水酸化アルミニウムアジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用が典型的であり、抗原は、一般的には、これらの塩に吸着される。リン酸カルシウムが別の典型的なアジュバントである。他のアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントとの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとａｌｕｍ、またはレシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とａｌｕｍの組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを使用することができる。
【０１３８】
本発明の組成物は、細胞に媒介される免疫応答と、体液性の免疫応答の両方を誘発することができる。この免疫応答は、長期間持続する（例えば、中和）抗体、および肺炎球菌に曝されると直ちに反応することができる細胞に媒介される免疫を誘導し得る。
【０１３９】
Ｔ細胞の２つのタイプ（ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞）は、一般的には、細胞媒介性の免疫と体液性免疫を開始および／または増大させるために必要であると考えられている。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現することができ、一般的には、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれている。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識するか、またはそれと相互作用することができる。
【０１４０】
ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現することができ、一般的には、Ｔへルパー細胞と呼ばれている。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原性ペプチドを認識することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌することができる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、および免疫応答に関与している他の細胞を活性化させることができる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、さらに、それらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なる、以下のような２種類の機能的に異なるサブセットに分類することができる：ＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型。
【０１４１】
活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫（抗原特異的ＣＴＬの生産の増大を含む）を増強し、したがって、細胞内感染に応答することにおいて特に有用である。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−βの１つ以上を分泌することができる。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化させることによって、局所炎症反応を生じ得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２でＢ細胞およびＴ細胞の増殖を刺激することによって、免疫応答を拡大させるようにも作用し得る。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
【０１４２】
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体の生産を増強させ、したがって、細胞外感染に応答することにおいて有用である。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０の１つ以上を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答によっては、さらなる防御のための、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産が生じ得る。
【０１４３】
増強された免疫応答には、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答の１つ以上が含まれ得る。
【０１４４】
ＴＨ１免疫応答には、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−β）の１つ以上の増加、活性化されたマクロファージの増加、ＮＫ活性の増大、あるいはＩｇＧ２ａの生産の増大の１つ以上が含まれ得る。一部の実施形態において、増強されたＴＨ１免疫応答には、ＩｇＧ２ａの生産の増大が含まれるであろう。
【０１４５】
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比較して、ＩｇＧ２ａの生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ１アジュバントとしては、例えば、サポニン処方物、ヴィロソーム、およびウイルス様粒子、腸内細菌のリポ多糖体（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドが挙げられ得る。免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド）が、本発明での使用において典型的なＴＨ１アジュバントである。
【０１４６】
ＴＨ２免疫応答には、ＴＨ２免疫応答と関係があるサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）の１つ以上の増加、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびメモリーＢ細胞の生産の増大の１つ以上が含まれ得る。一部の実施形態において、増強されたＴＨ２免疫応答には、ＩｇＧ１の生産の増大が含まれるであろう。
【０１４７】
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的には、アジュバントを用いない抗原の免疫化と比較して、ＩｇＧ１の生産レベルの増大を誘発するであろう。本発明での使用に適しているＴＨ２アジュバントとしては、例えば、無機物を含む組成物、オイルエマルジョン、ならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその無毒化誘導体が挙げられ得る。無機物を含む組成物（例えば、アルミニウム塩）が、本発明での使用において典型的なＴＨ２アジュバントである。
【０１４８】
一部の実施形態において、本発明に、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物が含まれる。しばしば、そのような組成物は、増強されたＴＨ１応答と増強されたＴＨ２応答を誘発する、すなわち、アジュバントを用いない免疫化と比較して、ＩｇＧ１の生産とＩｇＧ２ａの生産の両方の増大を誘発する。一般的には、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一のアジュバントでの免疫化と比較して（すなわち、ＴＨ１アジュバントだけでの免疫化、またはＴＨ２アジュバントだけでの免疫化と比較して）、ＴＨ１免疫応答の増大および／またはＴＨ２免疫応答の増大を誘発する。
【０１４９】
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であり得る。免疫応答により、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答の一方または両方が提供され得る。
【０１５０】
増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。免疫応答により、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜免疫応答の一方または両方が提供され得る。典型的には、粘膜免疫応答はＴＨ２免疫応答である。典型的には、粘膜免疫応答には、ＩｇＡの生産の増大が含まれる。
【０１５１】
上記組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射前の、液体媒体中の溶液または懸濁液に適している固体形態（例えば、凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）もまた、調製することができる。組成物は、局所投与のために、例えば、軟膏、クリーム剤、または散剤として調製される場合もある。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤またはカプセル剤として、噴霧剤として、あるいはシロップ剤として（状況に応じて、香味づけされたもの）調製される場合もある。組成物は、肺投与のために、例えば、微粉末を使用する吸入剤または噴霧剤として、調製される場合もある。組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製される場合もある。組成物は、鼻腔内投与、耳投与、または眼投与のために、例えば、滴剤として調製され得る。組成物は、組み合わせられた組成物が哺乳動物への投与の直前に再構成されるように設計された、キットの形態であり得る。そのようなキットには、液体形態の中にある１つ以上の抗原と、１つ以上の凍結乾燥させられた抗原とが含まれる場合がある。
【０１５２】
組成物が、使用前に即座に調製され（例えば、１種類の成分が凍結乾燥させられた形態で存在する場合）、そしてキットとして提示される場合には、このキットには２つのバイアルが含まれるか、または、キットには、１つの既に充填された注射器と１つのバイアルが含まれ、ここで、注射器の内容物は、注射前にバイアルの内容物を再度活性化させるために使用される場合もある。
【０１５３】
ワクチンとして使用される組成物には、免疫学的有効量の抗原（単数または複数）、ならびに、任意の他の成分が必要に応じて含まれる。「免疫学的有効量」によっては、単回用量または一連のものの一部としてのいずれかでの個体へのその量の投与が、処置または予防に有効であることが意味される。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状況についての処置を行う医師による評価、および他の関連する要因に応じて様々である。この量は、日常的に行われている試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に入るであろうと予想される。組成物中に１つより多い抗原を含ませる場合は、２つの抗原は、互いと同じ用量で存在させることもでき、異なる用量で存在させることもできる。
【０１５４】
上記の通り、組成物は、温度保護剤を包含する場合があるが、この成分は、アジュバント組成物（特に、アルミニウム塩など、鉱物アジュバントを含有する組成物）において特に有用でありうる。参考文献１３６に記載されている通り、液体の温度保護剤を、水性のワクチン組成物に添加して、その凝固点を低下させる、例えば、凝固点を０℃より下まで低下させることができる。したがって、組成物は０℃より下でも保存しうるが、その凝固点を超えて保存しながら、熱による分解を阻止することもできる。温度保護剤はまた、鉱物塩によるアジュバントが、凍結および融解後に凝結または沈殿しないように保護しながら組成物を凍結させることも可能とし、また、高温、例えば、４０℃を超えた温度で組成物を保護することも可能である。液体の温度保護剤が、最終混合物の容量で１〜８０％を形成するように、水性の出発ワクチン（ｓｔａｒｔｉｎｇ ａｑｕｅｏｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）と液体の温度保護剤とを混合することができる。適切な温度保護剤は、ヒトへの投与に安全であり、水中で容易に混和性／可溶性であるものとし、組成物中の他の成分（例えば、抗原およびアジュバント）を損なわないものとする。例として、グリセリン、プロピレングリコール、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。適切なＰＥＧは、平均分子量が２００〜２０，０００Ｄａの範囲でありうる。一実施形態では、ポリエチレングリコールの平均分子量が、約３００Ｄａ（「ＰＥＧ−３００」）でありうる。
【０１５５】
本発明は、（ｉ）１つ以上の抗原と；（ｉｉ）温度保護剤とを含む組成物を提供する。この組成物は、（ｉ）１つ以上の抗原を含む水性組成物を、（ｉｉ）温度保護剤と混合することにより形成することができる。次いで、混合物を、例えば、０℃より下、０〜２０℃、２０〜３５℃、３５〜５５℃、またはそれを超える温度で保存することができる。混合物は、液体形態で保存することもでき、凍結形態で保存することもできる。混合物は、凍結乾燥させることができる。代替的に、（ｉ）１つ以上の抗原を含む乾燥組成物を、（ｉｉ）温度保護剤を含む液体組成物と混合することによっても組成物を形成することができる。従って、成分（ｉｉ）を用いて、成分（ｉ）を復元することができる。
【０１５６】
（機能的同等物）
上記で説明した、本発明の方法、タンパク質アレイおよび医療上の使用において用い得るＧＡＳ抗原を同定するのに用いられる配列番号は、これらのＧＡＳ抗原の全長配列である。
【０１５７】
本発明の方法、タンパク質アレイおよび医療上の使用は、これらの全長ＧＡＳ抗原の使用に限定されるものではなく、これらのＧＡＳ抗原のうちのいずれかに対する、任意の「機能的同等物」もまた包含する。
【０１５８】
本明細書で用いられる「機能的同等物」という用語は、生物学的試料中に存在する、全長ＧＡＳ抗原に対する抗体と相互作用する能力を保持し、したがって、全長ＧＡＳ抗原の代わりに用い得る、配列表に示される全長配列を有するＧＡＳ抗原の改変体を包含することを意図する。
【０１５９】
したがって、「機能的同等物」という用語は、配列表に示される配列を有する全長ＧＡＳ抗原の断片を包含する。このような断片は、全長ＧＡＳ抗原に結合する抗体に結合する能力を保持しうる。本発明の機能的同等物は、全長ＧＡＳ抗原に対して生成された抗体に、少なくとも１０−７Ｍのアフィニティーで結合しうる。
【０１６０】
断片は、全長ＧＡＳ抗原配列のうち少なくともｎの連続アミノ酸を包含し、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である。断片は、全長ＧＡＳ抗原配列に由来するエピトープを含みうる。さらなる断片は、全長配列のＣ末端に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上の）アミノ酸、および／または全長配列のＮ末端に由来する１もしくは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上の）アミノ酸を欠く場合がある。例えば、本発明の方法およびアレイにおいて用い得る断片には、全長ＧＡＳ抗原において存在するリーダー配列および／または膜貫通配列を欠いている断片が含まれる。
【０１６１】
本発明の方法およびアレイにおいて用い得る断片のさらなる例には、Ｎ末端断片が含まれる。このような断片の例には、配列番号９（これは、配列番号５における配列のＮ末端断片である）に示すアミノ酸配列、ならびに配列番号１０（これは、配列番号４のＮ末端断片である）に示すアミノ酸配列が含まれる。
【０１６２】
「機能的同等物」という用語はまた、アミノ酸置換を有する全長ＧＡＳタンパク質の改変体、ならびにこのような改変体の断片も包含する。改変体は、本明細書に記載の全長ＧＡＳ抗原配列に対して５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有しうる。改変体は、配列表で示されるＧＡＳ抗原配列と比較して保存的なアミノ酸置換を含有しうる。このような置換の典型は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇの間；または芳香環残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間における置換である。
【０１６３】
「機能的同等物」という用語は、ＧＡＳ抗原に化学的または遺伝学的に連結されたさらなる実体を包含する融合タンパク質を含めて、ＧＡＳ抗原のより長鎖の改変体もさらに包含する。例えば、ＧＡＳ抗原を、タンパク質アレイ上においてその位置を特定することを容易にするか、またはそれが抗体に結合した場合の検出を容易にする標識に結合させることができる。このような標識の例には、放射性同位体、蛍光分子、または酵素など、分析により検出可能な試薬が含まれる。代替的に、ＧＡＳ抗原を、ヒスチジンドメインまたはＧＳＴドメインなど、その最初の精製を容易にするドメインに融合させることもできる。
【０１６４】
「機能的同等物」という用語はまた、ＧＡＳ抗原と構造的に類似し、全長ＧＡＳ抗原に対する抗体に結合する能力を保持する、上記で説明したＧＡＳ抗原の模倣体、改変体、および断片も包含する。
【０１６５】
（一般）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘだけからなる場合もあり、さらなる何かを包含する場合、例えば、Ｘ＋Ｙである場合もある。
【０１６６】
「実質的に」という語は、「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略することができる。
【０１６７】
数値ｘとの関連における「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１６８】
別段に言明しない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む過程は、特定の混合順序を要求しない。したがって、成分は、任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いと混合し、次いで、この混合物を、第３の成分などと混合することができる。
【０１６９】
ポリペプチド配列間における同一性は、ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長ペナルティー＝１というパラメータを伴う、アファインギャップ検索を用いる、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）内に実装されているＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、血清が回収された、リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を有する患者、およびイエメン人健常血液ドナー（ＹＨＤ）の年齢分布を示す図である。研究のために選択された、年齢を適合させた血清試料を示す。
【図２Ａ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図２Ｂ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図２Ｃ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図２Ｄ】図２は、タンパク質マイクロアレイの構成および検証を示す図である。Ａ：クーマシーにより染色された精製組換えＧＡＳタンパク質についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。分子量マーカーをレーン１に示す。Ｂ：ヒト血清と共にインキュベートし、Ｃｙ３標識抗ヒトＩｇＧおよびＣｙ５標識抗ヒトＩｇＭと共にインキュベートした後のチップについての代表的な画像である。多連にわたる試験抗原、ならびにＩｇＧおよびＩｇＭによる陰性対照および陽性対照を強調して示す。Ｃ：ヒトＩｇＧ対照曲線についてのグラフ表示である。抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ３と共にインキュベートすることにより明らかとなる、異なるＩｇＧ濃度に対するチップ画像を、グラフの下方に示す。Ｄ：Ｓ字型曲線により導出されるデータ正規化法について示す図である。参照Ｓ字型曲線（赤色；ｉｄ：理想型のＳ字型曲線）に調整したＳ字型対照曲線（黒色）を用いて、データを正規化する；ＰおよびＰ’：実験によるＳ字型曲線および参照Ｓ字型曲線上における非正規化ＭＦＩ値の交点Ｖａｌおよび正規化ＭＦＩ値の交点Ｎ（Ｖａｌ）；ＨＬ：３０，０００の正規化ＭＦＩ値に対応する値；ＬＬは、１５，０００の正規化ＭＦＩ値である。
【図３】図３は、ＧＡＳ抗原に対して高い反応（ＭＦＩ＞３００００）を示す、イエメン人（Ｙｅｍｉｎｉｔｅ）健常ドナーによる血清およびイタリア人健常ドナーによる血清の百分率を示す図である。反応の降順で抗原を表わす。
【図４−１】図４は、年齢を適合させて選択したヒト血清であるＹＨＤ血清４０例（図４における濃いグレー）およびＲＨＤ血清４３例（図４における薄いグレー）の免疫反応性の比較を示す図である。２つの血清群の抗原認識パターンを規定するため、正規化ＦＩ（ＭＦＩ）値を、専用ソフトウェア（ＴＩＧＲ Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ））を用いる目的変数なしの二次元階層クラスタリングにかけ、その結果として、高度に認識された抗原の２つの主要な群（図４Ａにおける、また、図４Ｂにも示される、群１および群２）が同定された。このクラスタリング解析により、血清が高い反応性（左側）〜低い反応性（右側）に区分された。主に健常ドナーに由来する血清を含む高反応性群（図４左側のＡ）、および低い反応性を示し、主にＲＨＤ患者に由来する血清を含む第２の群（図４の群Ｂ）の２つの主要な血清群を識別しうる。
【図４−２】図４は、年齢を適合させて選択したヒト血清であるＹＨＤ血清４０例（図４における濃いグレー）およびＲＨＤ血清４３例（図４における薄いグレー）の免疫反応性の比較を示す図である。２つの血清群の抗原認識パターンを規定するため、正規化ＦＩ（ＭＦＩ）値を、専用ソフトウェア（ＴＩＧＲ Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ））を用いる目的変数なしの二次元階層クラスタリングにかけ、その結果として、高度に認識された抗原の２つの主要な群（図４Ａにおける、また、図４Ｂにも示される、群１および群２）が同定された。このクラスタリング解析により、血清が高い反応性（左側）〜低い反応性（右側）に区分された。主に健常ドナーに由来する血清を含む高反応性群（図４左側のＡ）、および低い反応性を示し、主にＲＨＤ患者に由来する血清を含む第２の群（図４の群Ｂ）の２つの主要な血清群を識別しうる。
【図５−１】図５は、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（ＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均によるクラスター解析を適用したことを示す図である。同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤを含んだことから、ある抗原群がチップに存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【図５−２】図５は、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（ＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均によるクラスター解析を適用したことを示す図である。同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤを含んだことから、ある抗原群がチップに存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【図５−３】図５は、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（ＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均によるクラスター解析を適用したことを示す図である。同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤを含んだことから、ある抗原群がチップに存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【図６】図６は、健常者とＲＨＤ患者とを識別することを可能にする、抗原クラスターの同定を示す図である。一次元階層クラスタリング解析を用いて、図６のＫＡ１クラスターに由来する血清を、それらの認識プロファイルに基づき、異なる抗原群へとさらに分類したところ、２つの血清クラスターであるＨＳ１（紫色のボックス）およびＨＳ２（青色のボックス）を定義することが可能となった。２つのクラスターの各々において存在するかまた存在しない健常血清および患者血清の数を、図６Ｂで報告する。ＹＨＤの大半が、反応性が高い青色のＨＳ２クラスターにおいて見出されうるのに対し、ＲＨＤ血清の大半は、反応性が低い紫色のＨＳ１クラスターにおいて見出される。この種の検査を用いて、２つの血清集団を識別する能力を、特異度および感度の点で規定した（図６Ｃ）。この具体的な抗原群については、０．７３および０．６９の特異度値および感度値が得られた。図６Ｃはまた、特異度および感度を最大とする（値を１とする）理論的理想型の例も示す。
【図７−１】図７は、図６で説明した解析を、他の抗原クラスター：ＫＡ５（Ｂ）、ＫＡ９（Ｃ）、ＫＡ１０（Ｄ）、ＫＡ５＋Ｍ９（Ｅ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０（Ｆ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｇ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｈ）、ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｉ）にも適用した。特異度値および感度値を、各クラスターについて示す。
【図７−２】図７は、図６で説明した解析を、他の抗原クラスター：ＫＡ５（Ｂ）、ＫＡ９（Ｃ）、ＫＡ１０（Ｄ）、ＫＡ５＋Ｍ９（Ｅ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０（Ｆ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｇ）、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｈ）、ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７（Ｉ）にも適用した。特異度値および感度値を、各クラスターについて示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
序論
本発明者らは、１３０の組換えＧＡＳタンパク質抗原を含有するタンパク質マイクロアレイを開発した。該チップは、咽頭炎患者において高度な抗体反応を誘発する抗原を選択するための器具であったが、また、チック病を有する患者に由来する血清中のＧＡＳ抗原に対する高度の反応を明らかにすることも可能とし、感受性の個体における、ＧＡＳ抗原に依存する自己抗体の誘導が、チック障害の発症に関与しうることを強力に裏付けた（Ｂｏｍｂａｃｉ Ｍら、２００９年、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、４巻、７頁：ｅ６３３２．ｄｏｉ：１０．１３７１）。
【０１７２】
本明細書において、本発明者らは、このタンパク質マイクロアレイを用いて、ＲＨＤ患者および健常ドナーにおいて、この２つの集団を識別することを可能とする抗原認識パターンを同定することを目的として、１３０の組換えＧＡＳタンパク質に対する免疫反応を解析した。この手法により、健常ドナーには高度に認識されるが、ＲＨＤ患者には高度には認識されない抗原クラスターが同定されたが、これにより、診断検査のための基礎を確定することができる。
【０１７３】
材料と方法
ヒト血清
リウマチ性心疾患患者の血清は、ＲＨＤの臨床症状を示す、出身が中東地域の国（イエメン）である１１〜４０歳の男性患者または女性患者６０人から回収した。
【０１７４】
抗ＧＡＳ抗体力価は、年齢および地理的な出自を含めたいくつかの因子により変化することが公知である。実際、健常者における抗ＧＡＳ抗体力価は、小児早期において低く、５〜１５歳の小児においてピークまで上昇し、青年後期および成人早期において低下し、次いで、それ以後は一定となる。この理由で、同じ年齢範囲（１７〜４０歳）の群を用いてリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）血清群と対照のイエメン人健常ドナー（ＹＨＤ）群との比較を実施したが、このため、対照の血清が入手できなかった１１〜１６歳のＲＨＤ患者の血清は除外した。この比較で用いた最終的な血清数はＹＨＤ群が４０例およびＲＨＤが４３例であった。
【０１７５】
図１は、入手可能な２つの集団および本研究のために選択した集団についての分布解析を示す。
【０１７６】
加えて、かつての西欧人口において、ＧＡＳ感染に対する抗生剤予防がより高度に用いられたことを考慮に入れ、イタリア人健常ドナー（ＩＨＤ）から回収した血清２０例を、健常イエメン人とのさらなる比較のために用いた。
【０１７７】
すべての血清試料は、ＲＨＤの診断または瀉血のための日常的な医療管理の過程で得られた残余物であり、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ ａｎｄ Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｌａ Ｓａｐｉｅｎｚａ、Ｒｏｍｅにより利用可能とされたものであった。
【０１７８】
ＧＡＳタンパク質マイクロアレイ
主にＧＡＳ ＳＦ３７０ Ｍ１ゲノムから選択された１３０の組換えタンパク質をニトロセルロースチップ上に沈着させることにより、タンパク質アレイを生成させた（チップセットアップの詳細については、図２を参照されたい）。
【０１７９】
チップを、異なる血清と共にインキュベートし、沈着させた各タンパク質に結合した全ＩｇＧを、蛍光標識した抗ヒトＩｇＧで検出し、結果として得られる蛍光強度（ＦＩ）値を測定することにより、反応性を評価した。各スライドについて、基準曲線として用いる、Ｓ字型に調整した標準ＩｇＧ曲線との対比で、タンパク質のＭＦＩ値を正規化した（図２）。
【０１８０】
ＭＦＩ値が、バックグラウンド値に標準偏差の２倍を加えた値に対応する１５，０００以上である場合に、被験血清による抗原認識を陽性とみなした。ＭＦＩ値が３０，０００以上である場合を、高度な反応とみなした。患者に由来する血清１２０例（イタリア人健常ドナー（ＩＨＤ）による血清２０例、イエメン人健常ドナー（ＹＨＤ）による血清４０例、およびイエメン人ＲＨＤ患者（ＲＨＤ）による血清６０例）により、アレイをプローブした。
【０１８１】
結果
健常ドナーに由来する血清によって認識されるＧＡＳ抗原：抗体反応はイタリア人よりイエメン人において高度である
イエメン人健常血液ドナーに由来する血清４０例およびイタリア人健常ドナーに由来する血清２０例を用いて、２つの異なる地域に属する集団における抗ＧＡＳ抗体反応を調査した。図３は、ＧＡＳ抗原に対する反応が高度な健常ドナー血清の百分率を報告する。示される通り、バックグラウンドの抗連鎖球菌属抗体反応は、高度に認識された抗原の数の点でも、高度に陽性な血清の数の点でも、イタリア人試料よりイエメン人試料においてはるかに高度である。
【０１８２】
健常イエメン人とイエメン人ＲＨＤ患者とで示差的なＧＡＳ抗原の免疫反応
本発明者らは、年齢を適合させて選択したヒト血清であるＹＨＤ血清４０例（図４における濃いグレー）およびＲＨＤ血清４３例（図４における薄いグレー）の免疫反応性を比較した。２つの血清群の抗原認識パターンを規定するため、正規化ＦＩ（ＭＦＩ）値を、専用ソフトウェア（ＴＩＧＲ Ｍｕｌｔｉｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ（ＭｅＶ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｔｍ４／ｍｅｖ．ｈｔｍｌ））を用いる目的変数なしの（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）二次元階層クラスタリングにかけた。
【０１８３】
抗体による認識プロファイルをクラスタリングして検査することにより、高度に認識された抗原の２つの主要な群（図４における群１および群２）が同定された。群１には、ＧＡＳ５Ｆ（分泌タンパク質と推定される）、ＧＡＳ２５（ストレプトリシンＯ前駆体）、ＧＡＳ４０（表面排除タンパク質と推定される）、Ｍ１、ＧＡＳ１７９（エステラーゼと推定される）、ＧＡＳ９７（免疫原性の分泌タンパク質前駆体の相同体）、ＧＡＳ１９３（免疫原性の分泌タンパク質前駆体）が含まれた。群２には、５つの異なるＭタンパク質（Ｍ１２、Ｍ２３、Ｍ２、Ｍ３、およびＭ９）、ＧＡＳ５７（細胞エンベローププロテイナーゼと推定される）、ＧＡＳ３８０（仮説的タンパク質）、およびＳｐｅＩが含まれた。
【０１８４】
さらに、図４に示す通り、このクラスタリング解析により、血清が、高い反応性（左側）〜低い反応性（右側）に区分された。実際、主に健常ドナーに由来する血清を含む高反応性群（図４左側のＡ）、および低い反応性を示し、主にＲＨＤ患者に由来する血清が含まれる第２の群（図４の群Ｂ）の２つの主要な血清群を識別しうる。
【０１８５】
次いで、本発明者らは、チップ内に存在するＧＡＳ抗原を、同様の認識パターンを引き出す１０のクラスター（図５のＫＡ１〜ＫＡ１０）に分類する目的で、Ｋ平均（ｋ−ｍｅａｎ）によるクラスター解析を適用した。ｋ平均によるクラスタリングとは、平均が最も近接するクラスターに各観察が属するｋ個のクラスターへと、ｎ個の観察を分割することを目的とする統計的方法である。それらがいずれもデータ中の天然クラスター（ｎａｔｕｒａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ）の中心を見出そうと試みる点で、ｋ平均によるクラスタリングは、ガウスの混合（ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ Ｇａｕｓｓｉａｎｓ）についての期待値最大化アルゴリズムと類似する。
【０１８６】
図５に示す通り、同定された抗原クラスターのうちの４つ（番号ＫＡ１、ＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０）が含有する抗原の蛍光値は、残りのクラスターが含有する抗原の蛍光値より高かった。クラスタリングは、一次元的であった、すなわち、抗原の分類について意図するものであり、血清の分類について意図するものではなかったが、クラスターＫＡ１において、最も反応性の高い血清が、大多数のＹＨＤ血清を含むことが観察されたことは興味深い。この観察からは、ある抗原群がチップ内に存在し、その反応性により、健常ドナーに由来する血清と、ＲＨＤ患者に由来する血清との識別が可能となることが示唆される。
【０１８７】
次いで、本発明者らは、健常者と心臓病患者とを識別することを可能とするこの抗原群を、より正確な様式で定義しようと試みた。この目的で、一次元階層クラスタリング解析を用いて、血清を、それらの認識プロファイルに基づき、異なる抗原群へとさらに分類した。
【０１８８】
まず、図５のクラスターＫＡ１中に含まれる抗原群にこの種の解析を適用したところ、図６Ａの紫色のボックス（ＨＳ１）および青色のボックス（ＨＳ２）に対応する、第１の階層レベルにおける２つの血清クラスターであるＨＳ１およびＨＳ２を定義することが可能となった。２つのクラスターの各々において存在するかまたは存在しない健常血清および患者血清の数を、図６Ｂで報告する。示される通り、ＹＨＤ血清の大半が、反応性が高い青色のＨＳ２クラスターにおいて見出されうるのに対し、ＲＨＤ血清の大半は、反応性が低い紫色のＨＳ１クラスターにおいて見出される。この種の検査を用いて、２つの血清集団を識別する能力を、特異度および感度の点で規定した。図６Ｃは、特異度および感度を最大とする（値を１とする）理論的理想型の例を示す。示される通り、この具体的な抗原群について、本発明者らは、０．７３および０．６９の特異度値および感度値を得た。
【０１８９】
同じ種類の解析を、クラスターＫＡ５、ＫＡ９、ＫＡ１０、およびＫＡ５＋Ｍ９中の抗原にも適用した。また、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７、ＧＡＳ５＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７、ＧＡＳ５Ｆ＋ＧＡＳ２５＋ＧＡＳ４０＋ＧＡＳ５７を含めた、他の抗原群にも、同じ種類の解析を適用した。結果を図７Ａ〜Ｉにまとめる。
【０１９０】
示される通り、最高の特異度値および感度値をもたらすクラスターが、クラスターＫＡ１中の抗原（ＧＡＳ５、ＧＡＳ４０、ＧＡＳ５Ｆ、ＧＡＳ５７、ＧＡＳ９７、ＧＡＳ３８０、およびＳｐｅＡ）、ならびにＧＡＳ５抗原、ＧＡＳ２５抗原、ＧＡＳ４０抗原、およびＧＡＳ５７抗原を含んだのに対し、最低値は、ＧＡＳ抗原のＭバリアントが含まれるクラスターについて得られた。
【０１９１】
考察
本発明者らは、ＧＡＳ５抗原、ＧＡＳ２５抗原、ＧＡＳ４０抗原、およびＧＡＳ５７抗原を用いてこの種の解析を行えば、ＲＨＤをより正確に診断するための基礎が確定され、ＡＲＦを有する患者が、ＲＨＤを発症する可能性があるかどうかを予測することが可能となり、したがって、医療従事者が、ＡＲＦ患者に最適な予防治療について決定するための指針が得られると考えている。
【０１９２】
【化６】
【０１９３】
【化７】
【０１９４】
【化８】
【０１９５】
【化９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）患者に由来する生物学的試料を少なくとも１つのＧＡＳ抗原と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該患者に由来する該生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性を、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性と比較するステップを包含し、ここで、
健常個体に由来する該対照の生物学的試料と比較して、該患者に由来する該生物学的試料における反応性が低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示す、方法。
【請求項２】
ａ）患者に由来する生物学的試料を、
配列番号１（ＧＡＳ５）
配列番号２（ＧＡＳ５Ｆ）
配列番号３（ＧＡＳ２５）
配列番号４（ＧＡＳ４０）
配列番号５（ＧＡＳ５７）
配列番号６（ＧＡＳ９７）
配列番号７（ＧＡＳ３８０）および
配列番号８（ＳｐｅＡ）
のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原
またはその機能的同等物と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、該患者に由来する該生物学的試料中の任意の抗体の反応性を評価するステップと、
ｃ）ステップｂ）における反応性を、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の反応性と比較するステップを包含し、ここで、
健常な個体に由来する該対照の生物学的試料における反応性と比較して、該患者に由来する該生物学的試料における反応性が低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列を含むＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つ、またはそれらの機能的同等物と接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、２および３；配列番号１、３および４；配列番号１、４および５；配列番号２、３および４；配列番号２、４および５；もしくは配列番号３、４および５のアミノ酸配列を含む３つのＧＡＳ抗原、またはそれらの機能的同等物と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、２、３および４；もしくは配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５のアミノ酸配列を含む４つのＧＡＳ抗原、またはそれらの機能的同等物と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、２、３、４および５のアミノ酸配列を含む５つのＧＡＳ抗原と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、血清試料である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が、青年または小児に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＡＳ抗原が、１つ以上のタンパク質アレイ上に提示される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＧＡＳ抗原、またはそれらの機能的同等物を含む、タンパク質アレイ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質アレイと、ＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を有するか、またはＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を発症するリスクがある患者の診断において該アレイを用いるための指示書を含む、キット。
【請求項１２】
ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防する方法であって、該方法は、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防を必要とする患者に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１３】
ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するのに用いるための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物。
【請求項１】
患者においてＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を診断する、またはＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがある患者を同定する方法であって、該方法は、
ａ）患者に由来する生物学的試料を少なくとも１つのＧＡＳ抗原と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該患者に由来する該生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性を、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原に対する反応性と比較するステップを包含し、ここで、
健常個体に由来する該対照の生物学的試料と比較して、該患者に由来する該生物学的試料における反応性が低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示す、方法。
【請求項２】
ａ）患者に由来する生物学的試料を、
配列番号１（ＧＡＳ５）
配列番号２（ＧＡＳ５Ｆ）
配列番号３（ＧＡＳ２５）
配列番号４（ＧＡＳ４０）
配列番号５（ＧＡＳ５７）
配列番号６（ＧＡＳ９７）
配列番号７（ＧＡＳ３８０）および
配列番号８（ＳｐｅＡ）
のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原
またはその機能的同等物と、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に対する、該生物学的試料中に存在する任意の抗体の結合に適した条件下で、接触させるステップと、
ｂ）該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、該患者に由来する該生物学的試料中の任意の抗体の反応性を評価するステップと、
ｃ）ステップｂ）における反応性を、該少なくとも１つのＧＡＳ抗原またはその機能的同等物に結合した、健常個体に由来する対照の生物学的試料中の抗体の反応性と比較するステップを包含し、ここで、
健常な個体に由来する該対照の生物学的試料における反応性と比較して、該患者に由来する該生物学的試料における反応性が低いことは、該患者がＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）を患っていること、または該患者がＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを発症するリスクがあることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列を含むＧＡＳ抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つ、またはそれらの機能的同等物と接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、２および３；配列番号１、３および４；配列番号１、４および５；配列番号２、３および４；配列番号２、４および５；もしくは配列番号３、４および５のアミノ酸配列を含む３つのＧＡＳ抗原、またはそれらの機能的同等物と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、２、３および４；もしくは配列番号２、３、４および５；配列番号１、３、４および５のアミノ酸配列を含む４つのＧＡＳ抗原、またはそれらの機能的同等物と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）が、前記試料を、配列番号１、２、３、４および５のアミノ酸配列を含む５つのＧＡＳ抗原と接触させることを含む、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、血清試料である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的試料が、青年または小児に由来する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＡＳ抗原が、１つ以上のタンパク質アレイ上に提示される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、もしくは配列番号８から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも２つのＧＡＳ抗原、またはそれらの機能的同等物を含む、タンパク質アレイ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質アレイと、ＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を有するか、またはＧＡＳ感染と関連するリウマチ性心疾患を発症するリスクがある患者の診断において該アレイを用いるための指示書を含む、キット。
【請求項１２】
ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防する方法であって、該方法は、ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤの処置または予防を必要とする患者に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物を投与するステップを含む、方法。
【請求項１３】
ＧＡＳ感染と関連するＲＨＤを処置または予防するのに用いるための、配列番号１、２、３、４、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含む群から選択される少なくとも１つのＧＡＳ抗原、またはその機能的同等物。
【図１】
【図２Ａ】
【図３】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図２Ａ】
【図３】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図５−３】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【公表番号】特表２０１３−５０８７１９（Ｐ２０１３−５０８７１９Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４８１５（Ｐ２０１２−５３４８１５）
【出願日】平成２２年１０月２０日（２０１０．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４７５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８５６１
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２０日（２０１０．１０．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５４７５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４８５６１
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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