ＡＡＶベクターの凝集を防ぐための組成物およびその方法
【課題】凝集なく、ＡＡＶビリオンの高濃度ストック溶液を調製するための組成物および方法を提供する。
【解決手段】ＡＡＶ調製物および保存のための製剤は、意図される標的組織と等張であるとはいえ、高いイオン強度の溶液（例えば、μ〜５００ｍＭ）である。高いイオン強度および適度な浸透圧のこの組合せは、クエン酸ナトリウムのような高い価数の塩を用いて達成される。６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬまでのＡＡＶストック溶液は製剤を用いて実現でき、１０回の凍結融解サイクル後でさえ凝集が全く観察されない。界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８を０．００１％で添加し、扱っている間のビリオンの表面への結合による損失を防ぐ。ビリオン調製物をヌクレアーゼで処理すると、凝集を悪化させるビリオン表面上の小核酸鎖が除去される。
【解決手段】ＡＡＶ調製物および保存のための製剤は、意図される標的組織と等張であるとはいえ、高いイオン強度の溶液（例えば、μ〜５００ｍＭ）である。高いイオン強度および適度な浸透圧のこの組合せは、クエン酸ナトリウムのような高い価数の塩を用いて達成される。６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬまでのＡＡＶストック溶液は製剤を用いて実現でき、１０回の凍結融解サイクル後でさえ凝集が全く観察されない。界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８を０．００１％で添加し、扱っている間のビリオンの表面への結合による損失を防ぐ。ビリオン調製物をヌクレアーゼで処理すると、凝集を悪化させるビリオン表面上の小核酸鎖が除去される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、凝集を防ぐ、ＡＡＶビリオンの製造および保存用組成物および方法に関するものである。
【０００２】
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ヒト遺伝子導入のための有望なベクターである。Grimm, D., and Kleinschmidt, J. A. (1999) Hum Gene Ther. 10:2445-2450；High, K. A. (2001) Ann. N. Y. Acad. Sci. 953:64-67；Pfeifer, A., and Verma, I. M. (2001) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211を参照されたい。ＡＡＶは、パルボウイルスのディペンドウイルス（Dependovirus）属のメンバーである。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、末端逆方向反復（ＩＴＲ）配列にフランクした複製（ｒｅｐ）およびキャプシド形成（ｃａｐ）遺伝子をコードする４６８０ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡ分子から構成される。Berns, K. I. (1996) in Fields Virology (B. N. Fields et. al. Eds.), pp. 2173-2197. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphiaを参照されたい。ゲノムは、ｃａｐ遺伝子産物のアミノ末端変異体である３個のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）によりパッケージされる。得られた正二十面体のウイルス粒子は直径〜２６ｎｍを有する。ＡＡＶ２の高分解結晶構造が報告された。Xie, Q. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:10405-10410を参照されたい。
【０００３】
精製ＡＡＶ２ウイルス粒子の溶解性には限界があり、そしてＡＡＶ２粒子の凝集が問題とされてきた。Croyle, M. A. et al. (2001) Gene Therapy 8:1281-1290；Huang, J. et al. (2000) Mol. Therapy 1: S286；Wright, J. F. et al. (2003) Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 6:174-178；Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122:17-27を参照。通常用いられる緩衝食塩水溶液中では、有意な凝集は密度１０１３粒子／ｍＬで生じ、密度が高くなればなるほど、凝集は増大する。Huangと共同研究者らは、ＡＡＶベクターが濃度依存性で凝集することを報告した。Huang, J. et al. (2000) Mol. Therapy 1:S286を参照。同様に、Xieと共同研究者ら（Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122: 17-27）は、０．１ｍｇ／ｍＬを超える濃度で、ＡＡＶ２ベクターが、凝集を防ぐための塩の濃度の上昇を必要とすることを報告した。ＡＡＶ２ベクターの凝集は、リン酸緩衝食塩水およびＴｒｉｓ緩衝食塩水のような通常用いられる中性緩衝溶液中１０１３粒子／ｍＬを超える粒子密度で生じる。これは、タンパク質濃度〜０．０６ｍｇ／ｍＬに該当し、これらの条件下でＡＡＶ２の溶解性が低いこをを強調するものである。過剰のエンプティー（empty）キャプシドは同時に精製され、粒子密度に関与するので、カラムクロマトグラフィー技術を用いて精製されたベクターについての有効なベクター濃度の限界は、なおさらに低いかもしれない。
【０００４】
粒子の凝集は有意なものであり、その上アデノウイルスベクターについては完全に解決された課題ではない。最近確立されたアデノウイルス関連材料（ＡＲＮ）の安定性が最近報告された。Adadevoh, K. et al. (2002) BioProcessing 1(2):62-69を参照されたい。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、および２．５％ グリセロール（ｐＨ８．０）中で形成された関連材料の凝集が、動的光散乱法、光子相関分光法、および外観により評価された。凍結融解サイクルまたは非凍結保存を行った後、ベクターの凝集のレベルが変動し得ることが観察された。このことから、ＡＲＭの使用プロトコールは制限される。
【０００５】
凝集は、精製中の損失、および精製されたベクター調製物の試験における矛盾を生じ得る。中枢神経系のようなある種の部位へのＡＡＶ２ベクターのインビボ投与は少量の高濃度ベクターを必要とし、最大達成可能用量は低いベクター溶解性により制限され得る。
【０００６】
ベクターの凝集はまた、インビボ投与後の生体内分布に影響し、投与後にベクターに対して逆の免疫応答を引き起こすようである。タンパク質について報告（Braun, A. et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478）されたように、ベクターの凝集は、ベクターを抗原提示細胞にターゲティングし、キャプシドタンパク質および導入遺伝子産物に対する免疫応答の増強を誘発することにより、免疫原性を増大し得る。前臨床（Chenuaud, P. et al. (2004) Blood 103: 3303-3304；Flotte, T. R. (2004) Human Gene Ther. 15:716-717；Gao, G. et al. (2004) Blood 103:3300-3302）および臨床（High, K. A. et al. (2004) Blood 104:121a）研究におけるＡＡＶベクターに対する免疫応答の報告は、ベクターの免疫原性に関与し得る全ての因子に対処する必要があることを説明するものである。
【０００７】
精製ベクターを特徴付けるためのプロトコールの試験は、ベクターの凝集によっても影響されるようである。ベクターの感染価の決定はベクターの凝集に高感受性であることが報告された。Zhen, Z. et al. (2004) Human Gene Ther. 15: 709-715を参照されたい。重大な関心事は、ベクター凝集物は、それらの導入効率、生体内分布、および免疫原性が単量体粒子とは異なり得るので、インビボ投与後の有害な結果を有し得ることである。例えば、ＡＡＶ２ベクターの肝細胞への血管内デリバリーには、ベクターが肝類洞壁の有窓内皮細胞を通ることが必要である。これらの有窓細胞は、単量体ＡＡＶベクター（直径〜２６ｎｍ）の通過は可能だが、より大きなベクター凝集物の通過を防ぐと予想される、５０から１５０ｎｍの範囲の半径を有する（Meijer, K. D. F., and Molema, G. (1995) Sem. Liver Dis. 15:206）。マウスにおける生体内分布の研究では、蛍光分子Ｃｙ３で標識された凝集ＡＡＶ２ベクターは、血管デリバリーの後、肝マクロファージにおいて補足された。Huang, J. et al. (2000) Mol. Therapy 1:S286を参照。
【０００８】
ウイルスベースの導入ベクターのための製剤の開発は比較的最近の研究分野であり、ＡＡＶベクターの製剤および安定性を最適化するための組織的努力を記載した２、３の研究が報告されているのみである。Croyle, M. A. et al. (2001) Gene Therapy 8:1281-1290；Wright, J. F. et al. (2003) Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 6:174-178；Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122:17-27を参照されたい。ベクター調製物における変化を最小化する、前臨床上および臨床上の適用に適合可能な製剤を決定することが、一貫して高いベクターの安定性および機能的特徴を達成するに重要な必要条件である。タンパク質療法について十分に確立されている（Chen, B. et al. (1994) J. Pharm. Sci. 83:1657-1661；Shire, S. J. et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93:1390-1402；Wang, W. (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188；Won, C. M. et al. (1998) Int. J. Pharm. 167:25-36）のように、ベクターの安定性の重要な見地は製造および保存中の溶解性であり、ベクターの凝集は完全に対処されることを必要とする問題である。ベクターの凝集はベクター精製中の損失を生じる一方、凝集物はろ過により除去され、収量における損失は、より高いコスト、および前臨床および臨床研究用のベクターを生成する場合のキャパシティーの限界となる。凝集物を除去するためのろ過の後でさえ、新たな凝集物が、緩衝食塩水溶液中のＡＡＶ２ベクターの高濃度調製物において形成され得る。
【０００９】
ウイルス粒子の凝集を防ぐ、ｒＡＡＶ２のようなＡＡＶベクターの精製および保存のための改良された製剤および方法に対する必要がある。
【００１０】
発明の概要
当該技術分野におけるこれらの要求および他の要求が本発明によって満たされ、そしてそれは、凍結融解サイクル後でさえ高い感染価および導入効率が維持されるＡＡＶベクターの製造および保存において使用するための高いイオン強度溶液を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、賦形剤を添加して、凝集を防ぐのに十分な高イオン強度を達成することにより、ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法に関するものである。別の態様において、本発明は、凝集を防ぐのに十分な高イオン強度を有するビリオン組成物に関するものである。
【００１２】
本発明のある種の実施態様において、イオン強度は、少なくとも約１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭまたはそれ以上である。ある実施態様において、このイオン強度は、１種類以上の多価イオン、例えば、クエン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、または硫酸塩を含む賦形剤を用いて達成される。
【００１３】
さらなる実施態様において、イオン強度がビリオンの凝集を防ぐのに十分に高いものであったとしても、ビリオン調製物の浸透圧は、似通った等浸透圧レベル、例えば、２００ｍＯｓｍ、２５０ｍＯｓｍ、２８０ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ、または４００ｍＯｓｍで維持される。
【００１４】
ある実施態様において、ビリオンは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオン、例えば、ＡＡＶ−２である。
【００１５】
本発明の方法の他の実施態様において、ビリオン調製物は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］で処理される。さらなる実施態様において、ヌクレアーゼ処理は、凝集を防ぐのに十分に高いイオン強度を達成する賦形剤の添加と組合わされる。
【００１６】
本発明のある実施態様において、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８が、例えば、０．００１％までビリオン調製物に添加される。１つの実施態様において、組成物は、精製ウイルス粒子、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、および０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８を含む。
【００１７】
１つの実施態様において、ＡＡＶベクターは、１×１０１３ｖｇ／ｍＬを超える濃度、例えば、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、および６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬまでの濃度で有意な凝集を示すことなく本発明の組成物として保存され得る。ある実施態様において、本発明の方法および組成物を用いて保存されたＡＡＶベクターは、４℃にて５日間保存されたとき、有意な凝集を示さない。他の実施態様において、かかる組成物として保存されたＡＡＶベクターは、−２０℃または−８０℃で凍結融解サイクルを１回、５回、１０回、またはそれ以上行った後、有意な凝集を示さない。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の方法および組成物により保存されたビリオン調製物は、動的光散乱により測定された場合に平均的粒子半径（Ｒｈ）を示す。これは、ビリオンの有意な凝集が全く起こらなかったことを示す。ある実施態様において、本発明の方法および組成物により保存されたビリオン調製物は、約１５ｎｍ、２０ｎｍ、または３０ｎｍより大きい平均的粒子半径（Ｒｈ）を示す。
【００１９】
ある実施態様において、本発明の方法および組成物により保存されたビリオン調製物からのビリオンの回収率は、０．２２μｍのフィルターを通してろ過した後、約８５％、９０％、または９５％より高い。
【００２０】
なお別の実施態様において、本発明は、本発明の高いイオン強度製剤を含むキットに関するものである。１つの実施態様において、キットは、予め混合された賦形剤溶液を含む。別の実施態様において、キットは、本発明の高いイオン強度組成物の２種類以上の成分を別々に含み、これは使用者により混合され得る。ある実施態様において、キットは、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ［登録商標］、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８を含む。他の実施態様において、キットは、本発明の組成物の製造、あるいは本発明の方法の実施のための指示書をさらに含む。
【００２１】
発明の詳細な説明
ＡＡＶ２ベクターの凝集は、ベクターの高濃度調製物において頻繁に観察され、そして精製、回収、およびインビボでの能力および安全性に影響を及ぼし得る。ゆえに、ＡＡＶ２ベクターの開発にとって重要な目的は、高濃度ストックが調製されるときにベクターの凝集を防ぐ方法および製剤を同定することである。
【００２２】
特に示さない限り、本明細書において用いられる用語「ベクター」は、組換えＡＡＶビリオン、またはウイルス粒子に言及し、「ベクター」が頻繁に用いられるにも関わらず、他の文脈においてはプラスミドのような非ウイルスＤＮＡ分子にも言及する。
【００２３】
本発明は、凝集過程におけるウイルス粒子間のイオン相互作用の関与を示唆する、溶液のイオン強度がＡＡＶベクター凝集の重要なパラメーターであるという知見に一部基づくものである。イオン強度の上昇が、荷電賦形剤の同一性に関わらず、ＡＡＶ２ベクターの溶解性を増大させるという知見は、特定のイオン種に関与する相互作用よりむしろ溶液自体のイオン強度が、関連する物理化学的パラメーターであるという仮説を支持するものである。少なくとも２００ｍＭの閾値イオン強度が、本明細書で調べられるベクター粒子密度での凝集を防ぐのに必要とされる。
【００２４】
実際的な関心事のうち、通常用いられる緩衝食塩水溶液は、１０１３粒子／ｍＬを超える密度でのＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐのに十分なイオン強度を有する。高い塩濃度は、ＡＡＶ２ベクターの溶解性を増大させることが知られている（例えば、勾配から回収された高濃度ＡＡＶ２ベクターは、一般に、高濃度ＣｓＣｌに溶解性のままである）。しかしながら、前臨床および臨床研究に最適な製剤は、特に、高張液の希釈が遅い可能性のある部位へのベクターのインビボ投与のため、等張（２８０〜４００ｍＯｓｍ）近くであるべきである。本発明の実施態様において、イオン強度の荷電価数との指数関数的関係を用いて、高いイオン強度を有する等張製剤が開発される。ヒト非経腸製剤における賦形剤として通常用いられる複数の電荷価数を有する塩種（例えば、硫酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩）は、等張濃度で用いられるとき、ＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐために必要とされるイオン強度レベルをもたらし得る。等張（１５０ｍＭ）塩化ナトリウムは、イオン強度１５０ｍＭ（高いベクター濃度でのＡＡＶ２の溶解性を維持するのに十分な値である）を有する一方、イオン強度〜５００ｍＭを有する等張クエン酸ナトリウムは、少なくとも６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２ベクター濃度を凝集することなく支持することができる。
【００２５】
理論により制限されることを意図するのではないが、ＡＡＶ２粒子の低い溶解性は、凝集物における隣接粒子間の相補的に荷電した領域の安定効果と併せてそれらの高度に対称的な性質により引き起こされ得る。ＡＡＶ２の結晶構造に基づく表面電荷密度（Xie, Q. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:10405-10410）は、ウイルス表面上の正および負の電荷パターンを示す。従前の報告により、ＡＡＶ２ベクターの凝集がｐＨ依存性であることが示され、荷電した側鎖基を有するアミノ酸が粒子間結合に関与するとの仮説が立てられた。Qu, G. et al. (2003) Mol. Therapy 7:S238を参照。これらの報告により、荷電したアミノ酸側鎖がベクターの凝集に関与するなら、高濃度の遊離アミノ酸がベクター粒子の相互作用をブロックし得るとの仮説が立てられた。しかしながら、本発明者らは、荷電した側鎖を有するアミノ酸は、それらのイオン強度への関与を超えてＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐ際に有効でないことを見出した。
【００２６】
低いイオン強度でのベクターの凝集は、精製ベクター粒子の有効なヌクレアーゼ処理により低減されるが、阻止されないことも見出した。精製過程の初期工程における消化（清澄化ＨＥＫ細胞溶解物）は、ベクター精製後の凝集を低減しなかった。核酸基質に対する酵素の割合がより高いので、既に精製されたビリオンの消化はより有効なようである。これらの結果を説明する１つのメカニズムは、ベクター表面に結合した残りの核酸不純物（例えば、宿主細胞およびプラスミドＤＮＡ）が、隣接するウイルス粒子上の結合部位をもたらし、これにより凝集を生じ得るということである。精製ＡＡＶ２ベクター（エンプティーキャプシドなし）は、約１％の非ベクターＤＮＡを含有することが報告された。Smith, P. et al. (2003) Mol. Therapy 7:S348を参照。この非ベクターＤＮＡの＞５０％が、ヌクレアーゼ耐性であり、キャプシド粒子内にパッケージされることが報告された。一方、不純物ＤＮＡのうち、ヌクレアーゼ耐性であり、精製ベクター粒子の表面と結合するように思われるものもあった。有効なヌクレアーゼ処理がベクターの凝集を低減し得るという知見により、１個のベクター粒子当たり２５ヌクレオチド以下の平均的レベルでベクター表面と結合する核酸がＡＡＶベクターの凝集に関与し得ることが示唆される。
【００２７】
要約すると、ＡＡＶ２ベクターの精製中の高いイオン強度溶液の使用および最終製剤、ならびに残りのベクター表面ＤＮＡの有効な除去は、前臨床および臨床研究において使用するためのＡＡＶ２ベクターの高濃度溶液を達成するための２つの有効なストラテジーである。高いイオン強度溶液およびヌクレアーゼ処理は、組み合わせて、または別々に用いられ得る。データはＡＡＶ２ベクターを用いて得られたものだが、本発明の組成物および方法は、他のＡＡＶ血清型／変異体、またはアデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスのような他のウイルスベクターにも有用であり得る。
【００２８】
賦形剤の濃度の関数としてのＡＡＶの凝集
ＡＡＶベクターの凝集の機序を明らかにし、凝集を低減／阻止し得る賦形剤の種類を同定するために、最初のスクリーニング実験を行う。低い濃度の緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２）を含む中性緩衝食塩水においてベクターを希釈（５倍）して、ベクターの凝集を引き起こすことができる。希釈液に含まれるとき、ベクターの凝集を防ぐことができる賦形剤を同定するための「希釈圧力（dilution-stress）」法を用いて、賦形剤をスクリーニングする。スクリーニングのため、動的光散乱（ＤＬＳ）により凝集を測定する。調べた賦形剤の種類は、選択した無機塩類、アミノ酸、非荷電炭水化物、および界面活性剤を含むものであった。結果を表１に表す。
【００２９】
表１
希釈圧力法を用いた、ＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐ賦形剤についてのスクリーニング
【表１】
ＮＩＡ：凝集の阻害なし
【００３０】
表１に示す通り、荷電した賦形剤（無機塩およびアミノ酸）は、十分な濃度で存在するとき、凝集を防ぐ。しかしながら、ベクターの凝集を防ぐのに必要な塩濃度は変動し、それは、硫酸マグネシウムについて１８０ｍＯｓｍから塩化ナトリウムについて３２０ｍＯｓｍの範囲に及ぶ。アミノ酸のアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、およびリジンは、２００ｍＯｓｍで凝集を阻止しないが、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸は、３００〜３２０ｍＯｓｍで凝集を防ぐ。アルギニン、グリシン、およびヒスチジンは、２００ｍＯｓｍ以外の濃度で試験しなかった。選択した炭水化物は、５％ｗ／ｖまでの濃度で存在するとき、ベクター粒子の凝集に対する効果を全く有さない。例えば、５％ｗ／ｖ グリセロール（５４３ｍＯｓｍ）は凝集を阻止しない。界面活性剤のポリソルベート８０（１％ｗ／ｖ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８（１０％ｗ／ｖ）は、同様に、「希釈圧力」法を用いた凝集に対する効果を全く有さない。
【００３１】
浸透圧およびイオン強度の関数としてのＡＡＶの凝集
図１Ａおよび１Ｂは、ベクターの凝集のより詳細な分析の結果を種々の塩の濃度の関数として示す。図１Ａは、ベクターの凝集を選択した賦形剤の浸透圧の関数として示す。荷電した種について、ＡＡＶ２ベクターの凝集の濃度依存性阻害を観察する。多価イオンを有する塩は、１価の塩化ナトリウムより低い濃度で同程度の凝集阻害を達成する。例えば、硫酸マグネシウムは２００ｍＯｓｍで凝集を防ぐが、塩化ナトリウムは同様の効果を達成するのに３５０ｍＯｓｍを必要とする。クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムは、ベクター凝集を防ぐそれらの有効性の中間である。
【００３２】
図１Ａおよび表１の結果は、グリセロールおよび５％までの濃度でのある種の糖の、低いイオン強度により誘発されるＡＡＶ２ベクターの凝集に対する効果を全く示していないが、データにより、５％より高いグリセロール濃度でのＡＡＶ２の溶解性の改善を除外することはできない。例えば、Xieと共同研究者らは、２５％（ｗ／ｖ） グリセロールが、低いイオン強度溶液においてＡＡＶ２を非常に高濃度（４．４から１８×１０１４粒子／ｍｌ）まで濃縮できることを報告した。Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122:17-27を参照されたい。
【００３３】
図１Ｂは、図１Ａのデータを、それぞれの賦形剤について浸透圧ではなく計算したイオン強度の関数としてプロットしたものを示す。図１Ｂは、用いる塩に関わらず、イオン強度が２００ｍＭ以上のとき、ベクターの凝集は阻止されることを示している。これらのデータは、溶質濃度および電荷価数の両方に依存するパラメーターである溶液のイオン強度（μ）が、凝集に影響する１次因子であることを示唆するものであった。
【００３４】
本発明の実施態様において凝集を防ぐのに有用なイオン強度は、例えば、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、またはそれより高いイオン強度を含む。本発明の方法および製剤においてこれらのイオン強度を達成するには多価イオンが好ましく、例えば、２価、３価、４価、５価のイオン、およびそれより高い価数のイオンである。本発明の溶液および製剤におけるｐＨバッファーは、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、またはＨＥＰＥＳ（または他の良好なバッファー）であってもよく、任意の他の適当なｐＨバッファーが用いられてもよい。好ましい実施態様において、製造されるベクターの標的組織と相性のよい多価イオンおよびバッファーが選択される。
【００３５】
本発明の方法および組成物における多価イオンの使用により、比較的低い浸透圧だが、高いイオン強度の組成物を生成することが可能になる。本発明の高いイオン強度の組成物は、ほぼ等張であってもよく、例えば、約２００ｍＯｓｍ、２５０ｍＯｓｍ、２８０ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ、または４００ｍＯｓｍであってもよいが、他の浸透圧は、組成物のある種の使用に許容され得る。
【００３６】
ＡＡＶの精製方法の関数としてのＡＡＶの凝集
異なる方法（例えば、密度勾配精製対イオン交換クロマトグラフィー）により精製された組換えＡＡＶ２は、異なる不純物プロファイルを有すると予測される。図２は、精製方法の異なるいくつかのＡＡＶ調製物について、イオン強度の関数としてベクターの凝集を示す。精製方法は実施例１に記載されている。塩化ナトリウムを用いて、イオン強度を変動させる。２回塩化セシウム勾配超遠心（方法１）、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（方法２）、または合わせたカラムおよび塩化セシウム勾配超遠心（方法３）により精製されたＡＡＶ２−ＦＩＸベクターはそれぞれ、イオン強度が低減するにつれ、類似の凝集応答を示す。対照的に、カラム方法による精製、次に、ヌクレアーゼ消化工程（方法２＋ヌクレアーゼ）の対象とされたＡＡＶ２−ＦＩＸは、低いイオン濃度での凝集の低減を示す。
【００３７】
製造的スケールでのＡＡＶの凝集
表１、および図１Ａ、１Ｂ、および２のデータは、分析的スケール（凝集を測定するためのＤＬＳを利用する）でのベクターの凝集に関連する。対照的に、表２は、製造的スケールのベクター精製に相当する、ベクターの凝集を誘発し、定量するための方法を用いて、ラージスケールでのＡＡＶ２ベクターの凝集に対する上昇したイオン強度およびヌクレアーゼ処理の効果を示す。実験の詳細を実施例２に記載する。精製ＡＡＶベクターを、種々のイオン強度の溶液中にダイアフィルトレーションし、容量を低減して、高いベクター濃度を達成し、次に、０．２２μｍのフィルターを通してろ過した後のベクターの回収率を測定することにより、凝集を評価する。方法１ないし第２のＣｓＣｌ勾配遠心工程（９１ｍＬ中１．８×１０１５ｖｇ、〜３Ｍ ＣｓＣｌ中１．８×１０１３ｖｇ／ｍＬ）により精製したＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターの単一プールからのアリコートを、ダイアフィルトレーション実験の出発材料として用いる。中空糸を用いたタンジェンシャルフローフィルトレーションをダイアフィルトレーションのために用いる。なぜなら、それはスケールの拡大縮小が可能であり、様々な容量（最小１．４ｍＬ）の調製も可能であるため、中性緩衝食塩水中で凝集が生じると予測される濃度にＡＡＶを濃縮できるからである。
【００３８】
実験１において、３個の中空糸単位を用いて、製剤ＣＦ、ＴＦ１、またはＴＦ２においてＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターをダイアフィルトレーションし、容量を目標の２．５×１０１３ｖｇ／ｍＬまで低減する。実施例２を参照されたい。次に、試料を０．２２μｍのフィルターを通してろ過する。結果を表２に示す。上昇したイオン強度製剤ＴＦ１（９５±７．４％）およびＴＦ２（９３±７．４％）両方についてのベクター回収率（「収率％」）は、対照製剤ＣＦを用いた回収率（７７±６．６％）より有意に高い。
【００３９】
表２
処理スケールでのＡＡＶベクターの回収率
【表２】
【００４０】
実験２において、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣをＣＦまたはＴＦ２においてより高い目標値（６．７×１０１３ｖｇ／ｍＬ）まで濃縮する。ＴＦ２を用いたベクターの回収率（９６±４．４％）は、再度、ＣＦを用いた回収率（５９±６．０％）より有意に高い。用いたアッセイの変化内、ＴＦ２を用い目標濃度の両方でベクターを完全に回収した。これは、凝集が阻止されたことを示す。対照において、ＣＦを用いた目標濃度の両方で有意な凝集を観察し、凝集の程度（すなわち、０．２２μｍろ過後の損失）は、目標ベクター濃度が高くなるほど、高くなった。さらなる実験（示していない）において、実験２の濃縮後、０．２２μｍろ過工程前にＡＡＶ２ベクター試料５０μＬを採取し、次に、光学顕微鏡により調べる。ＣＦにおいて濃縮したベクターは、明らかな量の目に見える物質を含有し（示していない）、一方、かかる物質は、ＴＦ２において濃縮したベクターにおいて全く観察されない。
【００４１】
実験３は、精製ベクターのヌクレアーゼ消化前の凝集に対する効果を調べるものである。ヌクレアーゼ消化がない場合、ＣＦにおけるＡＡＶ２−ＡＡＤＣの回収率は、６８±１１％であり、これは実験１および２における回収率に類似する。対照において、ヌクレアーゼ処理し、次に、ＣＦにおいて濃縮した精製ベクターはより高い回収率（９１±１２％）となる。これらの製造用スケールの結果は、「希釈圧力」（分析的スケール）法を用いた図２に示すヌクレアーゼ消化の効果と同じ効果を反映する。
【００４２】
表２に表す結果は、本発明の方法および組成物が、ＡＡＶベクターの回収率を増大させることを示す。例えば、本発明の種々の実施態様において、回収率は、約８０％未満から少なくとも約８５％、９０％、９５％、またはそれ以上まで改善される。
【００４３】
保存または凍結融解サイクル後のＡＡＶの安定性および活性
Croyleと共同研究者らは、リン酸ナトリウム緩衝液において凍結融解サイクルを複数回行った後のＡＡＶおよびアデノウイルスのタイターの有意な損失を報告し、リン酸カリウムによりもたらされるより良好なｐＨの緩衝化により、凍結融解サイクル中のタイターの損失が阻止されることを示した。Croyle, M. A. et al. (2001) Gene Therapy 8: 1281-1290を参照されたい。本発明者らのリン酸ナトリウムを用いた凍結融解の安定性の研究の結果は、これらの知見を支持するものである。本発明者らは、１５０ｍＭ リン酸ナトリウムが、高濃度のＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターの調製および非凍結保存中の凝集を防ぐのに十分なイオン強度をもたらすが、−２０または−８０℃での１回の凍結融解サイクルでさえ凝集を生じることを見出した。
【００４４】
保存または凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル後のＡＡＶの安定性を、本発明の緩衝液において次の通り評価する。ＣＦ、ＴＦ１、およびＴＦ２において調製した高濃度のベクター（表２、実験１）を短期間の安定性の研究の対象とし、凝集が冷蔵保存中または複数回の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル後に生じ得るかどうかを評価する。未希釈の試料を用いたＤＬＳにより凝集を評価し、Ｒｈ値＞２０ｎｍがあるレベルの凝集の発生を示すとみなす。
【００４５】
表３
ＡＡＶ２ベクターの概要
【表３】
Ｐｒｅ：０．２μｍろ過直後に測定したＤＬＳ半径
ベクター濃度（ｖｇ／ｍＬ）：ＣＦ：１．９３Ｅ１３、ＴＦ１：２．３８Ｅ１３、ＴＦ２：２．３３Ｅ１３
ＴＨ：過剰の凝集のため、シグナル強度があまりに高く測定できない
【００４６】
表３に示すとおり、ＣＦにおいて調製したＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターは、４℃で５日間の保存後、ならびに−２０または−８０℃での１回以上のＦ／Ｔサイクル後にいくらかの凝集を示す。ＴＦ１において調製したベクターについては、４℃で５日間保存後に凝集は全く生じなかったが、−２０または−８０℃での１回のＦ／Ｔサイクル後に凝集が生じる（測定するにはシグナル強度があまりに高く、ＤＬＳにより示す）。これらの試料の外観検査は若干の懸濁を示し、そしてそれは凝集と一致する。ＴＦ２において調製したベクターについては、４℃での保存後または−２０℃でのＦ／Ｔサイクル１０回まで、凝集は全く観察されない。−８０℃での５および１０回のＦ／Ｔサイクル後、凝集がいくらか観察される。
【００４７】
ＴＦ２における保存またはＦ／Ｔサイクル後のＡＡＶ活性を、次の通り評価する。上述の通り、高いイオン強度、等張な製剤ＴＦ２は、濃縮および保存中のベクターの凝集を効果的に防ぎ、それゆえ、さらなる研究の前途有望な候補を表している。重要な疑問は、高いイオン強度のＴＦ２におけるベクターの調製および保存が、その機能活性に反対に影響するかどうかということである。これを評価するために、ＴＦ２において長時間調製し、保存したベクターの感染価および導入効率を測定するためのアッセイを行う。
【００４８】
感染性については、１回の感染現象を検出可能な高感度の感染性アッセイを用いる。Zhen, Z. et al. (2004) Human Gene Ther. 15:709-715を参照されたい。ＡＡＶ２−ＡＡＤＣを濃度６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬにてＴＦ２中に調製する。４℃にて４５日間保存後、調製物は、感染単位に対するベクターゲノムの比（ｖｇ／ＩＵ）１３を有し、これに対して参照ベクターの値は１６ｖｇ／ＩＵである。この差は、報告されたこのアッセイの変動性（ＲＳＤ〜５０％）を与えるほど有意ではない。
【００４９】
Ｄ７／４細胞を形質導入後、ＥＬＩＳＡによりＡＡＤＣタンパク質の発現を測定することにより、形質導入効率を評価する。図３は、１０から１０５ｖｇ／細胞までの範囲のベクター投入量について、ＴＦ２において調製したベクターと参照対照との間で有意差がないことを示す。さらに、これらのデータは、高いイオン強度のＴＦ２におけるＡＡＶ２ベクターの調製および保存が、ベクターの感染性または導入効率に対して有害な効果を有さないことを示す。
【００５０】
結論
ウイルス粒子の相互作用に対するイオン強度（μ）の効果を決定し、ベクターの凝集の機序を解明する。中性緩衝等張食塩水（μ＝１５０ｍＭ）のイオン強度は、〜１０１３粒子／ｍＬを超える密度での勾配超遠心または陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐのに十分である。５％（ｗ／ｖ）までの濃度の糖（ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、グリセロール）または界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０［登録商標］（１％）またはＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８（１０％）の含有は、ベクター粒子の凝集を阻止しない。
【００５１】
対照的に、精製中および最終ベクター製剤のために、上昇したイオン強度の溶液（μ＞２００ｍＭ）を用いるとき、ベクター粒子は依然溶解性である。インビボ投与のための等張賦形剤濃縮物を用いた上昇したイオン強度の溶液を、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および硫酸マグネシウムを含む多価イオンの塩を用いて調製する。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８、ｐＨ８．０（μ〜５００ｍＭ）を含有する等張製剤により、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターを６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬまで濃縮可能であり、調製中および−２０℃で凍結融解サイクルを１０回行った後に観察される凝集が全くない。以下の表３および付随の考察を参照されたい。上昇したイオン強度の製剤にて長時間調製し、保存したＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターは、高い感染価（１３ＩＵ／ｖｇ）および導入効率を保持する。
【００５２】
精製ＡＡＶ２ベクターのヌクレアーゼ処理は、ベクターの凝集の程度を低減し、このことは粒子間相互作用におけるベクター表面の核酸不純物の関与を示唆する。ゆえに、上昇したイオン強度の等張製剤の使用と組み合わせた、ベクター表面の残りの核酸を有効に除去するための精製方法が、ＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐのに有用な方法である。
【００５３】
実施例１
ＡＡＶ精製方法
ヒト凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）またはヒトアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を発現するＡＡＶ２ベクターを、既に記載（Matsushita, T. et al. (1998) Gene Therapy 5:938-945）の通り（変更含む）、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションにより生成する。ラージスケールの調製のため、細胞を８５０ｍｍ２のローラーボトル（Corning）にて培養し、トランスフェクションする。ベクターを３種類の方法のうちの１つで精製する。
【００５４】
精製方法１（Matsushitaから変更されている）において、ローラーボトル中のトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を遠心（１０００ｇ、１５分）により回収し、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．２に再懸濁し、次に、３回の凍結融解サイクル（エタノール／ドライアイスバスおよび３７℃のウォーターバスを交互）により溶解する。細胞溶解物を遠心（８０００ｇ、１５分）により清澄化する。次に、１０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２を添加して、上清を２００ｍＭ ＮａＣｌまで希釈し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］（Merck, Purity Grade 1；２００Ｕ／ｍＬ、１時間、３７℃）を用いて消化する。溶解物を２５ｍＭ ＣａＣＩ２まで１Ｍ ストック溶液を用いて調節し、４℃で１時間インキュベーションする。
【００５５】
混合物を遠心（８０００ｇ、１５分）し、ベクターを含有する上清を回収する。清澄化した細胞溶解物からウイルスを沈殿させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度８％まで添加し、混合物を４℃にて３時間インキュベーションし、次に遠心（８０００ｇ、１５分）する。ベクターを含有するペレットを、混合しながら０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、４℃で１６時間インキュベーションする。再懸濁した材料をプールし、固体塩化セシウムを最終密度１．４０ｇｍ／ｍｌまで添加する。次に、ＢｅｃｋｍａｎモデルＬＥ−８０遠心機を用いた超遠心（ＳＷ２８、２７０００ｒｐｍ、２４時間、２０℃）により、ベクターをバンド化する。遠心チューブを画分化し、ベクターを含有する密度１．３８から１．４２ｇｍ／ｍＬ部分をプールする。この材料を超遠心（ＮＶＴ６５ローター、６５０００ｒｐｍ、１６時間、２０℃）によって２回目のバンド化し、精製ＡＡＶ２ベクターを含有する分画をプールする。ベクターを濃縮し、バッファー交換を行うために、高濃度塩化セシウム溶液中のベクターを、以下（実施例２）に記載のタンジェンシャルフローフィルトレーションによる限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）の対象とする。
【００５６】
精製方法２において、ＡＡＶを含有する細胞回収物をマイクロ流動化し、続いて、０．６５および０．２２μｍのフィルター（Sartorius）を通してろ過する。既に記載のＰｏｒｏｓ ＨＳ５０樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ウイルスを清澄化細胞溶解物から精製する。米国特許第６，５９３，１２３号を参照。図２に記載のヌクレアーゼ消化のために、カラム精製ベクターを、１００Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅおよび１０Ｕ／ｍＬ ＤＮＡｓｅ Ｉ（ＲＮＡｓｅフリー、Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana）と共にインキュベーション（４時間、室温）する。
【００５７】
精製方法３のため、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ２ベクターを、さらに塩化セシウム勾配超遠心工程（ＳＷ２８、２７０００ｒｐｍ、２０時間）の対象とし、ＵＦ／ＤＦ前にエンプティーキャプシドを除去する。
【００５８】
リアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて、上述のＡＡＶ調製物を定量する。Sommer, J. M. et al. (2003) Mol. Therapy 7:122-128を参照。３種類の方法それぞれにより精製したベクターを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色分析により分析し、全てのケースで、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が予測した割合で存在し、さらに、キャプシドタンパク質は走査濃度測定により決定した総タンパク質の＞９５％を表す。しかしながら、方法２（カラムクロマトグラフィー）により精製したベクターは、方法１および３により精製した勾配精製ＡＡＶ２ベクター同様、エンプティーキャプシドを含有し、これは１ベクターゲノム当たり３〜１０個のエンプティーキャプシド範囲に渡る。
【００５９】
実施例２
ＡＡＶ２の凝集を検出するための限外ろ過およびダイアフィルトレーション
使い捨ての中空糸タンジェンシャルフローフィルトレーション装置（Amersham BioSciences 8" Midgee、１００ｋＤａの通常の孔サイズ）を用いて、上述の方法および表２に記載のＵＦ／ＤＦ実験について記載の方法により精製したＡＡＶ２ベクターを濃縮し、ダイアフィルトレーションする。全ＵＦ／ＤＦ方法のため、１０×生成物容量に該当するダイアフィルトレーションバッファー容量を用い、それを〜１ｍＬずつの増加にて添加し、ほぼ連続してダイアフィルトレーションする。この方法を用いて、ダイアフィルトレーション後に計測した残りのＣｓＣｌは、＜０．５ｍＭである。
【００６０】
ＵＦ／ＤＦについては、次の３種類の製剤：対照製剤（ＣＦ：１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５％ ソルビトール、ｐＨ７．３）；試験製剤１（ＴＦ１：１５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）；および試験製剤２（ＴＦ２：１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いた。表２に示す実験について、ベクター濃度１×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する容量でダイアフィルトレーションを行い、ダイアフィルトレーション後、２．５×１０１３ｖｇ／ｍＬ（ベクターの損失は全くないと仮定）に該当する値まで容量を低減する。
【００６１】
実験２について、２×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する容量でダイアフィルトレーションを行い、次に、容量を６．７×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する値に低減する。
【００６２】
実験３（ＣＦ±Ｂｚ）について、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ（約１．２×１０１４ｖｇ）をまず、ＴＦ１（ヌクレアーゼ活性と適合し得る製剤）にダイアフィルトレーションし、次に、０．２２μｍのフィルターに通す。この材料のタイターを決定し、容量を濃度１×１０１３ｖｇ／ｍＬになるよう調節する。この材料１０ｍＬに、ＭｇＣｌ２を濃度２ｍＭまで添加し、次に２つの等しいアリコートに分配する。第１のアリコートをＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２００Ｕ／ｍＬ、４時間、ＲＴ）と共にインキュベーションし、第２のアリコートを偽インキュベーションする。次に、それぞれのアリコートを、ベクター濃度２×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する容量でダイアフィルトレーションし、次に、目標３．６×１０１３ｖｇ／ｍＬまで濃縮する。全ＵＦ／ＤＦプロトコールの後、１％ ストックのＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ−６８（BASF Corp., Mount Olive, NJ）を最終濃度０．００１％までベクター生成物に添加し、溶液を０．２２μｍのシリンジフィルター（Sartorius）に通す。全ＵＦ／ＤＦ方法を、ラミナーフローキャビネット内で行う。
【００６３】
実施例３
動的光散乱によるベクターの凝集の測定
Protein Solutions DynaPro 99（λ＝８２５．４ｎｍ）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）により、精製ベクターを凝集について分析する。１次データ（粒子半径−Ｒｈ、３０サイクル、１０サイクル／分に渡り測定した平均値）を、報告した分析全てについて用いる。「希釈圧力」法を用いて、ベクター凝集に対する種々の賦形剤の効果を評価する。この方法において、試験希釈液８０μＬをベクター溶液２０μＬに、ＤＬＳ測定のために用いる実測用キュベット中で混合しながら添加し、データの収集を混合１０秒以内に開始する。試験希釈物の添加前に、ＡＡＶ２ベクター調製物のＲｈ値を測定し、＜１５ｎｍであることを確かめ、出発材料が単量体であることを確認する。１００％単量体でない試料は、０．２２μｍのシリンジディスクフィルター（Sartorius、低タンパク質結合）に通して凝集物を除去する。
【００６４】
図１および２において示す浸透圧およびイオン強度値を、混合物（すなわち、重量：試験希釈液（８０％）および出発ベクター製剤（２０％））に存在する全ての賦形剤を用いて計算する。浸透圧を、方程式：
【数１】
（ｃｉは各溶液種のモル濃度である）により計算する。イオン強度（μ）を、方程式：
【数２】
（ｚｉは、各種上の荷電である）により計算する。ベクターの凝集を生じる条件（例えば、低μ）では、Ｒｈの漸進的増加を一連のデータ回収に渡り観察する。希釈後３分間隔で測定した平均Ｒｈが凝集の信頼可能な測定であることを確認するために、同じ時間間隔でのＲｈの平均増加速度（ΔＲｈ／Δｔ）も決定する（示していない）。ΔＲｈ／Δｔの分析は、図１および２に報告した平均Ｒｈ値を用いて得たものと一致する結果を生じる。
【００６５】
実施例４
ＡＡＶビリオンの感染性
ＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターの感染性を既に記載の高感度アッセイを用いて決定する。Zhen, Z. et al. (2004) Human Gene Ther. 15:709-715を参照されたい。簡単に言うと、試料を連続希釈（１０倍希釈、１０複製物／希釈）し、１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中９６ウェル組織培養プレート（Falcon，カタログ番号３５３２２７）にて成長させたＤ７／４細胞（ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐを発現する改変ＨｅＬａ細胞）に添加する。アデノウイルス（Ａｄ−５、１００ｖｐ／細胞）を各ウェルに添加し、ヘルパー機能を提供する。４８時間後、各ウェルにおけるＡＡＶベクターの複製を、導入遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いたＱ−ＰＣＲにより定量し、限界希釈における感染頻度を、Ｋａｒｂｅｒ法により分析し、感染価を計算する。ＣＦにおいて予め調製し、−８０℃で保存した参照ＡＡＶ２−ＡＡＤＣと同時に、試験試料を実施する。
【００６６】
ＡＡＶ２ベクターの導入効率を、全細胞ＥＬＩＳＡにより定量する。１０から１０５ｖｇ／細胞投入量（５複製物／希釈）に該当する試験試料および参照ベクターの１０倍連続希釈物を用いて、９６ウェルプレートで成長させたＤ７／４細胞を感染させる。４８時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）２００μＬで２回洗浄する。次に、細胞を透過処理し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および４％ パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ １００μＬを各ウェルに添加（１５分）して、固定する。固定液を除去し、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳで２回、細胞を洗浄する。３％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを添加して、非特異的部位をブロックする（６０分間）。
【００６７】
洗浄後、細胞をウサギ抗ＡＡＤＣ ＩｇＧ抗体（Chemicon, AB136）と共に１時間インキュベーションし、洗浄する。次に、細胞をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧと共に１時間インキュベーションし、洗浄する。抗体を１％ ＢＳＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳに１：１０００希釈する。次に、基質（PNPP, Pierce、カタログ番号３４０４７）を添加（１×ジエタノールアミン基質バッファー中１ｍｇ／ｍＬ、Pierce、カタログ番号３４０６４）し、３０分間インキュベーション後、開裂した基質濃度を分光光度法（λ＝４０５ｎｍ）により測定する。ベクター投入量の関数としてのヒトＡＡＤＣ発現を、スプライン曲線（SigmaPlot）を用いて近似させる。ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ参照ベクターを試験試料と同時に測定する。
【００６８】
本発明の好ましい実例となる実施態様が記載されているが、種々の変更および修飾が、本発明から逸脱することなくその中で成され得ることは当業者に明らかであり、かつ添付の請求の範囲において、本発明の真の精神および範囲内にあるかかる変更および修飾全てをカバーすることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＡＡＶ２−ＦＩＸ粒子の凝集を示すデータを種々のバッファー組成物についての浸透圧（図１Ａ）またはイオン強度（図１Ｂ）の関数として表す。ＡＡＶ２−ＦＩＸベクターを実施例１の方法２により調製する。ｐＨ７．５にて１０ｍＭ リン酸ナトリウムで緩衝化した各濃度の賦形剤中にベクターを希釈後、平均粒子半径を動的光散乱（ＤＬＳ）により測定する。賦形剤は、塩化ナトリウム（ ）、クエン酸ナトリウム （ ）、リン酸ナトリウム（ ）、硫酸ナトリウム（ ）、硫酸マグネシウム（ ）、およびグリセロール（ ）を含む。
【図２】図２は、ＡＡＶ２−ＦＩＸの凝集についてのデータを精製方法の関数として表す。ＤＬＳにより測定され、次に、ｐＨ７．５にて１０ｍＭ リン酸ナトリウムで緩衝化した各濃度の塩化ナトリウム中にベクターを希釈後、平均粒子半径を測定する。方法１（２回のＣｓＣｌ勾配）（ ）；方法２（陽イオン交換クロマトグラフィー）（ ）；方法２＋ヌクレアーゼ消化（ ）；または方法３（クロマトグラフィー＋１回のＣｓＣｌ勾配）（ ）により、ベクターを精製する。精製方法１〜３は、実施例１に記載されている。
【図３】図３は、高いイオン強度製剤（ ）または対照製剤（ ）として調製し、保存したｒＡＡＶ２−ＡＡＤＣビリオンで形質導入したＤ７／４細胞からの導入遺伝子の発現についてのデータを表す。形質導入の７２時間後にＥＬＩＳＡ（それぞれのデータポイントについてトリプリケート）により、ＡＡＤＣの濃度を測定した。エラーバーは標準偏差を表す。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、凝集を防ぐ、ＡＡＶビリオンの製造および保存用組成物および方法に関するものである。
【０００２】
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ヒト遺伝子導入のための有望なベクターである。Grimm, D., and Kleinschmidt, J. A. (1999) Hum Gene Ther. 10:2445-2450；High, K. A. (2001) Ann. N. Y. Acad. Sci. 953:64-67；Pfeifer, A., and Verma, I. M. (2001) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211を参照されたい。ＡＡＶは、パルボウイルスのディペンドウイルス（Dependovirus）属のメンバーである。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、末端逆方向反復（ＩＴＲ）配列にフランクした複製（ｒｅｐ）およびキャプシド形成（ｃａｐ）遺伝子をコードする４６８０ヌクレオチドの１本鎖ＤＮＡ分子から構成される。Berns, K. I. (1996) in Fields Virology (B. N. Fields et. al. Eds.), pp. 2173-2197. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphiaを参照されたい。ゲノムは、ｃａｐ遺伝子産物のアミノ末端変異体である３個のキャプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３）によりパッケージされる。得られた正二十面体のウイルス粒子は直径〜２６ｎｍを有する。ＡＡＶ２の高分解結晶構造が報告された。Xie, Q. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:10405-10410を参照されたい。
【０００３】
精製ＡＡＶ２ウイルス粒子の溶解性には限界があり、そしてＡＡＶ２粒子の凝集が問題とされてきた。Croyle, M. A. et al. (2001) Gene Therapy 8:1281-1290；Huang, J. et al. (2000) Mol. Therapy 1: S286；Wright, J. F. et al. (2003) Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 6:174-178；Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122:17-27を参照。通常用いられる緩衝食塩水溶液中では、有意な凝集は密度１０１３粒子／ｍＬで生じ、密度が高くなればなるほど、凝集は増大する。Huangと共同研究者らは、ＡＡＶベクターが濃度依存性で凝集することを報告した。Huang, J. et al. (2000) Mol. Therapy 1:S286を参照。同様に、Xieと共同研究者ら（Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122: 17-27）は、０．１ｍｇ／ｍＬを超える濃度で、ＡＡＶ２ベクターが、凝集を防ぐための塩の濃度の上昇を必要とすることを報告した。ＡＡＶ２ベクターの凝集は、リン酸緩衝食塩水およびＴｒｉｓ緩衝食塩水のような通常用いられる中性緩衝溶液中１０１３粒子／ｍＬを超える粒子密度で生じる。これは、タンパク質濃度〜０．０６ｍｇ／ｍＬに該当し、これらの条件下でＡＡＶ２の溶解性が低いこをを強調するものである。過剰のエンプティー（empty）キャプシドは同時に精製され、粒子密度に関与するので、カラムクロマトグラフィー技術を用いて精製されたベクターについての有効なベクター濃度の限界は、なおさらに低いかもしれない。
【０００４】
粒子の凝集は有意なものであり、その上アデノウイルスベクターについては完全に解決された課題ではない。最近確立されたアデノウイルス関連材料（ＡＲＮ）の安定性が最近報告された。Adadevoh, K. et al. (2002) BioProcessing 1(2):62-69を参照されたい。２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、および２．５％ グリセロール（ｐＨ８．０）中で形成された関連材料の凝集が、動的光散乱法、光子相関分光法、および外観により評価された。凍結融解サイクルまたは非凍結保存を行った後、ベクターの凝集のレベルが変動し得ることが観察された。このことから、ＡＲＭの使用プロトコールは制限される。
【０００５】
凝集は、精製中の損失、および精製されたベクター調製物の試験における矛盾を生じ得る。中枢神経系のようなある種の部位へのＡＡＶ２ベクターのインビボ投与は少量の高濃度ベクターを必要とし、最大達成可能用量は低いベクター溶解性により制限され得る。
【０００６】
ベクターの凝集はまた、インビボ投与後の生体内分布に影響し、投与後にベクターに対して逆の免疫応答を引き起こすようである。タンパク質について報告（Braun, A. et al. (1997) Pharm. Res. 14:1472-1478）されたように、ベクターの凝集は、ベクターを抗原提示細胞にターゲティングし、キャプシドタンパク質および導入遺伝子産物に対する免疫応答の増強を誘発することにより、免疫原性を増大し得る。前臨床（Chenuaud, P. et al. (2004) Blood 103: 3303-3304；Flotte, T. R. (2004) Human Gene Ther. 15:716-717；Gao, G. et al. (2004) Blood 103:3300-3302）および臨床（High, K. A. et al. (2004) Blood 104:121a）研究におけるＡＡＶベクターに対する免疫応答の報告は、ベクターの免疫原性に関与し得る全ての因子に対処する必要があることを説明するものである。
【０００７】
精製ベクターを特徴付けるためのプロトコールの試験は、ベクターの凝集によっても影響されるようである。ベクターの感染価の決定はベクターの凝集に高感受性であることが報告された。Zhen, Z. et al. (2004) Human Gene Ther. 15: 709-715を参照されたい。重大な関心事は、ベクター凝集物は、それらの導入効率、生体内分布、および免疫原性が単量体粒子とは異なり得るので、インビボ投与後の有害な結果を有し得ることである。例えば、ＡＡＶ２ベクターの肝細胞への血管内デリバリーには、ベクターが肝類洞壁の有窓内皮細胞を通ることが必要である。これらの有窓細胞は、単量体ＡＡＶベクター（直径〜２６ｎｍ）の通過は可能だが、より大きなベクター凝集物の通過を防ぐと予想される、５０から１５０ｎｍの範囲の半径を有する（Meijer, K. D. F., and Molema, G. (1995) Sem. Liver Dis. 15:206）。マウスにおける生体内分布の研究では、蛍光分子Ｃｙ３で標識された凝集ＡＡＶ２ベクターは、血管デリバリーの後、肝マクロファージにおいて補足された。Huang, J. et al. (2000) Mol. Therapy 1:S286を参照。
【０００８】
ウイルスベースの導入ベクターのための製剤の開発は比較的最近の研究分野であり、ＡＡＶベクターの製剤および安定性を最適化するための組織的努力を記載した２、３の研究が報告されているのみである。Croyle, M. A. et al. (2001) Gene Therapy 8:1281-1290；Wright, J. F. et al. (2003) Curr. Opin. Drug Disc. Dev. 6:174-178；Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122:17-27を参照されたい。ベクター調製物における変化を最小化する、前臨床上および臨床上の適用に適合可能な製剤を決定することが、一貫して高いベクターの安定性および機能的特徴を達成するに重要な必要条件である。タンパク質療法について十分に確立されている（Chen, B. et al. (1994) J. Pharm. Sci. 83:1657-1661；Shire, S. J. et al. (2004) J. Pharm. Sci. 93:1390-1402；Wang, W. (1999) Int. J. Pharm. 185:129-188；Won, C. M. et al. (1998) Int. J. Pharm. 167:25-36）のように、ベクターの安定性の重要な見地は製造および保存中の溶解性であり、ベクターの凝集は完全に対処されることを必要とする問題である。ベクターの凝集はベクター精製中の損失を生じる一方、凝集物はろ過により除去され、収量における損失は、より高いコスト、および前臨床および臨床研究用のベクターを生成する場合のキャパシティーの限界となる。凝集物を除去するためのろ過の後でさえ、新たな凝集物が、緩衝食塩水溶液中のＡＡＶ２ベクターの高濃度調製物において形成され得る。
【０００９】
ウイルス粒子の凝集を防ぐ、ｒＡＡＶ２のようなＡＡＶベクターの精製および保存のための改良された製剤および方法に対する必要がある。
【００１０】
発明の概要
当該技術分野におけるこれらの要求および他の要求が本発明によって満たされ、そしてそれは、凍結融解サイクル後でさえ高い感染価および導入効率が維持されるＡＡＶベクターの製造および保存において使用するための高いイオン強度溶液を提供する。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、賦形剤を添加して、凝集を防ぐのに十分な高イオン強度を達成することにより、ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法に関するものである。別の態様において、本発明は、凝集を防ぐのに十分な高イオン強度を有するビリオン組成物に関するものである。
【００１２】
本発明のある種の実施態様において、イオン強度は、少なくとも約１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭまたはそれ以上である。ある実施態様において、このイオン強度は、１種類以上の多価イオン、例えば、クエン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、または硫酸塩を含む賦形剤を用いて達成される。
【００１３】
さらなる実施態様において、イオン強度がビリオンの凝集を防ぐのに十分に高いものであったとしても、ビリオン調製物の浸透圧は、似通った等浸透圧レベル、例えば、２００ｍＯｓｍ、２５０ｍＯｓｍ、２８０ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ、または４００ｍＯｓｍで維持される。
【００１４】
ある実施態様において、ビリオンは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオン、例えば、ＡＡＶ−２である。
【００１５】
本発明の方法の他の実施態様において、ビリオン調製物は、ヌクレアーゼ、例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］で処理される。さらなる実施態様において、ヌクレアーゼ処理は、凝集を防ぐのに十分に高いイオン強度を達成する賦形剤の添加と組合わされる。
【００１６】
本発明のある実施態様において、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８が、例えば、０．００１％までビリオン調製物に添加される。１つの実施態様において、組成物は、精製ウイルス粒子、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、および０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８を含む。
【００１７】
１つの実施態様において、ＡＡＶベクターは、１×１０１３ｖｇ／ｍＬを超える濃度、例えば、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、および６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬまでの濃度で有意な凝集を示すことなく本発明の組成物として保存され得る。ある実施態様において、本発明の方法および組成物を用いて保存されたＡＡＶベクターは、４℃にて５日間保存されたとき、有意な凝集を示さない。他の実施態様において、かかる組成物として保存されたＡＡＶベクターは、−２０℃または−８０℃で凍結融解サイクルを１回、５回、１０回、またはそれ以上行った後、有意な凝集を示さない。
【００１８】
ある実施態様において、本発明の方法および組成物により保存されたビリオン調製物は、動的光散乱により測定された場合に平均的粒子半径（Ｒｈ）を示す。これは、ビリオンの有意な凝集が全く起こらなかったことを示す。ある実施態様において、本発明の方法および組成物により保存されたビリオン調製物は、約１５ｎｍ、２０ｎｍ、または３０ｎｍより大きい平均的粒子半径（Ｒｈ）を示す。
【００１９】
ある実施態様において、本発明の方法および組成物により保存されたビリオン調製物からのビリオンの回収率は、０．２２μｍのフィルターを通してろ過した後、約８５％、９０％、または９５％より高い。
【００２０】
なお別の実施態様において、本発明は、本発明の高いイオン強度製剤を含むキットに関するものである。１つの実施態様において、キットは、予め混合された賦形剤溶液を含む。別の実施態様において、キットは、本発明の高いイオン強度組成物の２種類以上の成分を別々に含み、これは使用者により混合され得る。ある実施態様において、キットは、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ［登録商標］、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８を含む。他の実施態様において、キットは、本発明の組成物の製造、あるいは本発明の方法の実施のための指示書をさらに含む。
【００２１】
発明の詳細な説明
ＡＡＶ２ベクターの凝集は、ベクターの高濃度調製物において頻繁に観察され、そして精製、回収、およびインビボでの能力および安全性に影響を及ぼし得る。ゆえに、ＡＡＶ２ベクターの開発にとって重要な目的は、高濃度ストックが調製されるときにベクターの凝集を防ぐ方法および製剤を同定することである。
【００２２】
特に示さない限り、本明細書において用いられる用語「ベクター」は、組換えＡＡＶビリオン、またはウイルス粒子に言及し、「ベクター」が頻繁に用いられるにも関わらず、他の文脈においてはプラスミドのような非ウイルスＤＮＡ分子にも言及する。
【００２３】
本発明は、凝集過程におけるウイルス粒子間のイオン相互作用の関与を示唆する、溶液のイオン強度がＡＡＶベクター凝集の重要なパラメーターであるという知見に一部基づくものである。イオン強度の上昇が、荷電賦形剤の同一性に関わらず、ＡＡＶ２ベクターの溶解性を増大させるという知見は、特定のイオン種に関与する相互作用よりむしろ溶液自体のイオン強度が、関連する物理化学的パラメーターであるという仮説を支持するものである。少なくとも２００ｍＭの閾値イオン強度が、本明細書で調べられるベクター粒子密度での凝集を防ぐのに必要とされる。
【００２４】
実際的な関心事のうち、通常用いられる緩衝食塩水溶液は、１０１３粒子／ｍＬを超える密度でのＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐのに十分なイオン強度を有する。高い塩濃度は、ＡＡＶ２ベクターの溶解性を増大させることが知られている（例えば、勾配から回収された高濃度ＡＡＶ２ベクターは、一般に、高濃度ＣｓＣｌに溶解性のままである）。しかしながら、前臨床および臨床研究に最適な製剤は、特に、高張液の希釈が遅い可能性のある部位へのベクターのインビボ投与のため、等張（２８０〜４００ｍＯｓｍ）近くであるべきである。本発明の実施態様において、イオン強度の荷電価数との指数関数的関係を用いて、高いイオン強度を有する等張製剤が開発される。ヒト非経腸製剤における賦形剤として通常用いられる複数の電荷価数を有する塩種（例えば、硫酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩）は、等張濃度で用いられるとき、ＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐために必要とされるイオン強度レベルをもたらし得る。等張（１５０ｍＭ）塩化ナトリウムは、イオン強度１５０ｍＭ（高いベクター濃度でのＡＡＶ２の溶解性を維持するのに十分な値である）を有する一方、イオン強度〜５００ｍＭを有する等張クエン酸ナトリウムは、少なくとも６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ２ベクター濃度を凝集することなく支持することができる。
【００２５】
理論により制限されることを意図するのではないが、ＡＡＶ２粒子の低い溶解性は、凝集物における隣接粒子間の相補的に荷電した領域の安定効果と併せてそれらの高度に対称的な性質により引き起こされ得る。ＡＡＶ２の結晶構造に基づく表面電荷密度（Xie, Q. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:10405-10410）は、ウイルス表面上の正および負の電荷パターンを示す。従前の報告により、ＡＡＶ２ベクターの凝集がｐＨ依存性であることが示され、荷電した側鎖基を有するアミノ酸が粒子間結合に関与するとの仮説が立てられた。Qu, G. et al. (2003) Mol. Therapy 7:S238を参照。これらの報告により、荷電したアミノ酸側鎖がベクターの凝集に関与するなら、高濃度の遊離アミノ酸がベクター粒子の相互作用をブロックし得るとの仮説が立てられた。しかしながら、本発明者らは、荷電した側鎖を有するアミノ酸は、それらのイオン強度への関与を超えてＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐ際に有効でないことを見出した。
【００２６】
低いイオン強度でのベクターの凝集は、精製ベクター粒子の有効なヌクレアーゼ処理により低減されるが、阻止されないことも見出した。精製過程の初期工程における消化（清澄化ＨＥＫ細胞溶解物）は、ベクター精製後の凝集を低減しなかった。核酸基質に対する酵素の割合がより高いので、既に精製されたビリオンの消化はより有効なようである。これらの結果を説明する１つのメカニズムは、ベクター表面に結合した残りの核酸不純物（例えば、宿主細胞およびプラスミドＤＮＡ）が、隣接するウイルス粒子上の結合部位をもたらし、これにより凝集を生じ得るということである。精製ＡＡＶ２ベクター（エンプティーキャプシドなし）は、約１％の非ベクターＤＮＡを含有することが報告された。Smith, P. et al. (2003) Mol. Therapy 7:S348を参照。この非ベクターＤＮＡの＞５０％が、ヌクレアーゼ耐性であり、キャプシド粒子内にパッケージされることが報告された。一方、不純物ＤＮＡのうち、ヌクレアーゼ耐性であり、精製ベクター粒子の表面と結合するように思われるものもあった。有効なヌクレアーゼ処理がベクターの凝集を低減し得るという知見により、１個のベクター粒子当たり２５ヌクレオチド以下の平均的レベルでベクター表面と結合する核酸がＡＡＶベクターの凝集に関与し得ることが示唆される。
【００２７】
要約すると、ＡＡＶ２ベクターの精製中の高いイオン強度溶液の使用および最終製剤、ならびに残りのベクター表面ＤＮＡの有効な除去は、前臨床および臨床研究において使用するためのＡＡＶ２ベクターの高濃度溶液を達成するための２つの有効なストラテジーである。高いイオン強度溶液およびヌクレアーゼ処理は、組み合わせて、または別々に用いられ得る。データはＡＡＶ２ベクターを用いて得られたものだが、本発明の組成物および方法は、他のＡＡＶ血清型／変異体、またはアデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルスのような他のウイルスベクターにも有用であり得る。
【００２８】
賦形剤の濃度の関数としてのＡＡＶの凝集
ＡＡＶベクターの凝集の機序を明らかにし、凝集を低減／阻止し得る賦形剤の種類を同定するために、最初のスクリーニング実験を行う。低い濃度の緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２）を含む中性緩衝食塩水においてベクターを希釈（５倍）して、ベクターの凝集を引き起こすことができる。希釈液に含まれるとき、ベクターの凝集を防ぐことができる賦形剤を同定するための「希釈圧力（dilution-stress）」法を用いて、賦形剤をスクリーニングする。スクリーニングのため、動的光散乱（ＤＬＳ）により凝集を測定する。調べた賦形剤の種類は、選択した無機塩類、アミノ酸、非荷電炭水化物、および界面活性剤を含むものであった。結果を表１に表す。
【００２９】
表１
希釈圧力法を用いた、ＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐ賦形剤についてのスクリーニング
【表１】
ＮＩＡ：凝集の阻害なし
【００３０】
表１に示す通り、荷電した賦形剤（無機塩およびアミノ酸）は、十分な濃度で存在するとき、凝集を防ぐ。しかしながら、ベクターの凝集を防ぐのに必要な塩濃度は変動し、それは、硫酸マグネシウムについて１８０ｍＯｓｍから塩化ナトリウムについて３２０ｍＯｓｍの範囲に及ぶ。アミノ酸のアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、およびリジンは、２００ｍＯｓｍで凝集を阻止しないが、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸は、３００〜３２０ｍＯｓｍで凝集を防ぐ。アルギニン、グリシン、およびヒスチジンは、２００ｍＯｓｍ以外の濃度で試験しなかった。選択した炭水化物は、５％ｗ／ｖまでの濃度で存在するとき、ベクター粒子の凝集に対する効果を全く有さない。例えば、５％ｗ／ｖ グリセロール（５４３ｍＯｓｍ）は凝集を阻止しない。界面活性剤のポリソルベート８０（１％ｗ／ｖ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８（１０％ｗ／ｖ）は、同様に、「希釈圧力」法を用いた凝集に対する効果を全く有さない。
【００３１】
浸透圧およびイオン強度の関数としてのＡＡＶの凝集
図１Ａおよび１Ｂは、ベクターの凝集のより詳細な分析の結果を種々の塩の濃度の関数として示す。図１Ａは、ベクターの凝集を選択した賦形剤の浸透圧の関数として示す。荷電した種について、ＡＡＶ２ベクターの凝集の濃度依存性阻害を観察する。多価イオンを有する塩は、１価の塩化ナトリウムより低い濃度で同程度の凝集阻害を達成する。例えば、硫酸マグネシウムは２００ｍＯｓｍで凝集を防ぐが、塩化ナトリウムは同様の効果を達成するのに３５０ｍＯｓｍを必要とする。クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウムは、ベクター凝集を防ぐそれらの有効性の中間である。
【００３２】
図１Ａおよび表１の結果は、グリセロールおよび５％までの濃度でのある種の糖の、低いイオン強度により誘発されるＡＡＶ２ベクターの凝集に対する効果を全く示していないが、データにより、５％より高いグリセロール濃度でのＡＡＶ２の溶解性の改善を除外することはできない。例えば、Xieと共同研究者らは、２５％（ｗ／ｖ） グリセロールが、低いイオン強度溶液においてＡＡＶ２を非常に高濃度（４．４から１８×１０１４粒子／ｍｌ）まで濃縮できることを報告した。Xie, Q. et al. (2004) J. Virol. Methods 122:17-27を参照されたい。
【００３３】
図１Ｂは、図１Ａのデータを、それぞれの賦形剤について浸透圧ではなく計算したイオン強度の関数としてプロットしたものを示す。図１Ｂは、用いる塩に関わらず、イオン強度が２００ｍＭ以上のとき、ベクターの凝集は阻止されることを示している。これらのデータは、溶質濃度および電荷価数の両方に依存するパラメーターである溶液のイオン強度（μ）が、凝集に影響する１次因子であることを示唆するものであった。
【００３４】
本発明の実施態様において凝集を防ぐのに有用なイオン強度は、例えば、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、またはそれより高いイオン強度を含む。本発明の方法および製剤においてこれらのイオン強度を達成するには多価イオンが好ましく、例えば、２価、３価、４価、５価のイオン、およびそれより高い価数のイオンである。本発明の溶液および製剤におけるｐＨバッファーは、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、またはＨＥＰＥＳ（または他の良好なバッファー）であってもよく、任意の他の適当なｐＨバッファーが用いられてもよい。好ましい実施態様において、製造されるベクターの標的組織と相性のよい多価イオンおよびバッファーが選択される。
【００３５】
本発明の方法および組成物における多価イオンの使用により、比較的低い浸透圧だが、高いイオン強度の組成物を生成することが可能になる。本発明の高いイオン強度の組成物は、ほぼ等張であってもよく、例えば、約２００ｍＯｓｍ、２５０ｍＯｓｍ、２８０ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ、３５０ｍＯｓｍ、または４００ｍＯｓｍであってもよいが、他の浸透圧は、組成物のある種の使用に許容され得る。
【００３６】
ＡＡＶの精製方法の関数としてのＡＡＶの凝集
異なる方法（例えば、密度勾配精製対イオン交換クロマトグラフィー）により精製された組換えＡＡＶ２は、異なる不純物プロファイルを有すると予測される。図２は、精製方法の異なるいくつかのＡＡＶ調製物について、イオン強度の関数としてベクターの凝集を示す。精製方法は実施例１に記載されている。塩化ナトリウムを用いて、イオン強度を変動させる。２回塩化セシウム勾配超遠心（方法１）、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（方法２）、または合わせたカラムおよび塩化セシウム勾配超遠心（方法３）により精製されたＡＡＶ２−ＦＩＸベクターはそれぞれ、イオン強度が低減するにつれ、類似の凝集応答を示す。対照的に、カラム方法による精製、次に、ヌクレアーゼ消化工程（方法２＋ヌクレアーゼ）の対象とされたＡＡＶ２−ＦＩＸは、低いイオン濃度での凝集の低減を示す。
【００３７】
製造的スケールでのＡＡＶの凝集
表１、および図１Ａ、１Ｂ、および２のデータは、分析的スケール（凝集を測定するためのＤＬＳを利用する）でのベクターの凝集に関連する。対照的に、表２は、製造的スケールのベクター精製に相当する、ベクターの凝集を誘発し、定量するための方法を用いて、ラージスケールでのＡＡＶ２ベクターの凝集に対する上昇したイオン強度およびヌクレアーゼ処理の効果を示す。実験の詳細を実施例２に記載する。精製ＡＡＶベクターを、種々のイオン強度の溶液中にダイアフィルトレーションし、容量を低減して、高いベクター濃度を達成し、次に、０．２２μｍのフィルターを通してろ過した後のベクターの回収率を測定することにより、凝集を評価する。方法１ないし第２のＣｓＣｌ勾配遠心工程（９１ｍＬ中１．８×１０１５ｖｇ、〜３Ｍ ＣｓＣｌ中１．８×１０１３ｖｇ／ｍＬ）により精製したＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターの単一プールからのアリコートを、ダイアフィルトレーション実験の出発材料として用いる。中空糸を用いたタンジェンシャルフローフィルトレーションをダイアフィルトレーションのために用いる。なぜなら、それはスケールの拡大縮小が可能であり、様々な容量（最小１．４ｍＬ）の調製も可能であるため、中性緩衝食塩水中で凝集が生じると予測される濃度にＡＡＶを濃縮できるからである。
【００３８】
実験１において、３個の中空糸単位を用いて、製剤ＣＦ、ＴＦ１、またはＴＦ２においてＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターをダイアフィルトレーションし、容量を目標の２．５×１０１３ｖｇ／ｍＬまで低減する。実施例２を参照されたい。次に、試料を０．２２μｍのフィルターを通してろ過する。結果を表２に示す。上昇したイオン強度製剤ＴＦ１（９５±７．４％）およびＴＦ２（９３±７．４％）両方についてのベクター回収率（「収率％」）は、対照製剤ＣＦを用いた回収率（７７±６．６％）より有意に高い。
【００３９】
表２
処理スケールでのＡＡＶベクターの回収率
【表２】
【００４０】
実験２において、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣをＣＦまたはＴＦ２においてより高い目標値（６．７×１０１３ｖｇ／ｍＬ）まで濃縮する。ＴＦ２を用いたベクターの回収率（９６±４．４％）は、再度、ＣＦを用いた回収率（５９±６．０％）より有意に高い。用いたアッセイの変化内、ＴＦ２を用い目標濃度の両方でベクターを完全に回収した。これは、凝集が阻止されたことを示す。対照において、ＣＦを用いた目標濃度の両方で有意な凝集を観察し、凝集の程度（すなわち、０．２２μｍろ過後の損失）は、目標ベクター濃度が高くなるほど、高くなった。さらなる実験（示していない）において、実験２の濃縮後、０．２２μｍろ過工程前にＡＡＶ２ベクター試料５０μＬを採取し、次に、光学顕微鏡により調べる。ＣＦにおいて濃縮したベクターは、明らかな量の目に見える物質を含有し（示していない）、一方、かかる物質は、ＴＦ２において濃縮したベクターにおいて全く観察されない。
【００４１】
実験３は、精製ベクターのヌクレアーゼ消化前の凝集に対する効果を調べるものである。ヌクレアーゼ消化がない場合、ＣＦにおけるＡＡＶ２−ＡＡＤＣの回収率は、６８±１１％であり、これは実験１および２における回収率に類似する。対照において、ヌクレアーゼ処理し、次に、ＣＦにおいて濃縮した精製ベクターはより高い回収率（９１±１２％）となる。これらの製造用スケールの結果は、「希釈圧力」（分析的スケール）法を用いた図２に示すヌクレアーゼ消化の効果と同じ効果を反映する。
【００４２】
表２に表す結果は、本発明の方法および組成物が、ＡＡＶベクターの回収率を増大させることを示す。例えば、本発明の種々の実施態様において、回収率は、約８０％未満から少なくとも約８５％、９０％、９５％、またはそれ以上まで改善される。
【００４３】
保存または凍結融解サイクル後のＡＡＶの安定性および活性
Croyleと共同研究者らは、リン酸ナトリウム緩衝液において凍結融解サイクルを複数回行った後のＡＡＶおよびアデノウイルスのタイターの有意な損失を報告し、リン酸カリウムによりもたらされるより良好なｐＨの緩衝化により、凍結融解サイクル中のタイターの損失が阻止されることを示した。Croyle, M. A. et al. (2001) Gene Therapy 8: 1281-1290を参照されたい。本発明者らのリン酸ナトリウムを用いた凍結融解の安定性の研究の結果は、これらの知見を支持するものである。本発明者らは、１５０ｍＭ リン酸ナトリウムが、高濃度のＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターの調製および非凍結保存中の凝集を防ぐのに十分なイオン強度をもたらすが、−２０または−８０℃での１回の凍結融解サイクルでさえ凝集を生じることを見出した。
【００４４】
保存または凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル後のＡＡＶの安定性を、本発明の緩衝液において次の通り評価する。ＣＦ、ＴＦ１、およびＴＦ２において調製した高濃度のベクター（表２、実験１）を短期間の安定性の研究の対象とし、凝集が冷蔵保存中または複数回の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル後に生じ得るかどうかを評価する。未希釈の試料を用いたＤＬＳにより凝集を評価し、Ｒｈ値＞２０ｎｍがあるレベルの凝集の発生を示すとみなす。
【００４５】
表３
ＡＡＶ２ベクターの概要
【表３】
Ｐｒｅ：０．２μｍろ過直後に測定したＤＬＳ半径
ベクター濃度（ｖｇ／ｍＬ）：ＣＦ：１．９３Ｅ１３、ＴＦ１：２．３８Ｅ１３、ＴＦ２：２．３３Ｅ１３
ＴＨ：過剰の凝集のため、シグナル強度があまりに高く測定できない
【００４６】
表３に示すとおり、ＣＦにおいて調製したＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターは、４℃で５日間の保存後、ならびに−２０または−８０℃での１回以上のＦ／Ｔサイクル後にいくらかの凝集を示す。ＴＦ１において調製したベクターについては、４℃で５日間保存後に凝集は全く生じなかったが、−２０または−８０℃での１回のＦ／Ｔサイクル後に凝集が生じる（測定するにはシグナル強度があまりに高く、ＤＬＳにより示す）。これらの試料の外観検査は若干の懸濁を示し、そしてそれは凝集と一致する。ＴＦ２において調製したベクターについては、４℃での保存後または−２０℃でのＦ／Ｔサイクル１０回まで、凝集は全く観察されない。−８０℃での５および１０回のＦ／Ｔサイクル後、凝集がいくらか観察される。
【００４７】
ＴＦ２における保存またはＦ／Ｔサイクル後のＡＡＶ活性を、次の通り評価する。上述の通り、高いイオン強度、等張な製剤ＴＦ２は、濃縮および保存中のベクターの凝集を効果的に防ぎ、それゆえ、さらなる研究の前途有望な候補を表している。重要な疑問は、高いイオン強度のＴＦ２におけるベクターの調製および保存が、その機能活性に反対に影響するかどうかということである。これを評価するために、ＴＦ２において長時間調製し、保存したベクターの感染価および導入効率を測定するためのアッセイを行う。
【００４８】
感染性については、１回の感染現象を検出可能な高感度の感染性アッセイを用いる。Zhen, Z. et al. (2004) Human Gene Ther. 15:709-715を参照されたい。ＡＡＶ２−ＡＡＤＣを濃度６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬにてＴＦ２中に調製する。４℃にて４５日間保存後、調製物は、感染単位に対するベクターゲノムの比（ｖｇ／ＩＵ）１３を有し、これに対して参照ベクターの値は１６ｖｇ／ＩＵである。この差は、報告されたこのアッセイの変動性（ＲＳＤ〜５０％）を与えるほど有意ではない。
【００４９】
Ｄ７／４細胞を形質導入後、ＥＬＩＳＡによりＡＡＤＣタンパク質の発現を測定することにより、形質導入効率を評価する。図３は、１０から１０５ｖｇ／細胞までの範囲のベクター投入量について、ＴＦ２において調製したベクターと参照対照との間で有意差がないことを示す。さらに、これらのデータは、高いイオン強度のＴＦ２におけるＡＡＶ２ベクターの調製および保存が、ベクターの感染性または導入効率に対して有害な効果を有さないことを示す。
【００５０】
結論
ウイルス粒子の相互作用に対するイオン強度（μ）の効果を決定し、ベクターの凝集の機序を解明する。中性緩衝等張食塩水（μ＝１５０ｍＭ）のイオン強度は、〜１０１３粒子／ｍＬを超える密度での勾配超遠心または陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐのに十分である。５％（ｗ／ｖ）までの濃度の糖（ソルビトール、スクロース、マンニトール、トレハロース、グリセロール）または界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０［登録商標］（１％）またはＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８（１０％）の含有は、ベクター粒子の凝集を阻止しない。
【００５１】
対照的に、精製中および最終ベクター製剤のために、上昇したイオン強度の溶液（μ＞２００ｍＭ）を用いるとき、ベクター粒子は依然溶解性である。インビボ投与のための等張賦形剤濃縮物を用いた上昇したイオン強度の溶液を、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、および硫酸マグネシウムを含む多価イオンの塩を用いて調製する。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８、ｐＨ８．０（μ〜５００ｍＭ）を含有する等張製剤により、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターを６．４×１０１３ｖｇ／ｍＬまで濃縮可能であり、調製中および−２０℃で凍結融解サイクルを１０回行った後に観察される凝集が全くない。以下の表３および付随の考察を参照されたい。上昇したイオン強度の製剤にて長時間調製し、保存したＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターは、高い感染価（１３ＩＵ／ｖｇ）および導入効率を保持する。
【００５２】
精製ＡＡＶ２ベクターのヌクレアーゼ処理は、ベクターの凝集の程度を低減し、このことは粒子間相互作用におけるベクター表面の核酸不純物の関与を示唆する。ゆえに、上昇したイオン強度の等張製剤の使用と組み合わせた、ベクター表面の残りの核酸を有効に除去するための精製方法が、ＡＡＶ２ベクターの凝集を防ぐのに有用な方法である。
【００５３】
実施例１
ＡＡＶ精製方法
ヒト凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）またはヒトアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）を発現するＡＡＶ２ベクターを、既に記載（Matsushita, T. et al. (1998) Gene Therapy 5:938-945）の通り（変更含む）、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションにより生成する。ラージスケールの調製のため、細胞を８５０ｍｍ２のローラーボトル（Corning）にて培養し、トランスフェクションする。ベクターを３種類の方法のうちの１つで精製する。
【００５４】
精製方法１（Matsushitaから変更されている）において、ローラーボトル中のトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を遠心（１０００ｇ、１５分）により回収し、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５００ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．２に再懸濁し、次に、３回の凍結融解サイクル（エタノール／ドライアイスバスおよび３７℃のウォーターバスを交互）により溶解する。細胞溶解物を遠心（８０００ｇ、１５分）により清澄化する。次に、１０ｍＭ リン酸ナトリウム，ｐＨ７．２を添加して、上清を２００ｍＭ ＮａＣｌまで希釈し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］（Merck, Purity Grade 1；２００Ｕ／ｍＬ、１時間、３７℃）を用いて消化する。溶解物を２５ｍＭ ＣａＣＩ２まで１Ｍ ストック溶液を用いて調節し、４℃で１時間インキュベーションする。
【００５５】
混合物を遠心（８０００ｇ、１５分）し、ベクターを含有する上清を回収する。清澄化した細胞溶解物からウイルスを沈殿させるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）を最終濃度８％まで添加し、混合物を４℃にて３時間インキュベーションし、次に遠心（８０００ｇ、１５分）する。ベクターを含有するペレットを、混合しながら０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再懸濁し、４℃で１６時間インキュベーションする。再懸濁した材料をプールし、固体塩化セシウムを最終密度１．４０ｇｍ／ｍｌまで添加する。次に、ＢｅｃｋｍａｎモデルＬＥ−８０遠心機を用いた超遠心（ＳＷ２８、２７０００ｒｐｍ、２４時間、２０℃）により、ベクターをバンド化する。遠心チューブを画分化し、ベクターを含有する密度１．３８から１．４２ｇｍ／ｍＬ部分をプールする。この材料を超遠心（ＮＶＴ６５ローター、６５０００ｒｐｍ、１６時間、２０℃）によって２回目のバンド化し、精製ＡＡＶ２ベクターを含有する分画をプールする。ベクターを濃縮し、バッファー交換を行うために、高濃度塩化セシウム溶液中のベクターを、以下（実施例２）に記載のタンジェンシャルフローフィルトレーションによる限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）の対象とする。
【００５６】
精製方法２において、ＡＡＶを含有する細胞回収物をマイクロ流動化し、続いて、０．６５および０．２２μｍのフィルター（Sartorius）を通してろ過する。既に記載のＰｏｒｏｓ ＨＳ５０樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ウイルスを清澄化細胞溶解物から精製する。米国特許第６，５９３，１２３号を参照。図２に記載のヌクレアーゼ消化のために、カラム精製ベクターを、１００Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅおよび１０Ｕ／ｍＬ ＤＮＡｓｅ Ｉ（ＲＮＡｓｅフリー、Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana）と共にインキュベーション（４時間、室温）する。
【００５７】
精製方法３のため、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製したＡＡＶ２ベクターを、さらに塩化セシウム勾配超遠心工程（ＳＷ２８、２７０００ｒｐｍ、２０時間）の対象とし、ＵＦ／ＤＦ前にエンプティーキャプシドを除去する。
【００５８】
リアルタイム定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）を用いて、上述のＡＡＶ調製物を定量する。Sommer, J. M. et al. (2003) Mol. Therapy 7:122-128を参照。３種類の方法それぞれにより精製したベクターを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／銀染色分析により分析し、全てのケースで、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３が予測した割合で存在し、さらに、キャプシドタンパク質は走査濃度測定により決定した総タンパク質の＞９５％を表す。しかしながら、方法２（カラムクロマトグラフィー）により精製したベクターは、方法１および３により精製した勾配精製ＡＡＶ２ベクター同様、エンプティーキャプシドを含有し、これは１ベクターゲノム当たり３〜１０個のエンプティーキャプシド範囲に渡る。
【００５９】
実施例２
ＡＡＶ２の凝集を検出するための限外ろ過およびダイアフィルトレーション
使い捨ての中空糸タンジェンシャルフローフィルトレーション装置（Amersham BioSciences 8" Midgee、１００ｋＤａの通常の孔サイズ）を用いて、上述の方法および表２に記載のＵＦ／ＤＦ実験について記載の方法により精製したＡＡＶ２ベクターを濃縮し、ダイアフィルトレーションする。全ＵＦ／ＤＦ方法のため、１０×生成物容量に該当するダイアフィルトレーションバッファー容量を用い、それを〜１ｍＬずつの増加にて添加し、ほぼ連続してダイアフィルトレーションする。この方法を用いて、ダイアフィルトレーション後に計測した残りのＣｓＣｌは、＜０．５ｍＭである。
【００６０】
ＵＦ／ＤＦについては、次の３種類の製剤：対照製剤（ＣＦ：１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５％ ソルビトール、ｐＨ７．３）；試験製剤１（ＴＦ１：１５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）；および試験製剤２（ＴＦ２：１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いた。表２に示す実験について、ベクター濃度１×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する容量でダイアフィルトレーションを行い、ダイアフィルトレーション後、２．５×１０１３ｖｇ／ｍＬ（ベクターの損失は全くないと仮定）に該当する値まで容量を低減する。
【００６１】
実験２について、２×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する容量でダイアフィルトレーションを行い、次に、容量を６．７×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する値に低減する。
【００６２】
実験３（ＣＦ±Ｂｚ）について、ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ（約１．２×１０１４ｖｇ）をまず、ＴＦ１（ヌクレアーゼ活性と適合し得る製剤）にダイアフィルトレーションし、次に、０．２２μｍのフィルターに通す。この材料のタイターを決定し、容量を濃度１×１０１３ｖｇ／ｍＬになるよう調節する。この材料１０ｍＬに、ＭｇＣｌ２を濃度２ｍＭまで添加し、次に２つの等しいアリコートに分配する。第１のアリコートをＢｅｎｚｏｎａｓｅ（２００Ｕ／ｍＬ、４時間、ＲＴ）と共にインキュベーションし、第２のアリコートを偽インキュベーションする。次に、それぞれのアリコートを、ベクター濃度２×１０１３ｖｇ／ｍＬに該当する容量でダイアフィルトレーションし、次に、目標３．６×１０１３ｖｇ／ｍＬまで濃縮する。全ＵＦ／ＤＦプロトコールの後、１％ ストックのＰｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ−６８（BASF Corp., Mount Olive, NJ）を最終濃度０．００１％までベクター生成物に添加し、溶液を０．２２μｍのシリンジフィルター（Sartorius）に通す。全ＵＦ／ＤＦ方法を、ラミナーフローキャビネット内で行う。
【００６３】
実施例３
動的光散乱によるベクターの凝集の測定
Protein Solutions DynaPro 99（λ＝８２５．４ｎｍ）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）により、精製ベクターを凝集について分析する。１次データ（粒子半径−Ｒｈ、３０サイクル、１０サイクル／分に渡り測定した平均値）を、報告した分析全てについて用いる。「希釈圧力」法を用いて、ベクター凝集に対する種々の賦形剤の効果を評価する。この方法において、試験希釈液８０μＬをベクター溶液２０μＬに、ＤＬＳ測定のために用いる実測用キュベット中で混合しながら添加し、データの収集を混合１０秒以内に開始する。試験希釈物の添加前に、ＡＡＶ２ベクター調製物のＲｈ値を測定し、＜１５ｎｍであることを確かめ、出発材料が単量体であることを確認する。１００％単量体でない試料は、０．２２μｍのシリンジディスクフィルター（Sartorius、低タンパク質結合）に通して凝集物を除去する。
【００６４】
図１および２において示す浸透圧およびイオン強度値を、混合物（すなわち、重量：試験希釈液（８０％）および出発ベクター製剤（２０％））に存在する全ての賦形剤を用いて計算する。浸透圧を、方程式：
【数１】
（ｃｉは各溶液種のモル濃度である）により計算する。イオン強度（μ）を、方程式：
【数２】
（ｚｉは、各種上の荷電である）により計算する。ベクターの凝集を生じる条件（例えば、低μ）では、Ｒｈの漸進的増加を一連のデータ回収に渡り観察する。希釈後３分間隔で測定した平均Ｒｈが凝集の信頼可能な測定であることを確認するために、同じ時間間隔でのＲｈの平均増加速度（ΔＲｈ／Δｔ）も決定する（示していない）。ΔＲｈ／Δｔの分析は、図１および２に報告した平均Ｒｈ値を用いて得たものと一致する結果を生じる。
【００６５】
実施例４
ＡＡＶビリオンの感染性
ＡＡＶ２−ＡＡＤＣベクターの感染性を既に記載の高感度アッセイを用いて決定する。Zhen, Z. et al. (2004) Human Gene Ther. 15:709-715を参照されたい。簡単に言うと、試料を連続希釈（１０倍希釈、１０複製物／希釈）し、１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中９６ウェル組織培養プレート（Falcon，カタログ番号３５３２２７）にて成長させたＤ７／４細胞（ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐを発現する改変ＨｅＬａ細胞）に添加する。アデノウイルス（Ａｄ−５、１００ｖｐ／細胞）を各ウェルに添加し、ヘルパー機能を提供する。４８時間後、各ウェルにおけるＡＡＶベクターの複製を、導入遺伝子特異的プライマーおよびプローブを用いたＱ−ＰＣＲにより定量し、限界希釈における感染頻度を、Ｋａｒｂｅｒ法により分析し、感染価を計算する。ＣＦにおいて予め調製し、−８０℃で保存した参照ＡＡＶ２−ＡＡＤＣと同時に、試験試料を実施する。
【００６６】
ＡＡＶ２ベクターの導入効率を、全細胞ＥＬＩＳＡにより定量する。１０から１０５ｖｇ／細胞投入量（５複製物／希釈）に該当する試験試料および参照ベクターの１０倍連続希釈物を用いて、９６ウェルプレートで成長させたＤ７／４細胞を感染させる。４８時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）２００μＬで２回洗浄する。次に、細胞を透過処理し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および４％ パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ １００μＬを各ウェルに添加（１５分）して、固定する。固定液を除去し、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳで２回、細胞を洗浄する。３％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳを添加して、非特異的部位をブロックする（６０分間）。
【００６７】
洗浄後、細胞をウサギ抗ＡＡＤＣ ＩｇＧ抗体（Chemicon, AB136）と共に１時間インキュベーションし、洗浄する。次に、細胞をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧと共に１時間インキュベーションし、洗浄する。抗体を１％ ＢＳＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳに１：１０００希釈する。次に、基質（PNPP, Pierce、カタログ番号３４０４７）を添加（１×ジエタノールアミン基質バッファー中１ｍｇ／ｍＬ、Pierce、カタログ番号３４０６４）し、３０分間インキュベーション後、開裂した基質濃度を分光光度法（λ＝４０５ｎｍ）により測定する。ベクター投入量の関数としてのヒトＡＡＤＣ発現を、スプライン曲線（SigmaPlot）を用いて近似させる。ＡＡＶ２−ＡＡＤＣ参照ベクターを試験試料と同時に測定する。
【００６８】
本発明の好ましい実例となる実施態様が記載されているが、種々の変更および修飾が、本発明から逸脱することなくその中で成され得ることは当業者に明らかであり、かつ添付の請求の範囲において、本発明の真の精神および範囲内にあるかかる変更および修飾全てをカバーすることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＡＡＶ２−ＦＩＸ粒子の凝集を示すデータを種々のバッファー組成物についての浸透圧（図１Ａ）またはイオン強度（図１Ｂ）の関数として表す。ＡＡＶ２−ＦＩＸベクターを実施例１の方法２により調製する。ｐＨ７．５にて１０ｍＭ リン酸ナトリウムで緩衝化した各濃度の賦形剤中にベクターを希釈後、平均粒子半径を動的光散乱（ＤＬＳ）により測定する。賦形剤は、塩化ナトリウム（ ）、クエン酸ナトリウム （ ）、リン酸ナトリウム（ ）、硫酸ナトリウム（ ）、硫酸マグネシウム（ ）、およびグリセロール（ ）を含む。
【図２】図２は、ＡＡＶ２−ＦＩＸの凝集についてのデータを精製方法の関数として表す。ＤＬＳにより測定され、次に、ｐＨ７．５にて１０ｍＭ リン酸ナトリウムで緩衝化した各濃度の塩化ナトリウム中にベクターを希釈後、平均粒子半径を測定する。方法１（２回のＣｓＣｌ勾配）（ ）；方法２（陽イオン交換クロマトグラフィー）（ ）；方法２＋ヌクレアーゼ消化（ ）；または方法３（クロマトグラフィー＋１回のＣｓＣｌ勾配）（ ）により、ベクターを精製する。精製方法１〜３は、実施例１に記載されている。
【図３】図３は、高いイオン強度製剤（ ）または対照製剤（ ）として調製し、保存したｒＡＡＶ２−ＡＡＤＣビリオンで形質導入したＤ７／４細胞からの導入遺伝子の発現についてのデータを表す。形質導入の７２時間後にＥＬＩＳＡ（それぞれのデータポイントについてトリプリケート）により、ＡＡＤＣの濃度を測定した。エラーバーは標準偏差を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法であって、少なくとも約２００ｍＭのイオン強度を達成するためにビリオン調製物に１種類以上の賦形剤を添加することを含む、方法。
【請求項２】
ビリオンがＡＡＶビリオンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ビリオン調製物をヌクレアーゼで処理することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼがＢｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
１種類以上の賦形剤が多価イオンを含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
多価イオンがクエン酸塩である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種類以上の賦形剤の添加後のビリオン調製物の浸透圧が、約２８０ｍＯｓｍ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
１種類以上の賦形剤の添加後、ビリオン調製物におけるビリオンの平均粒子半径（Ｒｈ）が約２０ｎｍ未満（動的光散乱により測定される）である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
１種類以上の賦形剤の添加後、ビリオンの回収率が、０．２２μｍのフィルターを通してビリオン調製物をろ過した後、少なくとも約９０％である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
精製ウイルス粒子；
ｐＨバッファー；および
１種類以上の多価イオン
を含む賦形剤を含む精製ウイルス粒子の保存用組成物であって、イオン強度が約２００ｍＭより高い、組成物。
【請求項１１】
精製ウイルス粒子がＡＡＶウイルス粒子である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
１種類以上の多価イオンの１つがクエン酸イオン（citrate）である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８をさらに含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８が、０．００１％にて存在する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ｐＨバッファーが１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０であり、賦形剤が１００ｍＭ クエン酸ナトリウムを含むものである、請求項１０記載の組成物。
【請求項１６】
精製ウイルス粒子の平均粒子半径（Ｒｈ）が約２０ｎｍ未満（動的光散乱により測定される）である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１７】
精製ウイルス粒子の回収率が、０．２２μｍのフィルターを通してビリオン組成物をろ過した後、少なくとも約９０％である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１８】
ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法であって、該ビリオン調製物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］で処理することを含む、方法。
【請求項１９】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］処理後、ビリオン調製物中のビリオンの平均粒子半径（Ｒｈ）が、動的光散乱により測定された場合に約２０ｎｍ未満である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］処理後、ビリオンの回収率が、０．２２μｍのフィルターを通してビリオン調製物をろ過した後、少なくとも約９０％である、請求項１８記載の方法。
【請求項１】
ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法であって、少なくとも約２００ｍＭのイオン強度を達成するためにビリオン調製物に１種類以上の賦形剤を添加することを含む、方法。
【請求項２】
ビリオンがＡＡＶビリオンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該ビリオン調製物をヌクレアーゼで処理することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヌクレアーゼがＢｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
１種類以上の賦形剤が多価イオンを含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
多価イオンがクエン酸塩である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
１種類以上の賦形剤の添加後のビリオン調製物の浸透圧が、約２８０ｍＯｓｍ未満である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
１種類以上の賦形剤の添加後、ビリオン調製物におけるビリオンの平均粒子半径（Ｒｈ）が約２０ｎｍ未満（動的光散乱により測定される）である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
１種類以上の賦形剤の添加後、ビリオンの回収率が、０．２２μｍのフィルターを通してビリオン調製物をろ過した後、少なくとも約９０％である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
精製ウイルス粒子；
ｐＨバッファー；および
１種類以上の多価イオン
を含む賦形剤を含む精製ウイルス粒子の保存用組成物であって、イオン強度が約２００ｍＭより高い、組成物。
【請求項１１】
精製ウイルス粒子がＡＡＶウイルス粒子である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
１種類以上の多価イオンの１つがクエン酸イオン（citrate）である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８をさらに含む、請求項１０記載の組成物。
【請求項１４】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ［登録商標］Ｆ６８が、０．００１％にて存在する、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ｐＨバッファーが１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０であり、賦形剤が１００ｍＭ クエン酸ナトリウムを含むものである、請求項１０記載の組成物。
【請求項１６】
精製ウイルス粒子の平均粒子半径（Ｒｈ）が約２０ｎｍ未満（動的光散乱により測定される）である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１７】
精製ウイルス粒子の回収率が、０．２２μｍのフィルターを通してビリオン組成物をろ過した後、少なくとも約９０％である、請求項１０記載の組成物。
【請求項１８】
ビリオン調製物におけるビリオンの凝集を防ぐ方法であって、該ビリオン調製物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］で処理することを含む、方法。
【請求項１９】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］処理後、ビリオン調製物中のビリオンの平均粒子半径（Ｒｈ）が、動的光散乱により測定された場合に約２０ｎｍ未満である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ［登録商標］処理後、ビリオンの回収率が、０．２２μｍのフィルターを通してビリオン調製物をろ過した後、少なくとも約９０％である、請求項１８記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１４３２３３（Ｐ２０１２−１４３２３３Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−４０５６１（Ｐ２０１２−４０５６１）
【出願日】平成２４年２月２７日（２０１２．２．２７）
【分割の表示】特願２００７−５１５５２５（Ｐ２００７−５１５５２５）の分割
【原出願日】平成１７年６月１日（２００５．６．１）
【出願人】（５０００３４６５３）ジェンザイム・コーポレーション (37)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−４０５６１（Ｐ２０１２−４０５６１）
【出願日】平成２４年２月２７日（２０１２．２．２７）
【分割の表示】特願２００７−５１５５２５（Ｐ２００７−５１５５２５）の分割
【原出願日】平成１７年６月１日（２００５．６．１）
【出願人】（５０００３４６５３）ジェンザイム・コーポレーション (37)
【Ｆターム（参考）】
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