ＡＣＴＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびその使用
【課題】筋肉および／または骨に関連する障害に対する安全かつ有効な治療方法を提供すること。
【解決手段】インビトロおよびインビボで増殖分化因子（ＧＤＦ−８）を阻害するための方法および組成物が、提供される。筋変性障害および骨変性障害を処置するための方法が、提供される。この方法はまた、健常な動物において骨量および骨密度を増加させるのに有用である。また、骨格筋質量および骨密度のネガティブな調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害するための方法が提供される。これらの方法および組成物は、筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの変性障害を診断、予防、または処置するために使用され得る。
【解決手段】インビトロおよびインビボで増殖分化因子（ＧＤＦ−８）を阻害するための方法および組成物が、提供される。筋変性障害および骨変性障害を処置するための方法が、提供される。この方法はまた、健常な動物において骨量および骨密度を増加させるのに有用である。また、骨格筋質量および骨密度のネガティブな調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害するための方法が提供される。これらの方法および組成物は、筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの変性障害を診断、予防、または処置するために使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月２５日に出願された米国仮出願番号６０／４２１，０４１（その全体が本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本願の技術分野は、増殖分化因子−８（ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−８）（ＧＤＦ−８）（可溶性形態のアクチビンＩＩ型レセプター、およびそのフラグメントを含む）のインヒビター、特に、インビボでＧＤＦ−８活性を阻害するインヒビターに関する。この分野は、さらに、筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの変性疾患を診断、予防、または処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ＴＧＦ−βファミリーは、多数の構造関連増殖因子であり、そのすべてが生理学的に重要な増殖調節特性および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（）１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、８：１３３−１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５−２７２）。これらの因子としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、ミューラー阻害物質、グリア誘導神経栄養性因子、およびなお増え続けている増殖分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ−８）が挙げられる。これらのタンパク質の多くは、高度に相同性である。例えば、ヒトＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１としてもまた公知）は、アミノ酸レベルでＧＤＦ−８に対して９０％同一である（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：２２２−２３２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｎｍｙｒｉｃｋ．ｃｏｍＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０：１８５−１８９）。
【０００４】
ＴＧＦ−βファミリーのほとんどのメンバーは、細胞表面上に発現された２つの異なる型のセリン／スレオニンキナーゼレセプター（すなわち、約５０〜５５ｋＤａのＩ型レセプターおよび７０ｋＤａより大きいＩＩ型レセプター）のヘテロマー複合体の形成を通してシグナルを伝達することが公知である。Ｉ型レセプターは、直接リガンドに結合しない；それどころか、Ｉ型レセプターは、リガンド分子に結合しないＩＩ型レセプターと会合することによってシグナル伝達に関与する。ＴＧＦ−β系は、動物界全体にわたって高度に保存されている。（ＴＧＦ−β系の概説について、Ｍａｓｓａｇｕｅ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：１６−１７８；およびＭｏｕｓｔａｋａｓら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：４３５９−４３６９を参照のこと）。
【０００５】
アクチビンＩＩ型レセプターは、以前に、米国特許第５，８８５，７９４号に記載されている。アクチビンは、もともとは、下垂体における卵胞刺激ホルモンの生成への刺激効果を有するタンパク質として、卵胞液から精製された。アクチビンＩＩ型レセプターの５つのイソ型が、アクチビン応答細胞において同定されている。インビトロ研究に基づいて、これらのレセプターは、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーによって共有され得る（Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１０６６−１０７３）。本発明は、部分的には、ＩＩ型アクチビンレセプター（ＡｃｔＲＩＩＢと称される）が、アクチビンに加えて増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）に結合し得るという発見に基づいている。
【０００６】
ＧＤＦ−８は、骨格筋における重要な生物学的プロセスおよび骨形成の調節に関与する。ＧＤＦ−８は、発育中の骨格筋および成熟した骨格筋において高度に発現される。ＧＤＦ−８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋の著しい肥大および過形成（非特許文献１）および異常な皮質骨構造（非特許文献２）によって特徴付けられる。骨格筋質量における同様の増大は、ウシにおけるＧＤＦ−８の天然に存在する変異において明らかである（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。研究は、ＨＩＶ感染に関連する筋肉疲労が、ＧＤ−８発現の増大を伴うことを示してきた（非特許文献７）。ＧＤＦ−８はまた、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成、および筋芽細胞の増殖（特許文献１）に関係している。その増殖調節特性および形態形成特性に加えて、ＧＤＦ−８はまた、多数の他の生理学的プロセス（２型糖尿病の発達におけるグルコースホメオスタシス、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡によって誘導されるインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（例えば、肥満症））に関連し得る（非特許文献８）。
【０００７】
多くのヒト障害および動物障害は、機能障害性の筋組織（例えば、筋ジストロフィー（デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられる）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮、器官萎縮、フレイルティー（ｆｒａｉｌｔｙ）、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、ならびに他の疾患および状態によって引き起こされる筋肉疲労症候群）に関連する。現在まで、これらの障害を処置するために信頼性がありかつ有効な治療はほとんど発達してこなかった。
【０００８】
また、骨粗鬆症および骨関節炎を含む骨の損失（特に若年女性および／または閉経後の女性における骨の損失）に関連する多くの状態が存在する。さらに、代謝性骨疾患および代謝性骨障害としては、慢性的な糖質コルチコイド治療、早発性の性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養欠乏症、および拒食症に起因する低骨量が挙げられる。これらの状態に対して現在利用可能な治療は、骨吸収を阻害することにより行う。新たな骨形成を促進する治療が、これらの治療の望ましい代替である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第００／４３７８１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８３−９０
【非特許文献２】Ｈａｍｒｉｃｋら（２０００）Ｂｏｎｅ ２７（３）：３４３−３４９
【非特許文献３】Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４）Ｇｒｏｗｔｈ ３８：５０１−５０７
【非特許文献４】Ｓｗａｔｌａｎｄら（１９９４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．３８：７５２−７５７
【非特許文献５】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２４５７−１２４６１
【非特許文献６】Ｋａｍｂａｄｕｒら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：９１０−９１５
【非特許文献７】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４９３８−１４９４３
【非特許文献８】Ｋｉｍら（２００１）ＢＢＲＣ ２８１：９０２−９０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、特に、ヒトにおいて、骨量および／または骨密度の全体的な増加に寄与する新たな治療を開発する必要性が存在する。筋肉および／または骨に関連する障害に対する安全かつ有効な治療方法を提供することが、本発明の主題である。哺乳動物において骨量および／または骨密度を増加させる方法を提供することが、本発明の別の主題である。インビボで安全かつ有効なＧＤＦ−８のインヒビターを提供することが、本発明のなお別の主題である。
【００１２】
本発明のさらに別の主題は、インビボで安定でありかつ高い特異性および親和性でＧＤＦ−８に結合する、可溶性形態のアクチビンＩＩ型レセプターＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはその機能フラグメントを提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、以下の明細書中に部分的に記載され、そして本明細書から部分的に明らかであるかまたは本発明の実施によって学ばれ得る。本発明の種々の主題、局面、および利点は、特に添付の特許請求の範囲に示された要素および組み合わせによって認識され、そして達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
筋変性障害および骨変性障害を処置するための方法が、本明細書中で提供される。この方法はまた、健常な動物において骨量および骨密度を増加させるのに有用である。
【００１５】
また、骨格筋質量および骨密度のネガティブな調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害するための方法が提供される。
【００１６】
インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８に結合しかつ阻害する、安定化可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ形態およびそのフラグメントが、提供される。本願で開示される可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ形態は、それらを治療剤として適切にさせる薬物動態学的特性を有する。
【００１７】
他の局面は、本願で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含有する組成物、およびＧＤＦ−８を阻害する方法もしくは中和する方法におけるそれらの組成物の使用（ヒトまたは動物の処置方法を含む）を提供する。開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、筋組織または骨密度の増加が望ましい状態を処置または予防するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質はまた、損傷した筋肉（例えば、心筋、横隔膜など）を修復するための治療において使用される。例示的な疾患および障害としては、筋ジストロフィー（デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられる）；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮；器官萎縮；フレイルティー；手根管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；サルコペニア、悪液質および他の筋肉疲労症候群；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；２型糖尿病；グルコース寛容減損；代謝性症候群（例えば、Ｘ症候群）；外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性；骨変性疾患（例えば、骨関節炎および骨粗鬆症）のような筋障害および神経筋障害が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法において利用される改変ＡｃｔＲＩＩＢ形態は、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体の定常領域に由来する第２のアミノ酸配列を含む、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドである。
【００１９】
特定の実施形態において、第１の配列は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインの全体または一部分を含むか、あるいはこのような配列の変異体である。第２の配列は、抗体のＦｃ部分に由来し得るか、またはこのような配列の変異体である。
【００２０】
さらなる実施形態において、第２の配列は、リンカー配列によって連結されるかまたは連結されずに、第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結される。
【００２１】
筋肉変性障害および／または骨変性障害を処置するための治療方法もまた、提供される。例示的な疾患および障害としては、筋障害および神経筋障害（例えば、筋ジストロフィー）、筋萎縮、鬱血性閉塞性肺疾患、筋肉疲労症候群、サルコペニア、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満症）、２型糖尿病、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷（例えば、熱傷）によって誘導されるインスリン抵抗性、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）が挙げられる。
【００２２】
さらに、本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、生物学的サンプル中のＧＤＦ−８またはそのフラグメントを定量的または定性的に検出するための診断ツールとして使用され得る。検出されるＧＤＦ−８の存在または量は、上記に列挙した病状のうちの１以上と関連し得る。
【００２３】
本発明の方法において使用されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする単離された核酸もまた、提供される。さらに、上記核酸を含む発現ベクター；上記発現ベクターを含む宿主細胞；および上記核酸を生成するための方法が提供される。
【００２４】
なお別の局面は、筋障害および骨障害処置に有用な治療剤を同定する方法を提供する。
【００２５】
上記の概説および以下の詳細な説明が、例示的かつ説明のためのみであり、主張されるように本発明を制限しないことが理解される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスのうちの少なくとも１種の変性疾患の処置方法または予防方法であって、該方法は、哺乳動物に有効量の薬学的組成物を投与する工程、および該組成物がＧＤＦ−８活性を阻害することを可能にする工程を包含し、ここで、該組成物は、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含有する、方法。
（項目２）
上記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記薬学的組成物が、筋障害、神経筋障害、および骨変性障害のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記薬学的組成物が、筋ジストロフィー、デュシェーヌ筋ジストロフィー、筋萎縮、器官萎縮、手根管症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉疲労症候群、および筋萎縮性側索硬化症のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記薬学的組成物が、デュシェーヌ筋ジストロフィーの処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記薬学的組成物が、肥満症および脂肪組織障害のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記薬学的組成物が、Ｘ症候群、グルコース寛容減損、外傷誘導性インスリン抵抗性、および２型糖尿病のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記薬学的組成物が、２型糖尿病および肥満症のうちの少なくとも１種の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記薬学的組成物が、骨関節炎および骨粗鬆症のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記薬学的組成物が、損傷した筋肉の修復を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記損傷した筋肉が、心筋の筋肉または横隔膜である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１μ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される有効量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸２３〜１３８を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１９〜１４４を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第２のアミノ酸配列が、（ａ）ＩｇＧのＦｃフラグメント、（ｂ）ＩｇＧ１のＦｃフラグメント、（ｃ）ＩｇＧ４のＦｃフラグメント、および（ｄ）配列番号３のアミノ酸１４８〜３７８から選択される配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの配列が、配列番号３に記載されている、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの循環半減期が、５日を超える、項目１に記載の方法。
（項目１８）
配列番号３のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
（項目１９）
項目１８に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
（項目２０）
上記核酸が、配列番号４に記載されている、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
項目１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２２）
項目２１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目２３）
上記融合タンパク質が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４の配列に対してハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目１に記載の方法。
（項目２４）
ＧＤＦ−８のインヒビターを同定するための方法であって、以下：
（ａ）項目１８に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびＧＤＦ−８を含む第１の結合混合物を調製する工程；
（ｂ）該第１の混合物における該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドとＧＤＦ−８との間の結合量を測定する工程；
（ｃ）該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、ＧＤＦ−８、試験化合物を含む第２の結合混合物を調製する工程；および
（ｄ）該第２の混合物における該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドとＧＤＦ−８との間の結合量を測定する工程
を包含する、方法。
（項目２５）
ＧＤＦ−８活性を阻害する方法であって、該方法は、ＧＤＦ−８を組成物と接触させる工程、および該組成物がＧＤＦ−８活性を阻害することを可能にする工程を包含し、ここで、該組成物は、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含有する、方法。
（項目２６）
筋力を増大させる方法であって、該方法は、哺乳動物にＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの治療有効量を投与し、それによって、筋力を増大させる工程を包含し、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２７）
骨梁の骨密度を増大させる方法であって、該方法は、哺乳動物にＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの治療有効量を投与し、それによって、骨梁の骨密度を増大させる工程を包含し、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２８）
グルコース寛容減損を増大させる方法であって、該方法は、哺乳動物にＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの治療有効量を投与し、それによって、骨梁の骨密度を増大させる工程を包含し、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２９）
筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの少なくとも１種の障害の処置または予防のための、医薬の調製のためのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの使用であって、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、使用。
（項目３０）
上記哺乳動物がヒトである、項目２９に記載の使用。
（項目３１）
上記障害が神経筋障害である、項目２９に記載の使用。
（項目３２）
上記障害が、筋ジストロフィー、デュシェーヌ筋ジストロフィー、筋萎縮、器官萎縮、手根管症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉疲労症候群、または筋萎縮性側索硬化症である、項目２９に記載の使用。
（項目３３）
上記障害が、肥満症または脂肪組織障害である、項目２９に記載の使用。
（項目３４）
上記障害が、Ｘ症候群、グルコース寛容減損、外傷誘導性インスリン抵抗性、または２型糖尿病である、項目２９に記載の使用。
（項目３５）
上記障害が、骨関節炎または骨粗鬆症である、項目２９に記載の使用。
（項目３６）
以下：
（ａ）筋肉損傷の修復；
（ｂ）筋力の増大；
（ｃ）骨梁の骨密度の増大；および
（ｄ）グルコース寛容減損
のうちの少なくとも１種のための、医薬の調製のためのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの使用であって、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｉｉ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、使用。
（項目３７）
上記（ａ）の損傷した筋肉が、心筋の筋肉または横隔膜である、項目３６に記載の使用。
（項目３８）
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１μ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの有効量で哺乳動物に投与される、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目３９）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸２３〜１３８を含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４０）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１９〜１４４を含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４１）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの上記第２のアミノ酸配列が、（ａ）ＩｇＧのＦｃフラグメント、（ｂ）ＩｇＧ１のＦｃフラグメント、（ｃ）ＩｇＧ４のＦｃフラグメント、または（ｄ）配列番号３のアミノ酸１４８〜３７８を含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４２）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドのアミノ酸配列が、（ａ）配列番号３に記載されているか、または（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４の配列に対してハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４３）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの循環半減期が、５日を超える、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【００２６】
（配列の簡単な説明）
以下の表は、本明細書中で称される配列についての参照として提供される。
【００２７】
【数１】
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃに対するビオチン化ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１の結合を示す。
【図２】図２は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを試験したレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。
【図３】図３は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの単回静脈内（ＩＶ）投与または単回腹腔内（ＩＰ）投与を利用する、Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウスにおける薬物動態学的研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、ＧＤＦ−８に特異的に結合し得るアクチビンＩＩ型レセプターまたはそのフラグメントの任意の異性体をいう。この用語は、起源、生成方法、およびＡｃｔＲＩＩＢの他の特性のうちのいかなる特定の種にも限定されない。この用語は、組換え生成されたＡｃｔＲＩＩＢまたはそのフラグメントを包含し、そして特に、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのＧＤＦ−８結合ドメインを包含する。この用語はまた、ＡｃｔＲＩＩＢの対立遺伝子およびスプライス改変体、それらの相同体、ならびに導入された変異（置換、付加、および欠失）を含むそれらのオルソログおよび配列を包含する。
【００３０】
用語「筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの変性障害」とは、ＧＤＦ−８および／またはＴＧＦ−βスーパーフェミリーの他のメンバー（例えば、ＢＭＰ−１１）に関連する多くの障害および疾患をいう。このような障害の例としては、代謝障害（例えば、２型糖尿病）、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えばＸ症候群）、および外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；筋障害および神経筋障害（例えば、筋ジストロフィー（デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられる））；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮；器官萎縮；フレイルティー；手根管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；ならびにサルコペニア、悪液質および他の筋肉疲労症候群が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、骨粗鬆症（特に、若年女性および／または閉経後の女性における骨粗鬆症）；糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症；骨減少症；骨関節炎；および骨粗鬆症に関連する骨折が挙げられる。なおさらなる例としては、慢性的な糖質コルチコイド治療、早発性の性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養欠乏症、および拒食症に起因する低骨量が挙げられる。
【００３１】
用語「有効量」とは、患者における症状の改善または所望の生物学的結果（例えば、骨格筋量および／骨密度の増加）を生じる化合物の量をいう。このような量は、骨格筋量および骨密度のネガティブな調節に関連するＧＤＦ−８の活性を低下させるのに十分であるべきである。有効量は、以下のセクションに記載されるように決定され得る。
【００３２】
ＡｃｔＲＩＩＢに関連して使用される場合、用語「ＧＤＦ−８結合ドメイン」とは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン、またはＧＤＦ−８に結合するために必要なその一部（すなわち、ＧＤＦ−８に対する特異的結合を引き起こすＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部）をいう。
【００３３】
用語「ＴＧＦ−βスーパーファミリー」とは、構造的に成長因子に関連するファミリーをいう。この成長因子に関連するファミリーは、当該分野で周知である（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：１３３−１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：２３５−７２）。ＴＧＦ−βスーパーファミリーとしては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、ミューラー阻害物質、グリア誘導神経栄養性因子、およびなお増え続けている増殖分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ−８（ミオスタチン））が挙げられる。このようなタンパク質の多くは、構造的および／または機能的にＧＤＦ−８に関連している。例えば、ヒトＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１としてもまた公知）は、アミノ酸レベルでＧＤＦ−８に対して９０％同一である（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：２２２−２３２；Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９９）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０：１８５−１８９）。
【００３４】
用語「ＧＤＦ−８」とは、特定の増殖分化因子−８をいい、そして適切な場合には、構造的または機能的にＧＤＦ−８に関連する任意の因子（例えば、ＢＭＰ−１１およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する他の因子）を包含することが理解されるべきである。この用語は、全長のプロセシングされていないＧＤＦ−８の前駆形態、ならびに翻訳後切断により生じる成熟ポリペプチドおよびプロペプチドポリペプチドをいう。この用語はまた、本明細書中で議論されるようなＧＤＦ−８に関連する１以上の生物学的活性を保持する、ＧＤＦ−８の任意のフラグメントおよび改変体をいう。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。本発明は、すべての脊椎動物種（ヒト、ウシ、トリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚（配列情報について、例えば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２４５７−１２４６１を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない）に由来するＧＤＦ−８に関する。
【００３５】
用語「成熟ＧＤＦ−８」とは、ＧＤＦ−８前駆タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断されるタンパク質をいう。成熟ＧＤＦ−８は、モノマー、ホモダイマーとして存在し得るか、またはＧＤＦ−８潜在的複合体中に存在し得る。条件に依存して、成熟ＧＤＦ−８は、これらの様々なポリペプチドのいずれかまたはすべてとの間に平衡を確立し得る。その生物学的活性形態において、成熟ＧＤＦ−８はまた、「活性なＧＤＦ−８」と称される。
【００３６】
用語「ＧＤＦ−８プロペプド」とは、ＧＤＦ−８前駆タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されるポリペプチドをいう。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８におけるプロペプチド結合ドメインに結合し得る。
【００３７】
用語「ＧＤＦ−８潜在的複合体（ｌａｔｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、成熟ＧＤＦ−８ホモダイマーとＧＤＦ−８プロペプチドとの間で形成されるタンパク質の複合体をいう。２つのＧＤＦ−８プロペプチドが、ホモダイマー中の成熟ＧＤＦ−８の２分子に会合して、不活性なテトラマーの複合体を形成すると考えられる。潜在的複合体は、ＧＤＦ−８プロペプチドのうちの一方または両方に加えてかまたは代わりに他のＧＤＦ−８インヒビターを含み得る。
【００３８】
用語「ＧＤＦ−８活性」とは、活性なＧＤＦ−８タンパク質に関連する生理学的な成長調節活性または形態形成活性のうちの１以上をいう。例えば、活性なＧＤＦ−８は、骨格筋のネガティブな調節因子である。活性なＧＤＦ−８はまた、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節し得、線維芽細胞増殖を刺激し得、そして前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調節し得る。インビボおよびインビトロでＧＤＦ−８活性を評価するための手順としては、例えば、レポーター遺伝子アッセイ（実施例６を参照のこと）または筋肉および／骨パラメータの測定に関するインビボ試験（実施例８、９、および１０を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語「Ｆｃ部分」とは、パパインを用いるタンパク質分解によって生成される免疫グロブリンのＣ末端フラグメント、またはそれらに由来する機能的等価物をいう。用語「Ｆｃ部分」は、組換え生成されたＦｃフラグメント（任意の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）およびアイソタイプサブクラスのいずれかに由来するＦｃフラグメントが挙げられる）を包含することが理解されるべきである。用語「抗体の定常領域」とは、免疫グロブリンのＣ末端部分をいい、Ｆｃ部分および抗体の可変領域（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含まない限りは隣接配列を含む。抗体の定常領域は、特定のアイソタイプの抗体において、同一である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、有意に同一であるかまたは互いに相同であるヌクレオチド配列が、互いに相補的に結合する、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を記載することが意図される。この条件は、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５〜９０％同一な配列が、互いに結合され続けるような条件である。同一性割合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように決定される。
【００４１】
ストリンジェントな条件は、当該分野で公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５）、セクション２、４、および６に見いだされ得る。さらに、ストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第７章、９章、および１１章に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下である：
約６５〜７０℃で４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、または約４２〜５０℃で４×ＳＳＣ ＋ ５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、その後、
約６５〜７０℃で１×ＳＳＣにおける１回以上の洗浄。
例えば、ナイロン膜を使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる非限定的な例は以下である：
約６５℃で０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後、
６５℃で０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄。
例えば、Ｃｈｕｒｃｈら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１９９１−１９９５を参照のこと。さらなる試薬（例えば、ブロック化剤（ＢＳＡまたはサケ精子ＤＮＡ）、洗浄剤（ＳＤＳ）、キレート化剤（ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなど）が、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液に添加され得ることが理解される。
【００４２】
ＧＤＦ−８またはその活性に関係して使用される場合、用語「インヒビター」は、ＧＤＦ−８の活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害し得る任意の薬剤を包含する。このようなインヒビターとしては、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、およびＧＤＦ−８を阻害する他の低分子が挙げられる。このようなインヒビターは、ＧＤＦ−８タンパク質の生物学的活性を「阻害する」、「中和する」、または「低下させる」と言われる。
【００４３】
用語「中和する」、「中和すること」、「抑制性の」、およびそれらの同族語とは、ＧＤＦ−８インヒビターの非存在下におけるＧＤＦ−８の活性に対する、同じインヒビターによるＧＤＦ−８の活性の低下をいう。活性の低下は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きい。
【００４４】
用語「単離された」とは、実質的にその天然の環境から離れている分子をいう。例えば、単離されたタンパク質は、それらが由来する細胞源または組織源からの細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、 単離されたタンパク質が治療組成物として投与されるのに実質的に純粋であるか、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、少なくとも８０％〜９０％純粋、９０％〜９５％純粋であるか；あるいは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％純粋である調製物をいう。
【００４５】
用語「哺乳動物」とは、ヒトを含み、家庭用動物および家畜用動物、動物園用動物、競技用動物、またはペット用動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなど）として分類される任意の動物をいう。
【００４６】
用語「特異的相互作用」また結合する」などは、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原によって保有される特定のエピトープに対して特異的である場合に適用可能であり、この事例において、抗原結合ドメインを保有する抗体は、このエピトープを保有する種々の抗原に対して結合し得る。従って、抗体は、例えば、その抗体がＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８の両方によって保有されるエピトープに結合する限りは、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８に特異的に結合し得る。
【００４７】
特異的結合は、高い親和性および低〜中程度の能力によって特徴付けられる。非特定的結合は、通常、中程度〜高い能力で、低い親和性を有する。代表的に、結合は、親和性定数Ｋａが１０６Ｍ−１より高いかまたは好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合、特異的と考えられる。必要な場合、非特異的結合は、結合状態を変更することによって特異的結合に実質的に影響することなく、減少され得る。このような条件は、当該分野において公知であり、慣用的な技術を使用して、当業者は、適切な条件を選択し得る。条件は、通常、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を許容する時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などの点で規定される。例示的条件は、実施例５および６に記載される。
【００４８】
句「実質的に記載される（ｓｕｂｔａｎｔｉａｌｌｙ ａｓ ｓｅｔ ｏｕｔ）」は、関連するアミノ酸配列が、所定の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。例として、このような配列は、種々の種由来の改変体であり得るか、またはこれらは、短縮、欠失、アミノ酸置換または付加によって所定の配列から誘導され得る。２つのアミノ酸配列間の同一性％は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３−４１０に記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７のアルゴリズムのような標準的な整列アルゴリズムによって決定される。
【００４９】
用語「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方をいう。処置の必要なものには、特定の医療的障害を既に有する個体、ならびに最終的に障害を獲得し得るもの（すなわち、骨粗鬆症の家族歴を有する閉経後の女性、または２型糖尿病の家族歴もしくはいくらか上昇した血糖の読み値を有する肥満の患者のような予防的処置を必要とするもの）が挙げられ得る。
【００５０】
（ＩＩ．ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド）
本発明は、ＧＤＦ−８に結合し、インビトロおよび／またはインビボでその活性を阻害する改変アクチビンＩＩ型レセプターを提供する。特に、ここで開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、骨格筋質量および骨密度のネガティブな調節と関連するＧＤＦ−８活性を阻害する。本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、治療的用途（例えば、延長された循環半減期および／またはタンパク質分解からの改善された保護）に対してそれらを適切にする薬理学的特性を有する。
【００５１】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体の定常領域由来の第２のアミノ酸配列を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの特定の例示的実施形態の全アミノ酸およびＤＮＡ配列は、配列番号３および配列番号４それぞれに記載される。
【００５２】
第１のアミノ酸配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの全てまたは一部由来であり、ＧＤＦ−８を特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのこのような部分はまた、ＢＭＰ−１１および／またはアクチビン、あるいは他の成長因子に結合し得る。特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列は、配列番号３において、およそアミノ酸（ａａ）２３〜およそａａ１３８、または配列番号１のおよそａａ１９〜およそａａ１４４と同一かまたは実質的に記載される。配列番号１と配列番号３との間の違いは、配列番号１のａａ６４が、Ａｌａであり、他方、配列番号３の対応するａａ６８が、Ａｒｇであることである。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢの配列の他の改変が可能であり、例えば、配列番号１のａａ１６およびａａ１７は、それぞれ、ＣｙｓおよびＡｌａで置換され得る。いくつかの他の実施形態において、第１のアミノ酸配列は、配列番号３のおよそａａ２３およびおよそａａ１３８から、または配列番号１のおよそａａ１９およびおよそａａ１４４から、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個または１２０個の連続したアミノ酸を含む。このような配列は、短縮型配列が、ＧＤＦ−８に特異的に結合する限り、短縮され得る。ＧＤＦ−８への結合は、当該分野で公知の方法を使用して、または実施例５および６に記載されるように、アッセイされ得る。
【００５３】
第２のアミノ酸配列は、抗体（特に、Ｆｃ部分）の定常領域由来であるか、またはこのような配列の変異体である。いくつかの実施形態において、第２のアミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部分由来である。関連の実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、または別のＩｇＧアイソタイプであるＩｇＧ由来である。特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列は、配列番号３に記載されるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（アミノ酸１４８〜３７８）を含み、ここで、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は、Ｆｃ部分のエフェクター機能を最小化するように改変されている。このような改変は、Ｆｃレセプター結合のようなエフェクター機能を変更し得る特異的アミノ酸残基を変更すること（Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４）、または定常領域が誘導される種を変更することを包含する。抗体は、エフェクター機能を減少させる重鎖のＣＨ２領域の変異（すなわち、Ｆｃレセプター結合および補体活性化）を有し得る。例えば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に記載される変異のような変異を有し得る。ＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ２重鎖において、例えば、このような変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列のアミノ酸２３４および２３７に対応するアミノ酸残基においてなされ得る。抗体はまた、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化する変異（例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域の変異）を有し得る（Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８に開示される）。
【００５４】
特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列は、リンカー配列によって連結されるかまたはリンカー配列によって連結されないで、第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結される。リンカーの実際の長さおよび配列および連結される配列に田尾するその配向は、種々であり得る。例えば、リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号５）であり得る。リンカーは、２アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を含み得、溶解性、長さおよび立体的分離、免疫原性などのような所望の特性に基づいて選択される。特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質分解切断部位の配列（例えば、エンテロキナーゼ切断部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号６））、または例えば、融合タンパク質の精製、検出または改変に有用な他の機能性配列を含み得る。
【００５５】
任意のタンパク質の配列の特定のアミノ酸が、タンパク質の活性に有害に影響することなく、他のアミノ酸を置換し得ることが、当業者によって理解される。従って、種々の変化が、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの配列のアミノ酸配列、またはこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ配列において、それらの生物学的活性または有用性を認識可能に損失することなく、なされ得ることが企図される。ＡｃｔＲＩＩＢの生物学的活性は、実施例６〜１０に記載されるように測定され得る。このような変化としては、欠失、挿入、短縮、および置換が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の任意のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの、他のタンパク質由来のアミノ酸配列へのさらなる融合が構築され得る。望ましい融合配列は、例えば、サイトカイン、増殖因子および分化因子、酵素、ホルモン、他のレセプター成分などのＡｃｔＲＩＩＢの生物学的活性とは異なる生物学的活性を有するタンパク質由来であり得る。また、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、他のタンパク質および薬学的薬剤と化学的に連結されるかまたは結合され得る。このような改変は、得られる組成物の薬物動態学および／または体内分布を変更するように設計され得る。
【００５７】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、グリコシル化され得るか、ペグ化され得るかまたは別の非タンパク質ポリマーに連結され得る。例えば、本明細書中に開示されたＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、種々の非タンパク質ポリマー（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるように、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）の一つに連結され得る。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、例えば、その循環半減期を増加させるポリマーへの共有結合によって化学的に改変される。例示的なポリマーおよびポリマーをペプチドに結合させる方法はまた、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号および同第４，６０９，５４６号に示されている。
【００５８】
本発明のＡｃｔＩＩＢ融合ポリペプチドは、変化したグリコシル化パターン（すなわち、本来のまたはネイティブのグリコシル化パターンから変化した）を有するように改変され得る。本明細書中で使用される場合、「変化した」とは、一つ以上の欠失した炭水化物部分を有すること、および／または本来の配列に付加された一つ以上のグリコシル化部位を有することを意味する。本明細書で開示された改変ＡｃｔＲＩＩＢに対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、当該分野で周知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含むように変化させることにより達成され得る。炭水化物部分の数を増加させることの別の意味は、グリコシドのアミノ酸残基への化学的カップリングまたは酵素的カップリングによるものである。これらの方法は、ＷＯ ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎら（１９８１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２５９〜３０６中に記載される。ＡｃｔＲＩＩＢに存在する任意の炭水化物部分の除去は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２；Ｅｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１およびＴｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるように化学的に、または酵素的に達成され得る。
【００５９】
本発明のＡｃｔＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、検出可能標識または機能的標識を用いて標的化され得る。検出可能標識としては、放射標識（例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃ）が挙げられ、これは、従来の当該分野で公知の化学反応を使用して本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドに結合され得る。標識はまた、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を含む。標識はさらに、化学成分（例えば、ビオチン）を含み、これは、特異的な同族の検出可能部分（例えば、標識されたビオチン）に結合することによって検出され得る。
【００６０】
当業者は、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１およびアクチビン以外のタンパク質を、検出、測定、および阻害するために使用され得ることを理解する。このようなタンパク質の非限定的な例（例えば、様々な種由来のＧＤＦ−８の配列（オーソロガス）は、本明細書中に記載される。
【００６１】
（ＩＩＩ．核酸、クローニングおよび発現系）
本開示は、本発明の方法に使用され得る可溶性ＡｃｔＲＩＩＢをコードする単離された核酸を提供する。本発明の核酸は、本明細書中に開示される本発明の少なくとも一つのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドに対するコード配列を含む。特定の実施形態において、この核酸は、この配列を含むか、または配列番号４に示される配列に由来する。他の特定の実施形態において、この核酸配列は、配列番号３のアミノ酸約２３〜アミノ酸約１３８のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸約１９〜アミノ酸約１４４のアミノ酸配列をコードするような核酸配列である。
【００６２】
本開示はまた、少なくとも一つの上記本発明の核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態の構築物を提供する。
【００６３】
本開示はまた、宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、一つ以上の上記構築物を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの任意の一つをコードする核酸が、提供され、それ自体が本発明の一局面であり、コードされる生成物の生成の方法である。コードされたＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの生成は、適切な培養条件下でその核酸を含む発現組換え宿主細胞によって達成され得る。発現後、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、任意の適切な技術を使用して単離され、そして／または精製され、次いで、適切なものとして使用される。発現および精製のための例示的な手順は、実施例３および実施例４に示される。
【００６４】
特定のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびコードする核酸分子および本発明に基づくベクターは、例えば、それらの天然の環境から、実質的に精製された形態または均質な形態で、あるいは、核酸の場合、または必要とする機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源を含まないか、もしくは実質的に含まない形態で入手され得、単離され得、そして、または精製され得る。本発明に基づく核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、そして全体的に、または部分的に合成的であり得る。本明細書中に示されるヌクレオチド配列に対する言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を含み、そして、文脈が他に必要としない限りＴに対してＵが置換した特定の配列を有するＲＮＡ分子を含む。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド長であり、配列番号４に示される核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を包含する。
【００６６】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、周知である。適した宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、および酵母ならびにバキュロウイルスの系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現について当該分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞などが挙げられる。一般的な細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成するために適した他の細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編．１９９９）を参照のこと。本発明と適合性の任意の細胞株は、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成するために使用され得る。
【００６７】
適切なベクターが、選択または構築され得、そのベクターは、適切な調節配列（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な場合、他の配列を含む）を含む。ベクターは、プラスミドまたはウイルス（例えば、ファージ）または適切な場合、ファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。核酸の操作のための多くの公知の技術およびプロトコル（例えば、核酸構築物の調製において、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質分析）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ａｕｓｕｂｅｌら編．１９９２）において詳細に記載される。
【００６８】
従って、本発明のさらなる局面は、本明細書中で開示される核酸を含む宿主細胞である。さらに、本発明は、このような核酸を宿主細胞に導入する工程を包含する方法を提供する。その導入は、任意の適切な技術を利用し得る。真核生物細胞については、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルスを使用する形質導入（例えば、ワクシニア、または昆虫細胞については、バキュロウイルス）が挙げられ得る。細菌細胞については、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられ得る。
【００６９】
その導入は、続いて、例えば、その核酸の発現に適した条件下で宿主細胞を培養することによって、その核酸からの発現を引き起こすかまたは可能になる。
【００７０】
（ＩＶ．インヒビターを同定するための方法）
本発明のなお別の局面は、筋肉および骨の障害の処置において有用な治療剤を同定する方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ）は、当該分野で公知である。このようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物は、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびリガンド（例えば、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、アクチビン）を結合することによって形成される；その第１の結合混合物（Ｍ０）における結合の量が測定される。第２の結合混合物もまた、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、そのリガンド、およびそのスクリーニングされるべき化合物もしくは薬剤を合わせることによって形成され、第２の結合混合物（Ｍ１）における結合の量が、測定される。その第１の混合物および第２の混合物における結合の量は、次いで、例えば、そのＭ１／Ｍ０比を計算することによって比較される。その化合物または薬剤は、第１の結合混合物と比較して、その第２の結合混合物における結合の減少が観察される場合、ＡｃｔＲＩＩＢ媒介性細胞シグナル伝達を阻害し得ると考えられる。結合混合物の処方および最適化は、当該分野の技術水準内であり、このような結合混合物はまた、結合を増強または最適化するために必要な緩衝液および塩を含み得、さらなるコントロールアッセイは、本発明のスクリーニングアッセイにおいて含められ得る。
【００７１】
従って、そのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド−リガンド結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは、約３０％より大きく減少させることが見いだされた化合物が同定され得、次いで、望ましい場合、実施例５〜１２に記載されるように、他のアッセイ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ）および他の細胞ベースのアッセイおよびインビボアッセイにおいてＧＤＦ−８活性を阻害する能力について二次的にスクリーニングされる。
【００７２】
（Ｖ．疾患を処置する方法および他の使用）
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは可溶性であり、その融合ポリペプチドを治療剤として適切にする（すなわち、動物（特に、ヒト）における種々の医学的障害を予防、診断または処置するために有用にする）薬物動態特性を有する。特定の実施形態において、そのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの循環半減期は、５日、７日、１０日または１４日を超える。
【００７３】
そのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、筋肉および／または骨の障害と関連するＧＤＦ−８の１以上の活性を阻害するために使用され得る。ＧＤＦ−８活性の阻害は、Ｔｈｉｅｓら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（２００１）１８：２５１−２５９）に記載されるか、または実施例６に例示されるように、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）において測定され得る。
【００７４】
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドによって診断、処置または予防される医学的障害は、筋肉または神経筋の障害；脂肪組織障害（例えば、肥満）；２型糖尿病；損なわれたグルコース耐性；代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）；外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって引き起こされるインスリン耐性；または骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）である。
【００７５】
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、損傷した筋肉（例えば、心筋、横隔膜など）を修復する治療において使用され得る。例示的な疾患および障害としては、筋肉および神経筋の障害（例えば、筋ジストロフィー（デュシェンヌ筋ジストロフィーを含む））；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮症；器官萎縮症；フレイルティー；手根管症候群；欝血性閉塞性肺疾患；およびサルコペニア、悪液質および他の筋肉消耗症候群がさらに挙げられる。
【００７６】
本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドによって診断、処置または予防されるべき他の医療障害は、骨の損失に関連する障害であり、骨粗鬆症（特に、若年女性のおよび／または閉経後の女性における骨粗鬆症）；糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症；骨減少症；骨関節炎；および骨粗鬆症に関連する骨折が挙げられる。他の標的代謝骨疾患および標的代謝骨障害としては、慢性的な糖質コルチコイド治療、早発性の性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養欠乏症、および拒食症に起因する低骨量が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、好ましくは、哺乳動物（特に、ヒト）におけるこのような医療障害を予防、診断、または処置するために使用される。
【００７７】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含む組成物は、治療有効量で投与される。一般的には、治療有効量は、被験体の年齢、状態、および性別、ならびに被験体の病状の重篤度に伴って変化し得る。投薬量は、医師によって決定され得、そして必要な場合には、観察された処置効果に合うように調節され得る。一般的には、組成物は、ポリペプチドが、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量、あるいは実施例１０および１１に記載されるような用量で与えられるように投与される。組成物は、ボーラス用量として、この用量後の最も長い期間に対して循環レベルを最大にするように、与えられ得る。連続注射もまた、ボーラス用量後に使用され得る。
【００７８】
本発明の投薬単位ポリペプチドについての仕様は、活性化合物の一義的な特性、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにこのような活性化合物を配合することに関する当該分野における固有の限定によって指示され、かつ直接的に依存する。
【００７９】
毒性および治療効力は、細胞培養物または実験用動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）およびＥＤ５０（手段の５０％において治療的に有効な用量）の決定）によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、そしてこれはＬＤ５０／ＥＤ５０比と表され得る。大きな治療指標を示す組成物が、好ましい。
【００８０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためにある範囲の投薬量を処方することにおいて使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がわすかであるか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。この投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。
【００８１】
治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから見積られ得る。ある用量が、細胞培養で決定したようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する治療上の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルに処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定投薬量の効果は、適切なバイオアッセイによってモニタリングされ得る。適切なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＧＤＦ＝８結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取り込みアッセイに基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが挙げられる。
【００８２】
本発明のさらなる局面として、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、インビトロおよびインビボにおいて、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８）に属するタンパク質の存在を検出するために使用され得る。これらの
タンパク質の存在またはレベルを病状と関連付けることによって、当業者は、関連する病状を診断し得る。本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドによって診断され得る病状は、上記で示されている。
【００８３】
このような検出方法は、当該分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、イムノブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、および他の類似の技術が挙げられる。ポリペプチドは、さらに、タンパク質（例えば、ＧＤＦ−８）を検出するための１以上のこれらの技術を組み込む診断キットで提供され得る。このようなキットは、タンパク質の検出およびキットの使用を補助するための他の成分、包装、指示書、または他の物質を含み得る。
【００８４】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが診断目的を対象とする場合、これらを、例えば、リガンド基（例えば、ビオチン）または検出可能なマーカー基（例えば、蛍光基、放射性同位体、または酵素）で改変することが望まれ得る。所望の場合、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、蛍光団、発色団、放射活性原子、高電子密度試薬、酵素、および特定の結合相手を有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的には、それらの活性によって検出される。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計で定量可能な青色色素に変換する活性によって、検出され得る。他の適切な結合相手としては、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当該分野で公知の多数のレセプター−リガンドの組が挙げられる。他の順列および可能性は、当業者に容易に明らかであり、本発明の範囲内にある等価物と考えられる。
【００８５】
（ＶＩ．薬学的組成物および投与方法）
本発明は、患者に対する投与のために適切な組成物を提供する。組成物は、代表的には、本発明の１以上のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、句「薬学的に受容可能な賦形剤」とは、薬学的投与に適合する任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性遅延剤および吸収遅延剤などをいう。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。組成物はまた、補足的治療機能、付加的治療機能、または増強された治療機能を提供する他の活性化合物を含み得る。薬学的組成物はまた、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【００８６】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。その投与を達成するための方法は、当業者に公知である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮であり得る。局所投与または経口投与され得る組成物を得ることもまた可能である。
【００８７】
皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、代表的には、１以上の以下の成分を含む：滅菌希釈剤（例えば、注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）；および張度調節用の薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節され得る。このような調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に入れられ得る。
【００８８】
注射に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液または懸濁液、および注射可能な滅菌溶液もしくは懸濁液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＴＭ ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合おいて、組成物は、滅菌されていなければならず、そして注射しやすさが存在する程度まで流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、溶媒、または例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む分散媒、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用、分散物の場合において必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、および塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸収は、およそ、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、アルミナモノステアレート（ａｌｍｉｎｕｍ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）およびゼラチン）を含むことによってもたらされ得る。
【００８９】
経口組成物は、一般的には、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか、または錠剤中に圧縮される。経口治療投与の目的のために、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、賦形剤と共に組み込まれ得、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の天然化合物のいずれかを含む：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、スターチまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、ＰｒｉｍｏｇｅｌＴＭ、またはコーンスターチ）；潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓＴＭ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖またはサッカリン）；あるいは香料剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料）。
【００９０】
吸入による投与のために、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００９１】
全身投与もまた、経粘膜手段または経皮手段によってなされ得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの場合、組成物は、ＦｃＲｎレセプター媒介性経路を介して粘膜（例えば、腸、口、および肺）を通して伝達され得る。経粘膜投与は、例えば、ロゼンジ、鼻腔
スプレー、吸入器、または坐薬を通して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、一般的に当該分野で公知のような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに処方される。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透されるべきバリアーに適切な浸透物が、処方物中で使用される。このような浸透物は、当該分野で公知であり、例えば、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。
【００９２】
本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、体内からの急速な排泄に対して化合物を保護するキャリア（例えば、徐放性処方物（移植片および微小カプセル化送達系を含む））と共に調製され得る。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、ビニル酢酸エチル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ））が使用され得る。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【００９３】
投与および投薬量の均一性を簡略化するために、投薬単位形態中に経口組成物または非経口組成物を処方することが有利であり得る。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置されるべき被験体に対して単一の投薬量として適合された、物理的に別個の単位をいう。各単位は、必要とされる薬学的キャリアに関して所望の治療効果を生じるように計算された、予め決められた量の活性化合物を含む。
【００９４】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、上記の核酸）は、組織内の細胞、器官、また生物体に誘導され得、その結果、コードされるポリペプチドが発現される。この方法は、例えば、個々の組織および器官におけるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの効果を評価することにおいて有用であり得る。特定の実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする核酸は、組織特異的発現制御配列（例えば、ミオシンプロモーターまたはデスミンプロモーターのような筋特異的プロモーター配列、筋クレアチンキナーゼエンハンサーのような筋特異的エンハンサーエレメント）に連結される。当業者は、特定のポリヌクレオチド配列が、哺乳動物に全身注射または局所注射され得るウイルスベクターまたはプラスミドベクターに挿入され得ることを認識する。宿主細胞もまた収集され、そしてＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする核酸が、エキソビボで、その後の再移植のために当該分野で公知の方法を使用して、このような細胞にトランスフェクトされ得る。核酸はまた、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編、１９９９）に記載されるようなトランスジェニック動物を作製するために、単一の胚細胞にトランスフェクトされ得る。
【００９５】
本明細書は、本明細書中で引用される参考文献（その全体が本明細書中で参考として援用される）の教示を考慮してほぼ完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するように構成されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が、請求された本発明によって包含されること、ならびに本明細書および実施例が、特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神を含んで、例示のみとして考えられることが意図されることを認識する。
【００９６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態および局面を示す。当業者は、本発明の精神または範囲を変えることなく実施され得る多くの改変およびバリエーションを認識する。このような改変およびバリエーションは、本発明の範囲内に包含される。本実施例は、決して本発明を限定しない。
【実施例】
【００９７】
（実施例１：ＧＤＦ−８の精製）
組換えヒトＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチド）を発現する選択された細胞株に由来する馴化培地をｐＨ６．５に酸性化し、８０×５０ｍｍ
ＰＯＲＯＳＴＭ ＨＱ陰イオン交換カラム、直列に、８０×５０ｍｍ ＰＯＲＴＯＳＴＭ ＳＰ陽イオン交換かラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にアプライした。そのフロースルーを、ｐＨ５．０に調節し、７５×２０ｍｍ ＰＯＲＯＳＴＭ ＳＰ陽イオン交換かラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライし、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されるそのＧＤＦ−８潜在性複合体を含む画分を、プールし、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ２〜３に酸性化し、次いで、０．１ ％ ＴＦＡで２００ｍｌにして、粘度を低くした。そのプールを、次いで、ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ａ ６０×２１．２ｍｍガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を付けた２５０×２１．２ｍｍ Ｃ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）にアプライし、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出して、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。成熟ＧＤＦ−８を含む画分を、凍結乾燥によって濃縮して、アセトニトリルを除去し、２０ｍｌの０．１％ ＴＦＡを添加した。そのサンプルを、次いで、分離を補助するために６０℃に加熱した２５０×１０ｍｍ Ｃ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。これを、もはやさらなる分離が達成することができなくなるまで繰り返した。成熟ＧＤＦ−８を含む画分を、次いで、プールし、４０％ アセトニトリルにして、６０×２１．２ガードカラムを付けた６００×２１．２ ＢｉｏＳｅｐＴＭ Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。精製成熟ＧＤＦ−８を含む画分およびＧＤＦ−８プロペプチドを含む画分を、別個にプールし、その後の実験における使用のために濃縮した。
【００９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製成熟ＧＤＦ−８は、非還元条件下で２５ｋＤａで、および還元条件下で１３ｋＤａで、広いバンドとして移動する。還元条件下および非還元条件下では、ＢＭＰ−１１プロペプチドは、約３５ｋＤａで移動した。類似のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールは、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９７）９４：１２４５７−１２４６１）によってマウスＧＤＦ−８について報告され、成熟タンパク質のダイマー性質を反映する。そのＧＤＦ−８プロペプチドは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３５ｋＤａで移動した。活性な成熟ＢＭＰ−１１二量体は、組換えヒトＢＭＰ−１１を発現する細胞株に由来する馴化培地から同じ様式で精製した。その馴化培地を、１０ｍｌ ＴＡＬＯＮＴＭカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）にロードした。その結合したタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０／１Ｍ ＮａＣｌ／５００ｍＭ イミダゾールで溶出した。そのＢＭＰ−１１複合体を含む画分をプールし、１０％ トリフルオロ酢酸でｐＨ３に酸性化した。そのＢＭＰ−１１複合体プールを、２５０×４．６ｍｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライし、このカラムを、成熟ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１１プロペプチドのより良好な分離のために、６０℃に加熱した。ＢＭＰ−１１を、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出した。ＢＭＰ−１１を含む画分を、凍結乾燥によって濃縮して、アセトニトリルを除去した。
【００９９】
（実施例２：精製組換えヒトＧＤＦ−８の特徴）
５０μｇの各精製成熟ＧＤＦ−８および精製ＧＤＦ−８プロペプチドを混合し、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に透析し、３００×７．８ｍｍ ＢｉｏＳｅｐＴＭ
Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でクロマトグラフィー分離した。その成熟ＧＤＦ−８／プロペプチド複合体の分子量を、同じカラムでクロマトグラフィー分離した分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、溶出時間から決定した。
【０１００】
精製ＧＤＦ−８プロペプチドを、精製成熟ＧＤＦ−８とともに中性ｐＨでインキュベートする場合、その２つのタンパク質は、サイズ排除プロフィールにより示されるように、複合体であるようであった。１２．７分で溶出したその主なタンパク質ピークは、同じカラムでクロマトグラフィー分離した分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から７８ｋＤａの推定分子量を有した。その複合体のサイズは、プロペプチドの２つのモノマーと会合するその成熟ＧＤＦ−８の１つの二量体と、ほぼ一致していた。
【０１０１】
この観察を確認するために、成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチドの両方を含む調製物を、１００ｍＭの１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドヒドロクロリド（ＥＤＣ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）ありまたはなしで、１時間室温でインキュベートし、ＨＣｌでｐＨ２〜３に酸性化し、Ｍｉｃｒｏｎ−１０ Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で、トリシン緩衝化１０％ アクリルアミドを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥのために濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーＴＭブルー染色によって、タンパク質を可視化した。
【０１０２】
（実施例３：ＣＨＯ細胞におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの発現）
全長ヒトＡｃｔＲＩＩＢ ｃＤＮＡを、細胞外ドメイン（そのシグナルペプチドをコードする配列を除く）をＰＣＲクローニングするために使用した。使用したそのプライマーは、ＳｐｅＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）部位に隣接していた。ＰＣＲ増幅後に、このＰＣＲフラグメントを、その発現プラスミドｐＨＴｏｐ−ＨＢＭＬ／ＥＫＦｃのＳｐｅｌ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。そのオープンリーディングフレームは、以下をコードする：ミツバチメチリンリーダー（配列番号３のアミノ酸１〜２１）；ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号３のアミノ酸２３〜１３８）；エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＫ、配列番号６）；およびヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント（配列番号３のアミノ酸１４８〜３７８）。そのＳｐｅＩ部位の挿入の結果として、その配列においてＴｈｒ−２２が付加された。
【０１０３】
その上記ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを発現するように安定にトランスフェクトされたＣＨＯ安定細胞株を、そのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ構築物を含むｐＨＴｏｐ−ＨＢＭＬベクターのＣＨＯ／Ａ２細胞へのリポフェクチントランスフェクションにより得た。トランスフェクトされた細胞を、０．１μＭ メトトレキサート中で選択した。馴化培地のウェスタンブロッティング分析を用いて、最も高い発現クローンを同定した。
【０１０４】
そのｐＨＴｏｐベクターは、ｐＥＤ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０）から、Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１に記載されるように、そのアデノ主要後期プロモーターの大部分を除去し、そのｔｅｔオペレーターの６回反復を挿入することによって、誘導した。
【０１０５】
そのＣＨＯ／Ａ２細胞株を、転写活性化因子、ヘルペスウイルスＶＰ１６転写ドメインに融合されたそのｔｅｔリプレッサーの間に融合タンパク質（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１）を安定に組み込むことによって、ＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０）から、誘導した。
【０１０６】
（実施例４：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの精製）
馴化培地から濃縮した原材料を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｆａｓｔ
ＦｌｏｗＴＭ（ＸＫ２６／４．５ｃｍ、２３．８ｍｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、サイズ排除クロマトグラフィーによって以下のように決定した場合、９９％純粋にまで精製した。凍結した馴化培地を、３７℃の水浴で融解し、０．２２μｍフィルタを通して濾過した。その濾過した溶液の４部を、１部のプロテインＡローディング緩衝液（０．６５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ ホウ酸、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９．０）と混合し、それを、そのプロテインＡカラムに室温で流した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを、プロテインＡ溶出緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ クエン酸、ｐＨ２．５）を用いて勾配またはｐＨ約４〜５に段階的に上げることによって、そのカラムから溶出し、そのピークを集め、２６％中和緩衝液（０．０５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を添加することによって、ｐＨ７．０に中和した。その画分を、サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、次いで、プールし、４℃で保存した。その精製タンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５脱塩カラム（ＸＫ５０／１３．４ｃｍ、２３６ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、ＰＢＳへ処方し、次いで、０．２２μｍフィルタを通して濾過し、４℃で保存した。
【０１０７】
（実施例５：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ結合アッセイにおける精製ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１の結合特性）
そのＧＤＦ−８潜在的複合体を、２０モルのＥＺ−ｌｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，カタログ番号２１２１７）：１モルのＧＤＦ−８複合体の比で、２時間、氷上でビオチン化し、０．５％ ＴＦＡで不活性化し、Ｃ４ Ｊｕｐｉｔｅｒ ２５０×４．６ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でクロマトグラフィーに供して、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出したビオチン化成熟ＧＤＦ−８画分をプールし、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡプロテインアッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，カタログ番号２３２３５）により定量した。
【０１０８】
ビオチン化成熟ＢＭＰ−１１を、上記と同じ様式で、ＢＭＰ−１１潜在的複合体から調製した。組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（実施例３および４に記載されるように調製した）を、０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中１μｇ／ｍｌで、９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ，カタログ番号３５９０）上に一晩４℃でコーティングした。プレートを、次いで、１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンでブロックし、標準ＥＬＩＳＡプロトコルに従って洗浄した。１００μｌアリコートの種々の濃度のビオチン化ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１を、そのブロックしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートし、洗浄した。結合したＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１の量を、ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１３０４７Ｅ）により検出し、次に、ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，カタログ番号５０−７６−０４）を添加した。比色測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒデバイスマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎＭで行った。
【０１０９】
図１に示されるように、ビオチン化ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃに結合した（それぞれ、１５ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０）。
【０１１０】
（実施例６：レポーター遺伝子アッセイにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの阻害活性）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの活性を実証するために、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を、レポーターベクターＰＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２配列結合ルシフェラーゼを使用して行った。そのＣＡＧＡ配列は、ＴＧＦ誘導性遺伝子ＰＡＩ−１（Ｄｅｎｎｅｒら（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３０９１−３１００）のプロモーター内のＴＧＦ−応答性配列であると以前に報告された。
【０１１１】
１２個のＣＡＧＡボックスを含むレポーターベクターを、基本的なレポータープラスミドＰＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて作成した。そのアデノウイルス主要後期プロモーターに由来するそのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位（−３５／＋１０）を、そのＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。ＣＡＧＡボックスの１２回反復、ＡＧＣＣＡＧＡＣＡを含むオリゴヌクレオチドをアニールし、そのＸｈｏＩ部位にクローニングした。そのヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ストレプトアビジン、１０００μｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充したマッコイ５Ａ培地中、４８ウェルプレートで１６時間培養した。次いで、細胞を、グルタミン、ストレプトアビジン、ペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含むマッコイ５Ａ培地中、６時間３７℃で、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ−８、および種々の濃度のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃありまたはなしで処理した。ルシフェラーゼを、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその処理細胞において定量した。
【０１１２】
ＡｃｔＲＩＩＢの２つの独立して精製したロットは、上記のレポーター遺伝子アッセイにおいて、０．０７〜０．１ｎＭのＩＣ５０を示した（図２）。
【０１１３】
（実施例７：薬物動態）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの薬物動態（ＰＫ）を、１ｍｇ／ｋｇの用量において、１回の静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）投与として、Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）において評価した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（実施例３および４に記載されるように生成および精製した）を、ｉｏｄｏｇｅｎ法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（Ｆｅｒｒａｉｏｌｏら編．１９９２））を用いて放射性標識した。その動物に、上記の用量および血清濃度の非標識ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよび１２５Ｉ標識ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの混合物を与え、血清中の１２５Ｉ放射活性およびその注射した用量の比活性に基づいて決定した。図３は、ＴＣＡ沈澱した数 対 ＩＶまたはＩＰのいずれかで投与したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの時間に基づく血清濃度を示す。ＩＰ注射からの吸収は完全であり、バイオアベイラビリティーは、注射後の最初の１８０時間内で１００％に近かった；その最初の容量分布は、マウス血清容量（５０ｍｌ／ｋｇ）と適合した；ピーク血清濃度は、１１μｇ／ｍｌ（ＩＰ、注射後６時間）および１９．４μｇ／ｍｌ（ＩＶ）であった；最後の排除相の間の半減期は、約５日であった。
【０１１４】
（実施例８：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのインビボ効果）
ＡｃｔＲＩＩＢが成体マウスにおいて筋肉量を増やすか否かを決定するために、７週齢雌性Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、インビボ研究を行った。マウスを秤量し、体重に関して、８匹の群へと均一に割り当てた。４週間の研究の間に、各群に、ｒｅｃｅｉｖｅｄ １週間に１回以下の腹腔内注射を与えた：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（６０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または６０μｇ／ｋｇ）、マウスモノクローナル抗ＧＤＦ−８抗体ＪＡ１６（６０ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳ緩衝液（ビヒクルコントロール）。ＪＡ１６は、ＧＤＦ−８に特異的であり、かつインビボでＧＤＦ−８の筋肉ダウンレギュレート活性を阻害することが別の研究（米国特許出願公開番号２００３０１３８４２２号）で示されているので、この抗体を選択した。動物を、処置期間の前および後に、ｄｅｘａｓｃａｎ分析に供することにより、除脂肪体重における増加について評価した。筋肉重量を、腓腹筋および大腿四頭筋を切り出し、秤量することにより評価した。その子宮周囲脂肪パッドもまた取り出し、秤量した。脾臓および胸腺の重量もまた測定した。
【０１１５】
この研究の結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、ＧＤＦ−８活性をインビボで有意に阻害し、増大した筋肉重量を生じることを示した。理解されるように、ＪＡ１６を投与したマウスは、わずかにより高い体重および骨格筋重量を示し、大腿四頭筋重量における統計学的に有意な（ｐ＝０．０５）増加を有した（表４）。６０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃでの処置は、驚くべきことに、ＪＡ１６抗体と比較して、有意により有効であった。６０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよび３ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを投与した群は、コントロールと比較して、それぞれ、約３倍および約２倍の体重増加を有した（表１）。これらの増加は、１回の投薬後に最初に観察された。その大腿四頭筋重量は、絶対重量として、６０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを投与したマウスにおいて増大した（表３）。その腓腹筋は、絶対重量として、６０ｍｇ／ｋｇ ＪＡ１６および６０ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを投与したマウスにおいて増大した（表３）。体重の％として、大腿四頭筋重量は、コントロールと比較して、同じ３つの処置群において増大した（表４）。また、体重の％として、その腓腹筋重量は、６０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置したマウスにおいて増大した（表４）。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
（実施例９：筋量におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの用量依存効果）
成体マウスの筋量におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの効果をさらに研究するために、それに関する研究を、７週齢の雌性Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて行った。マウスを秤量し、体重に関して均等に、６匹の４つの群に分配した（６ ＳＣＩＤ、６ Ｃ５７マウス、そして各々６匹の２つのコントロール群）。各群に、１〜４週間の間、６０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＰＢＳ緩衝液（ビヒクルコントロール）の腹腔内注射を毎週与えた。研究の２９日目に、動物を、腓腹筋および大腿四頭筋を解剖し秤量することによって、筋量について評価した。この研究の結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、インビトロでＧＤＦ−８活性を有意に阻害し、ビヒクルコントロールと比較した場合、ＡｃｔＲＩＩＢの単回投与後でさえ筋量の増加を生じたことを示した。絶対重量としての大腿四頭筋重量は、Ｃ５７およびＳＣＩＤマウスの両方において２１％〜６０％まで増加した（表５）。同様に、絶対重量としての腓腹筋量は、３１〜５１％まで増加した（表５）。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
（実施例１０：骨梁におけるＧＤＦ−８のインビボでの役割）
ＧＤＦ−８の阻害は、筋量を増加させる。筋活性の増加または体重の増加のいずれかに起因する機械的付加の増加は、骨量および骨密度の増加に関連する。従って、ＧＤＦ−８ノックアウト（ＫＯ）マウスを、骨量および微小構造の変化について評価した。成体マウスの初期評価は、ＫＯマウスの脊椎における骨密度が、それらの野生型同腹仔の骨密度よりもほぼ２倍高かったことを示した。この増加は、単にＧＤＦ−８ ＫＯマウスにおける筋量の増加に起因して期待され得る増加をはるかに上回った。
【０１２３】
高解像度のマイクロ断層撮影画像化（μＣＴ４０、Ｓｃａｎｏ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、成体ＧＤＦ−８野生型（ＷＴ）マウスおよびＫＯマウスの第５腰椎および遠位大腿骨における骨梁容積画分および微小構造、ならびに大腿骨中骨幹での皮質骨の幾何学を評価した。標本を、９〜１０月齢のＧＤＦ−８ ＫＯおよび同腹仔コントロールから得た（各遺伝型および性別の４匹のマウス）。全体の椎体および大腿骨を、１２μｍ解像度でのマイクロコンピュータ断層撮影法を使用して走査した。椎体の骨梁または遠位大腿骨幹端の骨梁（すなわち、二次海綿質）を含む目的の領域を、半自動化輪郭アルゴリズムを使用して同定した。以下のパラメータを、直接３次元評価を使用してコンピューター計算した：骨容積画分（％）、骨梁厚（μｍ）、間隔（μｍ）および数（１／ｍｍ）。さらに、どれほど良好に骨梁ネットワークが連結されているかの指標である結合性密度を、大腿骨の中骨幹領域での皮質骨パラメータ（総面積、骨面積、および皮質厚を含む）と同様に評価した。
【０１２４】
雄性および雌性のどちらのＫＯマウスも、ＷＴ同腹仔と比較して、椎体の海綿質密度の劇的な増加を有した（ｎ＝４、それぞれ＋９３％および＋７０％、ｐ＜０．０００１）。この海綿質密度の増加は、骨梁厚における１４％の増加（ｐ＝０．０３）、骨梁数における３８％の増加（ｐ＝０．０００２）、および骨梁間隔における減少（ｐ＝０．００９）を伴った。構造および密度におけるこれらの変化の複合効果は、雄性ＫＯおよび雌性ＫＯにおいて、それらのＷＴ同腹仔と比較して、それぞれ、３．４倍および１．７倍の結合性の増加を生じた（ｐ＜０．０００１）。さらに、海綿質の石灰化のレベルの大まかな測定は、骨梁の平均ミネラル含量が、コントロールと比較してＫＯマウスで８％高かったことを示した（ｐ＜０．０００１）。この効果は、雌性マウスよりも雄性マウスでより大きいが、高解像度のマイクロコンピュータ断層撮影法によって評価された椎骨海綿質特性が、表６に示されているという最終的な結論に達するにはサンプルサイズが小さすぎるという示唆が存在する。
【０１２５】
脊椎における観察とは対照的に、雄性ＫＯマウスおよび雌性ＫＯマウスは、遠位大腿骨においてＷＴ同腹仔よりも海綿質密度が低かった（ｎ＝４、全体の遺伝子型効果に対してｐ＝０．０５）（表７）。この骨密度における減少は、雄性ＫＯマウスにおいてよりも雌性ＫＯマウスにおいてより明らかであった。ＧＤＦ−８ ＫＯマウスは、そのＷＴ同腹仔と同様の骨梁厚を有していたが、同腹仔コントロールと比較して骨梁はより少なく、骨梁間隔はより広かった。しかし、大腿中骨幹での皮質厚は、雄性ＧＤ−８ ＫＯとその同腹仔コントロールとで類似しており、ＧＤＦ−８雌性マウスではそのＷＴ同腹仔よりも約１０％大きかった（ｎ＝４、ｐ＝０．０４）（表８を参照のこと）。２つの遺伝子型間で、皮質骨面積または骨面積画分における差はなかった。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
【表８】
【０１２９】
（実施例１１：筋変性障害および骨変性障害の処置）
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドのようなＧＤＦ−８のインヒビターは、増加した筋量で指示された処置に対して有用であり、また、骨粗鬆症の予防および処置に対して有用である。さらに、ＧＤＦ−８の阻害は、骨同化効果が望まれる他の場合（例えば、骨治癒の増強（すなわち、骨折修復、脊椎癒合など））において有用であり得る。本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、疾患の兆候が現れた被験体または確定した筋変性疾患または骨変性疾患を有する被験体を処置するために使用される。
【０１３０】
骨障害（例えば、骨粗鬆総）の処置についてのＡｃｔＲＩＩＢの効力は、十分に確立された骨粗鬆症のモデルを使用して確かめられる。例えば、卵巣切除マウスが、新規の骨粗鬆症薬物処置の効力を試験するために使用されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（２００１）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１６：１６６５−１６７３；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら（２００１）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７０：５２９−５３７）。ヒトと同様に、これらのげっ歯類は、卵巣切除によって、骨（特に、海綿骨）の急速な損失を示す。結果の評価は、骨ミネラル密度、血清および尿中の骨代謝回転の生化学マーカー、骨強度、および組織学／組織形態計測に基づく。
【０１３１】
一研究では、健常な雌性マウスおよび／または免疫易感染性雌性マウスを、１２〜１６週齢で卵巣切除し、そして４〜６週間の間骨を損失させた。この骨損失期間の後、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＩＰ注射）またはビヒクルでの処置を、１〜６ヶ月行った。処置プロトコルは、様々な用量レジメンおよび処置レジメンの試験（例えば、毎日、毎週、または隔週の注射）を伴って変更し得た。処置していない卵巣切除マウス（またはラット）は、インタクトな（すなわち、卵巣切除されていない）年齢の一致するマウスに対して約１０〜３０％の骨密度を失うことが予測される。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置されたマウスが、ビヒクル処置を受けるマウスにおける骨量および骨密度よりも、１０〜５０％大きい骨量および骨密度を有すること、そしてさらに、この骨密度の増加が、特に、海綿骨の皮質骨に対する比がより大きい領域において、骨強度に関連することが予測される。
【０１３２】
別の研究の目的は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、エストロゲン欠乏症に関連する骨量、微小構造および強度の低下を予防することにおいて有効であることを示すことである。従って、この研究は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ抗体での処置を、骨損失期間後ではなく卵巣切除の直後に開始することを除いて、上記の設計と類似の設計を有する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置されたマウスが、ビヒクルで処置されたマウスよりも、卵巣切除後の骨量の損失が少ないことが予測される。
【０１３３】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、疾患を予防するため、ならびに／あるいは疾患の重篤度および／または症状を軽減するために使用される。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１日１回の頻度で皮下注射として投与され、そして月に１回のまれに投与されることが予測される。処置期間は、１ヶ月〜数年の範囲であり得る。
【０１３４】
ヒトにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの臨床効力を試験するために、骨量の低い閉経後の女性を、骨密度試験によって同定し、そして処置群にランダム化する。処置群としては、プラシーボ群、および抗体（様々な用量）を与える１〜３つの群が挙げられる。個体を、１〜３年の見通しに従って、骨代謝回転における生化学的マーカーの変化、骨ミネラル密度の変化、および脆弱性骨折の発症を評価する。処置を受けた個体は、ベースラインと比較して遠位大腿における骨ミネラル密度の増加および２〜３０％の腰椎の増加を示し、そして脆弱性骨折の事例が減少することが予測される。骨形成の生化学的マーカーが増加することが予測される。
【０１３５】
ポリペプチドは、単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される。単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される場合、投薬量は、好ましくは、症状の重篤度および疾患の進行度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。適切な有効量は、処置医師によって以下から選択される：１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ。例示的な処置レジメンおよび結果は、表９に要約されている。代替的レジメンとしては、以下が挙げられる：（１）１×ＩＣ５０、または４０μｇ／ｋｇの初期用量および０．５×ＩＣ５０、または２０μｇ／ｋｇ、２週間後；（２）１０×ＩＣ５０初期用量および５×ＩＣ５０、２週間後；あるいは１００×ＩＣ５０および５０×ＩＣ５０、２週間後。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
（実施例１２：代謝障害の処置）
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドのようなＧＤＦ−８のインヒビターは、代謝障害（例えば、２型糖尿病、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（例えば、肥満症））の処置のために有用である。本発明の方法において、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド抗体は、疾患の兆候が現れた被験体または確定した代謝疾患を有する被験体を処置するために使用される。
【０１３８】
代謝障害（例えば、２型糖尿病および／または肥満症）の処置に対するＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの効力は、肥満症、インスリン抵抗性および２型糖尿病（ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ）の十分に確立したマウスモデル、ならびに枯死性黄化を保有する株を使用して行われる。インスリン抵抗性はまた、特定のマウス株（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを含む）の高脂肪摂取または高カロリー摂取によって誘導され得る。ヒトと同様に、これらのげっ歯類は、インスリン抵抗性、高インスリン血症、異脂肪血症、および高血糖症を生じるグルコースホメオスタシスの低下を発症する。結果の評価は、血清のグルコース測定、インスリン測定、および脂質測定に基づく。改善されたインスリン感受性の測定は、インスリン耐性試験およびグルコース耐性試験によって決定され得る。より高感度な技術としては、改善が糖血症制御およびインスリン感受性であることを評価するための、正常血糖性高インスリン性クランプの使用が挙げられる。さらに、このクランプ技術は、改善された糖血症制御における主要なグルコース処理組織（筋肉、脂肪細胞、および肝臓）の役割の定量的評価を可能にする。
【０１３９】
一研究において、配列番号３に記載されるようなＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドでの処置（ＩＰ注射）またはビヒクルでの処置を、１週間〜６ヶ月間行う。この処置プロトコルは、様々な用量および処置レジメン（例えば、毎日、毎週、または隔週の注射）を伴って変更し得る。融合ポリペプチドで処置されたマウスは、プラシーボ処置を受けたマウスと比較して、グルコース取り込みがより大きく、解糖およびグリコーゲン合成が増加し、血清中の遊離の脂肪酸およびトリグリセリドがより少ないことが予測される。
【０１４０】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、疾患の予防、ならびに／あるいは疾患の重篤度および／または症状を軽減するために使用される。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１日１回の頻度で皮下注射として投与され、そして１ヶ月に１回のまれな頻度で投与されることが予測される。処置期間は、１ヶ月〜数年間の範囲であり得る。
【０１４１】
ヒトにおけるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの臨床効力を試験するために、２型糖尿病に罹患している被験体または２型糖尿病に罹患する危険性のある被験体を同定し、そして処置群に無作為化する。処置群としては、プラシーボ群およびＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド（様々な用量）を与える１〜３つの群が挙げられる。個体を、１〜３年の見通しに従って、グルコース代謝の変化を評価する。処置を受けた個体が、改善を示すことが予測される。
【０１４２】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される。単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される場合、その投薬量は、症状の重篤度および疾患の進行度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり得る。適切な有効量は、処置医師によって以下から選択される：１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ。例示的な処置レジメンおよび結果は、表７に要約されている。
【０１４３】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年１０月２５日に出願された米国仮出願番号６０／４２１，０４１（その全体が本明細書中で参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本願の技術分野は、増殖分化因子−８（ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−８）（ＧＤＦ−８）（可溶性形態のアクチビンＩＩ型レセプター、およびそのフラグメントを含む）のインヒビター、特に、インビボでＧＤＦ−８活性を阻害するインヒビターに関する。この分野は、さらに、筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの変性疾患を診断、予防、または処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ＴＧＦ−βファミリーは、多数の構造関連増殖因子であり、そのすべてが生理学的に重要な増殖調節特性および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（）１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、８：１３３−１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２２８：２３５−２７２）。これらの因子としては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、ミューラー阻害物質、グリア誘導神経栄養性因子、およびなお増え続けている増殖分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ−８）が挙げられる。これらのタンパク質の多くは、高度に相同性である。例えば、ヒトＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１としてもまた公知）は、アミノ酸レベルでＧＤＦ−８に対して９０％同一である（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：２２２−２３２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｎｍｙｒｉｃｋ．ｃｏｍＮａｋａｓｈｉｍａら（１９９９）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０：１８５−１８９）。
【０００４】
ＴＧＦ−βファミリーのほとんどのメンバーは、細胞表面上に発現された２つの異なる型のセリン／スレオニンキナーゼレセプター（すなわち、約５０〜５５ｋＤａのＩ型レセプターおよび７０ｋＤａより大きいＩＩ型レセプター）のヘテロマー複合体の形成を通してシグナルを伝達することが公知である。Ｉ型レセプターは、直接リガンドに結合しない；それどころか、Ｉ型レセプターは、リガンド分子に結合しないＩＩ型レセプターと会合することによってシグナル伝達に関与する。ＴＧＦ−β系は、動物界全体にわたって高度に保存されている。（ＴＧＦ−β系の概説について、Ｍａｓｓａｇｕｅ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：１６−１７８；およびＭｏｕｓｔａｋａｓら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１４：４３５９−４３６９を参照のこと）。
【０００５】
アクチビンＩＩ型レセプターは、以前に、米国特許第５，８８５，７９４号に記載されている。アクチビンは、もともとは、下垂体における卵胞刺激ホルモンの生成への刺激効果を有するタンパク質として、卵胞液から精製された。アクチビンＩＩ型レセプターの５つのイソ型が、アクチビン応答細胞において同定されている。インビトロ研究に基づいて、これらのレセプターは、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーによって共有され得る（Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１０６６−１０７３）。本発明は、部分的には、ＩＩ型アクチビンレセプター（ＡｃｔＲＩＩＢと称される）が、アクチビンに加えて増殖分化因子−８（ＧＤＦ−８）に結合し得るという発見に基づいている。
【０００６】
ＧＤＦ−８は、骨格筋における重要な生物学的プロセスおよび骨形成の調節に関与する。ＧＤＦ−８は、発育中の骨格筋および成熟した骨格筋において高度に発現される。ＧＤＦ−８ノックアウトトランスジェニックマウスは、骨格筋の著しい肥大および過形成（非特許文献１）および異常な皮質骨構造（非特許文献２）によって特徴付けられる。骨格筋質量における同様の増大は、ウシにおけるＧＤＦ−８の天然に存在する変異において明らかである（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６）。研究は、ＨＩＶ感染に関連する筋肉疲労が、ＧＤ−８発現の増大を伴うことを示してきた（非特許文献７）。ＧＤＦ−８はまた、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成、および筋芽細胞の増殖（特許文献１）に関係している。その増殖調節特性および形態形成特性に加えて、ＧＤＦ−８はまた、多数の他の生理学的プロセス（２型糖尿病の発達におけるグルコースホメオスタシス、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡によって誘導されるインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（例えば、肥満症））に関連し得る（非特許文献８）。
【０００７】
多くのヒト障害および動物障害は、機能障害性の筋組織（例えば、筋ジストロフィー（デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられる）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮、器官萎縮、フレイルティー（ｆｒａｉｌｔｙ）、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、ならびに他の疾患および状態によって引き起こされる筋肉疲労症候群）に関連する。現在まで、これらの障害を処置するために信頼性がありかつ有効な治療はほとんど発達してこなかった。
【０００８】
また、骨粗鬆症および骨関節炎を含む骨の損失（特に若年女性および／または閉経後の女性における骨の損失）に関連する多くの状態が存在する。さらに、代謝性骨疾患および代謝性骨障害としては、慢性的な糖質コルチコイド治療、早発性の性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養欠乏症、および拒食症に起因する低骨量が挙げられる。これらの状態に対して現在利用可能な治療は、骨吸収を阻害することにより行う。新たな骨形成を促進する治療が、これらの治療の望ましい代替である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第００／４３７８１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：８３−９０
【非特許文献２】Ｈａｍｒｉｃｋら（２０００）Ｂｏｎｅ ２７（３）：３４３−３４９
【非特許文献３】Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４）Ｇｒｏｗｔｈ ３８：５０１−５０７
【非特許文献４】Ｓｗａｔｌａｎｄら（１９９４）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．３８：７５２−７５７
【非特許文献５】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２４５７−１２４６１
【非特許文献６】Ｋａｍｂａｄｕｒら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：９１０−９１５
【非特許文献７】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４９３８−１４９４３
【非特許文献８】Ｋｉｍら（２００１）ＢＢＲＣ ２８１：９０２−９０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、特に、ヒトにおいて、骨量および／または骨密度の全体的な増加に寄与する新たな治療を開発する必要性が存在する。筋肉および／または骨に関連する障害に対する安全かつ有効な治療方法を提供することが、本発明の主題である。哺乳動物において骨量および／または骨密度を増加させる方法を提供することが、本発明の別の主題である。インビボで安全かつ有効なＧＤＦ−８のインヒビターを提供することが、本発明のなお別の主題である。
【００１２】
本発明のさらに別の主題は、インビボで安定でありかつ高い特異性および親和性でＧＤＦ−８に結合する、可溶性形態のアクチビンＩＩ型レセプターＡｃｔＲＩＩＢおよび／またはその機能フラグメントを提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる主題は、以下の明細書中に部分的に記載され、そして本明細書から部分的に明らかであるかまたは本発明の実施によって学ばれ得る。本発明の種々の主題、局面、および利点は、特に添付の特許請求の範囲に示された要素および組み合わせによって認識され、そして達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
筋変性障害および骨変性障害を処置するための方法が、本明細書中で提供される。この方法はまた、健常な動物において骨量および骨密度を増加させるのに有用である。
【００１５】
また、骨格筋質量および骨密度のネガティブな調節に関連するＧＤＦ−８活性を阻害するための方法が提供される。
【００１６】
インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８に結合しかつ阻害する、安定化可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ形態およびそのフラグメントが、提供される。本願で開示される可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ形態は、それらを治療剤として適切にさせる薬物動態学的特性を有する。
【００１７】
他の局面は、本願で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含有する組成物、およびＧＤＦ−８を阻害する方法もしくは中和する方法におけるそれらの組成物の使用（ヒトまたは動物の処置方法を含む）を提供する。開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、筋組織または骨密度の増加が望ましい状態を処置または予防するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質はまた、損傷した筋肉（例えば、心筋、横隔膜など）を修復するための治療において使用される。例示的な疾患および障害としては、筋ジストロフィー（デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられる）；筋萎縮性側索硬化症；筋萎縮；器官萎縮；フレイルティー；手根管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；サルコペニア、悪液質および他の筋肉疲労症候群；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；２型糖尿病；グルコース寛容減損；代謝性症候群（例えば、Ｘ症候群）；外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性；骨変性疾患（例えば、骨関節炎および骨粗鬆症）のような筋障害および神経筋障害が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法において利用される改変ＡｃｔＲＩＩＢ形態は、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体の定常領域に由来する第２のアミノ酸配列を含む、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドである。
【００１９】
特定の実施形態において、第１の配列は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインの全体または一部分を含むか、あるいはこのような配列の変異体である。第２の配列は、抗体のＦｃ部分に由来し得るか、またはこのような配列の変異体である。
【００２０】
さらなる実施形態において、第２の配列は、リンカー配列によって連結されるかまたは連結されずに、第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結される。
【００２１】
筋肉変性障害および／または骨変性障害を処置するための治療方法もまた、提供される。例示的な疾患および障害としては、筋障害および神経筋障害（例えば、筋ジストロフィー）、筋萎縮、鬱血性閉塞性肺疾患、筋肉疲労症候群、サルコペニア、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満症）、２型糖尿病、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷（例えば、熱傷）によって誘導されるインスリン抵抗性、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）が挙げられる。
【００２２】
さらに、本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、生物学的サンプル中のＧＤＦ−８またはそのフラグメントを定量的または定性的に検出するための診断ツールとして使用され得る。検出されるＧＤＦ−８の存在または量は、上記に列挙した病状のうちの１以上と関連し得る。
【００２３】
本発明の方法において使用されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする単離された核酸もまた、提供される。さらに、上記核酸を含む発現ベクター；上記発現ベクターを含む宿主細胞；および上記核酸を生成するための方法が提供される。
【００２４】
なお別の局面は、筋障害および骨障害処置に有用な治療剤を同定する方法を提供する。
【００２５】
上記の概説および以下の詳細な説明が、例示的かつ説明のためのみであり、主張されるように本発明を制限しないことが理解される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスのうちの少なくとも１種の変性疾患の処置方法または予防方法であって、該方法は、哺乳動物に有効量の薬学的組成物を投与する工程、および該組成物がＧＤＦ−８活性を阻害することを可能にする工程を包含し、ここで、該組成物は、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含有する、方法。
（項目２）
上記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記薬学的組成物が、筋障害、神経筋障害、および骨変性障害のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記薬学的組成物が、筋ジストロフィー、デュシェーヌ筋ジストロフィー、筋萎縮、器官萎縮、手根管症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉疲労症候群、および筋萎縮性側索硬化症のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記薬学的組成物が、デュシェーヌ筋ジストロフィーの処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記薬学的組成物が、肥満症および脂肪組織障害のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記薬学的組成物が、Ｘ症候群、グルコース寛容減損、外傷誘導性インスリン抵抗性、および２型糖尿病のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記薬学的組成物が、２型糖尿病および肥満症のうちの少なくとも１種の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記薬学的組成物が、骨関節炎および骨粗鬆症のうちの少なくとも１種から選択される障害の処置または予防を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記薬学的組成物が、損傷した筋肉の修復を必要とする哺乳動物に投与される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記損傷した筋肉が、心筋の筋肉または横隔膜である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１μ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される有効量で投与される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸２３〜１３８を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１９〜１４４を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第２のアミノ酸配列が、（ａ）ＩｇＧのＦｃフラグメント、（ｂ）ＩｇＧ１のＦｃフラグメント、（ｃ）ＩｇＧ４のＦｃフラグメント、および（ｄ）配列番号３のアミノ酸１４８〜３７８から選択される配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの配列が、配列番号３に記載されている、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの循環半減期が、５日を超える、項目１に記載の方法。
（項目１８）
配列番号３のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
（項目１９）
項目１８に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
（項目２０）
上記核酸が、配列番号４に記載されている、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
項目１９に記載の核酸を含む、発現ベクター。
（項目２２）
項目２１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目２３）
上記融合タンパク質が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４の配列に対してハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目１に記載の方法。
（項目２４）
ＧＤＦ−８のインヒビターを同定するための方法であって、以下：
（ａ）項目１８に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびＧＤＦ−８を含む第１の結合混合物を調製する工程；
（ｂ）該第１の混合物における該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドとＧＤＦ−８との間の結合量を測定する工程；
（ｃ）該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、ＧＤＦ−８、試験化合物を含む第２の結合混合物を調製する工程；および
（ｄ）該第２の混合物における該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドとＧＤＦ−８との間の結合量を測定する工程
を包含する、方法。
（項目２５）
ＧＤＦ−８活性を阻害する方法であって、該方法は、ＧＤＦ−８を組成物と接触させる工程、および該組成物がＧＤＦ−８活性を阻害することを可能にする工程を包含し、ここで、該組成物は、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含有する、方法。
（項目２６）
筋力を増大させる方法であって、該方法は、哺乳動物にＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの治療有効量を投与し、それによって、筋力を増大させる工程を包含し、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２７）
骨梁の骨密度を増大させる方法であって、該方法は、哺乳動物にＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの治療有効量を投与し、それによって、骨梁の骨密度を増大させる工程を包含し、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２８）
グルコース寛容減損を増大させる方法であって、該方法は、哺乳動物にＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの治療有効量を投与し、それによって、骨梁の骨密度を増大させる工程を包含し、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、方法。
（項目２９）
筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの少なくとも１種の障害の処置または予防のための、医薬の調製のためのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの使用であって、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｂ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、使用。
（項目３０）
上記哺乳動物がヒトである、項目２９に記載の使用。
（項目３１）
上記障害が神経筋障害である、項目２９に記載の使用。
（項目３２）
上記障害が、筋ジストロフィー、デュシェーヌ筋ジストロフィー、筋萎縮、器官萎縮、手根管症候群、鬱血性閉塞性肺疾患、サルコペニア、悪液質、筋肉疲労症候群、または筋萎縮性側索硬化症である、項目２９に記載の使用。
（項目３３）
上記障害が、肥満症または脂肪組織障害である、項目２９に記載の使用。
（項目３４）
上記障害が、Ｘ症候群、グルコース寛容減損、外傷誘導性インスリン抵抗性、または２型糖尿病である、項目２９に記載の使用。
（項目３５）
上記障害が、骨関節炎または骨粗鬆症である、項目２９に記載の使用。
（項目３６）
以下：
（ａ）筋肉損傷の修復；
（ｂ）筋力の増大；
（ｃ）骨梁の骨密度の増大；および
（ｄ）グルコース寛容減損
のうちの少なくとも１種のための、医薬の調製のためのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの使用であって、ここで、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ｉ）ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインに由来する第１のアミノ酸配列、および（ｉｉ）抗体のＦｃ部分に由来する第２のアミノ酸配列を含む、使用。
（項目３７）
上記（ａ）の損傷した筋肉が、心筋の筋肉または横隔膜である、項目３６に記載の使用。
（項目３８）
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１μ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、または５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの有効量で哺乳動物に投与される、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目３９）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号３のアミノ酸２３〜１３８を含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４０）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの第１のアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸１９〜１４４を含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４１）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの上記第２のアミノ酸配列が、（ａ）ＩｇＧのＦｃフラグメント、（ｂ）ＩｇＧ１のＦｃフラグメント、（ｃ）ＩｇＧ４のＦｃフラグメント、または（ｄ）配列番号３のアミノ酸１４８〜３７８を含む、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４２）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドのアミノ酸配列が、（ａ）配列番号３に記載されているか、または（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４の配列に対してハイブリダイズする核酸によってコードされる、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
（項目４３）
上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの循環半減期が、５日を超える、項目２９〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【００２６】
（配列の簡単な説明）
以下の表は、本明細書中で称される配列についての参照として提供される。
【００２７】
【数１】
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃに対するビオチン化ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１の結合を示す。
【図２】図２は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを試験したレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。
【図３】図３は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの単回静脈内（ＩＶ）投与または単回腹腔内（ＩＰ）投与を利用する、Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウスにおける薬物動態学的研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、ＧＤＦ−８に特異的に結合し得るアクチビンＩＩ型レセプターまたはそのフラグメントの任意の異性体をいう。この用語は、起源、生成方法、およびＡｃｔＲＩＩＢの他の特性のうちのいかなる特定の種にも限定されない。この用語は、組換え生成されたＡｃｔＲＩＩＢまたはそのフラグメントを包含し、そして特に、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのＧＤＦ−８結合ドメインを包含する。この用語はまた、ＡｃｔＲＩＩＢの対立遺伝子およびスプライス改変体、それらの相同体、ならびに導入された変異（置換、付加、および欠失）を含むそれらのオルソログおよび配列を包含する。
【００３０】
用語「筋肉、骨、またはグルコースホメオスタシスの変性障害」とは、ＧＤＦ−８および／またはＴＧＦ−βスーパーフェミリーの他のメンバー（例えば、ＢＭＰ−１１）に関連する多くの障害および疾患をいう。このような障害の例としては、代謝障害（例えば、２型糖尿病）、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えばＸ症候群）、および外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性；脂肪組織障害（例えば、肥満症）；筋障害および神経筋障害（例えば、筋ジストロフィー（デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられる））；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮；器官萎縮；フレイルティー；手根管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；ならびにサルコペニア、悪液質および他の筋肉疲労症候群が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、骨粗鬆症（特に、若年女性および／または閉経後の女性における骨粗鬆症）；糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症；骨減少症；骨関節炎；および骨粗鬆症に関連する骨折が挙げられる。なおさらなる例としては、慢性的な糖質コルチコイド治療、早発性の性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養欠乏症、および拒食症に起因する低骨量が挙げられる。
【００３１】
用語「有効量」とは、患者における症状の改善または所望の生物学的結果（例えば、骨格筋量および／骨密度の増加）を生じる化合物の量をいう。このような量は、骨格筋量および骨密度のネガティブな調節に関連するＧＤＦ−８の活性を低下させるのに十分であるべきである。有効量は、以下のセクションに記載されるように決定され得る。
【００３２】
ＡｃｔＲＩＩＢに関連して使用される場合、用語「ＧＤＦ−８結合ドメイン」とは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン、またはＧＤＦ−８に結合するために必要なその一部（すなわち、ＧＤＦ−８に対する特異的結合を引き起こすＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの一部）をいう。
【００３３】
用語「ＴＧＦ−βスーパーファミリー」とは、構造的に成長因子に関連するファミリーをいう。この成長因子に関連するファミリーは、当該分野で周知である（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：１３３−１４６；Ｈｏｏｄｌｅｓｓら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２８：２３５−７２）。ＴＧＦ−βスーパーファミリーとしては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、アクチビン、インヒビン、ミューラー阻害物質、グリア誘導神経栄養性因子、およびなお増え続けている増殖分化因子（ＧＤＦ）（例えば、ＧＤＦ−８（ミオスタチン））が挙げられる。このようなタンパク質の多くは、構造的および／または機能的にＧＤＦ−８に関連している。例えば、ヒトＢＭＰ−１１（ＧＤＦ−１１としてもまた公知）は、アミノ酸レベルでＧＤＦ−８に対して９０％同一である（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０８：２２２−２３２；Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９９）Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０：１８５−１８９）。
【００３４】
用語「ＧＤＦ−８」とは、特定の増殖分化因子−８をいい、そして適切な場合には、構造的または機能的にＧＤＦ−８に関連する任意の因子（例えば、ＢＭＰ−１１およびＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する他の因子）を包含することが理解されるべきである。この用語は、全長のプロセシングされていないＧＤＦ−８の前駆形態、ならびに翻訳後切断により生じる成熟ポリペプチドおよびプロペプチドポリペプチドをいう。この用語はまた、本明細書中で議論されるようなＧＤＦ−８に関連する１以上の生物学的活性を保持する、ＧＤＦ−８の任意のフラグメントおよび改変体をいう。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。本発明は、すべての脊椎動物種（ヒト、ウシ、トリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚（配列情報について、例えば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２４５７−１２４６１を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない）に由来するＧＤＦ−８に関する。
【００３５】
用語「成熟ＧＤＦ−８」とは、ＧＤＦ−８前駆タンパク質のカルボキシ末端ドメインから切断されるタンパク質をいう。成熟ＧＤＦ−８は、モノマー、ホモダイマーとして存在し得るか、またはＧＤＦ−８潜在的複合体中に存在し得る。条件に依存して、成熟ＧＤＦ−８は、これらの様々なポリペプチドのいずれかまたはすべてとの間に平衡を確立し得る。その生物学的活性形態において、成熟ＧＤＦ−８はまた、「活性なＧＤＦ−８」と称される。
【００３６】
用語「ＧＤＦ−８プロペプド」とは、ＧＤＦ−８前駆タンパク質のアミノ末端ドメインから切断されるポリペプチドをいう。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８におけるプロペプチド結合ドメインに結合し得る。
【００３７】
用語「ＧＤＦ−８潜在的複合体（ｌａｔｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、成熟ＧＤＦ−８ホモダイマーとＧＤＦ−８プロペプチドとの間で形成されるタンパク質の複合体をいう。２つのＧＤＦ−８プロペプチドが、ホモダイマー中の成熟ＧＤＦ−８の２分子に会合して、不活性なテトラマーの複合体を形成すると考えられる。潜在的複合体は、ＧＤＦ−８プロペプチドのうちの一方または両方に加えてかまたは代わりに他のＧＤＦ−８インヒビターを含み得る。
【００３８】
用語「ＧＤＦ−８活性」とは、活性なＧＤＦ−８タンパク質に関連する生理学的な成長調節活性または形態形成活性のうちの１以上をいう。例えば、活性なＧＤＦ−８は、骨格筋のネガティブな調節因子である。活性なＧＤＦ−８はまた、筋肉に特異的な酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節し得、線維芽細胞増殖を刺激し得、そして前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調節し得る。インビボおよびインビトロでＧＤＦ−８活性を評価するための手順としては、例えば、レポーター遺伝子アッセイ（実施例６を参照のこと）または筋肉および／骨パラメータの測定に関するインビボ試験（実施例８、９、および１０を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
用語「Ｆｃ部分」とは、パパインを用いるタンパク質分解によって生成される免疫グロブリンのＣ末端フラグメント、またはそれらに由来する機能的等価物をいう。用語「Ｆｃ部分」は、組換え生成されたＦｃフラグメント（任意の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）およびアイソタイプサブクラスのいずれかに由来するＦｃフラグメントが挙げられる）を包含することが理解されるべきである。用語「抗体の定常領域」とは、免疫グロブリンのＣ末端部分をいい、Ｆｃ部分および抗体の可変領域（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含まない限りは隣接配列を含む。抗体の定常領域は、特定のアイソタイプの抗体において、同一である。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、有意に同一であるかまたは互いに相同であるヌクレオチド配列が、互いに相補的に結合する、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を記載することが意図される。この条件は、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５〜９０％同一な配列が、互いに結合され続けるような条件である。同一性割合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように決定される。
【００４１】
ストリンジェントな条件は、当該分野で公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５）、セクション２、４、および６に見いだされ得る。さらに、ストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第７章、９章、および１１章に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下である：
約６５〜７０℃で４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション、または約４２〜５０℃で４×ＳＳＣ ＋ ５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション、その後、
約６５〜７０℃で１×ＳＳＣにおける１回以上の洗浄。
例えば、ナイロン膜を使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる非限定的な例は以下である：
約６５℃で０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、７％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後、
６５℃で０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄。
例えば、Ｃｈｕｒｃｈら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１９９１−１９９５を参照のこと。さらなる試薬（例えば、ブロック化剤（ＢＳＡまたはサケ精子ＤＮＡ）、洗浄剤（ＳＤＳ）、キレート化剤（ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなど）が、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液に添加され得ることが理解される。
【００４２】
ＧＤＦ−８またはその活性に関係して使用される場合、用語「インヒビター」は、ＧＤＦ−８の活性、発現、プロセシング、または分泌を阻害し得る任意の薬剤を包含する。このようなインヒビターとしては、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、およびＧＤＦ−８を阻害する他の低分子が挙げられる。このようなインヒビターは、ＧＤＦ−８タンパク質の生物学的活性を「阻害する」、「中和する」、または「低下させる」と言われる。
【００４３】
用語「中和する」、「中和すること」、「抑制性の」、およびそれらの同族語とは、ＧＤＦ−８インヒビターの非存在下におけるＧＤＦ−８の活性に対する、同じインヒビターによるＧＤＦ−８の活性の低下をいう。活性の低下は、好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きい。
【００４４】
用語「単離された」とは、実質的にその天然の環境から離れている分子をいう。例えば、単離されたタンパク質は、それらが由来する細胞源または組織源からの細胞物質または他のタンパク質を実質的に含まない。この用語は、 単離されたタンパク質が治療組成物として投与されるのに実質的に純粋であるか、または少なくとも７０％〜８０％（ｗ／ｗ）純粋、少なくとも８０％〜９０％純粋、９０％〜９５％純粋であるか；あるいは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％純粋である調製物をいう。
【００４５】
用語「哺乳動物」とは、ヒトを含み、家庭用動物および家畜用動物、動物園用動物、競技用動物、またはペット用動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなど）として分類される任意の動物をいう。
【００４６】
用語「特異的相互作用」また結合する」などは、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。この用語はまた、例えば、抗原結合ドメインが、多数の抗原によって保有される特定のエピトープに対して特異的である場合に適用可能であり、この事例において、抗原結合ドメインを保有する抗体は、このエピトープを保有する種々の抗原に対して結合し得る。従って、抗体は、例えば、その抗体がＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８の両方によって保有されるエピトープに結合する限りは、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８に特異的に結合し得る。
【００４７】
特異的結合は、高い親和性および低〜中程度の能力によって特徴付けられる。非特定的結合は、通常、中程度〜高い能力で、低い親和性を有する。代表的に、結合は、親和性定数Ｋａが１０６Ｍ−１より高いかまたは好ましくは１０８Ｍ−１より高い場合、特異的と考えられる。必要な場合、非特異的結合は、結合状態を変更することによって特異的結合に実質的に影響することなく、減少され得る。このような条件は、当該分野において公知であり、慣用的な技術を使用して、当業者は、適切な条件を選択し得る。条件は、通常、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を許容する時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などの点で規定される。例示的条件は、実施例５および６に記載される。
【００４８】
句「実質的に記載される（ｓｕｂｔａｎｔｉａｌｌｙ ａｓ ｓｅｔ ｏｕｔ）」は、関連するアミノ酸配列が、所定の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味する。例として、このような配列は、種々の種由来の改変体であり得るか、またはこれらは、短縮、欠失、アミノ酸置換または付加によって所定の配列から誘導され得る。２つのアミノ酸配列間の同一性％は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５；４０３−４１０に記載されるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７のアルゴリズムのような標準的な整列アルゴリズムによって決定される。
【００４９】
用語「処置」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）／予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方をいう。処置の必要なものには、特定の医療的障害を既に有する個体、ならびに最終的に障害を獲得し得るもの（すなわち、骨粗鬆症の家族歴を有する閉経後の女性、または２型糖尿病の家族歴もしくはいくらか上昇した血糖の読み値を有する肥満の患者のような予防的処置を必要とするもの）が挙げられ得る。
【００５０】
（ＩＩ．ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド）
本発明は、ＧＤＦ−８に結合し、インビトロおよび／またはインビボでその活性を阻害する改変アクチビンＩＩ型レセプターを提供する。特に、ここで開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、骨格筋質量および骨密度のネガティブな調節と関連するＧＤＦ−８活性を阻害する。本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、治療的用途（例えば、延長された循環半減期および／またはタンパク質分解からの改善された保護）に対してそれらを適切にする薬理学的特性を有する。
【００５１】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、（ａ）ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン由来の第１のアミノ酸配列および（ｂ）抗体の定常領域由来の第２のアミノ酸配列を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの特定の例示的実施形態の全アミノ酸およびＤＮＡ配列は、配列番号３および配列番号４それぞれに記載される。
【００５２】
第１のアミノ酸配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインの全てまたは一部由来であり、ＧＤＦ−８を特異的に結合し得る。いくつかの実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインのこのような部分はまた、ＢＭＰ−１１および／またはアクチビン、あるいは他の成長因子に結合し得る。特定の実施形態において、第１のアミノ酸配列は、配列番号３において、およそアミノ酸（ａａ）２３〜およそａａ１３８、または配列番号１のおよそａａ１９〜およそａａ１４４と同一かまたは実質的に記載される。配列番号１と配列番号３との間の違いは、配列番号１のａａ６４が、Ａｌａであり、他方、配列番号３の対応するａａ６８が、Ａｒｇであることである。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢの配列の他の改変が可能であり、例えば、配列番号１のａａ１６およびａａ１７は、それぞれ、ＣｙｓおよびＡｌａで置換され得る。いくつかの他の実施形態において、第１のアミノ酸配列は、配列番号３のおよそａａ２３およびおよそａａ１３８から、または配列番号１のおよそａａ１９およびおよそａａ１４４から、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個または１２０個の連続したアミノ酸を含む。このような配列は、短縮型配列が、ＧＤＦ−８に特異的に結合する限り、短縮され得る。ＧＤＦ−８への結合は、当該分野で公知の方法を使用して、または実施例５および６に記載されるように、アッセイされ得る。
【００５３】
第２のアミノ酸配列は、抗体（特に、Ｆｃ部分）の定常領域由来であるか、またはこのような配列の変異体である。いくつかの実施形態において、第２のアミノ酸配列は、ＩｇＧのＦｃ部分由来である。関連の実施形態において、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、または別のＩｇＧアイソタイプであるＩｇＧ由来である。特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列は、配列番号３に記載されるヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（アミノ酸１４８〜３７８）を含み、ここで、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は、Ｆｃ部分のエフェクター機能を最小化するように改変されている。このような改変は、Ｆｃレセプター結合のようなエフェクター機能を変更し得る特異的アミノ酸残基を変更すること（Ｌｕｎｄら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４７：２６５７−２６６２およびＭｏｒｇａｎら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６：３１９−３２４）、または定常領域が誘導される種を変更することを包含する。抗体は、エフェクター機能を減少させる重鎖のＣＨ２領域の変異（すなわち、Ｆｃレセプター結合および補体活性化）を有し得る。例えば、抗体は、米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号に記載される変異のような変異を有し得る。ＩｇＧ１重鎖またはＩｇＧ２重鎖において、例えば、このような変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の全長配列のアミノ酸２３４および２３７に対応するアミノ酸残基においてなされ得る。抗体はまた、免疫グロブリンの２つの重鎖の間のジスルフィド結合を安定化する変異（例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域の変異）を有し得る（Ａｎｇａｌら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８に開示される）。
【００５４】
特定の実施形態において、第２のアミノ酸配列は、リンカー配列によって連結されるかまたはリンカー配列によって連結されないで、第１のアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に連結される。リンカーの実際の長さおよび配列および連結される配列に田尾するその配向は、種々であり得る。例えば、リンカーは、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）２（配列番号５）であり得る。リンカーは、２アミノ酸、１０アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸を含み得、溶解性、長さおよび立体的分離、免疫原性などのような所望の特性に基づいて選択される。特定の実施形態において、リンカーは、タンパク質分解切断部位の配列（例えば、エンテロキナーゼ切断部位Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号６））、または例えば、融合タンパク質の精製、検出または改変に有用な他の機能性配列を含み得る。
【００５５】
任意のタンパク質の配列の特定のアミノ酸が、タンパク質の活性に有害に影響することなく、他のアミノ酸を置換し得ることが、当業者によって理解される。従って、種々の変化が、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの配列のアミノ酸配列、またはこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ配列において、それらの生物学的活性または有用性を認識可能に損失することなく、なされ得ることが企図される。ＡｃｔＲＩＩＢの生物学的活性は、実施例６〜１０に記載されるように測定され得る。このような変化としては、欠失、挿入、短縮、および置換が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明の任意のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの、他のタンパク質由来のアミノ酸配列へのさらなる融合が構築され得る。望ましい融合配列は、例えば、サイトカイン、増殖因子および分化因子、酵素、ホルモン、他のレセプター成分などのＡｃｔＲＩＩＢの生物学的活性とは異なる生物学的活性を有するタンパク質由来であり得る。また、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、他のタンパク質および薬学的薬剤と化学的に連結されるかまたは結合され得る。このような改変は、得られる組成物の薬物動態学および／または体内分布を変更するように設計され得る。
【００５７】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、グリコシル化され得るか、ペグ化され得るかまたは別の非タンパク質ポリマーに連結され得る。例えば、本明細書中に開示されたＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、種々の非タンパク質ポリマー（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に示されるように、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）の一つに連結され得る。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、例えば、その循環半減期を増加させるポリマーへの共有結合によって化学的に改変される。例示的なポリマーおよびポリマーをペプチドに結合させる方法はまた、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号および同第４，６０９，５４６号に示されている。
【００５８】
本発明のＡｃｔＩＩＢ融合ポリペプチドは、変化したグリコシル化パターン（すなわち、本来のまたはネイティブのグリコシル化パターンから変化した）を有するように改変され得る。本明細書中で使用される場合、「変化した」とは、一つ以上の欠失した炭水化物部分を有すること、および／または本来の配列に付加された一つ以上のグリコシル化部位を有することを意味する。本明細書で開示された改変ＡｃｔＲＩＩＢに対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、当該分野で周知のグリコシル化部位コンセンサス配列を含むように変化させることにより達成され得る。炭水化物部分の数を増加させることの別の意味は、グリコシドのアミノ酸残基への化学的カップリングまたは酵素的カップリングによるものである。これらの方法は、ＷＯ ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎら（１９８１）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：２５９〜３０６中に記載される。ＡｃｔＲＩＩＢに存在する任意の炭水化物部分の除去は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２；Ｅｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１およびＴｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載されるように化学的に、または酵素的に達成され得る。
【００５９】
本発明のＡｃｔＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、検出可能標識または機能的標識を用いて標的化され得る。検出可能標識としては、放射標識（例えば、１３１Ｉまたは９９Ｔｃ）が挙げられ、これは、従来の当該分野で公知の化学反応を使用して本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドに結合され得る。標識はまた、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）を含む。標識はさらに、化学成分（例えば、ビオチン）を含み、これは、特異的な同族の検出可能部分（例えば、標識されたビオチン）に結合することによって検出され得る。
【００６０】
当業者は、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１およびアクチビン以外のタンパク質を、検出、測定、および阻害するために使用され得ることを理解する。このようなタンパク質の非限定的な例（例えば、様々な種由来のＧＤＦ−８の配列（オーソロガス）は、本明細書中に記載される。
【００６１】
（ＩＩＩ．核酸、クローニングおよび発現系）
本開示は、本発明の方法に使用され得る可溶性ＡｃｔＲＩＩＢをコードする単離された核酸を提供する。本発明の核酸は、本明細書中に開示される本発明の少なくとも一つのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドに対するコード配列を含む。特定の実施形態において、この核酸は、この配列を含むか、または配列番号４に示される配列に由来する。他の特定の実施形態において、この核酸配列は、配列番号３のアミノ酸約２３〜アミノ酸約１３８のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸約１９〜アミノ酸約１４４のアミノ酸配列をコードするような核酸配列である。
【００６２】
本開示はまた、少なくとも一つの上記本発明の核酸を含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態の構築物を提供する。
【００６３】
本開示はまた、宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、一つ以上の上記構築物を含む。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの任意の一つをコードする核酸が、提供され、それ自体が本発明の一局面であり、コードされる生成物の生成の方法である。コードされたＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの生成は、適切な培養条件下でその核酸を含む発現組換え宿主細胞によって達成され得る。発現後、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、任意の適切な技術を使用して単離され、そして／または精製され、次いで、適切なものとして使用される。発現および精製のための例示的な手順は、実施例３および実施例４に示される。
【００６４】
特定のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびコードする核酸分子および本発明に基づくベクターは、例えば、それらの天然の環境から、実質的に精製された形態または均質な形態で、あるいは、核酸の場合、または必要とする機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子起源を含まないか、もしくは実質的に含まない形態で入手され得、単離され得、そして、または精製され得る。本発明に基づく核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、そして全体的に、または部分的に合成的であり得る。本明細書中に示されるヌクレオチド配列に対する言及は、特定の配列を有するＤＮＡ分子を含み、そして、文脈が他に必要としない限りＴに対してＵが置換した特定の配列を有するＲＮＡ分子を含む。
【００６５】
本発明はまた、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ヌクレオチド長であり、配列番号４に示される核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を包含する。
【００６６】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは、周知である。適した宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、および酵母ならびにバキュロウイルスの系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現について当該分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベイビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞などが挙げられる。一般的な細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成するために適した他の細胞については、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編．１９９９）を参照のこと。本発明と適合性の任意の細胞株は、本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを生成するために使用され得る。
【００６７】
適切なベクターが、選択または構築され得、そのベクターは、適切な調節配列（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な場合、他の配列を含む）を含む。ベクターは、プラスミドまたはウイルス（例えば、ファージ）または適切な場合、ファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。核酸の操作のための多くの公知の技術およびプロトコル（例えば、核酸構築物の調製において、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質分析）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ａｕｓｕｂｅｌら編．１９９２）において詳細に記載される。
【００６８】
従って、本発明のさらなる局面は、本明細書中で開示される核酸を含む宿主細胞である。さらに、本発明は、このような核酸を宿主細胞に導入する工程を包含する方法を提供する。その導入は、任意の適切な技術を利用し得る。真核生物細胞については、適切な技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルスを使用する形質導入（例えば、ワクシニア、または昆虫細胞については、バキュロウイルス）が挙げられ得る。細菌細胞については、適切な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられ得る。
【００６９】
その導入は、続いて、例えば、その核酸の発現に適した条件下で宿主細胞を培養することによって、その核酸からの発現を引き起こすかまたは可能になる。
【００７０】
（ＩＶ．インヒビターを同定するための方法）
本発明のなお別の局面は、筋肉および骨の障害の処置において有用な治療剤を同定する方法を提供する。適切なスクリーニングアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ）は、当該分野で公知である。このようなスクリーニングアッセイにおいて、第１の結合混合物は、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドおよびリガンド（例えば、ＧＤＦ−８、ＢＭＰ−１１、アクチビン）を結合することによって形成される；その第１の結合混合物（Ｍ０）における結合の量が測定される。第２の結合混合物もまた、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、そのリガンド、およびそのスクリーニングされるべき化合物もしくは薬剤を合わせることによって形成され、第２の結合混合物（Ｍ１）における結合の量が、測定される。その第１の混合物および第２の混合物における結合の量は、次いで、例えば、そのＭ１／Ｍ０比を計算することによって比較される。その化合物または薬剤は、第１の結合混合物と比較して、その第２の結合混合物における結合の減少が観察される場合、ＡｃｔＲＩＩＢ媒介性細胞シグナル伝達を阻害し得ると考えられる。結合混合物の処方および最適化は、当該分野の技術水準内であり、このような結合混合物はまた、結合を増強または最適化するために必要な緩衝液および塩を含み得、さらなるコントロールアッセイは、本発明のスクリーニングアッセイにおいて含められ得る。
【００７１】
従って、そのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド−リガンド結合を少なくとも約１０％（すなわち、Ｍ１／Ｍ０＜０．９）、好ましくは、約３０％より大きく減少させることが見いだされた化合物が同定され得、次いで、望ましい場合、実施例５〜１２に記載されるように、他のアッセイ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ結合アッセイ）および他の細胞ベースのアッセイおよびインビボアッセイにおいてＧＤＦ−８活性を阻害する能力について二次的にスクリーニングされる。
【００７２】
（Ｖ．疾患を処置する方法および他の使用）
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは可溶性であり、その融合ポリペプチドを治療剤として適切にする（すなわち、動物（特に、ヒト）における種々の医学的障害を予防、診断または処置するために有用にする）薬物動態特性を有する。特定の実施形態において、そのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの循環半減期は、５日、７日、１０日または１４日を超える。
【００７３】
そのＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、筋肉および／または骨の障害と関連するＧＤＦ−８の１以上の活性を阻害するために使用され得る。ＧＤＦ−８活性の阻害は、Ｔｈｉｅｓら（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ（２００１）１８：２５１−２５９）に記載されるか、または実施例６に例示されるように、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）において測定され得る。
【００７４】
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドによって診断、処置または予防される医学的障害は、筋肉または神経筋の障害；脂肪組織障害（例えば、肥満）；２型糖尿病；損なわれたグルコース耐性；代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）；外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって引き起こされるインスリン耐性；または骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）である。
【００７５】
本開示のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、損傷した筋肉（例えば、心筋、横隔膜など）を修復する治療において使用され得る。例示的な疾患および障害としては、筋肉および神経筋の障害（例えば、筋ジストロフィー（デュシェンヌ筋ジストロフィーを含む））；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋萎縮症；器官萎縮症；フレイルティー；手根管症候群；欝血性閉塞性肺疾患；およびサルコペニア、悪液質および他の筋肉消耗症候群がさらに挙げられる。
【００７６】
本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドによって診断、処置または予防されるべき他の医療障害は、骨の損失に関連する障害であり、骨粗鬆症（特に、若年女性のおよび／または閉経後の女性における骨粗鬆症）；糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症；骨減少症；骨関節炎；および骨粗鬆症に関連する骨折が挙げられる。他の標的代謝骨疾患および標的代謝骨障害としては、慢性的な糖質コルチコイド治療、早発性の性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養欠乏症、および拒食症に起因する低骨量が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、好ましくは、哺乳動物（特に、ヒト）におけるこのような医療障害を予防、診断、または処置するために使用される。
【００７７】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含む組成物は、治療有効量で投与される。一般的には、治療有効量は、被験体の年齢、状態、および性別、ならびに被験体の病状の重篤度に伴って変化し得る。投薬量は、医師によって決定され得、そして必要な場合には、観察された処置効果に合うように調節され得る。一般的には、組成物は、ポリペプチドが、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量、あるいは実施例１０および１１に記載されるような用量で与えられるように投与される。組成物は、ボーラス用量として、この用量後の最も長い期間に対して循環レベルを最大にするように、与えられ得る。連続注射もまた、ボーラス用量後に使用され得る。
【００７８】
本発明の投薬単位ポリペプチドについての仕様は、活性化合物の一義的な特性、および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにこのような活性化合物を配合することに関する当該分野における固有の限定によって指示され、かつ直接的に依存する。
【００７９】
毒性および治療効力は、細胞培養物または実験用動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）およびＥＤ５０（手段の５０％において治療的に有効な用量）の決定）によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指標であり、そしてこれはＬＤ５０／ＥＤ５０比と表され得る。大きな治療指標を示す組成物が、好ましい。
【００８０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のためにある範囲の投薬量を処方することにおいて使用され得る。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がわすかであるか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。この投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与経路に依存して、この範囲内で変化し得る。
【００８１】
治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから見積られ得る。ある用量が、細胞培養で決定したようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する治療上の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルに処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。任意の特定投薬量の効果は、適切なバイオアッセイによってモニタリングされ得る。適切なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、転写ベースのアッセイ、ＧＤＦ＝８結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前脂肪細胞の分化に基づくアッセイ、脂肪細胞におけるグルコース取り込みアッセイに基づくアッセイ、および免疫学的アッセイが挙げられる。
【００８２】
本発明のさらなる局面として、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、インビトロおよびインビボにおいて、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ−１１およびＧＤＦ−８）に属するタンパク質の存在を検出するために使用され得る。これらの
タンパク質の存在またはレベルを病状と関連付けることによって、当業者は、関連する病状を診断し得る。本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドによって診断され得る病状は、上記で示されている。
【００８３】
このような検出方法は、当該分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、放射免疫アッセイ、イムノブロット、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、および他の類似の技術が挙げられる。ポリペプチドは、さらに、タンパク質（例えば、ＧＤＦ−８）を検出するための１以上のこれらの技術を組み込む診断キットで提供され得る。このようなキットは、タンパク質の検出およびキットの使用を補助するための他の成分、包装、指示書、または他の物質を含み得る。
【００８４】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが診断目的を対象とする場合、これらを、例えば、リガンド基（例えば、ビオチン）または検出可能なマーカー基（例えば、蛍光基、放射性同位体、または酵素）で改変することが望まれ得る。所望の場合、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、従来技術を使用して標識され得る。適切な標識としては、蛍光団、発色団、放射活性原子、高電子密度試薬、酵素、および特定の結合相手を有するリガンドが挙げられる。酵素は、代表的には、それらの活性によって検出される。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計で定量可能な青色色素に変換する活性によって、検出され得る。他の適切な結合相手としては、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、および当該分野で公知の多数のレセプター−リガンドの組が挙げられる。他の順列および可能性は、当業者に容易に明らかであり、本発明の範囲内にある等価物と考えられる。
【００８５】
（ＶＩ．薬学的組成物および投与方法）
本発明は、患者に対する投与のために適切な組成物を提供する。組成物は、代表的には、本発明の１以上のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む。本明細書中で使用される場合、句「薬学的に受容可能な賦形剤」とは、薬学的投与に適合する任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張性遅延剤および吸収遅延剤などをいう。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。組成物はまた、補足的治療機能、付加的治療機能、または増強された治療機能を提供する他の活性化合物を含み得る。薬学的組成物はまた、投与のための指示書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【００８６】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。その投与を達成するための方法は、当業者に公知である。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下または経皮であり得る。局所投与または経口投与され得る組成物を得ることもまた可能である。
【００８７】
皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、代表的には、１以上の以下の成分を含む：滅菌希釈剤（例えば、注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩）；および張度調節用の薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調節され得る。このような調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラス製もしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に入れられ得る。
【００８８】
注射に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液または懸濁液、および注射可能な滅菌溶液もしくは懸濁液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＴＭ ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合おいて、組成物は、滅菌されていなければならず、そして注射しやすさが存在する程度まで流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、溶媒、または例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む分散媒、ならびにそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用、分散物の場合において必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、および塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続性吸収は、およそ、組成物中に吸収を遅延させる薬剤（例えば、アルミナモノステアレート（ａｌｍｉｎｕｍ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）およびゼラチン）を含むことによってもたらされ得る。
【００８９】
経口組成物は、一般的には、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル中に封入されるか、または錠剤中に圧縮される。経口治療投与の目的のために、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、賦形剤と共に組み込まれ得、そして錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または類似の天然化合物のいずれかを含む：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ガムトラガカントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、スターチまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギニン酸、ＰｒｉｍｏｇｅｌＴＭ、またはコーンスターチ）；潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓＴＭ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖またはサッカリン）；あるいは香料剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料）。
【００９０】
吸入による投与のために、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００９１】
全身投与もまた、経粘膜手段または経皮手段によってなされ得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの場合、組成物は、ＦｃＲｎレセプター媒介性経路を介して粘膜（例えば、腸、口、および肺）を通して伝達され得る。経粘膜投与は、例えば、ロゼンジ、鼻腔
スプレー、吸入器、または坐薬を通して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、一般的に当該分野で公知のような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに処方される。経粘膜投与または経皮投与のために、浸透されるべきバリアーに適切な浸透物が、処方物中で使用される。このような浸透物は、当該分野で公知であり、例えば、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。
【００９２】
本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、体内からの急速な排泄に対して化合物を保護するキャリア（例えば、徐放性処方物（移植片および微小カプセル化送達系を含む））と共に調製され得る。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、ビニル酢酸エチル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ））が使用され得る。このような処方物の調製方法は、当業者に明らかである。本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【００９３】
投与および投薬量の均一性を簡略化するために、投薬単位形態中に経口組成物または非経口組成物を処方することが有利であり得る。本明細書中で使用される場合、投薬単位形態とは、処置されるべき被験体に対して単一の投薬量として適合された、物理的に別個の単位をいう。各単位は、必要とされる薬学的キャリアに関して所望の治療効果を生じるように計算された、予め決められた量の活性化合物を含む。
【００９４】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、上記の核酸）は、組織内の細胞、器官、また生物体に誘導され得、その結果、コードされるポリペプチドが発現される。この方法は、例えば、個々の組織および器官におけるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの効果を評価することにおいて有用であり得る。特定の実施形態において、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする核酸は、組織特異的発現制御配列（例えば、ミオシンプロモーターまたはデスミンプロモーターのような筋特異的プロモーター配列、筋クレアチンキナーゼエンハンサーのような筋特異的エンハンサーエレメント）に連結される。当業者は、特定のポリヌクレオチド配列が、哺乳動物に全身注射または局所注射され得るウイルスベクターまたはプラスミドベクターに挿入され得ることを認識する。宿主細胞もまた収集され、そしてＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドをコードする核酸が、エキソビボで、その後の再移植のために当該分野で公知の方法を使用して、このような細胞にトランスフェクトされ得る。核酸はまた、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら編、１９９９）に記載されるようなトランスジェニック動物を作製するために、単一の胚細胞にトランスフェクトされ得る。
【００９５】
本明細書は、本明細書中で引用される参考文献（その全体が本明細書中で参考として援用される）の教示を考慮してほぼ完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するように構成されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が、請求された本発明によって包含されること、ならびに本明細書および実施例が、特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神を含んで、例示のみとして考えられることが意図されることを認識する。
【００９６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態および局面を示す。当業者は、本発明の精神または範囲を変えることなく実施され得る多くの改変およびバリエーションを認識する。このような改変およびバリエーションは、本発明の範囲内に包含される。本実施例は、決して本発明を限定しない。
【実施例】
【００９７】
（実施例１：ＧＤＦ−８の精製）
組換えヒトＧＤＦ−８タンパク質（成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチド）を発現する選択された細胞株に由来する馴化培地をｐＨ６．５に酸性化し、８０×５０ｍｍ
ＰＯＲＯＳＴＭ ＨＱ陰イオン交換カラム、直列に、８０×５０ｍｍ ＰＯＲＴＯＳＴＭ ＳＰ陽イオン交換かラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）にアプライした。そのフロースルーを、ｐＨ５．０に調節し、７５×２０ｍｍ ＰＯＲＯＳＴＭ ＳＰ陽イオン交換かラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にアプライし、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されるそのＧＤＦ−８潜在性複合体を含む画分を、プールし、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ２〜３に酸性化し、次いで、０．１ ％ ＴＦＡで２００ｍｌにして、粘度を低くした。そのプールを、次いで、ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ａ ６０×２１．２ｍｍガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を付けた２５０×２１．２ｍｍ Ｃ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）にアプライし、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出して、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。成熟ＧＤＦ−８を含む画分を、凍結乾燥によって濃縮して、アセトニトリルを除去し、２０ｍｌの０．１％ ＴＦＡを添加した。そのサンプルを、次いで、分離を補助するために６０℃に加熱した２５０×１０ｍｍ Ｃ５カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。これを、もはやさらなる分離が達成することができなくなるまで繰り返した。成熟ＧＤＦ−８を含む画分を、次いで、プールし、４０％ アセトニトリルにして、６０×２１．２ガードカラムを付けた６００×２１．２ ＢｉｏＳｅｐＴＭ Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライした。精製成熟ＧＤＦ−８を含む画分およびＧＤＦ−８プロペプチドを含む画分を、別個にプールし、その後の実験における使用のために濃縮した。
【００９８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製成熟ＧＤＦ−８は、非還元条件下で２５ｋＤａで、および還元条件下で１３ｋＤａで、広いバンドとして移動する。還元条件下および非還元条件下では、ＢＭＰ−１１プロペプチドは、約３５ｋＤａで移動した。類似のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールは、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９７）９４：１２４５７−１２４６１）によってマウスＧＤＦ−８について報告され、成熟タンパク質のダイマー性質を反映する。そのＧＤＦ−８プロペプチドは、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３５ｋＤａで移動した。活性な成熟ＢＭＰ−１１二量体は、組換えヒトＢＭＰ−１１を発現する細胞株に由来する馴化培地から同じ様式で精製した。その馴化培地を、１０ｍｌ ＴＡＬＯＮＴＭカラム（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）にロードした。その結合したタンパク質を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０／１Ｍ ＮａＣｌ／５００ｍＭ イミダゾールで溶出した。そのＢＭＰ−１１複合体を含む画分をプールし、１０％ トリフルオロ酢酸でｐＨ３に酸性化した。そのＢＭＰ−１１複合体プールを、２５０×４．６ｍｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ４カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）にアプライし、このカラムを、成熟ＢＭＰ−１１およびＢＭＰ−１１プロペプチドのより良好な分離のために、６０℃に加熱した。ＢＭＰ−１１を、ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出した。ＢＭＰ−１１を含む画分を、凍結乾燥によって濃縮して、アセトニトリルを除去した。
【００９９】
（実施例２：精製組換えヒトＧＤＦ−８の特徴）
５０μｇの各精製成熟ＧＤＦ−８および精製ＧＤＦ−８プロペプチドを混合し、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に透析し、３００×７．８ｍｍ ＢｉｏＳｅｐＴＭ
Ｓ−３０００サイズ排除カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でクロマトグラフィー分離した。その成熟ＧＤＦ−８／プロペプチド複合体の分子量を、同じカラムでクロマトグラフィー分離した分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、溶出時間から決定した。
【０１００】
精製ＧＤＦ−８プロペプチドを、精製成熟ＧＤＦ−８とともに中性ｐＨでインキュベートする場合、その２つのタンパク質は、サイズ排除プロフィールにより示されるように、複合体であるようであった。１２．７分で溶出したその主なタンパク質ピークは、同じカラムでクロマトグラフィー分離した分子量標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から７８ｋＤａの推定分子量を有した。その複合体のサイズは、プロペプチドの２つのモノマーと会合するその成熟ＧＤＦ−８の１つの二量体と、ほぼ一致していた。
【０１０１】
この観察を確認するために、成熟ＧＤＦ−８およびＧＤＦ−８プロペプチドの両方を含む調製物を、１００ｍＭの１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミドヒドロクロリド（ＥＤＣ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）ありまたはなしで、１時間室温でインキュベートし、ＨＣｌでｐＨ２〜３に酸性化し、Ｍｉｃｒｏｎ−１０ Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で、トリシン緩衝化１０％ アクリルアミドを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥのために濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーＴＭブルー染色によって、タンパク質を可視化した。
【０１０２】
（実施例３：ＣＨＯ細胞におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの発現）
全長ヒトＡｃｔＲＩＩＢ ｃＤＮＡを、細胞外ドメイン（そのシグナルペプチドをコードする配列を除く）をＰＣＲクローニングするために使用した。使用したそのプライマーは、ＳｐｅＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）部位に隣接していた。ＰＣＲ増幅後に、このＰＣＲフラグメントを、その発現プラスミドｐＨＴｏｐ−ＨＢＭＬ／ＥＫＦｃのＳｐｅｌ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。そのオープンリーディングフレームは、以下をコードする：ミツバチメチリンリーダー（配列番号３のアミノ酸１〜２１）；ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号３のアミノ酸２３〜１３８）；エンテロキナーゼ切断部位（ＤＤＤＫ、配列番号６）；およびヒトＩｇＧ、Ｆｃフラグメント（配列番号３のアミノ酸１４８〜３７８）。そのＳｐｅＩ部位の挿入の結果として、その配列においてＴｈｒ−２２が付加された。
【０１０３】
その上記ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを発現するように安定にトランスフェクトされたＣＨＯ安定細胞株を、そのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ構築物を含むｐＨＴｏｐ−ＨＢＭＬベクターのＣＨＯ／Ａ２細胞へのリポフェクチントランスフェクションにより得た。トランスフェクトされた細胞を、０．１μＭ メトトレキサート中で選択した。馴化培地のウェスタンブロッティング分析を用いて、最も高い発現クローンを同定した。
【０１０４】
そのｐＨＴｏｐベクターは、ｐＥＤ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０）から、Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１に記載されるように、そのアデノ主要後期プロモーターの大部分を除去し、そのｔｅｔオペレーターの６回反復を挿入することによって、誘導した。
【０１０５】
そのＣＨＯ／Ａ２細胞株を、転写活性化因子、ヘルペスウイルスＶＰ１６転写ドメインに融合されたそのｔｅｔリプレッサーの間に融合タンパク質（Ｇｏｓｓｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：５５４７−５５５１）を安定に組み込むことによって、ＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０）から、誘導した。
【０１０６】
（実施例４：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの精製）
馴化培地から濃縮した原材料を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｆａｓｔ
ＦｌｏｗＴＭ（ＸＫ２６／４．５ｃｍ、２３．８ｍｌ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、サイズ排除クロマトグラフィーによって以下のように決定した場合、９９％純粋にまで精製した。凍結した馴化培地を、３７℃の水浴で融解し、０．２２μｍフィルタを通して濾過した。その濾過した溶液の４部を、１部のプロテインＡローディング緩衝液（０．６５Ｍ Ｎａ２ＳＯ４、２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ ホウ酸、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９．０）と混合し、それを、そのプロテインＡカラムに室温で流した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを、プロテインＡ溶出緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ クエン酸、ｐＨ２．５）を用いて勾配またはｐＨ約４〜５に段階的に上げることによって、そのカラムから溶出し、そのピークを集め、２６％中和緩衝液（０．０５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を添加することによって、ｐＨ７．０に中和した。その画分を、サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、次いで、プールし、４℃で保存した。その精製タンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５脱塩カラム（ＸＫ５０／１３．４ｃｍ、２３６ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって、ＰＢＳへ処方し、次いで、０．２２μｍフィルタを通して濾過し、４℃で保存した。
【０１０７】
（実施例５：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ結合アッセイにおける精製ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１の結合特性）
そのＧＤＦ−８潜在的複合体を、２０モルのＥＺ−ｌｉｎｋＴＭＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，カタログ番号２１２１７）：１モルのＧＤＦ−８複合体の比で、２時間、氷上でビオチン化し、０．５％ ＴＦＡで不活性化し、Ｃ４ Ｊｕｐｉｔｅｒ ２５０×４．６ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）でクロマトグラフィーに供して、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離した。ＴＦＡ／アセトニトリル勾配で溶出したビオチン化成熟ＧＤＦ−８画分をプールし、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡプロテインアッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，カタログ番号２３２３５）により定量した。
【０１０８】
ビオチン化成熟ＢＭＰ−１１を、上記と同じ様式で、ＢＭＰ−１１潜在的複合体から調製した。組換えＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（実施例３および４に記載されるように調製した）を、０．２Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中１μｇ／ｍｌで、９６ウェル平底アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ，カタログ番号３５９０）上に一晩４℃でコーティングした。プレートを、次いで、１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンでブロックし、標準ＥＬＩＳＡプロトコルに従って洗浄した。１００μｌアリコートの種々の濃度のビオチン化ＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１を、そのブロックしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートし、洗浄した。結合したＧＤＦ−８またはＢＭＰ−１１の量を、ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号１３０４７Ｅ）により検出し、次に、ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，カタログ番号５０−７６−０４）を添加した。比色測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒデバイスマイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎＭで行った。
【０１０９】
図１に示されるように、ビオチン化ＧＤＦ−８およびＢＭＰ−１１は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃに結合した（それぞれ、１５ｎｇ／ｍｌおよび４０ｎｇ／ｍｌのＥＤ５０）。
【０１１０】
（実施例６：レポーター遺伝子アッセイにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの阻害活性）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの活性を実証するために、レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を、レポーターベクターＰＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２配列結合ルシフェラーゼを使用して行った。そのＣＡＧＡ配列は、ＴＧＦ誘導性遺伝子ＰＡＩ−１（Ｄｅｎｎｅｒら（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３０９１−３１００）のプロモーター内のＴＧＦ−応答性配列であると以前に報告された。
【０１１１】
１２個のＣＡＧＡボックスを含むレポーターベクターを、基本的なレポータープラスミドＰＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて作成した。そのアデノウイルス主要後期プロモーターに由来するそのＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位（−３５／＋１０）を、そのＢｇｌＩＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した。ＣＡＧＡボックスの１２回反復、ＡＧＣＣＡＧＡＣＡを含むオリゴヌクレオチドをアニールし、そのＸｈｏＩ部位にクローニングした。そのヒト横紋筋肉腫細胞株Ａ２０４（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８２）を、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ストレプトアビジン、１０００μｇ／ｍｌ ペニシリンおよび１０％ ウシ胎仔血清を補充したマッコイ５Ａ培地中、４８ウェルプレートで１６時間培養した。次いで、細胞を、グルタミン、ストレプトアビジン、ペニシリン、および１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含むマッコイ５Ａ培地中、６時間３７℃で、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＦ−８、および種々の濃度のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃありまたはなしで処理した。ルシフェラーゼを、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてその処理細胞において定量した。
【０１１２】
ＡｃｔＲＩＩＢの２つの独立して精製したロットは、上記のレポーター遺伝子アッセイにおいて、０．０７〜０．１ｎＭのＩＣ５０を示した（図２）。
【０１１３】
（実施例７：薬物動態）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの薬物動態（ＰＫ）を、１ｍｇ／ｋｇの用量において、１回の静脈内（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）投与として、Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤマウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）において評価した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（実施例３および４に記載されるように生成および精製した）を、ｉｏｄｏｇｅｎ法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（Ｆｅｒｒａｉｏｌｏら編．１９９２））を用いて放射性標識した。その動物に、上記の用量および血清濃度の非標識ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよび１２５Ｉ標識ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの混合物を与え、血清中の１２５Ｉ放射活性およびその注射した用量の比活性に基づいて決定した。図３は、ＴＣＡ沈澱した数 対 ＩＶまたはＩＰのいずれかで投与したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの時間に基づく血清濃度を示す。ＩＰ注射からの吸収は完全であり、バイオアベイラビリティーは、注射後の最初の１８０時間内で１００％に近かった；その最初の容量分布は、マウス血清容量（５０ｍｌ／ｋｇ）と適合した；ピーク血清濃度は、１１μｇ／ｍｌ（ＩＰ、注射後６時間）および１９．４μｇ／ｍｌ（ＩＶ）であった；最後の排除相の間の半減期は、約５日であった。
【０１１４】
（実施例８：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃのインビボ効果）
ＡｃｔＲＩＩＢが成体マウスにおいて筋肉量を増やすか否かを決定するために、７週齢雌性Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて、インビボ研究を行った。マウスを秤量し、体重に関して、８匹の群へと均一に割り当てた。４週間の研究の間に、各群に、ｒｅｃｅｉｖｅｄ １週間に１回以下の腹腔内注射を与えた：ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（６０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または６０μｇ／ｋｇ）、マウスモノクローナル抗ＧＤＦ−８抗体ＪＡ１６（６０ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳ緩衝液（ビヒクルコントロール）。ＪＡ１６は、ＧＤＦ−８に特異的であり、かつインビボでＧＤＦ−８の筋肉ダウンレギュレート活性を阻害することが別の研究（米国特許出願公開番号２００３０１３８４２２号）で示されているので、この抗体を選択した。動物を、処置期間の前および後に、ｄｅｘａｓｃａｎ分析に供することにより、除脂肪体重における増加について評価した。筋肉重量を、腓腹筋および大腿四頭筋を切り出し、秤量することにより評価した。その子宮周囲脂肪パッドもまた取り出し、秤量した。脾臓および胸腺の重量もまた測定した。
【０１１５】
この研究の結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、ＧＤＦ−８活性をインビボで有意に阻害し、増大した筋肉重量を生じることを示した。理解されるように、ＪＡ１６を投与したマウスは、わずかにより高い体重および骨格筋重量を示し、大腿四頭筋重量における統計学的に有意な（ｐ＝０．０５）増加を有した（表４）。６０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃでの処置は、驚くべきことに、ＪＡ１６抗体と比較して、有意により有効であった。６０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃおよび３ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを投与した群は、コントロールと比較して、それぞれ、約３倍および約２倍の体重増加を有した（表１）。これらの増加は、１回の投薬後に最初に観察された。その大腿四頭筋重量は、絶対重量として、６０ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを投与したマウスにおいて増大した（表３）。その腓腹筋は、絶対重量として、６０ｍｇ／ｋｇ ＪＡ１６および６０ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃを投与したマウスにおいて増大した（表３）。体重の％として、大腿四頭筋重量は、コントロールと比較して、同じ３つの処置群において増大した（表４）。また、体重の％として、その腓腹筋重量は、６０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置したマウスにおいて増大した（表４）。
【０１１６】
【表１】
【０１１７】
【表２】
【０１１８】
【表３】
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
（実施例９：筋量におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの用量依存効果）
成体マウスの筋量におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの効果をさらに研究するために、それに関する研究を、７週齢の雌性Ｃ５７Ｂ６／ＳＣＩＤ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて行った。マウスを秤量し、体重に関して均等に、６匹の４つの群に分配した（６ ＳＣＩＤ、６ Ｃ５７マウス、そして各々６匹の２つのコントロール群）。各群に、１〜４週間の間、６０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＰＢＳ緩衝液（ビヒクルコントロール）の腹腔内注射を毎週与えた。研究の２９日目に、動物を、腓腹筋および大腿四頭筋を解剖し秤量することによって、筋量について評価した。この研究の結果は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、インビトロでＧＤＦ−８活性を有意に阻害し、ビヒクルコントロールと比較した場合、ＡｃｔＲＩＩＢの単回投与後でさえ筋量の増加を生じたことを示した。絶対重量としての大腿四頭筋重量は、Ｃ５７およびＳＣＩＤマウスの両方において２１％〜６０％まで増加した（表５）。同様に、絶対重量としての腓腹筋量は、３１〜５１％まで増加した（表５）。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
（実施例１０：骨梁におけるＧＤＦ−８のインビボでの役割）
ＧＤＦ−８の阻害は、筋量を増加させる。筋活性の増加または体重の増加のいずれかに起因する機械的付加の増加は、骨量および骨密度の増加に関連する。従って、ＧＤＦ−８ノックアウト（ＫＯ）マウスを、骨量および微小構造の変化について評価した。成体マウスの初期評価は、ＫＯマウスの脊椎における骨密度が、それらの野生型同腹仔の骨密度よりもほぼ２倍高かったことを示した。この増加は、単にＧＤＦ−８ ＫＯマウスにおける筋量の増加に起因して期待され得る増加をはるかに上回った。
【０１２３】
高解像度のマイクロ断層撮影画像化（μＣＴ４０、Ｓｃａｎｏ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、成体ＧＤＦ−８野生型（ＷＴ）マウスおよびＫＯマウスの第５腰椎および遠位大腿骨における骨梁容積画分および微小構造、ならびに大腿骨中骨幹での皮質骨の幾何学を評価した。標本を、９〜１０月齢のＧＤＦ−８ ＫＯおよび同腹仔コントロールから得た（各遺伝型および性別の４匹のマウス）。全体の椎体および大腿骨を、１２μｍ解像度でのマイクロコンピュータ断層撮影法を使用して走査した。椎体の骨梁または遠位大腿骨幹端の骨梁（すなわち、二次海綿質）を含む目的の領域を、半自動化輪郭アルゴリズムを使用して同定した。以下のパラメータを、直接３次元評価を使用してコンピューター計算した：骨容積画分（％）、骨梁厚（μｍ）、間隔（μｍ）および数（１／ｍｍ）。さらに、どれほど良好に骨梁ネットワークが連結されているかの指標である結合性密度を、大腿骨の中骨幹領域での皮質骨パラメータ（総面積、骨面積、および皮質厚を含む）と同様に評価した。
【０１２４】
雄性および雌性のどちらのＫＯマウスも、ＷＴ同腹仔と比較して、椎体の海綿質密度の劇的な増加を有した（ｎ＝４、それぞれ＋９３％および＋７０％、ｐ＜０．０００１）。この海綿質密度の増加は、骨梁厚における１４％の増加（ｐ＝０．０３）、骨梁数における３８％の増加（ｐ＝０．０００２）、および骨梁間隔における減少（ｐ＝０．００９）を伴った。構造および密度におけるこれらの変化の複合効果は、雄性ＫＯおよび雌性ＫＯにおいて、それらのＷＴ同腹仔と比較して、それぞれ、３．４倍および１．７倍の結合性の増加を生じた（ｐ＜０．０００１）。さらに、海綿質の石灰化のレベルの大まかな測定は、骨梁の平均ミネラル含量が、コントロールと比較してＫＯマウスで８％高かったことを示した（ｐ＜０．０００１）。この効果は、雌性マウスよりも雄性マウスでより大きいが、高解像度のマイクロコンピュータ断層撮影法によって評価された椎骨海綿質特性が、表６に示されているという最終的な結論に達するにはサンプルサイズが小さすぎるという示唆が存在する。
【０１２５】
脊椎における観察とは対照的に、雄性ＫＯマウスおよび雌性ＫＯマウスは、遠位大腿骨においてＷＴ同腹仔よりも海綿質密度が低かった（ｎ＝４、全体の遺伝子型効果に対してｐ＝０．０５）（表７）。この骨密度における減少は、雄性ＫＯマウスにおいてよりも雌性ＫＯマウスにおいてより明らかであった。ＧＤＦ−８ ＫＯマウスは、そのＷＴ同腹仔と同様の骨梁厚を有していたが、同腹仔コントロールと比較して骨梁はより少なく、骨梁間隔はより広かった。しかし、大腿中骨幹での皮質厚は、雄性ＧＤ−８ ＫＯとその同腹仔コントロールとで類似しており、ＧＤＦ−８雌性マウスではそのＷＴ同腹仔よりも約１０％大きかった（ｎ＝４、ｐ＝０．０４）（表８を参照のこと）。２つの遺伝子型間で、皮質骨面積または骨面積画分における差はなかった。
【０１２６】
【表６】
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
【表８】
【０１２９】
（実施例１１：筋変性障害および骨変性障害の処置）
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドのようなＧＤＦ−８のインヒビターは、増加した筋量で指示された処置に対して有用であり、また、骨粗鬆症の予防および処置に対して有用である。さらに、ＧＤＦ−８の阻害は、骨同化効果が望まれる他の場合（例えば、骨治癒の増強（すなわち、骨折修復、脊椎癒合など））において有用であり得る。本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、疾患の兆候が現れた被験体または確定した筋変性疾患または骨変性疾患を有する被験体を処置するために使用される。
【０１３０】
骨障害（例えば、骨粗鬆総）の処置についてのＡｃｔＲＩＩＢの効力は、十分に確立された骨粗鬆症のモデルを使用して確かめられる。例えば、卵巣切除マウスが、新規の骨粗鬆症薬物処置の効力を試験するために使用されている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（２００１）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１６：１６６５−１６７３；およびＡｎｄｅｒｓｏｎら（２００１）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７０：５２９−５３７）。ヒトと同様に、これらのげっ歯類は、卵巣切除によって、骨（特に、海綿骨）の急速な損失を示す。結果の評価は、骨ミネラル密度、血清および尿中の骨代謝回転の生化学マーカー、骨強度、および組織学／組織形態計測に基づく。
【０１３１】
一研究では、健常な雌性マウスおよび／または免疫易感染性雌性マウスを、１２〜１６週齢で卵巣切除し、そして４〜６週間の間骨を損失させた。この骨損失期間の後、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＩＰ注射）またはビヒクルでの処置を、１〜６ヶ月行った。処置プロトコルは、様々な用量レジメンおよび処置レジメンの試験（例えば、毎日、毎週、または隔週の注射）を伴って変更し得た。処置していない卵巣切除マウス（またはラット）は、インタクトな（すなわち、卵巣切除されていない）年齢の一致するマウスに対して約１０〜３０％の骨密度を失うことが予測される。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置されたマウスが、ビヒクル処置を受けるマウスにおける骨量および骨密度よりも、１０〜５０％大きい骨量および骨密度を有すること、そしてさらに、この骨密度の増加が、特に、海綿骨の皮質骨に対する比がより大きい領域において、骨強度に関連することが予測される。
【０１３２】
別の研究の目的は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが、エストロゲン欠乏症に関連する骨量、微小構造および強度の低下を予防することにおいて有効であることを示すことである。従って、この研究は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ抗体での処置を、骨損失期間後ではなく卵巣切除の直後に開始することを除いて、上記の設計と類似の設計を有する。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃで処置されたマウスが、ビヒクルで処置されたマウスよりも、卵巣切除後の骨量の損失が少ないことが予測される。
【０１３３】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、疾患を予防するため、ならびに／あるいは疾患の重篤度および／または症状を軽減するために使用される。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１日１回の頻度で皮下注射として投与され、そして月に１回のまれに投与されることが予測される。処置期間は、１ヶ月〜数年の範囲であり得る。
【０１３４】
ヒトにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの臨床効力を試験するために、骨量の低い閉経後の女性を、骨密度試験によって同定し、そして処置群にランダム化する。処置群としては、プラシーボ群、および抗体（様々な用量）を与える１〜３つの群が挙げられる。個体を、１〜３年の見通しに従って、骨代謝回転における生化学的マーカーの変化、骨ミネラル密度の変化、および脆弱性骨折の発症を評価する。処置を受けた個体は、ベースラインと比較して遠位大腿における骨ミネラル密度の増加および２〜３０％の腰椎の増加を示し、そして脆弱性骨折の事例が減少することが予測される。骨形成の生化学的マーカーが増加することが予測される。
【０１３５】
ポリペプチドは、単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される。単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される場合、投薬量は、好ましくは、症状の重篤度および疾患の進行度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。適切な有効量は、処置医師によって以下から選択される：１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ。例示的な処置レジメンおよび結果は、表９に要約されている。代替的レジメンとしては、以下が挙げられる：（１）１×ＩＣ５０、または４０μｇ／ｋｇの初期用量および０．５×ＩＣ５０、または２０μｇ／ｋｇ、２週間後；（２）１０×ＩＣ５０初期用量および５×ＩＣ５０、２週間後；あるいは１００×ＩＣ５０および５０×ＩＣ５０、２週間後。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
（実施例１２：代謝障害の処置）
例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドのようなＧＤＦ−８のインヒビターは、代謝障害（例えば、２型糖尿病、グルコース寛容減損、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性、および脂肪組織障害（例えば、肥満症））の処置のために有用である。本発明の方法において、本発明のＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド抗体は、疾患の兆候が現れた被験体または確定した代謝疾患を有する被験体を処置するために使用される。
【０１３８】
代謝障害（例えば、２型糖尿病および／または肥満症）の処置に対するＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの効力は、肥満症、インスリン抵抗性および２型糖尿病（ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ）の十分に確立したマウスモデル、ならびに枯死性黄化を保有する株を使用して行われる。インスリン抵抗性はまた、特定のマウス株（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを含む）の高脂肪摂取または高カロリー摂取によって誘導され得る。ヒトと同様に、これらのげっ歯類は、インスリン抵抗性、高インスリン血症、異脂肪血症、および高血糖症を生じるグルコースホメオスタシスの低下を発症する。結果の評価は、血清のグルコース測定、インスリン測定、および脂質測定に基づく。改善されたインスリン感受性の測定は、インスリン耐性試験およびグルコース耐性試験によって決定され得る。より高感度な技術としては、改善が糖血症制御およびインスリン感受性であることを評価するための、正常血糖性高インスリン性クランプの使用が挙げられる。さらに、このクランプ技術は、改善された糖血症制御における主要なグルコース処理組織（筋肉、脂肪細胞、および肝臓）の役割の定量的評価を可能にする。
【０１３９】
一研究において、配列番号３に記載されるようなＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドでの処置（ＩＰ注射）またはビヒクルでの処置を、１週間〜６ヶ月間行う。この処置プロトコルは、様々な用量および処置レジメン（例えば、毎日、毎週、または隔週の注射）を伴って変更し得る。融合ポリペプチドで処置されたマウスは、プラシーボ処置を受けたマウスと比較して、グルコース取り込みがより大きく、解糖およびグリコーゲン合成が増加し、血清中の遊離の脂肪酸およびトリグリセリドがより少ないことが予測される。
【０１４０】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドはまた、疾患の予防、ならびに／あるいは疾患の重篤度および／または症状を軽減するために使用される。ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドが、１日１回の頻度で皮下注射として投与され、そして１ヶ月に１回のまれな頻度で投与されることが予測される。処置期間は、１ヶ月〜数年間の範囲であり得る。
【０１４１】
ヒトにおけるＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドの臨床効力を試験するために、２型糖尿病に罹患している被験体または２型糖尿病に罹患する危険性のある被験体を同定し、そして処置群に無作為化する。処置群としては、プラシーボ群およびＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチド（様々な用量）を与える１〜３つの群が挙げられる。個体を、１〜３年の見通しに従って、グルコース代謝の変化を評価する。処置を受けた個体が、改善を示すことが予測される。
【０１４２】
ＡｃｔＲＩＩＢ融合ポリペプチドは、単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される。単一の活性化合物としてか、または別の化合物もしくは組成物と組み合わせて投与される場合、その投薬量は、症状の重篤度および疾患の進行度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり得る。適切な有効量は、処置医師によって以下から選択される：１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ。例示的な処置レジメンおよび結果は、表７に要約されている。
【０１４３】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１３８１７９（Ｐ２０１０−１３８１７９Ａ）
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７４４９（Ｐ２０１０−１７４４９）
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【分割の表示】特願２００４−５４８３５２（Ｐ２００４−５４８３５２）の分割
【原出願日】平成１５年１０月２４日（２００３．１０．２４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【分割の表示】特願２００４−５４８３５２（Ｐ２００４−５４８３５２）の分割
【原出願日】平成１５年１０月２４日（２００３．１０．２４）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
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