ＡＤＰの測定方法およびＡＤＰ測定用キット
【課題】本発明の課題は、試料中のＡＤＰを正確に測定する方法およびそれに使用する測定用キットを提供することにある
【解決手段】試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、その作用の際に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、ブランク値が小さく、かつ、検量線の傾きも小さくなり、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定することが可能となる。
【解決手段】試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、その作用の際に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、ブランク値が小さく、かつ、検量線の傾きも小さくなり、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定することが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＡＤＰの測定方法およびＡＤＰ測定用キットに関する。更には、酵素反応によりＡＤＰを中間的または最終的に発生する試料中の特定物質の測定方法および特定物質測定用キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＰの測定方法は、試料中にあらかじめ存在するＡＤＰを測定する方法、酵素反応によりＡＤＰを生成する特定物質を測定する方法等に用いるため、種々の方法が開発されてきている（例えば、特許文献１、特許文献２）。
例えば、試料中のＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸を補酵素としてＮＡＤＨ存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてＮＡＤを生成させ、波長３４０ｎｍの吸光度をもつＮＡＤＨの減少量からＡＤＰを測定する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながらこの方法は、検体中のＡＤＰが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法であるため、測定できるＡＤＰの上限値が試薬中のＮＡＤＨにより制限されたりする場合がある。
また、ＡＤＰの測定方法として、試料中のＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等で作用させ、生成する過酸化水素の量からＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献３）。しかし、この方法は試料中の尿酸、アスコルビン酸等の還元物質や、ビリルビン、ヘモグロビン等の着色物質の影響を受けやすくそれが測定値に影響を及ぼす場合がある。
さらに、試料中のＡＤＰに、マグネシウムイオン存在下でグルコースとＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、次いで、生成するグルコース−６−リン酸をＮＡＤ（Ｐ）存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量から、ＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献２）。この方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量に基づいてＡＤＰを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定することから測定値の信頼性が高く、試料中の還元物質などの影響を受けないという利点を有し、従って、生体試料中のＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができるとされている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平９−２８５２９７号公報
【特許文献２】特開平９−２３４０９８号公報
【特許文献３】特開平５−２４４９９４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８５，７（４−５），３０３−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、ブランク値が小さく、かつ、検量線の傾きを小さくすることにより、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定する方法およびそれに使用する測定用キットを提供することにある。更には、そのような測定方法を利用した、酵素反応によりＡＤＰを中間的または最終的に発生する試料中の特定物質の測定方法およびそれに用いる測定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させ、次いで、生成するＡＤＰに、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を作用させてＡＤＰを正確に測定できるとされている前記の方法を、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いて高濃度の尿素等の特定物質の測定に用いることを検討した。しかし、この前記の方法では、試料中の特定物質が高濃度になったり、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いて測定したりすると、検量線の傾きが極めて大きくなり、特定物質を測定できる濃度範囲が極端に狭くなる問題があり、実用性に問題が発生する場合があることを発見した。さらに、その問題を解決するため種々検討した結果、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を用いて酵素反応をさせる際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させると、意外にもブランク値が減少し、かつ、検量線の傾きが小さくなり、かつ、結果的にＡＤＰや特定物質の測定可能な濃度範囲を広くし、正確に測定できることを見出した。本発明は、かかる経過によりなされたものである。
【０００７】
従って、本発明は、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、その作用の際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させることを特徴とする、ＡＤＰの測定方法に関する。
更に、本発明は、試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生させ、そのＡＤＰを上記の測定方法に付し、そのＡＤＰの量に由来して試料中の特定物質を測定する方法に関する。
更に、本発明は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰ測定用キットに関する。
更に、本発明は、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質測定用キットに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明においては、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を用いて、試料中のＡＤＰあるいは試料中の特定物質の酵素反応により発生するＡＤＰを測定する際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、比較例１、実施例１および実施例２で尿素窒素（ＢＵＮ）を測定したときの吸光度の値である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に用いられる試料としては、ＡＤＰを含む可能性のあるサンプルあるいは酵素反応によりＡＤＰを発生する可能性のあるサンプルであり、好ましくは液体であれば特に限定しないが、血清、血漿、尿等の生体試料、または、それらのモデルサンプルが好ましい。
本発明において、ＡＤＰとは、アデノシン二リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をいう。
【００１１】
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）類とは、例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのいずれかを意味するが、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）反応に用いる補酵素として働くそれらに類似した構造、例えば、リング骨格が同じで補酵素として機能を有することが知られている化合物でもよい。本明細書において、ＮＡＤとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、ＮＡＤＰとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味し、チオＮＡＤとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオＮＡＤＰとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とは、ＮＡＤ（Ｐ）類の対応する還元型であり、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）類がＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）とは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを意味し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、ＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、ＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ、ＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを意味する。
本明細書において、チオＮＡＤ（Ｐ）とは、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰを意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、チオＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）がチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。
【００１２】
本発明においては、下記反応式（本明細書ではこの反応をＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応と記載することもある）のように、ＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）およびＡＭＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生成させ、その生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定する。
【化１】
金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオンなどが好ましい。
【００１３】
本発明において、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するときには、下記反応式のように、グルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させグルコノラクトン−６−リン酸（６−ＧＬ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を発生させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することにより行うことが好ましい。
【化２】
本発明において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する３４０ｎｍ付近、例えば、波長３３０〜３５０ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。
本発明において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する４０５ｎｍ付近、例えば、波長３９０〜４１５ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。本発明においてこのチオＮＡＤ（Ｐ）を用いることは、安価で入手しやすい可視分光光度計を用いて測定できる点、ＡＤＰの測定領域を著しく改善できる点などで好適である。
また、ＡＤＰの測定領域をさらに広くするため、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を共存させてＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を行い、チオＮＡＤ（Ｐ）ＨとＮＡＤ（Ｐ）Ｈを発生させ、生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することによりＡＤＰを測定することが好ましい。
この場合、用いるＮＡＤ（Ｐ）の量は特に限定しないが、検量線の傾きを適度に調整するため、用いるチオＮＡＤ（Ｐ）の量の０．３〜３０倍モル数が好ましく、０．５〜２０倍モル数がさらに好ましい。
【００１４】
本発明において、生成するＡＭＰを測定するときには、例えば、そのＡＭＰにミオアデニル酸デアミナーゼを作用させ、生成するアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類およびα−ケトグルタール酸の存在下、グルタミン酸脱水素酵素を作用させて、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を、例えば、適当な波長、すなわち、上述したＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定するために適当な波長の吸光度の減少により測定することにより、ＡＭＰを測定することができる。
【００１５】
本発明においては、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる際、同時に、下記反応式のように、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を共存させてその試料中のＡＤＰと反応させることに特徴がある。
【化３】
この場合、用いるピルビン酸キナーゼの量は、用いるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの１／２０〜２０倍ＫＵが好ましい。また、ホスホエノールピルビン酸の量は、例えば、測定対象の想定されるＡＤＰの１／２０〜２０倍モル数が好ましく、１／１０〜１０倍モル数が更に好ましく、１／５〜５倍モル数が特に好ましい。
【００１６】
本発明のＡＤＰの測定方法は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰ測定用キットにより、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で実施できる。
このキットの組成は、一つの試薬にまとめてもよいが、試薬の安定性等を考慮したうえで二試薬、例えば、グルコースとホスホエノールピルビン酸とを含む第一試薬、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分およびピルビン酸キナーゼを含む第二試薬とに分けてこれらの成分を含ませることも可能である。試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。このキットにより自動分析装置や可視部測定装置を用いてＡＤＰを測定することができる。
【００１７】
さらに、本発明のＡＤＰの測定方法は、試料中の特定物質を酵素反応に付し中間的または最終的にＡＤＰを発生させ、そのＡＤＰを本発明の測定方法に付し、そのＡＤＰの量を測定して、試料中の特定物質を測定する方法に応用できる。
本発明おいて、特定物質とは、酵素反応によりＡＤＰを発生させうる物質であれば特に限定しないが、尿素、クレアチン、コリン等を例示することができる。
特定物質として尿素を測定するときには、酵素反応として、試料中の尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、尿素を測定することができる。そのウレアアミドリアーゼ反応の反応式を下記に示す。
【化４】
【００１８】
特定物質としてクレアチンを測定するときには、酵素反応として、試料中のクレアチンに試薬としてＡＴＰ、マグネシウムイオンとクレアチンキナーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、クレアチンを測定することができる。そのクレアチンキナーゼ反応の反応式を下記に示す。
【化５】
【００１９】
特定物質としてコリンを測定するときには、酵素反応として、試料中のコリンに試薬由来のＡＴＰ、マグネシウムイオン、コリンキナーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、コリンを測定することができる。
【化６】
【００２０】
このように、本発明の特定物質の測定方法の場合、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分には、一般的に、ＡＴＰをＡＤＰに変換するための酵素、その酵素の基質及びＡＴＰを含むことが一般的である。この場合、ホスホエノールピルビン酸の量は、例えば、ＡＴＰの１／２０〜２０倍モル数が好ましく、１／１０〜１０倍モル数が更に好ましく、１／５〜５倍モル数が特に好ましい。また、本発明の特定物質の測定方法の場合、用いるピルビン酸キナーゼの量は、用いるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの１／２０〜２０倍ＫＵが好ましい。
本発明の特定物質の測定方法は、特定物質を酵素反応によりＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオン、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質測定用キットにより、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で実施できる。
このキットの組成は、一つの試薬にまとめてもよいが、試薬の安定性等を考慮したうえで二試薬に分けてこれらの成分を含ませることも可能である。特定物質として尿素を測定する場合、例えば、第一試薬にグルコース、カリウムイオン、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸を含ませ、第２試薬にマグネシウムイオン、ＮＡＤ（Ｐ）類、ＡＴＰ依存性ヘキソキナーゼ、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼを含ませることができる。試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。自動分析装置や可視部測定装置を用いてこのキットにより特定物質を測定することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１、２および比較例１
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびピルビン酸キナーゼを用いた尿素窒素の測定方法
【００２２】
１．方法
ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた尿素窒素測定系において、ＡＤＰに作用する酵素としてピルビン酸キナーゼ並びにホスホエノールピルビン酸を組成中に含んだ測定系を実施例として示す。
ウレアアミドリアーゼを用いた測定法において、試料中の尿素はウレアアミドリアーゼによりＡＴＰ、炭酸水素イオン、カリウムイオンの存在下により分解反応し、ＡＤＰとアンモニウムイオンを生じる。続いて、発生したＡＤＰはグルコースの存在下で、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの作用により、グルコース−６−リン酸とＡＭＰを生じる。発生したグルコース−６−リン酸はＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素とし、グルコース−６−リン酸脱水素酵素の作用により６−ホスホグルコノラクトンとＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生じる。生じたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を、例えば、波長３４０ｎｍ付近または４０５ｎｍ付近の吸光度の増加量として測定し、試料中の尿素を尿素窒素濃度として測定する。
上記反応において、発生した試料由来のＡＤＰに対してＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを反応させると同時に、ホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼと競合反応させることにより、過剰なＡＤＰをＡＴＰに変換し、適量なＡＤＰ濃度を測定する。
比較例１として、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含まない組成を対照とした。さらに、グルコース−６−リン酸脱水素酵素に対する基質として、ＮＡＤ単独として調製した試薬を実施例１、ＮＡＤとチオＮＡＤを混合し、調製した試薬を実施例２とした。
検量線作成のための試料は尿素窒素とし２００ ｍｇ／ｄＬ となる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。
【００２３】
用いた試薬、および試料は以下の通りである。
実施例１の試薬組成
第一試薬（ｐＨ７．５）：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
１０ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ（アデノシン三リン酸・二ナトリウム）
１０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
０．１％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ７．０）：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
４ｍＭ ＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
２ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
２０ＫＵ／Ｌ ピルビン酸キナーゼ
【００２４】
実施例２の試薬組成
第一試薬（ｐＨ７．５）：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
１０ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ
１０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
０．１％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ７．０）：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
２ｍＭ ＮＡＤ
２ｍＭ チオＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
２ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
２０ＫＵ／Ｌ ピルビン酸キナーゼ
【００２５】
比較例１の試薬組成
第一試薬（ｐＨ７．５）：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
１０ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ
０．１％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ７．０）：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
４ｍＭ ＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
２ＫＵ／Ｌ ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００２６】
測定は以下のように行った。自動分析装置を用い、試料３．０μＬと第一試薬１００μＬとを３７℃、５分間混合した後、第二試薬１００μＬを加え同温度で５分間反応させる。実施例１、および比較例１は発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで測定した。また、実施例２は発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍで測定した。
【００２７】
２．結果
結果を図１に示す。図１の結果から、比較例１において、尿素窒素濃度が２５ｍｇ／ｄＬ以上では測定機器の吸光度上限となり、測定不可能なことが判る。一方、実施例１では尿素窒素濃度が１２５ｍｇ／ｄＬ付近まで吸光度上限とならず、測定可能であることが判る。さらに、実施例２の試薬組成では尿素窒素濃度が２００ｍｇ／ｄＬとなっても吸光度上限を迎えず、測定可能な範囲がさらに広いことが判る。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上に詳細に説明したとおり、本発明においては、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を用いて、試料中のＡＤＰあるいは試料中の特定物質の酵素反応により発生するＡＤＰを測定する際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のＡＤＰの測定方法およびＡＤＰ測定用キットに関する。更には、酵素反応によりＡＤＰを中間的または最終的に発生する試料中の特定物質の測定方法および特定物質測定用キットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＰの測定方法は、試料中にあらかじめ存在するＡＤＰを測定する方法、酵素反応によりＡＤＰを生成する特定物質を測定する方法等に用いるため、種々の方法が開発されてきている（例えば、特許文献１、特許文献２）。
例えば、試料中のＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸を補酵素としてＮＡＤＨ存在下で乳酸脱水素酵素を作用させてＮＡＤを生成させ、波長３４０ｎｍの吸光度をもつＮＡＤＨの減少量からＡＤＰを測定する方法が知られている（非特許文献１）。しかしながらこの方法は、検体中のＡＤＰが多くなるにつれて吸光度が減少する測定方法であるため、測定できるＡＤＰの上限値が試薬中のＮＡＤＨにより制限されたりする場合がある。
また、ＡＤＰの測定方法として、試料中のＡＤＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを作用させ、次いで、生成するピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ等で作用させ、生成する過酸化水素の量からＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献３）。しかし、この方法は試料中の尿酸、アスコルビン酸等の還元物質や、ビリルビン、ヘモグロビン等の着色物質の影響を受けやすくそれが測定値に影響を及ぼす場合がある。
さらに、試料中のＡＤＰに、マグネシウムイオン存在下でグルコースとＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを作用させ、次いで、生成するグルコース−６−リン酸をＮＡＤ（Ｐ）存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素を作用させ、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量から、ＡＤＰを測定する方法が知られている（特許文献２）。この方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量に基づいてＡＤＰを測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定することから測定値の信頼性が高く、試料中の還元物質などの影響を受けないという利点を有し、従って、生体試料中のＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができるとされている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平９−２８５２９７号公報
【特許文献２】特開平９−２３４０９８号公報
【特許文献３】特開平５−２４４９９４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８５，７（４−５），３０３−３１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、ブランク値が小さく、かつ、検量線の傾きを小さくすることにより、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定する方法およびそれに使用する測定用キットを提供することにある。更には、そのような測定方法を利用した、酵素反応によりＡＤＰを中間的または最終的に発生する試料中の特定物質の測定方法およびそれに用いる測定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを発生させ、次いで、生成するＡＤＰに、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を作用させてＡＤＰを正確に測定できるとされている前記の方法を、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いて高濃度の尿素等の特定物質の測定に用いることを検討した。しかし、この前記の方法では、試料中の特定物質が高濃度になったり、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いて測定したりすると、検量線の傾きが極めて大きくなり、特定物質を測定できる濃度範囲が極端に狭くなる問題があり、実用性に問題が発生する場合があることを発見した。さらに、その問題を解決するため種々検討した結果、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ等を用いて酵素反応をさせる際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させると、意外にもブランク値が減少し、かつ、検量線の傾きが小さくなり、かつ、結果的にＡＤＰや特定物質の測定可能な濃度範囲を広くし、正確に測定できることを見出した。本発明は、かかる経過によりなされたものである。
【０００７】
従って、本発明は、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、その作用の際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させることを特徴とする、ＡＤＰの測定方法に関する。
更に、本発明は、試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生させ、そのＡＤＰを上記の測定方法に付し、そのＡＤＰの量に由来して試料中の特定物質を測定する方法に関する。
更に、本発明は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰ測定用キットに関する。
更に、本発明は、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質測定用キットに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明においては、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を用いて、試料中のＡＤＰあるいは試料中の特定物質の酵素反応により発生するＡＤＰを測定する際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、比較例１、実施例１および実施例２で尿素窒素（ＢＵＮ）を測定したときの吸光度の値である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に用いられる試料としては、ＡＤＰを含む可能性のあるサンプルあるいは酵素反応によりＡＤＰを発生する可能性のあるサンプルであり、好ましくは液体であれば特に限定しないが、血清、血漿、尿等の生体試料、または、それらのモデルサンプルが好ましい。
本発明において、ＡＤＰとは、アデノシン二リン酸（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をいう。
【００１１】
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）類とは、例えば、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのいずれかを意味するが、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）反応に用いる補酵素として働くそれらに類似した構造、例えば、リング骨格が同じで補酵素として機能を有することが知られている化合物でもよい。本明細書において、ＮＡＤとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、ＮＡＤＰとはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味し、チオＮＡＤとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを意味し、チオＮＡＤＰとはチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートを意味する。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とは、ＮＡＤ（Ｐ）類の対応する還元型であり、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）類がＮＡＤ、ＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。
本明細書において、ＮＡＤ（Ｐ）とは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを意味し、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、ＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、ＮＡＤ（Ｐ）がＮＡＤ、ＮＡＤＰのときは、それぞれ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨを意味する。
本明細書において、チオＮＡＤ（Ｐ）とは、チオＮＡＤまたはチオＮＡＤＰを意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）Ｈとは、チオＮＡＤ（Ｐ）の対応する還元型を意味し、チオＮＡＤ（Ｐ）がチオＮＡＤ、チオＮＡＤＰのときは、それぞれ、チオＮＡＤＨ、チオＮＡＤＰＨを意味する。
【００１２】
本発明においては、下記反応式（本明細書ではこの反応をＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応と記載することもある）のように、ＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）およびＡＭＰ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を生成させ、その生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定する。
【化１】
金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、マンガンイオンなどが好ましい。
【００１３】
本発明において、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するときには、下記反応式のように、グルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させグルコノラクトン−６−リン酸（６−ＧＬ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を発生させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することにより行うことが好ましい。
【化２】
本発明において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する３４０ｎｍ付近、例えば、波長３３０〜３５０ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。
本発明において、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）類としてチオＮＡＤ（Ｐ）を用いる場合は、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈに由来する４０５ｎｍ付近、例えば、波長３９０〜４１５ｎｍの吸光度の増加量からＡＤＰを測定することができる。本発明においてこのチオＮＡＤ（Ｐ）を用いることは、安価で入手しやすい可視分光光度計を用いて測定できる点、ＡＤＰの測定領域を著しく改善できる点などで好適である。
また、ＡＤＰの測定領域をさらに広くするため、補酵素としてチオＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）を共存させてＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を行い、チオＮＡＤ（Ｐ）ＨとＮＡＤ（Ｐ）Ｈを発生させ、生成したチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することによりＡＤＰを測定することが好ましい。
この場合、用いるＮＡＤ（Ｐ）の量は特に限定しないが、検量線の傾きを適度に調整するため、用いるチオＮＡＤ（Ｐ）の量の０．３〜３０倍モル数が好ましく、０．５〜２０倍モル数がさらに好ましい。
【００１４】
本発明において、生成するＡＭＰを測定するときには、例えば、そのＡＭＰにミオアデニル酸デアミナーゼを作用させ、生成するアンモニアに、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類およびα−ケトグルタール酸の存在下、グルタミン酸脱水素酵素を作用させて、減少するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を、例えば、適当な波長、すなわち、上述したＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定するために適当な波長の吸光度の減少により測定することにより、ＡＭＰを測定することができる。
【００１５】
本発明においては、試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させる際、同時に、下記反応式のように、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）を共存させてその試料中のＡＤＰと反応させることに特徴がある。
【化３】
この場合、用いるピルビン酸キナーゼの量は、用いるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの１／２０〜２０倍ＫＵが好ましい。また、ホスホエノールピルビン酸の量は、例えば、測定対象の想定されるＡＤＰの１／２０〜２０倍モル数が好ましく、１／１０〜１０倍モル数が更に好ましく、１／５〜５倍モル数が特に好ましい。
【００１６】
本発明のＡＤＰの測定方法は、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰ測定用キットにより、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で実施できる。
このキットの組成は、一つの試薬にまとめてもよいが、試薬の安定性等を考慮したうえで二試薬、例えば、グルコースとホスホエノールピルビン酸とを含む第一試薬、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分およびピルビン酸キナーゼを含む第二試薬とに分けてこれらの成分を含ませることも可能である。試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。このキットにより自動分析装置や可視部測定装置を用いてＡＤＰを測定することができる。
【００１７】
さらに、本発明のＡＤＰの測定方法は、試料中の特定物質を酵素反応に付し中間的または最終的にＡＤＰを発生させ、そのＡＤＰを本発明の測定方法に付し、そのＡＤＰの量を測定して、試料中の特定物質を測定する方法に応用できる。
本発明おいて、特定物質とは、酵素反応によりＡＤＰを発生させうる物質であれば特に限定しないが、尿素、クレアチン、コリン等を例示することができる。
特定物質として尿素を測定するときには、酵素反応として、試料中の尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオンとウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、尿素を測定することができる。そのウレアアミドリアーゼ反応の反応式を下記に示す。
【化４】
【００１８】
特定物質としてクレアチンを測定するときには、酵素反応として、試料中のクレアチンに試薬としてＡＴＰ、マグネシウムイオンとクレアチンキナーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、クレアチンを測定することができる。そのクレアチンキナーゼ反応の反応式を下記に示す。
【化５】
【００１９】
特定物質としてコリンを測定するときには、酵素反応として、試料中のコリンに試薬由来のＡＴＰ、マグネシウムイオン、コリンキナーゼを作用させてＡＤＰを中間的に発生させてそのＡＤＰを本発明のＡＤＰの測定方法に付することにより、コリンを測定することができる。
【化６】
【００２０】
このように、本発明の特定物質の測定方法の場合、特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分には、一般的に、ＡＴＰをＡＤＰに変換するための酵素、その酵素の基質及びＡＴＰを含むことが一般的である。この場合、ホスホエノールピルビン酸の量は、例えば、ＡＴＰの１／２０〜２０倍モル数が好ましく、１／１０〜１０倍モル数が更に好ましく、１／５〜５倍モル数が特に好ましい。また、本発明の特定物質の測定方法の場合、用いるピルビン酸キナーゼの量は、用いるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの１／２０〜２０倍ＫＵが好ましい。
本発明の特定物質の測定方法は、特定物質を酵素反応によりＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオン、生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質測定用キットにより、例えば、２０〜４０℃、好ましくは３７℃付近で実施できる。
このキットの組成は、一つの試薬にまとめてもよいが、試薬の安定性等を考慮したうえで二試薬に分けてこれらの成分を含ませることも可能である。特定物質として尿素を測定する場合、例えば、第一試薬にグルコース、カリウムイオン、ＡＴＰ、ホスホエノールピルビン酸を含ませ、第２試薬にマグネシウムイオン、ＮＡＤ（Ｐ）類、ＡＴＰ依存性ヘキソキナーゼ、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼを含ませることができる。試薬には、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。自動分析装置や可視部測定装置を用いてこのキットにより特定物質を測定することができる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１、２および比較例１
ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼおよびピルビン酸キナーゼを用いた尿素窒素の測定方法
【００２２】
１．方法
ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた尿素窒素測定系において、ＡＤＰに作用する酵素としてピルビン酸キナーゼ並びにホスホエノールピルビン酸を組成中に含んだ測定系を実施例として示す。
ウレアアミドリアーゼを用いた測定法において、試料中の尿素はウレアアミドリアーゼによりＡＴＰ、炭酸水素イオン、カリウムイオンの存在下により分解反応し、ＡＤＰとアンモニウムイオンを生じる。続いて、発生したＡＤＰはグルコースの存在下で、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼの作用により、グルコース−６−リン酸とＡＭＰを生じる。発生したグルコース−６−リン酸はＮＡＤ（Ｐ）類を補酵素とし、グルコース−６−リン酸脱水素酵素の作用により６−ホスホグルコノラクトンとＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生じる。生じたＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を、例えば、波長３４０ｎｍ付近または４０５ｎｍ付近の吸光度の増加量として測定し、試料中の尿素を尿素窒素濃度として測定する。
上記反応において、発生した試料由来のＡＤＰに対してＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを反応させると同時に、ホスホエノールピルビン酸の存在下でピルビン酸キナーゼと競合反応させることにより、過剰なＡＤＰをＡＴＰに変換し、適量なＡＤＰ濃度を測定する。
比較例１として、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含まない組成を対照とした。さらに、グルコース−６−リン酸脱水素酵素に対する基質として、ＮＡＤ単独として調製した試薬を実施例１、ＮＡＤとチオＮＡＤを混合し、調製した試薬を実施例２とした。
検量線作成のための試料は尿素窒素とし２００ ｍｇ／ｄＬ となる様に尿素溶液を調製し、各濃度に生理食塩水で適宜希釈した。
【００２３】
用いた試薬、および試料は以下の通りである。
実施例１の試薬組成
第一試薬（ｐＨ７．５）：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
１０ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ（アデノシン三リン酸・二ナトリウム）
１０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
０．１％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ７．０）：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
４ｍＭ ＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
２ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
２０ＫＵ／Ｌ ピルビン酸キナーゼ
【００２４】
実施例２の試薬組成
第一試薬（ｐＨ７．５）：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
１０ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ
１０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
０．１％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ７．０）：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
２ｍＭ ＮＡＤ
２ｍＭ チオＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
２ＫＵ／Ｌ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
２０ＫＵ／Ｌ ピルビン酸キナーゼ
【００２５】
比較例１の試薬組成
第一試薬（ｐＨ７．５）：
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ Ｄ−グルコース
１０ｍＭ 炭酸水素カリウム
１０ｍＭ ＡＴＰ・２Ｎａ
０．１％ 界面活性剤
第二試薬（ｐＨ７．０）：
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ
１０ｍＭ 酢酸マグネシウム・四水和物
４ｍＭ ＮＡＤ
０．１％ 界面活性剤
２ＫＵ／Ｌ ヘキソキナーゼ
２ＫＵ／Ｌ ウレアアミドリアーゼ
２ＫＵ／Ｌ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００２６】
測定は以下のように行った。自動分析装置を用い、試料３．０μＬと第一試薬１００μＬとを３７℃、５分間混合した後、第二試薬１００μＬを加え同温度で５分間反応させる。実施例１、および比較例１は発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により主波長３４０ｎｍ、副波長４０５ｎｍで測定した。また、実施例２は発色反応後の吸光度を当該機種の１ポイントエンド法により主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍで測定した。
【００２７】
２．結果
結果を図１に示す。図１の結果から、比較例１において、尿素窒素濃度が２５ｍｇ／ｄＬ以上では測定機器の吸光度上限となり、測定不可能なことが判る。一方、実施例１では尿素窒素濃度が１２５ｍｇ／ｄＬ付近まで吸光度上限とならず、測定可能であることが判る。さらに、実施例２の試薬組成では尿素窒素濃度が２００ｍｇ／ｄＬとなっても吸光度上限を迎えず、測定可能な範囲がさらに広いことが判る。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
以上に詳細に説明したとおり、本発明においては、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ反応を用いて、試料中のＡＤＰあるいは試料中の特定物質の酵素反応により発生するＡＤＰを測定する際、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼとを共存させることにより、検量線の傾きが小さく、かつ、ブランク値を減少させ、その結果、広範囲のＡＤＰの濃度を正確に測定できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、その作用の際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させることを特徴とする、ＡＤＰの測定方法。
【請求項２】
生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することを、生成するグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させ生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することにより行う、請求項１に記載のＡＤＰの測定方法。
【請求項３】
ＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）とチオＮＡＤ（Ｐ）を共存させて使用し、かつ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類がＮＡＤ（Ｐ）ＨとチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈであり、かつ、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することにより行う、請求項２に記載のＡＤＰの測定方法。
【請求項４】
試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生させ、そのＡＤＰを請求項１から３のいずれかに記載の測定方法に付し、そのＡＤＰの量に由来して試料中の特定物質を測定する方法。
【請求項５】
特定物質が尿素であり、酵素反応が、試料中の尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを中間的または最終的に発生させる、請求項４に記載の特定物質を測定する方法。
【請求項６】
グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰ測定用キット。
【請求項７】
特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質測定用キット。
【請求項１】
試料中のＡＤＰに、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、および金属イオンを作用させて生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することにより、試料中のＡＤＰを測定する方法において、その作用の際、同時に、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを共存させることを特徴とする、ＡＤＰの測定方法。
【請求項２】
生成するグルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定することを、生成するグルコース−６−リン酸に、グルコース−６−リン酸脱水素酵素とＮＡＤ（Ｐ）類を作用させ生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定することにより行う、請求項１に記載のＡＤＰの測定方法。
【請求項３】
ＮＡＤ（Ｐ）類としてＮＡＤ（Ｐ）とチオＮＡＤ（Ｐ）を共存させて使用し、かつ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類がＮＡＤ（Ｐ）ＨとチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈであり、かつ、生成するチオＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の波長４０５ｎｍ付近の吸光度の増加を測定することにより行う、請求項２に記載のＡＤＰの測定方法。
【請求項４】
試料中の特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生させ、そのＡＤＰを請求項１から３のいずれかに記載の測定方法に付し、そのＡＤＰの量に由来して試料中の特定物質を測定する方法。
【請求項５】
特定物質が尿素であり、酵素反応が、試料中の尿素にＡＴＰ、マグネシウムイオン、カリウムイオン、炭酸水素イオン、およびウレアアミドリアーゼを作用させてＡＤＰを中間的または最終的に発生させる、請求項４に記載の特定物質を測定する方法。
【請求項６】
グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、ＡＤＰ測定用キット。
【請求項７】
特定物質を酵素反応に付しＡＤＰを中間的または最終的に発生するための必須成分、グルコース、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、金属イオン、グルコース−６−リン酸またはＡＭＰを測定するための必須成分、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸キナーゼを含む、特定物質測定用キット。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１０３８２５（Ｐ２０１１−１０３８２５Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６３８１１（Ｐ２００９−２６３８１１）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（０００００３９７５）日東紡績株式会社 (251)
【Ｆターム（参考）】
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