ＡＧ０１３７３６を含んでなる剤形
本発明は、式（１）の化合物またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグの剤形を提供する。さらに本発明は、該剤形を哺乳動物へ投与することによって、癌のような異常な細胞増殖を治療する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示がそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６０／４６０，６９５号（２００３年４月３日出願）および米国仮特許出願第６０／４９１，７７１号（２００３年７月３１日出願）の利益を主張する。
【０００２】
背景技術
本発明は、癌のような異常な細胞増殖の哺乳動物における治療に有用であるＶＥＧＦＲ阻害剤に関する。本発明はまた、異常な細胞増殖の哺乳動物、具体的にはヒトにおける治療にこうした化合物を使用する方法と、こうした化合物を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
式１：
【０００４】
【化１】
【０００５】
により表される化合物、６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールは、結腸癌、黒色腫、乳癌および肺癌の異種移植モデルにおいて広汎な前臨床活性のある、ＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼの強力かつ選択的な阻害剤である（Ｈｕ−Ｌｏｗｅ Ｄ，Ｈｅｌｌｅｒ Ｄ，Ｂｒｅｋｋｅｎ Ｊ，Ｆｅｅｌｅｙ Ｒ，Ａｍｕｎｄｓｏｎ Ｋ，Ｈａｉｎｅｓ Ｍ，Ｔｒｏｃｈｅ Ｇ，Ｋｉｍ Ｙ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｄ，Ｈｅｒｒｍａｎ Ｍ，Ｂａｔｕｇｏ Ｍ，Ｖｅｋｉｃｈ Ｓ，Ｋａｎｉａ Ｒ，ＭｃＴｉｇｕｅ Ｍ，Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｓ，Ｂｅｎｄｅｒ Ｓ，Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ Ｄ．，「ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼの低分子阻害剤、ＡＧ０１３７３６の薬理活性（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＡＧ０１３７３６，ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ）」Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２：抄録＃５３５７）。ダイナミック対比増強ＭＲＩ（ｄｃｅＭＲＩ）を使用して評価した前臨床の腫瘍血管応答は、腫瘍増殖指標と対応することを示した（Ｗｉｌｍｅｓ ＬＪ，Ｈｙｌｔｏｎ ＮＭ，Ｗａｎｇ Ｄ，Ｆｌｅｍｉｎｇ ＬＭ，Ｇｉｂｂｓ Ｊ，Ｋｉｍ Ｙ，Ｄｉｌｌｏｎ Ｒ，Ｂｒａｓｃｈ ＲＣ，Ｐａｒｋ ＪＷ，Ｌｉ Ｋ−Ｌ，Ｈｅｎｒｙ ＲＧ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ ＳＣ，Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ ＤＲ，Ｈｕ−Ｌｏｗｅ Ｄ，ＭｃＳｈａｎｅ ＴＭ，およびＰａｌｌａｖｉｃｉｎｉ ＭＧ．，「新規ＶＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、ＡＧ０１３７３６は、ヌードマウス中のヒトＢＴ４７４乳癌異種移植片における腫瘍増殖および血管透過性を抑制する（ＡＧ０１３７３６，ａ Ｎｏｖｅｌ ＶＥＧＦＲ ＴＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＢＴ４７４ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ）」Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３：抄録＃３７７２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要約
本発明は、６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールと体系的に命名可能である、式１：
【０００７】
【化２】
【０００８】
の化合物を使用する剤形と治療の方法を提供する。
１つの態様において、本発明は、哺乳動物への投与用の剤形を提供し、該剤形は、式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を、哺乳動物への投与後に４５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下の式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で含んでなる。２４時間ＡＵＣ血漿値は、本明細書の「詳細な説明」に記載のようにして決定可能である。
【０００９】
この態様の具体的な側面において、２４時間ＡＵＣ血漿値の上限は、４０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または３０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または８００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または７００ｎｇ・時間／ｍＬ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、２４時間ＡＵＣ血漿値は、少なくとも１０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも２５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも５０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも７５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１００ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１２５ｎｇ・時間／ｍＬである。２４時間ＡＵＣ血漿値の想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬ、５０〜２５００ｎｇ・時間／ｍＬ、７５〜１０００ｎｇ・時間／ｍＬ、１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬ、および１２５〜７００ｎｇ・時間／ｍＬが含まれる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、上記に定義される式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を３０ｍｇ以下の量で含んでなる剤形を提供する。化合物の全部または一部が塩、溶媒和物またはプロドラッグとして剤形にあるとき、その量は式１の化合物の同等量であり、それは分子量に基づいて当業者により容易に計算されると理解されたい。
【００１１】
この態様の具体的な側面において、この量の上限は、２０ｍｇ以下または１５ｍｇ以下または１２ｍｇ以下または１０ｍｇ以下または８ｍｇ以下または７ｍｇ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、この量は、少なくとも０．５ｍｇまたは少なくとも１ｍｇまたは少なくとも１．５ｍｇまたは少なくとも２ｍｇまたは少なくとも２．５ｍｇまたは少なくとも３ｍｇである。想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、０．５〜３０ｍｇ、１〜２０ｍｇ、１．５〜１５ｍｇ、２〜１０ｍｇ、２．５〜８ｍｇ、および３〜７ｍｇが含まれる。
【００１２】
さらに本発明は、上記に定義されるような式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を、ヒトが含まれる哺乳動物への投与後に４５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下の式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で哺乳動物へ投与することによって、異常な細胞増殖を哺乳動物において治療する方法を提供する。２４時間ＡＵＣ血漿値は、本明細書の「詳細な説明」に記載のようにして決定可能である。
【００１３】
この態様の具体的な側面において、２４時間ＡＵＣ血漿値の上限は、４０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または３０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または８００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または７００ｎｇ・時間／ｍＬ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、２４時間ＡＵＣ血漿値は、少なくとも１０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも２５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも５０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも７５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１００ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１２５ｎｇ・時間／ｍＬである。２４時間ＡＵＣ血漿値の想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬ、５０〜２５００ｎｇ・時間／ｍＬ、７５〜１０００ｎｇ・時間／ｍＬ、１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬ、および１２５〜７００ｎｇ・時間／ｍＬが含まれる。
【００１４】
さらに本発明は、上記に定義されるような式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を、投薬につき３０ｍｇ以下の量でヒトが含まれる哺乳動物へ投与することによって、異常な細胞増殖を哺乳動物において治療する方法を提供する。化合物の全部または一部が塩、溶媒和物、またはプロドラッグとして剤形にあるとき、その量は式１の化合物の同等量であり、分子量に基づいて当業者により容易に計算されると理解されたい。
【００１５】
この態様の具体的な側面において、この量の上限は、２０ｍｇ以下または１５ｍｇ以下または１２ｍｇ以下または１０ｍｇ以下または８ｍｇ以下または７ｍｇ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、この量は、少なくとも０．５ｍｇまたは少なくとも１ｍｇまたは少なくとも１．５ｍｇまたは少なくとも２ｍｇまたは少なくとも２．５ｍｇまたは少なくとも３ｍｇである。想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、０．５〜３０ｍｇ、１〜２０ｍｇ、１．５〜１５ｍｇ、２〜１０ｍｇ、２．５〜８ｍｇ、および３〜７ｍｇが含まれる。
【００１６】
本明細書に記載される本発明の方法のいずれの具体的な態様においても、異常な細胞増殖は癌であり、限定されないが、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、または１以上の前記癌の組合せが含まれる。前記方法の別の態様において、前記異常な細胞増殖は良性の増殖性疾患であり、限定されないが、乾癬、良性前立腺肥大症、または再狭窄が含まれる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、式１の化合物の療法的に許容される量を哺乳動物へ投与することによって、ＰＤＧＦＲ ＢＢ仲介性の癌細胞遊走を哺乳動物において阻害する方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、式１の化合物の療法的に許容される量を哺乳動物へ投与することによって、ｃ−ＫＩＴ活性を哺乳動物において阻害する方法を提供する。
本明細書に記載する本発明の方法のいずれかのさらに具体的な態様において、本方法は、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、シグナル伝達阻害剤、および抗増殖剤より選択される１以上の物質の量を哺乳動物へ投与することをさらに含み、該量は、前記異常な細胞増殖を治療するのに全体として有効である。そうした物質には、ＰＣＴ公開公報番号：ＷＯ００／３８７１５、ＷＯ００／３８７１６、ＷＯ００／３８７１７、ＷＯ００／３８７１８、ＷＯ００／３８７１９、ＷＯ００／３８７３０、ＷＯ００／３８６６５、ＷＯ／００３７１０７、およびＷＯ００／３８７８６に開示されるものが含まれ、この開示は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
抗腫瘍剤の例には、減数分裂阻害剤、例えば、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンクリスチンのような植物アルカロイド誘導体；コルキン、アロコキン、ハリコンドリン、Ｎ−ベンゾイルトリメチル−メチルエーテルコルヒチン酸、ドラスタチン１０、マイスタンシン、リゾキシン、パクリタキセル（ＴａｘｏｌＴＭ）、ドセタキセル（ＴａｘｏｔｅｒｅＴＭ）、２’−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］グルタラメート（ＴａｘｏｌＴＭ誘導体）のようなタキサン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、テニポシド、メトトレキセート、アザチオプリン、フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲンシタビン）、アドリアマイシン、およびミタマイシン；アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、イプロプラチン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−ザルコシル−Ｌ−ロイシンのエチルエステル（ＡｓａｌｅｙまたはＡｓａｌｅｘ）、１，４−シクロヘキサジン−１，４−ジカルバミン酸、２，５−ビス（１−アジルジニル）−３，６−ジオキソ−、ジエチルエステル（ジアジクォン）、１，４−ビス（メタンスルホニルオキシ）ブタン（ビスルファンまたはロイコスルファン）、クロロゾトシン、クロメゾン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドログラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、マイトマイシンＣ、ヒカンテオネマイトマイシンＣ、ミトゾラミド、１−（２−クロロエチル）−４−（３−クロロプロピル）−ピペラジン二塩酸塩、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンミラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、ビス（３−メシルオキシプロピル）アミン塩酸塩、マイトマイシン、シクロヘキシル−クロロエチルニトロソ尿素、メチルシクロヘキシル−クロロエチルニトロソ尿素、１−（２−クロロエチル）−３−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジニル）−１−ニトロソ尿素、ビス（２−クロロエチル）ニトロソ尿素のようなニトロソ尿素、プロカルバジン、ダカルバジン、メクロロエタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、リン酸エストラムスチンナトリウム、ストルプトゾイン、およびテモゾラミドのようなナイトロジェンマスタード関連化合物；ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、２−［（３−ヒドロキシ−２−ピリノジビル）メチレン］−ヒドラジンカルボチオアミド、デオキシフルオロウリジン、５−ヒドロキシ−２−ホルミルピリジンチオセミカルバゾン、α−２’−デオキシ−６−チオグアノシン、グリシン酸アフィジコリン、５−アザデオキシシチジン、β−チオグアニンデオキシリボシド、シクロシチジン、グアナゾール、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾリミダゾール、クラドリビン、ペントスタチン、チアグアニン、メルカプトプリン、ブレオマイシン、２−シクロデオキシアデノシン、ラルチトレキセドおよびペメトレキセド二ナトリウムのようなチミジン酸シンターゼ阻害剤、クロファラビン、フロクスウリジン、およびフルダラビン；ＤＮＡ／ＲＮＡ代謝拮抗薬、例えば、Ｌ−アラノシン、５−アザシチジン、アシビシン、アミノプテリンとＮ−［２−クロロ−５−［［（２，４−ジアミノ−５−メチル−６−キナゾリニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−５−エチル−６−キナゾリニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−［２−クロロ−４−［［（２，４−ジアミノプテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−アスパラギン酸のようなその誘導体、可溶性ベーカーズ・アンチフォール（Ｂａｋｅｒ’ｓ ａｎｔｉｆｏｌ）、ジクロロアリルローソン、ブレキナー、フトラフール、ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキセート、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸四ナトリウム塩、ピラゾフラン、トリメトレキセート、プリカマイシン、アクチノマイシンＤ、クリプトフィシン、およびクリプトフィシン−５２のような類似体、または、例えば、Ｎ−（５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル）−Ｌ−グルタミン酸のような、ヨーロッパ特許出願番号２３９３６２に開示される好ましい拮抗薬の１つ；増殖因子阻害剤；細胞周期阻害剤；挿入抗生物質、例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン；タンパク質、例えば、インターフェロン；および、抗ホルモン剤、例えばＮｏｌｖａｄｅｘＴＭ（タモキシフェン）のような抗エストロゲン、または例えば、ＣａｓｏｄｅｘＴＭ（４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド）のような抗アンドロゲンが含まれる。こうした併用治療は、治療の個別成分の同時、連続、または分離投薬により達成可能である。
が含まれる。
【００２０】
抗血管新生剤には、ＭＭＰ−２（マトリックス−メタロプロテイナーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ−９（マトリックス−メタロプロテイナーゼ９）阻害剤、およびＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤が含まれる。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ（アレコキシブ）、バルデコキシブ、およびロフェコキシブが含まれる。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、ＷＯ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公開）、ＷＯ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公開）、ヨーロッパ特許出願番号９７３０４９７１．１（１９９７年７月８日出願）、ヨーロッパ特許出願番号９９３０８６１７．２（１９９９年１０月２９日出願）、ＷＯ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公開）、ＷＯ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公開）、ＷＯ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公開）、ＷＯ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公開）、ヨーロッパ特許公開公報６０６，０４６（１９９４年７月１３日公開）、ヨーロッパ特許公開公報９３１，７８８（１９９９年７月２８日公開）、ＷＯ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公開）、ＷＯ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公開）、ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３（１９９８年７月２１日出願）、ヨーロッパ特許出願番号９９３０２２３２．１（１９９９年３月２５日出願）、イギリス特許出願番号９９１２９６．１（１９９９年６月３日出願）、米国仮特許出願番号６０／１４８，４６４（１９９９年８月１２日出願）、米国特許第５，８６３，９４９号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第５，８６１，５１０号（１９９９年１月１９日発行）、およびヨーロッパ特許公開公報７８０，３８６（１９９７年６月２５日公開）に記載され、これらはすべてそのまま参照により本明細書に組み込まれる。好ましいＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９阻害剤は、ＭＭＰ−１を阻害する活性をほとんどまたはまったく有さないものである。より好ましいのは、他のマトリックス−メタロプロテイナーゼ（即ち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）に比較して、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。
【００２１】
ＭＭＰ阻害剤の例には、ＡＧ−３３４０、ＲＯ３２−３５５５、ＲＳ１３−０８３０、および以下のリストに列挙する化合物が含まれる：
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；
３−エクソ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；
４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロブチル）−アミノ］−プロピオン酸；
４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；
３−エクソ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−エンド−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および
３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
および、前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグ。
【００２２】
シグナル伝達阻害剤の例には、ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦ抗体、およびＥＧＦＲ阻害剤である分子のように、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）応答を阻害することができる薬剤；ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤；および、ｅｒｂＢ２受容体へ結合する有機分子または抗体のようなｅｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮＴＭ（米国カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのジェネンテク社）が含まれる。
【００２３】
ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、ＷＯ９８／１４４５１（１９９８年４月９日公開）、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、および米国特許第５，７４７，４９８号（１９９８年５月５日発行）に記載されている。ＥＧＦＲ阻害剤には、限定されないが、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ２２Ｍａｂ（米国ニューヨーク州ニューヨークのイムクローン・システムズ社）、化合物ＺＤ−１８３９（アストラゼネカ）、ＢＩＢＸ−１３８２（ベーリンガーインゲルハイム）、ＭＤＸ−４４７（米国ニュージャージー州アナンデールのＭｅｄａｒｅｘ社）、およびＯＬＸ−１０３（米国ニュージャージー州ホワイトハウス・ステーションのメルク社）、ＶＲＣＴＣ−３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、およびＥＧＦ融合毒素（マサチューセッツ州ホプキントンのセラジェン社）が含まれる。
【００２４】
ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＳＵ−５４１６およびＳＵ−６６６８（米国カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのスジェン社）も、式１の化合物と組合せまたは同時投与可能である。ＶＥＧＦ阻害剤は、例えば、ＷＯ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日公開）、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７（１９９９年５月３日出願）、ＷＯ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日公開）、ＷＯ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日公開）、米国特許第５，８３４，５０４号（１９９８年１１月１０日発行）、ＷＯ９８／５０３５６（１９９８年１１月１２日公開）、米国特許第５，８８３，１１３号（１９９９年３月１６日発行）、米国特許第５，８８６，０２０号（１９９９年３月２３日発行）、米国特許第５，７９２，７８３号（１９９８年８月１１日発行）、ＷＯ９９／１０３４９（１９９９年３月４日公開）、ＷＯ９７／３２８５６（１９９７年９月１２日公開）、ＷＯ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日公開）、ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日公開）、ＷＯ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／１６７５５（１９９９年４月８日公開）、およびＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）に記載されて、これらはすべてそのまま参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの具体的なＶＥＧＦ阻害剤の他の例は、ＩＭ８６２（米国ワシントン州カークランドのＣｙｔｒａｎ社）；抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、ベバシツマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのジェネンテク社）；並びに、Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（コロラド州ボルダー）およびカイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）（カリフォルニア州エメリヴィル）からの合成リボザイム、ａｎｇｉｏｚｙｍｅＴＭである。
【００２５】
ＧＷ−２８２９７４（グラクソ・ウェルカム社）とモノクローナル抗体のＡＲ−２０９（米国テキサス州ウッドランズのＡｒｏｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）および２Ｂ−１（カイロン）のようなＥｒｂＢ２受容体阻害剤は、式１の化合物と組み合わせて投与可能である。こうしたｅｒｂＢ２阻害剤には、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日公開）、ＷＯ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日公開）、ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日公開）、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日発行）、および米国特許第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日発行）に記載されるものが含まれ、このそれぞれは、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用なｅｒｂＢ２受容体阻害剤は、米国仮特許出願番号６０／１１７，３４１（１９９９年１月２７日出願）および米国仮特許出願番号６０／１１７，３４６（１９９９年１月２７日出願）にも記載され、この両方ともそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
使用可能である他の抗増殖剤には、酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの阻害剤と受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦｒの阻害剤が含まれ、以下の米国特許出願に開示されて特許請求される化合物：０９／２２１９４６（１９９８年１２月２８日出願）；０９／４５４０５８（１９９９年１２月２日出願）；０９／５０１１６３（２０００年２月９日出願）；０９／５３９９３０（２０００年３月３１日出願）；０９／２０２７９６（１９９７年５月２２日出願）；０９／３８４３３９（１９９９年８月２６日出願）；および０９／３８３７５５（１９９９年８月２６日出願）と、以下の米国仮特許出願に開示されて特許請求される化合物：６０／１６８２０７（１９９９年１１月３０日出願）；６０／１７０１１９（１９９９年１２月１０日出願）；６０／１７７７１８（２０００年１月２１日出願）；６０／１６８２１７（１９９９年１１月３０日出願）；および６０／２００８３４（２０００年５月１日出願）が含まれる。上記の特許出願および仮特許出願のそれぞれは、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
式１の化合物はまた、異常な細胞増殖または癌を治療するのに有用な他の薬剤と使用可能であり、限定されないが、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体のように抗腫瘍免疫応答を増強することが可能な薬剤と、ＣＴＬＡ４を阻止することが可能な他の薬剤；および、他のファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤のような抗増殖剤が含まれる。本発明において使用可能である具体的なＣＴＬＡ４抗体には、そのまま参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願６０／１１３，６４７（１９９８年１２月２３日出願）に記載されるものが含まれる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、式１の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグと治療有効量のドセタキセルを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、式１の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグと治療有効量のドセタキセルをヒトが含まれる哺乳動物へ投与することによって、異常な細胞増殖を該哺乳動物において治療する方法を提供する。式１の化合物とドセタキセルは、要望どおりに、別々に、または同じ組成物において投与可能であり、同じ投薬スケジュールでも、異なる投薬スケジュールでも投与可能である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
定義
本明細書に使用する「異常な細胞増殖」は、他に述べなければ、正常な調節機序から独立している細胞増殖（例、接触阻害の消失）を意味する。これには：（１）突然変異したチロシンキナーゼを発現すること、または受容体チロシンキナーゼの過剰発現によって増殖する腫瘍細胞（腫瘍）；（２）異常なチロシンキナーゼ活性化が起こる他の増殖性疾患の良性および悪性の細胞；および（４）受容体チロシンキナーゼによって増殖するあらゆる腫瘍の異常増殖が含まれる。
【００３１】
本明細書に使用する用語「治療する」は、他に述べなければ、そうした用語が適用される障害または状態、またはそうした障害または状態の１以上の症状を逆転させること、緩和すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。本明細書に使用する用語「治療」は、他に述べなければ、治療する行為を意味し、「治療する」は直前に定義されている。
【００３２】
本明細書に使用する句「医薬的に許容される塩」には、他に述べなければ、化合物に存在し得る酸性または塩基性基の塩が含まれる。性質が塩基性である化合物は、様々な無機および有機酸と多種多様な塩を形成することが可能である。そうした塩基性化合物の医薬的に許容される酸付加塩を製造するために使用可能である酸は、無毒の酸付加塩、即ち、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシラート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシレート、エストラート、エシレート、エチルコハク酸塩、フマル酸塩、グルセプタート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシラート、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクラート、トシラート、トリエチオダイド、および吉草酸塩のような、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩を形成するものである。
【００３３】
本明細書に使用する用語「プロドラッグ」は、他に述べなければ、投与に続き、何らかの化学的または生理学的プロセスを介して薬物をｉｎ ｖｉｖｏで放出する薬物前駆体である化合物を意味する（例えば、プロドラッグは、生理学的なｐＨへ置かれるとすぐに、所望される薬物形態へ変換される）。
【００３４】
本発明にはまた、天然に通常見出される原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子に１以上の原子が置き換わっている事実を除けば、式１に引用する化合物と同一である、同位体標識化合物が含まれる。本発明の化合物へ取り込み可能である同位体の例には、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、および３６Ｃｌのように、それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、リン、イオウ、フッ素および塩素の同位体が含まれる。上記の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する、本発明の化合物、そのプロドラッグ、前記化合物または前記プロドラッグのの医薬的に許容される塩および溶媒和物は、本発明の範囲内にある。本発明の特定の同位体標識化合物、例えば、３Ｈおよび１４Ｃのような放射活性同位体が取り込まれているものは、薬物および／または基質の組織分布アッセイに有用である。トリチウム化、即ち３Ｈと炭素−１４、即ち１４Ｃの同位体は、その調製の容易さと検出可能性のために特に好ましい。さらに、重水素、即ち２Ｈのようなより重い同位体での置換は、より大きな代謝安定性より生じるある種の療法上の利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加または投与必要量の低下）をもたらすことができるので、ある状況においては好ましい場合がある。一般に、本発明の式１の同位体標識化合物とそのプロドラッグは、非標識化合物について記載した手順を行なうこと、容易に入手可能な同位体標識試薬を非同位体標識試薬に代用することによって製造可能である。
【００３５】
発明の詳細な説明
式１の化合物は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３１，４９１号および６，５３４，５２４号（それぞれ、２００３年３月１１日および２００３年３月１８日発行）に記載されるように製造可能である。ある種の出発材料は、当業者に馴染みの方法に従って製造可能であり、ある種の合成の変更は、当業者に馴染みの方法に従って行ってよい。
【００３６】
式１の化合物は、様々な無機および有機酸と多種多様な異なる塩を形成することが可能である。そうした塩は、哺乳動物への投与について医薬的に許容されなければならないが、実際には、はじめに式１の化合物を反応混合物より医薬的に許容されない塩として単離してから、後者をアルカリ性の試薬での処理によって遊離塩基化合物へ戻し変換して、引き続き、後者の遊離塩基を医薬的に許容される酸付加塩へ変換することがしばしば望ましい。本発明の塩基性化合物の酸付加塩は、水系溶媒の媒体、またはメタノールまたはエタノールのような好適な有機溶液において実質的に同量の選択される鉱酸または有機酸で塩基性化合物を処理することによって容易に製造される。溶媒の慎重な蒸発と同時に、所望される固形の塩を容易に得る。所望される塩は、有機溶媒中の遊離塩基の溶液より、適正な鉱酸または有機酸を溶媒へ加えることによって沈殿させてもよい。
【００３７】
式１の化合物の投与は、該化合物の作用部位への送達を可能にするどの方法によって実施してもよい。これらの方法には、経口ルート、十二指腸内ルート、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内、または注入が含まれる）、局所、および直腸の投与が含まれる。
【００３８】
本化合物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、持続放出製剤、溶液剤、懸濁液剤として経口投与に、無菌の溶液剤、懸濁液剤、または乳剤として非経口注射に、軟膏剤またはクリーム剤として局所投与に、または坐剤として直腸投与に適した形態で提供可能である。本化合物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形であってよい。好ましくは、剤形には、慣用の医薬担体または賦形剤と有効成分としての式１の化合物が含まれる。さらに、剤形には、他の医療または医薬の薬剤、担体、アジュバント、等を含めてよい。
【００３９】
例示の非経口投与型には、無菌の水溶液、例えば水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液中の溶液剤または懸濁液剤が含まれる。そうした剤形は、所望されるならば、好適に緩衝化してよい。
【００４０】
好適な医薬担体には、不活性の希釈剤または充填剤、水、および様々な有機溶媒が含まれる。医薬組成物は、所望されるならば、芳香剤、結合剤、賦形剤、等のような追加成分を含有してよい。このように、経口投与では、クエン酸のような様々な賦形剤を含有する錠剤が、デンプン、アルギン酸、およびある種の複合ケイ酸塩のような様々な崩壊剤と、そしてショ糖、ゼラチン、およびアカシアのような結合剤と一緒に利用可能である。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクのような滑沢剤が錠剤化の目的にしばしば有用である。同様の種類の固形組成物も、軟および硬充填のゼラチンカプセル剤に利用可能である。その好ましい材料には、ラクトースまたは乳糖と、高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水系の懸濁液剤またはエリキシル剤が経口投与に所望されるとき、そのなかの活性化合物は、様々な甘味剤または芳香剤、着色物質または色素と、そして所望されるならば、乳化剤または懸濁剤と、水、エタノール、ポリエチレングリコール、グリセリン、またはこれらの組合せのような希釈剤と一緒に組み合わせてよい。
【００４１】
本発明の剤形の好ましい態様において、剤形は、経口剤形、より好ましくは、錠剤またはカプセル剤である。
本発明の方法の好ましい態様において、式１の化合物は、例えば、本明細書に記載するような経口剤形を使用することのように、経口で投与する。
【００４２】
本方法には、望ましい投与方式を使用して、式１の化合物を投与することが含まれる。１つの具体的な態様において、本化合物は、１日につき１回（毎日、またはＱＤ）、好ましくは１日につき２回（１日２回、またはＢＩＤ）投与するが、より頻繁かまたは頻繁でない投与も本発明の範囲内にある。本化合物は、ヒトが含まれる哺乳動物へ、好ましくは絶食状態（投与の前および後の２時間以内は食物も飲み物もなし）で投与可能である。特に好ましい態様において、投与法はＢＩＤ、絶食である。
【００４３】
式１の化合物の具体的な量で様々な剤形を調製する方法は、当業者に知られているか、または明らかになろう。例えば、「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」マック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルヴェニア州イーストン、第１５版（１９７５）を参照のこと。
【００４４】
ＡＵＣ血漿値は、式１の化合物またはその活性代謝産物の血漿濃度を、様々な時間間隔で液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるように直接測定して、時間曲線に対する血漿濃度下の面積を計算することによって定量可能である。ＡＵＣを計算するのに適した方法は、例えば、台形近似：
【００４５】
【化３】
【００４６】
［ここで、ｎは、データ点の数であり、ｔｉおよびＣｉは、ｉ番目のデータ点の時間および濃度（ｘおよびｙ値）である］を使用することによるように、当該技術分野でよく知られている。２４時間ＡＵＣ値は、投薬スケジュールに従って測定した血漿濃度を正規化することによって定量可能である。濃度標準液の調製用の復元溶液中の安定化剤として、酸性亜硫酸ナトリウムを加える。
【００４７】
式１の化合物は、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、ＣＤＫ複合体、ＣＨＫ１、ＣＳＦ−Ｒ、および／またはＬＣＫに関連したキナーゼ活性の変調および／または阻害に関して有利な特性を有する。
【００４８】
以下の実施例に示すように、式１の化合物は、ＨＵＶＥＣアポトーシスをｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導すること、ＶＥＧＦ仲介性ＡｋｔおよびｅＮＯＳリン酸化をＨＵＶＥＣにおいて阻害すること、ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦＲ−２リン酸化に対して化合物の投与中止後も存続する阻害効果を明示すること、およびマトリックスタンパク質のフィブロネクチンに対するＰＤＧＦ ＢＢ誘発性の癌細胞遊走を阻害することが可能である。式１の化合物は、遊走および浸潤を阻害することによって、ＰＤＧＦＲ推進性の腫瘍進行に抗する活性を有するかもしれない。
【００４９】
式１の化合物はまた、ＴａｘｏｌＴＭ、より好ましくはドセタキセルと組み合わせるとき、腫瘍増殖阻害においてより有効な活性を明示する。いずれかの薬剤単独よりも、同時療法で、より有意な腫瘍退縮を観察した。
【００５０】
さらに本発明は、例えば哺乳動物組織において、式１の化合物を投与することによってプロテインキナーゼ活性を変調させるかまたは阻害する方法へ向けられる。本発明の化合物の、キナーゼの活性のようなプロテインキナーゼ活性のモジュレーターとしての活性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが含まれる、当業者に利用可能な方法のいずれによっても測定可能である。活性測定に適したアッセイの例には、Ｐａｒａｓｔ Ｃ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１６７８８−１６８０１（１９８８）；Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３１３−３２０（１９９５）；ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９７／３４８７６；およびＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９６／１４８４３に記載されるものが含まれる。これらの特性は、例えば、以下の実施例に示す生物学的試験法の１以上を使用することによって評価可能である。
【実施例】
【００５１】
以下に提供する実施例および製法は、本発明の剤形および方法をさらに例示して例証する。本発明の範囲は、以下の実施例の範囲により決して限定されないことを理解されたい。
【００５２】
実施例１
式１の化合物について：（１）いくつかのスケジューリング：１日１回、週末投薬、休日および間欠性の投薬でのｉｎ ｖｉｖｏ効力；（２）異種移植片モデルにおいてドセタキセルと組み合わせたときの効力；（３）内皮細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化；（４）細胞培養およびｉｎ ｖｉｖｏでの酸化窒素および関連産物の濃度；および（５）全血液細胞中のｃ−Ｋｉｔシグナルの、化合物の潜在バイオマーカーとしての使用を試験した。
【００５３】
生物学的試験；酵素アッセイ
ＶＥＦＧ、ＦＧＦ、その他のような増殖因子による細胞増殖の刺激は、そのそれぞれの受容体のチロシンキナーゼがそれぞれを自己リン酸化することの誘導に依存する。故に、これらの増殖因子によって誘導される細胞の増殖を妨げるプロテインキナーゼ阻害剤の能力は、受容体の自己リン酸化を妨げるその能力と直接的に相関する。化合物のプロテインキナーゼ阻害を測定するために、以下の構築体を設計した。
【００５４】
アッセイ用のＶＥＧＦ−Ｒ２構築体：この構築体は、チロシンキナーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を決定する。キナーゼ挿入ドメインの６８残基の中央５０残基を欠く、ヒト血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）のサイトゾルドメインの構築体（ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０）をバキュロウイルス／昆虫細胞系において発現させた。全長ＶＥＧＦ−Ｒ２の１３５６残基のうち、ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０は、残基８０６〜９３９および９９０〜１１７１と、キナーゼ挿入ドメイン内に、野生型ＶＥＧＦ−Ｒ２に対する１つの点突然変異（Ｅ９９０Ｖ）も含有する。この精製構築体の自己リン酸化を、５％グリセロールおよび５ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中３ｍＭ ＡＴＰおよび４０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、４μＭの濃度の酵素の４℃で２時間のインキュベーションにより実施した。自己リン酸化の後で、この構築体は、野生型の自己リン酸化キナーゼドメイン構築体に本質的に同等な触媒活性を保有することが示された。Ｐａｒａｓｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１６７８８−１６８０１（１９９８）を参照のこと。
【００５５】
アッセイ用のＦＧＦ−Ｒ１構築体：バキュロウイルスベクター発現系を使用して、ヒトＦＧＦ−Ｒ１の細胞内キナーゼドメインを、Ｍｏｈａｍｍａｄｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，９７７−９８９（１９９６）の残基番号付けシステムによる、内因性メチオニン残基４５６から出発してグルタミン酸７６６まで発現させた。さらに、この構築体はまた、以下の３つのアミノ酸置換を有する：Ｌ４５７Ｖ、Ｃ４８８Ａ、およびＣ５８４Ｓ。
【００５６】
アッセイ用のＬＣＫ構築体：昆虫細胞において、アミノ酸残基２２３から出発して残基５０９でのタンパク質の終わりまでのＮ−末端欠損体（以下の２つのアミノ酸置換がＮ末端にある：Ｐ２３３ＭおよびＣ２２４Ｄ）としてＬＣＫチロシンキナーゼを発現させた。
【００５７】
アッセイ用のＣＨＫ−１構築体：バキュロウイルス／昆虫細胞系を使用して、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き全長ヒトＣＨＫ−１（ＦＬ−ＣＨＫ−１）を発現させた。これは、４７６アミノ酸のヒトＣＨＫ−１のＣ末端に６つのヒスチジン残基（６ｘＨｉｓ−タグ）を含有する。このタンパク質を慣用のクロマトグラフィー技術によって精製した。
【００５８】
アッセイ用ＣＤＫ２／サイクリンＡ構築体：バキュロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞より、公知の方法論（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０，１３１７−１３１９（１９９３））を使用して、ＣＤＫ２を精製した。サイクリンＡは、全長組換えサイクリンＡを発現する大腸菌細胞より精製し、先端切断サイクリンＡ構築体は、限定したタンパク分解によって産生し、既報（Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３１３−３２０（１９９５））に記載のように精製した。
【００５９】
アッセイ用ＣＤＫ４／サイクリンＤ構築体：対応するバキュロウイルス発現ベクターで同時感染させた昆虫細胞より、従来の生化学のクロマトグラフィー技術を使用して、ヒトＣＤＫ４およびサイクリンＤ３の複合体、またはサイクリンＤ１とヒトＣＤＫ４およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−ＣＤＫ４）の融合タンパク質の複合体を精製した。
【００６０】
ＶＥＧＦ−Ｒ２アッセイ：共役分光測定（ＦＬＶＫ−Ｐ）アッセイ
ホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからの産生を、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を有する系を使用する、ＮＡＤＨの酸化へ共役した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５０分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ｅ３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少を追跡することによってＮＡＤＨの酸化をモニタリングした。リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（以下の表においてＦＬＶＫ−Ｐとして示す）のアッセイ条件は、以下の通りであった：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；５０ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；２０ユニットのＰＫ／ｍＬ；５ｍＭ ＤＴＴ；５．１ｍＭ ポリ（Ｅ４Ｙ１）；１ｍＭ ＡＴＰ；および２５ｍＭ ＭｇＣｌ２。非リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（表においてＦＬＶＫとして示す）のアッセイ条件は、以下の通りであった：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；５０ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；２０ユニットのＰＫ／ｍＬ；５ｍＭ ＤＴＴ；２０ｍＭ ポリ（Ｅ４Ｙ１）；３ｍＭ ＡＴＰ；および６０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。５〜４０ｎＭの酵素でアッセイを開始した。様々な濃度の試験化合物の存在下に酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
【００６１】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ビオチニル化ガストリンペプチド（１−１７）を基質として使用して、ホスホガストリンの形成をモニタリングした。ストレプタビジン被覆９６ウェルマイクロタイタープレートを使用してビオチニル化ホスホガストリンを固定化して、西洋ワサビペルオキシダーゼへ共役した抗ホスホチロシン抗体を使用する検出を続けた。２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンザチアゾリンスルホネート（６）］ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼの活性をモニタリングした。典型的なアッセイ溶液は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中２μＭビオチニル化ガストリンペプチド；５ｍＭ ＤＴＴ；２０μＭ ＡＴＰ；２６ｍＭ ＭｇＣｌ２；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２を含有した。０．８ｎＭのリン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２△５０でアッセイを開始した。西洋ワサビペルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳ，１０ｍＭを使用してアッセイした。酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加により西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を失活させ、４０５ｎｍでの吸光度読取りを続けた。様々な濃度の試験化合物の存在下に酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
【００６２】
ＦＧＦ−Ｒアッセイ：ＶＥＧＦ−Ｒ２についての上記の記載のように分光測定アッセイを行なったが、但し、濃度を以下のように変更した：ＦＧＦ−Ｒ＝５０ｎＭ，ＡＴＰ＝２ｍＭ，およびポリ（Ｅ４Ｙ１）＝１５ｍＭ。
【００６３】
ＬＣＫアッセイ：ＶＥＧＦ−Ｒ２についての上記の記載のように分光測定アッセイを行なったが、但し、濃度を以下のように変更した：ＬＣＫ＝６０ｎＭ，ＭｇＣｌ２＝０ｍＭ，ポリ（Ｅ４Ｙ１）＝２０ｍＭ。
【００６４】
ＣＨＫ−１アッセイ：合成基質ペプチドのＳｙｎｔｉｄｅ−２（ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ）へのホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからの産生を、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）を使用する、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の作用を介したＮＡＤＨの酸化へ共役した。ＮＡＤＨの酸化は、ＨＰ８４５２分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ε３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少を追跡することによってモニタリングした。典型的な反応溶液は：５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）中４ｍＮ ＰＥＰ；０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ；２８ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；１６ユニットのＰＫ／ｍＬ；３ｍＭ ＤＴＴ；０．１２５ｍＭ Ｓｙｎｔｉｄｅ−２；０．１５ｍＭ ＡＴＰ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；および４００ｍＬ ＮａＣｌを含有した。１０ｎＭのＦＬ−ＣＨＫ−１でアッセイを開始した。様々な濃度の試験化合物の存在下に初期酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
【００６５】
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ：このアッセイは、ヒト臍静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）の増殖因子刺激増殖を阻害する試験化合物の能力を決定する。ＨＵＶＥＣ細胞（継代数３〜４、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）をＴ７５フラスコ中のＥＧＭ２培養基（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）へ融かした。２４時間後、このフラスコへ新鮮なＥＧＭ２培地を加えた。４〜５日後、細胞を別の培養基（１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、６０μｇ／ｍＬの内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）、および１０μｇ／ｍＬ ヘパリンを補充したＦ１２Ｋ培地）へ曝露した。その後の実験では、指数増殖期のＨＵＶＥＣ細胞を使用した。１０，０００〜１２，０００個のＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェル・ディッシュにおいて１００μｌの濃縮培養基（上記に記載）においてプレート培養した。この細胞を、この培地において２４時間付着させた。次いで、培地を吸引により除去し、１１５μｌの飢餓培地（Ｆ１２Ｋ＋１％ ＦＢＳ）を各ウェルへ加えた。１８時間後、飢餓培地中１％ ＤＭＳＯに溶かした１５μｌの試験薬剤かまたはこの担体単独をそれぞれの処理ウェルへ加えた；最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。１時間後、飢餓培地中２０μｌの１５０ｎｇ／ｍＬ ｈｒＶＥＧＦ１６５を、未処理対照を含有するウェルを除くすべてのウェルへ加えた；最終ＶＥＧＦ濃度は２０ｎｇ／ｍＬであった。７２時間後にＭＴＴ色素低下により細胞の増殖を定量したが、この時点で細胞をＭＴＴ（プロメガ社）へ４〜５時間曝露した。停止溶液（プロメガ社）の添加により色素低下を止め、５７０および６３０ｎｍでの吸光度を９６ウェル分光光度計プレートリーダーで決定した。
【００６６】
癌細胞増殖（ＭＶ５２２）アッセイ：プロテインキナーゼ阻害剤が癌を治療するために血管新生を妨げる治療有用性を有するかどうかを決定するには、この阻害剤がキナーゼ受容体を発現しない細胞においては細胞増殖を非特異的に妨げないことを実証することが重要である。癌細胞を使用する増殖アッセイを実施することによってこのことを行う。癌細胞における細胞増殖を評価するためのプロトコールは、ＨＵＶＥＣ細胞における評価について使用するものと同様である。２０００個の肺癌細胞（ＭＶ５２２系、ＵＣＳＤより獲得した）を増殖培地（２ｍＭグルタミンおよび１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）にまいた。試験薬剤および／または担体の添加に先立って、細胞を１日間付着させる。ＨＵＶＥＣアッセイに使用するのと同じ試験薬剤で細胞を同時に処理する。試験薬剤への曝露の７２時間後に、ＭＴＴ色素低下アッセイによって細胞増殖を定量する。
【００６７】
Ｃ−Ｋｉｔ効力決定：阻害剤によるｃ−Ｋｉｔに抗する効力を決定するためにＮＣＩ−Ｈ５２６（ＡＴＣＣ）細胞を使用した。この細胞を亜集密まで増殖させて、飢餓培地において１８時間インキュベートした。阻害剤を加え、細胞を２．３％アルブミンおよび１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（シグマ）の存在下に３７℃で４５分間インキュベートした。この培養物へＳＣＦ、ｃ−Ｋｉｔ増殖因子を５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。５分後、この細胞を冷ＰＢＳで２回濯ぎ、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１％ ＮＰ４０，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解させた。各溶解液より１ｍｇの総タンパク質を使用し、４μｇ／ｍｌ ＣＤ１１７ ａｂ−３（Ｋ４５，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）とともに４℃で一晩インキュベートして、免疫沈降を実施した。翌朝、この抗体複合体をプロテインＡビーズへコンジュゲートした。リン酸化受容体用の抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または抗ｃ−Ｋｉｔ受容体抗体ｓｃ−１４９３（Ｃ−１４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を１：１０００で使用して、ＳＤＳ ＰＡＧＥとウェスタン・ブロット分析を実施した。化学発光試薬のＥＣＬ Ｐｌｕｓによってブロットを可視化した。ブロット中のシグナルの定量にｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ ８４６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用した。
【００６８】
動物および哺乳動物の全末梢血細胞中のｃ−ｋｉｔ陽性細胞集団の低下を式１の化合物の活性のバイオマーカーとして使用した。
ＥＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化測定：阻害剤によるｅＮＯＳおよびＡｋｔに抗する効力を決定するためにＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を使用した。この細胞を亜集密まで増殖させて、飢餓培地において１８時間インキュベートした。阻害剤を加え、細胞を２．３％アルブミンおよび１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（シグマ）の存在下に３７℃で４５分間インキュベートした。この培養基へＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍｌで加えた。５分後、この細胞を冷ＰＢＳで２回濯ぎ、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１％ ＮＰ４０，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解させた。３０〜４０μｇの総タンパク質をウェスタン法によって分析した。ｅＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化は：Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ １１７７）＃９５７１またはＰｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）＃９２７１の抗体（いずれもＣｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇより）を使用することによって評価した。タンパク質の検出は、ＮＯＳ３（Ｃ−２０）ｓｃ−６５４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはＡｋｔ 抗体＃９２７２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって達成した。いずれも、１：３０００で使用する抗ウサギＨＲＰ連結二次抗体を必要とする。化学発光基質のＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ（ピアス）によってブロットを可視化した。ブロット中のシグナルの定量にＡｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ ８８００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈより）を使用した。
【００６９】
マウスＰＫアッセイ：薬物のマウスにおける薬物動態（例、吸収と消失）について、以下の実験を使用して解析した。試験化合物は、０．５％ ＣＭＣ担体中の懸濁液剤として、または３０：７０（ＰＥＧ４００：酸性化Ｈ２Ｏ）担体中の溶液剤として製剤化した。この懸濁液剤または溶液剤をＣ３Ｈ雌性マウス（ｎ＝４）へ経口（ｐ．ｏ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。０時間（投薬前）、投薬後０．５時間、１．０時間、２．０時間、および４．０時間の時点で眼窩出血により血液試料を採取した。各試料より、２５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって血漿を入手した。この血漿より有機タンパク質沈殿法によって試験化合物を抽出した。各時点の出血につき、５０μＬの血漿を１．０ｍＬのアセトニトリルと合わせ、２分間激しく振り混ぜてから、４０００ｒｐｍで１５分間スピンしてタンパク質を沈殿させ、試験化合物を抽出した。次いで、アセトニトリル上清（試験化合物を含有する抽出物）を新しい試験管へ注ぎ、Ｎ２ガスの蒸気下にホットプレート（２５℃）で蒸発させた。乾燥した試験化合物の抽出物を含有するそれぞれの試験管へ１２５μＬの移動相（６０：４０，０．０２５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＋２．５ｍＬ／Ｌ ＴＥＡ：アセトニトリル）を加えた。激しく撹拌することによって、試験化合物をこの移動相に再懸濁させ、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりさらにタンパク質を除去した。ＵＶ検出付きヒューレット・パッカード１１００シリーズＨＰＬＣでの試験化合物分析のために各試料をＨＰＬＣバイアルへ注いだ。各試料より９５μＬをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ｐｒｏｄｉｇｙ逆相Ｃ−１８，１５０ｘ３．２ｍｍカラムへ注入し、１０分にわたる４５〜５０％アセトニトリル勾配ランで溶出させた。上記のやり方で血漿試料より抽出した試験化合物の既知濃度を使用して、標準曲線（ピーク面積ｘ濃度μｇ／ｍＬ）との比較により、試験化合物の血漿濃度（μｇ／ｍＬ）を決定した。標準品と未知検体と一緒に、３群（ｎ＝４）の品質コントロール（０．２５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、および７．５μｇ／ｍＬ）を実施して、分析の一貫性を保証した。標準曲線はＲ２＞０．９９を有し、品質コントロールは、いずれもその予測値の１０％範囲内にあった。定量した試験試料を、Ｋａｌｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用する可視ディスプレイのためにプロットし、ＷＩＮ ＮＯＮＬＩＮソフトウェアを使用して、その薬物動態パラメータを決定した。
【００７０】
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）アッセイ：ヒト肝ミクロソームにおける化合物の代謝について、以下のようなＬＳ−ＭＳ分析アッセイ手順によって測定した。はじめに、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）を融かし、冷１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ４）緩衝液で５ｍｇ／ｍＬへ希釈した。適正量のＫＰＯ４緩衝液、ＮＡＤＰＨ再生溶液（Ｂ−ＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびＭｇＣｌ２を含有する）、およびＨＬＭを１３ｘ１００ｍｍのガラス試験管において３７℃で１０分間プレインキュベートした（試験化合物につき３つの試験管；同一３検体）。試験化合物（最終５μＭ）を各試験管へ加えて反応を開始させ、穏やかに振り混ぜて混合した後で、３７℃でインキュベートした。ｔ＝０および２時間で、各インキュベーション試験管より２５０μＬの試料を取り出し、１ｍＬの氷冷アセトニトリル（＋０．０５μＭレセルピン）を含有する分離用１２ｘ７５ｍｍガラス試験管へ移した。試料を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、タンパク質と塩を沈殿させた（ベックマン Ａｌｌｅｇｒａ ６ＫＲ，Ｓ／Ｎ ＡＬＫ９８Ｄ０６，＃６３４）。上清を新しい１２ｘ７５ｍｍガラス試験管へ移し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ遠心分離真空エバポレーターにより蒸発させた。２００μＬの０．１％ギ酸／アセトニトリル（９０／１０）中で試料を復元し、激しく撹拌して溶かした。次いで、この試料を分離用ポリプロピレンミクロ遠心分離管へ移し、１４０００ｘｇで１０分間遠心分離した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｍｉｃｒｏ １４，Ｓ／Ｎ Ｍ００１７５８０）。各時点（０および２時間）での各同一３検体（＃１〜３）について、各試験化合物のアリコート試料を、以下に記載するＬＣ−ＭＳ分析用の単回ＨＰＬＣバイアルインサート（全部で６つの試料）へ合わせた。
【００７１】
合わせた化合物試料を、ヒューレット・パッカード ＨＰ１１００ ダイオードアレイＨＰＬＣとポジティブエレクトロスプレーＳＩＲモードで作動するＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ三連四重極型質量分析計からなる（各試験化合物の分子イオンを特異的に走査するようにプログラムされている）、ＬＣ−ＭＳシステムへ注入した。各試験化合物のピークを各時点で積分した。各化合物について、各時点でのピーク面積（ｎ＝３）を平均化して、この２時間での平均ピーク面積を０時間の時点での平均ピーク面積で割って、２時間で残存する試験化合物のパーセントを得た。
【００７２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＵＶＥＣアポトーシスアッセイ
ＥＬＩＳＡによるアポトーシスの定量：細胞溶解液中の細胞質ヒストン会合ＤＮＡ断片を定量するＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｌｉｓａ ＰＬＵＳ（カタログ番号：１７７５４２５，ロッシュ・バイオケミカルズ、マンハイム、ドイツ）を使用して、ＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを測定した。製造業者の手引きに若干の変更を加えて、この手順を実施した。簡潔に言えば、飢餓状態のＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下に様々な濃度の化合物Ａで処理した。この細胞のサイトゾル分画を様々な時点で採取し、マイクロタイタープレートへコートした一次抗ヒストンｍＡｂとペルオキシダーゼへ結合した二次抗ＤＮＡ ｍＡｂを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにおける抗原の供給源として使用した。発色性ペルオキシダーゼ基質を加えて、分光光度計で４０５ｎｍでの吸光度（基準波長：４９０ｎｍ）を測定することによって、アポトーシス細胞の数を定量した。
【００７３】
ＴＵＮＥＬによるアポトーシスの可視化：ＴｄＴ仲介性ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）技術を使用して、アポトーシス細胞のｉｎ ｓｉｔｕ検出を行った。簡潔に言えば、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバ・スライドにおいて増殖させたＨＵＶＥＣ細胞をＯ／Ｎ飢餓させてから、様々な濃度の化合物Ａで６時間処理した。次いで、製造業者の手引きに従って、この細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定して、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にして、ターミナルトランスフェラーゼとフルオレセイン−ｄＵＴＰ（Ｄｅａｄｅｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ系、プロメガ、カタログ番号 Ｇ３２５０）が含まれるヌクレオチドの混合物において１時間インキュベートした。この細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で対比染色した。陽性染色されたフルオレセインおよびＰＩ標識細胞を可視化して、蛍光顕微鏡によって写真撮影した。
【００７４】
ＰＤＧＦ仲介性細胞遊走アッセイ：このアッセイには、Ｕ８７ＭＧ細胞を使用した。６ウェルプレートを０．５ｎｇ／ｍＬ フィブロネクチンとともに一晩プレインキュベートする。翌日、Ｕ８７ＭＧ細胞を各ウェルにおいてプレート培養して、集密まで増殖させる。この細胞を、０．１％ ＦＢＳを含有する飢餓培地とともに一晩インキュベートした。ピペット先端を使用して約１ｃｍのスクラッチをつくり、細胞を飢餓培地で洗浄した。次いで、プレートを０．５ｎｇ／ｍＬ フィブロネクチンとともに１時間インキュベートしてから、再び洗浄した。１００ｎｇ／ＬＩ ｒｈＰＤＧＦ ＢＢと化合物Ａを飢餓培地中に含有する実験培地を導入した。０時間と１５時間の間で細胞を写真撮影して、遊走を可視化した。
【００７５】
細胞ＶＥＧＦＲ−２および下流分子リン酸化アッセイ：ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を亜集密まで培養して、飢餓培地（Ｆ１２Ｋ＋０．１％ ＦＢＳ）において１８時間インキュベートした。この細胞へ２．３％アルブミンおよび１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（シグマ）の存在下に化合物Ａを加えた。４５分後、この培養物へＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。５分後、この細胞を冷ＰＢＳで濯ぎ、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１％ ＮＰ４０，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解させた。溶解液由来の１ミリグラムの総タンパク質を、抗Ｆｌｋ−１ Ｃ−１１５８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して免疫沈殿させた。この抗体複合体をプロテインＡビーズへコンジュゲートして、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウェスタン分析を実施した。抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と抗Ｆｌｋ−１ Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）によって、それぞれリン酸化ＶＥＧＦＲ−２とそのタンパク質を検出した。ｅＮＯＳおよびＡｋｔについては、細胞を上記と同じように処理した。全量３０〜４０μｇのタンパク質を使用して、ウェスタン分析を実施した。ｅＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ １１７７，＃９５７１）またはＰｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３，＃９２７１）の抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって探知した。タンパク質は、ＮＯＳ３ Ｃ−２０（ｓｃ−６５４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはＡｋｔ 抗体＃９２７２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって評価した。ＨＲＰ連結抗ウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。化学発光基質のＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ（ピアス）によってすべてのブロットを可視化した。Ａｌｐｈａ ＩｎｎｏｔｅｃｈからのＡｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ ８８００を使用して、シグナルを定量した。
【００７６】
ウォッシュアウト実験：ＨＵＶＥＣ細胞を上記に記載のように処理した。化合物Ａ（１０ｎＭ）と４５分間のインキュベーションと、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で５分間の刺激の後で、上清を除去し、洗浄し、ＶＥＧＦおよびＮａ３ＶＯ４を含有する飢餓培地に置き換えた。この細胞を所望される長さの時間の間さらにインキュベートした後で、溶解させ、リン酸化および全体のＶＥＧＦＲ−２のために免疫沈殿およびウェスタンを使用して処理した（上記参照）。別の実験において、細胞を上記のように全体の時間の長さの間ＶＥＧＦで処理し、所望される時点でのＶＥＧＦＲ−２リン酸化および全ＶＥＧＦＲ−２を同様に評価した。ウォッシュアウトの間のシグナルをデンシトメトリーによって定量した。各実験からの最大刺激（５分）の強度を互いに正規化して、ホスホＶＥＧＦＲ−２の各時点での強度を２つの実験間で比較して、それにより、非処理であるがＶＥＧＦ刺激した細胞に対して、ＶＥＧＦＲ−２リン酸化の回復を決定した。
【００７７】
腫瘍モデル：ヒトＭＶ５２２（結腸癌）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）モデルでは、無胸腺マウス（ｎ＝８〜１２）に５ｘ１０６細胞／部位を移植（ｓ．ｃ．）した。マウスのルイス肺癌モデルでは、腫瘍断片（１〜２ｍｍ２）をＢ６Ｄ２Ｆ１マウスの右脇腹にトロカール移植した。投薬は、通常７日目（ＭＶ５２２）、または平均腫瘍サイズが１５０〜２００ｍｍ３に達するとき（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に開始した。
【００７８】
式１の化合物は、０．５％ ＣＭＣ／Ｈ２Ｏ中に製剤化して、ＰＯ、ＢＩＤ投与した。ドセタキセルは、７％ ＥｔＯＨ／３％ ポリソルベート／９０％ Ｈ２Ｏ中に製剤化して、週ごとに、静脈内で投薬した。通常、処理は３〜４週間続いた。腫瘍の幾何学的な長さおよび幅を、電子カリパスを使用して週３回測定した。腫瘍体積は、０．４ｘ［長さｘ（幅）２］の積として算出した。データは、平均±ＳＥＭとして報告した。試験の最後に、腫瘍と組織を分析用に切除、秤量、および採取した。薬物濃度の分析用に血漿を採取した。
【００７９】
結果を表１〜３に示す。
表１．化合物１の効力および選択性
【００８０】
【表１】
【００８１】
スクリーニングしたが、Ｋｉ計算の限度を超えた他の酵素は、ｃＭｅｔ、ＬＣＫ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、ＩＲＬ、ＢＴＫ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＬＫ、およびＣｈｋ１である。
【００８２】
表２．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌モデルにおける化合物１およびドセタキセルの同時投与用の試験設計
【００８３】
【表２】
【００８４】
表３．ドセタキセルおよび化合物１の組合せ療法は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片モデルにおいてより大きな抗腫瘍活性をもたらした。
【００８５】
【表３】
【００８６】
上記の組合せ群は、完全および部分的な腫瘍退縮の増加した出現率を明示する。これらの薬剤を組み合わせるとき、腫瘍増殖率は、より大きな度合いまで低下した。この組合せ治療は、単剤単独と同じくらい十分に忍容された。
【００８７】
実施例２
式１の化合物、６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールを固形腫瘍の患者へ様々な用量で投与した。式１の化合物を経口の錠剤形において、ＢＩＤまたはＱＤのスケジュールで使用して、３０名（男性１３名、女性１７名）の患者を治療した。サイクルは、それぞれ２８日であった。具体的な腫瘍の診断は、乳房（１１）、甲状腺（５）、腎細胞（５）、肺（４）および、その他（５）であった。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、薬物動態データを測定した。このサイクルの１５日目に、投与後０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、および１２時間の時点で血液試料を採取した。
【００８８】
薬物動態結果（１５日目の平均値）を表４に示す。患者は、他に述べなければ、絶食ではなかった。括弧内の数字は、百分率として表される変動係数である。この表において、Ｃｍａｘは、観測される式１の化合物の最高血漿濃度であり、ＡＵＣ（０−２４）は、２４時間のＡＵＣ血漿濃度であり、Ｔ１／２は、濃度対時間のプロットより決定される半減期である。見出し項目の「ＰＫの患者数」は、薬物動態データを入手した患者の数を示す。
【００８９】
表４
【００９０】
【表４】
【００９１】
さらに、第一コホートの患者（ｎ＝６）は、１０ｍｇ ＱＤ〜３０ｍｇ ＢＩＤに及ぶ個別化された用量を受けた（ＰＫ示さず）。絶食状態では、摂食状態に比べて、血漿曝露がより高く（約４９％）、患者内の変動は抑えられた。現時点での最大耐薬量（ＭＴＤ）は、絶食状態で５ｍｇ ＢＩＤであると決定した。ＭＴＤより高い用量での投薬制限毒性（ＤＬＴ）は、高血圧（ＨＴＮ）、発作、肝機能検査値の上昇、膵炎、無呼吸、および胃炎であった。さらに、応答した２名のＮＳＣＬＣ患者は、致命的な喀血を起こし、１名は３週後にこの化合物での治療を中止した。非投薬制限性のタンパク尿も観察された。ＭＴＤ以下の用量では、１名の患者で、グレード２の胃炎へＤＬＴが限定された。７／１４名の患者で非投薬制限性のＨＴＮが観察され、慣用の降圧用医薬品により管理した。ＲＥＣＩＳＴ判定基準による２つの永続性のある一部応答が観察され（腎細胞と上顎洞の腺嚢腫において）、この十分に前処置した集団のうち５名の患者で、安定した疾患が４ヶ月以上（４〜１３＋ヶ月の範囲）続いた。ｄｃｅＭＲＩを使用して、２１名の患者で予備分析を実施して、式１の化合物により誘発される血管系への効果をベースラインと２、２８、および５６日目で測定した。平均Ｋｔｒａｎｓの百分率変化（Ｐ．Ｓ．Ｔｏｆｔｓ，Ｇ．Ｂｒｉｘ，Ｄ．Ｌ．Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｅｖｅｌｈｏｃｈ，Ｅ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｖ．Ｋｎｏｐｐ，Ｈ．Ｂ．Ｗ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｔ．Ｌｅｅ，Ｎ．Ａ．Ｍａｙｒ，Ｇ．Ｊ．Ｍ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｐｏｒｔ，Ｊ．ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｋｏｆｆ，「分散可能トレーサーのダイナミック対比増強Ｔ１重み付けＭＲＩからの動態パラメータの評価：量および記号の標準化」（Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｃｏｎｔｒａｓｔ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔ１−Ｗｅｉｇｈｔｅｄ ＭＲＩ ｏｆ ａ Ｄｉｆｆｕｓａｂｌｅ Ｔｒａｃｅｒ：Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｓ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，１０：２２３−２３２（１９９９）とコントラスト強度Ｘ時間曲線下の初期面積（ＩＡＵＣ）をそれぞれの指標腫瘍（ｎ＝１〜４／患者）につき計算した。腫瘍血管系の応答は、ベースライン変数値が２日目までに５０％以上減少するものと定義した。腫瘍血管系応答の急激な（２日目）の減少（ＫｔｒａｎｓおよびＩＡＵＣの５０％以上の減少）が１８名の評価可能な患者の６名で観察され、１１／１８名で、ＫｔｒａｎｓおよびＩＡＵＣの両方の４０％以上の減少が明示された。スキャンに伴う技術課題により、３／２１の画像セットが評価可能でなかった。本実施例は、式１の化合物が、臨床応答と急性の腫瘍血管系変化により顕現されるように、きわめて有効な薬剤であることを示す。
【００９２】
実施例３
３０ｍｇ遊離塩基／ｋｇ用量の式１の［１４Ｃ］標識化合物をインタクトまたは胆管カニューレ挿入ビーグル犬へ経口投与した後で、広汎な代謝を観察した。生物変換経路には、酸素化（モノまたはジ）、グルクロニド化、グルコシル化、および酸素化に続く硫酸化またはグルコシル化が含まれた。図１は、同定された代謝産物を示す。血漿中では、Ｍ１２（Ｎ−オキシド）が検出可能な唯一の代謝産物である。尿中では、Ｍ５（デピリジニルカルボン酸）が主要な代謝産物である。主要な胆汁代謝産物には、Ｍ８（硫酸塩）とＭ１２が含まれる。主要な糞中代謝産物Ｍ１の化学構造は、不明のままである。
【００９３】
本化合物の単回経口投薬に続く、［１４Ｃ］由来放射活性のビーグル犬における排泄パターンは、雄と雌で同様であり、放射活性は、主に糞より排泄された。インタクトな雌の糞中８０．９％と尿中７．０％の回収率と比較して、インタクトな雄の平均回収率は、糞中８５．５％と尿中５．３％であった。胆管カニューレ挿入した雄イヌは、比較的少ない分量の放射活性を胆汁に排泄し（８．３％の回収率）、さらなる放射活性は、糞（５２．７％）と尿（１１．３％）に回収された。胆管カニューレを挿入したイヌからの尿および胆汁の放射活性を合わせると、投与した放射活性のほぼ２０％が胃腸吸収を受けたことを示唆する。すべての試料の全体平均回収率は、インタクトな雄と雌についてそれぞれ９２．４％と９２．６％、胆管カニューレ挿入した雄で８９．６％であった。放射ＨＰＬＣ検出器（β−ＲＡＭ）とインライン共役したＨＰＣＬと、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）供給源のＭＳ検出をポジティブまたはネガティブ形式で使用して、すべての代謝産物のプロファイリングおよび構造解明を実施した。
【００９４】
実施例４
式１の化合物は、ＣＤ−１マウスにおいて、［１４Ｃ］標識化合物の単回経口投与に続き、広汎な代謝を受ける。低い百分率の未変化薬物が尿および糞中に回収され、多様な第Ｉ相および第ＩＩ相の代謝産物が観察された。生物変換経路には、酸素化（モノまたはジ）、グルクロニド化、グルコシル化、および酸素化に続くグルクロニド化またはグルコシル化のいずれかが含まれた。同定された代謝産物を図２に示す。血漿中では、未変化薬物とＭ１２（Ｎ−オキシド）が２つの主要な成分を代表した。Ｍ７（グルクロニド）は、尿と糞の両方で最も顕著な代謝産物を代表した。
【００９５】
５０ｍｇ遊離塩基／ｋｇ用量の［１４Ｃ］ＡＧ−０１３７３６を雄性ＣＤ−１マウスへ単回経口投与後、［１４Ｃ］由来放射活性の大部分が糞中で回収された。投薬後４８時間での放射活性の平均（ｎ＝２）回収率（用量の％）は、糞中６５．８％と尿中１２．７％であった。排泄物中の放射活性の消失速度は速やかで、ほぼ７２％の用量が投薬後２４時間以内に回収された。ＬＣ−ＲＡＭ−ＭＳ法を使用して、代謝産物の放射活性プロファイリングと構造特性決定を実施した。
【００９６】
図１および２に示す代謝産物に加えて、他の既知の代謝産物には、式１ａに示す活性ｄｅｓ−メチル代謝産物が含まれる。
【００９７】
【化４】
【００９８】
実施例５
免疫組織化学を使用して、腫瘍微小血管密度（ＭＶＤ）を測定することによって、血管新生を評価した。凍結した腫瘍切片を血管表面マーカーのＣＤ−３１用に染色し、組織切片の数領域中の血管の量をマニュアルで定量した。種々の試験は、式１の化合物の２〜３週のＰＯ ＢＩＤ投与が、対照腫瘍と比較して、処理した腫瘍中の血管の数を７０％低下させることを示した。処理後の微小血管密度の減少は、ＬＬＣ、ＭＶ５２２、およびＭ２４ｍｅｔが含まれる、使用したすべての腫瘍モデルで観察された。ＬＬＣ腫瘍モデルでは、浸透Ａｌｚｅｔポンプを介して連続的に送達するとき、式１の化合物は、有意な増殖阻害をもたらした。３回の試験からのデータは、ＬＬＣモデルにおけるこのクラスの薬剤により達成可能である最大の腫瘍増殖阻害が７８％であることを示した。５５±１７ｎｇ／ｍＬ（Ｎ＝３）ほどの低さの血漿濃度では、９０％の最大増殖阻害が達成された。この濃度を生物学的活性濃度（ＢＡＣ）と名付けた。５０％最大増殖阻害は、２８±１１ｎｇ／ｍＬ（Ｎ＝３）の血漿濃度と関連した。この濃度を最小有効濃度（ＭＥＣ）と名付けた。１つの試験群で、本化合物の連続注入により産生される７０％のＭＧＩは、５７４ｎｇ・時間／ｍＬのＡＵＣ（０−２４）と関連したが、同じ試験において、ＰＯ ＢＩＤ投薬後の７２０ｎｇ・時間／ｍＬのＡＵＣ（０−２４）は、４０％の最大増殖阻害（ＭＧＩ）を生じた。これらの結果は、このモデルにおいて見られる抗腫瘍効力がトラフ（谷）濃度により推進されること、そしてマウスでは、最大抗腫瘍効力をもたらすのに、本化合物の連続した低濃度が十分であり得ることを示唆する。
【００９９】
式１の化合物は、ヒト乳癌異種移植片モデル、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において単剤として有効であった。このモデルにおける式１の化合物とドセタキセルの組合せを用いた効力試験に備えて、ナイーブなヌードマウスで予備試験を行って、ＰＫおよび耐性に対する潜在的な薬物−薬物相互作用の効果を決定した。１５または３０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル、週１回３週間ＩＶ投与の後で、対照と比べた体重の減少（それぞれ、７％と１１％）をドセタキセル処理動物で確認した。ドセタキセル単独で処理した動物と、ドセタキセルと式１の化合物（３０ｍｇ／ｋｇ／日、１６日間；ＰＯ）の組合せを与えたものとの間では、体重の差異を認めなかった。ドセタキセル投与は、式１の化合物のＡＵＣに影響を及ぼさなかったが、ＡＧ−０１３７３６のＣｍａｘ値は、式１の化合物単独と比べて、組合せ群において有意に低下した。
【０１００】
選択した組織（肝臓、腎臓、心臓、脾臓、胃、小腸および大腸、卵巣、胸骨、関節）の組織学的検査は、この試験において単剤としての式１の化合物で処理したマウスにおける標的臓器効果を明らかにしなかった。ドセタキセル処理マウスに認められた変化には、卵胞の壊死とごく軽症〜軽症の骨髄低細胞性が含まれた。式１の化合物とドセタキセルの組合せ治療は、卵巣に対するドセタキセルの効果を悪化させなかったが、式１の化合物／ドセタキセル組合せを与えた動物において骨髄低細胞性の強度増加（ごく軽症〜中等症）を認めた。さらに、組合せで処理した動物においては、低細胞性の強度増加の二次効果と見られる、骨髄出血が観察された。
【０１０１】
式１の化合物とドセタキセルをＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデルにおける効力評価のために組み合わせた。式１の化合物単独（２５、５、および１ｍｇ／ｋｇ，ＰＯ，ＢＩＤ，３週間投与）は、用量依存性の腫瘍増殖阻害をもたらした。ドセタキセル単独（ＩＶ、週ごと）２０および１０ｍｇ／ｋｇも有効であった（しかし、２ｍｇ／ｋｇは無効であった）。式１の化合物とドセタキセルの間には、有益な療法上の相互作用があるように見られた。この利益は、これらの薬剤を高用量および中用量の両方で組み合わせるときにより明らかであった。高用量および中用量の組合せアームでの部分退縮（腫瘍サイズの１６％〜９７％の低下）および完全応答の出現率は、個々の薬剤単独の同じ用量での群の出現率よりずっと大きかった。この試験の限られた群と比較的短い時間フレームのために、上記のことは決定的な知見ではない。式１の化合物は、すべての用量で十分に耐えられた。高用量の組合せ群（２５ｍｇ／ｋｇの化合物１と２０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル）では、他のすべての群と比べて、化学療法剤の第三回目の投薬後に、平均体重の３％〜７％の低下があった。薬物動態分析は、式１の化合物のＡＵＣ値がドセタキセルの存在下で影響を受けないこと、しかしＣｍａｘ値は、式１の化合物単独と比較して、組合せ群で有意に低下することを明示した。
【０１０２】
ドセタキセルとの組合せにおける式１の化合物の抗腫瘍効果をＬＬＣモデルにおいて検討した。ＬＬＣモデルは、ドセタキセルに対してきわめて抵抗性である。その細胞傷害剤では、報告されているＭＴＤ（３０ｍｇ／ｋｇ，週ごとに投薬、ｉｖ）で腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）がほとんど見られなかった（ＴＧＤ＝３．２日）。すべてのマウスが大きな原発腫瘍により実験の２８日以内に安楽死した。対照的に、式１の化合物単剤は、用量依存性で統計学的に有意なＴＧＤをもたらした（１０ｍｇ／ｋｇで１３．４日、３０ｍｇ／ｋｇで１５．４日、ＰＯ，ＢＩＤ）。しかしながら、この薬剤は、遅延させただけで、肺への転移を止めることはなかった。低用量組合せ群（ＴＧＤ＝１５．２日）ではなく、高用量組合せ群のＴＧＤ（２０．４日）は、単剤単独のいずれよりも統計学的に異なっていた（それぞれ、Ｐ＝０．００７９およびＰ＝０．２５４）。高用量組合せ群ではより多くの動物（３／１０）が客観的なエンドポイントに達したが、低用量組合せ群では達しなかった。結論として、式１の化合物とドセタキセルの高用量組合せ療法は、いずれの単独療法単独よりも大きい原発腫瘍増殖および転移の遅延をもたらす可能性があるが、完全な治癒をもたらすわけではない。
【０１０３】
ＭＶ５２２腫瘍モデルを使用する１つの試験は、式１の化合物の１日１回（ＱＤ）６０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ投薬が３０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ，ＢＩＤと同様の腫瘍増殖阻害をもたらす（ｐ＝０．１５４）ことを明示した。さらに、抗腫瘍効果は、３０ｍｇ／ｋｇで連続５日間ＰＯ，ＢＩＤ投薬後に２日間休薬するとき、同じ用量濃度を使用して毎日ＰＯ，ＢＩＤ投薬することと比べて低下するようには見えなかった（ｐ＝０．２２３）。これらの結果は、この非臨床腫瘍モデルにおいて、式１の化合物をＱＤで投与しても、またはある種の臨時投薬スケジュールで投与しても、有意な抗腫瘍効果を達成することを期待してよいことを示唆する。
【０１０４】
ＭＶ５２２異種移植片モデルにおいて抗腫瘍効果をもたらすのに必要とされる受容体阻害の時間量と式１の化合物の濃度について検討した。この結果は、ＰＯ投薬（ＱＤまたはＢＩＤ）では、５０％以上の抗腫瘍効果のためには、ほぼ２４時間毎日ＥＣ５０（５ｎｇ／ｍＬ）より高く曝露することが必要であることを示した。９０％の腫瘍増殖阻害を達成するためには、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ以上の血漿濃度に毎日少なくとも４時間曝露することが必要であった。上記の閾値を超えた曝露は、さらなる効果を保証しなかった。ＢＩＤまたはＱＤ群のいずれでも、同様の体重損失があり、いずれも５％未満であった。従って、適正な用量と曝露時間があれば、ＱＤ処方は、ＢＩＤ処方と同じくらい有効であるかもしれない。
【０１０５】
Ａｌｚｅｔポンプを介した連続曝露は、規則的な定期投薬と比べて、式１の化合物によるより大きな抗腫瘍効果をもたらした。このポンプによる１０ｍｇ／ｍＬでの送達は、３０ｎｇ／ｍＬの一定した平均全身曝露をもたらし、腫瘍の静止状態を生じた。対照的に、予測ＥＣ９０に優る式１の化合物の血漿濃度を生じる、飽和量（ＰＯ，ＢＩＤ）では、腫瘍増殖遅延をもたらすことができただけである。従って、式１の化合物の連続全身曝露は、腫瘍を治療するのに、１日２回の経口投薬処方より有効であると思われた。
【０１０６】
間欠性の投薬処方を使用する式１の化合物の抗腫瘍効果も試験した。治療群は、以下の通りであった：担体の連日投薬、担体の間欠投薬、３０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）の連日投薬、および３０ｍｇ／ｋｇの間欠投薬。間欠投薬のスケジュールは、以下の通りであった：サイクル１（１２〜１８日目に投薬、１９〜２８日目に休薬）、およびサイクル２（２９〜３６日目に投薬、３７〜４４日目に休薬）。平均腫瘍サイズが２５０ｍｍ３になったときに投薬を開始し；いずれにもＡＧ−０１３７３６（ＰＯ，ＢＩＤ）を与えた。全体的に見て、間欠および連日のＢＩＤ投薬の間には有意差があり、連続した連日投薬処方は、増殖遅延をもたらすのにより有効であった。間欠投薬された薬物群では、投薬を中止して３〜４日以内に腫瘍が通常の増殖速度を再び獲得した。しかしながら、サイクル２投薬の２日以内には、腫瘍増殖阻害が再開した。予測されるように、どの群でも退縮は見られなかった。
【０１０７】
具体的で好ましい態様を参照にして本発明を例示したが、当業者は、定型的な実験と本発明の実践により、種々の変更および改良がなし得ることを理解されよう。従って、本発明は、上記の記載によって限定されず、付帯の特許請求項とその同等物により規定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、１４Ｃ標識化合物の単回経口投薬に続く、イヌにおいて同定される式１の化合物の代謝産物を示す。
【図２】図２は、１４Ｃ標識化合物の単回経口投薬に続く、マウスにおいて同定される式１の化合物の代謝産物を示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示がそのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６０／４６０，６９５号（２００３年４月３日出願）および米国仮特許出願第６０／４９１，７７１号（２００３年７月３１日出願）の利益を主張する。
【０００２】
背景技術
本発明は、癌のような異常な細胞増殖の哺乳動物における治療に有用であるＶＥＧＦＲ阻害剤に関する。本発明はまた、異常な細胞増殖の哺乳動物、具体的にはヒトにおける治療にこうした化合物を使用する方法と、こうした化合物を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
式１：
【０００４】
【化１】
【０００５】
により表される化合物、６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールは、結腸癌、黒色腫、乳癌および肺癌の異種移植モデルにおいて広汎な前臨床活性のある、ＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼの強力かつ選択的な阻害剤である（Ｈｕ−Ｌｏｗｅ Ｄ，Ｈｅｌｌｅｒ Ｄ，Ｂｒｅｋｋｅｎ Ｊ，Ｆｅｅｌｅｙ Ｒ，Ａｍｕｎｄｓｏｎ Ｋ，Ｈａｉｎｅｓ Ｍ，Ｔｒｏｃｈｅ Ｇ，Ｋｉｍ Ｙ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｄ，Ｈｅｒｒｍａｎ Ｍ，Ｂａｔｕｇｏ Ｍ，Ｖｅｋｉｃｈ Ｓ，Ｋａｎｉａ Ｒ，ＭｃＴｉｇｕｅ Ｍ，Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｓ，Ｂｅｎｄｅｒ Ｓ，Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ Ｄ．，「ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ受容体チロシンキナーゼの低分子阻害剤、ＡＧ０１３７３６の薬理活性（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＡＧ０１３７３６，ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ）」Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２：抄録＃５３５７）。ダイナミック対比増強ＭＲＩ（ｄｃｅＭＲＩ）を使用して評価した前臨床の腫瘍血管応答は、腫瘍増殖指標と対応することを示した（Ｗｉｌｍｅｓ ＬＪ，Ｈｙｌｔｏｎ ＮＭ，Ｗａｎｇ Ｄ，Ｆｌｅｍｉｎｇ ＬＭ，Ｇｉｂｂｓ Ｊ，Ｋｉｍ Ｙ，Ｄｉｌｌｏｎ Ｒ，Ｂｒａｓｃｈ ＲＣ，Ｐａｒｋ ＪＷ，Ｌｉ Ｋ−Ｌ，Ｈｅｎｒｙ ＲＧ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ ＳＣ，Ｓｈａｌｉｎｓｋｙ ＤＲ，Ｈｕ−Ｌｏｗｅ Ｄ，ＭｃＳｈａｎｅ ＴＭ，およびＰａｌｌａｖｉｃｉｎｉ ＭＧ．，「新規ＶＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、ＡＧ０１３７３６は、ヌードマウス中のヒトＢＴ４７４乳癌異種移植片における腫瘍増殖および血管透過性を抑制する（ＡＧ０１３７３６，ａ Ｎｏｖｅｌ ＶＥＧＦＲ ＴＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＢＴ４７４ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ Ｎｕｄｅ Ｍｉｃｅ）」Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３：抄録＃３７７２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要約
本発明は、６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールと体系的に命名可能である、式１：
【０００７】
【化２】
【０００８】
の化合物を使用する剤形と治療の方法を提供する。
１つの態様において、本発明は、哺乳動物への投与用の剤形を提供し、該剤形は、式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を、哺乳動物への投与後に４５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下の式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で含んでなる。２４時間ＡＵＣ血漿値は、本明細書の「詳細な説明」に記載のようにして決定可能である。
【０００９】
この態様の具体的な側面において、２４時間ＡＵＣ血漿値の上限は、４０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または３０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または８００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または７００ｎｇ・時間／ｍＬ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、２４時間ＡＵＣ血漿値は、少なくとも１０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも２５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも５０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも７５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１００ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１２５ｎｇ・時間／ｍＬである。２４時間ＡＵＣ血漿値の想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬ、５０〜２５００ｎｇ・時間／ｍＬ、７５〜１０００ｎｇ・時間／ｍＬ、１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬ、および１２５〜７００ｎｇ・時間／ｍＬが含まれる。
【００１０】
別の態様において、本発明は、上記に定義される式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を３０ｍｇ以下の量で含んでなる剤形を提供する。化合物の全部または一部が塩、溶媒和物またはプロドラッグとして剤形にあるとき、その量は式１の化合物の同等量であり、それは分子量に基づいて当業者により容易に計算されると理解されたい。
【００１１】
この態様の具体的な側面において、この量の上限は、２０ｍｇ以下または１５ｍｇ以下または１２ｍｇ以下または１０ｍｇ以下または８ｍｇ以下または７ｍｇ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、この量は、少なくとも０．５ｍｇまたは少なくとも１ｍｇまたは少なくとも１．５ｍｇまたは少なくとも２ｍｇまたは少なくとも２．５ｍｇまたは少なくとも３ｍｇである。想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、０．５〜３０ｍｇ、１〜２０ｍｇ、１．５〜１５ｍｇ、２〜１０ｍｇ、２．５〜８ｍｇ、および３〜７ｍｇが含まれる。
【００１２】
さらに本発明は、上記に定義されるような式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を、ヒトが含まれる哺乳動物への投与後に４５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下の式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で哺乳動物へ投与することによって、異常な細胞増殖を哺乳動物において治療する方法を提供する。２４時間ＡＵＣ血漿値は、本明細書の「詳細な説明」に記載のようにして決定可能である。
【００１３】
この態様の具体的な側面において、２４時間ＡＵＣ血漿値の上限は、４０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または３０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または２０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１５００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または１０００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または８００ｎｇ・時間／ｍＬ以下または７００ｎｇ・時間／ｍＬ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、２４時間ＡＵＣ血漿値は、少なくとも１０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも２５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも５０ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも７５ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１００ｎｇ・時間／ｍＬまたは少なくとも１２５ｎｇ・時間／ｍＬである。２４時間ＡＵＣ血漿値の想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬ、５０〜２５００ｎｇ・時間／ｍＬ、７５〜１０００ｎｇ・時間／ｍＬ、１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬ、および１２５〜７００ｎｇ・時間／ｍＬが含まれる。
【００１４】
さらに本発明は、上記に定義されるような式１の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグ、またはこれらの混合物を、投薬につき３０ｍｇ以下の量でヒトが含まれる哺乳動物へ投与することによって、異常な細胞増殖を哺乳動物において治療する方法を提供する。化合物の全部または一部が塩、溶媒和物、またはプロドラッグとして剤形にあるとき、その量は式１の化合物の同等量であり、分子量に基づいて当業者により容易に計算されると理解されたい。
【００１５】
この態様の具体的な側面において、この量の上限は、２０ｍｇ以下または１５ｍｇ以下または１２ｍｇ以下または１０ｍｇ以下または８ｍｇ以下または７ｍｇ以下である。好ましくは、そして列挙した上限のいずれとも組み合わせて、この量は、少なくとも０．５ｍｇまたは少なくとも１ｍｇまたは少なくとも１．５ｍｇまたは少なくとも２ｍｇまたは少なくとも２．５ｍｇまたは少なくとも３ｍｇである。想定範囲には、列挙した下限のいずれかから列挙した上限のいずれかまでの範囲が含まれる。好ましい範囲の具体的な非限定例には、０．５〜３０ｍｇ、１〜２０ｍｇ、１．５〜１５ｍｇ、２〜１０ｍｇ、２．５〜８ｍｇ、および３〜７ｍｇが含まれる。
【００１６】
本明細書に記載される本発明の方法のいずれの具体的な態様においても、異常な細胞増殖は癌であり、限定されないが、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、または１以上の前記癌の組合せが含まれる。前記方法の別の態様において、前記異常な細胞増殖は良性の増殖性疾患であり、限定されないが、乾癬、良性前立腺肥大症、または再狭窄が含まれる。
【００１７】
別の態様において、本発明は、式１の化合物の療法的に許容される量を哺乳動物へ投与することによって、ＰＤＧＦＲ ＢＢ仲介性の癌細胞遊走を哺乳動物において阻害する方法を提供する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、式１の化合物の療法的に許容される量を哺乳動物へ投与することによって、ｃ−ＫＩＴ活性を哺乳動物において阻害する方法を提供する。
本明細書に記載する本発明の方法のいずれかのさらに具体的な態様において、本方法は、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、シグナル伝達阻害剤、および抗増殖剤より選択される１以上の物質の量を哺乳動物へ投与することをさらに含み、該量は、前記異常な細胞増殖を治療するのに全体として有効である。そうした物質には、ＰＣＴ公開公報番号：ＷＯ００／３８７１５、ＷＯ００／３８７１６、ＷＯ００／３８７１７、ＷＯ００／３８７１８、ＷＯ００／３８７１９、ＷＯ００／３８７３０、ＷＯ００／３８６６５、ＷＯ／００３７１０７、およびＷＯ００／３８７８６に開示されるものが含まれ、この開示は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００１９】
抗腫瘍剤の例には、減数分裂阻害剤、例えば、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンクリスチンのような植物アルカロイド誘導体；コルキン、アロコキン、ハリコンドリン、Ｎ−ベンゾイルトリメチル−メチルエーテルコルヒチン酸、ドラスタチン１０、マイスタンシン、リゾキシン、パクリタキセル（ＴａｘｏｌＴＭ）、ドセタキセル（ＴａｘｏｔｅｒｅＴＭ）、２’−Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］グルタラメート（ＴａｘｏｌＴＭ誘導体）のようなタキサン、チオコルヒチン、トリチルシステイン、テニポシド、メトトレキセート、アザチオプリン、フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲンシタビン）、アドリアマイシン、およびミタマイシン；アルキル化剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、イプロプラチン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−ザルコシル−Ｌ−ロイシンのエチルエステル（ＡｓａｌｅｙまたはＡｓａｌｅｘ）、１，４−シクロヘキサジン−１，４−ジカルバミン酸、２，５−ビス（１−アジルジニル）−３，６−ジオキソ−、ジエチルエステル（ジアジクォン）、１，４−ビス（メタンスルホニルオキシ）ブタン（ビスルファンまたはロイコスルファン）、クロロゾトシン、クロメゾン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドログラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、マイトマイシンＣ、ヒカンテオネマイトマイシンＣ、ミトゾラミド、１−（２−クロロエチル）−４−（３−クロロプロピル）−ピペラジン二塩酸塩、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンミラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、ビス（３−メシルオキシプロピル）アミン塩酸塩、マイトマイシン、シクロヘキシル−クロロエチルニトロソ尿素、メチルシクロヘキシル−クロロエチルニトロソ尿素、１−（２−クロロエチル）−３−（２，６−ジオキソ−３−ピペリジニル）−１−ニトロソ尿素、ビス（２−クロロエチル）ニトロソ尿素のようなニトロソ尿素、プロカルバジン、ダカルバジン、メクロロエタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、リン酸エストラムスチンナトリウム、ストルプトゾイン、およびテモゾラミドのようなナイトロジェンマスタード関連化合物；ＤＮＡ代謝拮抗薬、例えば、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、２−［（３−ヒドロキシ−２−ピリノジビル）メチレン］−ヒドラジンカルボチオアミド、デオキシフルオロウリジン、５−ヒドロキシ−２−ホルミルピリジンチオセミカルバゾン、α−２’−デオキシ−６−チオグアノシン、グリシン酸アフィジコリン、５−アザデオキシシチジン、β−チオグアニンデオキシリボシド、シクロシチジン、グアナゾール、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾリミダゾール、クラドリビン、ペントスタチン、チアグアニン、メルカプトプリン、ブレオマイシン、２−シクロデオキシアデノシン、ラルチトレキセドおよびペメトレキセド二ナトリウムのようなチミジン酸シンターゼ阻害剤、クロファラビン、フロクスウリジン、およびフルダラビン；ＤＮＡ／ＲＮＡ代謝拮抗薬、例えば、Ｌ−アラノシン、５−アザシチジン、アシビシン、アミノプテリンとＮ−［２−クロロ−５−［［（２，４−ジアミノ−５−メチル−６−キナゾリニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−［４−［［（２，４−ジアミノ−５−エチル−６−キナゾリニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−アスパラギン酸、Ｎ−［２−クロロ−４−［［（２，４−ジアミノプテリジニル）メチル］アミノ］ベンゾイル］−Ｌ−アスパラギン酸のようなその誘導体、可溶性ベーカーズ・アンチフォール（Ｂａｋｅｒ’ｓ ａｎｔｉｆｏｌ）、ジクロロアリルローソン、ブレキナー、フトラフール、ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキセート、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸四ナトリウム塩、ピラゾフラン、トリメトレキセート、プリカマイシン、アクチノマイシンＤ、クリプトフィシン、およびクリプトフィシン−５２のような類似体、または、例えば、Ｎ−（５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル）−Ｌ−グルタミン酸のような、ヨーロッパ特許出願番号２３９３６２に開示される好ましい拮抗薬の１つ；増殖因子阻害剤；細胞周期阻害剤；挿入抗生物質、例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン；タンパク質、例えば、インターフェロン；および、抗ホルモン剤、例えばＮｏｌｖａｄｅｘＴＭ（タモキシフェン）のような抗エストロゲン、または例えば、ＣａｓｏｄｅｘＴＭ（４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド）のような抗アンドロゲンが含まれる。こうした併用治療は、治療の個別成分の同時、連続、または分離投薬により達成可能である。
が含まれる。
【００２０】
抗血管新生剤には、ＭＭＰ−２（マトリックス−メタロプロテイナーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ−９（マトリックス−メタロプロテイナーゼ９）阻害剤、およびＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤が含まれる。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ（アレコキシブ）、バルデコキシブ、およびロフェコキシブが含まれる。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、ＷＯ９６／３３１７２（１９９６年１０月２４日公開）、ＷＯ９６／２７５８３（１９９６年３月７日公開）、ヨーロッパ特許出願番号９７３０４９７１．１（１９９７年７月８日出願）、ヨーロッパ特許出願番号９９３０８６１７．２（１９９９年１０月２９日出願）、ＷＯ９８／０７６９７（１９９８年２月２６日公開）、ＷＯ９８／０３５１６（１９９８年１月２９日公開）、ＷＯ９８／３４９１８（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３４９１５（１９９８年８月１３日公開）、ＷＯ９８／３３７６８（１９９８年８月６日公開）、ＷＯ９８／３０５６６（１９９８年７月１６日公開）、ヨーロッパ特許公開公報６０６，０４６（１９９４年７月１３日公開）、ヨーロッパ特許公開公報９３１，７８８（１９９９年７月２８日公開）、ＷＯ９０／０５７１９（１９９０年５月３１日公開）、ＷＯ９９／５２９１０（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／５２８８９（１９９９年１０月２１日公開）、ＷＯ９９／２９６６７（１９９９年６月１７日公開）、ＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ９８／０１１１３（１９９８年７月２１日出願）、ヨーロッパ特許出願番号９９３０２２３２．１（１９９９年３月２５日出願）、イギリス特許出願番号９９１２９６．１（１９９９年６月３日出願）、米国仮特許出願番号６０／１４８，４６４（１９９９年８月１２日出願）、米国特許第５，８６３，９４９号（１９９９年１月２６日発行）、米国特許第５，８６１，５１０号（１９９９年１月１９日発行）、およびヨーロッパ特許公開公報７８０，３８６（１９９７年６月２５日公開）に記載され、これらはすべてそのまま参照により本明細書に組み込まれる。好ましいＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９阻害剤は、ＭＭＰ−１を阻害する活性をほとんどまたはまったく有さないものである。より好ましいのは、他のマトリックス−メタロプロテイナーゼ（即ち、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）に比較して、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。
【００２１】
ＭＭＰ阻害剤の例には、ＡＧ−３３４０、ＲＯ３２−３５５５、ＲＳ１３−０８３０、および以下のリストに列挙する化合物が含まれる：
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロペンチル）−アミノ］−プロピオン酸；
３−エクソ−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（２−クロロ−４−フルオロ−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；
４−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−シクロブチル）−アミノ］−プロピオン酸；
４−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−４−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−ピラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
（２Ｒ，３Ｒ）１−［４−（４−フルオロ−２−メチル−ベンジルオキシ）−ベンゼンスルホニル］−３−ヒドロキシ−３−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（１−ヒドロキシカルバモイル−１−メチル−エチル）−アミノ］−プロピオン酸；
３−［［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニル］−（４−ヒドロキシカルバモイル−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）−アミノ］−プロピオン酸；
３−エクソ−３−［４−（４−クロロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
３−エンド−３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−８−オキサ−ビシクロ［３．２．１］オクタン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；および
３−［４−（４−フルオロ−フェノキシ）−ベンゼンスルホニルアミノ］−テトラヒドロ−フラン−３−カルボン酸ヒドロキシアミド；
および、前記化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグ。
【００２２】
シグナル伝達阻害剤の例には、ＥＧＦＲ抗体、ＥＧＦ抗体、およびＥＧＦＲ阻害剤である分子のように、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）応答を阻害することができる薬剤；ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤；および、ｅｒｂＢ２受容体へ結合する有機分子または抗体のようなｅｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮＴＭ（米国カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのジェネンテク社）が含まれる。
【００２３】
ＥＧＦＲ阻害剤は、例えば、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、ＷＯ９８／１４４５１（１９９８年４月９日公開）、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、および米国特許第５，７４７，４９８号（１９９８年５月５日発行）に記載されている。ＥＧＦＲ阻害剤には、限定されないが、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ２２Ｍａｂ（米国ニューヨーク州ニューヨークのイムクローン・システムズ社）、化合物ＺＤ−１８３９（アストラゼネカ）、ＢＩＢＸ−１３８２（ベーリンガーインゲルハイム）、ＭＤＸ−４４７（米国ニュージャージー州アナンデールのＭｅｄａｒｅｘ社）、およびＯＬＸ−１０３（米国ニュージャージー州ホワイトハウス・ステーションのメルク社）、ＶＲＣＴＣ−３１０（Ｖｅｎｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、およびＥＧＦ融合毒素（マサチューセッツ州ホプキントンのセラジェン社）が含まれる。
【００２４】
ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＳＵ−５４１６およびＳＵ−６６６８（米国カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのスジェン社）も、式１の化合物と組合せまたは同時投与可能である。ＶＥＧＦ阻害剤は、例えば、ＷＯ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日公開）、ＰＣＴ国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７（１９９９年５月３日出願）、ＷＯ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日公開）、ＷＯ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日公開）、米国特許第５，８３４，５０４号（１９９８年１１月１０日発行）、ＷＯ９８／５０３５６（１９９８年１１月１２日公開）、米国特許第５，８８３，１１３号（１９９９年３月１６日発行）、米国特許第５，８８６，０２０号（１９９９年３月２３日発行）、米国特許第５，７９２，７８３号（１９９８年８月１１日発行）、ＷＯ９９／１０３４９（１９９９年３月４日公開）、ＷＯ９７／３２８５６（１９９７年９月１２日公開）、ＷＯ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日公開）、ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日公開）、ＷＯ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／１６７５５（１９９９年４月８日公開）、およびＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）に記載されて、これらはすべてそのまま参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの具体的なＶＥＧＦ阻害剤の他の例は、ＩＭ８６２（米国ワシントン州カークランドのＣｙｔｒａｎ社）；抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体、ベバシツマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（カリフォルニア州サウス・サンフランシスコのジェネンテク社）；並びに、Ｒｉｂｏｚｙｍｅ（コロラド州ボルダー）およびカイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）（カリフォルニア州エメリヴィル）からの合成リボザイム、ａｎｇｉｏｚｙｍｅＴＭである。
【００２５】
ＧＷ−２８２９７４（グラクソ・ウェルカム社）とモノクローナル抗体のＡＲ−２０９（米国テキサス州ウッドランズのＡｒｏｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）および２Ｂ−１（カイロン）のようなＥｒｂＢ２受容体阻害剤は、式１の化合物と組み合わせて投与可能である。こうしたｅｒｂＢ２阻害剤には、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日公開）、ＷＯ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日公開）、ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日公開）、ＷＯ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日公開）、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日公開）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日発行）、および米国特許第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日発行）に記載されるものが含まれ、このそれぞれは、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用なｅｒｂＢ２受容体阻害剤は、米国仮特許出願番号６０／１１７，３４１（１９９９年１月２７日出願）および米国仮特許出願番号６０／１１７，３４６（１９９９年１月２７日出願）にも記載され、この両方ともそのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
使用可能である他の抗増殖剤には、酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの阻害剤と受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦｒの阻害剤が含まれ、以下の米国特許出願に開示されて特許請求される化合物：０９／２２１９４６（１９９８年１２月２８日出願）；０９／４５４０５８（１９９９年１２月２日出願）；０９／５０１１６３（２０００年２月９日出願）；０９／５３９９３０（２０００年３月３１日出願）；０９／２０２７９６（１９９７年５月２２日出願）；０９／３８４３３９（１９９９年８月２６日出願）；および０９／３８３７５５（１９９９年８月２６日出願）と、以下の米国仮特許出願に開示されて特許請求される化合物：６０／１６８２０７（１９９９年１１月３０日出願）；６０／１７０１１９（１９９９年１２月１０日出願）；６０／１７７７１８（２０００年１月２１日出願）；６０／１６８２１７（１９９９年１１月３０日出願）；および６０／２００８３４（２０００年５月１日出願）が含まれる。上記の特許出願および仮特許出願のそれぞれは、そのまま参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
式１の化合物はまた、異常な細胞増殖または癌を治療するのに有用な他の薬剤と使用可能であり、限定されないが、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体のように抗腫瘍免疫応答を増強することが可能な薬剤と、ＣＴＬＡ４を阻止することが可能な他の薬剤；および、他のファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤のような抗増殖剤が含まれる。本発明において使用可能である具体的なＣＴＬＡ４抗体には、そのまま参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願６０／１１３，６４７（１９９８年１２月２３日出願）に記載されるものが含まれる。
【００２８】
別の態様において、本発明は、式１の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグと治療有効量のドセタキセルを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、式１の化合物、またはその医薬的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグと治療有効量のドセタキセルをヒトが含まれる哺乳動物へ投与することによって、異常な細胞増殖を該哺乳動物において治療する方法を提供する。式１の化合物とドセタキセルは、要望どおりに、別々に、または同じ組成物において投与可能であり、同じ投薬スケジュールでも、異なる投薬スケジュールでも投与可能である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
定義
本明細書に使用する「異常な細胞増殖」は、他に述べなければ、正常な調節機序から独立している細胞増殖（例、接触阻害の消失）を意味する。これには：（１）突然変異したチロシンキナーゼを発現すること、または受容体チロシンキナーゼの過剰発現によって増殖する腫瘍細胞（腫瘍）；（２）異常なチロシンキナーゼ活性化が起こる他の増殖性疾患の良性および悪性の細胞；および（４）受容体チロシンキナーゼによって増殖するあらゆる腫瘍の異常増殖が含まれる。
【００３１】
本明細書に使用する用語「治療する」は、他に述べなければ、そうした用語が適用される障害または状態、またはそうした障害または状態の１以上の症状を逆転させること、緩和すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。本明細書に使用する用語「治療」は、他に述べなければ、治療する行為を意味し、「治療する」は直前に定義されている。
【００３２】
本明細書に使用する句「医薬的に許容される塩」には、他に述べなければ、化合物に存在し得る酸性または塩基性基の塩が含まれる。性質が塩基性である化合物は、様々な無機および有機酸と多種多様な塩を形成することが可能である。そうした塩基性化合物の医薬的に許容される酸付加塩を製造するために使用可能である酸は、無毒の酸付加塩、即ち、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カムシラート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシレート、エストラート、エシレート、エチルコハク酸塩、フマル酸塩、グルセプタート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシラート、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクラート、トシラート、トリエチオダイド、および吉草酸塩のような、薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩を形成するものである。
【００３３】
本明細書に使用する用語「プロドラッグ」は、他に述べなければ、投与に続き、何らかの化学的または生理学的プロセスを介して薬物をｉｎ ｖｉｖｏで放出する薬物前駆体である化合物を意味する（例えば、プロドラッグは、生理学的なｐＨへ置かれるとすぐに、所望される薬物形態へ変換される）。
【００３４】
本発明にはまた、天然に通常見出される原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子に１以上の原子が置き換わっている事実を除けば、式１に引用する化合物と同一である、同位体標識化合物が含まれる。本発明の化合物へ取り込み可能である同位体の例には、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、および３６Ｃｌのように、それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、リン、イオウ、フッ素および塩素の同位体が含まれる。上記の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有する、本発明の化合物、そのプロドラッグ、前記化合物または前記プロドラッグのの医薬的に許容される塩および溶媒和物は、本発明の範囲内にある。本発明の特定の同位体標識化合物、例えば、３Ｈおよび１４Ｃのような放射活性同位体が取り込まれているものは、薬物および／または基質の組織分布アッセイに有用である。トリチウム化、即ち３Ｈと炭素−１４、即ち１４Ｃの同位体は、その調製の容易さと検出可能性のために特に好ましい。さらに、重水素、即ち２Ｈのようなより重い同位体での置換は、より大きな代謝安定性より生じるある種の療法上の利点（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加または投与必要量の低下）をもたらすことができるので、ある状況においては好ましい場合がある。一般に、本発明の式１の同位体標識化合物とそのプロドラッグは、非標識化合物について記載した手順を行なうこと、容易に入手可能な同位体標識試薬を非同位体標識試薬に代用することによって製造可能である。
【００３５】
発明の詳細な説明
式１の化合物は、そのまま参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３１，４９１号および６，５３４，５２４号（それぞれ、２００３年３月１１日および２００３年３月１８日発行）に記載されるように製造可能である。ある種の出発材料は、当業者に馴染みの方法に従って製造可能であり、ある種の合成の変更は、当業者に馴染みの方法に従って行ってよい。
【００３６】
式１の化合物は、様々な無機および有機酸と多種多様な異なる塩を形成することが可能である。そうした塩は、哺乳動物への投与について医薬的に許容されなければならないが、実際には、はじめに式１の化合物を反応混合物より医薬的に許容されない塩として単離してから、後者をアルカリ性の試薬での処理によって遊離塩基化合物へ戻し変換して、引き続き、後者の遊離塩基を医薬的に許容される酸付加塩へ変換することがしばしば望ましい。本発明の塩基性化合物の酸付加塩は、水系溶媒の媒体、またはメタノールまたはエタノールのような好適な有機溶液において実質的に同量の選択される鉱酸または有機酸で塩基性化合物を処理することによって容易に製造される。溶媒の慎重な蒸発と同時に、所望される固形の塩を容易に得る。所望される塩は、有機溶媒中の遊離塩基の溶液より、適正な鉱酸または有機酸を溶媒へ加えることによって沈殿させてもよい。
【００３７】
式１の化合物の投与は、該化合物の作用部位への送達を可能にするどの方法によって実施してもよい。これらの方法には、経口ルート、十二指腸内ルート、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内、または注入が含まれる）、局所、および直腸の投与が含まれる。
【００３８】
本化合物は、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、持続放出製剤、溶液剤、懸濁液剤として経口投与に、無菌の溶液剤、懸濁液剤、または乳剤として非経口注射に、軟膏剤またはクリーム剤として局所投与に、または坐剤として直腸投与に適した形態で提供可能である。本化合物は、正確な投与量の単回投与に適した単位剤形であってよい。好ましくは、剤形には、慣用の医薬担体または賦形剤と有効成分としての式１の化合物が含まれる。さらに、剤形には、他の医療または医薬の薬剤、担体、アジュバント、等を含めてよい。
【００３９】
例示の非経口投与型には、無菌の水溶液、例えば水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液中の溶液剤または懸濁液剤が含まれる。そうした剤形は、所望されるならば、好適に緩衝化してよい。
【００４０】
好適な医薬担体には、不活性の希釈剤または充填剤、水、および様々な有機溶媒が含まれる。医薬組成物は、所望されるならば、芳香剤、結合剤、賦形剤、等のような追加成分を含有してよい。このように、経口投与では、クエン酸のような様々な賦形剤を含有する錠剤が、デンプン、アルギン酸、およびある種の複合ケイ酸塩のような様々な崩壊剤と、そしてショ糖、ゼラチン、およびアカシアのような結合剤と一緒に利用可能である。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクのような滑沢剤が錠剤化の目的にしばしば有用である。同様の種類の固形組成物も、軟および硬充填のゼラチンカプセル剤に利用可能である。その好ましい材料には、ラクトースまたは乳糖と、高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水系の懸濁液剤またはエリキシル剤が経口投与に所望されるとき、そのなかの活性化合物は、様々な甘味剤または芳香剤、着色物質または色素と、そして所望されるならば、乳化剤または懸濁剤と、水、エタノール、ポリエチレングリコール、グリセリン、またはこれらの組合せのような希釈剤と一緒に組み合わせてよい。
【００４１】
本発明の剤形の好ましい態様において、剤形は、経口剤形、より好ましくは、錠剤またはカプセル剤である。
本発明の方法の好ましい態様において、式１の化合物は、例えば、本明細書に記載するような経口剤形を使用することのように、経口で投与する。
【００４２】
本方法には、望ましい投与方式を使用して、式１の化合物を投与することが含まれる。１つの具体的な態様において、本化合物は、１日につき１回（毎日、またはＱＤ）、好ましくは１日につき２回（１日２回、またはＢＩＤ）投与するが、より頻繁かまたは頻繁でない投与も本発明の範囲内にある。本化合物は、ヒトが含まれる哺乳動物へ、好ましくは絶食状態（投与の前および後の２時間以内は食物も飲み物もなし）で投与可能である。特に好ましい態様において、投与法はＢＩＤ、絶食である。
【００４３】
式１の化合物の具体的な量で様々な剤形を調製する方法は、当業者に知られているか、または明らかになろう。例えば、「レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」マック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルヴェニア州イーストン、第１５版（１９７５）を参照のこと。
【００４４】
ＡＵＣ血漿値は、式１の化合物またはその活性代謝産物の血漿濃度を、様々な時間間隔で液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるように直接測定して、時間曲線に対する血漿濃度下の面積を計算することによって定量可能である。ＡＵＣを計算するのに適した方法は、例えば、台形近似：
【００４５】
【化３】
【００４６】
［ここで、ｎは、データ点の数であり、ｔｉおよびＣｉは、ｉ番目のデータ点の時間および濃度（ｘおよびｙ値）である］を使用することによるように、当該技術分野でよく知られている。２４時間ＡＵＣ値は、投薬スケジュールに従って測定した血漿濃度を正規化することによって定量可能である。濃度標準液の調製用の復元溶液中の安定化剤として、酸性亜硫酸ナトリウムを加える。
【００４７】
式１の化合物は、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、ＣＤＫ複合体、ＣＨＫ１、ＣＳＦ−Ｒ、および／またはＬＣＫに関連したキナーゼ活性の変調および／または阻害に関して有利な特性を有する。
【００４８】
以下の実施例に示すように、式１の化合物は、ＨＵＶＥＣアポトーシスをｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導すること、ＶＥＧＦ仲介性ＡｋｔおよびｅＮＯＳリン酸化をＨＵＶＥＣにおいて阻害すること、ＨＵＶＥＣ中のＶＥＧＦＲ−２リン酸化に対して化合物の投与中止後も存続する阻害効果を明示すること、およびマトリックスタンパク質のフィブロネクチンに対するＰＤＧＦ ＢＢ誘発性の癌細胞遊走を阻害することが可能である。式１の化合物は、遊走および浸潤を阻害することによって、ＰＤＧＦＲ推進性の腫瘍進行に抗する活性を有するかもしれない。
【００４９】
式１の化合物はまた、ＴａｘｏｌＴＭ、より好ましくはドセタキセルと組み合わせるとき、腫瘍増殖阻害においてより有効な活性を明示する。いずれかの薬剤単独よりも、同時療法で、より有意な腫瘍退縮を観察した。
【００５０】
さらに本発明は、例えば哺乳動物組織において、式１の化合物を投与することによってプロテインキナーゼ活性を変調させるかまたは阻害する方法へ向けられる。本発明の化合物の、キナーゼの活性のようなプロテインキナーゼ活性のモジュレーターとしての活性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが含まれる、当業者に利用可能な方法のいずれによっても測定可能である。活性測定に適したアッセイの例には、Ｐａｒａｓｔ Ｃ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１６７８８−１６８０１（１９８８）；Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３１３−３２０（１９９５）；ＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９７／３４８７６；およびＷＩＰＯ国際特許公開公報番号ＷＯ９６／１４８４３に記載されるものが含まれる。これらの特性は、例えば、以下の実施例に示す生物学的試験法の１以上を使用することによって評価可能である。
【実施例】
【００５１】
以下に提供する実施例および製法は、本発明の剤形および方法をさらに例示して例証する。本発明の範囲は、以下の実施例の範囲により決して限定されないことを理解されたい。
【００５２】
実施例１
式１の化合物について：（１）いくつかのスケジューリング：１日１回、週末投薬、休日および間欠性の投薬でのｉｎ ｖｉｖｏ効力；（２）異種移植片モデルにおいてドセタキセルと組み合わせたときの効力；（３）内皮細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化；（４）細胞培養およびｉｎ ｖｉｖｏでの酸化窒素および関連産物の濃度；および（５）全血液細胞中のｃ−Ｋｉｔシグナルの、化合物の潜在バイオマーカーとしての使用を試験した。
【００５３】
生物学的試験；酵素アッセイ
ＶＥＦＧ、ＦＧＦ、その他のような増殖因子による細胞増殖の刺激は、そのそれぞれの受容体のチロシンキナーゼがそれぞれを自己リン酸化することの誘導に依存する。故に、これらの増殖因子によって誘導される細胞の増殖を妨げるプロテインキナーゼ阻害剤の能力は、受容体の自己リン酸化を妨げるその能力と直接的に相関する。化合物のプロテインキナーゼ阻害を測定するために、以下の構築体を設計した。
【００５４】
アッセイ用のＶＥＧＦ−Ｒ２構築体：この構築体は、チロシンキナーゼ活性を阻害する試験化合物の能力を決定する。キナーゼ挿入ドメインの６８残基の中央５０残基を欠く、ヒト血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）のサイトゾルドメインの構築体（ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０）をバキュロウイルス／昆虫細胞系において発現させた。全長ＶＥＧＦ−Ｒ２の１３５６残基のうち、ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０は、残基８０６〜９３９および９９０〜１１７１と、キナーゼ挿入ドメイン内に、野生型ＶＥＧＦ−Ｒ２に対する１つの点突然変異（Ｅ９９０Ｖ）も含有する。この精製構築体の自己リン酸化を、５％グリセロールおよび５ｍＭ ＤＴＴを含有する１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中３ｍＭ ＡＴＰおよび４０ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在下、４μＭの濃度の酵素の４℃で２時間のインキュベーションにより実施した。自己リン酸化の後で、この構築体は、野生型の自己リン酸化キナーゼドメイン構築体に本質的に同等な触媒活性を保有することが示された。Ｐａｒａｓｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，１６７８８−１６８０１（１９９８）を参照のこと。
【００５５】
アッセイ用のＦＧＦ−Ｒ１構築体：バキュロウイルスベクター発現系を使用して、ヒトＦＧＦ−Ｒ１の細胞内キナーゼドメインを、Ｍｏｈａｍｍａｄｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，９７７−９８９（１９９６）の残基番号付けシステムによる、内因性メチオニン残基４５６から出発してグルタミン酸７６６まで発現させた。さらに、この構築体はまた、以下の３つのアミノ酸置換を有する：Ｌ４５７Ｖ、Ｃ４８８Ａ、およびＣ５８４Ｓ。
【００５６】
アッセイ用のＬＣＫ構築体：昆虫細胞において、アミノ酸残基２２３から出発して残基５０９でのタンパク質の終わりまでのＮ−末端欠損体（以下の２つのアミノ酸置換がＮ末端にある：Ｐ２３３ＭおよびＣ２２４Ｄ）としてＬＣＫチロシンキナーゼを発現させた。
【００５７】
アッセイ用のＣＨＫ−１構築体：バキュロウイルス／昆虫細胞系を使用して、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き全長ヒトＣＨＫ−１（ＦＬ−ＣＨＫ−１）を発現させた。これは、４７６アミノ酸のヒトＣＨＫ−１のＣ末端に６つのヒスチジン残基（６ｘＨｉｓ−タグ）を含有する。このタンパク質を慣用のクロマトグラフィー技術によって精製した。
【００５８】
アッセイ用ＣＤＫ２／サイクリンＡ構築体：バキュロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞より、公知の方法論（Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３０，１３１７−１３１９（１９９３））を使用して、ＣＤＫ２を精製した。サイクリンＡは、全長組換えサイクリンＡを発現する大腸菌細胞より精製し、先端切断サイクリンＡ構築体は、限定したタンパク分解によって産生し、既報（Ｊｅｆｆｒｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３１３−３２０（１９９５））に記載のように精製した。
【００５９】
アッセイ用ＣＤＫ４／サイクリンＤ構築体：対応するバキュロウイルス発現ベクターで同時感染させた昆虫細胞より、従来の生化学のクロマトグラフィー技術を使用して、ヒトＣＤＫ４およびサイクリンＤ３の複合体、またはサイクリンＤ１とヒトＣＤＫ４およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−ＣＤＫ４）の融合タンパク質の複合体を精製した。
【００６０】
ＶＥＧＦ−Ｒ２アッセイ：共役分光測定（ＦＬＶＫ−Ｐ）アッセイ
ホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからの産生を、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）とピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を有する系を使用する、ＮＡＤＨの酸化へ共役した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ６５０分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ｅ３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少を追跡することによってＮＡＤＨの酸化をモニタリングした。リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（以下の表においてＦＬＶＫ−Ｐとして示す）のアッセイ条件は、以下の通りであった：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；５０ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；２０ユニットのＰＫ／ｍＬ；５ｍＭ ＤＴＴ；５．１ｍＭ ポリ（Ｅ４Ｙ１）；１ｍＭ ＡＴＰ；および２５ｍＭ ＭｇＣｌ２。非リン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２Δ５０（表においてＦＬＶＫとして示す）のアッセイ条件は、以下の通りであった：２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中１ｍＭ ＰＥＰ；２５０μＭ ＮＡＤＨ；５０ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；２０ユニットのＰＫ／ｍＬ；５ｍＭ ＤＴＴ；２０ｍＭ ポリ（Ｅ４Ｙ１）；３ｍＭ ＡＴＰ；および６０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２。５〜４０ｎＭの酵素でアッセイを開始した。様々な濃度の試験化合物の存在下に酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
【００６１】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ビオチニル化ガストリンペプチド（１−１７）を基質として使用して、ホスホガストリンの形成をモニタリングした。ストレプタビジン被覆９６ウェルマイクロタイタープレートを使用してビオチニル化ホスホガストリンを固定化して、西洋ワサビペルオキシダーゼへ共役した抗ホスホチロシン抗体を使用する検出を続けた。２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンザチアゾリンスルホネート（６）］ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼの活性をモニタリングした。典型的なアッセイ溶液は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中２μＭビオチニル化ガストリンペプチド；５ｍＭ ＤＴＴ；２０μＭ ＡＴＰ；２６ｍＭ ＭｇＣｌ２；および２ｍＭ ＭｎＣｌ２を含有した。０．８ｎＭのリン酸化ＶＥＧＦ−Ｒ２△５０でアッセイを開始した。西洋ワサビペルオキシダーゼ活性は、ＡＢＴＳ，１０ｍＭを使用してアッセイした。酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加により西洋ワサビペルオキシダーゼ反応を失活させ、４０５ｎｍでの吸光度読取りを続けた。様々な濃度の試験化合物の存在下に酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
【００６２】
ＦＧＦ−Ｒアッセイ：ＶＥＧＦ−Ｒ２についての上記の記載のように分光測定アッセイを行なったが、但し、濃度を以下のように変更した：ＦＧＦ−Ｒ＝５０ｎＭ，ＡＴＰ＝２ｍＭ，およびポリ（Ｅ４Ｙ１）＝１５ｍＭ。
【００６３】
ＬＣＫアッセイ：ＶＥＧＦ−Ｒ２についての上記の記載のように分光測定アッセイを行なったが、但し、濃度を以下のように変更した：ＬＣＫ＝６０ｎＭ，ＭｇＣｌ２＝０ｍＭ，ポリ（Ｅ４Ｙ１）＝２０ｍＭ。
【００６４】
ＣＨＫ−１アッセイ：合成基質ペプチドのＳｙｎｔｉｄｅ−２（ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ）へのホスホリル転移に伴うＡＤＰのＡＴＰからの産生を、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）を使用する、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の作用を介したＮＡＤＨの酸化へ共役した。ＮＡＤＨの酸化は、ＨＰ８４５２分光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度（ε３４０＝６．２２ｃｍ−１ｍＭ−１）の減少を追跡することによってモニタリングした。典型的な反応溶液は：５０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）中４ｍＮ ＰＥＰ；０．１５ｍＭ ＮＡＤＨ；２８ユニットのＬＤＨ／ｍＬ；１６ユニットのＰＫ／ｍＬ；３ｍＭ ＤＴＴ；０．１２５ｍＭ Ｓｙｎｔｉｄｅ−２；０．１５ｍＭ ＡＴＰ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；および４００ｍＬ ＮａＣｌを含有した。１０ｎＭのＦＬ−ＣＨＫ−１でアッセイを開始した。様々な濃度の試験化合物の存在下に初期酵素活性を測定することによって、Ｋｉ値を決定した。Ｅｎｚｙｍｅ ＫｉｎｅｔｉｃおよびＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈのソフトウェアを使用してデータを解析した。
【００６５】
ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ：このアッセイは、ヒト臍静脈内皮細胞（「ＨＵＶＥＣ」）の増殖因子刺激増殖を阻害する試験化合物の能力を決定する。ＨＵＶＥＣ細胞（継代数３〜４、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）をＴ７５フラスコ中のＥＧＭ２培養基（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）へ融かした。２４時間後、このフラスコへ新鮮なＥＧＭ２培地を加えた。４〜５日後、細胞を別の培養基（１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）、６０μｇ／ｍＬの内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）、および１０μｇ／ｍＬ ヘパリンを補充したＦ１２Ｋ培地）へ曝露した。その後の実験では、指数増殖期のＨＵＶＥＣ細胞を使用した。１０，０００〜１２，０００個のＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェル・ディッシュにおいて１００μｌの濃縮培養基（上記に記載）においてプレート培養した。この細胞を、この培地において２４時間付着させた。次いで、培地を吸引により除去し、１１５μｌの飢餓培地（Ｆ１２Ｋ＋１％ ＦＢＳ）を各ウェルへ加えた。１８時間後、飢餓培地中１％ ＤＭＳＯに溶かした１５μｌの試験薬剤かまたはこの担体単独をそれぞれの処理ウェルへ加えた；最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。１時間後、飢餓培地中２０μｌの１５０ｎｇ／ｍＬ ｈｒＶＥＧＦ１６５を、未処理対照を含有するウェルを除くすべてのウェルへ加えた；最終ＶＥＧＦ濃度は２０ｎｇ／ｍＬであった。７２時間後にＭＴＴ色素低下により細胞の増殖を定量したが、この時点で細胞をＭＴＴ（プロメガ社）へ４〜５時間曝露した。停止溶液（プロメガ社）の添加により色素低下を止め、５７０および６３０ｎｍでの吸光度を９６ウェル分光光度計プレートリーダーで決定した。
【００６６】
癌細胞増殖（ＭＶ５２２）アッセイ：プロテインキナーゼ阻害剤が癌を治療するために血管新生を妨げる治療有用性を有するかどうかを決定するには、この阻害剤がキナーゼ受容体を発現しない細胞においては細胞増殖を非特異的に妨げないことを実証することが重要である。癌細胞を使用する増殖アッセイを実施することによってこのことを行う。癌細胞における細胞増殖を評価するためのプロトコールは、ＨＵＶＥＣ細胞における評価について使用するものと同様である。２０００個の肺癌細胞（ＭＶ５２２系、ＵＣＳＤより獲得した）を増殖培地（２ｍＭグルタミンおよび１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）にまいた。試験薬剤および／または担体の添加に先立って、細胞を１日間付着させる。ＨＵＶＥＣアッセイに使用するのと同じ試験薬剤で細胞を同時に処理する。試験薬剤への曝露の７２時間後に、ＭＴＴ色素低下アッセイによって細胞増殖を定量する。
【００６７】
Ｃ−Ｋｉｔ効力決定：阻害剤によるｃ−Ｋｉｔに抗する効力を決定するためにＮＣＩ−Ｈ５２６（ＡＴＣＣ）細胞を使用した。この細胞を亜集密まで増殖させて、飢餓培地において１８時間インキュベートした。阻害剤を加え、細胞を２．３％アルブミンおよび１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（シグマ）の存在下に３７℃で４５分間インキュベートした。この培養物へＳＣＦ、ｃ−Ｋｉｔ増殖因子を５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。５分後、この細胞を冷ＰＢＳで２回濯ぎ、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１％ ＮＰ４０，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解させた。各溶解液より１ｍｇの総タンパク質を使用し、４μｇ／ｍｌ ＣＤ１１７ ａｂ−３（Ｋ４５，Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ）とともに４℃で一晩インキュベートして、免疫沈降を実施した。翌朝、この抗体複合体をプロテインＡビーズへコンジュゲートした。リン酸化受容体用の抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、または抗ｃ−Ｋｉｔ受容体抗体ｓｃ−１４９３（Ｃ−１４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を１：１０００で使用して、ＳＤＳ ＰＡＧＥとウェスタン・ブロット分析を実施した。化学発光試薬のＥＣＬ Ｐｌｕｓによってブロットを可視化した。ブロット中のシグナルの定量にｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｓｔｏｒｍ ８４６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用した。
【００６８】
動物および哺乳動物の全末梢血細胞中のｃ−ｋｉｔ陽性細胞集団の低下を式１の化合物の活性のバイオマーカーとして使用した。
ＥＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化測定：阻害剤によるｅＮＯＳおよびＡｋｔに抗する効力を決定するためにＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を使用した。この細胞を亜集密まで増殖させて、飢餓培地において１８時間インキュベートした。阻害剤を加え、細胞を２．３％アルブミンおよび１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（シグマ）の存在下に３７℃で４５分間インキュベートした。この培養基へＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍｌで加えた。５分後、この細胞を冷ＰＢＳで２回濯ぎ、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１％ ＮＰ４０，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解させた。３０〜４０μｇの総タンパク質をウェスタン法によって分析した。ｅＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化は：Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ １１７７）＃９５７１またはＰｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３）＃９２７１の抗体（いずれもＣｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇより）を使用することによって評価した。タンパク質の検出は、ＮＯＳ３（Ｃ−２０）ｓｃ−６５４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはＡｋｔ 抗体＃９２７２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって達成した。いずれも、１：３０００で使用する抗ウサギＨＲＰ連結二次抗体を必要とする。化学発光基質のＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ（ピアス）によってブロットを可視化した。ブロット中のシグナルの定量にＡｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ ８８００（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈより）を使用した。
【００６９】
マウスＰＫアッセイ：薬物のマウスにおける薬物動態（例、吸収と消失）について、以下の実験を使用して解析した。試験化合物は、０．５％ ＣＭＣ担体中の懸濁液剤として、または３０：７０（ＰＥＧ４００：酸性化Ｈ２Ｏ）担体中の溶液剤として製剤化した。この懸濁液剤または溶液剤をＣ３Ｈ雌性マウス（ｎ＝４）へ経口（ｐ．ｏ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。０時間（投薬前）、投薬後０．５時間、１．０時間、２．０時間、および４．０時間の時点で眼窩出血により血液試料を採取した。各試料より、２５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって血漿を入手した。この血漿より有機タンパク質沈殿法によって試験化合物を抽出した。各時点の出血につき、５０μＬの血漿を１．０ｍＬのアセトニトリルと合わせ、２分間激しく振り混ぜてから、４０００ｒｐｍで１５分間スピンしてタンパク質を沈殿させ、試験化合物を抽出した。次いで、アセトニトリル上清（試験化合物を含有する抽出物）を新しい試験管へ注ぎ、Ｎ２ガスの蒸気下にホットプレート（２５℃）で蒸発させた。乾燥した試験化合物の抽出物を含有するそれぞれの試験管へ１２５μＬの移動相（６０：４０，０．０２５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＋２．５ｍＬ／Ｌ ＴＥＡ：アセトニトリル）を加えた。激しく撹拌することによって、試験化合物をこの移動相に再懸濁させ、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりさらにタンパク質を除去した。ＵＶ検出付きヒューレット・パッカード１１００シリーズＨＰＬＣでの試験化合物分析のために各試料をＨＰＬＣバイアルへ注いだ。各試料より９５μＬをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ−Ｐｒｏｄｉｇｙ逆相Ｃ−１８，１５０ｘ３．２ｍｍカラムへ注入し、１０分にわたる４５〜５０％アセトニトリル勾配ランで溶出させた。上記のやり方で血漿試料より抽出した試験化合物の既知濃度を使用して、標準曲線（ピーク面積ｘ濃度μｇ／ｍＬ）との比較により、試験化合物の血漿濃度（μｇ／ｍＬ）を決定した。標準品と未知検体と一緒に、３群（ｎ＝４）の品質コントロール（０．２５μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、および７．５μｇ／ｍＬ）を実施して、分析の一貫性を保証した。標準曲線はＲ２＞０．９９を有し、品質コントロールは、いずれもその予測値の１０％範囲内にあった。定量した試験試料を、Ｋａｌｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを使用する可視ディスプレイのためにプロットし、ＷＩＮ ＮＯＮＬＩＮソフトウェアを使用して、その薬物動態パラメータを決定した。
【００７０】
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）アッセイ：ヒト肝ミクロソームにおける化合物の代謝について、以下のようなＬＳ−ＭＳ分析アッセイ手順によって測定した。はじめに、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）を融かし、冷１００ｍＭリン酸カリウム（ＫＰＯ４）緩衝液で５ｍｇ／ｍＬへ希釈した。適正量のＫＰＯ４緩衝液、ＮＡＤＰＨ再生溶液（Ｂ−ＮＡＤＰ、グルコース−６−リン酸、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびＭｇＣｌ２を含有する）、およびＨＬＭを１３ｘ１００ｍｍのガラス試験管において３７℃で１０分間プレインキュベートした（試験化合物につき３つの試験管；同一３検体）。試験化合物（最終５μＭ）を各試験管へ加えて反応を開始させ、穏やかに振り混ぜて混合した後で、３７℃でインキュベートした。ｔ＝０および２時間で、各インキュベーション試験管より２５０μＬの試料を取り出し、１ｍＬの氷冷アセトニトリル（＋０．０５μＭレセルピン）を含有する分離用１２ｘ７５ｍｍガラス試験管へ移した。試料を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、タンパク質と塩を沈殿させた（ベックマン Ａｌｌｅｇｒａ ６ＫＲ，Ｓ／Ｎ ＡＬＫ９８Ｄ０６，＃６３４）。上清を新しい１２ｘ７５ｍｍガラス試験管へ移し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ遠心分離真空エバポレーターにより蒸発させた。２００μＬの０．１％ギ酸／アセトニトリル（９０／１０）中で試料を復元し、激しく撹拌して溶かした。次いで、この試料を分離用ポリプロピレンミクロ遠心分離管へ移し、１４０００ｘｇで１０分間遠心分離した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｍｉｃｒｏ １４，Ｓ／Ｎ Ｍ００１７５８０）。各時点（０および２時間）での各同一３検体（＃１〜３）について、各試験化合物のアリコート試料を、以下に記載するＬＣ−ＭＳ分析用の単回ＨＰＬＣバイアルインサート（全部で６つの試料）へ合わせた。
【００７１】
合わせた化合物試料を、ヒューレット・パッカード ＨＰ１１００ ダイオードアレイＨＰＬＣとポジティブエレクトロスプレーＳＩＲモードで作動するＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ三連四重極型質量分析計からなる（各試験化合物の分子イオンを特異的に走査するようにプログラムされている）、ＬＣ−ＭＳシステムへ注入した。各試験化合物のピークを各時点で積分した。各化合物について、各時点でのピーク面積（ｎ＝３）を平均化して、この２時間での平均ピーク面積を０時間の時点での平均ピーク面積で割って、２時間で残存する試験化合物のパーセントを得た。
【００７２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＵＶＥＣアポトーシスアッセイ
ＥＬＩＳＡによるアポトーシスの定量：細胞溶解液中の細胞質ヒストン会合ＤＮＡ断片を定量するＣｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｌｉｓａ ＰＬＵＳ（カタログ番号：１７７５４２５，ロッシュ・バイオケミカルズ、マンハイム、ドイツ）を使用して、ＨＵＶＥＣ細胞のアポトーシスを測定した。製造業者の手引きに若干の変更を加えて、この手順を実施した。簡潔に言えば、飢餓状態のＨＵＶＥＣ細胞をＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下に様々な濃度の化合物Ａで処理した。この細胞のサイトゾル分画を様々な時点で採取し、マイクロタイタープレートへコートした一次抗ヒストンｍＡｂとペルオキシダーゼへ結合した二次抗ＤＮＡ ｍＡｂを用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにおける抗原の供給源として使用した。発色性ペルオキシダーゼ基質を加えて、分光光度計で４０５ｎｍでの吸光度（基準波長：４９０ｎｍ）を測定することによって、アポトーシス細胞の数を定量した。
【００７３】
ＴＵＮＥＬによるアポトーシスの可視化：ＴｄＴ仲介性ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）技術を使用して、アポトーシス細胞のｉｎ ｓｉｔｕ検出を行った。簡潔に言えば、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋチャンバ・スライドにおいて増殖させたＨＵＶＥＣ細胞をＯ／Ｎ飢餓させてから、様々な濃度の化合物Ａで６時間処理した。次いで、製造業者の手引きに従って、この細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定して、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過性にして、ターミナルトランスフェラーゼとフルオレセイン−ｄＵＴＰ（Ｄｅａｄｅｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ系、プロメガ、カタログ番号 Ｇ３２５０）が含まれるヌクレオチドの混合物において１時間インキュベートした。この細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で対比染色した。陽性染色されたフルオレセインおよびＰＩ標識細胞を可視化して、蛍光顕微鏡によって写真撮影した。
【００７４】
ＰＤＧＦ仲介性細胞遊走アッセイ：このアッセイには、Ｕ８７ＭＧ細胞を使用した。６ウェルプレートを０．５ｎｇ／ｍＬ フィブロネクチンとともに一晩プレインキュベートする。翌日、Ｕ８７ＭＧ細胞を各ウェルにおいてプレート培養して、集密まで増殖させる。この細胞を、０．１％ ＦＢＳを含有する飢餓培地とともに一晩インキュベートした。ピペット先端を使用して約１ｃｍのスクラッチをつくり、細胞を飢餓培地で洗浄した。次いで、プレートを０．５ｎｇ／ｍＬ フィブロネクチンとともに１時間インキュベートしてから、再び洗浄した。１００ｎｇ／ＬＩ ｒｈＰＤＧＦ ＢＢと化合物Ａを飢餓培地中に含有する実験培地を導入した。０時間と１５時間の間で細胞を写真撮影して、遊走を可視化した。
【００７５】
細胞ＶＥＧＦＲ−２および下流分子リン酸化アッセイ：ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を亜集密まで培養して、飢餓培地（Ｆ１２Ｋ＋０．１％ ＦＢＳ）において１８時間インキュベートした。この細胞へ２．３％アルブミンおよび１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４（シグマ）の存在下に化合物Ａを加えた。４５分後、この培養物へＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で加えた。５分後、この細胞を冷ＰＢＳで濯ぎ、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，１％ ＮＰ４０，１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼ阻害剤カクテル）で溶解させた。溶解液由来の１ミリグラムの総タンパク質を、抗Ｆｌｋ−１ Ｃ−１１５８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用して免疫沈殿させた。この抗体複合体をプロテインＡビーズへコンジュゲートして、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウェスタン分析を実施した。抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と抗Ｆｌｋ−１ Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）によって、それぞれリン酸化ＶＥＧＦＲ−２とそのタンパク質を検出した。ｅＮＯＳおよびＡｋｔについては、細胞を上記と同じように処理した。全量３０〜４０μｇのタンパク質を使用して、ウェスタン分析を実施した。ｅＮＯＳおよびＡｋｔリン酸化は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ １１７７，＃９５７１）またはＰｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ ４７３，＃９２７１）の抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって探知した。タンパク質は、ＮＯＳ３ Ｃ−２０（ｓｃ−６５４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはＡｋｔ 抗体＃９２７２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用することによって評価した。ＨＲＰ連結抗ウサギＩｇＧを二次抗体として使用した。化学発光基質のＳｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ（ピアス）によってすべてのブロットを可視化した。Ａｌｐｈａ ＩｎｎｏｔｅｃｈからのＡｌｐｈａ Ｉｍａｇｅｒ ８８００を使用して、シグナルを定量した。
【００７６】
ウォッシュアウト実験：ＨＵＶＥＣ細胞を上記に記載のように処理した。化合物Ａ（１０ｎＭ）と４５分間のインキュベーションと、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で５分間の刺激の後で、上清を除去し、洗浄し、ＶＥＧＦおよびＮａ３ＶＯ４を含有する飢餓培地に置き換えた。この細胞を所望される長さの時間の間さらにインキュベートした後で、溶解させ、リン酸化および全体のＶＥＧＦＲ−２のために免疫沈殿およびウェスタンを使用して処理した（上記参照）。別の実験において、細胞を上記のように全体の時間の長さの間ＶＥＧＦで処理し、所望される時点でのＶＥＧＦＲ−２リン酸化および全ＶＥＧＦＲ−２を同様に評価した。ウォッシュアウトの間のシグナルをデンシトメトリーによって定量した。各実験からの最大刺激（５分）の強度を互いに正規化して、ホスホＶＥＧＦＲ−２の各時点での強度を２つの実験間で比較して、それにより、非処理であるがＶＥＧＦ刺激した細胞に対して、ＶＥＧＦＲ−２リン酸化の回復を決定した。
【００７７】
腫瘍モデル：ヒトＭＶ５２２（結腸癌）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）モデルでは、無胸腺マウス（ｎ＝８〜１２）に５ｘ１０６細胞／部位を移植（ｓ．ｃ．）した。マウスのルイス肺癌モデルでは、腫瘍断片（１〜２ｍｍ２）をＢ６Ｄ２Ｆ１マウスの右脇腹にトロカール移植した。投薬は、通常７日目（ＭＶ５２２）、または平均腫瘍サイズが１５０〜２００ｍｍ３に達するとき（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に開始した。
【００７８】
式１の化合物は、０．５％ ＣＭＣ／Ｈ２Ｏ中に製剤化して、ＰＯ、ＢＩＤ投与した。ドセタキセルは、７％ ＥｔＯＨ／３％ ポリソルベート／９０％ Ｈ２Ｏ中に製剤化して、週ごとに、静脈内で投薬した。通常、処理は３〜４週間続いた。腫瘍の幾何学的な長さおよび幅を、電子カリパスを使用して週３回測定した。腫瘍体積は、０．４ｘ［長さｘ（幅）２］の積として算出した。データは、平均±ＳＥＭとして報告した。試験の最後に、腫瘍と組織を分析用に切除、秤量、および採取した。薬物濃度の分析用に血漿を採取した。
【００７９】
結果を表１〜３に示す。
表１．化合物１の効力および選択性
【００８０】
【表１】
【００８１】
スクリーニングしたが、Ｋｉ計算の限度を超えた他の酵素は、ｃＭｅｔ、ＬＣＫ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＡＫ、Ｐｙｋ２、ＩＲＬ、ＢＴＫ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＬＫ、およびＣｈｋ１である。
【００８２】
表２．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌モデルにおける化合物１およびドセタキセルの同時投与用の試験設計
【００８３】
【表２】
【００８４】
表３．ドセタキセルおよび化合物１の組合せ療法は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片モデルにおいてより大きな抗腫瘍活性をもたらした。
【００８５】
【表３】
【００８６】
上記の組合せ群は、完全および部分的な腫瘍退縮の増加した出現率を明示する。これらの薬剤を組み合わせるとき、腫瘍増殖率は、より大きな度合いまで低下した。この組合せ治療は、単剤単独と同じくらい十分に忍容された。
【００８７】
実施例２
式１の化合物、６−［２−（メチルカルバモイル）フェニルスルファニル］−３−Ｅ−［２−（ピリジン−２−イル）エテニル］インダゾールを固形腫瘍の患者へ様々な用量で投与した。式１の化合物を経口の錠剤形において、ＢＩＤまたはＱＤのスケジュールで使用して、３０名（男性１３名、女性１７名）の患者を治療した。サイクルは、それぞれ２８日であった。具体的な腫瘍の診断は、乳房（１１）、甲状腺（５）、腎細胞（５）、肺（４）および、その他（５）であった。液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって、薬物動態データを測定した。このサイクルの１５日目に、投与後０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、および１２時間の時点で血液試料を採取した。
【００８８】
薬物動態結果（１５日目の平均値）を表４に示す。患者は、他に述べなければ、絶食ではなかった。括弧内の数字は、百分率として表される変動係数である。この表において、Ｃｍａｘは、観測される式１の化合物の最高血漿濃度であり、ＡＵＣ（０−２４）は、２４時間のＡＵＣ血漿濃度であり、Ｔ１／２は、濃度対時間のプロットより決定される半減期である。見出し項目の「ＰＫの患者数」は、薬物動態データを入手した患者の数を示す。
【００８９】
表４
【００９０】
【表４】
【００９１】
さらに、第一コホートの患者（ｎ＝６）は、１０ｍｇ ＱＤ〜３０ｍｇ ＢＩＤに及ぶ個別化された用量を受けた（ＰＫ示さず）。絶食状態では、摂食状態に比べて、血漿曝露がより高く（約４９％）、患者内の変動は抑えられた。現時点での最大耐薬量（ＭＴＤ）は、絶食状態で５ｍｇ ＢＩＤであると決定した。ＭＴＤより高い用量での投薬制限毒性（ＤＬＴ）は、高血圧（ＨＴＮ）、発作、肝機能検査値の上昇、膵炎、無呼吸、および胃炎であった。さらに、応答した２名のＮＳＣＬＣ患者は、致命的な喀血を起こし、１名は３週後にこの化合物での治療を中止した。非投薬制限性のタンパク尿も観察された。ＭＴＤ以下の用量では、１名の患者で、グレード２の胃炎へＤＬＴが限定された。７／１４名の患者で非投薬制限性のＨＴＮが観察され、慣用の降圧用医薬品により管理した。ＲＥＣＩＳＴ判定基準による２つの永続性のある一部応答が観察され（腎細胞と上顎洞の腺嚢腫において）、この十分に前処置した集団のうち５名の患者で、安定した疾患が４ヶ月以上（４〜１３＋ヶ月の範囲）続いた。ｄｃｅＭＲＩを使用して、２１名の患者で予備分析を実施して、式１の化合物により誘発される血管系への効果をベースラインと２、２８、および５６日目で測定した。平均Ｋｔｒａｎｓの百分率変化（Ｐ．Ｓ．Ｔｏｆｔｓ，Ｇ．Ｂｒｉｘ，Ｄ．Ｌ．Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｅｖｅｌｈｏｃｈ，Ｅ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｖ．Ｋｎｏｐｐ，Ｈ．Ｂ．Ｗ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｔ．Ｌｅｅ，Ｎ．Ａ．Ｍａｙｒ，Ｇ．Ｊ．Ｍ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｐｏｒｔ，Ｊ．ＴａｙｌｏｒおよびＲ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓｋｏｆｆ，「分散可能トレーサーのダイナミック対比増強Ｔ１重み付けＭＲＩからの動態パラメータの評価：量および記号の標準化」（Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｃｏｎｔｒａｓｔ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｔ１−Ｗｅｉｇｈｔｅｄ ＭＲＩ ｏｆ ａ Ｄｉｆｆｕｓａｂｌｅ Ｔｒａｃｅｒ：Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｓ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，１０：２２３−２３２（１９９９）とコントラスト強度Ｘ時間曲線下の初期面積（ＩＡＵＣ）をそれぞれの指標腫瘍（ｎ＝１〜４／患者）につき計算した。腫瘍血管系の応答は、ベースライン変数値が２日目までに５０％以上減少するものと定義した。腫瘍血管系応答の急激な（２日目）の減少（ＫｔｒａｎｓおよびＩＡＵＣの５０％以上の減少）が１８名の評価可能な患者の６名で観察され、１１／１８名で、ＫｔｒａｎｓおよびＩＡＵＣの両方の４０％以上の減少が明示された。スキャンに伴う技術課題により、３／２１の画像セットが評価可能でなかった。本実施例は、式１の化合物が、臨床応答と急性の腫瘍血管系変化により顕現されるように、きわめて有効な薬剤であることを示す。
【００９２】
実施例３
３０ｍｇ遊離塩基／ｋｇ用量の式１の［１４Ｃ］標識化合物をインタクトまたは胆管カニューレ挿入ビーグル犬へ経口投与した後で、広汎な代謝を観察した。生物変換経路には、酸素化（モノまたはジ）、グルクロニド化、グルコシル化、および酸素化に続く硫酸化またはグルコシル化が含まれた。図１は、同定された代謝産物を示す。血漿中では、Ｍ１２（Ｎ−オキシド）が検出可能な唯一の代謝産物である。尿中では、Ｍ５（デピリジニルカルボン酸）が主要な代謝産物である。主要な胆汁代謝産物には、Ｍ８（硫酸塩）とＭ１２が含まれる。主要な糞中代謝産物Ｍ１の化学構造は、不明のままである。
【００９３】
本化合物の単回経口投薬に続く、［１４Ｃ］由来放射活性のビーグル犬における排泄パターンは、雄と雌で同様であり、放射活性は、主に糞より排泄された。インタクトな雌の糞中８０．９％と尿中７．０％の回収率と比較して、インタクトな雄の平均回収率は、糞中８５．５％と尿中５．３％であった。胆管カニューレ挿入した雄イヌは、比較的少ない分量の放射活性を胆汁に排泄し（８．３％の回収率）、さらなる放射活性は、糞（５２．７％）と尿（１１．３％）に回収された。胆管カニューレを挿入したイヌからの尿および胆汁の放射活性を合わせると、投与した放射活性のほぼ２０％が胃腸吸収を受けたことを示唆する。すべての試料の全体平均回収率は、インタクトな雄と雌についてそれぞれ９２．４％と９２．６％、胆管カニューレ挿入した雄で８９．６％であった。放射ＨＰＬＣ検出器（β−ＲＡＭ）とインライン共役したＨＰＣＬと、エレクトロスプレー（ＥＳＩ）および大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）供給源のＭＳ検出をポジティブまたはネガティブ形式で使用して、すべての代謝産物のプロファイリングおよび構造解明を実施した。
【００９４】
実施例４
式１の化合物は、ＣＤ−１マウスにおいて、［１４Ｃ］標識化合物の単回経口投与に続き、広汎な代謝を受ける。低い百分率の未変化薬物が尿および糞中に回収され、多様な第Ｉ相および第ＩＩ相の代謝産物が観察された。生物変換経路には、酸素化（モノまたはジ）、グルクロニド化、グルコシル化、および酸素化に続くグルクロニド化またはグルコシル化のいずれかが含まれた。同定された代謝産物を図２に示す。血漿中では、未変化薬物とＭ１２（Ｎ−オキシド）が２つの主要な成分を代表した。Ｍ７（グルクロニド）は、尿と糞の両方で最も顕著な代謝産物を代表した。
【００９５】
５０ｍｇ遊離塩基／ｋｇ用量の［１４Ｃ］ＡＧ−０１３７３６を雄性ＣＤ−１マウスへ単回経口投与後、［１４Ｃ］由来放射活性の大部分が糞中で回収された。投薬後４８時間での放射活性の平均（ｎ＝２）回収率（用量の％）は、糞中６５．８％と尿中１２．７％であった。排泄物中の放射活性の消失速度は速やかで、ほぼ７２％の用量が投薬後２４時間以内に回収された。ＬＣ−ＲＡＭ−ＭＳ法を使用して、代謝産物の放射活性プロファイリングと構造特性決定を実施した。
【００９６】
図１および２に示す代謝産物に加えて、他の既知の代謝産物には、式１ａに示す活性ｄｅｓ−メチル代謝産物が含まれる。
【００９７】
【化４】
【００９８】
実施例５
免疫組織化学を使用して、腫瘍微小血管密度（ＭＶＤ）を測定することによって、血管新生を評価した。凍結した腫瘍切片を血管表面マーカーのＣＤ−３１用に染色し、組織切片の数領域中の血管の量をマニュアルで定量した。種々の試験は、式１の化合物の２〜３週のＰＯ ＢＩＤ投与が、対照腫瘍と比較して、処理した腫瘍中の血管の数を７０％低下させることを示した。処理後の微小血管密度の減少は、ＬＬＣ、ＭＶ５２２、およびＭ２４ｍｅｔが含まれる、使用したすべての腫瘍モデルで観察された。ＬＬＣ腫瘍モデルでは、浸透Ａｌｚｅｔポンプを介して連続的に送達するとき、式１の化合物は、有意な増殖阻害をもたらした。３回の試験からのデータは、ＬＬＣモデルにおけるこのクラスの薬剤により達成可能である最大の腫瘍増殖阻害が７８％であることを示した。５５±１７ｎｇ／ｍＬ（Ｎ＝３）ほどの低さの血漿濃度では、９０％の最大増殖阻害が達成された。この濃度を生物学的活性濃度（ＢＡＣ）と名付けた。５０％最大増殖阻害は、２８±１１ｎｇ／ｍＬ（Ｎ＝３）の血漿濃度と関連した。この濃度を最小有効濃度（ＭＥＣ）と名付けた。１つの試験群で、本化合物の連続注入により産生される７０％のＭＧＩは、５７４ｎｇ・時間／ｍＬのＡＵＣ（０−２４）と関連したが、同じ試験において、ＰＯ ＢＩＤ投薬後の７２０ｎｇ・時間／ｍＬのＡＵＣ（０−２４）は、４０％の最大増殖阻害（ＭＧＩ）を生じた。これらの結果は、このモデルにおいて見られる抗腫瘍効力がトラフ（谷）濃度により推進されること、そしてマウスでは、最大抗腫瘍効力をもたらすのに、本化合物の連続した低濃度が十分であり得ることを示唆する。
【００９９】
式１の化合物は、ヒト乳癌異種移植片モデル、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において単剤として有効であった。このモデルにおける式１の化合物とドセタキセルの組合せを用いた効力試験に備えて、ナイーブなヌードマウスで予備試験を行って、ＰＫおよび耐性に対する潜在的な薬物−薬物相互作用の効果を決定した。１５または３０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル、週１回３週間ＩＶ投与の後で、対照と比べた体重の減少（それぞれ、７％と１１％）をドセタキセル処理動物で確認した。ドセタキセル単独で処理した動物と、ドセタキセルと式１の化合物（３０ｍｇ／ｋｇ／日、１６日間；ＰＯ）の組合せを与えたものとの間では、体重の差異を認めなかった。ドセタキセル投与は、式１の化合物のＡＵＣに影響を及ぼさなかったが、ＡＧ−０１３７３６のＣｍａｘ値は、式１の化合物単独と比べて、組合せ群において有意に低下した。
【０１００】
選択した組織（肝臓、腎臓、心臓、脾臓、胃、小腸および大腸、卵巣、胸骨、関節）の組織学的検査は、この試験において単剤としての式１の化合物で処理したマウスにおける標的臓器効果を明らかにしなかった。ドセタキセル処理マウスに認められた変化には、卵胞の壊死とごく軽症〜軽症の骨髄低細胞性が含まれた。式１の化合物とドセタキセルの組合せ治療は、卵巣に対するドセタキセルの効果を悪化させなかったが、式１の化合物／ドセタキセル組合せを与えた動物において骨髄低細胞性の強度増加（ごく軽症〜中等症）を認めた。さらに、組合せで処理した動物においては、低細胞性の強度増加の二次効果と見られる、骨髄出血が観察された。
【０１０１】
式１の化合物とドセタキセルをＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍モデルにおける効力評価のために組み合わせた。式１の化合物単独（２５、５、および１ｍｇ／ｋｇ，ＰＯ，ＢＩＤ，３週間投与）は、用量依存性の腫瘍増殖阻害をもたらした。ドセタキセル単独（ＩＶ、週ごと）２０および１０ｍｇ／ｋｇも有効であった（しかし、２ｍｇ／ｋｇは無効であった）。式１の化合物とドセタキセルの間には、有益な療法上の相互作用があるように見られた。この利益は、これらの薬剤を高用量および中用量の両方で組み合わせるときにより明らかであった。高用量および中用量の組合せアームでの部分退縮（腫瘍サイズの１６％〜９７％の低下）および完全応答の出現率は、個々の薬剤単独の同じ用量での群の出現率よりずっと大きかった。この試験の限られた群と比較的短い時間フレームのために、上記のことは決定的な知見ではない。式１の化合物は、すべての用量で十分に耐えられた。高用量の組合せ群（２５ｍｇ／ｋｇの化合物１と２０ｍｇ／ｋｇのドセタキセル）では、他のすべての群と比べて、化学療法剤の第三回目の投薬後に、平均体重の３％〜７％の低下があった。薬物動態分析は、式１の化合物のＡＵＣ値がドセタキセルの存在下で影響を受けないこと、しかしＣｍａｘ値は、式１の化合物単独と比較して、組合せ群で有意に低下することを明示した。
【０１０２】
ドセタキセルとの組合せにおける式１の化合物の抗腫瘍効果をＬＬＣモデルにおいて検討した。ＬＬＣモデルは、ドセタキセルに対してきわめて抵抗性である。その細胞傷害剤では、報告されているＭＴＤ（３０ｍｇ／ｋｇ，週ごとに投薬、ｉｖ）で腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）がほとんど見られなかった（ＴＧＤ＝３．２日）。すべてのマウスが大きな原発腫瘍により実験の２８日以内に安楽死した。対照的に、式１の化合物単剤は、用量依存性で統計学的に有意なＴＧＤをもたらした（１０ｍｇ／ｋｇで１３．４日、３０ｍｇ／ｋｇで１５．４日、ＰＯ，ＢＩＤ）。しかしながら、この薬剤は、遅延させただけで、肺への転移を止めることはなかった。低用量組合せ群（ＴＧＤ＝１５．２日）ではなく、高用量組合せ群のＴＧＤ（２０．４日）は、単剤単独のいずれよりも統計学的に異なっていた（それぞれ、Ｐ＝０．００７９およびＰ＝０．２５４）。高用量組合せ群ではより多くの動物（３／１０）が客観的なエンドポイントに達したが、低用量組合せ群では達しなかった。結論として、式１の化合物とドセタキセルの高用量組合せ療法は、いずれの単独療法単独よりも大きい原発腫瘍増殖および転移の遅延をもたらす可能性があるが、完全な治癒をもたらすわけではない。
【０１０３】
ＭＶ５２２腫瘍モデルを使用する１つの試験は、式１の化合物の１日１回（ＱＤ）６０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ投薬が３０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ，ＢＩＤと同様の腫瘍増殖阻害をもたらす（ｐ＝０．１５４）ことを明示した。さらに、抗腫瘍効果は、３０ｍｇ／ｋｇで連続５日間ＰＯ，ＢＩＤ投薬後に２日間休薬するとき、同じ用量濃度を使用して毎日ＰＯ，ＢＩＤ投薬することと比べて低下するようには見えなかった（ｐ＝０．２２３）。これらの結果は、この非臨床腫瘍モデルにおいて、式１の化合物をＱＤで投与しても、またはある種の臨時投薬スケジュールで投与しても、有意な抗腫瘍効果を達成することを期待してよいことを示唆する。
【０１０４】
ＭＶ５２２異種移植片モデルにおいて抗腫瘍効果をもたらすのに必要とされる受容体阻害の時間量と式１の化合物の濃度について検討した。この結果は、ＰＯ投薬（ＱＤまたはＢＩＤ）では、５０％以上の抗腫瘍効果のためには、ほぼ２４時間毎日ＥＣ５０（５ｎｇ／ｍＬ）より高く曝露することが必要であることを示した。９０％の腫瘍増殖阻害を達成するためには、４０〜６０ｎｇ／ｍＬ以上の血漿濃度に毎日少なくとも４時間曝露することが必要であった。上記の閾値を超えた曝露は、さらなる効果を保証しなかった。ＢＩＤまたはＱＤ群のいずれでも、同様の体重損失があり、いずれも５％未満であった。従って、適正な用量と曝露時間があれば、ＱＤ処方は、ＢＩＤ処方と同じくらい有効であるかもしれない。
【０１０５】
Ａｌｚｅｔポンプを介した連続曝露は、規則的な定期投薬と比べて、式１の化合物によるより大きな抗腫瘍効果をもたらした。このポンプによる１０ｍｇ／ｍＬでの送達は、３０ｎｇ／ｍＬの一定した平均全身曝露をもたらし、腫瘍の静止状態を生じた。対照的に、予測ＥＣ９０に優る式１の化合物の血漿濃度を生じる、飽和量（ＰＯ，ＢＩＤ）では、腫瘍増殖遅延をもたらすことができただけである。従って、式１の化合物の連続全身曝露は、腫瘍を治療するのに、１日２回の経口投薬処方より有効であると思われた。
【０１０６】
間欠性の投薬処方を使用する式１の化合物の抗腫瘍効果も試験した。治療群は、以下の通りであった：担体の連日投薬、担体の間欠投薬、３０ｍｇ／ｋｇ（ＢＩＤ）の連日投薬、および３０ｍｇ／ｋｇの間欠投薬。間欠投薬のスケジュールは、以下の通りであった：サイクル１（１２〜１８日目に投薬、１９〜２８日目に休薬）、およびサイクル２（２９〜３６日目に投薬、３７〜４４日目に休薬）。平均腫瘍サイズが２５０ｍｍ３になったときに投薬を開始し；いずれにもＡＧ−０１３７３６（ＰＯ，ＢＩＤ）を与えた。全体的に見て、間欠および連日のＢＩＤ投薬の間には有意差があり、連続した連日投薬処方は、増殖遅延をもたらすのにより有効であった。間欠投薬された薬物群では、投薬を中止して３〜４日以内に腫瘍が通常の増殖速度を再び獲得した。しかしながら、サイクル２投薬の２日以内には、腫瘍増殖阻害が再開した。予測されるように、どの群でも退縮は見られなかった。
【０１０７】
具体的で好ましい態様を参照にして本発明を例示したが、当業者は、定型的な実験と本発明の実践により、種々の変更および改良がなし得ることを理解されよう。従って、本発明は、上記の記載によって限定されず、付帯の特許請求項とその同等物により規定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図１は、１４Ｃ標識化合物の単回経口投薬に続く、イヌにおいて同定される式１の化合物の代謝産物を示す。
【図２】図２は、１４Ｃ標識化合物の単回経口投薬に続く、マウスにおいて同定される式１の化合物の代謝産物を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物への投与用の剤形であって、式１：
【化１】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を、哺乳動物への投与後に２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬの式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で含んでなる、前記剤形。
【請求項２】
２４時間ＡＵＣ血漿値が１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬである、請求項１の剤形。
【請求項３】
経口剤形である、請求項１の剤形。
【請求項４】
式１：
【化２】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を０．５〜３０ｍｇの量で含んでなる剤形。
【請求項５】
量が２〜１０ｍｇである、請求項４の剤形。
【請求項６】
経口剤形である、請求項４の剤形。
【請求項７】
異常な細胞増殖を哺乳動物において治療する方法であって、請求項１〜６のいずれかの剤形を哺乳動物へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項８】
剤形を経口で投与する、請求項７の方法。
【請求項９】
剤形を１日につき少なくとも１回の投与頻度で投与する、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
剤形を１日につき少なくとも２回の投与頻度で投与する、請求項７または８の方法。
【請求項１１】
哺乳動物が、投与の工程前少なくとも２時間、投与の工程後少なくとも２時間、または投与の工程の前後ともに少なくとも２時間絶食する、請求項７〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
異常な細胞増殖が癌である、請求項７〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
癌が、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、およびこれらの組合せより選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗体、細胞傷害剤、抗ホルモン剤、抗アンドロゲン剤、およびこれらの混合物からなる群より選択される抗腫瘍剤を同時投与することをさらに含む、請求項７〜１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
抗腫瘍剤がドセタキセルである、請求項１４の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物への投与用の剤形であって、式１：
【化１】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を、哺乳動物への投与後に２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬの式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で含んでなる、前記剤形。
【請求項２】
２４時間ＡＵＣ血漿値が１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬである、請求項１の剤形。
【請求項３】
経口剤形である、請求項１の剤形。
【請求項４】
式１：
【化２】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を０．５〜３０ｍｇの量で含んでなる剤形。
【請求項５】
量が２〜１０ｍｇである、請求項４の剤形。
【請求項６】
経口剤形である、請求項４の剤形。
【請求項７】
異常な細胞増殖を哺乳動物において治療するための、請求項１〜６のいずれかの剤形。
【請求項８】
剤形を経口で投与する、請求項７の剤形。
【請求項９】
剤形を１日につき少なくとも１回の投与頻度で投与する、請求項７または８の剤形。
【請求項１０】
剤形を１日につき少なくとも２回の投与頻度で投与する、請求項７または８の剤形。
【請求項１１】
哺乳動物が、投与の工程前少なくとも２時間、投与の工程後少なくとも２時間、または投与の工程の前後ともに少なくとも２時間絶食する、請求項７〜１０のいずれかの剤形。
【請求項１２】
異常な細胞増殖が癌である、請求項７〜１１のいずれかの剤形。
【請求項１３】
癌が、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、およびこれらの組合せより選択される、請求項１２の剤形。
【請求項１４】
有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗体、細胞傷害剤、抗ホルモン剤、抗アンドロゲン剤、およびこれらの混合物からなる群より選択される抗腫瘍剤を同時投与することを特徴とする、請求項７〜１３のいずれかの剤形。
【請求項１５】
抗腫瘍剤がドセタキセルである、請求項１４の剤形。
【請求項１】
哺乳動物への投与用の剤形であって、式１：
【化１】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を、哺乳動物への投与後に２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬの式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で含んでなる、前記剤形。
【請求項２】
２４時間ＡＵＣ血漿値が１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬである、請求項１の剤形。
【請求項３】
経口剤形である、請求項１の剤形。
【請求項４】
式１：
【化２】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を０．５〜３０ｍｇの量で含んでなる剤形。
【請求項５】
量が２〜１０ｍｇである、請求項４の剤形。
【請求項６】
経口剤形である、請求項４の剤形。
【請求項７】
異常な細胞増殖を哺乳動物において治療する方法であって、請求項１〜６のいずれかの剤形を哺乳動物へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項８】
剤形を経口で投与する、請求項７の方法。
【請求項９】
剤形を１日につき少なくとも１回の投与頻度で投与する、請求項７または８の方法。
【請求項１０】
剤形を１日につき少なくとも２回の投与頻度で投与する、請求項７または８の方法。
【請求項１１】
哺乳動物が、投与の工程前少なくとも２時間、投与の工程後少なくとも２時間、または投与の工程の前後ともに少なくとも２時間絶食する、請求項７〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
異常な細胞増殖が癌である、請求項７〜１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
癌が、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、およびこれらの組合せより選択される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗体、細胞傷害剤、抗ホルモン剤、抗アンドロゲン剤、およびこれらの混合物からなる群より選択される抗腫瘍剤を同時投与することをさらに含む、請求項７〜１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
抗腫瘍剤がドセタキセルである、請求項１４の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物への投与用の剤形であって、式１：
【化１】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を、哺乳動物への投与後に２５〜４５００ｎｇ・時間／ｍＬの式１の化合物またはその活性代謝産物の２４時間ＡＵＣ血漿値を提供するのに有効な量で含んでなる、前記剤形。
【請求項２】
２４時間ＡＵＣ血漿値が１００〜８００ｎｇ・時間／ｍＬである、請求項１の剤形。
【請求項３】
経口剤形である、請求項１の剤形。
【請求項４】
式１：
【化２】
の化合物、その医薬的に許容される塩または溶媒和物、またはこれらの混合物を０．５〜３０ｍｇの量で含んでなる剤形。
【請求項５】
量が２〜１０ｍｇである、請求項４の剤形。
【請求項６】
経口剤形である、請求項４の剤形。
【請求項７】
異常な細胞増殖を哺乳動物において治療するための、請求項１〜６のいずれかの剤形。
【請求項８】
剤形を経口で投与する、請求項７の剤形。
【請求項９】
剤形を１日につき少なくとも１回の投与頻度で投与する、請求項７または８の剤形。
【請求項１０】
剤形を１日につき少なくとも２回の投与頻度で投与する、請求項７または８の剤形。
【請求項１１】
哺乳動物が、投与の工程前少なくとも２時間、投与の工程後少なくとも２時間、または投与の工程の前後ともに少なくとも２時間絶食する、請求項７〜１０のいずれかの剤形。
【請求項１２】
異常な細胞増殖が癌である、請求項７〜１１のいずれかの剤形。
【請求項１３】
癌が、肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、頭頚部癌、皮膚（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｎａｌ ｐｅｌｖｉｓ）、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、およびこれらの組合せより選択される、請求項１２の剤形。
【請求項１４】
有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、挿入抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗体、細胞傷害剤、抗ホルモン剤、抗アンドロゲン剤、およびこれらの混合物からなる群より選択される抗腫瘍剤を同時投与することを特徴とする、請求項７〜１３のいずれかの剤形。
【請求項１５】
抗腫瘍剤がドセタキセルである、請求項１４の剤形。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５２２０８７（Ｐ２００６−５２２０８７Ａ）
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６３７８（Ｐ２００６−５０６３７８）
【出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００８６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７１５２
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００８６７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７１５２
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５９３１４１９５３）ファイザー・インク (302)
【Ｆターム（参考）】
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