ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子、該遺伝子によりコードされるＡＭＶ逆転写酵素及び該遺伝子を用いるＡＭＶ逆転写酵素の製造方法
【課題】工業的規模で発現することが可能な、新規なトリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素遺伝子と、それを用いた該酵素の製造方法を提供する。
【解決手段】ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、特定の塩基配列からなるＤＮＡ、および該ＤＮＡのコードするＡＭＶ逆転写酵素ベータ。
【解決手段】ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、特定の塩基配列からなるＤＮＡ、および該ＤＮＡのコードするＡＭＶ逆転写酵素ベータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＡＭＶ逆転写酵素遺伝子及びそれを用いたＡＭＶ逆転写酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼであり、レトロウイルスの増殖に必須の因子として発見された。この酵素は一本鎖ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成（逆転写）する活性を有しており、ｃＤＮＡ合成等に必須な遺伝子工学試薬あるいは遺伝子診断用酵素として利用されている。
【０００３】
トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）に由来する逆転写酵素は、約６３ｋＤａの分子量を有するアルファ鎖及び約９５ｋＤａの分子量を有するベータ鎖からなるヘテロダイマーであり、ＡＳＬＶファミリーとして知られている。このアルファ鎖は、ベータ鎖のタンパク質分解性プロセシングにより形成される（非特許文献１）。この逆転写酵素は、所定のＲＴバリアントが大腸菌又は真核生物昆虫細胞において発現されるとの報告されており（特許文献１）、またシャペロンと共発現することで大腸菌において発現されると報告されているが（特許文献２）、工業的な利用の観点からはより大量の発現が必要とされている。
【０００４】
【特許文献１】特表２００２／５３４１２５号公報
【特許文献２】特開２００２−３１５５８４号公報
【非特許文献１】Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ Ｓ．Ｆ．Ｊ．，１９９３ ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明の目的は、工業的規模で発現（工業的規模でＡＭＶ酵素を製造）することすることが可能な新規なＡＭＶ逆転写酵素遺伝子と、それを用いたＡＭＶ逆転写酵素の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、大腸菌を用いた工業的規模での発現（製造）を可能ならしめるべくＡＭＶ逆転写酵素の遺伝子配列を見直し、大腸菌が容易に翻訳するコドンに対応するようにＤＮＡ配列を変換することにより前記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子であって、配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。
【０００７】
また本発明は、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体又はそれと実質的に相同なタンパク質であり、配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体又はそれと実質的に相同なタンパク質であり、配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質であり、配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の「ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子」とは、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子であり、その発現、即ちｍＲＮＡへの転写と転写されたｍＲＮＡの翻訳によってＡＭＶ逆転写酵素を製造し得るものである。なお天然のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、全長が２．６ｋベースで、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡである。この配列番号１記載の塩基配列を有するものはＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であるが、ＡＭＶ逆転写酵素にはベータ体よりも低分子のアルファ体が存在し、アルファ体遺伝子は、前記配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子の５’末端側約１．７ｋベースからなるＤＮＡ（配列番号２）である。なお、これら遺伝子がコードするタンパク質の機能構造は、従来公的のデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に収録されている。
【０００９】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のうち、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。そして配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。
【００１０】
ここで、「天然型コドンから大腸菌型コドンに変換された」とは、いずれの遺伝子においても、その転写により、ＡＭＶが天然に有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子から転写されるｍＲＮＡにおいて見いだされる大腸菌レアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）、すなわち大腸菌での使用頻度が低いコドンが、当該コドンがコードするアミノ酸を変更することなく大腸菌での使用頻度が高いコドンに置き換えられたｍＲＮＡを生成することを意味する。コドンの大腸菌における使用頻度の高低は、例えば公的データベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｋａｚｕｓａ.ｏｒ.ｊｐ/ｃｏｄｏｎ/）を参考にゲノム遺伝子の解析を行うことによって推測することができるが、具体的に、大腸菌における使用頻度の高いコドンとして、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ及びＣＧＡ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、グリシン（Ｇｌｙ）コドンのＧＧＡ、プロリン（Ｐｒｏ）コドンのＣＣＣを例示することができる。このように大腸菌で使用頻度の高いコドンに置き換えられたｍＲＮＡを転写するよう塩基配列中のコドンを変更することで、本発明の遺伝子は大腸菌を用いることにより、工業的規模で発現することが可能である。
【００１１】
コドンの変換は、当該コドンに対応する（当該コドンに転写される）ＤＮＡの塩基配列の部分（コドン）を変えることにより可能であるが、ＤＮＡの塩基配列の変換は、例えばＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法等の従来公知の変異導入法を利用して行うことができる。中でも、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組み合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，４３，２００２参照）がコドン変換のための特に好ましい方法として例示することができる。この方法は、アミノ酸配列から数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲにより合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を合成する方法である。
【００１２】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、前記した４種類のＤＮＡのほか、その一部が、その発現によってＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一な蛋白質であって、ＡＭＶ逆転写酵素を形成するアミノ酸が欠失し、ＡＭＶ逆転写酵素を形成するアミノ酸以外のアミノ酸が付加され、又は、ＡＭＶ逆転写酵素を形成する所定のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたＡＭＶ逆転写酵素様蛋白質をコードするＤＮＡ、また更には前記４種類のＤＮＡ又はＡＭＶ逆転写酵素様蛋白質をコードするＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ（以下、これらＤＮＡをまとめて前記４種類のＤＮＡに「実質的に相同なＤＮＡ」と記載することがある）を含む。なお、「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一な蛋白質」とは、具体的には、逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性又はＲＮａｓｅＨ活性というＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの主酵素活性のうち１つ以上がＡＭＶと同等以上である蛋白質をいう。例えば、前記した各遺伝子との間で、公知の配列比較アルゴリズムを用いて解析した場合に、又は、手法自体が公知である手動整列及び目視試験により測定し、最大対応で整列化させた場合に、それぞれの塩基配列の７５％以上、好ましくは８５％、より好ましくは９５％以上に同一性が見出される遺伝子が、その様な蛋白質をコードする遺伝子として例示できる。前記公知の解析方法として、例えば、解析局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ等，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２， ４８２，１９８１）、相同性整列化アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｍａｎ等，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，４８，４４３，１９７０）、類似性検索法（Ｐｅｒｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４，１９８８）等を例示できる。中でも、公知のＰｉｌｅｕｐ法やＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．，２１５，４０３，１９９０）が、本発明の実質的に相同なＤＮＡを規定する上で好ましい方法として例示できる。そして「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。
【００１３】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素は、前記したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を発現させることにより得られる蛋白質（ＡＭＶ逆転写酵素様蛋白質を含む）である。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の発現のためには従来公知の方法を使用することが可能であるが、かかる方法として例えば、本発明の遺伝子である前記ＤＮＡを適当な細胞に形質転換し、又は、プラスミドベクターに挿入して使用すれば良い。プラスミドベクターへの挿入は、そのプラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適当な位置とは、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定することが出来る。またプラスミドベクターに挿入する場合、例えばプロモータ機能を有するＤＮＡ配列を付加しても良い。大腸菌で機能するプロモータとして、例えばｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ又はＴ７プロモータ等を例示することができる。これらの中でも転写活性の調節が容易なｌａｃプロモータは、好適なプロモータである。
【００１４】
プラスミドベクターとしては形質転換する細胞内で安定に存在し、複製することができるものであれば特に制限はない。もっとも、本発明の遺伝子は、その塩基配列が大腸菌内で使用頻度の高いコドンに変換されているため、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られているｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系、広宿主域（Ｂｒｏａｄ−Ｈｏｓｔ−Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクター等の使用が好ましい。
【００１５】
宿主としては前記の通り、Ｋ１２系のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株に代表される大腸菌が好ましいが、変異処理した大腸菌変異株を使用することもできる。変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線又は放射線等の、従来公知の変異手段を用いる方法を使用できる。
【００１６】
以上に説明したプラスミドベクター等を公知の手法に従って大腸菌等に導入し、当該大腸菌を公知の手法に従って培養すればＡＭＶ逆転写酵素を製造することができる。プラスミドベクター等を大腸菌等に導入する方法としては、例えば、”Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，ｐ ．４６９−６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，や“Ｏｔｈｅｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ“，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，ｐ．３０５−６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を参照することができる。
【００１７】
大腸菌の培養方法としては、例えば必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地により培養する方法を例示できる。より具体的には、例えば、プラスミドベクターを含有した大腸菌のみを選択して培養するために、培地としてプラスミドベクターの構成を基にした選抜剤を含むものを使用することが例示できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターを使用する場合には、培地にアンピシリンを添加することを例示できる。また培地には、炭素、窒素及び無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加しても良い。更にグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を添加しても良い。培養温度は、例えば約２０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは約３０℃とすることが例示できる。ｐＨは約６．８から７．４、好ましくは７．０とすることが例示できる。
【００１８】
前記したｌａｃプロモータ等の誘導性のプロモータを用い、誘導によってＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を発現させる場合には、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度にまで培養を行い、しかる後に誘導の操作を行うことが好ましい。その目安としては、例えば、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０を示す増殖期間に誘導の操作を行い、引き続き培養するが例示できる。ｌａｃプロモータの誘導剤としてはＩＰＴＧを例示することができるが、使用するプロモータに応じて適宜選択して使用すれば良い。ｌａｃプロモータを使用する場合のＩＰＴＧの添加濃度は終濃度で約０．１から１．０ｍＭであれば良いが、好ましくは０．１５ｍＭである。
【００１９】
培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出する際には、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すれば良い。例えば大腸菌のようにＡＭＶ逆転写酵素が宿主内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出することができる。この段階では種々の蛋白質が混在しているが、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー等を単独又は組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素のみを抽出することができる。
【発明の効果】
【００２０】
ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の天然（ウイルス）型コドンを大腸菌型コドンに変換したことにより、大腸菌を宿主として使用することによって工業的規模で発現（工業的規模でＡＭＶ逆転写酵素を製造）することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。図中ＡＭＶｂｅｔａＥｃｏｌｉが大腸菌型コドンに変換したＤＮＡ配列の配列、ＡＭＶｂｅｔａが天然（ウィルス）型ＡＭＶベータ体の配列である。ＡＭＶアルファ体はその塩基番号１番から１７１６番目までである。
【図２】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図３】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図４】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図５】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図６】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図７】図７は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの構造を示す図である。
【図８】図８は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡの構造を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄの構造を示す図である。
【図１０】図１０は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄの構造を示す図である。
【図１１】図１１は、発現量の差を示す電気泳動像の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００２４】
実施例１ ＡＭＶ逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列の設計
配列番号１に記載したＡＭＶ逆転写酵素のアミノ酸配列に基づき、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法により、コドンを大腸菌型に変換した。コドンを変換したＤＮＡ配列と天然（ウィルス）型コドンをアライメントした結果を図１から図６に示す。図１から図６の通り、アミノ酸配列はそのままにＤＮＡの配列変換が行われ、そのＤＮＡ配列間の類似性は７４％であった。
【００２５】
実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列の作製
天然（ウィルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換したＤＮＡ配列を作製するために１２０種類のオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドを配列番号７から１２６に示す。
【００２６】
次いで、オリゴヌクレオチドから完全長のＡＭＶ逆転写酵素をコードするＤＮＡを作製するために、二段階のＰＣＲ反応を行った。一段階目のＰＣＲ反応の反応液は表１の通りであり、９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６２℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、次いで、７２℃、７分の第四ステップを行った。表１中のＤＮＡミックスは、１２０種類の合成した５０ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液である。
【００２７】
【表１】
第二段階目のＰＣＲ反応は、第一段階目のＰＣＲ反応の反応液を用いて、表２の反応液組成で行った。プライマーの配列は、配列番号７（５’―ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＧ―３’）と配列番号１２６（５’―ＴＴＡＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＴ―３’）のオリゴヌクレオチドを用いた。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００２８】
【表２】
次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入しＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。調製したプラスミドベクターは制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＢとした。
【００２９】
さらに、ｐＴｒｃＡＭＶＢを鋳型にＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。使用したＰＣＲプライマーの配列は、配列番号７（５’―ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＧ―３’）と配列番号１２７（５’―ＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＣＣ―３’）である。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００３０】
次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入しＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。調製したプラスミドベクターは制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＡとした。図７にｐＴｒｃＡＭＶＢ及び図８にｐＴｒｃＡＭＶＡの構造を示す。
【００３１】
ＰＣＲ法を用いて、プラスミド上にＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子を保有する大腸菌クローン（ＡＴＣＣ ３１９９０）からＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子を取り出した。使用したＰＣＲプライマーの配列は、配列番号１２８（５’― ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＣＧＣＴＣ―３’）と配列番号１２９（５’―ＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＴＣＡＴＣ―３’）である。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入し大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。プラスミドベクターを複製させた後、複製したプラスミドベクターについて制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄとした。
【００３２】
ＰＣＲ法を用いて、プラスミド上にＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子を保有する大腸菌クローン（ＡＴＣＣ ３１９９０）からＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子を取り出した。使用したＰＣＲプライマーの配列は、配列番号１２８（５’―ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＣＧＣＴＣ―３’）と配列番号１３０（５’―ＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＴＧＣＣ―３’）である。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００３３】
次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入しＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドベクターを複製させた後、複製したプラスミドベクターについて制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄとした。図９にｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ及び図１０にｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄの構造を示す。
実施例３ 配列の確認
実施例２において作製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ及びｐＴｒｃＡＭＶＡに挿入したＤＮＡの配列を、チェーンターミネータ法に基づく市販の試薬キット（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーには合成した１２０種類のオリゴヌクレオチドを適宜使用した。その結果、ｐＴｒｃＡＭＶＢ及びｐＴｒｃＡＭＶＡに挿入したＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００３４】
実施例４ ＡＭＶ逆転写酵素の発現誘導
プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢを用いて、５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地中でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラバイオ社）を形質転換した。３７℃で１８時間培養後、出現した任意のコロニーをピックアップし５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種した。３７℃で培養し、ＯＤ６６０ｎｍの値が約０．５になったところで０．１５ｍＭのＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を添加した。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢで形質転換した株をＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢとした。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡについても同様に操作し、形質転換株をＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡとした。
【００３５】
同様の方法でプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ及びプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄも形質転換を行い、それぞれＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄとした。
【００３６】
ＩＰＴＧ添加から適当な間隔で培養液をサンプリングし、それぞれの形質転換株から蛋白質溶液を調製した。調製は市販のキット（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ノバジェン社）により行い、調製した蛋白質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動像の結果を図１１に示す。図１１の通り、発現するタンパク質のアミノ酸配列は同一であるものの、宿主である大腸菌に合わせたコドンでは天然（ウィルス）型コドンに比べて有意に発現量を増加していた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＡＭＶ逆転写酵素遺伝子及びそれを用いたＡＭＶ逆転写酵素の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼであり、レトロウイルスの増殖に必須の因子として発見された。この酵素は一本鎖ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成（逆転写）する活性を有しており、ｃＤＮＡ合成等に必須な遺伝子工学試薬あるいは遺伝子診断用酵素として利用されている。
【０００３】
トリ骨髄芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）に由来する逆転写酵素は、約６３ｋＤａの分子量を有するアルファ鎖及び約９５ｋＤａの分子量を有するベータ鎖からなるヘテロダイマーであり、ＡＳＬＶファミリーとして知られている。このアルファ鎖は、ベータ鎖のタンパク質分解性プロセシングにより形成される（非特許文献１）。この逆転写酵素は、所定のＲＴバリアントが大腸菌又は真核生物昆虫細胞において発現されるとの報告されており（特許文献１）、またシャペロンと共発現することで大腸菌において発現されると報告されているが（特許文献２）、工業的な利用の観点からはより大量の発現が必要とされている。
【０００４】
【特許文献１】特表２００２／５３４１２５号公報
【特許文献２】特開２００２−３１５５８４号公報
【非特許文献１】Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ Ｓ．Ｆ．Ｊ．，１９９３ ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明の目的は、工業的規模で発現（工業的規模でＡＭＶ酵素を製造）することすることが可能な新規なＡＭＶ逆転写酵素遺伝子と、それを用いたＡＭＶ逆転写酵素の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、大腸菌を用いた工業的規模での発現（製造）を可能ならしめるべくＡＭＶ逆転写酵素の遺伝子配列を見直し、大腸菌が容易に翻訳するコドンに対応するようにＤＮＡ配列を変換することにより前記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子であって、配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。
【０００７】
また本発明は、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体又はそれと実質的に相同なタンパク質であり、配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体又はそれと実質的に相同なタンパク質であり、配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質であり、配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
本発明の「ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子」とは、ＡＭＶ逆転写酵素をコードする遺伝子であり、その発現、即ちｍＲＮＡへの転写と転写されたｍＲＮＡの翻訳によってＡＭＶ逆転写酵素を製造し得るものである。なお天然のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、全長が２．６ｋベースで、配列番号１記載の塩基配列を有するＤＮＡである。この配列番号１記載の塩基配列を有するものはＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であるが、ＡＭＶ逆転写酵素にはベータ体よりも低分子のアルファ体が存在し、アルファ体遺伝子は、前記配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子の５’末端側約１．７ｋベースからなるＤＮＡ（配列番号２）である。なお、これら遺伝子がコードするタンパク質の機能構造は、従来公的のデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に収録されている。
【０００９】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子のうち、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。そして配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡは、ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、その塩基配列（アミノ酸残基をコードするコドン）が天然（ウイルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換されたＤＮＡである。
【００１０】
ここで、「天然型コドンから大腸菌型コドンに変換された」とは、いずれの遺伝子においても、その転写により、ＡＭＶが天然に有するＡＭＶ逆転写酵素遺伝子から転写されるｍＲＮＡにおいて見いだされる大腸菌レアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ）、すなわち大腸菌での使用頻度が低いコドンが、当該コドンがコードするアミノ酸を変更することなく大腸菌での使用頻度が高いコドンに置き換えられたｍＲＮＡを生成することを意味する。コドンの大腸菌における使用頻度の高低は、例えば公的データベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｋａｚｕｓａ.ｏｒ.ｊｐ/ｃｏｄｏｎ/）を参考にゲノム遺伝子の解析を行うことによって推測することができるが、具体的に、大腸菌における使用頻度の高いコドンとして、アルギニン（Ａｒｇ）コドンのＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ及びＣＧＡ、イソロイシン（Ｉｌｅ）コドンのＡＵＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）コドンのＣＵＡ、グリシン（Ｇｌｙ）コドンのＧＧＡ、プロリン（Ｐｒｏ）コドンのＣＣＣを例示することができる。このように大腸菌で使用頻度の高いコドンに置き換えられたｍＲＮＡを転写するよう塩基配列中のコドンを変更することで、本発明の遺伝子は大腸菌を用いることにより、工業的規模で発現することが可能である。
【００１１】
コドンの変換は、当該コドンに対応する（当該コドンに転写される）ＤＮＡの塩基配列の部分（コドン）を変えることにより可能であるが、ＤＮＡの塩基配列の変換は、例えばＳｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法等の従来公知の変異導入法を利用して行うことができる。中でも、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組み合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，４３，２００２参照）がコドン変換のための特に好ましい方法として例示することができる。この方法は、アミノ酸配列から数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲにより合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を合成する方法である。
【００１２】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素遺伝子は、前記した４種類のＤＮＡのほか、その一部が、その発現によってＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一な蛋白質であって、ＡＭＶ逆転写酵素を形成するアミノ酸が欠失し、ＡＭＶ逆転写酵素を形成するアミノ酸以外のアミノ酸が付加され、又は、ＡＭＶ逆転写酵素を形成する所定のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたＡＭＶ逆転写酵素様蛋白質をコードするＤＮＡ、また更には前記４種類のＤＮＡ又はＡＭＶ逆転写酵素様蛋白質をコードするＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ（以下、これらＤＮＡをまとめて前記４種類のＤＮＡに「実質的に相同なＤＮＡ」と記載することがある）を含む。なお、「ＡＭＶ逆転写酵素と実質的に同一な蛋白質」とは、具体的には、逆転写酵素活性、ＤＮＡポリメラーゼ活性又はＲＮａｓｅＨ活性というＡＭＶ逆転写酵素が有する３つの主酵素活性のうち１つ以上がＡＭＶと同等以上である蛋白質をいう。例えば、前記した各遺伝子との間で、公知の配列比較アルゴリズムを用いて解析した場合に、又は、手法自体が公知である手動整列及び目視試験により測定し、最大対応で整列化させた場合に、それぞれの塩基配列の７５％以上、好ましくは８５％、より好ましくは９５％以上に同一性が見出される遺伝子が、その様な蛋白質をコードする遺伝子として例示できる。前記公知の解析方法として、例えば、解析局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ等，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２， ４８２，１９８１）、相同性整列化アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｍａｎ等，Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，４８，４４３，１９７０）、類似性検索法（Ｐｅｒｓｏｎ等，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４，１９８８）等を例示できる。中でも、公知のＰｉｌｅｕｐ法やＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．，２１５，４０３，１９９０）が、本発明の実質的に相同なＤＮＡを規定する上で好ましい方法として例示できる。そして「ストリンジェントな条件」とは、通常の状態と比較してＤＮＡ同士が二重鎖を形成し難い条件をいい、例えば、４２℃で５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム及び７５ｍＭクエン酸ナトリウムが共存する条件等が挙げられる。
【００１３】
本発明のＡＭＶ逆転写酵素は、前記したＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を発現させることにより得られる蛋白質（ＡＭＶ逆転写酵素様蛋白質を含む）である。ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の発現のためには従来公知の方法を使用することが可能であるが、かかる方法として例えば、本発明の遺伝子である前記ＤＮＡを適当な細胞に形質転換し、又は、プラスミドベクターに挿入して使用すれば良い。プラスミドベクターへの挿入は、そのプラスミドベクターの適当な位置に遺伝子工学的に挿入すればよい。ここでいう適当な位置とは、プラスミドベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、あるいは伝達性に関わる領域を破壊しない範囲で自由に決定することが出来る。またプラスミドベクターに挿入する場合、例えばプロモータ機能を有するＤＮＡ配列を付加しても良い。大腸菌で機能するプロモータとして、例えばｌａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ又はＴ７プロモータ等を例示することができる。これらの中でも転写活性の調節が容易なｌａｃプロモータは、好適なプロモータである。
【００１４】
プラスミドベクターとしては形質転換する細胞内で安定に存在し、複製することができるものであれば特に制限はない。もっとも、本発明の遺伝子は、その塩基配列が大腸菌内で使用頻度の高いコドンに変換されているため、大腸菌内で安定に存在し複製できるプラスミドベクターとして知られているｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＥＴ系、広宿主域（Ｂｒｏａｄ−Ｈｏｓｔ−Ｒａｎｇｅ）プラスミドベクター等の使用が好ましい。
【００１５】
宿主としては前記の通り、Ｋ１２系のＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株に代表される大腸菌が好ましいが、変異処理した大腸菌変異株を使用することもできる。変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線又は放射線等の、従来公知の変異手段を用いる方法を使用できる。
【００１６】
以上に説明したプラスミドベクター等を公知の手法に従って大腸菌等に導入し、当該大腸菌を公知の手法に従って培養すればＡＭＶ逆転写酵素を製造することができる。プラスミドベクター等を大腸菌等に導入する方法としては、例えば、”Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１６，ｐ ．４６９−６３１，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，や“Ｏｔｈｅｒ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ“，Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０４，ｐ．３０５−６３６，１９９１，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）を参照することができる。
【００１７】
大腸菌の培養方法としては、例えば必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）培地により培養する方法を例示できる。より具体的には、例えば、プラスミドベクターを含有した大腸菌のみを選択して培養するために、培地としてプラスミドベクターの構成を基にした選抜剤を含むものを使用することが例示できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドベクターを使用する場合には、培地にアンピシリンを添加することを例示できる。また培地には、炭素、窒素及び無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加しても良い。更にグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を添加しても良い。培養温度は、例えば約２０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは約３０℃とすることが例示できる。ｐＨは約６．８から７．４、好ましくは７．０とすることが例示できる。
【００１８】
前記したｌａｃプロモータ等の誘導性のプロモータを用い、誘導によってＡＭＶ逆転写酵素遺伝子を発現させる場合には、良好なＡＭＶ逆転写酵素の生産性が得られる程度にまで培養を行い、しかる後に誘導の操作を行うことが好ましい。その目安としては、例えば、培養液の濁度（６６０ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０を示す増殖期間に誘導の操作を行い、引き続き培養するが例示できる。ｌａｃプロモータの誘導剤としてはＩＰＴＧを例示することができるが、使用するプロモータに応じて適宜選択して使用すれば良い。ｌａｃプロモータを使用する場合のＩＰＴＧの添加濃度は終濃度で約０．１から１．０ｍＭであれば良いが、好ましくは０．１５ｍＭである。
【００１９】
培養液からＡＭＶ逆転写酵素を抽出する際には、発現の形態によって適宜抽出方法を選択すれば良い。例えば大腸菌のようにＡＭＶ逆転写酵素が宿主内に蓄積する場合は遠心分離操作等により菌体を集めた後、酵素処理剤や超音波破砕等により菌体を破砕して抽出することができる。この段階では種々の蛋白質が混在しているが、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー等を単独又は組み合わせて適用することにより、ＡＭＶ逆転写酵素のみを抽出することができる。
【発明の効果】
【００２０】
ＡＭＶ逆転写酵素遺伝子の天然（ウイルス）型コドンを大腸菌型コドンに変換したことにより、大腸菌を宿主として使用することによって工業的規模で発現（工業的規模でＡＭＶ逆転写酵素を製造）することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。図中ＡＭＶｂｅｔａＥｃｏｌｉが大腸菌型コドンに変換したＤＮＡ配列の配列、ＡＭＶｂｅｔａが天然（ウィルス）型ＡＭＶベータ体の配列である。ＡＭＶアルファ体はその塩基番号１番から１７１６番目までである。
【図２】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図３】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図４】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図５】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図６】図１から図６は、ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体の天然（ウィルス）型コドン及び大腸菌コドンの遺伝子配列を比較した図である。
【図７】図７は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢの構造を示す図である。
【図８】図８は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡの構造を示す図である。
【図９】図９は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄの構造を示す図である。
【図１０】図１０は、プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄの構造を示す図である。
【図１１】図１１は、発現量の差を示す電気泳動像の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００２４】
実施例１ ＡＭＶ逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列の設計
配列番号１に記載したＡＭＶ逆転写酵素のアミノ酸配列に基づき、ＤＮＡＷｏｒｋｓ法により、コドンを大腸菌型に変換した。コドンを変換したＤＮＡ配列と天然（ウィルス）型コドンをアライメントした結果を図１から図６に示す。図１から図６の通り、アミノ酸配列はそのままにＤＮＡの配列変換が行われ、そのＤＮＡ配列間の類似性は７４％であった。
【００２５】
実施例２ ＡＭＶ逆転写酵素をコードするＤＮＡ配列の作製
天然（ウィルス）型コドンから大腸菌型コドンに変換したＤＮＡ配列を作製するために１２０種類のオリゴヌクレオチドを合成した。合成したオリゴヌクレオチドを配列番号７から１２６に示す。
【００２６】
次いで、オリゴヌクレオチドから完全長のＡＭＶ逆転写酵素をコードするＤＮＡを作製するために、二段階のＰＣＲ反応を行った。一段階目のＰＣＲ反応の反応液は表１の通りであり、９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６２℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、次いで、７２℃、７分の第四ステップを行った。表１中のＤＮＡミックスは、１２０種類の合成した５０ｐｍｏｌ／μＬのオリゴヌクレオチドをそれぞれ一定量サンプリングし混合した溶液である。
【００２７】
【表１】
第二段階目のＰＣＲ反応は、第一段階目のＰＣＲ反応の反応液を用いて、表２の反応液組成で行った。プライマーの配列は、配列番号７（５’―ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＧ―３’）と配列番号１２６（５’―ＴＴＡＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＴＣＴ―３’）のオリゴヌクレオチドを用いた。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００２８】
【表２】
次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入しＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。調製したプラスミドベクターは制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＢとした。
【００２９】
さらに、ｐＴｒｃＡＭＶＢを鋳型にＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。使用したＰＣＲプライマーの配列は、配列番号７（５’―ＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＧ―３’）と配列番号１２７（５’―ＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＴＣＣＧＣＣ―３’）である。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００３０】
次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入しＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。調製したプラスミドベクターは制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＡとした。図７にｐＴｒｃＡＭＶＢ及び図８にｐＴｒｃＡＭＶＡの構造を示す。
【００３１】
ＰＣＲ法を用いて、プラスミド上にＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子を保有する大腸菌クローン（ＡＴＣＣ ３１９９０）からＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子を取り出した。使用したＰＣＲプライマーの配列は、配列番号１２８（５’― ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＣＧＣＴＣ―３’）と配列番号１２９（５’―ＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＡＧＡＧＧＧＣＴＣＧＣＣＴＣＡＴＣ―３’）である。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入し大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。プラスミドベクターを複製させた後、複製したプラスミドベクターについて制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄとした。
【００３２】
ＰＣＲ法を用いて、プラスミド上にＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子を保有する大腸菌クローン（ＡＴＣＣ ３１９９０）からＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子を取り出した。使用したＰＣＲプライマーの配列は、配列番号１２８（５’―ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＴＣＣＧＣＴＣ―３’）と配列番号１３０（５’―ＴＴＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＣＴＧＣＣ―３’）である。９４℃、５分の熱処理後、９４℃、３０秒間の第一ステップ、６５℃、３０秒間の第二ステップ、７２℃、１分間の第三ステップを２５サイクル行い、最後に、７２℃、７分の第四ステップを行った。反応終了後、０．９％のアガロース電気泳動で確認したところ、設計通りのサイズのＤＮＡバンドを確認することができた。
【００３３】
次いで、目的バンドから市販の試薬（Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：キアゲン社）を用いてＤＮＡを抽出後、抽出したＤＮＡの５’末端を市販の試薬（ＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ Ｋｉｔ：タカラバイオ社）を用いてリン酸化し、制限酵素ＳｍａＩで消化したｐＴｒｃ９９ａプラスミドベクターに挿入しＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を形質転換した。形質転換した大腸菌を培養し、プラスミドベクターを複製させた後、複製したプラスミドベクターについて制限解析及び配列決定により調査し、これをｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄとした。図９にｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ及び図１０にｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄの構造を示す。
実施例３ 配列の確認
実施例２において作製したプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢ及びｐＴｒｃＡＭＶＡに挿入したＤＮＡの配列を、チェーンターミネータ法に基づく市販の試薬キット（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社）にて解析した。なお、シークエンス用プライマーには合成した１２０種類のオリゴヌクレオチドを適宜使用した。その結果、ｐＴｒｃＡＭＶＢ及びｐＴｒｃＡＭＶＡに挿入したＤＮＡの塩基配列は設計通りであることを確認した。
【００３４】
実施例４ ＡＭＶ逆転写酵素の発現誘導
プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢを用いて、５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ寒天培地中でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラバイオ社）を形質転換した。３７℃で１８時間培養後、出現した任意のコロニーをピックアップし５０μｇ／ｍＬの抗生物質アンピシリンを添加したＬＢ液体培地に接種した。３７℃で培養し、ＯＤ６６０ｎｍの値が約０．５になったところで０．１５ｍＭのＩＰＴＧ（タカラバイオ社製）を添加した。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢで形質転換した株をＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢとした。プラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡについても同様に操作し、形質転換株をＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡとした。
【００３５】
同様の方法でプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ及びプラスミドベクターｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄも形質転換を行い、それぞれＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＢｗｉｌｄ、ＪＭ１０９／ｐＴｒｃＡＭＶＡｗｉｌｄとした。
【００３６】
ＩＰＴＧ添加から適当な間隔で培養液をサンプリングし、それぞれの形質転換株から蛋白質溶液を調製した。調製は市販のキット（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ノバジェン社）により行い、調製した蛋白質溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動像の結果を図１１に示す。図１１の通り、発現するタンパク質のアミノ酸配列は同一であるものの、宿主である大腸菌に合わせたコドンでは天然（ウィルス）型コドンに比べて有意に発現量を増加していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子であって、配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項６】
配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項７】
配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項８】
配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項１】
ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体をコードする遺伝子であって、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体をコードする遺伝子であって、配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
ＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項４】
ＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質をコードする遺伝子であって、配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ、それと実質的に相同なＤＮＡ又はこれらＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項６】
配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項７】
配列番号５記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素ベータ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【請求項８】
配列番号６記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと実質的に相同なＤＮＡによりコードされるＡＭＶ逆転写酵素アルファ体のＮ末端アミノ酸をメチオニンとしたタンパク質又はそれと実質的に相同なタンパク質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１２０５０６（Ｐ２０１２−１２０５０６Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７５５５７（Ｐ２０１０−２７５５５７）
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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