ＡＰ−１モチーフを介する遺伝子発現抑制剤
【課題】炎症ならびに発熱を伴う疾病の症状の緩和と改善、ならびに癌増殖の抑制に有効な転写因子ＡＰ−１のモチーフを介した遺伝子発現の抑制剤を提供する。
【解決手段】その遺伝子活性化にＡＰ−１モチーフへの転写因子ＡＰ−１の結合が関与することが知られているインターロイキン−６、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、シクロキシゲナーゼ−２等遺伝子の転写量をＲＴ−ＰＣＲ法によって評価し、さらにＡＰ−１モチーフをルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターベクターを哺乳動物細胞に導入して構築したレポーターアッセイ系において、ＩＬ−１による活性化の抑制の効果を評価することにより、活性化抑制効果がある物質として、シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびにシリンジン（エレウテロサイドＢ）を提供するとともに、構造的に同様な効果が容易に期待される物質群を提供する。
【解決手段】その遺伝子活性化にＡＰ−１モチーフへの転写因子ＡＰ−１の結合が関与することが知られているインターロイキン−６、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、シクロキシゲナーゼ−２等遺伝子の転写量をＲＴ−ＰＣＲ法によって評価し、さらにＡＰ−１モチーフをルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置したレポーターベクターを哺乳動物細胞に導入して構築したレポーターアッセイ系において、ＩＬ−１による活性化の抑制の効果を評価することにより、活性化抑制効果がある物質として、シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびにシリンジン（エレウテロサイドＢ）を提供するとともに、構造的に同様な効果が容易に期待される物質群を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特長あるリグナン構造を有し、転写因子ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を抑制することによって慢性関節リウマチを始めとする炎症性、発熱性疾病、ならびに悪性腫瘍の治療・予防に寄与する化学物質群に関する。
【背景技術】
【０００２】
結合組織の変形をともなう膠原病、ならびに組織に浸潤することによって転移を来す悪性腫瘍は、極めて治療の困難な難治性の炎症性疾患である。これら難治性疾患には、慢性関節リウマチを始めとし、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス等多数の疾患を含み、また悪性度の高い各種の癌ならびに肉腫を含む。これら難治性疾患は、組織の局所的な破壊、細胞の局所的な増殖等を含む炎症をともなうのが普通であり、その炎症は、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、プロスタグランジン類（ＰＧｓ）、ロイコトリエン類等の炎症性物質、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−Ｉ）で代表される組織性蛋白分解酵素の局所的な集積を伴うことが知られている。
【０００３】
従来これら炎症性疾患に対しては、さまざまな対症療法が編み出されてきた。関節リウマチを例にとれば概略以下のようである（例えば非特許文献０１、０２、０３）。まずアスピリンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、アラキドン酸カスケードに係わるシクロオキシゲナーゼなど酵素の阻害活性を有し、関節の痛みや腫れを軽減する効果を示す。ただし関節破壊に奏効しないことが知られている。炎症に対し強力な効果を発揮する副腎皮質ステロイド薬（ステロイド）は副作用もまた強く、長期間の投与が困難である。リウマチ活動性を抑制する薬剤として、抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（金製剤、オークルなど）が開発されている。投与後、効果がみられるまでに数ヶ月を要することや、有効性の面で個人差が大きいことなどが問題点とされている。抗リウマチ薬が無効の場合、免疫抑制剤（メトトレキセート他）が用いられるが、間質性肺炎、肝障害その他の副作用の可能性が指摘されている。その他、生物学的製剤として、抗ＴＮＦα抗体、ＴＮＦ受容体、抗ＩＬ−６受容体抗体などが使用あるいは治験中である（非特許文献０４）。リウマチを例とした場合においても、これら治療技術は、その炎症に対する根本的な解決を提供するに至っていないのが現状である。
【０００４】
これら炎症性疾患の根本的な解決のためには、その分子・細胞レベルでの発症メカニズムの研究が不可欠である。これらの研究から、以下に詳述するように、炎症にともなって活性化する遺伝子の多くにおいて、その発現制御領域にＡＰ−１モチーフが存在することが明らかとなってきた。
【０００５】
ＡＰ−１モチーフは、構造遺伝子の発現制御領域にあって、その配列が５′−ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡ−３′（配列番号１）であることを特長とするＤＮＡモチーフであって、このモチーフは、燐酸化されることによって活性化された転写因子ｃ−ｊｕｎと、今ひとつの転写因子ｃ−ｆｏｓよりなる複合体（ＡＰ−１複合体）の結合部位を提供し、ＡＰ−１モチーフへのＡＰ−１複合体の結合が、その下流あるいは近傍にある遺伝子の転写を活性化する例が多々知られている代表的な転写制御系を提供するものである。
【０００６】
ここでＡＰ−１複合体を形成するｃ−ｆｏｓあるいは活性化ｃ−ｊｕｎは、それぞれの生成から化学修飾に至る過程で、さまざまな細胞内の制御系の調節を受け、結果として組織・細胞特異的、かつ複雑な転写制御系を構築している。
【０００７】
即ちまず代表的な活性化制御についていえば、ｃ−ｊｕｎの燐酸化は、体内で生産される物質によっても、また体外から作用する物質でも起きるが、なかでも体外物質であるフォルボールエステルの作用によるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、あるいは細胞膜に局在する上皮細胞増殖因子受容体、ＩＬ−１受容体あるいはＴＧＦ−β受容体等の受容体にそれぞれ体内物質である増殖因子あるいはサイトカインが結合したときに細胞内に発せられるシグナルによって、細胞内の燐酸化カスケード（ＭＡＰキナーゼカスケード）が起動し、その最終標的として起きることが知られている（非特許文献０５，０６，０７，０８，０９，１０，１１）。
【０００８】
また抑制制御も、体外から作用する物質によっても、また生体内物質によっても起きるが、代表的な生体内物質についていえば、ＡＰ−１複合体は、副腎皮質ホルモン受容体（ＧＲ）が副腎皮質ホルモン（ＧＨ）と結合した受容体リガンド複合体（ＧＨ・ＧＲ）を形成しているとき、この複合体と相互作用する能力を有し、この相互作用により、ＡＰ−１複合体の本来の転写誘導活性化が抑制されることが知られている（非特許文献０８，１２，１３）。
【０００９】
また、生体外からの作用についていえば、ｃ−ｊｕｎは、例えばペルオキシゾーム増殖活性化因子受容体γ（ＰＰＡＲ−γ）に合成トリテルペノイド（２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアノ−１，９，ジエン−２８−オイン酸、ＣＤＤＯ）などのリガンドが結合した複合体と相互作用する能力を有し、この相互作用によっても、ＡＰ−１複合体の本来の転写誘導活性化が抑制されることも知られている（非特許文献０９）。
【００１０】
その他、細胞外からさまざまな形でＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現に作用する物質として知られている外来性因子には、レチノイン酸（非特許文献１４）、フェノバルビタール、（非特許文献１５）、リポポリサッカライド（非特許文献１６）、ベンゾジアゼピン（非特許文献１７）などが知られている。フリーラジカルなど酸化ストレスを与える物質もＡＰ−１複合体を増加させ、ＡＰ−１モチーフをその制御領域に有するさまざまな遺伝子を活性化することが知られている（例えば非特許文献１８）。このように、ＡＰ−１モチーフを介する遺伝子発現調節は、細胞が、細胞外にあるさまざまな効果因子を検出しつつ行う、機能調節の中心的な場の一つを提供していることが明らかとなってきたが、本発明において提供する物質については、その調節機能がＡＰ−１モチーフを介するものであることを示唆する知見は全く知られていなかった。
【００１１】
さてこのようにＡＰ−１モチーフを有する遺伝子は多数知られているが、その最も代表的なものにＭＭＰ−１遺伝子がある（非特許文献０５、非特許文献１８）。ＭＭＰ−１はコラゲナーゼ１あるいは間質性コラゲナーゼ（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）とも称され、間葉系細胞に広く分布し、結合組織の構造蛋白質の主体をなすコラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型ならびにＩＩＩ型）を特異的に切断し、よって組織の崩壊あるいは再構築に導く酵素であって、慢性関節リウマチを始め、悪性腫瘍の浸潤などにおける組織病変のみでなく、発生分化にともなう形態形成時においても主要な役割を果たす酵素である。
【００１２】
ＭＭＰ−１は、ＩＬ−１あるいはＴＮＦ−αなど炎症性サイトカインによって誘導されることが知られているが、１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）など体内に存在しない外来性物質によっても誘導されることが知られ、ＴＰＡの作用機序から、この誘導がＭＭＰ−１遺伝子の上流にあるＡＰ−１モチーフを介するものであることが示唆され、さらにＭＭＰ−１遺伝子の上流域をさまざまな大きさならびに位置で切り取って発現ベクターに導入したプロモーターアッセイ系を用いた検索により、実際ＡＰ−１モチーフがその制御の中心的な役割を果たしていることが証明されたのである。
【００１３】
ＡＰ−１モチーフはＭＭＰ−１遺伝子に加えて、コラーゲン遺伝子（α２（１）プロコラーゲン、非特許文献０８）、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ型）遺伝子（非特許文献１９）、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ型）受容体遺伝子（非特許文献２０）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１、非特許文献１８）、肺癌特異的遺伝子１（ＢＣＳＧ１、非特許文献０７）、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ、非特許文献１５）、κイムノグロブリン軽鎖遺伝子（非特許文献１６）、エンドテリン遺伝子（非特許文献２１）、ζグロビン遺伝子（非特許文献２２）、βグロビン遺伝子（非特許文献２３）、ＩＬ−６遺伝子（非特許文献２４）、ｃ−ｆｏｓ遺伝子（非特許文献２４）、ＭＭＰ−１３遺伝子（非特許文献２５、２６）、等枚挙にいとまがないほどの遺伝子の上流あるいはイントロン中などにＡＰ−１モチーフあるいは類似のモチーフとして存在し、それぞれさまざまな形でこれら遺伝子の発現を制御していることが証明、あるいは示唆されている。
【００１４】
このようにＡＰ−１モチーフは、特定の少数の遺伝子発現の制御に係わるのでなく、多数遺伝子を一括した制御に係わるモチーフであって、従って本モチーフを介する外部からの制御は、単一の生体機能への介入でなく、総合的な介入、あるいは別の言葉でいえば体質への介入を可能とするモチーフであることが明らかとなりつつある。
【００１５】
このような背景にあって、ＡＰ−１モチーフを有する遺伝子の発現を外部から制御しようとする研究は少なからぬ興味を引き、すでにいくつかの特記すべき発見あるいは発明がなされている。
【００１６】
ＡＰ−１モチーフを介する制御を受ける遺伝子のなかでも代表的なＭＭＰ−１遺伝子の制御についていえば、最も代表的なものは、副腎皮質ホルモンによる抑制制御技術である（非特許文献０９）。即ち、副腎皮質ホルモンは炎症時に活性化された組織コラーゲンの合成やＭＭＰ−１コラゲナーゼの合成を抑制する。この抑制は、代表的な抗炎症薬である副腎皮質ホルモンの作用機序そのものであると考えられている。
【００１７】
さらにレチノイン酸あるいはレチニルメチルエステルなどその誘導体もＭＭＰ−１の誘導を抑制することが報告されている。これら副腎皮質ホルモンやレチノイド化合物などのリガンド分子は、細胞内、とくに核内にこれらリガンドに対応する特異的な受容体分子を介して作用し、受容体−リガンド結合物がＡＰ−１複合体に作用することによって間接的にＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を制御するものであって、直接的にＡＰ−１モチーフに作用するものでないことが判明しているが、いずれにせよ、体外からのＡＰ−１モチーフを有する遺伝子に対して抑制制御を掛けることが可能であることを明確に示すものである。
【００１８】
さらに合成化合物についても、先に触れたＣＤＤＯの他に、ＳＢ２０３５８０、ＳＰ６００１２５といった化合物で効果が認められている（非特許文献０９）。体外からの作用の今一つの例として酸化ストレスが挙げられる。例えば、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）は酸化ストレスによって活性化を受けることが知られているが、この酸化ストレスによる活性化には、ＰＡＩ−１遺伝子の上流域にあるＡＰ−１モチーフが主要や役割を果たしていることが明らかとなった。そこで燐酸化ｃ−ｆｏｓ量を調べたところ、酸化ストレスによって燐酸化ｃ−ｆｏｓ量が顕著に増加することが明らかとなった。これら一連の研究から、酸化ストレスによってＡＰ−１複合体が増加し、結果としてＡＰ−１モチーフを介した遺伝子の活性化が起こることが明らかとされた（非特許文献１８）。
【００１９】
さらに最近、ＡＰ−１阻害剤として、ＡＰ−１の結合部位に高い親和性を有する２本鎖ヌクレオチド配列が報告されている（特許文献００１）。この配列はコラゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の一部配列と同一または相同であり、ＴＧＡＧＴＣＡ及び相補鎖ＴＧＡＣＴＣＡを含んだ配列である。また、化合物としては、ＡＰ−１と活性阻害活性を有するスピロ化合物が報告され、ＡＰ−１結合阻害活性、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎の抑制が示されている（特許文献００２）。
【００２０】
また、４−［３，５−ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＴＡＣ−１０１）がＡＰ−１阻害活性を有し細胞死を誘導することが報告されている（非特許文献２７）。しかしながら、これら既知の作用物質から本発明を予測することは不可能であり、本発明の新規性に係わるものでないことは明らかである。
【００２１】
本発明においてその分子生物学的機能を明らかにした（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびに（＋）−シリンガレシノール骨格を有することを特長とする一群のリグナンは、エゾウコギ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）、杜仲（Ｅｕｃｏｍｎｉａｅ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）、厚朴（ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ホオノキ（ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｖｏｂａｔａ）などの植物に含まれていることが従来知られてきており、またその分子生物学的な機能は不明のまま、従来様々な生理作用が明らかにされてきた（非特許文献２８，２９，３０、３１）。
【００２２】
その一例について触れると、ラット副腎髄質褐色細胞腫に由来するパラニューロン細胞株ＰＣ−１２の一系は、神経細胞増殖因子に反応して神経突起を伸長させる機能を有するが、同細胞に対して（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコシド（エレウテロサイドＥ）も神経突起を伸長させる効果を示すことが明らかとされている。同様な作用は（＋）−シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコシドについても、また（＋）−シリンガレシノールならびに（−）−シリンガレシノールについても認められている（非特許文献３２、２８）。
【００２３】
また、ラットを繰り返し遊泳させると、その遊泳時間は回数とともに極端に減少することが知られているが、ラットにエレウテロサイドＥを経口投与した群（５００ｍｇ／ｋｇ／日）では、非投与群において、遊泳時間が短縮するにも係わらず、投与群では短縮せず、エレウテロサイドＥには、抗疲労効果があることが示されている（非特許文献２９）。またラットを拘束水浸ストレスにさらしたとき、対照群には胃潰瘍発生が見られるが、エレウテロサイドＥを２週間経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ／日）した投与群では予防効果が示されていることを明らかとしている（非特許文献２７）。
【００２４】
（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、ならびに（＋）−シリンガレシノール骨格を有する類縁化合物がなんらかの顕著な生理作用を有するものであることは、これらの報告からも明らかであるが、これらの報告は、なんらその作用機序について知見を与えるものでなく、従って、これら既知情報から本発明を予測することは不可能であり、本発明の新規性に係わるものでないことは明らかである。
【非特許文献０１】川井真一 医学のあゆみ ２０９：８１４−８１９（２００４）
【非特許文献０２】田中良哉 医学のあゆみ ２０９：８２１−８２６（２００４）
【非特許文献０３】伊藤聡、住田孝之 医学のあゆみ ２０９：８３３−８３９（２００４）
【非特許文献０４】日経バイオ年鑑 （２００６）
【非特許文献０５】Ａｎｇｅｌ、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２２５６−２２６６（１９８７）
【非特許文献０６】Ｋｏｅｎｉｇ、Ｈ．、ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２２４１−２２４６（１９９２）
【非特許文献０７】Ｌｕ、Ａ．−Ｐ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３１３６４−３１３７２（２００２）
【非特許文献０８】Ｒｏｓｓｅｒｔ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５：６６−６８（２０００）
【非特許文献０９】Ｖｉｎｃｅｎｔｉ、Ｍ．Ｐ．、Ｂｒｉｃｋｅｒｈｏｆｆ、Ｅ．Ａｒｔ−ｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．４：１５７−１６４（２００２）
【非特許文献１０】Ｗｈｅｔｔｏｎ、Ａ．Ｄ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．８４：９３−１０４（１９８６）
【非特許文献１１】Ｚｈａｎｇ、Ｘ．−Ｋ．、ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：６０１６−６０２５（１９９１）
【非特許文献１２】Ｂｅａｔｏ、Ｍ．、ＦＡＳＥＢ Ｊ．５：２０４４−２０５１（１９９１）
【非特許文献１３】Ｊｏｎａｔ、Ｃ．、ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ６２：１１８９−１２０４（１９９０）
【非特許文献１４】Ｐａｅｚ−Ｐｅｒｅｄａ、Ｍ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ−ｅｓｔ．１０８：１１２３−１１３１（２００１）
【非特許文献１５】Ｒａｖａｎｔｉ、Ｌ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７２９２−３７３００（１９９９）
【非特許文献１６】Ｓｃｈａｎｋｅ、Ｊ．Ｔ．、ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：５４２５−５４３２（１９９４）
【非特許文献１７】Ｐｉｎｋｕｓ、Ｒ．、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２９０：６３７−６４０（１９９３）
【非特許文献１８】Ｏｂａｔａ、Ｈ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６６４３−２６６５１（１９９７）
【非特許文献１９】Ｍｉｒａ−Ｙ−Ｌｏｐｅｓ、Ｒ．、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３１：９０９−９１６（１９９８）．
【非特許文献２０】Ｓｕｈ、Ｔ．Ｔ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５９９２−２５９９８（１９９４）．
【非特許文献２１】Ｌｅｅ、Ｍ．−Ｅ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９０３４−１９０３９（１９９１）
【非特許文献２２】Ｈｕａｎｇ、Ｂ．−Ｌ．、ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４６６９−１４６７４（１９９８）
【非特許文献２３】Ａｍｒｏｌｉａ、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１３５９３−１３５９８（１９９８）
【非特許文献２４】Ｒａｙ、Ａ．、ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：５５３７−５５４７（１９８９）
【非特許文献２５】Ｐｅｎｄａｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４０：２２２−２３３（１９９７）
【非特許文献２６】Ｒａｕｓｃｈｅｒ、Ｆ．Ｊ．３ｒｄ．、ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ５２：４７１−４８０（１９８８）
【非特許文献２７】Ｓｈｉｂａｔａ、 Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０：３５８３−９０（２０００）
【非特許文献２８】Ｃｈｉｂａ、Ｋ．、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：７９１−７９３（１９９４）
【非特許文献２９】Ｄｅｙａｍａ、Ｔ．、ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｎ．２２：１０５７−１０７０（２００１）
【非特許文献３０】 Ｆｕｊｉｋａｗａ、Ｔ．、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９：１２２７−１２３０（１９９６）
【非特許文献３１】Ｎｉｓｈｉｂｅ、Ｓ．、ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３８：１７６３−１７６５（１９９０）
【非特許文献３２】Ｙａｍａｚａｋｉ、Ｍ．、ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７：１６０４−１６０８（１９９４）
【非特許文献３３】Ｗａｎｇ、Ｚ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．４３：２４９−２５２（１９９６）
【非特許文献３４】Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）
【特許文献００１】特開平１０−３６２７２
【特許文献００２】特願平１０−１７９６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を抑制することによる慢性関節リウマチを始めとする炎症性、発熱性疾病、ならびに悪性腫瘍の治療剤もしくは予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
この課題を達成するため、本発明者らは、ＩＬ−１βによってＭＭＰ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインを誘導生産する滑膜肉腫由来細胞株ＳＷ９８２が優れた炎症の試験管内モデルであることに注目した。すなわち、まずこの試験管内モデルを用いてさまざまな候補物質の炎症性サイトカインならびに酵素タンパク質の生産抑制効果を探索することを第一の手段とした。すなわち、炎症の指標となる、ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＣＯＸ−２，ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２などの遺伝子発現を、それぞれの転写ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法による定量をすることによって、作用候補物質の検索を行った。
【００２７】
さらにこれら炎症関連サイトカインならびに酵素のプロモーター制御領域に共通して存在するＡＰ−１モチーフの制御への関与を評価するため、ＡＰ−１モチーフを含み、そのモチーフが遺伝子発現に強く関与することが周知であるＭＭＰ−１遺伝子のプロモーター配列を含むその上流ＤＮＡ断片に注目した。即ち該配列にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を接続したレポーターベクターを構築した。このレポーターベクターをＳＷ９８２細胞に導入したレポーターアッセイ系において、培養環境に添加した候補物質が、ルシフェラーゼ遺伝子発現のＩＬ−１βによる活性化を抑制する効果を評価することによって、該物質がＡＰ−１モチーフを介する遺伝子発現調節機構に干渉しているか否かについての判定を行うことを第２の手段とした。
【００２８】
さらにこの判定に基づき、培養環境に添加した候補物質のなかで、ＡＰ−１モチーフを介した遺伝子発現制御効果を示した物質ならびに示さなかった物質について、それぞれを作用させたＳＷ９８２細胞中のＡＰ−１モチーフへの作用物質、即ちＡＰ−１複合体、の量の差異をゲルシフトアッセイ法によって定量することによって、確かにその作用がＡＰ−１モチーフを介するものであるかを確認することを第３の手段とした。
【００２９】
最後に、炎症性酵素タンパク質の指標の一つとしたＣＯＸ−２については、その効果が直接ではなく、各種プロスタグランジンを誘導するアラキドン酸カスケードへのキーエンザイムとして作用するものであることから、実際にプロスタグランジンの生産が抑制されているかどうかを確認するために、プロスタグランジンＥ２の濃度を測定することにより、その効果を明らかにすることを第４の手段とした。
【発明の効果】
【００３０】
本発明者らは、以上の手段を用いて鋭意課題の解決に努力した結果、エゾウコギエキスに滑膜肉腫由来細胞株ＳＷ９８２のＩＬ−１βによる炎症性サイトカイン生産誘導を抑制する物質が含まれることを見出し、さらにその成分を探索した結果、（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびにシリンジン骨格を有するその関連物質がその本体であることを見出した。
【００３１】
さらにＡＰ−１モチーフをその上流に配置し、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を配置したレポーターベクターをＳＷ９８２細胞に導入して構築したレポーターアッセイ系によって、シリンジン骨格を有するリグナンであるシリンジン（エレウテロサイドＢ）、なかんずくその誘導体である（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイトＥ）が遺伝子発現のＩＬ−１による活性化を抑制する効果を示すことを見出した。
【００３２】
さらにこの発見に基づき、培養環境に添加した候補物質のなかでＡＰ−１モチーフを介した遺伝子発現制御効果を示したエレウテロサイドＥならびに示さなかったイソフラキシジンについて、それぞれを作用させたＳＷ９８２細胞中のＡＰ−１モチーフへの作用物質、即ちＡＰ−１複合体の量の差異をゲルシフトアッセイ法によって、エレウテロサイドＥ添加群において、ＡＰ−１複合体量が減少していることを確認し、この作用がＡＰ−１モチーフを介するものであることを確認した。
【００３３】
最後に、炎症性酵素タンパク質の指標の一つとしたＣＯＸ−２の減少が、確かにプロスタグランジンの生産抑制に寄与しているかどうかを、転写レベルで抑制効果を示したエレウテロサイドＢ，エレウテロサイドＥ、ならびに抑制効果を示さなかったイソフラキシジン添加群について、ＩＬ−１β刺激ＳＷ９８２細胞のおけるプロスタグランジンＥ２の濃度を測定することにより、確かにこれら転写抑制物質がプロスタグランジンＥ２の濃度を顕著に低下させていることを確認し、本発明を完成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびに該物質で代表される（＋）−シリンガレシノール骨格ならびにその起源物質であるシリンジン骨格を有するリグナンをさまざまな形で提供することを可能とする食品、医薬品ならびに化粧品によって実施されるものであり、由来する原料ならびに提供の方法によらない。
【００３５】
たとえば（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）は、エゾウコギ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ Ｈａｒｍｓ）に含まれるが、杜仲（Ｅｕｃｏｍｎｉａｅ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）など、他の植物にも含まれ、これら植物のエキスは、植物が食品として適している限り食品として、化粧品原料として、あるいは医薬品原料として提供の手段となる。
【００３６】
また、たとえば（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）が体内においで細胞に吸収される形であることが推定されるアグリコン（（＋）−シリンガレシノール）、あるいはその中間産物である（＋）−シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコピラノシド、さらにその起源物質であるシリンジンも、エゾウコギ、杜仲、厚朴（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）等に含まれていることが知られており、これらの抽出物も食品として適している限り食品として、化粧品の原料として、あるいは医薬品の原料として提供の手段となる。（非特許文献２８，２９，３０，３１）
【００３７】
また該物質は熱水抽出物のＨＰＬＣクロマトグラフィーによる分離法（例えば非特許文献３３）などによって、高純度に精製し、また適宜な化学修飾を加えることが可能であるが、精製した該物質ならびに類縁物質は、その精製方法ならびに加工方法によらず、適宜な工程をへて医薬品、化粧品、あるいは食品素材として認可される限り提供の手段となる。
【００３８】
さらに該物質はその含有植物のエキスあるいはその加工品についてその生理的作用を明らかにした上で、認可される限り、特定保険食品がその提供の手段となる。さらに該物質は乾燥状態で粉体であり、水溶性である限りにおいて、錠剤、水溶液、ゲル、散剤等の剤形で提供することが可能である。またさらに該物質は水溶液状態で耐熱性である限りにおいて、瓶缶に充填した保存性ある医薬品、化粧品、飲料あるいは食品の素材として提供することが可能である。
【実施例】
【００３９】
以下に実験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実験例のみに限定されるものではない。以下の本実施例においては、（＋）−シリンガレシノール ジ−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ Ｒｅｆｅｒｅｎｚｓｕｂｓｔａｎｚｅｎ ＧｂＲｍｂＨ （Ｉｃｈｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より販売されているものを使用している。しかし、同様の標品、その水和物、等級品は他のルートからも入手可能であり、化学式（＋）−ｓｙｒｉｎａｇａｒｅｓｉｎｏｌ ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅであればその品位によらない。
【００４０】
実施例１）ＳＷ９８２細胞における炎症関連遺伝子発現の抑制：
試験方法：凍結保存してある、ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 由来）を解凍し、終濃度が１０％ｖ／ｖとなるように牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下増殖培地）中で培養した。培養した細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、継代培養により増殖させた。
【００４１】
このように培養したＳＷ９８２細胞を、６ｃｍプラスチックシャーレあたり３〜５ｘ１０５個接種し、さらに２４時間培養後、炎症性サイトカインを誘導する目的でＩＬ−１βを終濃度２ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに薬剤添加群においては、シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、関連物質、ならびに非関連物質を以下の濃度となるようにようにそれぞれ添加した。すなわち、エレウテロサイドＥ（１７μＭ、５０μＭ、１５０μＭ）、シリンジン（エレウテロサイドＢ、１７μＭ、５０μＭ、１５０μＭ）、ならびに非関連物質としてイソフラキシジン（１３５μＭ、４５０μＭ）である。ここで、イソフラキシジンはエレウテロサイドＢならびにＥと同様にエゾウコギに含まれる成分である。
【００４２】
これら薬剤添加群ならびに非添加群をそれぞれ、５％ＣＯ２ガスを含む加湿した気相中、３７℃に保温して２４時間培養した。培養後、トリプシンーＥＤＴＡにて細胞を剥離し、グアニジウムチオシアネート法（例えば、非特許文献３４参照）を用いることで、ＲＮＡを抽出した。
【００４３】
逆転写酵素反応（ＲＴ反応）は、１００ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて４２℃、２０分行った。得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＩＬ−１β遺伝子に特異的なプライマー（センスプライマーとアンチセンスプライマー）を加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、３９１ｂｐのＩＬ−１βｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号２と配列番号３である。
【００４４】
また、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＩＬ−６遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、６２９ｂｐのＩＬ−６ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号４と配列番号５である。
【００４５】
さらにまた、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＣＯＸ−２遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、３０５ｂｐのＣＯＸ−１ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号６と配列番号７である。
【００４６】
さらにまた、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＭＭＰ−１遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、５５０ｂｐのＭＭＰ−１ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号８と配列番号９である。
【００４７】
さらにまた、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＭＭＰ−２遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、５５０ｂｐのＭＭＰ−２ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号１０と配列番号１１である。
【００４８】
さらにまた、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）を内標準物質として採用した。ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、５５０ｂｐのＧ３ＰＤＨｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号１２と配列番号１３である。
【００４９】
以上のようにして各々増幅させたＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル内で電気泳動を行い、エチジウムブロマイドにより染色を施した。このようにして染色したゲル上で、トランスイルミネーターを使用したＵＶ照射によってバンドを検出した。このバンドが分子量標準ＤＮＡのサイズとの比較によって、ＰＣＲ増幅によって得られる目的のバンドであることを確認した後、写真撮影を行った。目的とするＤＮＡバンドの発色強度をデンシトメーターにて数値化し、Ｇ３ＰＤＨの発色強度を対照とし、その相対値（ＯＤ／Ｇ３ＰＤＨ）を算出した。
【００５０】
結果は図１、２、３に示し、以下の通りである。１）シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ではＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１の遺伝子発現においてはほぼ同様に５０μＭで抑制傾向が認められた。２）イソフラキシジンでは４５０μＭ、エレウテロサイドＢでは１５０μＭで抑制が認められた。３）ＭＭＰ−２においてはエレウテロサイドＢにおいて、シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）より低濃度で遺伝子発現の抑制が認められた。以上の結果からシリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）が最も低濃度でＭＭＰ−２を除く各種炎症性タンパクの遺伝子発現を抑制することが明らかとなった。
【００５１】
実施例２）ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有するレポーターベクターの構築
Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｌ（ＭＭＰ−１）配列の発現制御領域をルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍａｇａ）に挿入してＡＰ−１モチーフを有するレポーターベクターを構築した。ＭＭＰ−１の発現制御領域（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣＢＩ，ＨＳＡＪ０２５５０）から、高い発現制御能が得られることが報告されている（非特許文献３）−５１７〜−４２を含んだ制御領域−５１７〜＋６４を選んで、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）をテンプレイトとして、プライマー（配列番号１４、１５）を用いて増幅させた。このＭＭＰ−１の発現制御領域は、５’末端を制限酵素ＫｐｎＩで、３’末端を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、精製した。挿入した配列は、配列番号１６である。
【００５２】
別にｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を大腸菌に導入して増幅し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断後、精製し、調製したＭＭＰ−１発現制御領域ｃＤＮＡ（−５１７〜＋６４）をライゲースで挿入した。挿入した配列は、配列番号１６である。Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、ＪＭ１０９９（Ｐｒｏｍｅｇａ）にこのベクターを導入し、いくつかのシングルコロニーについて配列確認して、ＭＭＰ１制御領域−５１７〜＋６４が期待通り挿入されたルシフェラーゼレポーターベクターを選択した。この制御領域−５１７〜＋６４中の−７３〜−６７にＡＰ−１モチーフ［ＴＧＡＧＴＣＡ］が含まれており、−３２〜−２５の位置にＴＡＴＡｂｏｘ［ＴＡＴＡＴＡＴＡ］が存在する。
【００５３】
実施例３）ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有するレポーターベクターを用いた（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）の遺伝子発現抑制効果の測定：ウェル（９６ウェルシャーレ）あたり１．５ｘ１０４のＳＷ９８２細胞を接種２４時間後、上述の実施例で示された様にして構築されたリコンビナント（１μｇ）とその５０分の１量のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を発現する内部標準ベクター（ｐＲＬ−ＴＫ ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）をリポフェクチン法により２４時間コトランスフェクトした。コトランスフェクション後、細胞はＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）添加の条件でエレウテロサイドＥ５０μＭあるいは１００μＭ添加して、さらに２４時間培養した。培養後、ルシェフェラーゼ活性をルミノメーター（Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０１）により測定した。ここで、各試験群に対して５ウェルずつ、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い測定し、その比の平均値±ＳＤを求めた。
【００５４】
ＩＬ−１β活性化ＳＷ９８２細胞の導入した場合のエレウテロサイドＥのルシフェラーゼ遺伝子発現制御効果を図４に示す。リコンビナントのみ導入細胞では、ＩＬ−１βの添加により、対照ベクターに対してＭＭＰ−１プロモーター領域導入ベクターにおいて活性誘導が認められた。５０μＭのシリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）の添加で、活性誘導が抑制される傾向が認められた。さらに、エレウテロサイドＥ１００μＭの添加で、ほぼ完全な抑制が認められた。ここに図で示していないが、対照としてイソフラキシジンを添加した試験においては、その５０、１００μＭいずれの濃度においても活性誘導の抑制は認められなかった。
【００５５】
以上の結果は、さきに示されたエレウテロサイドＥによるＭＭＰ−１遺伝子転写の抑制が、ＭＭＰ−１のＡＰ−１モチーフを含むプロモーター領域によって支配されていることを示すものである。
【００５６】
実施例４）ＡＰ−１モチーフ結合性ＡＰ−１複合体のゲルシフトアッセイ法による定量６ｃｍシャーレにＳＷ９８２細胞を播種後、細胞がプラトーに達した時点で、ＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で２４時間、エレウテロサイドＥあるいはイソフラキシジンを添加あるいは非添加した。細胞から核画分を分離し、さらに核抽出物を得て、ゲルシフト法に供した。
【００５７】
ゲルシフト法はＤＩＧ Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｋｉｔ，２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）のプロトコールに準じて行った。すなわち、核抽出物５−１５μｇに対し、５×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識プローブ（０．４ｎｇ／μｌ）２μｌ、ｐｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ（１μｇ／μｌ）１μｌ、ｐｏｌｙ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（０．１μｇ／μｌ）１μｌを加え、総量２０μｌとした。ここでオリゴヌクレオチドプローブとして用いた各転写因子の結合部位の配列は配列番号１７である。その後、６％非変性ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行い、ゲルをナイロン膜に転写させ、化学発光検出によりシグナルをバンドとして検出した。さらに検出したバンドの濃度をデンシトメーターにより数値化し、ラベルしないオリゴヌクレオチドプローブを添加した場合のバンド位置の濃度をノイズとして差し引いて、ノイズ補正後の数値をＡＰ−１複合体のＡＰ−１転写因子結合部位への結合の指標とした。ノイズ補正後の数値をＡＰ−１複合体のＡＰ−１転写因子結合部位への結合の指標とした。その数値は以下表１に示す通りである。
【表１】
【００５８】
結果、ＡＰ−１複合体のプローブへの結合は、エレウテロサイドＥの濃度に依存して抑制され、１００μＭでは１８％にまで抑制した。一方、イソフラキシジンではその抑制は僅かであった。以上の結果はエレウテロサイドＥにより認められた各種炎症性タンパクの遺伝子発現ならびにＭＭＰ−１プロモーター活性の抑制が、ＡＰ−１複合体のプロモーター領域への結合阻害に起因することを示す証拠を提出するものである。
【００５９】
実施例５）効果物質によるプロスタグランディンＥ２産生の抑制効果：エレウテロサイドＥによってＩＬ−１β活性化ＳＷ９８２細胞のＣＯＸ−２遺伝子転写が抑制される以上の結果が、確かに炎症の抑制に働いているか否かを証明するため、同細胞の培養液を分析し、ＣＯＸ−２によって起動されるアラキドン酸カスケードの主要な炎症誘起物質であるプロスタグランディンＥ２の濃度を定量した。
【００６０】
即ち、ウェル（９６ウェルプレート）あたり３ｘ１０３のＳＷ９８２細胞を接種２４時間後、ＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）ならびに効果物質を添加して４８時間培養し、培養後の培養上清について、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）値をｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法によって測定した（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ ｋｉｔ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）。
【００６１】
ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたイソフラキシジン、エレウテロサイドＢならびにエレウテロサイドＥの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を図５，６，７に示す。ＰＧＥ２生産は、エレウテロサイドＥならびにエレウテロサイドＢの添加によって濃度依存的に抑制された。特にエレウテロサイドＥについては、わずか１．９μＭの濃度でも、ＰＧＥ２濃度は無添加群の２５％以下にまで抑制する顕著な効果が認められた。なお、イソフラキシジンは１３５μＭまでの濃度でＰＧＥ２生産に対してなんら効果がなく、４５０μＭの高濃度ではじめて抑制効果を示した。
【００６２】
この結果から、エレウテロサイドＥのＣＯＸ−２遺伝子転写抑制効果が、たしかに該遺伝子に由来するＣＯＸ−２酵素の起動によって生ずる炎症メディエイターであるＰＧＥ２生産の抑制に帰結していることを証明した。
【００６３】
実施例６）作用因子のＳＷ９８２細胞の生存性に与える影響：細胞培養系に添加された作用物質が細胞の生存性に影響するかどうかを、トリパンブルー法を用いた生細胞計数法を用いて測定した。即ち、増殖培地中に浮遊させたＳＷ９８２細胞を各ウェル当たり３０００個になるように、０．５ｍＬずつ、９６穴ウェルプレートに播種した。同時にＩＬ−１βを終濃度２ｎｇ／ｍＬになるように添加した。さらに、イソフラキシジンについては、終濃度１５０、４５０μＭになるように、シリンジンについては、最終濃度５０，１５０μＭになるように、またエレウテロサイドＥについては、５０、１５０μＭになるように添加した。このようにして播種した細胞培養を、５％ＣＯ２ガスを含む加湿した気相中、３７℃に保温して２日間培養を行った。培養後、細胞の増殖をトリパンブルー染色法（例えば、非特許文献３５参照。）にて測定し（ｎ＝２）、全細胞数に対する非染色性細胞数の％をとって、細胞障害性効果を判定した。
【非特許文献３５】分子生物学研究のための培養細胞実験法（羊土社），ｐ８８
【００６４】
試験結果：このようにして培養したＳＷ９８２細胞の生存性に及ぼすイソフラキシジン、シリンジン、エレウテロサイドＥの効果を表２に示す。対象群において生存率が９６．２％±５％であるに対し、シリンジン添加群で若干の低下（シリンジン１５０μＭ添加で８０．６％±３．９％）を認めたが、イソフラキシジンならびにエレウテロサイドＥについて対象群との有意な差を認めなかった。これらの結果により、これらの物質の効果が細胞障害に基づくものである可能性が否定された。
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上に述べたごとく、本発明によって、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−１）遺伝子を始めとする、ＡＰ−１モチーフをその遺伝子発現制御領域の有する遺伝子の発現を抑制することにより、これら遺伝子がその発症ならびに増悪に係わっている疾患、すなわち慢性関節リウマチをはじめとする炎症性、発熱性疾病の症状、ならびに悪性腫瘍を抑制することを通じてこれら疾病の予防ならびに治療に効果ある薬剤、化粧品ならびに食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】 ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞のＩＬ−１β刺激下でのイソフラキシジン添加時の各種遺伝子発現への影響を示した図である。縦軸：ルシフェラーゼ転写活性 横軸：左からＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１ならびにＧ３ＰＤＨ 横軸各項目左から：無添加対象群、２：イソフラキシジン１３５μＭ添加群、３：イソフラキシジン４５０μＭ添加群
【図２】 ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞のＩＬ−１β刺激下でのエレウテロサイドＢ添加時の各種遺伝子発現への影響を示した図である。縦軸：ルシフェラーゼ転写活性 横軸：左からＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１ならびにＧ３ＰＤＨ 横軸各項目左から：無添加対象群、２：エレウテロサイドＢ １７μＭ、３：エレウテロサイドＢ ５０μＭ、４：エレウテロサイドＢ １５０μＭ添加群
【図３】 ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞のＩＬ−１β刺激下でのエレウテロサイドＥ添加時の各種遺伝子発現への影響を示した図である。縦軸：ルシフェラーゼ転写活性 横軸：左からＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１ならびにＧ３ＰＤＨ 横軸各項目左から：無添加対象群、２：エレウテロサイドＥ １７μＭ、３：エレウテロサイドＥ ５０μＭ、４：エレウテロサイドＥ １５０μＭ添加群
【図４】 ＡＰ−１モチーフを含むＭＭＰ−１プロモーター制御領域を導入したルシフェラーゼベクターをＩＬ−１β活性化ＳＷ９８２細胞の導入した場合のエレウテロサイドＥのルシフェラーゼ遺伝子発現制御効果を示した図である。縦軸：対照ベクターによって生産されるウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するＭＭＰ−１プロモーターベクターによって生産されるホタルルシフェラーゼ活性の比 横軸：左から、ＩＬ−１β非添加群、ＩＬ−１β添加群、ｃ） ＩＬ−１βならびにエレウテロサイドＥ５０μＭ添加群、ｄ） ＩＬ−１βならびにエレウテロサイドＥ１００μＭ添加群
【図５】 ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたイソフラキシジンの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を示した図である。縦軸：４８時間培養後の培地中ＰＧＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ） 横軸：イソフラキシジンの添加濃度（μＭ）
【図６】 ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたエレウテロサイドＢの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を示した図である。縦軸：４８時間培養後の培地中ＰＧＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ） 横軸：エレウテロサイドＢの添加濃度（μＭ）
【図７】 ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたエレウテロサイドＥの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を示した図である。縦軸：４８時間培養後の培地中ＰＧＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ） 横軸：エレウテロサイドＥの添加濃度（μＭ）
【配列表フリーテキスト】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、特長あるリグナン構造を有し、転写因子ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を抑制することによって慢性関節リウマチを始めとする炎症性、発熱性疾病、ならびに悪性腫瘍の治療・予防に寄与する化学物質群に関する。
【背景技術】
【０００２】
結合組織の変形をともなう膠原病、ならびに組織に浸潤することによって転移を来す悪性腫瘍は、極めて治療の困難な難治性の炎症性疾患である。これら難治性疾患には、慢性関節リウマチを始めとし、リウマチ熱、全身性エリテマトーデス等多数の疾患を含み、また悪性度の高い各種の癌ならびに肉腫を含む。これら難治性疾患は、組織の局所的な破壊、細胞の局所的な増殖等を含む炎症をともなうのが普通であり、その炎症は、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、プロスタグランジン類（ＰＧｓ）、ロイコトリエン類等の炎症性物質、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−Ｉ）で代表される組織性蛋白分解酵素の局所的な集積を伴うことが知られている。
【０００３】
従来これら炎症性疾患に対しては、さまざまな対症療法が編み出されてきた。関節リウマチを例にとれば概略以下のようである（例えば非特許文献０１、０２、０３）。まずアスピリンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、アラキドン酸カスケードに係わるシクロオキシゲナーゼなど酵素の阻害活性を有し、関節の痛みや腫れを軽減する効果を示す。ただし関節破壊に奏効しないことが知られている。炎症に対し強力な効果を発揮する副腎皮質ステロイド薬（ステロイド）は副作用もまた強く、長期間の投与が困難である。リウマチ活動性を抑制する薬剤として、抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）（金製剤、オークルなど）が開発されている。投与後、効果がみられるまでに数ヶ月を要することや、有効性の面で個人差が大きいことなどが問題点とされている。抗リウマチ薬が無効の場合、免疫抑制剤（メトトレキセート他）が用いられるが、間質性肺炎、肝障害その他の副作用の可能性が指摘されている。その他、生物学的製剤として、抗ＴＮＦα抗体、ＴＮＦ受容体、抗ＩＬ−６受容体抗体などが使用あるいは治験中である（非特許文献０４）。リウマチを例とした場合においても、これら治療技術は、その炎症に対する根本的な解決を提供するに至っていないのが現状である。
【０００４】
これら炎症性疾患の根本的な解決のためには、その分子・細胞レベルでの発症メカニズムの研究が不可欠である。これらの研究から、以下に詳述するように、炎症にともなって活性化する遺伝子の多くにおいて、その発現制御領域にＡＰ−１モチーフが存在することが明らかとなってきた。
【０００５】
ＡＰ−１モチーフは、構造遺伝子の発現制御領域にあって、その配列が５′−ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡ−３′（配列番号１）であることを特長とするＤＮＡモチーフであって、このモチーフは、燐酸化されることによって活性化された転写因子ｃ−ｊｕｎと、今ひとつの転写因子ｃ−ｆｏｓよりなる複合体（ＡＰ−１複合体）の結合部位を提供し、ＡＰ−１モチーフへのＡＰ−１複合体の結合が、その下流あるいは近傍にある遺伝子の転写を活性化する例が多々知られている代表的な転写制御系を提供するものである。
【０００６】
ここでＡＰ−１複合体を形成するｃ−ｆｏｓあるいは活性化ｃ−ｊｕｎは、それぞれの生成から化学修飾に至る過程で、さまざまな細胞内の制御系の調節を受け、結果として組織・細胞特異的、かつ複雑な転写制御系を構築している。
【０００７】
即ちまず代表的な活性化制御についていえば、ｃ−ｊｕｎの燐酸化は、体内で生産される物質によっても、また体外から作用する物質でも起きるが、なかでも体外物質であるフォルボールエステルの作用によるプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化、あるいは細胞膜に局在する上皮細胞増殖因子受容体、ＩＬ−１受容体あるいはＴＧＦ−β受容体等の受容体にそれぞれ体内物質である増殖因子あるいはサイトカインが結合したときに細胞内に発せられるシグナルによって、細胞内の燐酸化カスケード（ＭＡＰキナーゼカスケード）が起動し、その最終標的として起きることが知られている（非特許文献０５，０６，０７，０８，０９，１０，１１）。
【０００８】
また抑制制御も、体外から作用する物質によっても、また生体内物質によっても起きるが、代表的な生体内物質についていえば、ＡＰ−１複合体は、副腎皮質ホルモン受容体（ＧＲ）が副腎皮質ホルモン（ＧＨ）と結合した受容体リガンド複合体（ＧＨ・ＧＲ）を形成しているとき、この複合体と相互作用する能力を有し、この相互作用により、ＡＰ−１複合体の本来の転写誘導活性化が抑制されることが知られている（非特許文献０８，１２，１３）。
【０００９】
また、生体外からの作用についていえば、ｃ−ｊｕｎは、例えばペルオキシゾーム増殖活性化因子受容体γ（ＰＰＡＲ−γ）に合成トリテルペノイド（２−シアノ−３，１２−ジオキソオレアノ−１，９，ジエン−２８−オイン酸、ＣＤＤＯ）などのリガンドが結合した複合体と相互作用する能力を有し、この相互作用によっても、ＡＰ−１複合体の本来の転写誘導活性化が抑制されることも知られている（非特許文献０９）。
【００１０】
その他、細胞外からさまざまな形でＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現に作用する物質として知られている外来性因子には、レチノイン酸（非特許文献１４）、フェノバルビタール、（非特許文献１５）、リポポリサッカライド（非特許文献１６）、ベンゾジアゼピン（非特許文献１７）などが知られている。フリーラジカルなど酸化ストレスを与える物質もＡＰ−１複合体を増加させ、ＡＰ−１モチーフをその制御領域に有するさまざまな遺伝子を活性化することが知られている（例えば非特許文献１８）。このように、ＡＰ−１モチーフを介する遺伝子発現調節は、細胞が、細胞外にあるさまざまな効果因子を検出しつつ行う、機能調節の中心的な場の一つを提供していることが明らかとなってきたが、本発明において提供する物質については、その調節機能がＡＰ−１モチーフを介するものであることを示唆する知見は全く知られていなかった。
【００１１】
さてこのようにＡＰ−１モチーフを有する遺伝子は多数知られているが、その最も代表的なものにＭＭＰ−１遺伝子がある（非特許文献０５、非特許文献１８）。ＭＭＰ−１はコラゲナーゼ１あるいは間質性コラゲナーゼ（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）とも称され、間葉系細胞に広く分布し、結合組織の構造蛋白質の主体をなすコラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型ならびにＩＩＩ型）を特異的に切断し、よって組織の崩壊あるいは再構築に導く酵素であって、慢性関節リウマチを始め、悪性腫瘍の浸潤などにおける組織病変のみでなく、発生分化にともなう形態形成時においても主要な役割を果たす酵素である。
【００１２】
ＭＭＰ−１は、ＩＬ−１あるいはＴＮＦ−αなど炎症性サイトカインによって誘導されることが知られているが、１２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）など体内に存在しない外来性物質によっても誘導されることが知られ、ＴＰＡの作用機序から、この誘導がＭＭＰ−１遺伝子の上流にあるＡＰ−１モチーフを介するものであることが示唆され、さらにＭＭＰ−１遺伝子の上流域をさまざまな大きさならびに位置で切り取って発現ベクターに導入したプロモーターアッセイ系を用いた検索により、実際ＡＰ−１モチーフがその制御の中心的な役割を果たしていることが証明されたのである。
【００１３】
ＡＰ−１モチーフはＭＭＰ−１遺伝子に加えて、コラーゲン遺伝子（α２（１）プロコラーゲン、非特許文献０８）、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ型）遺伝子（非特許文献１９）、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼ型）受容体遺伝子（非特許文献２０）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１、非特許文献１８）、肺癌特異的遺伝子１（ＢＣＳＧ１、非特許文献０７）、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ、非特許文献１５）、κイムノグロブリン軽鎖遺伝子（非特許文献１６）、エンドテリン遺伝子（非特許文献２１）、ζグロビン遺伝子（非特許文献２２）、βグロビン遺伝子（非特許文献２３）、ＩＬ−６遺伝子（非特許文献２４）、ｃ−ｆｏｓ遺伝子（非特許文献２４）、ＭＭＰ−１３遺伝子（非特許文献２５、２６）、等枚挙にいとまがないほどの遺伝子の上流あるいはイントロン中などにＡＰ−１モチーフあるいは類似のモチーフとして存在し、それぞれさまざまな形でこれら遺伝子の発現を制御していることが証明、あるいは示唆されている。
【００１４】
このようにＡＰ−１モチーフは、特定の少数の遺伝子発現の制御に係わるのでなく、多数遺伝子を一括した制御に係わるモチーフであって、従って本モチーフを介する外部からの制御は、単一の生体機能への介入でなく、総合的な介入、あるいは別の言葉でいえば体質への介入を可能とするモチーフであることが明らかとなりつつある。
【００１５】
このような背景にあって、ＡＰ−１モチーフを有する遺伝子の発現を外部から制御しようとする研究は少なからぬ興味を引き、すでにいくつかの特記すべき発見あるいは発明がなされている。
【００１６】
ＡＰ−１モチーフを介する制御を受ける遺伝子のなかでも代表的なＭＭＰ−１遺伝子の制御についていえば、最も代表的なものは、副腎皮質ホルモンによる抑制制御技術である（非特許文献０９）。即ち、副腎皮質ホルモンは炎症時に活性化された組織コラーゲンの合成やＭＭＰ−１コラゲナーゼの合成を抑制する。この抑制は、代表的な抗炎症薬である副腎皮質ホルモンの作用機序そのものであると考えられている。
【００１７】
さらにレチノイン酸あるいはレチニルメチルエステルなどその誘導体もＭＭＰ−１の誘導を抑制することが報告されている。これら副腎皮質ホルモンやレチノイド化合物などのリガンド分子は、細胞内、とくに核内にこれらリガンドに対応する特異的な受容体分子を介して作用し、受容体−リガンド結合物がＡＰ−１複合体に作用することによって間接的にＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を制御するものであって、直接的にＡＰ−１モチーフに作用するものでないことが判明しているが、いずれにせよ、体外からのＡＰ−１モチーフを有する遺伝子に対して抑制制御を掛けることが可能であることを明確に示すものである。
【００１８】
さらに合成化合物についても、先に触れたＣＤＤＯの他に、ＳＢ２０３５８０、ＳＰ６００１２５といった化合物で効果が認められている（非特許文献０９）。体外からの作用の今一つの例として酸化ストレスが挙げられる。例えば、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）は酸化ストレスによって活性化を受けることが知られているが、この酸化ストレスによる活性化には、ＰＡＩ−１遺伝子の上流域にあるＡＰ−１モチーフが主要や役割を果たしていることが明らかとなった。そこで燐酸化ｃ−ｆｏｓ量を調べたところ、酸化ストレスによって燐酸化ｃ−ｆｏｓ量が顕著に増加することが明らかとなった。これら一連の研究から、酸化ストレスによってＡＰ−１複合体が増加し、結果としてＡＰ−１モチーフを介した遺伝子の活性化が起こることが明らかとされた（非特許文献１８）。
【００１９】
さらに最近、ＡＰ−１阻害剤として、ＡＰ−１の結合部位に高い親和性を有する２本鎖ヌクレオチド配列が報告されている（特許文献００１）。この配列はコラゲナーゼ遺伝子のプロモーター領域の一部配列と同一または相同であり、ＴＧＡＧＴＣＡ及び相補鎖ＴＧＡＣＴＣＡを含んだ配列である。また、化合物としては、ＡＰ−１と活性阻害活性を有するスピロ化合物が報告され、ＡＰ−１結合阻害活性、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎の抑制が示されている（特許文献００２）。
【００２０】
また、４−［３，５−ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＴＡＣ−１０１）がＡＰ−１阻害活性を有し細胞死を誘導することが報告されている（非特許文献２７）。しかしながら、これら既知の作用物質から本発明を予測することは不可能であり、本発明の新規性に係わるものでないことは明らかである。
【００２１】
本発明においてその分子生物学的機能を明らかにした（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびに（＋）−シリンガレシノール骨格を有することを特長とする一群のリグナンは、エゾウコギ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ）、杜仲（Ｅｕｃｏｍｎｉａｅ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）、厚朴（ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ホオノキ（ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｖｏｂａｔａ）などの植物に含まれていることが従来知られてきており、またその分子生物学的な機能は不明のまま、従来様々な生理作用が明らかにされてきた（非特許文献２８，２９，３０、３１）。
【００２２】
その一例について触れると、ラット副腎髄質褐色細胞腫に由来するパラニューロン細胞株ＰＣ−１２の一系は、神経細胞増殖因子に反応して神経突起を伸長させる機能を有するが、同細胞に対して（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコシド（エレウテロサイドＥ）も神経突起を伸長させる効果を示すことが明らかとされている。同様な作用は（＋）−シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコシドについても、また（＋）−シリンガレシノールならびに（−）−シリンガレシノールについても認められている（非特許文献３２、２８）。
【００２３】
また、ラットを繰り返し遊泳させると、その遊泳時間は回数とともに極端に減少することが知られているが、ラットにエレウテロサイドＥを経口投与した群（５００ｍｇ／ｋｇ／日）では、非投与群において、遊泳時間が短縮するにも係わらず、投与群では短縮せず、エレウテロサイドＥには、抗疲労効果があることが示されている（非特許文献２９）。またラットを拘束水浸ストレスにさらしたとき、対照群には胃潰瘍発生が見られるが、エレウテロサイドＥを２週間経口投与（５０ｍｇ／ｋｇ／日）した投与群では予防効果が示されていることを明らかとしている（非特許文献２７）。
【００２４】
（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、ならびに（＋）−シリンガレシノール骨格を有する類縁化合物がなんらかの顕著な生理作用を有するものであることは、これらの報告からも明らかであるが、これらの報告は、なんらその作用機序について知見を与えるものでなく、従って、これら既知情報から本発明を予測することは不可能であり、本発明の新規性に係わるものでないことは明らかである。
【非特許文献０１】川井真一 医学のあゆみ ２０９：８１４−８１９（２００４）
【非特許文献０２】田中良哉 医学のあゆみ ２０９：８２１−８２６（２００４）
【非特許文献０３】伊藤聡、住田孝之 医学のあゆみ ２０９：８３３−８３９（２００４）
【非特許文献０４】日経バイオ年鑑 （２００６）
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【非特許文献０８】Ｒｏｓｓｅｒｔ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １５：６６−６８（２０００）
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【非特許文献３３】Ｗａｎｇ、Ｚ．、ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．４３：２４９−２５２（１９９６）
【非特許文献３４】Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．、ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）
【特許文献００１】特開平１０−３６２７２
【特許文献００２】特願平１０−１７９６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を抑制することによる慢性関節リウマチを始めとする炎症性、発熱性疾病、ならびに悪性腫瘍の治療剤もしくは予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
この課題を達成するため、本発明者らは、ＩＬ−１βによってＭＭＰ−１、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインを誘導生産する滑膜肉腫由来細胞株ＳＷ９８２が優れた炎症の試験管内モデルであることに注目した。すなわち、まずこの試験管内モデルを用いてさまざまな候補物質の炎症性サイトカインならびに酵素タンパク質の生産抑制効果を探索することを第一の手段とした。すなわち、炎症の指標となる、ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＣＯＸ−２，ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２などの遺伝子発現を、それぞれの転写ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ法による定量をすることによって、作用候補物質の検索を行った。
【００２７】
さらにこれら炎症関連サイトカインならびに酵素のプロモーター制御領域に共通して存在するＡＰ−１モチーフの制御への関与を評価するため、ＡＰ−１モチーフを含み、そのモチーフが遺伝子発現に強く関与することが周知であるＭＭＰ−１遺伝子のプロモーター配列を含むその上流ＤＮＡ断片に注目した。即ち該配列にレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を接続したレポーターベクターを構築した。このレポーターベクターをＳＷ９８２細胞に導入したレポーターアッセイ系において、培養環境に添加した候補物質が、ルシフェラーゼ遺伝子発現のＩＬ−１βによる活性化を抑制する効果を評価することによって、該物質がＡＰ−１モチーフを介する遺伝子発現調節機構に干渉しているか否かについての判定を行うことを第２の手段とした。
【００２８】
さらにこの判定に基づき、培養環境に添加した候補物質のなかで、ＡＰ−１モチーフを介した遺伝子発現制御効果を示した物質ならびに示さなかった物質について、それぞれを作用させたＳＷ９８２細胞中のＡＰ−１モチーフへの作用物質、即ちＡＰ−１複合体、の量の差異をゲルシフトアッセイ法によって定量することによって、確かにその作用がＡＰ−１モチーフを介するものであるかを確認することを第３の手段とした。
【００２９】
最後に、炎症性酵素タンパク質の指標の一つとしたＣＯＸ−２については、その効果が直接ではなく、各種プロスタグランジンを誘導するアラキドン酸カスケードへのキーエンザイムとして作用するものであることから、実際にプロスタグランジンの生産が抑制されているかどうかを確認するために、プロスタグランジンＥ２の濃度を測定することにより、その効果を明らかにすることを第４の手段とした。
【発明の効果】
【００３０】
本発明者らは、以上の手段を用いて鋭意課題の解決に努力した結果、エゾウコギエキスに滑膜肉腫由来細胞株ＳＷ９８２のＩＬ−１βによる炎症性サイトカイン生産誘導を抑制する物質が含まれることを見出し、さらにその成分を探索した結果、（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびにシリンジン骨格を有するその関連物質がその本体であることを見出した。
【００３１】
さらにＡＰ−１モチーフをその上流に配置し、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を配置したレポーターベクターをＳＷ９８２細胞に導入して構築したレポーターアッセイ系によって、シリンジン骨格を有するリグナンであるシリンジン（エレウテロサイドＢ）、なかんずくその誘導体である（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイトＥ）が遺伝子発現のＩＬ−１による活性化を抑制する効果を示すことを見出した。
【００３２】
さらにこの発見に基づき、培養環境に添加した候補物質のなかでＡＰ−１モチーフを介した遺伝子発現制御効果を示したエレウテロサイドＥならびに示さなかったイソフラキシジンについて、それぞれを作用させたＳＷ９８２細胞中のＡＰ−１モチーフへの作用物質、即ちＡＰ−１複合体の量の差異をゲルシフトアッセイ法によって、エレウテロサイドＥ添加群において、ＡＰ−１複合体量が減少していることを確認し、この作用がＡＰ−１モチーフを介するものであることを確認した。
【００３３】
最後に、炎症性酵素タンパク質の指標の一つとしたＣＯＸ−２の減少が、確かにプロスタグランジンの生産抑制に寄与しているかどうかを、転写レベルで抑制効果を示したエレウテロサイドＢ，エレウテロサイドＥ、ならびに抑制効果を示さなかったイソフラキシジン添加群について、ＩＬ−１β刺激ＳＷ９８２細胞のおけるプロスタグランジンＥ２の濃度を測定することにより、確かにこれら転写抑制物質がプロスタグランジンＥ２の濃度を顕著に低下させていることを確認し、本発明を完成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ならびに該物質で代表される（＋）−シリンガレシノール骨格ならびにその起源物質であるシリンジン骨格を有するリグナンをさまざまな形で提供することを可能とする食品、医薬品ならびに化粧品によって実施されるものであり、由来する原料ならびに提供の方法によらない。
【００３５】
たとえば（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）は、エゾウコギ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ Ｈａｒｍｓ）に含まれるが、杜仲（Ｅｕｃｏｍｎｉａｅ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）など、他の植物にも含まれ、これら植物のエキスは、植物が食品として適している限り食品として、化粧品原料として、あるいは医薬品原料として提供の手段となる。
【００３６】
また、たとえば（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）が体内においで細胞に吸収される形であることが推定されるアグリコン（（＋）−シリンガレシノール）、あるいはその中間産物である（＋）−シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコピラノシド、さらにその起源物質であるシリンジンも、エゾウコギ、杜仲、厚朴（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）等に含まれていることが知られており、これらの抽出物も食品として適している限り食品として、化粧品の原料として、あるいは医薬品の原料として提供の手段となる。（非特許文献２８，２９，３０，３１）
【００３７】
また該物質は熱水抽出物のＨＰＬＣクロマトグラフィーによる分離法（例えば非特許文献３３）などによって、高純度に精製し、また適宜な化学修飾を加えることが可能であるが、精製した該物質ならびに類縁物質は、その精製方法ならびに加工方法によらず、適宜な工程をへて医薬品、化粧品、あるいは食品素材として認可される限り提供の手段となる。
【００３８】
さらに該物質はその含有植物のエキスあるいはその加工品についてその生理的作用を明らかにした上で、認可される限り、特定保険食品がその提供の手段となる。さらに該物質は乾燥状態で粉体であり、水溶性である限りにおいて、錠剤、水溶液、ゲル、散剤等の剤形で提供することが可能である。またさらに該物質は水溶液状態で耐熱性である限りにおいて、瓶缶に充填した保存性ある医薬品、化粧品、飲料あるいは食品の素材として提供することが可能である。
【実施例】
【００３９】
以下に実験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実験例のみに限定されるものではない。以下の本実施例においては、（＋）−シリンガレシノール ジ−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）は、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ Ｒｅｆｅｒｅｎｚｓｕｂｓｔａｎｚｅｎ ＧｂＲｍｂＨ （Ｉｃｈｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より販売されているものを使用している。しかし、同様の標品、その水和物、等級品は他のルートからも入手可能であり、化学式（＋）−ｓｙｒｉｎａｇａｒｅｓｉｎｏｌ ｄｉ−Ｏ−β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅであればその品位によらない。
【００４０】
実施例１）ＳＷ９８２細胞における炎症関連遺伝子発現の抑制：
試験方法：凍結保存してある、ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ 由来）を解凍し、終濃度が１０％ｖ／ｖとなるように牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（以下増殖培地）中で培養した。培養した細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、継代培養により増殖させた。
【００４１】
このように培養したＳＷ９８２細胞を、６ｃｍプラスチックシャーレあたり３〜５ｘ１０５個接種し、さらに２４時間培養後、炎症性サイトカインを誘導する目的でＩＬ−１βを終濃度２ｎｇ／ｍｌとなるように添加し、さらに薬剤添加群においては、シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、関連物質、ならびに非関連物質を以下の濃度となるようにようにそれぞれ添加した。すなわち、エレウテロサイドＥ（１７μＭ、５０μＭ、１５０μＭ）、シリンジン（エレウテロサイドＢ、１７μＭ、５０μＭ、１５０μＭ）、ならびに非関連物質としてイソフラキシジン（１３５μＭ、４５０μＭ）である。ここで、イソフラキシジンはエレウテロサイドＢならびにＥと同様にエゾウコギに含まれる成分である。
【００４２】
これら薬剤添加群ならびに非添加群をそれぞれ、５％ＣＯ２ガスを含む加湿した気相中、３７℃に保温して２４時間培養した。培養後、トリプシンーＥＤＴＡにて細胞を剥離し、グアニジウムチオシアネート法（例えば、非特許文献３４参照）を用いることで、ＲＮＡを抽出した。
【００４３】
逆転写酵素反応（ＲＴ反応）は、１００ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて４２℃、２０分行った。得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＩＬ−１β遺伝子に特異的なプライマー（センスプライマーとアンチセンスプライマー）を加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、３９１ｂｐのＩＬ−１βｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号２と配列番号３である。
【００４４】
また、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＩＬ−６遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、６２９ｂｐのＩＬ−６ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号４と配列番号５である。
【００４５】
さらにまた、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＣＯＸ−２遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、３０５ｂｐのＣＯＸ−１ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号６と配列番号７である。
【００４６】
さらにまた、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＭＭＰ−１遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、５５０ｂｐのＭＭＰ−１ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号８と配列番号９である。
【００４７】
さらにまた、ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、ＭＭＰ−２遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、５５０ｂｐのＭＭＰ−２ｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号１０と配列番号１１である。
【００４８】
さらにまた、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）を内標準物質として採用した。ＲＴ反応によって得られたｃＤＮＡ溶液に対し、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーを加え、１．２５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて２０サイクルのＰＣＲ（熱変性９４℃で１分、アニーリング５５℃で１分、伸長反応７２℃で２分）を行った。ＰＣＲ増幅によって、５５０ｂｐのＧ３ＰＤＨｃＤＮＡを得た。用いたプライマーは、配列番号１２と配列番号１３である。
【００４９】
以上のようにして各々増幅させたＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル内で電気泳動を行い、エチジウムブロマイドにより染色を施した。このようにして染色したゲル上で、トランスイルミネーターを使用したＵＶ照射によってバンドを検出した。このバンドが分子量標準ＤＮＡのサイズとの比較によって、ＰＣＲ増幅によって得られる目的のバンドであることを確認した後、写真撮影を行った。目的とするＤＮＡバンドの発色強度をデンシトメーターにて数値化し、Ｇ３ＰＤＨの発色強度を対照とし、その相対値（ＯＤ／Ｇ３ＰＤＨ）を算出した。
【００５０】
結果は図１、２、３に示し、以下の通りである。１）シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）ではＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１の遺伝子発現においてはほぼ同様に５０μＭで抑制傾向が認められた。２）イソフラキシジンでは４５０μＭ、エレウテロサイドＢでは１５０μＭで抑制が認められた。３）ＭＭＰ−２においてはエレウテロサイドＢにおいて、シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）より低濃度で遺伝子発現の抑制が認められた。以上の結果からシリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）が最も低濃度でＭＭＰ−２を除く各種炎症性タンパクの遺伝子発現を抑制することが明らかとなった。
【００５１】
実施例２）ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有するレポーターベクターの構築
Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｌ（ＭＭＰ−１）配列の発現制御領域をルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍａｇａ）に挿入してＡＰ−１モチーフを有するレポーターベクターを構築した。ＭＭＰ−１の発現制御領域（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣＢＩ，ＨＳＡＪ０２５５０）から、高い発現制御能が得られることが報告されている（非特許文献３）−５１７〜−４２を含んだ制御領域−５１７〜＋６４を選んで、Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ（ＢＤ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）をテンプレイトとして、プライマー（配列番号１４、１５）を用いて増幅させた。このＭＭＰ−１の発現制御領域は、５’末端を制限酵素ＫｐｎＩで、３’末端を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断後、精製した。挿入した配列は、配列番号１６である。
【００５２】
別にｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を大腸菌に導入して増幅し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎをＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断後、精製し、調製したＭＭＰ−１発現制御領域ｃＤＮＡ（−５１７〜＋６４）をライゲースで挿入した。挿入した配列は、配列番号１６である。Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、ＪＭ１０９９（Ｐｒｏｍｅｇａ）にこのベクターを導入し、いくつかのシングルコロニーについて配列確認して、ＭＭＰ１制御領域−５１７〜＋６４が期待通り挿入されたルシフェラーゼレポーターベクターを選択した。この制御領域−５１７〜＋６４中の−７３〜−６７にＡＰ−１モチーフ［ＴＧＡＧＴＣＡ］が含まれており、−３２〜−２５の位置にＴＡＴＡｂｏｘ［ＴＡＴＡＴＡＴＡ］が存在する。
【００５３】
実施例３）ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有するレポーターベクターを用いた（＋）−シリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）の遺伝子発現抑制効果の測定：ウェル（９６ウェルシャーレ）あたり１．５ｘ１０４のＳＷ９８２細胞を接種２４時間後、上述の実施例で示された様にして構築されたリコンビナント（１μｇ）とその５０分の１量のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を発現する内部標準ベクター（ｐＲＬ−ＴＫ ｖｅｃｔｏｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ）をリポフェクチン法により２４時間コトランスフェクトした。コトランスフェクション後、細胞はＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）添加の条件でエレウテロサイドＥ５０μＭあるいは１００μＭ添加して、さらに２４時間培養した。培養後、ルシェフェラーゼ活性をルミノメーター（Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０１）により測定した。ここで、各試験群に対して５ウェルずつ、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い測定し、その比の平均値±ＳＤを求めた。
【００５４】
ＩＬ−１β活性化ＳＷ９８２細胞の導入した場合のエレウテロサイドＥのルシフェラーゼ遺伝子発現制御効果を図４に示す。リコンビナントのみ導入細胞では、ＩＬ−１βの添加により、対照ベクターに対してＭＭＰ−１プロモーター領域導入ベクターにおいて活性誘導が認められた。５０μＭのシリンガレシノールジＯ−β−Ｄジグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）の添加で、活性誘導が抑制される傾向が認められた。さらに、エレウテロサイドＥ１００μＭの添加で、ほぼ完全な抑制が認められた。ここに図で示していないが、対照としてイソフラキシジンを添加した試験においては、その５０、１００μＭいずれの濃度においても活性誘導の抑制は認められなかった。
【００５５】
以上の結果は、さきに示されたエレウテロサイドＥによるＭＭＰ−１遺伝子転写の抑制が、ＭＭＰ−１のＡＰ−１モチーフを含むプロモーター領域によって支配されていることを示すものである。
【００５６】
実施例４）ＡＰ−１モチーフ結合性ＡＰ−１複合体のゲルシフトアッセイ法による定量６ｃｍシャーレにＳＷ９８２細胞を播種後、細胞がプラトーに達した時点で、ＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で２４時間、エレウテロサイドＥあるいはイソフラキシジンを添加あるいは非添加した。細胞から核画分を分離し、さらに核抽出物を得て、ゲルシフト法に供した。
【００５７】
ゲルシフト法はＤＩＧ Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ｋｉｔ，２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）のプロトコールに準じて行った。すなわち、核抽出物５−１５μｇに対し、５×Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識プローブ（０．４ｎｇ／μｌ）２μｌ、ｐｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ（１μｇ／μｌ）１μｌ、ｐｏｌｙ Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（０．１μｇ／μｌ）１μｌを加え、総量２０μｌとした。ここでオリゴヌクレオチドプローブとして用いた各転写因子の結合部位の配列は配列番号１７である。その後、６％非変性ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動を行い、ゲルをナイロン膜に転写させ、化学発光検出によりシグナルをバンドとして検出した。さらに検出したバンドの濃度をデンシトメーターにより数値化し、ラベルしないオリゴヌクレオチドプローブを添加した場合のバンド位置の濃度をノイズとして差し引いて、ノイズ補正後の数値をＡＰ−１複合体のＡＰ−１転写因子結合部位への結合の指標とした。ノイズ補正後の数値をＡＰ−１複合体のＡＰ−１転写因子結合部位への結合の指標とした。その数値は以下表１に示す通りである。
【表１】
【００５８】
結果、ＡＰ−１複合体のプローブへの結合は、エレウテロサイドＥの濃度に依存して抑制され、１００μＭでは１８％にまで抑制した。一方、イソフラキシジンではその抑制は僅かであった。以上の結果はエレウテロサイドＥにより認められた各種炎症性タンパクの遺伝子発現ならびにＭＭＰ−１プロモーター活性の抑制が、ＡＰ−１複合体のプロモーター領域への結合阻害に起因することを示す証拠を提出するものである。
【００５９】
実施例５）効果物質によるプロスタグランディンＥ２産生の抑制効果：エレウテロサイドＥによってＩＬ−１β活性化ＳＷ９８２細胞のＣＯＸ−２遺伝子転写が抑制される以上の結果が、確かに炎症の抑制に働いているか否かを証明するため、同細胞の培養液を分析し、ＣＯＸ−２によって起動されるアラキドン酸カスケードの主要な炎症誘起物質であるプロスタグランディンＥ２の濃度を定量した。
【００６０】
即ち、ウェル（９６ウェルプレート）あたり３ｘ１０３のＳＷ９８２細胞を接種２４時間後、ＩＬ−１β（２ｎｇ／ｍｌ）ならびに効果物質を添加して４８時間培養し、培養後の培養上清について、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）値をｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＥＩＡ）法によって測定した（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ Ｅ２ ＥＩＡ ｋｉｔ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）。
【００６１】
ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたイソフラキシジン、エレウテロサイドＢならびにエレウテロサイドＥの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を図５，６，７に示す。ＰＧＥ２生産は、エレウテロサイドＥならびにエレウテロサイドＢの添加によって濃度依存的に抑制された。特にエレウテロサイドＥについては、わずか１．９μＭの濃度でも、ＰＧＥ２濃度は無添加群の２５％以下にまで抑制する顕著な効果が認められた。なお、イソフラキシジンは１３５μＭまでの濃度でＰＧＥ２生産に対してなんら効果がなく、４５０μＭの高濃度ではじめて抑制効果を示した。
【００６２】
この結果から、エレウテロサイドＥのＣＯＸ−２遺伝子転写抑制効果が、たしかに該遺伝子に由来するＣＯＸ−２酵素の起動によって生ずる炎症メディエイターであるＰＧＥ２生産の抑制に帰結していることを証明した。
【００６３】
実施例６）作用因子のＳＷ９８２細胞の生存性に与える影響：細胞培養系に添加された作用物質が細胞の生存性に影響するかどうかを、トリパンブルー法を用いた生細胞計数法を用いて測定した。即ち、増殖培地中に浮遊させたＳＷ９８２細胞を各ウェル当たり３０００個になるように、０．５ｍＬずつ、９６穴ウェルプレートに播種した。同時にＩＬ−１βを終濃度２ｎｇ／ｍＬになるように添加した。さらに、イソフラキシジンについては、終濃度１５０、４５０μＭになるように、シリンジンについては、最終濃度５０，１５０μＭになるように、またエレウテロサイドＥについては、５０、１５０μＭになるように添加した。このようにして播種した細胞培養を、５％ＣＯ２ガスを含む加湿した気相中、３７℃に保温して２日間培養を行った。培養後、細胞の増殖をトリパンブルー染色法（例えば、非特許文献３５参照。）にて測定し（ｎ＝２）、全細胞数に対する非染色性細胞数の％をとって、細胞障害性効果を判定した。
【非特許文献３５】分子生物学研究のための培養細胞実験法（羊土社），ｐ８８
【００６４】
試験結果：このようにして培養したＳＷ９８２細胞の生存性に及ぼすイソフラキシジン、シリンジン、エレウテロサイドＥの効果を表２に示す。対象群において生存率が９６．２％±５％であるに対し、シリンジン添加群で若干の低下（シリンジン１５０μＭ添加で８０．６％±３．９％）を認めたが、イソフラキシジンならびにエレウテロサイドＥについて対象群との有意な差を認めなかった。これらの結果により、これらの物質の効果が細胞障害に基づくものである可能性が否定された。
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００６５】
以上に述べたごとく、本発明によって、マトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＭＭＰ−１）遺伝子を始めとする、ＡＰ−１モチーフをその遺伝子発現制御領域の有する遺伝子の発現を抑制することにより、これら遺伝子がその発症ならびに増悪に係わっている疾患、すなわち慢性関節リウマチをはじめとする炎症性、発熱性疾病の症状、ならびに悪性腫瘍を抑制することを通じてこれら疾病の予防ならびに治療に効果ある薬剤、化粧品ならびに食品が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】 ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞のＩＬ−１β刺激下でのイソフラキシジン添加時の各種遺伝子発現への影響を示した図である。縦軸：ルシフェラーゼ転写活性 横軸：左からＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１ならびにＧ３ＰＤＨ 横軸各項目左から：無添加対象群、２：イソフラキシジン１３５μＭ添加群、３：イソフラキシジン４５０μＭ添加群
【図２】 ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞のＩＬ−１β刺激下でのエレウテロサイドＢ添加時の各種遺伝子発現への影響を示した図である。縦軸：ルシフェラーゼ転写活性 横軸：左からＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１ならびにＧ３ＰＤＨ 横軸各項目左から：無添加対象群、２：エレウテロサイドＢ １７μＭ、３：エレウテロサイドＢ ５０μＭ、４：エレウテロサイドＢ １５０μＭ添加群
【図３】 ヒト滑膜肉腫細胞株ＳＷ９８２細胞のＩＬ−１β刺激下でのエレウテロサイドＥ添加時の各種遺伝子発現への影響を示した図である。縦軸：ルシフェラーゼ転写活性 横軸：左からＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＣＯＸ−２、ＭＭＰ−１ならびにＧ３ＰＤＨ 横軸各項目左から：無添加対象群、２：エレウテロサイドＥ １７μＭ、３：エレウテロサイドＥ ５０μＭ、４：エレウテロサイドＥ １５０μＭ添加群
【図４】 ＡＰ−１モチーフを含むＭＭＰ−１プロモーター制御領域を導入したルシフェラーゼベクターをＩＬ−１β活性化ＳＷ９８２細胞の導入した場合のエレウテロサイドＥのルシフェラーゼ遺伝子発現制御効果を示した図である。縦軸：対照ベクターによって生産されるウミシイタケルシフェラーゼ活性に対するＭＭＰ−１プロモーターベクターによって生産されるホタルルシフェラーゼ活性の比 横軸：左から、ＩＬ−１β非添加群、ＩＬ−１β添加群、ｃ） ＩＬ−１βならびにエレウテロサイドＥ５０μＭ添加群、ｄ） ＩＬ−１βならびにエレウテロサイドＥ１００μＭ添加群
【図５】 ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたイソフラキシジンの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を示した図である。縦軸：４８時間培養後の培地中ＰＧＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ） 横軸：イソフラキシジンの添加濃度（μＭ）
【図６】 ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたエレウテロサイドＢの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を示した図である。縦軸：４８時間培養後の培地中ＰＧＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ） 横軸：エレウテロサイドＢの添加濃度（μＭ）
【図７】 ＩＬ−１βによって活性化されたＳＷ９８２細胞の培養培地に添加されたエレウテロサイドＥの該細胞によるプロスタグランジンＥ２生産に及ぼす効果を示した図である。縦軸：４８時間培養後の培地中ＰＧＥ２濃度（ｎｇ／ｍｌ） 横軸：エレウテロサイドＥの添加濃度（μＭ）
【配列表フリーテキスト】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンであって、ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を抑制することを特長とする遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
シリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンであって、その作用がＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現抑制であることを特長とする疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項３】
そのシリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンがシリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコピラノシド、シリンガレシノール、あるいはシリンジンであることを特長とする請求項１にある遺伝子発現抑制剤
【請求項４】
そのシリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンがシリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコピラノシド、シリンガレシノール、あるいはシリンジンであることを特長とする請求項２にある疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項５】
その疾病が関節リウマチあるいは悪性腫瘍であることを特長とする請求項２にある疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項６】
その症状が発熱であることを特長とする請求項２にある疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項１】
シリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンであって、ＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現を抑制することを特長とする遺伝子発現抑制剤。
【請求項２】
シリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンであって、その作用がＡＰ−１モチーフをその発現制御領域に有する遺伝子の発現抑制であることを特長とする疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項３】
そのシリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンがシリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコピラノシド、シリンガレシノール、あるいはシリンジンであることを特長とする請求項１にある遺伝子発現抑制剤
【請求項４】
そのシリンガレシノール骨格あるいはシリンジン骨格を有するリグナンがシリンガレシノールジＯ−β−Ｄグルコピラノシド（エレウテロサイドＥ）、シリンガレシノールＯ−β−Ｄグルコピラノシド、シリンガレシノール、あるいはシリンジンであることを特長とする請求項２にある疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項５】
その疾病が関節リウマチあるいは悪性腫瘍であることを特長とする請求項２にある疾病ならびに症状の治療・予防剤
【請求項６】
その症状が発熱であることを特長とする請求項２にある疾病ならびに症状の治療・予防剤
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−３０２６４４（Ｐ２００７−３０２６４４Ａ）
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１５３９９０（Ｐ２００６−１５３９９０）
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【出願人】（０００１３９２４１）株式会社ローマン工業 (2)
【出願人】（５０１３３３３９７）財団法人河野臨床医学研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月２２日（２００７．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【出願人】（０００１３９２４１）株式会社ローマン工業 (2)
【出願人】（５０１３３３３９７）財団法人河野臨床医学研究所 (3)
【Ｆターム（参考）】
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