ＡＰＯ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体とその使用法
【課題】Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを提供する。
【解決手段】Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬの天然配列中に一又は複数のアミノ酸置換を含むＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体。Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体はシステイン置換を含み得る。Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体ポリペプチドを含み、これはポリ（エチレングリコール）２０００などの１又は複数のポリオール群に対して抱合又は結合する。そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子、及びＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を含むベクターと宿主細胞。
【解決手段】Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬの天然配列中に一又は複数のアミノ酸置換を含むＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体。Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体はシステイン置換を含み得る。Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体ポリペプチドを含み、これはポリ（エチレングリコール）２０００などの１又は複数のポリオール群に対して抱合又は結合する。そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子、及びＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を含むベクターと宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体、そのような変異体の調製方法、及びそのような変異体を利用した組成物とアッセイに関する。特に、本発明は、天然配列Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬとは異なり、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬレセプターのＤＲ４及びＤＲ５に対して結合親和特性を有するＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体に関する。加えて、本発明は、システイン置換を有することにより、例えば、ポリエチレングリコール等の部分による化学修飾を促進できるＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barr et al., Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Steller et al., Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itoh et al., Cell, 66：233-243(1991)］。
【０００３】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pitti et al., J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wiley et al., Immunity, 3：673-682(1995)；Browning et al., Cell, 72:847-856(1993)；Armitage et al., Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開の国際公開９７／０１６３３；1997年7月17日公開の国際公開９７／２５４２８；Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開の国際公開９８／２８４２６；1998年10月22日公開の国際公開９８／４６７５１；1998年5月7日公開の国際公開９８／１８９２１；Moore et al., Science, 285:260-263(1999)；Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ−２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００４】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995)；Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)；２００１年９月４日発行の米国特許第６２８４２３６を参照］。完全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素による切断を通して、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、（ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の）３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitz et al.；Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を含む免疫系の調節に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている［例えば、Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998)；Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999)；Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999)；Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)］。
【０００５】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型はまた大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含むインビトロの様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWiley et al.；上掲のPitti et al.；Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998)；Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999)；Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999)；Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999)；Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999)；Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000)；Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenazi et al.；上掲のWalzcak et al.；Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999)；上掲のChinnaiyan et al.；Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenazi et al.；上掲のWalzcak et al.］。ＪｏらはＡｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000)；またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、死亡対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001)；Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
【０００６】
ＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞応答の誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定され［Hohman et al., J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；１９９１年３月２０日に公開された欧州特許第４１７５６３号］、両者のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され特徴付けられている［Loetscher et al., Cell, 61：351(1990)；Schall et al., Cell, 61：361(1990)；Smith et al., Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型が両方のＴＮＦレセプター遺伝子に伴っている［例えばTakao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)］。両方のＴＮＦＲが細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有している。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出されている［Nophar, Y et al., EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。組換え可溶型ＴＮＦレセプターのクローニングはHale等［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］によって報告されている。類似のプロリンリッチ領域がＴＮＦＲ２に見出されるが、ＴＮＦＲ１では見出されない。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２-末端から出発して、１から４と命名される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０アミノ酸長で、よく保存されている位置に４から６のシステイン残基を含んでいる［Schall et al., 上掲；Loetscher et al., 上掲；Smith et al., 上掲；Nophar et al., 上掲；Kohno et al., 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−約１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は１７から約５４までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５５から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１４０までのアミノ酸；及びＣＲＤ４−約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)］。リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割はまた上掲のBannerらに記載されている。
【０００８】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnson et al., Cell, 47：545(1986)；Radek et al., Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic et al., EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet et al., EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara et al., J. Exp. Med. 及びItoh et al., Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Upton et al., Virology, 160：20-29(1987)；Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Upton et al., Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher A.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159-163 (1991)］又はこのドメインでの５-アミノ酸の挿入がＮＧＦ結合には殆ど又は全く効果がないことを示した［上掲のYan, H. and Chao, M.V.］。ｐ７５ＮＧＦＲはそのＣＲＤ４及び膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンリッチなストレッチを含んでおり、これはＮＧＦ結合には関与していない［Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988)；Seckinger, P et al., J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989)；上掲のYan, H. and Chao, M.V.］。
【０００９】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプターはＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。このような新たに同定されたＴＮＦＲのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）［Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996)；Montgomery et al., Cell, 87:427-436 (1996)；Marsters et al., J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997)；Simonet et al., Cell, 89:309-319 (1997)］を含む。上掲のSimonetらは、他の周知のＴＮＦＲ様分子とは異なり、ＯＰＧは疎水性の膜貫通−スパニング配列を含まないと報告している。下記にて検討されているように、ＯＰＧはデコイ(囮)レセプターのように作用すると考えられている。
【００１０】
Panらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan et al., Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺機構に関与可能な細胞質デスドメインを含むと報告されている。Panらは、ＤＲ４がＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997)及びPan et al., Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［１９９８年１１月１９日に公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９もまた参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている［Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９８年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１］）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【００１１】
最近同定されたＴＮＦＲファミリーメンバーの更なるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達トランスデューサーというよりはむしろ阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Pan et al., Science, 276：111-113(1997)；Sheridan et al., Science, 277：818-821 (1997)；McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneider et al., FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapaya et al., J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marsters et al., Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Pan et al., FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Esposti et al., Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［上掲のSimonet et al.］及びＤＣＲ３［Pitti et al., Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合すると報告されている。
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬは細胞表面「デスレセプター」ＤＲ４及びＤＲ５を通して作用してカスパーゼ、又は細胞内細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている。［例えば、Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)を参照のこと］。リガンド結合の際、ＤＲ４とＤＲ５は、双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１［Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000)；Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000)；Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【００１２】
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss and Dower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997)；Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)；Wallach, “TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families", Cytokine Research, Academic Press, 377-411頁(2000)を参照のこと。
多様な境界面に関与するあるタンパク質のタンパク質-タンパク質相互作用において、亜鉛結合部位は構造的役割を担うことが示されているが［Feese et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:3544-3548(1994)；Somers et al., Nature, 372: 478-481(1994)；Raman et al., Cell, 95: 939-950(1998)］、ＴＮＦファミリー（ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ-α、又はＴＮＦ-β）で以前に構造的に特徴付けられたメンバーには、金属へ結合するものはない。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ような種々のホルモンの製剤における亜鉛のような金属イオンの利用は、文献に記載されている。［例えば、１９９２年１０月１５日公開の国際公開９２／１７２００を参照のこと］。レセプターへのｈＧＨの結合における亜鉛の関与は同様に１９９２年３月５日公開の国際公開９２／０３４７８に記載されている。インターフェロン-α二量体及びインターフェロン-β二量体における亜鉛結合の役割は、それぞれWalter et al., Structure, 4:1453-1463(1996)及びKarpusas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:11813-11818(1997)に報告されている。亜鉛のような種々の金属イオンの構造的及び生物学的役割は、当該分野で概説されていおり、例えば、Christianson et al., Advances in Protein Chemistry, 42: 281-355(1991)を参照のこと。
【発明の概要】
【００１３】
本発明はＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を提供する。特に、本発明は、図１に示すＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬの天然配列（図１）中に一又は複数のアミノ酸置換を含むＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を提供する。場合によっては、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体は図９に同定されるようなシステイン置換を含み得る。コレに関連する本発明の実施態様は、図９に示すＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体ポリペプチドを含み、これはポリ（エチレングリコール）２０００などの１又は複数のポリオール群に対して抱合又は結合する。本発明はまた、そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子、及びＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を含むベクターと宿主細胞を提供する。
本発明はまた、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに示すような置換を含むＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を提供し、該置換により変異体のＤＲ４レセプター及び／又はＤＲ５レセプター結合特性が変更されている。驚くべきことに、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに示すようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体のＤＲ４及び／又はＤＲ５に関する結合親和性が（図１に示す天然Ａｐｏ−２リガンドと比較して）変化し、さらにはＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を示すことが分かった。本発明はまた、そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬをコードする核酸分子、並びにＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を有するベクター及び宿主細胞を提供する。
【００１４】
本発明の更なる実施態様は、そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を含む製造品及びキットを提供する。製造品及びキットには、容器、容器貼付ラベル、及び容器内に収容される薬剤が含まれる。容器貼付ラベルは、薬剤（又は薬剤を含む組成物）が特定の治療的又は非治療的用途に使用できるものであることを示す。薬剤は、本明細書に開示する１又は複数のＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を含む。
加えて、本明細書に開示するＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を使用する治療法及び非治療法が提供される。本発明の実施形態は、哺乳動物の細胞にアポトーシスを誘発する方法を含み、この方法は、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されたレセプターを発現する哺乳動物の細胞を、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの治療的有効量に接触させることを含む。本発明の更なる実施形態は、哺乳動物の癌を治療する方法を含み、本方法は、そのような哺乳動物に対し、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体の有効量を投与することを含む。場合によっては、該方法において、癌は肺癌、乳癌、神経膠腫、大腸癌又は結腸直腸癌であり得る。本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物の免疫関連疾患の治療法を含み、この方法は、そのような哺乳動物に対し、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含む。場合によっては、該方法において、免疫関連疾患は関節炎又は多発性硬化症であり得る。
【００１５】
本発明の様々な実施形態を以下に挙げる：
１．図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドの配列とは異なり、図１の（配列番号１）の残基位置のアミノ酸置換Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃのうち１又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２．図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該変異が表ＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換からなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
３．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ４レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
４．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
５．前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項４のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
６．前記ＤＲ４レセプターが図２Ａ−２Ｂ（配列番号３）のアミノ酸１〜２１８を有する、請求項３のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
７．前記１又は複数のアミノ酸突然変異が天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９３、１９９又は２０１に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
８．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
９．図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ａ、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ｄ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ：Ｄ２６９Ｅ、及び
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｓ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６９Ｅ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群（１セット）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１０．図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を含んでなり、該突然変異が表ＩＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含む、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１１．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１２．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１３．前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１４．前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１１のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１５．前記１又は複数のアミノ酸突然変異が天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１６．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１７．図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該突然変異が表ＶＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を有する、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１８．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１７のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１９．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１７のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２０．前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１９のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２１．前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１８のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２２．図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号１）の残基位置に：
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ；
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ；及び
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｉ２６６Ｌ
からなるグループから選択される１群（１セット）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２３．前記ポリペプチドが１又は複数のポリオールに抱合又は結合する、請求項１ないし２２のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２４．前記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項２３のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２５．前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約１０００から２５０００ダルトンである、請求項２４のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２６．請求項１ないし２２のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子。
２７．請求項２６のコード化ＤＮＡを含むベクター。
２８．請求項２７のベクターを含む宿主細胞。
２９．前記宿主細胞が大腸菌、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞である、請求項２８の宿主細胞。
３０．請求項２８の宿主細胞を前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、及び前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを前記培養物から回収することを含む、Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの生成方法。
３１．請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを含む組成物。
３２．前記組成物が、１又は複数の二価金属イオンを含む、製薬的に許容可能な製剤を含む、請求項３１の組成物。
３３．ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターを発現する哺乳動物細胞を、請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドに接触させることを含む、哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する方法。
３４．哺乳動物の癌細胞を、請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量に接触させることを含む、癌治療法。
３５．前記哺乳動物の癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、神経膠腫癌細胞、或いは大腸又は結腸直腸癌細胞を含む、請求項３４の方法。
３６．前記方法が、前記哺乳動物の癌細胞を、プロドラッグ、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤、又はサイトカインに接触させることを更に含む、請求項３４の方法。
３７．前記哺乳動物に対し、請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳動物の免疫関連疾患治療法。
３８．前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項３７の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＡｐｏ−２リガンドｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列と、それに得られたアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド位置４４７（配列番号２）の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であることを示すために使用されている。
【図２Ａ】完全長ヒトＤＲ４レセプターのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）と、それに得られたアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヒトＤＲ４レセプターの対応するヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、Pan et al., Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図２Ｂ】完全長ヒトＤＲ４レセプターのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）と、それに得られたアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヒトＤＲ４レセプターの対応するヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、Pan et al., Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図３Ａ】１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３に開示されているヒトＤＲ５レセプターの４１１アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図３Ｂ】１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６に開示されている、ヒトＤＲ５の別の形態である４１０アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｃ】１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６に開示されている、ヒトＤＲ５の別の形態である４１０アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４Ａ】Ａｐｏ−２Ｌの結晶構造を示す。三重の軸に沿った三量体が示されている。単量体はみな同一である。残基１２０から始まるタンパク質構造は秩序正しく、残基１３１−１４１と１９５−２０１は乱れている（破線で示す）。対象な関係にある３つのシステインを含む亜鉛結合部位及び溶媒リガンドを図中の空白として示す。
【図４Ｂ】亜鉛結合部位の拡大立体斜視図である。Ｓγ−亜鉛−Ｓγ間の角度は１１２度であり、Ｓγ−亜鉛−溶媒間の角度は１０７度であり、このときの結合距離は亜鉛−硫黄間で２．３Å、及び亜鉛−溶媒間で２．３Åであった。図４ＢはプログラムＭｏｌｓｃｒｉｐｔ[Kraulis et al., J. Appl. Cryst., 24:946-950 (1991)]及びＲａｓｔｅｒ３Ｄ[Merrit et al., Acta Cryst., D50:869-873 (1994)]を用いて作成した。
【図４Ｃ】結晶学的データのまとめである。
【図５】選択したＴＮＦファミリーメンバー、即ちＡｐｏ２Ｌ（配列番号７）；ＴＮＦ−β（配列番号８）；ＴＮＦ−α（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；ＦａｓＬ（配列番号１１）；ＲＡＮＫＬ（配列番号１２）の配列アラインメントを示す。配列の上の矢印は、Ａｐｏ２Ｌ中のβ鎖を示す。整列させた配列上の番号は図１（配列番号１）に示したＡｐｏ２Ｌ配列番号と対応している。
【図６】Ａｐｏ−２Ｌの空間を満たすモデル上にマッピングした突然変異の分析を示す。アラニンに変異導入されたとき生理活性が５分の１未満に低下した残基を標識し、濃いグレーで示した。変異導入された他の残基が中程度の濃さのグレーで示され、うち数個が標識されている。
【図７Ａ】Ａｐｏ２Ｌ・ＤＲ５複合体（Hymowitz等, (1999) Mol. Cell. 4, 563）のＸ線結晶構造に見られる「パッチＡ」接触を示す。Ａｐｏ２Ｌのバックボーンの跡と選択された側鎖が濃いグレーで、ＤＲ５のバックボーンの跡と選択された側鎖が薄いグレーで示されている。ＤＲ５のレセプター配列として配列番号５のアミノ酸１４３−１５７、及びＤＲ４のレセプター配列として配列番号３のアミノ酸１９４−２０８が示されている。
【図７Ｂ】Ａｐｏ２Ｌ・ＥＣＤ複合体に決定されたＸ線構造を示す別の図である。
【図８Ａ】Ａｐｏ−２Ｌ変異体の同定に使用される一価のファージディスプレイの概略図である。
【図８Ｂ】Ａｐｏ−２Ｌファージディスプレイライブラリーの実施形態を例示する。
【図８Ｃ】ＤＲ４（グレー）又はＤＲ５（黒）への特異的結合のファージライブラリーの濃縮を示すグラフである。各回における濃縮は、空のウェルからの溶出に対する、レセプターでコーティングしたウェルから溶出されたファージの比として計算した。ＤＲ４−ＩｇＧへの結合についてＤＲ４ライブラリーを５回ソーティングし、３−５回目には競合者としてＤＲ５−ＩｇＧを含めた。ＤＲ５ライブラリーをＤＲ５−ＩｇＧへの結合について８回ソーティングし、５−８回目には競合者としてＤＲ４−ＩｇＧを含めた。
【図９】列挙された残基にシステイン置換を有する様々な天然及びペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体のＥＤ５０比を示すグラフである。
【図１０Ａ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｂ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｃ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｄ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｅ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｆ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｇ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、マウスにおける部分的にペグ化された５Ｋ及び２０ＫのＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ又は２Ｋ−ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ及びＡｐｏ２Ｌ．０の薬物動態を示す。０時間目に、マウスにＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又は２Ｋ−ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃを腹腔内注射した。これらのデータは、部分的にペグ化した変異体がＡｐｏ２Ｌ．０よりも長い半減期を持つことを示す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、マウス異種移植モデルにおける部分的にペグ化されたＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体のヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍に対する効果を示す。胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５×１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（NCI）を皮下注射した。腫瘍を形成させてノギス測定の結果約５００−１５００ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウスにビヒクル（２×／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）、又はペグ化したＡｐｏ−２Ｌ変異体（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）を腹腔内注射した。３日ごとに腫瘍体積を測定し、２週間後に処置をやめた。
【図１３】クリスタルバイオレットアッセイにおけるＡｐｏ−２ＬとＫ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０のカニクイザルの肝細胞に対する効果を示す。
【図１４】オンライン光分散検出器（ＭＡＬＳ）（Wyatt Technology, Inc.）を備えたクロマトグラフシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Biotech）上におけるサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により５Ｋ又は２０ＫのＰＥＧ−マレイミドを用いて部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの分析結果を示す。実線はＵＶトレースを表し、記号は光分散データから計算したモル質量を示す。
【図１５】ＤＲ４−ＩｇＧを用いたＤＲ４ライブラリークローンによる競合ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。ファージＥＬＩＳＡではＤＲ４−ＩｇＧ及び抗Ｍ１３抗体−ＨＲＰコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタプレートのウェルを使用して結合ファージを検出した。ＤＲ４−ＩｇＧの溶液濃度結合を増大することにより結合を競合させた。
【図１６】ＤＲ５−ＩｇＧを用いたＤＲ４ライブラリークローンによる競合ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。ファージＥＬＩＳＡではＤＲ４−ＩｇＧ及び抗Ｍ１３抗体−ＨＲＰコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタプレートのウェルを使用して結合ファージを検出した。ＤＲ５−ＩｇＧの溶液濃度結合を増大することにより結合を競合させた。
【図１７】ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体によるＣｏｌｏ２０５大腸癌細胞上のアポトーシス誘発のアッセイを示す。Hymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640に開示された蛍光アッセイを使用してＤＲ５選択性（パネルＡ）又はＤＲ４選択性（パネルＢ）突然変異体を試験した。「抗Ｆｌａｇ」とは、２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）が特定の濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体と共に添加されていることを示す。曲線は４パラメータ式を用いた適合を示す。
【図１８】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのレセプター選択性突然変異体によるジャーカット細胞上のアポトーシス誘発のアッセイを示す。Hymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640に開示された蛍光アッセイを使用してＤＲ５選択性（パネルＡ）又はＤＲ４選択性（パネルＢ）突然変異体を試験した。「抗Ｆｌａｇ」とは、２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）が特定の濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体と共に添加されていることを示す。曲線は４パラメータ式を用いた適合を示す。
【図１９】指定濃度の変異体Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）存在下におけるカニクイザル肝細胞の生存度を示す。クリスタルバイオレット染色を使用して肝細胞の生存度を測定した。
【図２０】オンライン光分散検出器（ＭＡＬＳ）（Wyatt Technology, Inc.）を備えたクロマトグラフシステムを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Biotech）上におけるサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による２ＫＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ及びカルボキシアミドメチル化したＫ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ（ＩＡＭ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ）の分析結果を示す。実線はＵＶトレースを表し、塗りつぶした四角の記号は光分散データから計算したモル質量を示す。
【図２１】マウスにおけるペグ化Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ及びＡｐｏ２Ｌ．０の薬物動態を示す。マウスに５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇのタンパク質を静脈内注射した。指定の時間に血清試料を回収し、Ａｐｏ２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【図２２】マウス異種移植モデルにおけるＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対するペグ化Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの効果を示す。３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０又はペグ化Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを１回だけマウスに静脈内注射した。マウスの別のグループには、「標準的」な処置計画に対応する処置として、６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０を５回腹腔内投与した。
【００１７】
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ」及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、ここでは図１（配列番号１）に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４−２８１、９５−２８１、残基９２−２８１、残基９１−２８１、残基４１−２８１、残基３９−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１、並びに上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入、又は置換変異体を含むポリペプチド配列を意味するものとして互換可能に使用される。一実施態様では、ポリペプチド配列は図１（配列番号１）の残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は図１（配列番号１）の残基９２−２８１又は残基９１−２８１を含む。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは図１に示された天然ヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９（図１；配列番号２）をコードするコドンは「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」でありうる。場合によっては、断片又は変異体は生物学的に活性であり、上記の配列の何れか一と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。この定義には、その天然のアミノ酸の少なくとも一がアラニン残基のような他のアミノ酸によって置換されているＡｐｏ−２リガンドの置換変異体が包含される。随意的な置換変異体は、以下の図９及び表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに特定された残基の置換の一又は複数を含む。定義には、組換え又は合成法によって調製された、又はＡｐｏ−２リガンド源から単離された天然配列Ａｐｏ−２リガンドもまた包含される。本発明のＡｐｏ−２リガンドは１９９７年１月１６日公開の国際公開９７／０１６３３、１９９７年７月１７日公開の国際公開９７／２５４２８、１９９９年７月２２日公開の国際公開９９／３６５３５、２００１年１月４日公開の国際公開０１／００８３２、２００２年２月７日公開の国際公開０２／０９７５５、及び２０００年１２月１４日公開の国際公開００／７５１９１に開示されたＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドを含む。本用語は、一般に、ポリペプチドの単量体、二量体、三量体、六量体又は命令オリゴマーを含むＡｐｏ−２リガンドの形態を意味するものとして使用される。Ａｐｏ−２Ｌ配列において言及されているアミノ酸残基の全ての番号付けは、特に他の定義を述べない限り、図１（配列番号：１）における番号付けを使用している。例えば、「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は図１（配列番号：１）に与えられた配列中、位置２０３のアスパラギン酸残基を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する「Ａｐｏ−２リガンド選択的変異体」という用語は、天然Ａｐｏ−２リガンド配列に１又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターに対して選択的な結合親和性を有するＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを指す。一実施形態では、Ａｐｏ−２リガンド変異体はＤＲ４レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、又は２０９のいずれか１つに１又は複数のアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ａｐｏ−２リガンド変異体はＤＲ５レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９のいずれか１つに１又は複数のアミノ酸置換を含む。
好ましいＡｐｏ−２リガンド選択的変異体は、１又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンド変異体がＤＲ４レセプターに対して示す以上（≧）の結合親和性を示す。さらに好ましくは、Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ５に対して示すより小さい（＜）結合親和性を示す。このようなＡｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい（不変である）か、それよりも大きく（増大している）、Ａｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、小さいか、殆ど消滅しており、ここでの目的のため、Ａｐｏ−２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ４レセプターについて「選択性」であると考えられる。好ましい本発明のＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１０分の１以下の結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ５レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１００分の１以下の結合親和性を有する。Ａｐｏ−２リガンド変異体それぞれの結合親和性を測定し、本技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより（１１４−２８１形式等の）天然Ａｐｏ−２Ｌの結合特性と比較することができる。これについては実施例で後述する。本発明の好ましいＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）にアポトーシスを誘発し、そのようなアポトーシス活性を実施例のアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体の、Ａｐｏ−２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対する結合親和性は、変化していても、していなくともよく、それらデコイレセプターを当技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと呼ぶ。
【００１９】
さらなる好ましいＡｐｏ−２リガンド選択的変異体は、１又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ５レセプターに対して示す以上（≧）の結合親和性を示し、さらに好ましくは、そのようなＡｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ４に対して示すより小さい結合親和性を示す。このようなＡｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい（不変である）か、それよりも大きく（増大している）、Ａｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、それより小さいか、殆ど消滅しており、ここでの目的のため、Ａｐｏ−２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ５レセプターについて「選択性」であると考えられる。好ましい本発明のＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１０分の１以下の結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ４レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１００分の１以下の結合親和性を有する。Ａｐｏ−２リガンド変異体それぞれの結合親和性を測定し、本技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより（１１４−２８１形式等の）天然Ａｐｏ２Ｌの結合特性と比較することができる。これについては実施例で後述する。本発明の好ましいＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）にアポトーシスを誘発し、そのようなアポトーシス活性を実施例のアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体の、Ａｐｏ−２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対する結合親和性は、変化していても、していなくともよく、それらデコイレセプターを当技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと呼ぶ。
【００２０】
本明細書に開示するＡｐｏ−２リガンド変異体を省略して表記するため、天然配列Ａｐｏ−２リガンドのアミノ酸配列（図１参照）に沿ったアミノ酸残基の位置に番号を付与する。アミノ酸の識別には以下のようなアミノ酸のアルファベット１文字を使用する。
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｔｈｒ Ｔ スレオニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
【００２１】
ここで使用される「ＤＲ４」及び「ＤＲ４レセプター」という用語は、Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)；１９９８年７月３０日公開の国際公開９８／３２８５６；２００２年１月２９日発行の米国特許第６３４２３６３号；及び１９９９年７月２９日公開の国際公開９９／３７６８４に記載されているレセプターの完全長可溶性細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ４レセプターの完全長アミノ酸配列は、貼付図面の図２Ａ−２Ｂに与えられている。ＤＲ４の細胞外ドメインを有するＩｇ−融合タンパク質を以下の実施例に開示する。
ここで使用される「ＤＲ５」及び「ＤＲ５レセプター」という用語は、Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)；Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)、２０００年６月６日発行の米国特許第６０７２０４７号、１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９；Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許第８７０８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１に記載されているレセプターの完全長可溶性細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ５レセプターは当該分野においてＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている。ここで使用されるＤＲ５という用語には、図３Ａに提供された完全長４１１アミノ酸ポリペプチド及び図３Ｂ−３Ｃに提供された完全長４４０アミノ酸ポリペプチドが含まれる。ＤＲ５の細胞外ドメインを有するＩｇ−融合タンパク質を以下の実施例に開示する。
【００２２】
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は広義に多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。本発明のポリオールには当該分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合（コンジュゲート）」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合（joined）又は結合（linked）されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
【００２３】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」という用語は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に持たないリガンド又はレセプターの型を意味する。通常、可溶性ＥＣＤは、そのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。
「Ａｐｏ−２リガンド単量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ単量体」という用語はＡｐｏ−２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有結合鎖を意味する。
「Ａｐｏ−２リガンド二量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ二量体」という用語はジスルフィド結合を介して共有結合によって結合した二つのＡｐｏ−２Ｌ単量体を意味する。ここで使用される該用語には、Ａｐｏ−２Ｌの三量体型内にあるＡｐｏ−２Ｌ二量体及び遊離しているＡｐｏ−２Ｌ二量体が含まれる（すなわち、他のＡｐｏ−２Ｌ単量体と結合している）。
「Ａｐｏ−２リガンド三量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ三量体」という用語は非共有的に結合している(associated)三つのＡｐｏ−２Ｌ単量体を意味する。
【００２４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ−２リガンド、又はＡｐｏ−２リガンド変異体、又はそれらの部分等のタンパク質を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、抗体が産生され得るモノに対するエピトープを提供するのに十分な残基を有しているが、Ａｐｏ−２リガンド又はＡｐｏ−２リガンド変異体の活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０から約２０の残基)を有する。
「二価の金属イオン」という用語は、二つの正電荷を有する金属イオンを称する。本発明において使用される二価金属イオンの例には、限定されるものではないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム、及びマンガンが含まれる。かかる金属の特定の形態は塩形態（例えば、製薬剤的に許容可能な塩形態）、例えば、上述の二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩形態を含むものが用いられうる。本発明において使用される好適な二価金属イオンは、亜鉛、より好ましくはその塩形態、硫酸亜鉛である。ここにおいて記載の二価金属イオンは、好ましくは、例えば、（１）所望する期間にわたってＡｐｏ−２Ｌ三量体の貯蔵安定性を高め、（２）組換え細胞培養又は精製法においてＡｐｏ−２Ｌ三量体の生産又は収量を高め、（３）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の溶解性を高め（又は凝集性を低下させ）、又は（４）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の形成を高めるのに十分な濃度又は量（例えば有効量）で用いられる。
【００２５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。Ａｐｏ−２リガンドの自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツでのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」Ａｐｏ−２リガンド核酸分子は、同定され、Ａｐｏ−２リガンド核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ−２リガンド核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ−２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ−２リガンド核酸分子を含む。
【００２６】
ここで特定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るために間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、Ａｐｏ−２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成可能であり、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを割り当てることを含み、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸同一性値は、ジェネンテック社によって作成され、ソースコードが米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, CAを通して公に入手可能である。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ-２プログラムにより設定され、変化しない。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２７】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ここにおける目的のための「生物学的に活性」又は「生物学的活性」は、（ａ）インビボ又はエキソビボで少なくとも一種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）又はウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘導し又は刺激する能力を有すること；（ｂ）抗体を産生することが可能であること、すなわち免疫原性であること；（ｃ）ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、又はＯＰＧ等のＡｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬのレセプターへ結合し及び／又はこれを刺激することが可能あること；又は（ｄ）天然又は天然に生じるＡｐｏ−２Ｌポリペプチドの活性を保持することを意味する。
【００２８】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を典型的に伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡ電気泳動法により決定し測定することができる。
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、多形神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞腫などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫等）、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルム腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び神経芽細胞び頭部及び頸部の様々な癌が含まれる。
【００２９】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液又は細胞の免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
【００３０】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤(parent drug)に比較して癌細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化されるか又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman,「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella et al.,「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt et al.（編）, pp.247-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、後述の化学療法剤が含まれる。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、並びにそれらの断片及び／又は変異体を含むことを意図する。
【００３１】
「化学療法剤」は、癌のような状態の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコデイチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルチノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)のようなマイトマイシン(mitomycins）；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３２】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００３３】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αあるいはＴＧＦ−βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン−α、−β、及び−γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；ＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００３４】
ここで使用される「治療する」、「治療」、及び「療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
ここで使用される「哺乳類」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、犬及びネコを含む哺乳類と分類されるあらゆる動物に相当する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳類はヒトである。
【００３５】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ＴＮＦリガンドファミリーに関連した新規サイトカインで、ここにおいて「Ａｐｏ−２リガンド」又は「ＴＲＡＩＬ」と特定されたサイトカインが記載されている。ヒト天然Ａｐｏ−２リガンドの予測成熟アミノ酸配列は、２８１個のアミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算上の分子量を有する。シグナル配列が存在せず内在性疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ−２リガンドがＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示唆する。また、可溶性細胞外ドメインＡｐｏ−２リガンドポリペプチドが記載されている。例えば１９９７年７月１７日に公開のＷＯ９７／２５４２８を参照のこと。Ａｐｏ−２Ｌ置換変異体がさらに記載されている。アラニンスキャンニング技術が、生物学的活性を有する種々の置換変異体分子を同定するために利用されてきた。Ａｐｏ−２リガンドの特定の置換変異体は、少なくとも一つのアミノ酸がアラニン残基等の別のアミノ酸残基によって置換されているものを含む。これら置換変異体は、例えば「Ｄ２０３Ａ」、「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されている。この命名法は、位置２０３、２１８、及び／又は２６９（図１（配列番号１）に示した番号を使用）の残基がアラニン残基によって置換されているＡｐｏ−２リガンド変異体を同定するために利用されている。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、図９に示されているか、又は下記の表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに記載されている置換の一又は複数を含んでもよい。場合によっては、このようなＡｐｏ−２Ｌ変異体はＤＲ４又はＤＲ５レセプター選択的変異体である。このようなＤＲ４又はＤＲ５レセプター選択的変異体は様々な用途、例えばＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターのいずれかのみを発現する癌細胞の治療、及びＤＲ４及びＤＲ５レセプターの標本の精製において、有用である。
Ａｐｏ−２リガンドの細胞外ドメインのＸ線結晶構造が本明細書に開示され、アラニンスキャンニング突然変異誘発が、そのレセプター接触領域のマッピングを提供するために実施されている。Ａｐｏ−２リガンドに対して得られた構造は、Ａｐｏ−２リガンド三量体分子の三つのサブユニットの相互作用を統合する新規な二価金属イオン（亜鉛）結合部位を含むホモ三量体タンパク質を明らかにする。
【００３６】
Ａｐｏ−２ＬのＸ線構造は、ＴＮＦ-αのモデルを利用する分子置換［Eck et al., J. Bio. Chem., 264: 17595-17605 (1989)］によって決定され、３．９オングストローム（１１４−２８１残基形態に対して）及び１．３オングストローム（Ｄ２１８Ａ変異体；９１−２８１形態に対して）まで精緻化される。ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、Ａｐｏ−２Ｌは、約５１００平方オングストローム（単量体当たり平方１７００オングストローム）を埋めて球状三量体を形成する、三つのゼリーロール単量体からなる緻密な三量体を含むと思われる（図４を参照のこと）。コアのβストランドの位置は、ＴＮＦファミリーの他の構造的に特徴付けられたメンバーのＴＮＦ-α［Eck et al., 上掲；Jones et al., Nature, 338:225-228(1989)］、ＴＮＦ-β［Eck et al., J. Biol. Chem., 267:2119-2122(1992)］、及びＣＤ４０Ｌ［Karpusas et al., Structure, 3:1031-1039(1995)］で、ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β のコアストランドと比較して０．８オングストロームのr.m.s.d.のものと比較して良好に保持されている。Ａｐｏ−２Ｌ三量体の境界面のどの残基も、現在知られている全てのヒトＴＮＦファミリーメンバーの配列において完全に保持されているものはないようである；しかしながら、これら残基の疎水化学的性質は保持されている。Ａｐｏ−２Ｌ三量体における保境界面の保持された残基は、塩基の近傍（三量体の最も広い部分）及び三回転軸に沿ってクラスターを形成する。Ｃｙｓ２３０の近傍のＡｐｏ−２Ｌ三量体境界面の頂点の近くでは、構造は分岐しているように思われ、１９０及び２３０のループのコンホメーションは各構造において変動する。
β骨格コアとは対照的に、レセプター結合表面及びループの構造は、ＴＮＦファミリーメンバーの中でかなり変化する。Ａｐｏ−２リガンドの構造とＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、及びＣＤ４０Ｌの構造の間の一つの違いは、ストランドＡ及びＡ’の間の接合である。ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、及びＣＤ４０Ｌでは、ストランドＡの後に、緻密なループが続いている。Ａｐｏ−２リガンドでは、１５残基の挿入がこのループを長くし、そのコンホメーションを変える。ループの最初の部分（残基１３１から１４１）は、ループの二番目の部分（残基１４２から１５４）がＣＤ４０Ｌに類似するコンホメーションをそのＣ末端部分に有して、分子の表面を一つの単量体-単量体境界面から次へと越える際に乱れる。
【００３７】
三量体化境界面の頂点の近くに、二価金属イオン（亜鉛）結合部位が埋もれている。ＴＮＦファミリーメンバーは、配列分析によって、Ｃｙｓ２３０に関して三つのグループに分けられる：（１）Ｃｙｓ２３０に対応する位置のシステイン残基に、金属イオンとの相互作用を妨げるジスルフィド結合を形成することが可能な隣接ループ（Ａｐｏ−２Ｌの１９４−２０３ループ）の中の他のシステインが伴っているＴＮＦ-α及びＦａｓリガンドのようなタンパク質、（２）Ｃｙｓ２３０に対応するシステインを持たないタンパク質（例えばＴＮＦ−β及びＯＰＧＬ）、及び（３）Ｃｙｓ２３０に対応するシステイン残基を一つのみ有するタンパク質である。Ａｐｏ−２Ｌ及び他の種におけるそのオルソログは、後者の基準に当てはまり（すなわち、Ｃｙｓ２３０のみを持つタンパク質）、三量体表面において二価金属イオンと結合することが期待される。Ａｐｏ−２ＬのＣｙｓ２３０の直ぐ前の主要鎖のコンホメーションは、ＴＮＦ-α及びＣＤ４０ＬのようなＴＨＦファミリーメンバーを含むジスルフィドとは異なる。Ａｐｏ−２Ｌでは、Ｃｙｓ２３０の側鎖は、境界面から遠ざかるのではなく、境界面に向かっている。
【００３８】
各Ａｐｏ−２Ｌ単量体のＣｙｓ２３０残基は内部を三量体軸へ向いて内方を指し、内部の溶媒分子と共に二価金属イオンを配位する。この二価金属イオン結合部位は、亜鉛結合部位にとって適切な結合及び角度を持つ僅かに歪んだ四面体幾何を示し、溶媒へは完全に接触不可能である。結合金属の同一性は、誘導結合プラズマ原子発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を利用して確認された。ＩＣＰ-ＡＥＳを利用したＣｄ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＣｕの定量分析では、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の一分子当たり０．７９モルのＺｎと０．０６モルのＣｏが検出され、構造中の結合イオンが、約１対１のモル比の亜鉛であることが示された。この部位の重要性は、Ｃｙｓ２３０のアラニン置換が８倍未満のアポトーシス活性の減少となったという観察によって立証された。更に、キレート試薬に対する透析によるＡｐｏ−２Ｌからの結合金属の除去により、ＤＲ５親和性の７倍の低下及びアポトーシス活性の９０倍未満の低下が生じた。Ｚｎの除去によって、システインは酸化されやすくなり、アポトーシス活性が低下したジスルフィド結合Ａｐｏ−２Ｌ二量体が形成された。金属結合部位はＡｐｏ−２Ｌ三量体構造に埋もれているように思われ、レセプターに接触するとは予想されないことから、データは、二価金属イオン結合が、Ａｐｏ−２Ｌの安定性と三量体構造を維持するのに重要であろうことを示唆している。
【００３９】
Ａｐｏ−２リガンドのレセプター結合部位をマッピングするために、レセプター結合及び生物学的活性にとって重要なアミノ酸残基がアラニンスキャンニング突然変異誘発法によって同定された［Cunningham et al., Science, 244:1081-1085(1989)］。残基Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、又はＴｙｒ２３７での一つのアラニン置換により、バイオアッセイのアポトーシス活性が５分の１未満に減少し、レセプターに対する親和性の減少が示された。ＤＲ４、ＤＲ５及びＤｃＲ２へのＡｐｏ−２Ｌの結合は、残基Ｇｌｎ２０５、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、又はＴｙｒ２３７でのアラニン置換によって最も影響を受け、これによって三つのレセプターすべてに対する親和性が５分の１以下に減少した。また、減少したアポトーシス活性を有するこれら変異体のすべては、ＤＲ４又はＤＲ５のどちらか（又は両方）に対して正常に機能しない結合を示したが、これはレセプター結合がアポトーシス活性に必要であることを示している。
残基Ａｓｐ２１８及びＡｓｐ２６９でのアラニン置換は、アポトーシス活性が増大したＡｐｏ−２Ｌ変異体を生じた。残基Ａｓｐ２１８は、Ｔｙｒ２１６に近くに位置し、アポトーシス活性にとっては必要な残基の一つである。低分解Ａｐｏ−２Ｌ構造（１１４−２８１形態）との比較により、２１６−２２０ループの高次構造がＤ２１８Ａ変異の存在によって有意に改変されたように思えないことが示された。
【００４０】
突然変異誘発分析の結果をＡｐｏ−２Ｌ三量体構造にマッピングした際、レセプター結合及び生物活性のためのＡｐｏ−２Ｌ上の機能的エピトープは、ＴＮＦ−ベータに類似し、二つの単量体の接合点によって形成された表面に位置することが発見された。単量体−単量体境界面の浅い溝は、結合部位へ寄与する両単量体を有するレセプター結合部位を形成する。また、ＴＮＦ−アルファの残基Ａｒｇ３２、Ｔｙｒ８７、及びＡｓｐ１４３（Ａｐｏ−２Ｌの残基Ａｒｇ１５８、Ｔｙｒ２１６、及びＡｓｐ２６７に対応する）ＴＮＦレセプター結合へ寄与する［Goh et al., Protein Engineering, 4:785-791(1991)］。対照的に、ＴＮＦ−アルファの残基（Ａｐｏ−２Ｌの残基Ｇｌｎ２０５、Ｇｌｕ２３６、及びＴｙｒ２３７に対応する）は、ＴＮＦＲ結合において比較的重要ではない役割を担う。従って、ＴＮＦ−アルファにとって、レセプター結合へは三量体構造の底部が最も重要な貢献をする一方で、Ａｐｏ−２Ｌでは、重要なレセプター結合残基は、同じく三量体構造の頂点に存在している。Ａｐｏ−２Ｌは、その標的レセプターとの相互作用のため接触表面がより大きく、拡張している点で、構造が知られているＴＮＦファミリーメンバーの中では独特であると思われる。随意的実施形態において、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基（すなわち、変異されていない）を含むと考えられている。
下記の説明は、核酸をコードするＡｐｏ−２リガンドを含むベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞の培養、及び細胞培養からポリペプチドを回収することによって、本明細書に開示するＡｐｏ−２リガンド変異体等のＡｐｏ−２リガンドを生産する方法に関する。
【００４１】
Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ−２リガンドｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得ることできる。従って、ヒトＡｐｏ−２リガンドＤＮＡは、国際公開９７／２５４２８に記載されているヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリーのような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることが可能である。また、Ａｐｏ−２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ−２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ−２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook et al., 上掲；Dieffenbach et al., PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００４２】
Ａｐｏ−２リガンドのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ−２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような断片又は変異体は、完全長Ａｐｏ−２リガンドについて図１（配列番号１）に示したアミノ酸配列の、又は細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠失を示す。最終構築物が例えばここに定義するように所望の生物活性、例えばアポトーシス活性を有する限り、挿入、置換及び／又は欠失の任意の組み合わせで最終構造物に到達することができる。場合によっては、実施例に開示するようなファージライブラリー選択法によりＡｐｏ−２リガンド変異体を同定できる。好ましい実施態様では、断片又は変異体は、Ａｐｏ−２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ−２リガンドの完全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、又は膜係留特性（膜アンカー特性）の改変のように、Ａｐｏ−２リガンドの翻訳後プロセスを改変し得る。
ここで記載されているＡｐｏ−２リガンド配列における変異は、米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して生じさせることができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を含む。
【００４３】
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunningham et al., Science, 244: 1081 (1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることによっても好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：１(1976)］。
本発明の特定のＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図９又は下記の表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに与えられた一又は複数の列挙された置換を含むＡｐｏ−２Ｌポリペプチドを含む。このようなＡｐｏ−２Ｌ変異体は、典型的には、少なくとも一又は複数のアミノ酸が天然配列Ａｐｏ−２Ｌアミノ酸配列（例えば、図１（配列番号１）に提供のもの、Ａｐｏ−２Ｌの完全長又は成熟形態あるいはその細胞外ドメイン配列、例えば１１４−２８１アミノ酸形態）と異なる非天然に生じるアミノ酸配列を含む。場合によっては、天然Ａｐｏ−２Ｌと比較してＡｐｏ−２Ｌ変異体において異なる一又は複数のアミノ酸は、図９又は表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに示されたもののようなアミノ酸置換を含む。本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図１（配列番号１）の残基３９−２８１、４１−２８１、９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１、９６−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、図９又は表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに記載されている一又は複数のアミノ酸置換を有する可溶性Ａｐｏ−２Ｌ変異体を含む。好ましいＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図１（配列番号１）の残基９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに記載された一又は複数のアミノ酸置換を有し、これによりＤＲ４又はＤＲ５のレセプター結合又はレセプター選択性など生物活性が増強される。
【００４４】
また、本発明の範囲に含まれるＡｐｏ−２リガンド配列の変異体は、アミノ末端誘導体又は修飾形にも関連する。このようなＡｐｏ−２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン（例えばホルミルメチオニル又は他のブロックされたメチオニル種など）を有するここに記載した任意のＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを含む。
天然又は変異体Ａｐｏ−２リガンドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。用いられるであろう任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終結配列は当該分野で知られており、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳しく記載されている。
【００４５】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ−２リガンド核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合したＡｐｏ−２リガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例えば、栄養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ−２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ−２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
原核生物及び真核生物宿主に適したプロモーターは当該分野で知られており、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳しく記載されている。
【００４６】
大腸菌における可溶性Ａｐｏ−２Ｌの生産の好ましい方法には、生産物発現の制御のための誘発的プロモーターが用いられる。制御可能な誘発的なプロモーターの利用は、生産物発現の誘発、及び宿主によってよく耐えることのできないかなりの量の生産物の蓄積の前に、所望する細胞密度への培養成長を可能にする。
Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の発現のために、三つの誘発的なプロモーター系（Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ））が出願人によって評価された。これら三つのプロモーターのそれぞれの利用は、収集細胞ペーストから回収されたかなりの量の可溶性で生物学的に活性なＡｐｏ−２Ｌ三量体を結果として生じた。しっかりとしたプロモーターコントロール、及び収集細胞ペーストにおいて到達したより高い細胞密度及び力価のために、試験されたこれら三つの誘発的なプロモーター系の中でＡＰプロモーターが好まれている。
【００４７】
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)を参照のこと］。
Ａｐｏ−２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrook et al., 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＡｐｏ−２リガンドであるＡｐｏ−２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的に特に有用である。
【００４８】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ−２リガンドの合成に適応化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００４９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ−２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化Ａｐｏ−２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含むすべてのこのような宿主細胞の例は、さらに国際公開９７／２５４２８に記載されている。
宿主細胞を形質移入し、好ましくは上述のＡｐｏ−２リガンド産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００５０】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際公開９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００５１】
Ａｐｏ−２リガンドを生産するために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookらにより記載されているような適切な培地で培養される。大腸菌の培養に用いることができる培養培地の特定の形態は、後述の実施例でさらに説明する。大腸菌の培養に用いられうる培養培地の特定の形態は、下記の実施例にさらに記載されている。Ａｐｏ−２リガンドを生産するための哺乳動物宿主細胞は、種々の培養培地において培養することができる。
市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「ＤＭＥＭ」、シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００５２】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
本発明の一側面では、宿主細胞の培養又は発酵のために、典型的には一又は複数の二価金属イオンが培養培地へ添加されるかあるいは含まれる。二価金属イオンは、好ましくは、貯蔵安定性を増すため、溶解性を増すため、又は一又は複数の亜鉛イオンによって調整される安定なＡｐｏ−２Ｌ三量体の形成を補助するために十分な濃度レベルで培養培地に存在するかあるいは添加される。添加されうる二価金属イオンの量は、一部は培養中の宿主細胞密度又はこのような二価金属イオンへの潜在的な宿主細胞感受性に依存する。培養におけるより高い細胞密度では、二価金属イオンの濃度を増すことは有益である。宿主細胞による生産物の発現中又は発現後に二価金属イオンが添加される場合は、宿主細胞による産物の発現が増加するのに応じて二価金属イオン濃度を調節又は増加させることが望ましい。典型的な普通に入手可能な細胞培養培地に存在しうる微量レベルの二価金属イオンは、安定な三量体形成には十分ではないと一般的に考えられている。したがって、本明細書に開示するように、更なる量の二価金属イオンの添加が好ましい。
【００５３】
培養中の宿主細胞の成長期の間に二価金属イオンが添加される場合は、二価金属イオンは、逆に又は負の方向に宿主細胞へ影響しない濃度で培養培地へ添加されるのが好ましい。振盪フラスコ培養では、１ｍＭより高い濃度でのＺｎＳＯ４の添加は、結果として低い宿主細胞密度を生じる可能性がある。当業者であれば、細菌細胞は、細胞マトリックスと金属イオン複合体を形成することで、効果的に金属イオンを隔離することが可能であることが分かる。従って、細胞培養では、成長期の後（所望する宿主細胞密度に達した後）又は宿主細胞による生産物発現の直前に、選択された二価金属イオンを添加することが好ましい。十分な量の二価金属イオンが存在していることを確かめるために、更なる二価金属イオンを、生産物発現期の間に細胞培養培地へ添加又は供給することができる。
培養培地の二価金属イオン濃度は、宿主細胞に対して有害又は毒性でありうる濃度を越えてはならない。宿主細胞として大腸菌を用いる本発明の方法では、培養培地の二価金属イオンの濃度が約１ｍＭ（好ましくは≦１ｍＭ）を越えないことが好ましい。さらにより好ましくは、培養培地の二価金属イオン濃度は、約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルである。最も好ましくは、このような方法で使用される二価金属イオンは硫酸亜鉛である。金属イオン及びＡｐｏ−２リガンド三量体が１対１モル比で存在することが可能である量の二価金属イオンを細胞培養へ添加することが望ましい。
【００５４】
二価金属イオンは、細胞培養へ如何なる許容可能な形態でも添加が可能である。例えは、金属イオンの溶液は水を使って調製することが可能であり、次に、二価金属イオン溶液は培養培地へ添加又は供給することが可能である。
Ａｐｏ−２Ｌの発現は、例えば、ここに記載された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、一般的なサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインシトゥハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いる方法もまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性核種、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位となる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、検定を実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定によって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等である。
【００５５】
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ−２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
Ａｐｏ−２リガンドは、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶菌液から回収してもよい。Ａｐｏ−２リガンドが膜結合性である場合は、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
【００５６】
Ａｐｏ−２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、Ａｐｏ−２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、Ａｐｏ−２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ−２リガンドを精製することが通常必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ−２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
好ましい実施態様では、Ａｐｏ−２リガンドはアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ−２リガンド断片又は変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な性質変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ−２リガンドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とのＡｐｏ−２リガンド融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着させるために使用することができる。
【００５７】
例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ−２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ−２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
このような精製工程では、回収されたＡｐｏ−２Ｌを二価金属イオン含有溶液又は一又は複数の二価金属イオンを含有する精製物質（例えばクロマトグラフィー媒体又は支持体）へ曝露することが望ましいであろう。好ましい実施態様では、二価金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用される。場合によっては、ＤＴＴ又はＢＭＥのような二価金属イオン及び還元剤の両方を、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用してもよい。精製又は回収の間に二価金属イオンを使用することは、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の安定性を提供するか、あるいは細胞培養段階の間に形成されるＡｐｏ−２Ｌ三量体を維持すると考えられる。
【００５８】
以下の記載はまた一又は複数の化学基に共有的に結合した（以下「抱合された(conjugated)」）Ａｐｏ−２リガンド変異体を製造する方法に関する。本発明のＡｐｏ−２Ｌ抱合体に使用するのに適した化学基は好ましくは有意に毒性又は免疫原性ではない。化学基は場合によっては保存することができ保存に適した条件下で使用できるＡｐｏ−２Ｌ変異体抱合体を製造するために選択される。ポリペプチドに抱合されうる様々な例示的化学基が当該分野で知られており、例えば糖タンパク質に天然に生じる炭水化物のような炭水化物、ポリグルタミン、及び非タンパク様ポリマー、例えばポリオールが含まれる（米国特許第６２４５９０１号を参照）。
例えばポリオールは、上掲の国際公開９３／００１０９に開示されているように、リジン残基を含む一又は複数のアミノ酸残基においてＡｐｏ−２Ｌ変異体のようなポリペプチドに抱合されうる。用いられるポリオールは任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーとでき、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには一又は複数のヒドロキシル位置で１から４の炭素を有するアルキル基のような化学基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）であり、よって記載を簡単にするために、以下の議論においては、用いるポリオールがＰＥＧである例示的な実施態様に関するものとし、ポリペプチドにポリオールを抱合させる方法を「ペグ化(pegylation)」と称する。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧに対してここに記載した抱合法を使用して用いることができることは理解できるであろう。
【００５９】
Ａｐｏ−２Ｌ変異体のペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は変動し得、典型的には約５００から約３００００ダルトン（Ｄ）の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１０００から約２５０００Ｄであり、より好ましくは約２０００から約５０００Ｄである。一実施態様では、ペグ化は約２０００Ｄの平均分子量を持つＰＥＧを用いて実施される。場合によっては、ＰＥＧホモポリマーは未置換であるが、一端にアルキル基が置換されていてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ調製物は商業的に入手可能であり、典型的には本発明において使用するのに適したＰＥＧ調製物は平均分子量に応じて販売されている非均一調製物である。例えば、市販のＰＥＧ(５０００)調製物は典型的には分子量が僅かに変動し、通常は±５００Ｄの分子を含む。
本発明のＡｐｏ−２リガンド変異体は単量体形態又は三量体形態（３つの単量体を含む）等、様々な形態でありうる。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌ変異体三量体は、ＰＥＧ分子が三量体Ａｐｏ−２Ｌ変異体を構成する３つの単量体の１つ、２つ、又は全てに結合又は抱合されるようにペグ化される。そのような実施態様では、用いられるＰＥＧは約２０００から約５０００Ｄの平均分子量を有するのが好ましい。また、Ａｐｏ−２Ｌ変異体三量体は「部分的に」ペグ化され得、つまり、三量体を構成する三の単量体の一又は二だけがＰＥＧに結合又は抱合される。そのような「部分的に」ペグ化されたＡｐｏ−２Ｌ変異体では、場合によっては、用いられるＰＥＧが約５０００Ｄ又は５０００Ｄを超える平均分子量を有する。
【００６０】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が当該分野で知られている。ＰＥＧに抱合したタンパク質を製造するための特定の方法には、米国特許第４１７９３３７号、米国特許第４９３５４６５号及び米国特許第５８４９５３５号に記載された方法が含まれる。典型的には、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量等々に応じて、ポリマーの末端反応性基にタンパク質のアミノ酸残基の一又は複数を介して共有的に結合される。反応性基を有するポリマーはここでは活性化ポリマーと命名する。反応性基はタンパク質の遊離のアミノ又は他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは無作為な形又は部位特異的な形の何れかの形でタンパク質上のアミノ又は他の反応性基に結合しうる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応性基のタイプと量、並びに用いられるポリマーのタイプは、反応性基がタンパク質上の余りに多くの特に活性な基と反応することを避けるために用いられる特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存するものと理解される。これは完全に避けることができないであろうため、タンパク質１モル当たり一般に約０．１から１０００モル、好ましくは２から２００モルの活性化ポリマーを、タンパク質濃度に応じて用いることが推奨される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持し、同時に可能ならばタンパク質の循環半減期を最適化するためのバランス量である。
残基はタンパク質の任意の反応性アミノ酸、例えばＮ末端アミノ酸基であってもよいが、好ましくは反応性アミノ酸はシステインであり、これは、例えば国際公開９９／０３８８７、国際公開９４／１２２１９、国際公開９４／２２４６６、米国特許第５２０６３４４号、米国特許第５１６６３２２号、及び米国特許第５２０６３４４号に示されているように、その遊離のチオール基を介して活性化ポリマーの反応性基に結合している。あるいは、反応性基はリジンであり、これは、活性化ポリマーの反応性基にその遊離のイプシロン-アミノ基を介して結合しており、あるいはグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、これはアミド結合を介してポリマーに結合している。ついで、この反応性基は例えばタンパク質のα及びεアミンと反応して共有結合を形成する。簡便には、ＰＥＧ分子の他端はメトキシ基のような非反応性基で「ブロック」されて、タンパク質分子のＰＥＧ架橋複合体の形成を低減させることができる。
【００６１】
好適な活性化ＰＥＧは多くの一般的な反応によって生成させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ-ＮＨＳ-ＰＥＧ）は、Buckmann and Merr, Makromol. Chem., 182:1379-1384 (1981)の方法に従って、ＰＥＧ-モノメチルエーテル（ユニオンカーバイド社から市販されている）から、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によって調製することができる。また、ＰＥＧ末端ヒドロキシ基は、例えば臭化チオニルと反応させてＰＥＧ-Ｂｒを生成した後、過剰のアンモニアでアミノ分解してＰＥＧ-ＮＨ２を形成することによって、アミノ基に転換できる。ついで、ＰＥＧ-ＮＨ２は標準的なカップリング試薬、例えばウッドワード試薬Ｋを使用して対象のタンパク質に抱合される。更に、ＰＥＧ末端-ＣＨ２ＯＨ基は、例えばＭｎＯ２での酸化によってアルデヒド基に転換できる。アルデヒド基は水素化シアノホウ素のような試薬を用いる還元性アルキル化によってタンパク質に抱合される。あるいは、本発明における使用に適した活性化ＰＥＧは多数の製造元から購入することができる。例えば、Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)は、メトキシ-ＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩及びメトキシ-ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸塩に加えて、分子量２０００のメトキシ-ＰＥＧ-マレイミドを販売している。
本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体のペグ化の度合いを調節して、対応する非ペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体と比較してインビボ半減期（以下、「半減期」）を望ましく増加させることができる。ペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体の半減期は典型的にはペグ化の度合いが増加するのに応じて徐々に増加する。タンパク質のペグ化の度合いと部位は、例えば（１）ペグ化部位の数と反応性（例えば第一級アミン）及び（２）ペグ化反応条件によって、決まる。タンパク質におけるペグ化部位のいくつかは相対的に非反応性である可能性が高いので、標準的なペグ化反応では典型的には完全なペグ化にはならない。
【００６２】
標準的な突然変異誘発法を用いてタンパク質中の潜在的なペグ化部位の数を変えることができる。よって、アミノ酸置換がシステインやリジンのようなアミノ酸を導入又は置換する程度まで、本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体は（図１に示された）天然配列Ａｐｏ−２Ｌよりもより多い又は少ない数の潜在的ペグ化部位を含むことができる。ペグ化の度合いと部位はまた反応条件、例えば活性化ＰＥＧ及びタンパク質の相対濃度並びにｐＨを調節することによって操作することができる。所望の度合いのＰＥＧ化に対する好適な条件は、標準的なペグ化反応のパラメータを変えることによって経験的に決定することができる。
Ａｐｏ−２Ｌ変異体のペグ化は任意の簡便な方法によって実施される。例示的な実施態様では、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０のＣｙｓ１７０側鎖（つまり、図１のアミノ酸１１４−２８１を持ち、位置１７０の天然アルギニン残基がシステイン残基に置換された変異体Ａｐｏ−２Ｌ）は、分子量２０００Ｄのメトキシ-ＰＥＧ-マレイミド（Shearwater Polymers）との反応によって共有結合的に修飾される。簡便には、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０は、最初に約３０分間、周囲温度で１０ｍＭのＤＴＴを用いて還元し、ついでＰＤ-１０ゲル濾過カラムに通して、平衡にし、ＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出させて還元剤を除去することによって、修飾の準備がなされる。ついで、一定量のＰＥＧ-マレイミド溶液（ｄＨ２０中１０ＭＭ）を直ぐに添加する。完全な反応を確実なものにするために必要な時間と試薬濃度の条件は経験的に決定することができる。０．５から５倍の範囲のＲ１７０ＣＡｐｏ−２Ｌ．０単量体に対するＰＥＧ-マレイミドのモル濃度比と２又は２４時間の反応時間を使用することができる。反応は、あらゆる未ペグ化Ｃｙｓ１７０チオールがカルボキシアミドメチル化されるように、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０単量体濃度に対して１０倍のモルの過剰のヨードアセトアミドを添加することによって停止される。ヨードアセトアミドでの修飾は約３０分であり、その後、過剰な試薬は、平衡化されＰＢＳで溶出されるＮＡＰ-５カラム（Pharmacia）でのゲル濾過によって除去される。
【００６３】
ペグ化タンパク質はＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー-質量分析法、及びインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。ペグ化の度合いは典型的にはＳＤＳ-ＰＡＧＥによって最初に示される。１０％のＳＤＳ中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動は、典型的には溶出バッファーとして１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で実施される。どの残基がペグ化されているかを証明するために、トリプシン及びＬｙｓ-Ｃプロテアーゼのようなプロテアーゼ類を使用するペプチドマッピングを実施することができる。しかして、ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の試料を、Ｌｙｓ-Ｃプロテアーゼのようなプロテアーゼで消化させ、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣのような方法で分離することができる。生成されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、Ａｐｏ−２Ｌ．０ポリペプチドに対して過去に決定したペプチドマップと比較することができる。ついで、各ピークをピーク中のフラグメントのサイズを証明するために質量分析によって分析することができる。ＰＥＧ基を有するフラグメントは、通常、注入後にはＨＰＬＣカラムに保持されておらず、クロマトグラフから消失している。クロマトグラフからのそのような消失は、少なくとも一のペグ化可能なアミノ酸残基を含んでいるに違いない特定のフラグメントに対するペグ化を示している。ペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、Ａｐｏ−２Ｌレセプターと相互作用し、及び／又は哺乳動物においてアポトーシスを誘導する能力について、及び／又は他の生物学的活性について、当該分野で知られている方法を使用して、更にアッセイすることができる。
さらに、本明細書に開示するＡｐｏ２Ｌ変異体を、当該分野で知られている技術を用いてロイシンジッパー配列に結合させる又は融合させることも考慮する。
【００６４】
また、Ａｐｏ−２リガンド変異体及び１又は複数の二価の金属イオンを含有する製剤が、本発明により提供される。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適している（及びＡｐｏ−２Ｌ三量体の維持）。好ましい製剤は、Ａｐｏ−２Ｌ及び亜鉛又はコバルトを含む。より好ましくは、この製剤は金属がタンパク質に対して＜２Ｘモル比であるＡｐｏ−２Ｌ変異体及び亜鉛又はコバルト溶液を含む。水溶性懸濁液が所望されるならば、製剤中の二価金属イオンはタンパク質に対して＞２Ｘモル比であってもよい。硫酸亜鉛を用いて、当出願人はＡｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）沈殿物を発見し、製剤中の硫酸亜鉛の濃度が約１００ｍＭの水溶懸濁液を作った。当業者であれば、＞２Ｘモル比では、金属が製剤にとって有害になりうるか又は治療用製剤として望ましくない製剤中の二価金属イオン濃度の上限範囲がありうることが分かるであろう。
製剤は、既知の技術で調製することが可能である。例えば、Ａｐｏ−２Ｌ製剤はゲル濾過カラム上でのバッファー交換によって調製することが可能である。
【００６５】
典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、さらに好ましくは約７〜約７．５である。好ましくは、亜鉛がＡｐｏ−２Ｌへ結合したままであることを確かなものにするためにｐＨは選択される。ｐＨが高すぎる又は低すぎるならば、亜鉛はＡｐｏ−２Ｌへ結合したままではなく、結果としてＡｐｏ−２Ｌの二量体が形成される傾向となる。例えばＡｐｏ−２リガンド及び二価金属イオンの濃度及び投与経路よっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
Ａｐｏ−２Ｌの治療用製剤は、凍結乾燥製剤、水溶液又は水性分散液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Osol, A.編 (1980)）と、適切な純度を有する所望のＡｐｏ−２Ｌ分子を混合することにより調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００６６】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質である。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。
インビボ投与に使用されるＡｐｏ−２Ｌは滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。Ａｐｏ−２Ｌは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、Ａｐｏ−２Ｌは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。Ａｐｏ−２Ｌの液体製剤の例は、皮下注射用の１回投与バイアルに充填された無菌の、透明な、無色の保存料未添加(unpreserved)溶液である。
【００６７】
治療的Ａｐｏ−２Ｌ変異体製剤は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えば欧州特許第２５７９５６号参照）。
また、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、徐放性調製物の形態で投与することが可能である。徐放性調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン-酢酸ビニル（Langer et al., 上掲）、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が含まれる。
【００６８】
ここに記載されたＡｐｏ−２Ｌ変異体及びその製剤は、種々の治療的及び非治療的応用へ用いられる。これら応用は、種々の癌及びウイルス性症状の治療の方法である。このような治療的及び非治療的応用は、例えば、国際公開９７／２５４２８及び国際公開９７／０１６３３に記載されている。
ここに記載のＡｐｏ２Ｌ変異体は種々の病理状態、例えば免疫関連疾患又は癌を治療するのに有用である。ここに記載した様々な病理状態の哺乳動物における診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検出を可能にする診断技術は、当該分野で利用可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診（法）、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等々を含む技術を通して同定され得る。また、免疫関連疾患は容易に同定できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症の産生である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受ける。リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成を伴い、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対称的パターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾腫大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【００６９】
Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入の経路により投与できる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプでの注入によって実施することもできる。
Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単独又は複数の用量が使用されうる。単独に使用されるＡｐｏ２Ｌ変異体の効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
【００７０】
Ａｐｏ２Ｌ変異体のインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４６５７７６０号、第５２０６３４４号、又は第５２２５２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないＡｐｏ２Ｌ変異体の用量が、例えば、Ａｐｏ２Ｌ変異体を受入れる哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療法に依存して変わりうることは理解できるであろう。
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。そのような他の治療法を、Ａｐｏ２Ｌ変異体とは別の薬剤として、並びにＡｐｏ２Ｌ変異体分子自体に結合させるか接合させて使用できることも考慮する。更に、治療法は、リツキサン(Rituxan)ＴＭ又はハーセプチン(Herceptin)ＴＭなどの腫瘍抗原を標的とする治療的抗体並びに抗ＶＥＧＦなどの抗血管形成抗体、又はＤＲ５又はＤＲ４のようなＡｐｏ２Ｌレセプターを標的とする抗体に基づく。
【００７１】
化学治療剤に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service, M.C.Perry編, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。また、化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与に先行し、又はその後に行い、又はそれらと共に与えられてもよい。
また、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、Ａｐｏ−３、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＲ３）に結合する抗体などの他の抗原に対する抗体を投与することも好ましい。他の方法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ここにおけるＡｐｏ２Ｌ変異体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて当該発明のＡｐｏ２Ｌ変異体を投与する。
【００７２】
Ａｐｏ２Ｌ変異体（及び一又は複数の他の治療剤）は同時的又は経時的に投与される。Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の後、インビトロにおいて処理された細胞を分析することができる。インビボでの治療がなされた場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、壊死をアッセイするために腫瘍細胞を病理検査することができ、又は血清の免疫系応答を分析することができる。
ここに記載した疾患の診断又は治療に有用なＡｐｏ−２Ｌ変異体を含むキットのような製造品は、少なくとも容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効なＡｐｏ−２Ｌ変異体製剤を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。容器上又は添付されるラベルには、製剤が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含め、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【００７３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書において引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【００７４】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【００７５】
実施例１
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬファージディスプレイライブラリーの設計と生産
ファージディスプレイライブラリーに含めるため、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ・ＤＲ−５ＥＣＤ複合体について決定されたＸ線構造の検査に基づいてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの残基を選択した（例えば、Hymowitz et al., (1999) Molecular Cell 4, 563-571参照）。加えて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのアラニン−スキャンにより得られた情報（例えば、Hymowitz et al., (2000) Biochemistry 38, 633-640参照）を使用してライブラリー設計の際の指針とした。例えば、アラニン置換により試験した全Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター（例えばＧｌｎ２０５）に対する結合の親和性が（５分の１未満まで）大きく減少した部位はライブラリーに選択しなかった。アラニンで置換したとき中程度の変化（５倍未満）しか示さなかった部位は、変異した際にレセプター選択性が増大しやすかった。この種の部位の一例はＧｌｎ１９３であり、この場合アラニン置換によるＤＲ４への親和性減少が１．７倍になるが、ＤＲ５及びＤｃＲ２に対する結合には影響が無い（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 38, 633-640参照）。レセプター親和性のさらなる変化は、Ｇｌｎ１９３をアラニン以外の残基で置換することにより得られる。この理論を使用して、部位１８９、１９１、１９３、１９９、２０１及び２０９をランダム化して有する（ＤＲ４ライブラリー）か、又は部位１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７及び２６９をランダム化して有する（ＤＲ５ライブラリー）２つのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬライブラリーを設計した。図７Ａに示すように、これらの残基はＸ線結晶構造に観察される「パッチＡ」接触内部又は近傍にある（例えばHymowitz et al., (1999) Molecular Cell 4, 563-571）。これらライブラリーは特定の部位に「ＮＮＳ」コドンを含み、よって全２０のアミノ酸及び１つだけの終止コドンがこれらの位置に可能であった。
【００７６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの発現のために設計されたファージミドベクター（図１；配列番号１の残基９６−２８１）をＭ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質への融合物として以下のように構成した。ＮｓｉＩ部位（５’オリゴ）及びＢａｍＨＩ部位（３’オリゴ）を生成するオリゴヌクレオチドを使用して、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの９６−２８１部分をコードするＤＮＡをテンプレートプラスミドｐＡＰＯＫ５からのＰＣＲにより増幅した（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640）。ＮｓｉＩ及びＢａｍＨＩによる切断の後、この断片をＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＴＦＡＡ−ｇ３に連結させた（例えばLee, G.F. and Kelley, R.F. (1998)J. Biol. Chem 273, 4149-4154参照）。制限消化分析により、適切な挿入についてプラスミドクローンをスクリーニングし、ジデオキシヌクレオチド配列決定によりポジティブなクローンを確認した。結果として得られたプラスミド（ｐＡＰＯＫ４）は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの９６−２８１のＮ末端に融合した断片ｓｔＩＩ細菌シグナル配列を有する断片をコードする。配列Ｇ・Ｓ・Ａを有するトリペプチドリンカーをＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＣ末端に付加した後、インフレームのアンバー終止コドン及びＭ１３バクテリオファージの遺伝子３生成物を付加した。アルカリフォスファターゼプロモーターを直接発現に使用した。アンバー終止コドンの抑制能を有する大腸菌株（supE遺伝子型）中において、ｓｔＩＩ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−遺伝子３からなる融合タンパク質を周辺質に分泌させた。アンバー終止コドンの抑制は１００％有効ではないので、遊離ｓｔＩＩ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのいくらかも同様に分泌される。周辺質において、ｓｔＩＩシグナルペプチドは大腸菌シグナルペプチダーゼによって除去されると推定される。ヘルパーファージとの同時感染により組立タンパク質を供給すると、表面上にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−遺伝子３を有するファージ粒子が産出される。表面に現れたタンパク質の正確な組成は不明であるが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−遺伝子３の１分子が遊離Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）の２分子を有する三量体に集合したものと思われる。遺伝子８に対して遺伝子３を使用してＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを示していることから、これは、各ファージ粒子が１−５を超えるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ分子のコピーを示さない「一価の表示」に相当する（例えばLowman, H.B. and Wells, J.A. (1993) J. Mol. Biol. 234, 564-578を参照）。
【００７７】
ｐＡＰＯＫ４ベクターの最初の試験により、正しく構築されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（表１）のファージ上の表出が小さいことが示された。固定ＤＲ５−ＩｇＧを用いたファージＥＬＩＳＡは、特定の結合シグナルを１週間だけ示した。精製したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにより結合は抑制されなかったが、代わりに外来性リガンドによりファージＥＬＩＳＡで測定したシグナルが増大し、これはファージ上の不完全な三量体構築と呼応するものであった。加えて、ＤＲ５−ＩｇＧに対するファージの保存による濃縮はごく小さく、限定的なものであった。通常の３７℃でなく、３０℃で成長させてファージを産出させた場合、特定の結合が増大した。ｐＡＰＯＫ４を使用した場合の表出が小さいと仮定し、様々なプロモーターを用いた構築を表出の増大について試験した。ｐＡＰＯＫ４中のアルカリフォスファターゼプロモーターをｔａｃプロモーターで置換することにより、ＰＡＰＯＫ４．２を構築した。これは、ｐＡＰＯＫ４中でＡＰプロモーターを有するＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩ制限断片を、プラスミドｐＷ１２０５ａ由来のｔａｃプロモーターを有するＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩ断片（例えばSidhu et al., (2000) Methods n Enzymology 328, 333-363を参照）で置換することにより行われた。ファージＥＬＩＳＡ及び濃縮両方によるｐＡＰＯＫ４．２ベクターからの発現の分析の結果、ｐＡＰＯＫ４よりも良好なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのファージディスプレイが認められた（表１）。最適な表出は、１μＭのＩＰＴＧを加えることによりｔａｃプロモーターを誘導した３０℃でのファージ産出において得られた。
【００７８】
Sidhu等によって開示されたように（Sidhu et al., (2000) Methods Enzymology 328, 333-363参照）ライブラリーを構築した。ＤＲ５ライブラリーでは、「ＴＡＡ」終止コドンをｐＡＰＯＫ４．２の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、及び２６９に導入した。Ｋｕｎｋｅｌのプロトコル（例えばKunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 488-492）を適合させて用い、この「終止」テンプレートをオリゴヌクレオチド指向突然変異のテンプレートとして使用した。突然変異反応には２つのオリゴヌクレオチドを使用した。まずライブラリー位置１８９、１９１、及び１９３において「ＮＮＳ」コドンがコード化され、第２に部位２６４、２６６、２６７、２６９においてＮＮＳコドンが産出された。終止テンプレートの使用により、変異しなかったテンプレートＤＮＡがＫｕｎｋｅｌ選択後も残存し、機能的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを産出しないことが確実となる。ＤＲ４ライブラリーでは、ＴＡＡ終止を位置１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、２０９に導入した。過去の実験（データは示さない）で、ファージ上のＡｐｏ２Ｌの表出が向上し、且つＤＲ５に対する親和性の低減が示されていたため、変異Ｙ２１３Ｗ：Ｓ２１５Ｄも終止テンプレートに導入した。部位１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、２０９でＮＮＳコドンをコードするオリゴヌクレオチドを使用してこの終止テンプレートの突然変異を誘発した。ＳＳ−３２０大腸菌内へ電気穿孔すると、ＤＲ５ライブラリーは２．５×１０８独立クローンの力価を生じさせた。ライブラリー由来の１０個のクローンの配列決定を行ったところ、両部位において７／１０が変異していることが示され、実際のライブラリーサイズが１．７５×１０８クローンであることが示された。ＤＲ４ライブラリーは５×１０９クローンの力価を生じさせ、配列決定により５／１０が変異したことが示され、よって実際のライブラリーサイズが２．５×１０９であることが示された。ＳＳ−３２０細胞はアンバー抑制因子を有さないので、ＸＬ−１大腸菌を使用して選別のためのファージ粒子を生成した。ライブラリーを用いて電気穿孔されたＳＳ−３２０を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬのＶＣＳ（Stratagene, Inc.）ヘルパーファージを含む５００ｍＬの２ＹＴ培地中で成長させた。２００ＲＰＭで動作する回転式振盪培養機上に置いた４Ｌのバッフルフラスコ中で３７℃で一晩成長させた後、遠心分離により細胞を除去し、２０％のＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌの１／５容量を添加することで上清からファージを沈殿させた。遠心分離によりファージを回収し、初期対数期のＸＬ−１大腸菌の培養液５００ｍｌを感染させるために使用した。３７℃での成長を１時間継続し、ＶＣＳヘルパーファージを１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬに添加し、回転式振盪培養機（２００ＲＰＭ）上に置いた４Ｌのバッフルフラスコ中で培養液を３０℃で一晩成長させた。上述のようにしてファージを回収し、４ｍＬのＰＢＳ中に再度懸濁した。このファージストックを親和性に基づく選別に使用した。上述のようにしてＸＬ−１の感染により選別の各回の間にファージを増幅させた。但し、使用する培養液の容量を５００から５０ｍＬに減少させた。
【００７９】
実施例２
レセプター選択性によるファージライブラリーの選別
マイクロタイタプレート（Nunc-Maxisorp）のウェルに吸収させたレセプター−ＩｇＧ融合タンパク質を用いてレセプター結合によるファージ選別を行った。レセプター−ＩｇＧタンパク質をコーティング緩衝液中（５０ｍＬの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で２−１０μｇ／ｍＬに希釈し、この溶液１００μＬを９６ウェルプレートの複数のウェルに加えた。第１回目の選別では、９６ウェル全てを使用し、続く回では使用するウェルの数を減らした。周囲温度で２時間に亘って穏やかに振盪しながらコーティング緩衝液をマイクロタイタプレート上でインキュベートした。その後コーティング緩衝液を除去し、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び５％の粉末状スキムミルク（ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳ２００μＬを用いてウェルをブロックした。ブロッキングは室温で１時間行い、ついでウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液）ですすいだ。
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬライブラリーファージ溶液をブロッキング緩衝液中で１０倍に希釈し、次いでこの溶液１００μＬをレセプター−ＩｇＧでコーティングしたプレートのウェルに添加した。加えて、先にタンパク質コーティングを行うことなくブロッキング緩衝液でウェルをブロックすることにより準備した空のプレートの等しい数のウェルに希釈したファージを添加した。プレート上において、回転式振盪培養機（Bellco）で穏やかに振盪しながら、周囲温度で２時間溶液をインキュベートした。ファージ溶液を捨て、噴出瓶から洗浄緩衝液をウェルに注ぎ、その後洗浄液を捨てることを繰り返す（６回）ことによりウェルをすすいだ。１０ｍMのＨｃｌ１００μＬを添加することによりウェルから結合したファージを溶出した。２０分間振盪しながらインキュベートした後、溶出液をピペットで取って除去し、２ＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ ｐＨ１１の１／２０容量を添加することによりｐＨを中性にした。レセプタープレートの溶出液の半分を使用してＸＬ−１大腸菌を感染させ、よって次回の選別ためファージ（５０ｍＬの培養液）を伝播させた。レセプタープレートと空のプレートから得た溶出液の一部を使用して、大腸菌とのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測ることによりファージ濃度を推定した。簡単に説明すると、ファージ溶液の一連の１０倍希釈液を対数期ＸＬ−１を用いて３７℃で３０分間インキュベートし、次いで５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢ寒天板上に細胞を筋状に出した。一晩３７℃でインキュベートした後、カルベニシリン耐性コロニーの数を目視による検査により決定した。親ファージミド（ｐＡＰＯＫ４．２）がアンピシリン耐性遺伝子を有しているので、コロニーの数はファージ濃度に比例する。レセプター結合による選択の質の向上は、空のプレートから溶出したものに対するレセプタープレートから溶出したファージの比から計算される。
【００８０】
ウェルにコーティングしたＤＲ４−ＩｇＧ（構成を以下の実施例３に示す）に対し、２回にわたってＤＲ４ライブラリーを選別し、その後競合するＤＲ５−ＩｇＧ（構成を以下の実施例３に示す）の存在下でＤＲ４結合について３回選別した。第３、４、及び５回目の選別の際、それぞれ５０、２５０、及び７５０ｎＭのＤＲ５−ＩｇＧを用いて３０分間ファージをインキュベートした後、これら溶液をＤＲ４−ＩｇＧでコーティングしたプレートに添加した。ＤＲ５ライブラリーについては、ファージをＤＲ５−ＩｇＧでコーティングしたウェルに対して４回にわたって選別し、その後ＤＲ４−ＩｇＧを競合に使用して４回選別を行った。第５、６、７、及び８回目には、ファージをそれぞれ１、１０、１００、及び５００ｎＭのＤＲ４−ＩｇＧでインキュベートし、その後ＤＲ５−ＩｇＧ結合について選択を行った。図８Ｃに示すように、ＤＲ４ライブラリーとＤＲ５ライブラリーの両方においてレセプター結合に特定の品質向上が見られた。選別が完了したら、選択されたライブラリーから得た個々のクローンを「点ＥＬＩＳＡ」により特定の結合についてスクリーニングした。ＸＬ−１大腸菌をファージプールで感染させることにより個々のクローンを得た後、ＬＢ／カルベニシリン寒天板に細胞を筋状に出した。単一のコロニーを選び、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンと１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬのＶＣＳヘルパーファージを含む５ｍＬのＬＢ培養液をインキュベートするのに使用した。３０℃で一晩成長させた後、培養液上清のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降によりファージを回収した。点ＥＬＩＳＡにおいて、ファージコロニーを結合緩衝液で１０倍に希釈し、マイクロタイタプレートにコーティングした様々なタンパク質への結合について試験した。M１３バクテリオファージのコーティングタンパク質に対するＨＲＰ結合抗体（Pharmacia）を用いて結合したファージを検出した。DR4ライブラリークローンについて、試験タンパク質はＤＲ４−ＩｇＧ、ＤＲ５−ＩｇＧ、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ、及びＢＳＡであった。ＥＬＩＳＡによりＤＲ４−ＩｇＧだけに反応し、それ以外のタンパク質には反応しなかったクローンだけをさらなる分析に使用した。ＤＲ５ライブラリークローンの試験タンパク質はＤＲ５−ＩｇＧとハーセプチン(Herceptin)（登録商標）（Genentech, Inc., South San Francisco, CA）であった。ＤＲ５−ＩｇＧ結合に対してポジティブで、ハーセプチン(Herceptin)（登録商標）に対してはそうでないクローンをさらなる研究のために選択した。
【００８１】
実施例３
レセプター選択性クローンの特徴付け
実施例２に記載されている２つのライブラリーの各々から得たレセプター選択性クローンをさらなる分析のために選択した。Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍ１３キット（Qiagen）を用いて一本鎖ＤＮＡをファージ粒子から単離し、染料ターミネーターサイクルキット（Beckman-Coulter）を用いたジデオキシヌクレオチド配列決定を行った。ｔａｃプロモーターの一部に相補的なプライマー（mal-fl: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCACACAGGAAACAGCCAG-3' 配列番号１３）を使用して配列決定反応を初回抗原刺激した。ＣＥＱ２０００ＸＬキャピラリーシークエンサー（Beckman-Coulter）で配列決定反応を分析することによりＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのコード化領域の配列全体を決定することができた。ライブラリー位置のＤＮＡ配列から推論したアミノ酸同一性を表ＩＩ（ＤＲ４選択性）及び表ＩＩＩ（ＤＲ５選択性）に示す。ライブラリー位置の外部において偽配列変更は検出されなかった。
ＤＲ４ライブラリーのクローン４つに対する相対的結合強度を競合ファージＥＬＩＳＡにより決定した（図１５及び１６）。このアッセイでは、溶液中のレセプター−ＩｇＧの濃度を次第に増加させながら、レセプター−ＩｇＧでコーティングしたウェルに固定濃度のファージを添加した。インキュベーションにより結合させ、結合しなかったファージを洗浄した後、ＨＲＰ結合、抗Ｍ１３抗体（Pharmacia）により結合ファージを測定した。４パラメータ適合を使用した溶液中のレセプター−ＩｇＧ濃度により変化するＥＬＩＳＡシグナルの分析により、ＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０値はファージ濃度によって変化するので、まずファージクローンをタイターすることにより、４つのクローンのシグナル強度が等しくなるような希釈を決定した。４つのクローンの全てにおいて、ファージ上に表出した野生型（天然配列）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬについて測定されたものと類似か、それよりも少し小さいＩＣ５０値がＤＲ−４結合に対して得られた（図１５）。対照的に、可溶性ＤＲ５−ＩｇＧによる競合の不足により示されたように、クローンのいずれもがＤＲ５−ＩｇＧに結合しないように見受けられた（図１６）。
【００８２】
ＤＲ５ライブラリーの代表的な配列のいくつかをｐＡＰＯＫ５．０にサブクローンしてさらなる試験に使用した。サブクローニングは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬコード化セグメントの５’及び３’末端に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたファージクローン上でのＰＣＲ反応により行われた。ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩによる制限消化の後、ＰＣＲ断片をＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＡＰＯＫ５．０に結合させて、野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列を変異ＤＮＡで置換した。ジデオキシヌクレオチド配列決定により配列を確認した。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）突然変異体（変異体）を発現させて精製し、前述したように、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）及びＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞上の生理活性により精製したタンパク質をレセプター結合についてアッセイした（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640）。簡単に説明すると、Ａｐｏ２Ｌ変異体の結合のレセプターイムノアドヘシン固定化の解離定数（Ｋｄ）（表ＩＩ及びＩＩＩを参照）をＰａｒｍａｃｉａ ＢＩＡｃｏｒｅ３０００で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定値から決定した。それぞれ１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３及び１９９９年３月９日公開の国際公開９９／１０４８４に開示されているようにして、ＤＲ５−ＩｇＧ（Ａｐｏ−２−ＩｇＧとも呼ぶ）とＤｃＲ２−ＩｇＧレセプターイムノアドヘシンを調製した。ＤＲ４−ＩｇＧを以下のように調製した。成熟ＤＲ４ ＥＣＤ配列（アミノ酸１−２１８；Pan等, 上掲）を、Ｆｌａｇシグナル配列の下流でｐＣＭＶ−１ Ｆｌａｇベクター（Kodak）にクローニングし、前述[Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]のようにして、ヒトイムノグロブリンＧ１重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域及びＦｃ領域に融合させた。Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)に開示されているようにして、イムノアドヘシンをヒト２９３細胞への一過性形質移入により発現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより細胞の上清から精製した。アミン結合化学（Pharmacia Biosensor）を使用して、レセプターイムノアドヘシンタンパク質を３００−５００共鳴ユニットのレベルでセンサーチップの表面に結合した。２倍に増大した際の１５．６ｎＭから５００ｎＭの濃度におけるＡｐｏ−２Ｌ結合についてｓｅｎｓｏｒｇｒａｍを記録した。非線形回帰分析により動力学的定数を決定し、結合定数を計算した。
【００８３】
アラマーブルーアッセイを使用してインビトロでのＡｐｏ−２Ｌ変異体のアポトーシス活性を特徴付けた。ＳＫ−ＭＥＳ細胞はＤＲ４とＤＲ５の両方を発現し、野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘導に対して感受性であった。簡単に説明すると、蛍光染料の代謝転換から細胞の生存度を測定するバイオアッセイを使用してＡｐｏ−２Ｌ変異体のアポトーシス活性を決定した。Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１）又はＡｐｏ−２Ｌ変異体（例えば表ＩＩ及び表ＩＩＩ参照）の連続する２倍の希釈物を、０．１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco）中に作成し、各希釈物５０μLを９６ウェルファルコン組織培養マイクロプレートの個々のウェルに移した。５０μＭのＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ５８）（ＲＭＰＩ−１６４０中、０．１％ＢＳＡ）を２×１０４細胞／ウェルの濃度で添加した。これら混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。２０時間目に、２５μＬのアラマーブルー（AccuMed, Inc., Westlake, Ohio）を添加した。５３０ｎｍで励起後５９０ｎｍにおける相対的蛍光度を測定することにより細胞数を決定した。４パラメータ適合を用いてこれらのデータを分析し、ＥＤ５０を計算し、細胞生存度を５０％に低下させるＡｐｏ−２Ｌの濃度を求めた。
表ＩＶにまとめたように、ＤＲ５選択的変異体は通常ＤＲ４に対する親和性を低下させ、ＤＲ５に対する親和性を野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）と同程度にするか、又はそれよりやや減少させる。驚くべきことに、ＤＲ５選択的変異体（表ＩＩＩに同定されたＤＲ５−２１及びＤＲ５−２３）のうち、ＤＲ４に対する親和性が１０分の１、及び１００分の１まで低下した２つの変異体は、それぞれインビトロでのＳＫ−ＭＥＳ細胞のアポトーシス誘導に対する活性が大きかった。
【００８４】
実施例４
ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の生成及び試験
ＤＲ４が非架橋及び架橋リガンドに応答できるのに対し、ＤＲ５が架橋Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにしか応答しないことが言われている（例えばMuhlenbeck et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 32208-32213）。ここに開示するレセプター選択的変異体のシグナル伝達及び活性特性を調べるため、一部の変異体にエピトープでタグをつけたものを調製し、アッセイした。Ｍ２抗ｆｌａｇ抗体（Sigma-Aldrich Chemical Co.）との架橋を可能にするＮ末端のｆｌａｇタグにより突然変異体を生成した。
ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の大腸菌発現のために設計されたプラスミドは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）をｐＦＬＡＧ−ＭＡＣ（Sigma）に導入したプラスミド（pFLAG-Apo2L; Genentech）のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発により作成した。ＰＦＬＡＧ−Ａｐｏ２Ｌは、Ｎ末端にｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）の細胞質発現をｔａｃプロモーターの制御下に方向付ける。突然変異誘発のテンプレートは、Kunkelのプロトコル（例えばKunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 488-492参照）を用いて生成したプラスミドの一本鎖型であった。ジデオキシヌクレオチド配列決定により突然変異体を同定した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の発現のため、突然変異によるプラスミドを大腸菌株４３Ｅ７に形質転換した。形質転換した大腸菌を、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含む２ＹＴ培地５００ｍＬ中で３７℃で初期対数期まで成長させ、ＩＰＴＧ添加により発現を誘発し、最終濃度を０．４ｍＭとした。タグをつけていないタンパク質について前述したように（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640）、但し酸性ペプチドｆｌａｇはタンパク質のＰＩ低下を招くので陽イオン交換カラムのｐＨを下げ、ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を精製した。
【００８５】
ｆｌａｇでタグをつけたタンパク質の生成に、ＤＲ４選択的変異体クローン番号８及び９、並びにＤＲ５選択的変異体クローン番号１、２、８、２１、及び２３を選択した。表Ｖに示すように、まずＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によりＤＲ４とＤＲ５結合について、及び抗ｆｌａｇ架橋した場合としない場合のＳＫ−ＭＥＳ上のアポトーシス誘発について、精製したｆｌａｇタグＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を試験した。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８及び９のＤＲ５に対する親和性は１０００分の１に低下する一方で、ＤＲ４への結合に対しては高い親和性を維持していた。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８のＤＲ４に対する親和性は５倍に増大し、一方Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−９の親和性は４分の１に低下した。いずれのＤＲ４選択性タンパク質もＳＫ−ＭＥＳ細胞におけるアポトーシス誘発の活性を大きく低下させた。抗ｆｌａｇ架橋した場合の活性の増大も、野生型Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌに見られたものよりずっと小さいものであった。抗ｆｌａｇ架橋によってＦｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８の活性は増大せず、野生型タンパク質について３０倍の活性増大が観察されたのに比較して、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−９の活性増大は６倍に過ぎなかった。
【００８６】
ＤＲ５選択的変異体全てのＤＲ４に対する親和性は低下し、その一方でＤＲ５への結合には高い親和性を維持していた。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−１、２、及び２１の場合、ＤＲ５への結合に対しては２分１以下の低下しか示さなかったのに対し、ＤＲ４に対する親和性は１１分の１まで低下した。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−２３のＤＲ４に対する親和性は１００分の１に低下したが、ＤＲ５への結合の低下は２．４分の１程度であった。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８にはＤＲ４への結合が全く見られなかったが、この変異体のＤＲ５への結合は野生型タンパク質と等しいか、それよりも大きかった。ＤＲ４選択的変異体に見られた結果と対照的に、ＤＲ５選択性タンパク質の全てはＳＫ−ＭＥＳ上のアポトーシス誘発について高い活性を保持していた。実際、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−１、２、及び８は、野生型と比較して、アポトーシス誘発に活性増大（ＥＤ５０低下）を示した。抗ｆｌａｇ抗体と架橋すると、ＤＲ５選択的変異体の全てについて、架橋野生型Ａｐｏ２Ｌに観察された値（ＥＤ５０）に活性が増大した。これらの結果は、ＳＫ−ＭＥＳ上でのアポトーシスシグナル伝達においてＤＲ５結合のほうがＤＲ４結合より重要であることを示している。完全に理解されているわけではないが、ＤＲ４に対する親和性が低下した変異体の一部の方がアポトーシス誘発に高い影響力を持つので、ＤＲ４は弱いシグナル伝達を行うことができ、ＤＲ５により生成されるシグナルを弱め得ると考えられている。
【００８７】
実施例５
Ｃｏｌｏ２０５及びヒト白血病Ｔ細胞株に対するＦｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の活性
さらに、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８及びＦｌａｇ−Ａｐｏ２ｌ．ＤＲ５−８のアポトーシス誘発活性を、Ｃｏｌｏ２０５大腸癌細胞及びヒト白血病Ｔ細胞株を用いて調べた。Ｃｏｌｏ２０５細胞はＤＲ４とＤＲ５の両方を発現し、ＳＫ−ＭＥＳよりも野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘発に対して影響を受けやすい。ＦｕｒｋａｔＴ細胞はＤＲ５しか発現しないと思われた。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬよりもＤＲ５選択的変異体に対して感受性であった（図１７Ａ）。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８の抗ｆｌａｇ架橋により、Ｃｏｌｏ２０５における活性にさらなる有意な増大は起こらなかった。対照的に、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８に対するＣｏｌｏ２０５の感受性は低かった（図１７Ｂ）。この変異体の抗ｆｌａｇ架橋により、活性が少し増大した。ヒト白血病Ｔ細胞株は、リガンド架橋に関係なく、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８に感受性でなかった（図１８Ｂ）。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８は架橋無しでヒト白血病Ｔ細胞株にアポトーシスを誘発した。抗ｆｌａｇ架橋は架橋野生型Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌで測定されたレベルまで活性を増大させた。
【００８８】
実施例６
ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（登録商標）アッセイによるレセプター結合
さらに、ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（登録商標）を使用して、５つの既知のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター（ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＰＯＧ、ＤＲ４、ＤＲ５）に対するＡｐｏ−２Ｌ変異体の結合を調べた。このアッセイは、「ドナー」と「アクセプター」ビーズを近づけることにより一重項酸素媒介、蛍光共鳴エネルギー伝達を促進すると、シグナルを生成する。この場合、ドナービーズはストレプトアビジンで被覆されており、ビオチン化したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの捕獲に使用される。レセプターに対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合により、ビーズが近づき、シグナルが伝達される。結合のＩＣ５０値は、ビオチン化リガンドを非ビオチン化リガンドで置換することにより決定することができる。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの各々について置換曲線を生成し、表ＶＩに示した相対的ＩＣ５０値を決定するために使用した。ＤＲ４及びＤＲ５結合に関して、ＩＣ５０値の変化はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）により測定した傾向と一致していた。アッセイしたＡｐｏ−２Ｌ変異体のＯＰＧに対する結合は大幅に縮小していた。ＤＲ４選択的変異体はＤｃＲ１に対する親和性を示し、ＤｃＲ２についてはそれよりもやや小さい親和性を示した。ＤＲ５選択的変異体の全てはＤｃＲ１に対する親和性の大きな低下を示したが、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８を例外に、ＤｃＲ１よりもＤｃＲ２に対する結合能を保持していた。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８はＤｃｒ１、ＤｃＲ２、ＯＰＧ、及びＤＲ４に対する親和性の大きな低下を示したが、ＤＲ５には比較的高い親和性で結合した。
【００８９】
実施例７
正常カニクイザル肝細胞へのＡｐｏ−２Ｌ変異体の作用
インビトロでリガンドに曝した後の肝細胞生存度を測定することにより、レセプター選択的変異体２つ（Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８及びＦｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−２３）の正常細胞に対する影響を調べた。通常肝細胞は、リガンドが凝集していない限りＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対して感受性でない（例えば、Lawrence et al., (2001) Nature Medicine 7, 383-385参照）。アッセイのため、カニクイザル由来の肝細胞を使用してクリスタルバイオレット染色により生存度を測定した。抗ｆｌａｇ架橋後のＤＲ４選択性及びＤＲ５選択的変異体の肝細胞に対する毒性は、架橋野生型リガンドよりも小さかった（図１９）。
【００９０】
実施例８
Ａｐｏ２Ｌシステイン置換変異体の生産
Ａｐｏ-２Ｌのシステイン置換変異体は、プラスミドｐＡＰＯＫ５．０の一本鎖型でのオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Methods in Enzymology, 154: 367-382 (1987)）によって構築した。このプラスミドは、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターにより推進されるＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸型の細胞内大腸菌発現のために設計した。ｐＡＰＯＫ５．０はＡｐｏ-２Ｌの残基９１−１１３（図１）をコードしているＤＮＡセグメントの欠失突然変異誘発によってｐＡＰＯＫ５（１９９９年７月２２日公開の国際公開９９／３６５３５）から構築した。ｐＡＰＯＫ５は、ｔｒｐプロモーターを持つプラスミドｐＳ１１６２へＡｐｏ-２Ｌ ｃＤＮＡ（図１の残基９１−２８１をコードする）をクローニングするためのＰＣＲを利用して構築した。突然変異誘発後に、プラスミドの同一性をプラスミドのＡｐｏ２Ｌの全体部分のジデオキシヌクレオチド配列決定（Sanger）によって確認した。
ついで、システイン置換タンパク質をコードするプラスミドを、発現のための大腸菌株２９４に形質転換した。培養物をＬｕｒｉａブロス＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリン中で３７℃にて飽和するまで一晩成長させた。続いて、飽和した培養物を５０倍希釈してＮａ２ＨＰＯ４（６ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）、グルコース（４．９ｇ／Ｌ）、カザミノ酸（４．９ｇ／Ｌ）、２７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００３％チアミンＨＣｌ及び適量の蒸留水＋カルベニシリン４０μｇ／ｍＬからなる滅菌濾過培地中に蒔いた。Ａ５００が０．５−０．８になるまで培養物を３７℃にて成長させた後、２５μｇ／ｍＬの最終濃度になるまで３-α-インドールアクリル酸（ＩＡＡ）（Sigma, St.Louis, MO）を添加して発現を誘導した。振盪しながら細胞を３０℃で一晩成長させ、遠心分離して収集し、後述のようにその後Ａｐｏ２Ｌを回収するために−２０℃で凍結保存した。
【００９１】
モデルＭ１１０-Ｆマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corporation, Newton, MA）を使用して、凍結した大腸菌細胞ペレットから、１０容量（ｗｔ／ｖｏｌ）の１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０／２００ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ中での均質化によってＡｐｏ-２Ｌタンパク質を抽出した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度までホモジネートに添加して、これをついで遠心分離して細胞片を除去した。固形の硫酸アンモニウムを撹拌しながら周囲温度にて４５％の飽和度の最終濃度になるまで抽出上清に加え、遠心分離によってペレットを回収した。硫酸アンモニウムペレットを５０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄して残留ＥＤＴＡを除去した後、５０容積（ｗｔ／ｖｏｌ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／０．１％トリトンＸ-１００中に再懸濁させた。得られた溶液を遠心分離によって透明にし、５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレーティングセファロースカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を使用して固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。カラムに、１００ｍＭのＮｉＳＯ４／３００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中のニッケルを充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。充填後、カラムを、ＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、ＰＢＳ中５０ｍＭのイミダゾール／３５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。ＩＭＡＣ溶出液を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に対して透析し、遠心分離によって透明にし、更に、平衡化し２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰセファロースカラム（Pharmacia）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ＨｉＴｒａｐ ＳＰカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／０．５ＭのＮａＣｌで溶出させた。ＳＰカラム溶出液を２ｍＭのＤＴＴで還元し、続いて周囲温度で４５％の飽和度の最終濃度になるまで撹拌しながら固形の硫酸アンモニウムを加えることによって沈殿させた。硫酸アンモニウムペレットを３．５ｍＬの２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁させ、ＰＤ１０カラム（Pharmacia）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌ／２ｍＭのＤＴＴの最終バッファー中に交換した。精製したＡｐｏ-２Ｌシステイン置換タンパク質を、クーマシー染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び質量分析によって特徴付けし、−２０℃で凍結して保存した。
【００９２】
実施例９
Ｃｙｓ残基でのＡｐｏ-２Ｌのペグ化
システイン置換Ａｐｏ２Ｌタンパク質を、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド、分子量２０００、５０００又は２００００Ｄ（Shearwater Polymers）との、或いはヨードアセトアミド（IAM）との反応により共有結合的に修飾した。ＰＤ-１０ゲル濾過カラムを通過させて保存バッファー中に含まれるＤＴＴを最初に除去して、Ａｐｏ２Ｌ変異体のペグ化の準備をした。カラムを平衡化し、ＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ ７．５）又はアルギニン製剤バッファー（０．５Ｍのコハク酸アルギニン、２０ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ ７．５）で溶出させた。一定量のＰＥＧ−マレイミド溶液（ｄＨ２Ｏ中１０ｍＭ）を直ぐに添加した。１：１、２：１、５：１又は１０：１のシステイン変異体−Ａｐｏ２Ｌ．０単量体に対するＰＥＧ−マレイミドのモル濃度比及び２から２４時間の反応時間を使用した。反応を、２ｍＭになるまでＤＴＴを添加することにより終結させ、周囲温度で３０分インキュベーションした後、ヨードアセトアミドを１０ｍＭになるまで添加した。この反応停止手順によって、反応中に生じたあらゆるジスルフィド結合を減少させ、あらゆる未ペグ化Ｃｙｓをカルボキシアミドメチル化させた。ヨードアセトアミドでの修飾は３０分間で、その後、過剰な試薬を、平衡化されＰＢＳで溶出されるＮＡＰ-５カラム（Pharmacia）でのゲル濾過によって除去した。これらの試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＳＥＣ-ＭＡＬＳによって分析した。またＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するアポトーシス誘導活性を本明細書に記載のようにアッセイした。
【００９３】
実施例１０
部分的にペグ化されたＡｐｏ２Ｌシステイン変異体の調製
ペグ化されたＡｐｏ２Ｌシステイン変異体のクリアランスが遅いにも関わらず、システイン残基に起こり得るジスルフィド二量体形成が回避されるという特性を有するＡＰＯ２Ｌ三量体を生産することを目的にペグ化の実験を行い、その際、ｃｙｓをＡｐｏ２Ｌ単量体に導入した後３ＰＥＧ分子を三量体に添加するのではなく１−２のＰＥＧ分子を三量体に添加して、残った３番目のｃｙｓをカルボキシメチルヨードアセトアミド（ＩＡＭ）でブロックし、よって三量体の形成を防いだ。
各三量体につき１−２個の共有結合的に添加されたＰＥＧ鎖を有するＡＰＯ−２Ｌの三量体形式は、有意な生理活性特性及びジスルフィド二量体を形成する傾向の低下など、最適な特徴を同時に多数示すと考えられる。
【００９４】
５Ｋ又は２０ＫのＰＥＧ−マイレミドを用いてＲ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの部分的ペグ化を以下のように行った。コハク酸アルギニン製剤バッファーで平衡化したＰＤ-１０（Amersham Biotec）ゲル濾過カラムを通過させてＤＴＴを最初に除去し、修飾のためのＡｐｏ２Ｌ変異体のペグ化の準備をした。直ぐに２８０ｎｍでの吸光測定によりタンパク質濃度を決定した後、ＰＥＧ−マイレミド（５０００又は２００００分子量；Shearwater, Inc.）をまず０．７ＰＥＧ：１．０Ａｐｏ２Ｌ単量体の比で添加した。ＰＥＧ−マイレミドは、水中で新しく調製した保存液１０ｍＭであった。反応溶液を周囲温度で一晩インキュベートした。ペグ化反応を、２ｍＭになるまでＤＴＴを添加することにより終結させ、この溶液を室温で１時間インキュベーションした後、ヨードアセトアミドを１０ｍＭになるまで添加した。さらに一晩インキュベートすることにより、ＰＢＳで溶出したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Amersham Biotech）ゲル濾過カラム上でペグ化タンパク質を分画した。２８０ｎｍでの吸光によりタンパク質溶出をモニターし、修飾されていないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬよりも先に溶出する分画を含むタンパク質を収集してプールした。この手順は５Ｋ又は２０ＫのＰＥＧ−マイレミドを用いてＲ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを部分的にペグ化するのに使用された。オンライン光分散（ＳＥＣ-ＭＡＬＳ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによってこれらの調製物を分析したところ（図１４）、各三量体につき１又は２のＰＥＧ鎖を有する三量体を主に含む混合物から構成されることが示された。調製物の両方が含んでいる、各三量体につき１又は３のＰＥＧ鎖を有する三量体の量は、いずれも少なかった。図１０Ｇに示すように、これら混合物のＳＫ−ＭＥＳ細胞上のアポトーシス誘発の活性レベルは高かった。５Ｋｐ−Ｒ１７０Ｃ．０及び２０Ｋｐ−Ｒ１７０Ｃ．０のマウスにおける半減期はＡｐｏ２Ｌ．０よりも長く（図１１Ａ、Ｂ）、修飾されていない野生型Ａｐｏ２Ｌよりも異種移植モデルにおける腫瘍の容積を大きく減少させた（図１２Ａ、Ｂ）。
【００９５】
実施例１１
天然及びペグ化システイン変異体のアポトーシス活性
蛍光染料の代謝転換から細胞生存度を測定するバイオアッセイを使用して天然及びペグ化Ａｐｏ２Ｌシステイン変異体のアポトーシス活性を決定した（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640参照）。簡単に説明すると、０．１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco）中でＡｐｏ−２Ｌ．０又はＡｐｏ２Ｌ変異体の連続する２倍希釈物を作成し、各希釈物５０μＬを９６ウェルＦａｌｃｏｎ組織培養マイクロプレートの個々のウェルに移した。ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺癌細胞（ATCC HTB58）（ＲＭＰＩ−１６４０中、０．１％ＢＳＡ）を２×１０４細胞／ウェルの濃度で添加した。これらの混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。２０時間目に、２５μＬのアラマーブルー（AccuMed, Inc., Westlake, Ohio）を添加した。５３０ｎｍで励起した後、５９０ｎｍにおける相対的蛍光度を決定した。４パラメータ適合を用いてこれらのデータを分析し、ＥＤ５０、即ち細胞生存度を５０％減少させるＡｐｏ２Ｌ．０の濃度を計算した。
これらアッセイの結果を図９に示す。
【００９６】
実施例１２
ＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の薬物動態学
Ａｐｏ２Ｌのクリアランスに対するペグ化の効果をマウスで試験した。時間ゼロにおいてマウスにＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＰＥＧ-Ｒ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。２４時間後に血漿試料を収集した。Ａｐｏ２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。 図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、Ａｐｏ２Ｌ．０は循環から迅速に排除されるのに対して、ＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０とＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌはそれよりもゆっくりと排除された。よって、Ａｐｏ２Ｌ変異体に対するＰＥＧの部位特異的付着により、クリアランス速度が有意に減少した。
【００９７】
実施例１３
マウス異種移植モデルにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対するＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０及びＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの効果
胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５ｘ１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（ＮＣＩ）を皮下注射した。腫瘍を生じさせ、ノギスでの測定で約５００−１５００ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウスにビヒクル（２×／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、ＰＥＧ−Ｒ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）、又はＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）を腹腔内注射した。腫瘍体積を三日毎に測定し、二週間後に治療を停止した。図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０又はＰＥＧ又はＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０での処置は、Ａｐｏ２Ｌ．０の等価な投薬量よりも腫瘍体積を大きく減少させた。よって、Ｃｙｓ１７０又はＣｙｓ１７９でのＡｐｏ２Ｌのペグ化は、このヒト癌異種移植モデルにおいて効果を達成するのに必要な投薬量を低減させる。
【００９８】
実施例１４
ＤＲ５レセプター選択的変異体の置換の選択
ファージディスプレイ法を使用して、変異Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ．ＤＲ５−８に見られる置換のＤＲ５選択性決定における役割を決定した。「復帰細胞ライブラリー」を構築し、１８９、１９１、１９３、２６４、２６６及び２６７における残基を、野生型残基又はＤＲ５−８アミノ酸として変化させた。以下のコドンを使用した：１８９−ＹＡＳ、Ｔｙｒコード化、アンバー、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；１９１−ＡＲＲ、Ａｒｇ及びＬｙｓコード化；１９３−ＣＲＡ、Ｇｌｎ又はＡｒｇコード化；２６４−ＣＲＣ、Ｈｉｓ及びＡｒｇコード化；２６６−ＭＴＴ、Ｉｌｅ及びＬｅｕコード化；２６７−ＳＡＳ、Ｈｉｓ、Ｇｌｉｎ、Ａｓｐ、及びＧｌｕコード化。このライブラリーの多様性は、５１２のヌクレオチド配列によって記述される１９２のアミノ酸配列であった。Kunkelの突然変異誘発を使用して実施例１に開示したようにこのライブラリーを構築したが、但しＸＬ−１大腸菌を電気穿孔法に使用した。このライブラリーは２．５×１０１０クローンの力価を与えるもので、配列決定により５／１２が正しく突然変異していることが示され、よってライブラリーの実際のサイズは１×１０１０であった。上述のようにしてファージを生成し、回収した。
マイクロタイタプレートにコーティングしたＤＲ５−ＩｇＧに対して復帰細胞ライブラリーを１回選別した後、競合するＤＲ４−ＩｇＧの存在下でＤＲ５結合について３回選別した。２、３、及び４回の選別について、それぞれ１００ｎＭ、１μＭ、及び４μＭのＤＲ４−ＩｇＧを用いて３０分間ファージをインキュベートし、その後これらの溶液をＤＲ−ＩｇＧでコーティングしたプレートに添加した。第３回目の選別により、１０００倍を超える濃縮が得られた。点ＥＬＩＺＡにより、第２回目の選別の後、２２／２４のクローンがＤＲ５結合に対してポジティブであり、７／２４がＤＲ４に結合できることが示された。第３回目の後、２４／２４のクローンがＤＲ５に結合し、１／２４だけがＤＲ４に結合した。これら４８個のファージクローンから単離した一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を上述のようにして決定した。ＤＲ５に対してポジティブであるがＤＲ４に対してはポジティブでないライブラリー位置のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸同一性を表ＶＩＩに示す。これらの結果により、位置２６４と２６７における残基同一性は、これらの位置にＤＲ５−８アミノ酸が存在しないことからＤＲ５選択性に重要でないことが示された。対照的に、ＤＲ５−８アミノ酸は位置１８９、１９１、１９３及び２６６において優勢であり、これはこれらの部位がＤＲ５選択性に重要であることが示された。位置１８９において、Ｇｌｎコドンにより、又はアンバー終止コドンの抑制により発現されるＧｌｎに対し、優先度が強いことが示された。
【００９９】
ファージ選択に見られる優先度に基づき、２つの変異体をｐＡＰＯＫ５．０にサブクローニングし、さらに試験した。ＤＲ５−８Ｂは、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１ｋ及びＱ１９３Ｒにより野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとは異なり、ＤＲ５−８Ｃは加えてＩ２６６Ｌの置換を有する。これらの変異体を発現させて精製し、上述したように、精製したタンパク質をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によりレセプター結合について、及びＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞上の生理活性についてアッセイした（例えばHymowitz等, (2000) Biochemistry 39, 633-640）。表ＶＩＩＩに示すように、ＤＲ５−８ＢとＤＲ５−８Ｃの両方において、ＤＲ４に対する親和性が低下し、一方ＤＲ５に対する親和性がやや増大した。変異体ＤＲ５−８Ｃは、ＥＤ５０値に反映されているように、アポトーシス誘発について活性を有し、それは野生型タンパク質に観察されるものと同等か、やや良好であった。ＤＲ５−８Ｂのアポトーシス誘発活性は３分の１に低下した。比較すると、ＤＲ５−８において、ＤＲ４に対する親和性が大きく低下しており、一方野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと同等のアポトーシス誘発活性を維持していた。この実験において、ＤＲ４に対するＤＲ５−８の親和性はＫｄ値を測定するには弱すぎた。これらの結果により、アミノ酸置換Ｈ２６４Ｒ及びＤ２６７ＱによりＤＲ４結合に対してさらなる選択が行われることが示された。
【０１００】
実施例１５
マウス異種移植モデルにおけるＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの抗腫瘍活性に対するＰＥＧ鎖長の効果
上述のようにして、マウス異種移植モデルにおいて抗ＣＯＬＯ２０５腫瘍活性に対するＰＥＧ鎖長の効果を調べた。これらの実験では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）のＫ１７９Ｃ変異体を試験した。結果として各三量体につき３つのＰＥＧ鎖（各単量体につき１つ）が付加される条件下（上記実施例９に記載）において、分子量１０００、２０００、又は５０００のメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比２：１でＫ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを反応させた。ＣＭ−セファロースのカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ調製物から非ペグ化タンパク質のトレースレベル、及び加えて過剰非反応ＰＥＧ−マレイミドを除去した。２０００−ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃの分析的ゲル濾過（図２０）により、三量体への３−２０００分子量のＰＥＧ鎖の付加と一致する光分散データから計算されたモル質量を有する均質なペグ化三量体タンパク質が示された。ペグ化−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ調製物の各々をＳＫ−ＭＥＳ細胞でのアポトーシス活性についてアッセイした。Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌのペグ化により、このアッセイではＰＥＧ差の長さに応じてＥＤ５０が増大した。Ａｐｏ２Ｌ．０と比較した場合、１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２ＬのＥＤ５０は４．３倍に増大し、２０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２ＬのＥＤ５０は８．７倍に増大し、また５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ０−Ａｐｏ２ＬのＥＤ５０の増大は２３．２倍で活性が最も弱かった。
【０１０１】
ＰＥＧ鎖長に対するクリアランスの依存をマウスで試験した。上述のように薬物動態試験を行い、但しその際ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ又はＡｐｏ２Ｌ．０の注射を静脈注射により行った。注射した容量は、Ａｐｏ２Ｌ．０を５又は３０ｍｇ／ｋｇ、１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを３０ｍｇ／ｋｇ、及び２０００と５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを５ｍｇ／ｋｇであった。対照としての５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０と、２０００及び５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌについて、血漿試料を注射の１分、２時間、６時間及び２４時間後に回収した。１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌと３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０だけは、１分後及び２４時間後の試料を採取した。Ａｐｏ２Ｌの濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、図２１に示すような薬物動態曲線を導き出した。データは、ペグ化によりＡｐｏ２Ｌのクリアランスが減少し、半減期がＰＥＧの鎖長とともに増大することを示している。２４時間後には、用量５ｍｇ／ｋｇで、２つのペグ化種の血漿濃度がインビトロのバイオアッセイで測定されたＥＤ５０を超えており、Ａｐｏ２Ｌ．０は検出不可能なレベルに低下した。
【０１０２】
マウス異種移植モデルにおいて１０００、２０００、及び５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２ＬのＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対する効果を試験した。これらの実験では、静脈内投与（３０ｍｇ／ｋｇ）を１回行った。ペグ化タンパク質に対する効果を、３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０を１回静脈内投与した場合の効果、並びに６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０の腹腔内投与を５×／ｗｋで１週間行う「標準的」処置と比較した。腫瘍体積を２週間測定した。図２２に示すように、２０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌは、同量のＡｐｏ２Ｌ．０と同様に腫瘍の成長を抑制したのに対し、５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌによる腫瘍成長の抑制効果はそれよりも小さかった。１０００分試料のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌによる腫瘍成長の抑制効果は、同量のＡｐｏ２Ｌ．０よりも大きかった。有意な点は、この活性が、１０倍のＡｐｏ２Ｌ．０を投与する標準的な治療の活性に匹敵するものであったことである。１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの半減期の増大と、生理活性が良好に保持されるという組合せにより、分子の効果が向上した。
【０１０３】
表
表Ｉ 特異的ＤＲ５−ＩｇＧ−結合の濃縮により決定されたファージ上の機能的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのファージディスプレイ
結合してＤＲ５−ＩｇＧウェルから溶出したファージの、空のウェルに観察されたものに対する比から濃縮を計算した。２つの野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬファージミド構築物を２種類の成長温度で試験した。
【０１０４】
表ＩＩ ＤＲ４−選択性ファージクローンのＤＮＡ配列から推定したライブラリー位置におけるアミノ酸配列
「Ｘ」は、満足な配列決定データが無いために残基同一性が決定できない位置を示す。本開示において、例えば「ＤＲ４−８」は、表中に同定されたＤＲ４選択的変異体クローン番号８を指す。「ＷＴ」は野生型を意味する。
【０１０５】
表ＩＩＩ ＤＲ５−選択性ファージクローンのＤＮＡ配列から推定したライブラリー位置におけるアミノ酸配列
【０１０６】
表ＩＶ ＤＲ５−選択性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体タンパク質のレセプター結合及びアポトーシス誘発活性
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの１１４−２８１作成物においてＤＲ５選択性突然変異体を生成し、精製し、ＳＫ−ＭＥＳ上のアポトーシス誘発、及びＢＩＡｃｏｒｅによるレセプター結合についてアッセイした。野生型に対する突然変異体の比を示す。
【０１０７】
表Ｖ ＤＲ４選択性及びＤＲ５選択性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体のレセプター結合及びアポトーシス誘発（ｆｌａｇでタグをつけたもの）
ＢＩＡｃｏｒｅ分析によりＫＤ値を決定し、野生型タンパク質について計算された値に対する比で示す。アポトーシス誘発は、２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）がある場合と無い場合について、ＥＤ５０値（ｎｇ／ｍＬ）から評価した。
【０１０８】
表ＶＩ ＣＡＲＢ−ＡＱああ正により決定されたｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体のレセプター結合
ＩＣ５０値に基づいて突然変異体を野生型Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと比較した。記号「＞」は、アッセイで試験した突然変異体の最高濃度よりＩＣ５０値が高く、よってレセプター結合の倍増には低い制限しか予測できないことを示す。
【０１０９】
表ＶＩＩ 復帰細胞ライブラリーから選択された配列
【０１１０】
表ＶＩＩＩ ＤＲ５−８変異体の相対的レセプター結合親和性及び生理活性
ａ：アミノ酸変化は野生型Ａｐｏ２Ｌに対するものである。
ｂ：レセプター結合と生理活性の値は野生型Ａｐｏ２Ｌに対する比である。
【０１１１】
１． 図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、次の図１（配列番号１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃのうち１又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２． 図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該変異が表ＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
３． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ４レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
４． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
５． 前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
６． 前記ＤＲ４レセプターが図２Ａ−２Ｂ（配列番号３）のアミノ酸１〜２１８を有する、請求項３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
７． 前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９３、１９９又は２０１に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
８． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
９． 図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ａ、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ｄ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ：Ｄ２６９Ｅ、及び
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｓ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６９Ｅ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１０． 図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を含んでなり、該突然変異が表ＩＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含む、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１１． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１２． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１３． 前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１４． 前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１１に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１５． 前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１６． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１７． 図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、前記突然変異が表ＶＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を有する、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１８． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１９． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２０． 前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１９に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２１． 前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１８に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２２． 図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ；
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ；及び
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｉ２６６Ｌ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２３． 前記ポリペプチドが１又は複数のポリオールに抱合又は結合する、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２４． 前記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項２３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２５． 前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約１０００ダルトンから２５０００ダルトンである、請求項２４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２６． 請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
２７． 請求項２６のコード化ＤＮＡを含んでなるベクター。
２８． 請求項２７のベクターを含んでなる宿主細胞。
２９． 前記宿主細胞が大腸菌、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞である、請求項２８の宿主細胞。
３０． 請求項２８に記載の宿主細胞を前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを前記培養物から回収することを含んでなる、Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの製造方法。
３１． 請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物。
３２． 前記組成物が、１又は複数の二価金属イオンを含む製薬的に許容可能な製剤を含む、請求項３１に記載の組成物。
３３． ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターを発現する哺乳動物細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含んでなる、哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する方法。
３４． 哺乳動物の癌細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含む、癌治療法。
３５． 前記哺乳動物の癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、神経膠腫癌細胞、或いは大腸又は結腸直腸癌細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
３６． 前記方法が、前記哺乳動物の癌細胞を、プロドラッグ、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤、又はサイトカインにさらすことを更に含む、請求項３４に記載の方法。
３７． 前記哺乳動物に対し、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫関連疾患治療法。
３８． 前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項３７に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体、そのような変異体の調製方法、及びそのような変異体を利用した組成物とアッセイに関する。特に、本発明は、天然配列Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬとは異なり、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬレセプターのＤＲ４及びＤＲ５に対して結合親和特性を有するＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体に関する。加えて、本発明は、システイン置換を有することにより、例えば、ポリエチレングリコール等の部分による化学修飾を促進できるＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特性付けられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Barr et al., Bio/Technology, 12：487-493(1994)；Steller et al., Science, 267：1445-1449(1995)を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Itoh et al., Cell, 66：233-243(1991)］。
【０００３】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される）、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)；Pitti et al., J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wiley et al., Immunity, 3：673-682(1995)；Browning et al., Cell, 72:847-856(1993)；Armitage et al., Nature, 357:80-82(1992), 1997年1月16日公開の国際公開９７／０１６３３；1997年7月17日公開の国際公開９７／２５４２８；Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；1998年7月2日公開の国際公開９８／２８４２６；1998年10月22日公開の国際公開９８／４６７５１；1998年5月7日公開の国際公開９８／１８９２１；Moore et al., Science, 285:260-263(1999)；Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ−２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００４】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995)；Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996)；２００１年９月４日発行の米国特許第６２８４２３６を参照］。完全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通タンパク質である。ある細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素による切断を通して、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究はＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにする［Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、（ホモ三量体の各サブユニットの位置２３０の）３つのシステイン残基が併せて亜鉛原子を配位しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるという独特の構造的特徴を有していることが分かった。［上掲のHymowitz et al.；Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)］。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患を含む免疫系の調節に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている［例えば、Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998)；Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999)；Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999)；Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)］。
【０００５】
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型はまた大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含むインビトロの様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することが報告されている［例えば、上掲のWiley et al.；上掲のPitti et al.；Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998)；Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)；Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999)；Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999)；Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999)；Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999)；Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000)；Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)を参照のこと］。マウス腫瘍モデルでのインビボ研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて、実質的な抗腫瘍効果を生じうることを示唆している［例えば上掲のAshkenazi et al.；上掲のWalzcak et al.；Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999)；上掲のChinnaiyan et al.；Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999)を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どの正常なヒト細胞タイプはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのある種の組換え形態によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenazi et al.；上掲のWalzcak et al.］。ＪｏらはＡｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬのポリヒスチジンタグ可溶型が正常な単離された非ヒトではなくヒト肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したことを報告している［Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000)；またNagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)を参照のこと］。ある種の組換えＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、死亡対正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001)；Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)］。
【０００６】
ＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞応答の誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ１)と７５-ｋＤａ(ＴＮＦＲ２)の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定され［Hohman et al., J. Biol. Chem., 264：14927-14934(1989)；Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87：3127-3131(1990)；１９９１年３月２０日に公開された欧州特許第４１７５６３号］、両者のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され特徴付けられている［Loetscher et al., Cell, 61：351(1990)；Schall et al., Cell, 61：361(1990)；Smith et al., Science, 248：1019-1023(1990)；Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88：2830-2834(1991)；Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11：3020-3026(1991)］。広範な多型が両方のＴＮＦレセプター遺伝子に伴っている［例えばTakao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)］。両方のＴＮＦＲが細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有している。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶型ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出されている［Nophar, Y et al., EMBO J., 9：3269(1990)；及びKohno, T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87：8331(1990)］。組換え可溶型ＴＮＦレセプターのクローニングはHale等［J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)］によって報告されている。類似のプロリンリッチ領域がＴＮＦＲ２に見出されるが、ＴＮＦＲ１では見出されない。
【０００７】
１型又は２型のＴＮＦＲ(ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２)の細胞外部分は、ＮＨ２-末端から出発して、１から４と命名される４つのシステインに富んだドメイン(ＣＲＤ)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０アミノ酸長で、よく保存されている位置に４から６のシステイン残基を含んでいる［Schall et al., 上掲；Loetscher et al., 上掲；Smith et al., 上掲；Nophar et al., 上掲；Kohno et al., 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−約１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は１７から約５４までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５５から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１４０までのアミノ酸；及びＣＲＤ４−約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)］。リガンド結合におけるＣＲＤの潜在的な役割はまた上掲のBannerらに記載されている。
【０００８】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター(ＮＧＦＲ)［Johnson et al., Cell, 47：545(1986)；Radek et al., Nature, 325：593(1987)］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Stamenkovic et al., EMBO J., 8：1403(1989)］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Mallet et al., EMBO J., 9：1063(1990)］及びＦａｓ抗原［Yonehara et al., J. Exp. Med. 及びItoh et al., Cell, 66:233-243(1991)］を含む幾つかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ(ｓＴＮＦＲ)様のＴ２タンパク質にも見出されている［Upton et al., Virology, 160：20-29(1987)；Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176：335(1991)；Upton et al., Virology, 184：370(1991)］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、ＣＲＤ１の欠失［Welcher A.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159-163 (1991)］又はこのドメインでの５-アミノ酸の挿入がＮＧＦ結合には殆ど又は全く効果がないことを示した［上掲のYan, H. and Chao, M.V.］。ｐ７５ＮＧＦＲはそのＣＲＤ４及び膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンリッチなストレッチを含んでおり、これはＮＧＦ結合には関与していない［Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988)；Seckinger, P et al., J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989)；上掲のYan, H. and Chao, M.V.］。
【０００９】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプターはＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
最近になって、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。このような新たに同定されたＴＮＦＲのメンバーは、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）［Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996)；Montgomery et al., Cell, 87:427-436 (1996)；Marsters et al., J.Biol.Chem., 272:14029-14032 (1997)；Simonet et al., Cell, 89:309-319 (1997)］を含む。上掲のSimonetらは、他の周知のＴＮＦＲ様分子とは異なり、ＯＰＧは疎水性の膜貫通−スパニング配列を含まないと報告している。下記にて検討されているように、ＯＰＧはデコイ(囮)レセプターのように作用すると考えられている。
【００１０】
Panらは、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Pan et al., Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺機構に関与可能な細胞質デスドメインを含むと報告されている。Panらは、ＤＲ４がＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridan et al., Science, 277: 818-821 (1997)及びPan et al., Science, 277: 815-818 (1997)においては、Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［１９９８年１１月１９日に公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９もまた参照のこと］。この分子は、ＤＲ５と呼ばれる（あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている［Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９８年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１］）。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999)に記載されている。
【００１１】
最近同定されたＴＮＦＲファミリーメンバーの更なるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達トランスデューサーというよりはむしろ阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１（ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される）［Pan et al., Science, 276：111-113(1997)；Sheridan et al., Science, 277：818-821 (1997)；McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneider et al., FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapaya et al., J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２（ＴＲＵＮＤＤ，又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される）［Marsters et al., Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Pan et al., FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Esposti et al., Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［上掲のSimonet et al.］及びＤＣＲ３［Pitti et al., Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合すると報告されている。
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬは細胞表面「デスレセプター」ＤＲ４及びＤＲ５を通して作用してカスパーゼ、又は細胞内細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている。［例えば、Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)を参照のこと］。リガンド結合の際、ＤＲ４とＤＲ５は、双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１［Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000)；Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000)；Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【００１２】
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281:1305-1308(1998)；Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss and Dower、及びNagata, Cell, 88:355-365(1997)；Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)；Wallach, “TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families", Cytokine Research, Academic Press, 377-411頁(2000)を参照のこと。
多様な境界面に関与するあるタンパク質のタンパク質-タンパク質相互作用において、亜鉛結合部位は構造的役割を担うことが示されているが［Feese et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:3544-3548(1994)；Somers et al., Nature, 372: 478-481(1994)；Raman et al., Cell, 95: 939-950(1998)］、ＴＮＦファミリー（ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦ-α、又はＴＮＦ-β）で以前に構造的に特徴付けられたメンバーには、金属へ結合するものはない。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ような種々のホルモンの製剤における亜鉛のような金属イオンの利用は、文献に記載されている。［例えば、１９９２年１０月１５日公開の国際公開９２／１７２００を参照のこと］。レセプターへのｈＧＨの結合における亜鉛の関与は同様に１９９２年３月５日公開の国際公開９２／０３４７８に記載されている。インターフェロン-α二量体及びインターフェロン-β二量体における亜鉛結合の役割は、それぞれWalter et al., Structure, 4:1453-1463(1996)及びKarpusas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:11813-11818(1997)に報告されている。亜鉛のような種々の金属イオンの構造的及び生物学的役割は、当該分野で概説されていおり、例えば、Christianson et al., Advances in Protein Chemistry, 42: 281-355(1991)を参照のこと。
【発明の概要】
【００１３】
本発明はＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を提供する。特に、本発明は、図１に示すＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬの天然配列（図１）中に一又は複数のアミノ酸置換を含むＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を提供する。場合によっては、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体は図９に同定されるようなシステイン置換を含み得る。コレに関連する本発明の実施態様は、図９に示すＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体ポリペプチドを含み、これはポリ（エチレングリコール）２０００などの１又は複数のポリオール群に対して抱合又は結合する。本発明はまた、そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子、及びＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を含むベクターと宿主細胞を提供する。
本発明はまた、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに示すような置換を含むＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を提供し、該置換により変異体のＤＲ４レセプター及び／又はＤＲ５レセプター結合特性が変更されている。驚くべきことに、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに示すようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体のＤＲ４及び／又はＤＲ５に関する結合親和性が（図１に示す天然Ａｐｏ−２リガンドと比較して）変化し、さらにはＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を示すことが分かった。本発明はまた、そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬをコードする核酸分子、並びにＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体をコードする核酸分子を有するベクター及び宿主細胞を提供する。
【００１４】
本発明の更なる実施態様は、そのようなＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を含む製造品及びキットを提供する。製造品及びキットには、容器、容器貼付ラベル、及び容器内に収容される薬剤が含まれる。容器貼付ラベルは、薬剤（又は薬剤を含む組成物）が特定の治療的又は非治療的用途に使用できるものであることを示す。薬剤は、本明細書に開示する１又は複数のＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を含む。
加えて、本明細書に開示するＡｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ変異体を使用する治療法及び非治療法が提供される。本発明の実施形態は、哺乳動物の細胞にアポトーシスを誘発する方法を含み、この方法は、ＤＲ４レセプター及びＤＲ５レセプターからなる群から選択されたレセプターを発現する哺乳動物の細胞を、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの治療的有効量に接触させることを含む。本発明の更なる実施形態は、哺乳動物の癌を治療する方法を含み、本方法は、そのような哺乳動物に対し、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体の有効量を投与することを含む。場合によっては、該方法において、癌は肺癌、乳癌、神経膠腫、大腸癌又は結腸直腸癌であり得る。本発明のさらなる実施形態は、哺乳動物の免疫関連疾患の治療法を含み、この方法は、そのような哺乳動物に対し、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含む。場合によっては、該方法において、免疫関連疾患は関節炎又は多発性硬化症であり得る。
【００１５】
本発明の様々な実施形態を以下に挙げる：
１．図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドの配列とは異なり、図１の（配列番号１）の残基位置のアミノ酸置換Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃのうち１又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２．図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該変異が表ＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換からなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
３．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ４レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
４．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
５．前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項４のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
６．前記ＤＲ４レセプターが図２Ａ−２Ｂ（配列番号３）のアミノ酸１〜２１８を有する、請求項３のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
７．前記１又は複数のアミノ酸突然変異が天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９３、１９９又は２０１に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
８．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
９．図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ａ、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ｄ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ：Ｄ２６９Ｅ、及び
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｓ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６９Ｅ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群（１セット）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１０．図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を含んでなり、該突然変異が表ＩＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含む、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１１．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１２．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１３．前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１２のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１４．前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１１のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１５．前記１又は複数のアミノ酸突然変異が天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１６．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項１０のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１７．図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該突然変異が表ＶＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を有する、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１８．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１７のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１９．前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１７のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２０．前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１９のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２１．前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１８のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２２．図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、図１（配列番号１）の残基位置に：
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ；
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ；及び
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｉ２６６Ｌ
からなるグループから選択される１群（１セット）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２３．前記ポリペプチドが１又は複数のポリオールに抱合又は結合する、請求項１ないし２２のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２４．前記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項２３のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２５．前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約１０００から２５０００ダルトンである、請求項２４のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２６．請求項１ないし２２のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子。
２７．請求項２６のコード化ＤＮＡを含むベクター。
２８．請求項２７のベクターを含む宿主細胞。
２９．前記宿主細胞が大腸菌、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞である、請求項２８の宿主細胞。
３０．請求項２８の宿主細胞を前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること、及び前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを前記培養物から回収することを含む、Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの生成方法。
３１．請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを含む組成物。
３２．前記組成物が、１又は複数の二価金属イオンを含む、製薬的に許容可能な製剤を含む、請求項３１の組成物。
３３．ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターを発現する哺乳動物細胞を、請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドに接触させることを含む、哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する方法。
３４．哺乳動物の癌細胞を、請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量に接触させることを含む、癌治療法。
３５．前記哺乳動物の癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、神経膠腫癌細胞、或いは大腸又は結腸直腸癌細胞を含む、請求項３４の方法。
３６．前記方法が、前記哺乳動物の癌細胞を、プロドラッグ、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤、又はサイトカインに接触させることを更に含む、請求項３４の方法。
３７．前記哺乳動物に対し、請求項１ないし２５のいずれかのＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含む、哺乳動物の免疫関連疾患治療法。
３８．前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項３７の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒトＡｐｏ−２リガンドｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列と、それに得られたアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ヌクレオチド位置４４７（配列番号２）の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であることを示すために使用されている。
【図２Ａ】完全長ヒトＤＲ４レセプターのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）と、それに得られたアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヒトＤＲ４レセプターの対応するヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、Pan et al., Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図２Ｂ】完全長ヒトＤＲ４レセプターのｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号４）と、それに得られたアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ヒトＤＲ４レセプターの対応するヌクレオチド配列とアミノ酸配列は、Pan et al., Science, 276:111 (1997)にも開示されている。
【図３Ａ】１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３に開示されているヒトＤＲ５レセプターの４１１アミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図３Ｂ】１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６に開示されている、ヒトＤＲ５の別の形態である４１０アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｃ】１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６に開示されている、ヒトＤＲ５の別の形態である４１０アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４Ａ】Ａｐｏ−２Ｌの結晶構造を示す。三重の軸に沿った三量体が示されている。単量体はみな同一である。残基１２０から始まるタンパク質構造は秩序正しく、残基１３１−１４１と１９５−２０１は乱れている（破線で示す）。対象な関係にある３つのシステインを含む亜鉛結合部位及び溶媒リガンドを図中の空白として示す。
【図４Ｂ】亜鉛結合部位の拡大立体斜視図である。Ｓγ−亜鉛−Ｓγ間の角度は１１２度であり、Ｓγ−亜鉛−溶媒間の角度は１０７度であり、このときの結合距離は亜鉛−硫黄間で２．３Å、及び亜鉛−溶媒間で２．３Åであった。図４ＢはプログラムＭｏｌｓｃｒｉｐｔ[Kraulis et al., J. Appl. Cryst., 24:946-950 (1991)]及びＲａｓｔｅｒ３Ｄ[Merrit et al., Acta Cryst., D50:869-873 (1994)]を用いて作成した。
【図４Ｃ】結晶学的データのまとめである。
【図５】選択したＴＮＦファミリーメンバー、即ちＡｐｏ２Ｌ（配列番号７）；ＴＮＦ−β（配列番号８）；ＴＮＦ−α（配列番号９）；ＣＤ４０（配列番号１０）；ＦａｓＬ（配列番号１１）；ＲＡＮＫＬ（配列番号１２）の配列アラインメントを示す。配列の上の矢印は、Ａｐｏ２Ｌ中のβ鎖を示す。整列させた配列上の番号は図１（配列番号１）に示したＡｐｏ２Ｌ配列番号と対応している。
【図６】Ａｐｏ−２Ｌの空間を満たすモデル上にマッピングした突然変異の分析を示す。アラニンに変異導入されたとき生理活性が５分の１未満に低下した残基を標識し、濃いグレーで示した。変異導入された他の残基が中程度の濃さのグレーで示され、うち数個が標識されている。
【図７Ａ】Ａｐｏ２Ｌ・ＤＲ５複合体（Hymowitz等, (1999) Mol. Cell. 4, 563）のＸ線結晶構造に見られる「パッチＡ」接触を示す。Ａｐｏ２Ｌのバックボーンの跡と選択された側鎖が濃いグレーで、ＤＲ５のバックボーンの跡と選択された側鎖が薄いグレーで示されている。ＤＲ５のレセプター配列として配列番号５のアミノ酸１４３−１５７、及びＤＲ４のレセプター配列として配列番号３のアミノ酸１９４−２０８が示されている。
【図７Ｂ】Ａｐｏ２Ｌ・ＥＣＤ複合体に決定されたＸ線構造を示す別の図である。
【図８Ａ】Ａｐｏ−２Ｌ変異体の同定に使用される一価のファージディスプレイの概略図である。
【図８Ｂ】Ａｐｏ−２Ｌファージディスプレイライブラリーの実施形態を例示する。
【図８Ｃ】ＤＲ４（グレー）又はＤＲ５（黒）への特異的結合のファージライブラリーの濃縮を示すグラフである。各回における濃縮は、空のウェルからの溶出に対する、レセプターでコーティングしたウェルから溶出されたファージの比として計算した。ＤＲ４−ＩｇＧへの結合についてＤＲ４ライブラリーを５回ソーティングし、３−５回目には競合者としてＤＲ５−ＩｇＧを含めた。ＤＲ５ライブラリーをＤＲ５−ＩｇＧへの結合について８回ソーティングし、５−８回目には競合者としてＤＲ４−ＩｇＧを含めた。
【図９】列挙された残基にシステイン置換を有する様々な天然及びペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体のＥＤ５０比を示すグラフである。
【図１０Ａ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｂ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｃ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｄ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｅ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｆ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１０Ｇ】Ａｐｏ−２Ｌと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）等の成分で修飾したＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体の、アポトーシス誘発活性を示す。これらＡｐｏ−２Ｌ分子のアポトーシス誘発活性を、ＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞とアラマーブルーアッセイを用いて評価した。「Ａｐｏ２Ｌ．０」は配列番号１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ａｐｏ２Ｌ．２」は配列番号１のアミノ酸９１−２８１からなるＡｐｏ−２リガンドを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＰＥＧ」は、Ｋ１７９Ｃ置換変異体（つまり、配列中１７９の位置においてシステインが置換されたＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸形態）で、この残基に２０００分子量のＰＥＧ成分が付加されているものを、「Ｋ１７９Ｃ．０−ＩＡＭ」はこの残基にヨードアセトアミド成分が付加されているＫ１７９Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−５Ｋｐ」はこの残基に５０００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、「Ｒ１７０Ｃ−２０Ｋｐ」はこの残基に２００００分子量のＰＥＧ成分が付加されている、部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ置換変異体を、それぞれ示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、マウスにおける部分的にペグ化された５Ｋ及び２０ＫのＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ又は２Ｋ−ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ及びＡｐｏ２Ｌ．０の薬物動態を示す。０時間目に、マウスにＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又はＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）又は２Ｋ−ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃを腹腔内注射した。これらのデータは、部分的にペグ化した変異体がＡｐｏ２Ｌ．０よりも長い半減期を持つことを示す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、マウス異種移植モデルにおける部分的にペグ化されたＡｐｏ−２Ｌシステイン置換変異体のヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍に対する効果を示す。胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５×１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（NCI）を皮下注射した。腫瘍を形成させてノギス測定の結果約５００−１５００ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウスにビヒクル（２×／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）、又はペグ化したＡｐｏ−２Ｌ変異体（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）を腹腔内注射した。３日ごとに腫瘍体積を測定し、２週間後に処置をやめた。
【図１３】クリスタルバイオレットアッセイにおけるＡｐｏ−２ＬとＫ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０のカニクイザルの肝細胞に対する効果を示す。
【図１４】オンライン光分散検出器（ＭＡＬＳ）（Wyatt Technology, Inc.）を備えたクロマトグラフシステムを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Biotech）上におけるサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により５Ｋ又は２０ＫのＰＥＧ−マレイミドを用いて部分的にペグ化されたＲ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの分析結果を示す。実線はＵＶトレースを表し、記号は光分散データから計算したモル質量を示す。
【図１５】ＤＲ４−ＩｇＧを用いたＤＲ４ライブラリークローンによる競合ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。ファージＥＬＩＳＡではＤＲ４−ＩｇＧ及び抗Ｍ１３抗体−ＨＲＰコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタプレートのウェルを使用して結合ファージを検出した。ＤＲ４−ＩｇＧの溶液濃度結合を増大することにより結合を競合させた。
【図１６】ＤＲ５−ＩｇＧを用いたＤＲ４ライブラリークローンによる競合ファージＥＬＩＳＡの結果を示す。ファージＥＬＩＳＡではＤＲ４−ＩｇＧ及び抗Ｍ１３抗体−ＨＲＰコンジュゲートでコーティングしたマイクロタイタプレートのウェルを使用して結合ファージを検出した。ＤＲ５−ＩｇＧの溶液濃度結合を増大することにより結合を競合させた。
【図１７】ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体によるＣｏｌｏ２０５大腸癌細胞上のアポトーシス誘発のアッセイを示す。Hymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640に開示された蛍光アッセイを使用してＤＲ５選択性（パネルＡ）又はＤＲ４選択性（パネルＢ）突然変異体を試験した。「抗Ｆｌａｇ」とは、２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）が特定の濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体と共に添加されていることを示す。曲線は４パラメータ式を用いた適合を示す。
【図１８】Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのレセプター選択性突然変異体によるジャーカット細胞上のアポトーシス誘発のアッセイを示す。Hymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640に開示された蛍光アッセイを使用してＤＲ５選択性（パネルＡ）又はＤＲ４選択性（パネルＢ）突然変異体を試験した。「抗Ｆｌａｇ」とは、２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）が特定の濃度のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体と共に添加されていることを示す。曲線は４パラメータ式を用いた適合を示す。
【図１９】指定濃度の変異体Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及び２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）存在下におけるカニクイザル肝細胞の生存度を示す。クリスタルバイオレット染色を使用して肝細胞の生存度を測定した。
【図２０】オンライン光分散検出器（ＭＡＬＳ）（Wyatt Technology, Inc.）を備えたクロマトグラフシステムを用いたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Amersham Biotech）上におけるサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による２ＫＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ及びカルボキシアミドメチル化したＫ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ（ＩＡＭ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ）の分析結果を示す。実線はＵＶトレースを表し、塗りつぶした四角の記号は光分散データから計算したモル質量を示す。
【図２１】マウスにおけるペグ化Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ及びＡｐｏ２Ｌ．０の薬物動態を示す。マウスに５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇのタンパク質を静脈内注射した。指定の時間に血清試料を回収し、Ａｐｏ２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【図２２】マウス異種移植モデルにおけるＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対するペグ化Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの効果を示す。３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０又はペグ化Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを１回だけマウスに静脈内注射した。マウスの別のグループには、「標準的」な処置計画に対応する処置として、６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０を５回腹腔内投与した。
【００１７】
好適な実施態様の詳細な説明
Ｉ．定義
「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ−２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ」及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、ここでは図１（配列番号１）に示されたアミノ酸配列のアミノ酸残基１１４−２８１、９５−２８１、残基９２−２８１、残基９１−２８１、残基４１−２８１、残基３９−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１、並びに上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入、又は置換変異体を含むポリペプチド配列を意味するものとして互換可能に使用される。一実施態様では、ポリペプチド配列は図１（配列番号１）の残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は図１（配列番号１）の残基９２−２８１又は残基９１−２８１を含む。Ａｐｏ−２Ｌポリペプチドは図１に示された天然ヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９（図１；配列番号２）をコードするコドンは「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」でありうる。場合によっては、断片又は変異体は生物学的に活性であり、上記の配列の何れか一と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。この定義には、その天然のアミノ酸の少なくとも一がアラニン残基のような他のアミノ酸によって置換されているＡｐｏ−２リガンドの置換変異体が包含される。随意的な置換変異体は、以下の図９及び表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに特定された残基の置換の一又は複数を含む。定義には、組換え又は合成法によって調製された、又はＡｐｏ−２リガンド源から単離された天然配列Ａｐｏ−２リガンドもまた包含される。本発明のＡｐｏ−２リガンドは１９９７年１月１６日公開の国際公開９７／０１６３３、１９９７年７月１７日公開の国際公開９７／２５４２８、１９９９年７月２２日公開の国際公開９９／３６５３５、２００１年１月４日公開の国際公開０１／００８３２、２００２年２月７日公開の国際公開０２／０９７５５、及び２０００年１２月１４日公開の国際公開００／７５１９１に開示されたＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドを含む。本用語は、一般に、ポリペプチドの単量体、二量体、三量体、六量体又は命令オリゴマーを含むＡｐｏ−２リガンドの形態を意味するものとして使用される。Ａｐｏ−２Ｌ配列において言及されているアミノ酸残基の全ての番号付けは、特に他の定義を述べない限り、図１（配列番号：１）における番号付けを使用している。例えば、「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は図１（配列番号：１）に与えられた配列中、位置２０３のアスパラギン酸残基を意味する。
【００１８】
本明細書で使用する「Ａｐｏ−２リガンド選択的変異体」という用語は、天然Ａｐｏ−２リガンド配列に１又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターに対して選択的な結合親和性を有するＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを指す。一実施形態では、Ａｐｏ−２リガンド変異体はＤＲ４レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、又は２０９のいずれか１つに１又は複数のアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ａｐｏ−２リガンド変異体はＤＲ５レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９のいずれか１つに１又は複数のアミノ酸置換を含む。
好ましいＡｐｏ−２リガンド選択的変異体は、１又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンド変異体がＤＲ４レセプターに対して示す以上（≧）の結合親和性を示す。さらに好ましくは、Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ５に対して示すより小さい（＜）結合親和性を示す。このようなＡｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい（不変である）か、それよりも大きく（増大している）、Ａｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、小さいか、殆ど消滅しており、ここでの目的のため、Ａｐｏ−２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ４レセプターについて「選択性」であると考えられる。好ましい本発明のＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１０分の１以下の結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ５レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１００分の１以下の結合親和性を有する。Ａｐｏ−２リガンド変異体それぞれの結合親和性を測定し、本技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより（１１４−２８１形式等の）天然Ａｐｏ−２Ｌの結合特性と比較することができる。これについては実施例で後述する。本発明の好ましいＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）にアポトーシスを誘発し、そのようなアポトーシス活性を実施例のアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体の、Ａｐｏ−２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対する結合親和性は、変化していても、していなくともよく、それらデコイレセプターを当技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと呼ぶ。
【００１９】
さらなる好ましいＡｐｏ−２リガンド選択的変異体は、１又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ５レセプターに対して示す以上（≧）の結合親和性を示し、さらに好ましくは、そのようなＡｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ−２リガンドがＤＲ４に対して示すより小さい結合親和性を示す。このようなＡｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい（不変である）か、それよりも大きく（増大している）、Ａｐｏ−２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合、それより小さいか、殆ど消滅しており、ここでの目的のため、Ａｐｏ−２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ５レセプターについて「選択性」であると考えられる。好ましい本発明のＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１０分の１以下の結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ４レセプターに対して（天然配列Ａｐｏ−２リガンドと比較した場合）１００分の１以下の結合親和性を有する。Ａｐｏ−２リガンド変異体それぞれの結合親和性を測定し、本技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより（１１４−２８１形式等の）天然Ａｐｏ２Ｌの結合特性と比較することができる。これについては実施例で後述する。本発明の好ましいＤＲ４選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）にアポトーシスを誘発し、そのようなアポトーシス活性を実施例のアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ５選択性Ａｐｏ−２リガンド変異体の、Ａｐｏ−２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対する結合親和性は、変化していても、していなくともよく、それらデコイレセプターを当技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと呼ぶ。
【００２０】
本明細書に開示するＡｐｏ−２リガンド変異体を省略して表記するため、天然配列Ａｐｏ−２リガンドのアミノ酸配列（図１参照）に沿ったアミノ酸残基の位置に番号を付与する。アミノ酸の識別には以下のようなアミノ酸のアルファベット１文字を使用する。
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｔｈｒ Ｔ スレオニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
【００２１】
ここで使用される「ＤＲ４」及び「ＤＲ４レセプター」という用語は、Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)；１９９８年７月３０日公開の国際公開９８／３２８５６；２００２年１月２９日発行の米国特許第６３４２３６３号；及び１９９９年７月２９日公開の国際公開９９／３７６８４に記載されているレセプターの完全長可溶性細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ４レセプターの完全長アミノ酸配列は、貼付図面の図２Ａ−２Ｂに与えられている。ＤＲ４の細胞外ドメインを有するＩｇ−融合タンパク質を以下の実施例に開示する。
ここで使用される「ＤＲ５」及び「ＤＲ５レセプター」という用語は、Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)；Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)、２０００年６月６日発行の米国特許第６０７２０４７号、１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３；１９９８年９月２４日公開の国際公開９８／４１６２９；Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997)；Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997)；Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開９８／３５９８６；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許第８７０８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開９８／４６６４３；１９９９年１月２１日公開の国際公開９９／０２６５３；１９９９年２月２５日公開の国際公開９９／０９１６５；１９９９年３月１１日公開の国際公開９９／１１７９１に記載されているレセプターの完全長可溶性細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ５レセプターは当該分野においてＡｐｏ−２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている。ここで使用されるＤＲ５という用語には、図３Ａに提供された完全長４１１アミノ酸ポリペプチド及び図３Ｂ−３Ｃに提供された完全長４４０アミノ酸ポリペプチドが含まれる。ＤＲ５の細胞外ドメインを有するＩｇ−融合タンパク質を以下の実施例に開示する。
【００２２】
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は広義に多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水可溶型ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン−ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。本発明のポリオールには当該分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合（コンジュゲート）」という用語は、ここではその最も広い定義で使用され、共に接合（joined）又は結合（linked）されていることを意味する。分子は、接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
【００２３】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」という用語は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に持たないリガンド又はレセプターの型を意味する。通常、可溶性ＥＣＤは、そのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。
「Ａｐｏ−２リガンド単量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ単量体」という用語はＡｐｏ−２Ｌの細胞外ドメイン配列の共有結合鎖を意味する。
「Ａｐｏ−２リガンド二量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ二量体」という用語はジスルフィド結合を介して共有結合によって結合した二つのＡｐｏ−２Ｌ単量体を意味する。ここで使用される該用語には、Ａｐｏ−２Ｌの三量体型内にあるＡｐｏ−２Ｌ二量体及び遊離しているＡｐｏ−２Ｌ二量体が含まれる（すなわち、他のＡｐｏ−２Ｌ単量体と結合している）。
「Ａｐｏ−２リガンド三量体」又は「Ａｐｏ−２Ｌ三量体」という用語は非共有的に結合している(associated)三つのＡｐｏ−２Ｌ単量体を意味する。
【００２４】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＡｐｏ−２リガンド、又はＡｐｏ−２リガンド変異体、又はそれらの部分等のタンパク質を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、抗体が産生され得るモノに対するエピトープを提供するのに十分な残基を有しているが、Ａｐｏ−２リガンド又はＡｐｏ−２リガンド変異体の活性を阻害しないよう十分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８から約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０から約２０の残基)を有する。
「二価の金属イオン」という用語は、二つの正電荷を有する金属イオンを称する。本発明において使用される二価金属イオンの例には、限定されるものではないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム、及びマンガンが含まれる。かかる金属の特定の形態は塩形態（例えば、製薬剤的に許容可能な塩形態）、例えば、上述の二価の金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩形態を含むものが用いられうる。本発明において使用される好適な二価金属イオンは、亜鉛、より好ましくはその塩形態、硫酸亜鉛である。ここにおいて記載の二価金属イオンは、好ましくは、例えば、（１）所望する期間にわたってＡｐｏ−２Ｌ三量体の貯蔵安定性を高め、（２）組換え細胞培養又は精製法においてＡｐｏ−２Ｌ三量体の生産又は収量を高め、（３）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の溶解性を高め（又は凝集性を低下させ）、又は（４）Ａｐｏ−２Ｌ三量体の形成を高めるのに十分な濃度又は量（例えば有効量）で用いられる。
【００２５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。Ａｐｏ−２リガンドの自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツでのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」Ａｐｏ−２リガンド核酸分子は、同定され、Ａｐｏ−２リガンド核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ−２リガンド核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ−２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ−２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ−２リガンド核酸分子を含む。
【００２６】
ここで特定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るために間隙を導入し、如何なる同類置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、Ａｐｏ−２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成可能であり、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムを割り当てることを含み、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸同一性値は、ジェネンテック社によって作成され、ソースコードが米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, CAを通して公に入手可能である。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ-２プログラムにより設定され、変化しない。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２７】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ここにおける目的のための「生物学的に活性」又は「生物学的活性」は、（ａ）インビボ又はエキソビボで少なくとも一種類の哺乳動物細胞（好ましくは癌細胞）又はウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘導し又は刺激する能力を有すること；（ｂ）抗体を産生することが可能であること、すなわち免疫原性であること；（ｃ）ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、又はＯＰＧ等のＡｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬのレセプターへ結合し及び／又はこれを刺激することが可能あること；又は（ｄ）天然又は天然に生じるＡｐｏ−２Ｌポリペプチドの活性を保持することを意味する。
【００２８】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を典型的に伴う、哺乳動物における細胞死の規則的又はコントロールされた形態を指す。この活性は、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡ電気泳動法により決定し測定することができる。
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、多形神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞腫などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫等）、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルム腫瘍等の腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び神経芽細胞び頭部及び頸部の様々な癌が含まれる。
【００２９】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病理学的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症）、自己免疫性血小板減少症（溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、ＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
本明細書の「自己免疫疾患」という語は広義で使用され、一般的な意味で、自己の組織成分に対する個体の体液又は細胞の免疫反応から正常又は健康な組織の破壊が生じる、哺乳動物の障害、又は状態を指す。例として、これらに限定するものではないが、エリテマトーデス、甲状腺炎、リウマチ様関節炎、乾癬、多発性硬化症、自己免疫糖尿病、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が挙げられる。
【００３０】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤(parent drug)に比較して癌細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化されるか又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman,「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella et al.,「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt et al.（編）, pp.247-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、後述の化学療法剤が含まれる。
ここで用いられる「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、並びにそれらの断片及び／又は変異体を含むことを意図する。
【００３１】
「化学療法剤」は、癌のような状態の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；カンプトセシン(合成類似体トポテカン（topotecan）を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin）合成類似体を含む）；クリプトフィシン(cryptophycin）(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin ）；デュカロマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む）； エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin ）；サルコデイチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin ）；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カリミノマイシン(carminomycin）、カルチノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)のようなマイトマイシン(mitomycins）；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin )のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３２】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００３３】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αあるいはＴＧＦ−βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン−α、−β、及び−γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；ＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００３４】
ここで使用される「治療する」、「治療」、及び「療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
ここで使用される「哺乳類」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、犬及びネコを含む哺乳類と分類されるあらゆる動物に相当する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳類はヒトである。
【００３５】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ＴＮＦリガンドファミリーに関連した新規サイトカインで、ここにおいて「Ａｐｏ−２リガンド」又は「ＴＲＡＩＬ」と特定されたサイトカインが記載されている。ヒト天然Ａｐｏ−２リガンドの予測成熟アミノ酸配列は、２８１個のアミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算上の分子量を有する。シグナル配列が存在せず内在性疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ−２リガンドがＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示唆する。また、可溶性細胞外ドメインＡｐｏ−２リガンドポリペプチドが記載されている。例えば１９９７年７月１７日に公開のＷＯ９７／２５４２８を参照のこと。Ａｐｏ−２Ｌ置換変異体がさらに記載されている。アラニンスキャンニング技術が、生物学的活性を有する種々の置換変異体分子を同定するために利用されてきた。Ａｐｏ−２リガンドの特定の置換変異体は、少なくとも一つのアミノ酸がアラニン残基等の別のアミノ酸残基によって置換されているものを含む。これら置換変異体は、例えば「Ｄ２０３Ａ」、「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されている。この命名法は、位置２０３、２１８、及び／又は２６９（図１（配列番号１）に示した番号を使用）の残基がアラニン残基によって置換されているＡｐｏ−２リガンド変異体を同定するために利用されている。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、図９に示されているか、又は下記の表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩに記載されている置換の一又は複数を含んでもよい。場合によっては、このようなＡｐｏ−２Ｌ変異体はＤＲ４又はＤＲ５レセプター選択的変異体である。このようなＤＲ４又はＤＲ５レセプター選択的変異体は様々な用途、例えばＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターのいずれかのみを発現する癌細胞の治療、及びＤＲ４及びＤＲ５レセプターの標本の精製において、有用である。
Ａｐｏ−２リガンドの細胞外ドメインのＸ線結晶構造が本明細書に開示され、アラニンスキャンニング突然変異誘発が、そのレセプター接触領域のマッピングを提供するために実施されている。Ａｐｏ−２リガンドに対して得られた構造は、Ａｐｏ−２リガンド三量体分子の三つのサブユニットの相互作用を統合する新規な二価金属イオン（亜鉛）結合部位を含むホモ三量体タンパク質を明らかにする。
【００３６】
Ａｐｏ−２ＬのＸ線構造は、ＴＮＦ-αのモデルを利用する分子置換［Eck et al., J. Bio. Chem., 264: 17595-17605 (1989)］によって決定され、３．９オングストローム（１１４−２８１残基形態に対して）及び１．３オングストローム（Ｄ２１８Ａ変異体；９１−２８１形態に対して）まで精緻化される。ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、Ａｐｏ−２Ｌは、約５１００平方オングストローム（単量体当たり平方１７００オングストローム）を埋めて球状三量体を形成する、三つのゼリーロール単量体からなる緻密な三量体を含むと思われる（図４を参照のこと）。コアのβストランドの位置は、ＴＮＦファミリーの他の構造的に特徴付けられたメンバーのＴＮＦ-α［Eck et al., 上掲；Jones et al., Nature, 338:225-228(1989)］、ＴＮＦ-β［Eck et al., J. Biol. Chem., 267:2119-2122(1992)］、及びＣＤ４０Ｌ［Karpusas et al., Structure, 3:1031-1039(1995)］で、ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β のコアストランドと比較して０．８オングストロームのr.m.s.d.のものと比較して良好に保持されている。Ａｐｏ−２Ｌ三量体の境界面のどの残基も、現在知られている全てのヒトＴＮＦファミリーメンバーの配列において完全に保持されているものはないようである；しかしながら、これら残基の疎水化学的性質は保持されている。Ａｐｏ−２Ｌ三量体における保境界面の保持された残基は、塩基の近傍（三量体の最も広い部分）及び三回転軸に沿ってクラスターを形成する。Ｃｙｓ２３０の近傍のＡｐｏ−２Ｌ三量体境界面の頂点の近くでは、構造は分岐しているように思われ、１９０及び２３０のループのコンホメーションは各構造において変動する。
β骨格コアとは対照的に、レセプター結合表面及びループの構造は、ＴＮＦファミリーメンバーの中でかなり変化する。Ａｐｏ−２リガンドの構造とＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、及びＣＤ４０Ｌの構造の間の一つの違いは、ストランドＡ及びＡ’の間の接合である。ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、及びＣＤ４０Ｌでは、ストランドＡの後に、緻密なループが続いている。Ａｐｏ−２リガンドでは、１５残基の挿入がこのループを長くし、そのコンホメーションを変える。ループの最初の部分（残基１３１から１４１）は、ループの二番目の部分（残基１４２から１５４）がＣＤ４０Ｌに類似するコンホメーションをそのＣ末端部分に有して、分子の表面を一つの単量体-単量体境界面から次へと越える際に乱れる。
【００３７】
三量体化境界面の頂点の近くに、二価金属イオン（亜鉛）結合部位が埋もれている。ＴＮＦファミリーメンバーは、配列分析によって、Ｃｙｓ２３０に関して三つのグループに分けられる：（１）Ｃｙｓ２３０に対応する位置のシステイン残基に、金属イオンとの相互作用を妨げるジスルフィド結合を形成することが可能な隣接ループ（Ａｐｏ−２Ｌの１９４−２０３ループ）の中の他のシステインが伴っているＴＮＦ-α及びＦａｓリガンドのようなタンパク質、（２）Ｃｙｓ２３０に対応するシステインを持たないタンパク質（例えばＴＮＦ−β及びＯＰＧＬ）、及び（３）Ｃｙｓ２３０に対応するシステイン残基を一つのみ有するタンパク質である。Ａｐｏ−２Ｌ及び他の種におけるそのオルソログは、後者の基準に当てはまり（すなわち、Ｃｙｓ２３０のみを持つタンパク質）、三量体表面において二価金属イオンと結合することが期待される。Ａｐｏ−２ＬのＣｙｓ２３０の直ぐ前の主要鎖のコンホメーションは、ＴＮＦ-α及びＣＤ４０ＬのようなＴＨＦファミリーメンバーを含むジスルフィドとは異なる。Ａｐｏ−２Ｌでは、Ｃｙｓ２３０の側鎖は、境界面から遠ざかるのではなく、境界面に向かっている。
【００３８】
各Ａｐｏ−２Ｌ単量体のＣｙｓ２３０残基は内部を三量体軸へ向いて内方を指し、内部の溶媒分子と共に二価金属イオンを配位する。この二価金属イオン結合部位は、亜鉛結合部位にとって適切な結合及び角度を持つ僅かに歪んだ四面体幾何を示し、溶媒へは完全に接触不可能である。結合金属の同一性は、誘導結合プラズマ原子発光分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を利用して確認された。ＩＣＰ-ＡＥＳを利用したＣｄ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＣｕの定量分析では、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の一分子当たり０．７９モルのＺｎと０．０６モルのＣｏが検出され、構造中の結合イオンが、約１対１のモル比の亜鉛であることが示された。この部位の重要性は、Ｃｙｓ２３０のアラニン置換が８倍未満のアポトーシス活性の減少となったという観察によって立証された。更に、キレート試薬に対する透析によるＡｐｏ−２Ｌからの結合金属の除去により、ＤＲ５親和性の７倍の低下及びアポトーシス活性の９０倍未満の低下が生じた。Ｚｎの除去によって、システインは酸化されやすくなり、アポトーシス活性が低下したジスルフィド結合Ａｐｏ−２Ｌ二量体が形成された。金属結合部位はＡｐｏ−２Ｌ三量体構造に埋もれているように思われ、レセプターに接触するとは予想されないことから、データは、二価金属イオン結合が、Ａｐｏ−２Ｌの安定性と三量体構造を維持するのに重要であろうことを示唆している。
【００３９】
Ａｐｏ−２リガンドのレセプター結合部位をマッピングするために、レセプター結合及び生物学的活性にとって重要なアミノ酸残基がアラニンスキャンニング突然変異誘発法によって同定された［Cunningham et al., Science, 244:1081-1085(1989)］。残基Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、又はＴｙｒ２３７での一つのアラニン置換により、バイオアッセイのアポトーシス活性が５分の１未満に減少し、レセプターに対する親和性の減少が示された。ＤＲ４、ＤＲ５及びＤｃＲ２へのＡｐｏ−２Ｌの結合は、残基Ｇｌｎ２０５、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、又はＴｙｒ２３７でのアラニン置換によって最も影響を受け、これによって三つのレセプターすべてに対する親和性が５分の１以下に減少した。また、減少したアポトーシス活性を有するこれら変異体のすべては、ＤＲ４又はＤＲ５のどちらか（又は両方）に対して正常に機能しない結合を示したが、これはレセプター結合がアポトーシス活性に必要であることを示している。
残基Ａｓｐ２１８及びＡｓｐ２６９でのアラニン置換は、アポトーシス活性が増大したＡｐｏ−２Ｌ変異体を生じた。残基Ａｓｐ２１８は、Ｔｙｒ２１６に近くに位置し、アポトーシス活性にとっては必要な残基の一つである。低分解Ａｐｏ−２Ｌ構造（１１４−２８１形態）との比較により、２１６−２２０ループの高次構造がＤ２１８Ａ変異の存在によって有意に改変されたように思えないことが示された。
【００４０】
突然変異誘発分析の結果をＡｐｏ−２Ｌ三量体構造にマッピングした際、レセプター結合及び生物活性のためのＡｐｏ−２Ｌ上の機能的エピトープは、ＴＮＦ−ベータに類似し、二つの単量体の接合点によって形成された表面に位置することが発見された。単量体−単量体境界面の浅い溝は、結合部位へ寄与する両単量体を有するレセプター結合部位を形成する。また、ＴＮＦ−アルファの残基Ａｒｇ３２、Ｔｙｒ８７、及びＡｓｐ１４３（Ａｐｏ−２Ｌの残基Ａｒｇ１５８、Ｔｙｒ２１６、及びＡｓｐ２６７に対応する）ＴＮＦレセプター結合へ寄与する［Goh et al., Protein Engineering, 4:785-791(1991)］。対照的に、ＴＮＦ−アルファの残基（Ａｐｏ−２Ｌの残基Ｇｌｎ２０５、Ｇｌｕ２３６、及びＴｙｒ２３７に対応する）は、ＴＮＦＲ結合において比較的重要ではない役割を担う。従って、ＴＮＦ−アルファにとって、レセプター結合へは三量体構造の底部が最も重要な貢献をする一方で、Ａｐｏ−２Ｌでは、重要なレセプター結合残基は、同じく三量体構造の頂点に存在している。Ａｐｏ−２Ｌは、その標的レセプターとの相互作用のため接触表面がより大きく、拡張している点で、構造が知られているＴＮＦファミリーメンバーの中では独特であると思われる。随意的実施形態において、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６、及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基（すなわち、変異されていない）を含むと考えられている。
下記の説明は、核酸をコードするＡｐｏ−２リガンドを含むベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞の培養、及び細胞培養からポリペプチドを回収することによって、本明細書に開示するＡｐｏ−２リガンド変異体等のＡｐｏ−２リガンドを生産する方法に関する。
【００４１】
Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ−２リガンドｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得ることできる。従って、ヒトＡｐｏ−２リガンドＤＮＡは、国際公開９７／２５４２８に記載されているヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリーのような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることが可能である。また、Ａｐｏ−２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ−２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ−２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook et al., 上掲；Dieffenbach et al., PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００４２】
Ａｐｏ−２リガンドのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ−２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような断片又は変異体は、完全長Ａｐｏ−２リガンドについて図１（配列番号１）に示したアミノ酸配列の、又は細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠失を示す。最終構築物が例えばここに定義するように所望の生物活性、例えばアポトーシス活性を有する限り、挿入、置換及び／又は欠失の任意の組み合わせで最終構造物に到達することができる。場合によっては、実施例に開示するようなファージライブラリー選択法によりＡｐｏ−２リガンド変異体を同定できる。好ましい実施態様では、断片又は変異体は、Ａｐｏ−２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ−２リガンドの完全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、又は膜係留特性（膜アンカー特性）の改変のように、Ａｐｏ−２リガンドの翻訳後プロセスを改変し得る。
ここで記載されているＡｐｏ−２リガンド配列における変異は、米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して生じさせることができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を含む。
【００４３】
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、アラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunningham et al., Science, 244: 1081 (1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることによっても好ましい。さらに、アラニンは埋設及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：１(1976)］。
本発明の特定のＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図９又は下記の表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに与えられた一又は複数の列挙された置換を含むＡｐｏ−２Ｌポリペプチドを含む。このようなＡｐｏ−２Ｌ変異体は、典型的には、少なくとも一又は複数のアミノ酸が天然配列Ａｐｏ−２Ｌアミノ酸配列（例えば、図１（配列番号１）に提供のもの、Ａｐｏ−２Ｌの完全長又は成熟形態あるいはその細胞外ドメイン配列、例えば１１４−２８１アミノ酸形態）と異なる非天然に生じるアミノ酸配列を含む。場合によっては、天然Ａｐｏ−２Ｌと比較してＡｐｏ−２Ｌ変異体において異なる一又は複数のアミノ酸は、図９又は表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに示されたもののようなアミノ酸置換を含む。本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図１（配列番号１）の残基３９−２８１、４１−２８１、９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１、９６−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、図９又は表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに記載されている一又は複数のアミノ酸置換を有する可溶性Ａｐｏ−２Ｌ変異体を含む。好ましいＡｐｏ−２Ｌ変異体は、図１（配列番号１）の残基９１−２８１、９２−２８１、９５−２８１又は１１４−２８１を含んでなり、表ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩ又はＶＩＩＩに記載された一又は複数のアミノ酸置換を有し、これによりＤＲ４又はＤＲ５のレセプター結合又はレセプター選択性など生物活性が増強される。
【００４４】
また、本発明の範囲に含まれるＡｐｏ−２リガンド配列の変異体は、アミノ末端誘導体又は修飾形にも関連する。このようなＡｐｏ−２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン（例えばホルミルメチオニル又は他のブロックされたメチオニル種など）を有するここに記載した任意のＡｐｏ−２リガンドポリペプチドを含む。
天然又は変異体Ａｐｏ−２リガンドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。用いられるであろう任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終結配列は当該分野で知られており、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳しく記載されている。
【００４５】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ−２リガンド核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合したＡｐｏ−２リガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的なクラス及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例えば、栄養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ−２リガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ−２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ−２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
原核生物及び真核生物宿主に適したプロモーターは当該分野で知られており、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳しく記載されている。
【００４６】
大腸菌における可溶性Ａｐｏ−２Ｌの生産の好ましい方法には、生産物発現の制御のための誘発的プロモーターが用いられる。制御可能な誘発的なプロモーターの利用は、生産物発現の誘発、及び宿主によってよく耐えることのできないかなりの量の生産物の蓄積の前に、所望する細胞密度への培養成長を可能にする。
Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）の発現のために、三つの誘発的なプロモーター系（Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ））が出願人によって評価された。これら三つのプロモーターのそれぞれの利用は、収集細胞ペーストから回収されたかなりの量の可溶性で生物学的に活性なＡｐｏ−２Ｌ三量体を結果として生じた。しっかりとしたプロモーターコントロール、及び収集細胞ペーストにおいて到達したより高い細胞密度及び力価のために、試験されたこれら三つの誘発的なプロモーター系の中でＡＰプロモーターが好まれている。
【００４７】
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)を参照のこと］。
Ａｐｏ−２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrook et al., 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＡｐｏ−２リガンドであるＡｐｏ−２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的に特に有用である。
【００４８】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ−２リガンドの合成に適応化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第１１７０６０号；及び欧州特許第１１７０５８号に記載されている。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【００４９】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ−２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化Ａｐｏ−２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含むすべてのこのような宿主細胞の例は、さらに国際公開９７／２５４２８に記載されている。
宿主細胞を形質移入し、好ましくは上述のＡｐｏ−２リガンド産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【００５０】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際公開９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００５１】
Ａｐｏ−２リガンドを生産するために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookらにより記載されているような適切な培地で培養される。大腸菌の培養に用いることができる培養培地の特定の形態は、後述の実施例でさらに説明する。大腸菌の培養に用いられうる培養培地の特定の形態は、下記の実施例にさらに記載されている。Ａｐｏ−２リガンドを生産するための哺乳動物宿主細胞は、種々の培養培地において培養することができる。
市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「ＤＭＥＭ」、シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００５２】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
本発明の一側面では、宿主細胞の培養又は発酵のために、典型的には一又は複数の二価金属イオンが培養培地へ添加されるかあるいは含まれる。二価金属イオンは、好ましくは、貯蔵安定性を増すため、溶解性を増すため、又は一又は複数の亜鉛イオンによって調整される安定なＡｐｏ−２Ｌ三量体の形成を補助するために十分な濃度レベルで培養培地に存在するかあるいは添加される。添加されうる二価金属イオンの量は、一部は培養中の宿主細胞密度又はこのような二価金属イオンへの潜在的な宿主細胞感受性に依存する。培養におけるより高い細胞密度では、二価金属イオンの濃度を増すことは有益である。宿主細胞による生産物の発現中又は発現後に二価金属イオンが添加される場合は、宿主細胞による産物の発現が増加するのに応じて二価金属イオン濃度を調節又は増加させることが望ましい。典型的な普通に入手可能な細胞培養培地に存在しうる微量レベルの二価金属イオンは、安定な三量体形成には十分ではないと一般的に考えられている。したがって、本明細書に開示するように、更なる量の二価金属イオンの添加が好ましい。
【００５３】
培養中の宿主細胞の成長期の間に二価金属イオンが添加される場合は、二価金属イオンは、逆に又は負の方向に宿主細胞へ影響しない濃度で培養培地へ添加されるのが好ましい。振盪フラスコ培養では、１ｍＭより高い濃度でのＺｎＳＯ４の添加は、結果として低い宿主細胞密度を生じる可能性がある。当業者であれば、細菌細胞は、細胞マトリックスと金属イオン複合体を形成することで、効果的に金属イオンを隔離することが可能であることが分かる。従って、細胞培養では、成長期の後（所望する宿主細胞密度に達した後）又は宿主細胞による生産物発現の直前に、選択された二価金属イオンを添加することが好ましい。十分な量の二価金属イオンが存在していることを確かめるために、更なる二価金属イオンを、生産物発現期の間に細胞培養培地へ添加又は供給することができる。
培養培地の二価金属イオン濃度は、宿主細胞に対して有害又は毒性でありうる濃度を越えてはならない。宿主細胞として大腸菌を用いる本発明の方法では、培養培地の二価金属イオンの濃度が約１ｍＭ（好ましくは≦１ｍＭ）を越えないことが好ましい。さらにより好ましくは、培養培地の二価金属イオン濃度は、約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルである。最も好ましくは、このような方法で使用される二価金属イオンは硫酸亜鉛である。金属イオン及びＡｐｏ−２リガンド三量体が１対１モル比で存在することが可能である量の二価金属イオンを細胞培養へ添加することが望ましい。
【００５４】
二価金属イオンは、細胞培養へ如何なる許容可能な形態でも添加が可能である。例えは、金属イオンの溶液は水を使って調製することが可能であり、次に、二価金属イオン溶液は培養培地へ添加又は供給することが可能である。
Ａｐｏ−２Ｌの発現は、例えば、ここに記載された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、一般的なサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインシトゥハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いる方法もまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性核種、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位となる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、検定を実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定によって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等である。
【００５５】
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ−２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
Ａｐｏ−２リガンドは、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶菌液から回収してもよい。Ａｐｏ−２リガンドが膜結合性である場合は、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から引き離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
【００５６】
Ａｐｏ−２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、Ａｐｏ−２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、Ａｐｏ−２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ−２リガンドを精製することが通常必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ−２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
好ましい実施態様では、Ａｐｏ−２リガンドはアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ−２リガンド断片又は変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な性質変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ−２リガンドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とのＡｐｏ−２リガンド融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着させるために使用することができる。
【００５７】
例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ−２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ−２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
このような精製工程では、回収されたＡｐｏ−２Ｌを二価金属イオン含有溶液又は一又は複数の二価金属イオンを含有する精製物質（例えばクロマトグラフィー媒体又は支持体）へ曝露することが望ましいであろう。好ましい実施態様では、二価金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用される。場合によっては、ＤＴＴ又はＢＭＥのような二価金属イオン及び還元剤の両方を、Ａｐｏ−２Ｌの精製又は回収の間に使用してもよい。精製又は回収の間に二価金属イオンを使用することは、Ａｐｏ−２Ｌ三量体の安定性を提供するか、あるいは細胞培養段階の間に形成されるＡｐｏ−２Ｌ三量体を維持すると考えられる。
【００５８】
以下の記載はまた一又は複数の化学基に共有的に結合した（以下「抱合された(conjugated)」）Ａｐｏ−２リガンド変異体を製造する方法に関する。本発明のＡｐｏ−２Ｌ抱合体に使用するのに適した化学基は好ましくは有意に毒性又は免疫原性ではない。化学基は場合によっては保存することができ保存に適した条件下で使用できるＡｐｏ−２Ｌ変異体抱合体を製造するために選択される。ポリペプチドに抱合されうる様々な例示的化学基が当該分野で知られており、例えば糖タンパク質に天然に生じる炭水化物のような炭水化物、ポリグルタミン、及び非タンパク様ポリマー、例えばポリオールが含まれる（米国特許第６２４５９０１号を参照）。
例えばポリオールは、上掲の国際公開９３／００１０９に開示されているように、リジン残基を含む一又は複数のアミノ酸残基においてＡｐｏ−２Ｌ変異体のようなポリペプチドに抱合されうる。用いられるポリオールは任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーとでき、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには一又は複数のヒドロキシル位置で１から４の炭素を有するアルキル基のような化学基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）であり、よって記載を簡単にするために、以下の議論においては、用いるポリオールがＰＥＧである例示的な実施態様に関するものとし、ポリペプチドにポリオールを抱合させる方法を「ペグ化(pegylation)」と称する。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧに対してここに記載した抱合法を使用して用いることができることは理解できるであろう。
【００５９】
Ａｐｏ−２Ｌ変異体のペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は変動し得、典型的には約５００から約３００００ダルトン（Ｄ）の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１０００から約２５０００Ｄであり、より好ましくは約２０００から約５０００Ｄである。一実施態様では、ペグ化は約２０００Ｄの平均分子量を持つＰＥＧを用いて実施される。場合によっては、ＰＥＧホモポリマーは未置換であるが、一端にアルキル基が置換されていてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ調製物は商業的に入手可能であり、典型的には本発明において使用するのに適したＰＥＧ調製物は平均分子量に応じて販売されている非均一調製物である。例えば、市販のＰＥＧ(５０００)調製物は典型的には分子量が僅かに変動し、通常は±５００Ｄの分子を含む。
本発明のＡｐｏ−２リガンド変異体は単量体形態又は三量体形態（３つの単量体を含む）等、様々な形態でありうる。場合によっては、Ａｐｏ−２Ｌ変異体三量体は、ＰＥＧ分子が三量体Ａｐｏ−２Ｌ変異体を構成する３つの単量体の１つ、２つ、又は全てに結合又は抱合されるようにペグ化される。そのような実施態様では、用いられるＰＥＧは約２０００から約５０００Ｄの平均分子量を有するのが好ましい。また、Ａｐｏ−２Ｌ変異体三量体は「部分的に」ペグ化され得、つまり、三量体を構成する三の単量体の一又は二だけがＰＥＧに結合又は抱合される。そのような「部分的に」ペグ化されたＡｐｏ−２Ｌ変異体では、場合によっては、用いられるＰＥＧが約５０００Ｄ又は５０００Ｄを超える平均分子量を有する。
【００６０】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が当該分野で知られている。ＰＥＧに抱合したタンパク質を製造するための特定の方法には、米国特許第４１７９３３７号、米国特許第４９３５４６５号及び米国特許第５８４９５３５号に記載された方法が含まれる。典型的には、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量等々に応じて、ポリマーの末端反応性基にタンパク質のアミノ酸残基の一又は複数を介して共有的に結合される。反応性基を有するポリマーはここでは活性化ポリマーと命名する。反応性基はタンパク質の遊離のアミノ又は他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは無作為な形又は部位特異的な形の何れかの形でタンパク質上のアミノ又は他の反応性基に結合しうる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応性基のタイプと量、並びに用いられるポリマーのタイプは、反応性基がタンパク質上の余りに多くの特に活性な基と反応することを避けるために用いられる特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存するものと理解される。これは完全に避けることができないであろうため、タンパク質１モル当たり一般に約０．１から１０００モル、好ましくは２から２００モルの活性化ポリマーを、タンパク質濃度に応じて用いることが推奨される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持し、同時に可能ならばタンパク質の循環半減期を最適化するためのバランス量である。
残基はタンパク質の任意の反応性アミノ酸、例えばＮ末端アミノ酸基であってもよいが、好ましくは反応性アミノ酸はシステインであり、これは、例えば国際公開９９／０３８８７、国際公開９４／１２２１９、国際公開９４／２２４６６、米国特許第５２０６３４４号、米国特許第５１６６３２２号、及び米国特許第５２０６３４４号に示されているように、その遊離のチオール基を介して活性化ポリマーの反応性基に結合している。あるいは、反応性基はリジンであり、これは、活性化ポリマーの反応性基にその遊離のイプシロン-アミノ基を介して結合しており、あるいはグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、これはアミド結合を介してポリマーに結合している。ついで、この反応性基は例えばタンパク質のα及びεアミンと反応して共有結合を形成する。簡便には、ＰＥＧ分子の他端はメトキシ基のような非反応性基で「ブロック」されて、タンパク質分子のＰＥＧ架橋複合体の形成を低減させることができる。
【００６１】
好適な活性化ＰＥＧは多くの一般的な反応によって生成させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ-ＮＨＳ-ＰＥＧ）は、Buckmann and Merr, Makromol. Chem., 182:1379-1384 (1981)の方法に従って、ＰＥＧ-モノメチルエーテル（ユニオンカーバイド社から市販されている）から、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）との反応によって調製することができる。また、ＰＥＧ末端ヒドロキシ基は、例えば臭化チオニルと反応させてＰＥＧ-Ｂｒを生成した後、過剰のアンモニアでアミノ分解してＰＥＧ-ＮＨ２を形成することによって、アミノ基に転換できる。ついで、ＰＥＧ-ＮＨ２は標準的なカップリング試薬、例えばウッドワード試薬Ｋを使用して対象のタンパク質に抱合される。更に、ＰＥＧ末端-ＣＨ２ＯＨ基は、例えばＭｎＯ２での酸化によってアルデヒド基に転換できる。アルデヒド基は水素化シアノホウ素のような試薬を用いる還元性アルキル化によってタンパク質に抱合される。あるいは、本発明における使用に適した活性化ＰＥＧは多数の製造元から購入することができる。例えば、Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, Ala.)は、メトキシ-ＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩及びメトキシ-ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸塩に加えて、分子量２０００のメトキシ-ＰＥＧ-マレイミドを販売している。
本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体のペグ化の度合いを調節して、対応する非ペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体と比較してインビボ半減期（以下、「半減期」）を望ましく増加させることができる。ペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体の半減期は典型的にはペグ化の度合いが増加するのに応じて徐々に増加する。タンパク質のペグ化の度合いと部位は、例えば（１）ペグ化部位の数と反応性（例えば第一級アミン）及び（２）ペグ化反応条件によって、決まる。タンパク質におけるペグ化部位のいくつかは相対的に非反応性である可能性が高いので、標準的なペグ化反応では典型的には完全なペグ化にはならない。
【００６２】
標準的な突然変異誘発法を用いてタンパク質中の潜在的なペグ化部位の数を変えることができる。よって、アミノ酸置換がシステインやリジンのようなアミノ酸を導入又は置換する程度まで、本発明のＡｐｏ−２Ｌ変異体は（図１に示された）天然配列Ａｐｏ−２Ｌよりもより多い又は少ない数の潜在的ペグ化部位を含むことができる。ペグ化の度合いと部位はまた反応条件、例えば活性化ＰＥＧ及びタンパク質の相対濃度並びにｐＨを調節することによって操作することができる。所望の度合いのＰＥＧ化に対する好適な条件は、標準的なペグ化反応のパラメータを変えることによって経験的に決定することができる。
Ａｐｏ−２Ｌ変異体のペグ化は任意の簡便な方法によって実施される。例示的な実施態様では、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０のＣｙｓ１７０側鎖（つまり、図１のアミノ酸１１４−２８１を持ち、位置１７０の天然アルギニン残基がシステイン残基に置換された変異体Ａｐｏ−２Ｌ）は、分子量２０００Ｄのメトキシ-ＰＥＧ-マレイミド（Shearwater Polymers）との反応によって共有結合的に修飾される。簡便には、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０は、最初に約３０分間、周囲温度で１０ｍＭのＤＴＴを用いて還元し、ついでＰＤ-１０ゲル濾過カラムに通して、平衡にし、ＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で溶出させて還元剤を除去することによって、修飾の準備がなされる。ついで、一定量のＰＥＧ-マレイミド溶液（ｄＨ２０中１０ＭＭ）を直ぐに添加する。完全な反応を確実なものにするために必要な時間と試薬濃度の条件は経験的に決定することができる。０．５から５倍の範囲のＲ１７０ＣＡｐｏ−２Ｌ．０単量体に対するＰＥＧ-マレイミドのモル濃度比と２又は２４時間の反応時間を使用することができる。反応は、あらゆる未ペグ化Ｃｙｓ１７０チオールがカルボキシアミドメチル化されるように、Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０単量体濃度に対して１０倍のモルの過剰のヨードアセトアミドを添加することによって停止される。ヨードアセトアミドでの修飾は約３０分であり、その後、過剰な試薬は、平衡化されＰＢＳで溶出されるＮＡＰ-５カラム（Pharmacia）でのゲル濾過によって除去される。
【００６３】
ペグ化タンパク質はＳＤＳ-ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、ペプチドマッピング、液体クロマトグラフィー-質量分析法、及びインビトロ生物学的アッセイによって特徴付けすることができる。ペグ化の度合いは典型的にはＳＤＳ-ＰＡＧＥによって最初に示される。１０％のＳＤＳ中でのポリアクリルアミドゲル電気泳動は、典型的には溶出バッファーとして１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中で実施される。どの残基がペグ化されているかを証明するために、トリプシン及びＬｙｓ-Ｃプロテアーゼのようなプロテアーゼ類を使用するペプチドマッピングを実施することができる。しかして、ペグ化及び非ペグ化Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の試料を、Ｌｙｓ-Ｃプロテアーゼのようなプロテアーゼで消化させ、得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣのような方法で分離することができる。生成されたペプチドのクロマトグラフィーパターンを、Ａｐｏ−２Ｌ．０ポリペプチドに対して過去に決定したペプチドマップと比較することができる。ついで、各ピークをピーク中のフラグメントのサイズを証明するために質量分析によって分析することができる。ＰＥＧ基を有するフラグメントは、通常、注入後にはＨＰＬＣカラムに保持されておらず、クロマトグラフから消失している。クロマトグラフからのそのような消失は、少なくとも一のペグ化可能なアミノ酸残基を含んでいるに違いない特定のフラグメントに対するペグ化を示している。ペグ化Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、Ａｐｏ−２Ｌレセプターと相互作用し、及び／又は哺乳動物においてアポトーシスを誘導する能力について、及び／又は他の生物学的活性について、当該分野で知られている方法を使用して、更にアッセイすることができる。
さらに、本明細書に開示するＡｐｏ２Ｌ変異体を、当該分野で知られている技術を用いてロイシンジッパー配列に結合させる又は融合させることも考慮する。
【００６４】
また、Ａｐｏ−２リガンド変異体及び１又は複数の二価の金属イオンを含有する製剤が、本発明により提供される。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適している（及びＡｐｏ−２Ｌ三量体の維持）。好ましい製剤は、Ａｐｏ−２Ｌ及び亜鉛又はコバルトを含む。より好ましくは、この製剤は金属がタンパク質に対して＜２Ｘモル比であるＡｐｏ−２Ｌ変異体及び亜鉛又はコバルト溶液を含む。水溶性懸濁液が所望されるならば、製剤中の二価金属イオンはタンパク質に対して＞２Ｘモル比であってもよい。硫酸亜鉛を用いて、当出願人はＡｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１形態）沈殿物を発見し、製剤中の硫酸亜鉛の濃度が約１００ｍＭの水溶懸濁液を作った。当業者であれば、＞２Ｘモル比では、金属が製剤にとって有害になりうるか又は治療用製剤として望ましくない製剤中の二価金属イオン濃度の上限範囲がありうることが分かるであろう。
製剤は、既知の技術で調製することが可能である。例えば、Ａｐｏ−２Ｌ製剤はゲル濾過カラム上でのバッファー交換によって調製することが可能である。
【００６５】
典型的には、適量の製薬的に許容可能な塩が、製剤を等浸透圧にするために製剤において使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、さらに好ましくは約７〜約７．５である。好ましくは、亜鉛がＡｐｏ−２Ｌへ結合したままであることを確かなものにするためにｐＨは選択される。ｐＨが高すぎる又は低すぎるならば、亜鉛はＡｐｏ−２Ｌへ結合したままではなく、結果としてＡｐｏ−２Ｌの二量体が形成される傾向となる。例えばＡｐｏ−２リガンド及び二価金属イオンの濃度及び投与経路よっては、ある種の担体がより好ましくなることは、当業者には明らかである。
Ａｐｏ−２Ｌの治療用製剤は、凍結乾燥製剤、水溶液又は水性分散液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, １６版, A. Osol, A.編 (1980)）と、適切な純度を有する所望のＡｐｏ−２Ｌ分子を混合することにより調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００６６】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質である。局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。
インビボ投与に使用されるＡｐｏ−２Ｌは滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。Ａｐｏ−２Ｌは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、Ａｐｏ−２Ｌは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。Ａｐｏ−２Ｌの液体製剤の例は、皮下注射用の１回投与バイアルに充填された無菌の、透明な、無色の保存料未添加(unpreserved)溶液である。
【００６７】
治療的Ａｐｏ−２Ｌ変異体製剤は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される（肺内送達については、例えば欧州特許第２５７９５６号参照）。
また、Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、徐放性調製物の形態で投与することが可能である。徐放性調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、欧州特許第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン-酢酸ビニル（Langer et al., 上掲）、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が含まれる。
【００６８】
ここに記載されたＡｐｏ−２Ｌ変異体及びその製剤は、種々の治療的及び非治療的応用へ用いられる。これら応用は、種々の癌及びウイルス性症状の治療の方法である。このような治療的及び非治療的応用は、例えば、国際公開９７／２５４２８及び国際公開９７／０１６３３に記載されている。
ここに記載のＡｐｏ２Ｌ変異体は種々の病理状態、例えば免疫関連疾患又は癌を治療するのに有用である。ここに記載した様々な病理状態の哺乳動物における診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検出を可能にする診断技術は、当該分野で利用可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診（法）、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等々を含む技術を通して同定され得る。また、免疫関連疾患は容易に同定できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体、及び引き続き起こる免疫媒介炎症の産生である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受ける。リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成を伴い、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合対称的パターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾腫大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【００６９】
Ａｐｏ−２Ｌ変異体は、周知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入の経路により投与できる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプでの注入によって実施することもできる。
Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単独又は複数の用量が使用されうる。単独に使用されるＡｐｏ２Ｌ変異体の効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti et al., Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
【００７０】
Ａｐｏ２Ｌ変異体のインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４６５７７６０号、第５２０６３４４号、又は第５２２５２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないＡｐｏ２Ｌ変異体の用量が、例えば、Ａｐｏ２Ｌ変異体を受入れる哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療法に依存して変わりうることは理解できるであろう。
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。そのような他の治療法を、Ａｐｏ２Ｌ変異体とは別の薬剤として、並びにＡｐｏ２Ｌ変異体分子自体に結合させるか接合させて使用できることも考慮する。更に、治療法は、リツキサン(Rituxan)ＴＭ又はハーセプチン(Herceptin)ＴＭなどの腫瘍抗原を標的とする治療的抗体並びに抗ＶＥＧＦなどの抗血管形成抗体、又はＤＲ５又はＤＲ４のようなＡｐｏ２Ｌレセプターを標的とする抗体に基づく。
【００７１】
化学治療剤に対する調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定される。そのような化学療法に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service, M.C.Perry編, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。また、化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与に先行し、又はその後に行い、又はそれらと共に与えられてもよい。
また、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又は他のＴＮＦＲファミリーメンバー（例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、Ａｐｏ−３、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＢＲ３）に結合する抗体などの他の抗原に対する抗体を投与することも好ましい。他の方法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、ここにおけるＡｐｏ２Ｌ変異体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて当該発明のＡｐｏ２Ｌ変異体を投与する。
【００７２】
Ａｐｏ２Ｌ変異体（及び一又は複数の他の治療剤）は同時的又は経時的に投与される。Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与の後、インビトロにおいて処理された細胞を分析することができる。インビボでの治療がなされた場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、壊死をアッセイするために腫瘍細胞を病理検査することができ、又は血清の免疫系応答を分析することができる。
ここに記載した疾患の診断又は治療に有用なＡｐｏ−２Ｌ変異体を含むキットのような製造品は、少なくとも容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効なＡｐｏ−２Ｌ変異体製剤を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。容器上又は添付されるラベルには、製剤が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第２の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含め、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第２又は第３の容器を具備してもよい。
【００７３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書において引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【００７４】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【００７５】
実施例１
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬファージディスプレイライブラリーの設計と生産
ファージディスプレイライブラリーに含めるため、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ・ＤＲ−５ＥＣＤ複合体について決定されたＸ線構造の検査に基づいてＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの残基を選択した（例えば、Hymowitz et al., (1999) Molecular Cell 4, 563-571参照）。加えて、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのアラニン−スキャンにより得られた情報（例えば、Hymowitz et al., (2000) Biochemistry 38, 633-640参照）を使用してライブラリー設計の際の指針とした。例えば、アラニン置換により試験した全Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター（例えばＧｌｎ２０５）に対する結合の親和性が（５分の１未満まで）大きく減少した部位はライブラリーに選択しなかった。アラニンで置換したとき中程度の変化（５倍未満）しか示さなかった部位は、変異した際にレセプター選択性が増大しやすかった。この種の部位の一例はＧｌｎ１９３であり、この場合アラニン置換によるＤＲ４への親和性減少が１．７倍になるが、ＤＲ５及びＤｃＲ２に対する結合には影響が無い（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 38, 633-640参照）。レセプター親和性のさらなる変化は、Ｇｌｎ１９３をアラニン以外の残基で置換することにより得られる。この理論を使用して、部位１８９、１９１、１９３、１９９、２０１及び２０９をランダム化して有する（ＤＲ４ライブラリー）か、又は部位１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７及び２６９をランダム化して有する（ＤＲ５ライブラリー）２つのＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬライブラリーを設計した。図７Ａに示すように、これらの残基はＸ線結晶構造に観察される「パッチＡ」接触内部又は近傍にある（例えばHymowitz et al., (1999) Molecular Cell 4, 563-571）。これらライブラリーは特定の部位に「ＮＮＳ」コドンを含み、よって全２０のアミノ酸及び１つだけの終止コドンがこれらの位置に可能であった。
【００７６】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの発現のために設計されたファージミドベクター（図１；配列番号１の残基９６−２８１）をＭ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質への融合物として以下のように構成した。ＮｓｉＩ部位（５’オリゴ）及びＢａｍＨＩ部位（３’オリゴ）を生成するオリゴヌクレオチドを使用して、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの９６−２８１部分をコードするＤＮＡをテンプレートプラスミドｐＡＰＯＫ５からのＰＣＲにより増幅した（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640）。ＮｓｉＩ及びＢａｍＨＩによる切断の後、この断片をＮｓｉＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＴＦＡＡ−ｇ３に連結させた（例えばLee, G.F. and Kelley, R.F. (1998)J. Biol. Chem 273, 4149-4154参照）。制限消化分析により、適切な挿入についてプラスミドクローンをスクリーニングし、ジデオキシヌクレオチド配列決定によりポジティブなクローンを確認した。結果として得られたプラスミド（ｐＡＰＯＫ４）は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの９６−２８１のＮ末端に融合した断片ｓｔＩＩ細菌シグナル配列を有する断片をコードする。配列Ｇ・Ｓ・Ａを有するトリペプチドリンカーをＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのＣ末端に付加した後、インフレームのアンバー終止コドン及びＭ１３バクテリオファージの遺伝子３生成物を付加した。アルカリフォスファターゼプロモーターを直接発現に使用した。アンバー終止コドンの抑制能を有する大腸菌株（supE遺伝子型）中において、ｓｔＩＩ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−遺伝子３からなる融合タンパク質を周辺質に分泌させた。アンバー終止コドンの抑制は１００％有効ではないので、遊離ｓｔＩＩ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのいくらかも同様に分泌される。周辺質において、ｓｔＩＩシグナルペプチドは大腸菌シグナルペプチダーゼによって除去されると推定される。ヘルパーファージとの同時感染により組立タンパク質を供給すると、表面上にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−遺伝子３を有するファージ粒子が産出される。表面に現れたタンパク質の正確な組成は不明であるが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）−遺伝子３の１分子が遊離Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（９６−２８１）の２分子を有する三量体に集合したものと思われる。遺伝子８に対して遺伝子３を使用してＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを示していることから、これは、各ファージ粒子が１−５を超えるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ分子のコピーを示さない「一価の表示」に相当する（例えばLowman, H.B. and Wells, J.A. (1993) J. Mol. Biol. 234, 564-578を参照）。
【００７７】
ｐＡＰＯＫ４ベクターの最初の試験により、正しく構築されたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（表１）のファージ上の表出が小さいことが示された。固定ＤＲ５−ＩｇＧを用いたファージＥＬＩＳＡは、特定の結合シグナルを１週間だけ示した。精製したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにより結合は抑制されなかったが、代わりに外来性リガンドによりファージＥＬＩＳＡで測定したシグナルが増大し、これはファージ上の不完全な三量体構築と呼応するものであった。加えて、ＤＲ５−ＩｇＧに対するファージの保存による濃縮はごく小さく、限定的なものであった。通常の３７℃でなく、３０℃で成長させてファージを産出させた場合、特定の結合が増大した。ｐＡＰＯＫ４を使用した場合の表出が小さいと仮定し、様々なプロモーターを用いた構築を表出の増大について試験した。ｐＡＰＯＫ４中のアルカリフォスファターゼプロモーターをｔａｃプロモーターで置換することにより、ＰＡＰＯＫ４．２を構築した。これは、ｐＡＰＯＫ４中でＡＰプロモーターを有するＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩ制限断片を、プラスミドｐＷ１２０５ａ由来のｔａｃプロモーターを有するＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩ断片（例えばSidhu et al., (2000) Methods n Enzymology 328, 333-363を参照）で置換することにより行われた。ファージＥＬＩＳＡ及び濃縮両方によるｐＡＰＯＫ４．２ベクターからの発現の分析の結果、ｐＡＰＯＫ４よりも良好なＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのファージディスプレイが認められた（表１）。最適な表出は、１μＭのＩＰＴＧを加えることによりｔａｃプロモーターを誘導した３０℃でのファージ産出において得られた。
【００７８】
Sidhu等によって開示されたように（Sidhu et al., (2000) Methods Enzymology 328, 333-363参照）ライブラリーを構築した。ＤＲ５ライブラリーでは、「ＴＡＡ」終止コドンをｐＡＰＯＫ４．２の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、及び２６９に導入した。Ｋｕｎｋｅｌのプロトコル（例えばKunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 488-492）を適合させて用い、この「終止」テンプレートをオリゴヌクレオチド指向突然変異のテンプレートとして使用した。突然変異反応には２つのオリゴヌクレオチドを使用した。まずライブラリー位置１８９、１９１、及び１９３において「ＮＮＳ」コドンがコード化され、第２に部位２６４、２６６、２６７、２６９においてＮＮＳコドンが産出された。終止テンプレートの使用により、変異しなかったテンプレートＤＮＡがＫｕｎｋｅｌ選択後も残存し、機能的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬを産出しないことが確実となる。ＤＲ４ライブラリーでは、ＴＡＡ終止を位置１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、２０９に導入した。過去の実験（データは示さない）で、ファージ上のＡｐｏ２Ｌの表出が向上し、且つＤＲ５に対する親和性の低減が示されていたため、変異Ｙ２１３Ｗ：Ｓ２１５Ｄも終止テンプレートに導入した。部位１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、２０９でＮＮＳコドンをコードするオリゴヌクレオチドを使用してこの終止テンプレートの突然変異を誘発した。ＳＳ−３２０大腸菌内へ電気穿孔すると、ＤＲ５ライブラリーは２．５×１０８独立クローンの力価を生じさせた。ライブラリー由来の１０個のクローンの配列決定を行ったところ、両部位において７／１０が変異していることが示され、実際のライブラリーサイズが１．７５×１０８クローンであることが示された。ＤＲ４ライブラリーは５×１０９クローンの力価を生じさせ、配列決定により５／１０が変異したことが示され、よって実際のライブラリーサイズが２．５×１０９であることが示された。ＳＳ−３２０細胞はアンバー抑制因子を有さないので、ＸＬ−１大腸菌を使用して選別のためのファージ粒子を生成した。ライブラリーを用いて電気穿孔されたＳＳ−３２０を、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンと１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬのＶＣＳ（Stratagene, Inc.）ヘルパーファージを含む５００ｍＬの２ＹＴ培地中で成長させた。２００ＲＰＭで動作する回転式振盪培養機上に置いた４Ｌのバッフルフラスコ中で３７℃で一晩成長させた後、遠心分離により細胞を除去し、２０％のＰＥＧ ２．５Ｍ ＮａＣｌの１／５容量を添加することで上清からファージを沈殿させた。遠心分離によりファージを回収し、初期対数期のＸＬ−１大腸菌の培養液５００ｍｌを感染させるために使用した。３７℃での成長を１時間継続し、ＶＣＳヘルパーファージを１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬに添加し、回転式振盪培養機（２００ＲＰＭ）上に置いた４Ｌのバッフルフラスコ中で培養液を３０℃で一晩成長させた。上述のようにしてファージを回収し、４ｍＬのＰＢＳ中に再度懸濁した。このファージストックを親和性に基づく選別に使用した。上述のようにしてＸＬ−１の感染により選別の各回の間にファージを増幅させた。但し、使用する培養液の容量を５００から５０ｍＬに減少させた。
【００７９】
実施例２
レセプター選択性によるファージライブラリーの選別
マイクロタイタプレート（Nunc-Maxisorp）のウェルに吸収させたレセプター−ＩｇＧ融合タンパク質を用いてレセプター結合によるファージ選別を行った。レセプター−ＩｇＧタンパク質をコーティング緩衝液中（５０ｍＬの炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６）で２−１０μｇ／ｍＬに希釈し、この溶液１００μＬを９６ウェルプレートの複数のウェルに加えた。第１回目の選別では、９６ウェル全てを使用し、続く回では使用するウェルの数を減らした。周囲温度で２時間に亘って穏やかに振盪しながらコーティング緩衝液をマイクロタイタプレート上でインキュベートした。その後コーティング緩衝液を除去し、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び５％の粉末状スキムミルク（ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳ２００μＬを用いてウェルをブロックした。ブロッキングは室温で１時間行い、ついでウェルをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液）ですすいだ。
Ａｐｏ−２Ｌ／ＴＲＡＩＬライブラリーファージ溶液をブロッキング緩衝液中で１０倍に希釈し、次いでこの溶液１００μＬをレセプター−ＩｇＧでコーティングしたプレートのウェルに添加した。加えて、先にタンパク質コーティングを行うことなくブロッキング緩衝液でウェルをブロックすることにより準備した空のプレートの等しい数のウェルに希釈したファージを添加した。プレート上において、回転式振盪培養機（Bellco）で穏やかに振盪しながら、周囲温度で２時間溶液をインキュベートした。ファージ溶液を捨て、噴出瓶から洗浄緩衝液をウェルに注ぎ、その後洗浄液を捨てることを繰り返す（６回）ことによりウェルをすすいだ。１０ｍMのＨｃｌ１００μＬを添加することによりウェルから結合したファージを溶出した。２０分間振盪しながらインキュベートした後、溶出液をピペットで取って除去し、２ＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅ ｐＨ１１の１／２０容量を添加することによりｐＨを中性にした。レセプタープレートの溶出液の半分を使用してＸＬ−１大腸菌を感染させ、よって次回の選別ためファージ（５０ｍＬの培養液）を伝播させた。レセプタープレートと空のプレートから得た溶出液の一部を使用して、大腸菌とのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測ることによりファージ濃度を推定した。簡単に説明すると、ファージ溶液の一連の１０倍希釈液を対数期ＸＬ−１を用いて３７℃で３０分間インキュベートし、次いで５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むＬＢ寒天板上に細胞を筋状に出した。一晩３７℃でインキュベートした後、カルベニシリン耐性コロニーの数を目視による検査により決定した。親ファージミド（ｐＡＰＯＫ４．２）がアンピシリン耐性遺伝子を有しているので、コロニーの数はファージ濃度に比例する。レセプター結合による選択の質の向上は、空のプレートから溶出したものに対するレセプタープレートから溶出したファージの比から計算される。
【００８０】
ウェルにコーティングしたＤＲ４−ＩｇＧ（構成を以下の実施例３に示す）に対し、２回にわたってＤＲ４ライブラリーを選別し、その後競合するＤＲ５−ＩｇＧ（構成を以下の実施例３に示す）の存在下でＤＲ４結合について３回選別した。第３、４、及び５回目の選別の際、それぞれ５０、２５０、及び７５０ｎＭのＤＲ５−ＩｇＧを用いて３０分間ファージをインキュベートした後、これら溶液をＤＲ４−ＩｇＧでコーティングしたプレートに添加した。ＤＲ５ライブラリーについては、ファージをＤＲ５−ＩｇＧでコーティングしたウェルに対して４回にわたって選別し、その後ＤＲ４−ＩｇＧを競合に使用して４回選別を行った。第５、６、７、及び８回目には、ファージをそれぞれ１、１０、１００、及び５００ｎＭのＤＲ４−ＩｇＧでインキュベートし、その後ＤＲ５−ＩｇＧ結合について選択を行った。図８Ｃに示すように、ＤＲ４ライブラリーとＤＲ５ライブラリーの両方においてレセプター結合に特定の品質向上が見られた。選別が完了したら、選択されたライブラリーから得た個々のクローンを「点ＥＬＩＳＡ」により特定の結合についてスクリーニングした。ＸＬ−１大腸菌をファージプールで感染させることにより個々のクローンを得た後、ＬＢ／カルベニシリン寒天板に細胞を筋状に出した。単一のコロニーを選び、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンと１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬのＶＣＳヘルパーファージを含む５ｍＬのＬＢ培養液をインキュベートするのに使用した。３０℃で一晩成長させた後、培養液上清のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降によりファージを回収した。点ＥＬＩＳＡにおいて、ファージコロニーを結合緩衝液で１０倍に希釈し、マイクロタイタプレートにコーティングした様々なタンパク質への結合について試験した。M１３バクテリオファージのコーティングタンパク質に対するＨＲＰ結合抗体（Pharmacia）を用いて結合したファージを検出した。DR4ライブラリークローンについて、試験タンパク質はＤＲ４−ＩｇＧ、ＤＲ５−ＩｇＧ、ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ、及びＢＳＡであった。ＥＬＩＳＡによりＤＲ４−ＩｇＧだけに反応し、それ以外のタンパク質には反応しなかったクローンだけをさらなる分析に使用した。ＤＲ５ライブラリークローンの試験タンパク質はＤＲ５−ＩｇＧとハーセプチン(Herceptin)（登録商標）（Genentech, Inc., South San Francisco, CA）であった。ＤＲ５−ＩｇＧ結合に対してポジティブで、ハーセプチン(Herceptin)（登録商標）に対してはそうでないクローンをさらなる研究のために選択した。
【００８１】
実施例３
レセプター選択性クローンの特徴付け
実施例２に記載されている２つのライブラリーの各々から得たレセプター選択性クローンをさらなる分析のために選択した。Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍ１３キット（Qiagen）を用いて一本鎖ＤＮＡをファージ粒子から単離し、染料ターミネーターサイクルキット（Beckman-Coulter）を用いたジデオキシヌクレオチド配列決定を行った。ｔａｃプロモーターの一部に相補的なプライマー（mal-fl: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCACACAGGAAACAGCCAG-3' 配列番号１３）を使用して配列決定反応を初回抗原刺激した。ＣＥＱ２０００ＸＬキャピラリーシークエンサー（Beckman-Coulter）で配列決定反応を分析することによりＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのコード化領域の配列全体を決定することができた。ライブラリー位置のＤＮＡ配列から推論したアミノ酸同一性を表ＩＩ（ＤＲ４選択性）及び表ＩＩＩ（ＤＲ５選択性）に示す。ライブラリー位置の外部において偽配列変更は検出されなかった。
ＤＲ４ライブラリーのクローン４つに対する相対的結合強度を競合ファージＥＬＩＳＡにより決定した（図１５及び１６）。このアッセイでは、溶液中のレセプター−ＩｇＧの濃度を次第に増加させながら、レセプター−ＩｇＧでコーティングしたウェルに固定濃度のファージを添加した。インキュベーションにより結合させ、結合しなかったファージを洗浄した後、ＨＲＰ結合、抗Ｍ１３抗体（Pharmacia）により結合ファージを測定した。４パラメータ適合を使用した溶液中のレセプター−ＩｇＧ濃度により変化するＥＬＩＳＡシグナルの分析により、ＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０値はファージ濃度によって変化するので、まずファージクローンをタイターすることにより、４つのクローンのシグナル強度が等しくなるような希釈を決定した。４つのクローンの全てにおいて、ファージ上に表出した野生型（天然配列）Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬについて測定されたものと類似か、それよりも少し小さいＩＣ５０値がＤＲ−４結合に対して得られた（図１５）。対照的に、可溶性ＤＲ５−ＩｇＧによる競合の不足により示されたように、クローンのいずれもがＤＲ５−ＩｇＧに結合しないように見受けられた（図１６）。
【００８２】
ＤＲ５ライブラリーの代表的な配列のいくつかをｐＡＰＯＫ５．０にサブクローンしてさらなる試験に使用した。サブクローニングは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬコード化セグメントの５’及び３’末端に相補的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたファージクローン上でのＰＣＲ反応により行われた。ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩによる制限消化の後、ＰＣＲ断片をＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＡＰＯＫ５．０に結合させて、野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ配列を変異ＤＮＡで置換した。ジデオキシヌクレオチド配列決定により配列を確認した。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）突然変異体（変異体）を発現させて精製し、前述したように、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）及びＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞上の生理活性により精製したタンパク質をレセプター結合についてアッセイした（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640）。簡単に説明すると、Ａｐｏ２Ｌ変異体の結合のレセプターイムノアドヘシン固定化の解離定数（Ｋｄ）（表ＩＩ及びＩＩＩを参照）をＰａｒｍａｃｉａ ＢＩＡｃｏｒｅ３０００で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定値から決定した。それぞれ１９９８年１１月１９日公開の国際公開９８／５１７９３及び１９９９年３月９日公開の国際公開９９／１０４８４に開示されているようにして、ＤＲ５−ＩｇＧ（Ａｐｏ−２−ＩｇＧとも呼ぶ）とＤｃＲ２−ＩｇＧレセプターイムノアドヘシンを調製した。ＤＲ４−ＩｇＧを以下のように調製した。成熟ＤＲ４ ＥＣＤ配列（アミノ酸１−２１８；Pan等, 上掲）を、Ｆｌａｇシグナル配列の下流でｐＣＭＶ−１ Ｆｌａｇベクター（Kodak）にクローニングし、前述[Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]のようにして、ヒトイムノグロブリンＧ１重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域及びＦｃ領域に融合させた。Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)に開示されているようにして、イムノアドヘシンをヒト２９３細胞への一過性形質移入により発現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより細胞の上清から精製した。アミン結合化学（Pharmacia Biosensor）を使用して、レセプターイムノアドヘシンタンパク質を３００−５００共鳴ユニットのレベルでセンサーチップの表面に結合した。２倍に増大した際の１５．６ｎＭから５００ｎＭの濃度におけるＡｐｏ−２Ｌ結合についてｓｅｎｓｏｒｇｒａｍを記録した。非線形回帰分析により動力学的定数を決定し、結合定数を計算した。
【００８３】
アラマーブルーアッセイを使用してインビトロでのＡｐｏ−２Ｌ変異体のアポトーシス活性を特徴付けた。ＳＫ−ＭＥＳ細胞はＤＲ４とＤＲ５の両方を発現し、野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘導に対して感受性であった。簡単に説明すると、蛍光染料の代謝転換から細胞の生存度を測定するバイオアッセイを使用してＡｐｏ−２Ｌ変異体のアポトーシス活性を決定した。Ａｐｏ−２Ｌ（１１４−２８１）又はＡｐｏ−２Ｌ変異体（例えば表ＩＩ及び表ＩＩＩ参照）の連続する２倍の希釈物を、０．１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco）中に作成し、各希釈物５０μLを９６ウェルファルコン組織培養マイクロプレートの個々のウェルに移した。５０μＭのＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺癌細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ５８）（ＲＭＰＩ−１６４０中、０．１％ＢＳＡ）を２×１０４細胞／ウェルの濃度で添加した。これら混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。２０時間目に、２５μＬのアラマーブルー（AccuMed, Inc., Westlake, Ohio）を添加した。５３０ｎｍで励起後５９０ｎｍにおける相対的蛍光度を測定することにより細胞数を決定した。４パラメータ適合を用いてこれらのデータを分析し、ＥＤ５０を計算し、細胞生存度を５０％に低下させるＡｐｏ−２Ｌの濃度を求めた。
表ＩＶにまとめたように、ＤＲ５選択的変異体は通常ＤＲ４に対する親和性を低下させ、ＤＲ５に対する親和性を野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）と同程度にするか、又はそれよりやや減少させる。驚くべきことに、ＤＲ５選択的変異体（表ＩＩＩに同定されたＤＲ５−２１及びＤＲ５−２３）のうち、ＤＲ４に対する親和性が１０分の１、及び１００分の１まで低下した２つの変異体は、それぞれインビトロでのＳＫ−ＭＥＳ細胞のアポトーシス誘導に対する活性が大きかった。
【００８４】
実施例４
ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の生成及び試験
ＤＲ４が非架橋及び架橋リガンドに応答できるのに対し、ＤＲ５が架橋Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬにしか応答しないことが言われている（例えばMuhlenbeck et al., (2000) J. Biol. Chem. 275, 32208-32213）。ここに開示するレセプター選択的変異体のシグナル伝達及び活性特性を調べるため、一部の変異体にエピトープでタグをつけたものを調製し、アッセイした。Ｍ２抗ｆｌａｇ抗体（Sigma-Aldrich Chemical Co.）との架橋を可能にするＮ末端のｆｌａｇタグにより突然変異体を生成した。
ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の大腸菌発現のために設計されたプラスミドは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）をｐＦＬＡＧ−ＭＡＣ（Sigma）に導入したプラスミド（pFLAG-Apo2L; Genentech）のオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発により作成した。ＰＦＬＡＧ−Ａｐｏ２Ｌは、Ｎ末端にｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）の細胞質発現をｔａｃプロモーターの制御下に方向付ける。突然変異誘発のテンプレートは、Kunkelのプロトコル（例えばKunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 488-492参照）を用いて生成したプラスミドの一本鎖型であった。ジデオキシヌクレオチド配列決定により突然変異体を同定した。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の発現のため、突然変異によるプラスミドを大腸菌株４３Ｅ７に形質転換した。形質転換した大腸菌を、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含む２ＹＴ培地５００ｍＬ中で３７℃で初期対数期まで成長させ、ＩＰＴＧ添加により発現を誘発し、最終濃度を０．４ｍＭとした。タグをつけていないタンパク質について前述したように（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640）、但し酸性ペプチドｆｌａｇはタンパク質のＰＩ低下を招くので陽イオン交換カラムのｐＨを下げ、ｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を精製した。
【００８５】
ｆｌａｇでタグをつけたタンパク質の生成に、ＤＲ４選択的変異体クローン番号８及び９、並びにＤＲ５選択的変異体クローン番号１、２、８、２１、及び２３を選択した。表Ｖに示すように、まずＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によりＤＲ４とＤＲ５結合について、及び抗ｆｌａｇ架橋した場合としない場合のＳＫ−ＭＥＳ上のアポトーシス誘発について、精製したｆｌａｇタグＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体を試験した。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８及び９のＤＲ５に対する親和性は１０００分の１に低下する一方で、ＤＲ４への結合に対しては高い親和性を維持していた。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８のＤＲ４に対する親和性は５倍に増大し、一方Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−９の親和性は４分の１に低下した。いずれのＤＲ４選択性タンパク質もＳＫ−ＭＥＳ細胞におけるアポトーシス誘発の活性を大きく低下させた。抗ｆｌａｇ架橋した場合の活性の増大も、野生型Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌに見られたものよりずっと小さいものであった。抗ｆｌａｇ架橋によってＦｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８の活性は増大せず、野生型タンパク質について３０倍の活性増大が観察されたのに比較して、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−９の活性増大は６倍に過ぎなかった。
【００８６】
ＤＲ５選択的変異体全てのＤＲ４に対する親和性は低下し、その一方でＤＲ５への結合には高い親和性を維持していた。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−１、２、及び２１の場合、ＤＲ５への結合に対しては２分１以下の低下しか示さなかったのに対し、ＤＲ４に対する親和性は１１分の１まで低下した。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−２３のＤＲ４に対する親和性は１００分の１に低下したが、ＤＲ５への結合の低下は２．４分の１程度であった。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８にはＤＲ４への結合が全く見られなかったが、この変異体のＤＲ５への結合は野生型タンパク質と等しいか、それよりも大きかった。ＤＲ４選択的変異体に見られた結果と対照的に、ＤＲ５選択性タンパク質の全てはＳＫ−ＭＥＳ上のアポトーシス誘発について高い活性を保持していた。実際、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−１、２、及び８は、野生型と比較して、アポトーシス誘発に活性増大（ＥＤ５０低下）を示した。抗ｆｌａｇ抗体と架橋すると、ＤＲ５選択的変異体の全てについて、架橋野生型Ａｐｏ２Ｌに観察された値（ＥＤ５０）に活性が増大した。これらの結果は、ＳＫ−ＭＥＳ上でのアポトーシスシグナル伝達においてＤＲ５結合のほうがＤＲ４結合より重要であることを示している。完全に理解されているわけではないが、ＤＲ４に対する親和性が低下した変異体の一部の方がアポトーシス誘発に高い影響力を持つので、ＤＲ４は弱いシグナル伝達を行うことができ、ＤＲ５により生成されるシグナルを弱め得ると考えられている。
【００８７】
実施例５
Ｃｏｌｏ２０５及びヒト白血病Ｔ細胞株に対するＦｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体の活性
さらに、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８及びＦｌａｇ−Ａｐｏ２ｌ．ＤＲ５−８のアポトーシス誘発活性を、Ｃｏｌｏ２０５大腸癌細胞及びヒト白血病Ｔ細胞株を用いて調べた。Ｃｏｌｏ２０５細胞はＤＲ４とＤＲ５の両方を発現し、ＳＫ−ＭＥＳよりも野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘発に対して影響を受けやすい。ＦｕｒｋａｔＴ細胞はＤＲ５しか発現しないと思われた。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬよりもＤＲ５選択的変異体に対して感受性であった（図１７Ａ）。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８の抗ｆｌａｇ架橋により、Ｃｏｌｏ２０５における活性にさらなる有意な増大は起こらなかった。対照的に、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８に対するＣｏｌｏ２０５の感受性は低かった（図１７Ｂ）。この変異体の抗ｆｌａｇ架橋により、活性が少し増大した。ヒト白血病Ｔ細胞株は、リガンド架橋に関係なく、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８に感受性でなかった（図１８Ｂ）。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８は架橋無しでヒト白血病Ｔ細胞株にアポトーシスを誘発した。抗ｆｌａｇ架橋は架橋野生型Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌで測定されたレベルまで活性を増大させた。
【００８８】
実施例６
ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（登録商標）アッセイによるレセプター結合
さらに、ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（登録商標）を使用して、５つの既知のＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター（ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＰＯＧ、ＤＲ４、ＤＲ５）に対するＡｐｏ−２Ｌ変異体の結合を調べた。このアッセイは、「ドナー」と「アクセプター」ビーズを近づけることにより一重項酸素媒介、蛍光共鳴エネルギー伝達を促進すると、シグナルを生成する。この場合、ドナービーズはストレプトアビジンで被覆されており、ビオチン化したＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの捕獲に使用される。レセプターに対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの結合により、ビーズが近づき、シグナルが伝達される。結合のＩＣ５０値は、ビオチン化リガンドを非ビオチン化リガンドで置換することにより決定することができる。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの各々について置換曲線を生成し、表ＶＩに示した相対的ＩＣ５０値を決定するために使用した。ＤＲ４及びＤＲ５結合に関して、ＩＣ５０値の変化はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）により測定した傾向と一致していた。アッセイしたＡｐｏ−２Ｌ変異体のＯＰＧに対する結合は大幅に縮小していた。ＤＲ４選択的変異体はＤｃＲ１に対する親和性を示し、ＤｃＲ２についてはそれよりもやや小さい親和性を示した。ＤＲ５選択的変異体の全てはＤｃＲ１に対する親和性の大きな低下を示したが、Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８を例外に、ＤｃＲ１よりもＤｃＲ２に対する結合能を保持していた。Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−８はＤｃｒ１、ＤｃＲ２、ＯＰＧ、及びＤＲ４に対する親和性の大きな低下を示したが、ＤＲ５には比較的高い親和性で結合した。
【００８９】
実施例７
正常カニクイザル肝細胞へのＡｐｏ−２Ｌ変異体の作用
インビトロでリガンドに曝した後の肝細胞生存度を測定することにより、レセプター選択的変異体２つ（Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ４−８及びＦｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ．ＤＲ５−２３）の正常細胞に対する影響を調べた。通常肝細胞は、リガンドが凝集していない限りＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対して感受性でない（例えば、Lawrence et al., (2001) Nature Medicine 7, 383-385参照）。アッセイのため、カニクイザル由来の肝細胞を使用してクリスタルバイオレット染色により生存度を測定した。抗ｆｌａｇ架橋後のＤＲ４選択性及びＤＲ５選択的変異体の肝細胞に対する毒性は、架橋野生型リガンドよりも小さかった（図１９）。
【００９０】
実施例８
Ａｐｏ２Ｌシステイン置換変異体の生産
Ａｐｏ-２Ｌのシステイン置換変異体は、プラスミドｐＡＰＯＫ５．０の一本鎖型でのオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Methods in Enzymology, 154: 367-382 (1987)）によって構築した。このプラスミドは、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターにより推進されるＡｐｏ２Ｌの１１４−２８１アミノ酸型の細胞内大腸菌発現のために設計した。ｐＡＰＯＫ５．０はＡｐｏ-２Ｌの残基９１−１１３（図１）をコードしているＤＮＡセグメントの欠失突然変異誘発によってｐＡＰＯＫ５（１９９９年７月２２日公開の国際公開９９／３６５３５）から構築した。ｐＡＰＯＫ５は、ｔｒｐプロモーターを持つプラスミドｐＳ１１６２へＡｐｏ-２Ｌ ｃＤＮＡ（図１の残基９１−２８１をコードする）をクローニングするためのＰＣＲを利用して構築した。突然変異誘発後に、プラスミドの同一性をプラスミドのＡｐｏ２Ｌの全体部分のジデオキシヌクレオチド配列決定（Sanger）によって確認した。
ついで、システイン置換タンパク質をコードするプラスミドを、発現のための大腸菌株２９４に形質転換した。培養物をＬｕｒｉａブロス＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリン中で３７℃にて飽和するまで一晩成長させた。続いて、飽和した培養物を５０倍希釈してＮａ２ＨＰＯ４（６ｇ／Ｌ）、ＫＨ２ＰＯ４（３ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）、ＮＨ４Ｃｌ（１ｇ／Ｌ）、グルコース（４．９ｇ／Ｌ）、カザミノ酸（４．９ｇ／Ｌ）、２７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．００３％チアミンＨＣｌ及び適量の蒸留水＋カルベニシリン４０μｇ／ｍＬからなる滅菌濾過培地中に蒔いた。Ａ５００が０．５−０．８になるまで培養物を３７℃にて成長させた後、２５μｇ／ｍＬの最終濃度になるまで３-α-インドールアクリル酸（ＩＡＡ）（Sigma, St.Louis, MO）を添加して発現を誘導した。振盪しながら細胞を３０℃で一晩成長させ、遠心分離して収集し、後述のようにその後Ａｐｏ２Ｌを回収するために−２０℃で凍結保存した。
【００９１】
モデルＭ１１０-Ｆマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corporation, Newton, MA）を使用して、凍結した大腸菌細胞ペレットから、１０容量（ｗｔ／ｖｏｌ）の１００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０／２００ｍＭのＮａＣｌ／５ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ中での均質化によってＡｐｏ-２Ｌタンパク質を抽出した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を０．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度までホモジネートに添加して、これをついで遠心分離して細胞片を除去した。固形の硫酸アンモニウムを撹拌しながら周囲温度にて４５％の飽和度の最終濃度になるまで抽出上清に加え、遠心分離によってペレットを回収した。硫酸アンモニウムペレットを５０％の硫酸アンモニウム溶液で洗浄して残留ＥＤＴＡを除去した後、５０容積（ｗｔ／ｖｏｌ）の５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／０．１％トリトンＸ-１００中に再懸濁させた。得られた溶液を遠心分離によって透明にし、５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレーティングセファロースカラム（Pharmacia, Piscataway, NJ）を使用して固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。カラムに、１００ｍＭのＮｉＳＯ４／３００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中のニッケルを充填し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。充填後、カラムを、ＰＢＳ中３５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、ＰＢＳ中５０ｍＭのイミダゾール／３５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。ＩＭＡＣ溶出液を２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５に対して透析し、遠心分離によって透明にし、更に、平衡化し２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５で洗浄した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ ＳＰセファロースカラム（Pharmacia）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。ＨｉＴｒａｐ ＳＰカラムを２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／０．５ＭのＮａＣｌで溶出させた。ＳＰカラム溶出液を２ｍＭのＤＴＴで還元し、続いて周囲温度で４５％の飽和度の最終濃度になるまで撹拌しながら固形の硫酸アンモニウムを加えることによって沈殿させた。硫酸アンモニウムペレットを３．５ｍＬの２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌ中に再懸濁させ、ＰＤ１０カラム（Pharmacia）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５／１００ｍＭのＮａＣｌ／２ｍＭのＤＴＴの最終バッファー中に交換した。精製したＡｐｏ-２Ｌシステイン置換タンパク質を、クーマシー染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び質量分析によって特徴付けし、−２０℃で凍結して保存した。
【００９２】
実施例９
Ｃｙｓ残基でのＡｐｏ-２Ｌのペグ化
システイン置換Ａｐｏ２Ｌタンパク質を、メトキシ−ＰＥＧ−マレイミド、分子量２０００、５０００又は２００００Ｄ（Shearwater Polymers）との、或いはヨードアセトアミド（IAM）との反応により共有結合的に修飾した。ＰＤ-１０ゲル濾過カラムを通過させて保存バッファー中に含まれるＤＴＴを最初に除去して、Ａｐｏ２Ｌ変異体のペグ化の準備をした。カラムを平衡化し、ＨＩＣバッファー（０．４５ＭのＮａ２ＳＯ４、２５ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ ７．５）又はアルギニン製剤バッファー（０．５Ｍのコハク酸アルギニン、２０ｍＭトリス-ＨＣｌ ｐＨ ７．５）で溶出させた。一定量のＰＥＧ−マレイミド溶液（ｄＨ２Ｏ中１０ｍＭ）を直ぐに添加した。１：１、２：１、５：１又は１０：１のシステイン変異体−Ａｐｏ２Ｌ．０単量体に対するＰＥＧ−マレイミドのモル濃度比及び２から２４時間の反応時間を使用した。反応を、２ｍＭになるまでＤＴＴを添加することにより終結させ、周囲温度で３０分インキュベーションした後、ヨードアセトアミドを１０ｍＭになるまで添加した。この反応停止手順によって、反応中に生じたあらゆるジスルフィド結合を減少させ、あらゆる未ペグ化Ｃｙｓをカルボキシアミドメチル化させた。ヨードアセトアミドでの修飾は３０分間で、その後、過剰な試薬を、平衡化されＰＢＳで溶出されるＮＡＰ-５カラム（Pharmacia）でのゲル濾過によって除去した。これらの試料をＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＳＥＣ-ＭＡＬＳによって分析した。またＳＫ-ＭＥＳ細胞に対するアポトーシス誘導活性を本明細書に記載のようにアッセイした。
【００９３】
実施例１０
部分的にペグ化されたＡｐｏ２Ｌシステイン変異体の調製
ペグ化されたＡｐｏ２Ｌシステイン変異体のクリアランスが遅いにも関わらず、システイン残基に起こり得るジスルフィド二量体形成が回避されるという特性を有するＡＰＯ２Ｌ三量体を生産することを目的にペグ化の実験を行い、その際、ｃｙｓをＡｐｏ２Ｌ単量体に導入した後３ＰＥＧ分子を三量体に添加するのではなく１−２のＰＥＧ分子を三量体に添加して、残った３番目のｃｙｓをカルボキシメチルヨードアセトアミド（ＩＡＭ）でブロックし、よって三量体の形成を防いだ。
各三量体につき１−２個の共有結合的に添加されたＰＥＧ鎖を有するＡＰＯ−２Ｌの三量体形式は、有意な生理活性特性及びジスルフィド二量体を形成する傾向の低下など、最適な特徴を同時に多数示すと考えられる。
【００９４】
５Ｋ又は２０ＫのＰＥＧ−マイレミドを用いてＲ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの部分的ペグ化を以下のように行った。コハク酸アルギニン製剤バッファーで平衡化したＰＤ-１０（Amersham Biotec）ゲル濾過カラムを通過させてＤＴＴを最初に除去し、修飾のためのＡｐｏ２Ｌ変異体のペグ化の準備をした。直ぐに２８０ｎｍでの吸光測定によりタンパク質濃度を決定した後、ＰＥＧ−マイレミド（５０００又は２００００分子量；Shearwater, Inc.）をまず０．７ＰＥＧ：１．０Ａｐｏ２Ｌ単量体の比で添加した。ＰＥＧ−マイレミドは、水中で新しく調製した保存液１０ｍＭであった。反応溶液を周囲温度で一晩インキュベートした。ペグ化反応を、２ｍＭになるまでＤＴＴを添加することにより終結させ、この溶液を室温で１時間インキュベーションした後、ヨードアセトアミドを１０ｍＭになるまで添加した。さらに一晩インキュベートすることにより、ＰＢＳで溶出したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Amersham Biotech）ゲル濾過カラム上でペグ化タンパク質を分画した。２８０ｎｍでの吸光によりタンパク質溶出をモニターし、修飾されていないＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬよりも先に溶出する分画を含むタンパク質を収集してプールした。この手順は５Ｋ又は２０ＫのＰＥＧ−マイレミドを用いてＲ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを部分的にペグ化するのに使用された。オンライン光分散（ＳＥＣ-ＭＡＬＳ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによってこれらの調製物を分析したところ（図１４）、各三量体につき１又は２のＰＥＧ鎖を有する三量体を主に含む混合物から構成されることが示された。調製物の両方が含んでいる、各三量体につき１又は３のＰＥＧ鎖を有する三量体の量は、いずれも少なかった。図１０Ｇに示すように、これら混合物のＳＫ−ＭＥＳ細胞上のアポトーシス誘発の活性レベルは高かった。５Ｋｐ−Ｒ１７０Ｃ．０及び２０Ｋｐ−Ｒ１７０Ｃ．０のマウスにおける半減期はＡｐｏ２Ｌ．０よりも長く（図１１Ａ、Ｂ）、修飾されていない野生型Ａｐｏ２Ｌよりも異種移植モデルにおける腫瘍の容積を大きく減少させた（図１２Ａ、Ｂ）。
【００９５】
実施例１１
天然及びペグ化システイン変異体のアポトーシス活性
蛍光染料の代謝転換から細胞生存度を測定するバイオアッセイを使用して天然及びペグ化Ａｐｏ２Ｌシステイン変異体のアポトーシス活性を決定した（例えばHymowitz et al., (2000) Biochemistry 39, 633-640参照）。簡単に説明すると、０．１％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Gibco）中でＡｐｏ−２Ｌ．０又はＡｐｏ２Ｌ変異体の連続する２倍希釈物を作成し、各希釈物５０μＬを９６ウェルＦａｌｃｏｎ組織培養マイクロプレートの個々のウェルに移した。ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト肺癌細胞（ATCC HTB58）（ＲＭＰＩ−１６４０中、０．１％ＢＳＡ）を２×１０４細胞／ウェルの濃度で添加した。これらの混合物を３７℃で２４時間インキュベートした。２０時間目に、２５μＬのアラマーブルー（AccuMed, Inc., Westlake, Ohio）を添加した。５３０ｎｍで励起した後、５９０ｎｍにおける相対的蛍光度を決定した。４パラメータ適合を用いてこれらのデータを分析し、ＥＤ５０、即ち細胞生存度を５０％減少させるＡｐｏ２Ｌ．０の濃度を計算した。
これらアッセイの結果を図９に示す。
【００９６】
実施例１２
ＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０の薬物動態学
Ａｐｏ２Ｌのクリアランスに対するペグ化の効果をマウスで試験した。時間ゼロにおいてマウスにＡｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＰＥＧ-Ｒ１７９Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。２４時間後に血漿試料を収集した。Ａｐｏ２Ｌ濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。 図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、Ａｐｏ２Ｌ．０は循環から迅速に排除されるのに対して、ＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０とＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌはそれよりもゆっくりと排除された。よって、Ａｐｏ２Ｌ変異体に対するＰＥＧの部位特異的付着により、クリアランス速度が有意に減少した。
【００９７】
実施例１３
マウス異種移植モデルにおけるヒトＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対するＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０及びＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの効果
胸腺欠損ヌードマウス（Jackson Laboratories）に５ｘ１０６のＣＯＬＯ２０５ヒト大腸癌細胞（ＮＣＩ）を皮下注射した。腫瘍を生じさせ、ノギスでの測定で約５００−１５００ｍｍ３の体積になるまで成長させた。マウスにビヒクル（２×／週）、Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２ｘ／週）、ＰＥＧ−Ｒ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）、又はＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０（１０ｍｇ／ｋｇ、２×／週）を腹腔内注射した。腫瘍体積を三日毎に測定し、二週間後に治療を停止した。図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−Ｒ１７０Ｃ-Ａｐｏ２Ｌ．０又はＰＥＧ又はＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ．０での処置は、Ａｐｏ２Ｌ．０の等価な投薬量よりも腫瘍体積を大きく減少させた。よって、Ｃｙｓ１７０又はＣｙｓ１７９でのＡｐｏ２Ｌのペグ化は、このヒト癌異種移植モデルにおいて効果を達成するのに必要な投薬量を低減させる。
【００９８】
実施例１４
ＤＲ５レセプター選択的変異体の置換の選択
ファージディスプレイ法を使用して、変異Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ．ＤＲ５−８に見られる置換のＤＲ５選択性決定における役割を決定した。「復帰細胞ライブラリー」を構築し、１８９、１９１、１９３、２６４、２６６及び２６７における残基を、野生型残基又はＤＲ５−８アミノ酸として変化させた。以下のコドンを使用した：１８９−ＹＡＳ、Ｔｙｒコード化、アンバー、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ；１９１−ＡＲＲ、Ａｒｇ及びＬｙｓコード化；１９３−ＣＲＡ、Ｇｌｎ又はＡｒｇコード化；２６４−ＣＲＣ、Ｈｉｓ及びＡｒｇコード化；２６６−ＭＴＴ、Ｉｌｅ及びＬｅｕコード化；２６７−ＳＡＳ、Ｈｉｓ、Ｇｌｉｎ、Ａｓｐ、及びＧｌｕコード化。このライブラリーの多様性は、５１２のヌクレオチド配列によって記述される１９２のアミノ酸配列であった。Kunkelの突然変異誘発を使用して実施例１に開示したようにこのライブラリーを構築したが、但しＸＬ−１大腸菌を電気穿孔法に使用した。このライブラリーは２．５×１０１０クローンの力価を与えるもので、配列決定により５／１２が正しく突然変異していることが示され、よってライブラリーの実際のサイズは１×１０１０であった。上述のようにしてファージを生成し、回収した。
マイクロタイタプレートにコーティングしたＤＲ５−ＩｇＧに対して復帰細胞ライブラリーを１回選別した後、競合するＤＲ４−ＩｇＧの存在下でＤＲ５結合について３回選別した。２、３、及び４回の選別について、それぞれ１００ｎＭ、１μＭ、及び４μＭのＤＲ４−ＩｇＧを用いて３０分間ファージをインキュベートし、その後これらの溶液をＤＲ−ＩｇＧでコーティングしたプレートに添加した。第３回目の選別により、１０００倍を超える濃縮が得られた。点ＥＬＩＺＡにより、第２回目の選別の後、２２／２４のクローンがＤＲ５結合に対してポジティブであり、７／２４がＤＲ４に結合できることが示された。第３回目の後、２４／２４のクローンがＤＲ５に結合し、１／２４だけがＤＲ４に結合した。これら４８個のファージクローンから単離した一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を上述のようにして決定した。ＤＲ５に対してポジティブであるがＤＲ４に対してはポジティブでないライブラリー位置のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸同一性を表ＶＩＩに示す。これらの結果により、位置２６４と２６７における残基同一性は、これらの位置にＤＲ５−８アミノ酸が存在しないことからＤＲ５選択性に重要でないことが示された。対照的に、ＤＲ５−８アミノ酸は位置１８９、１９１、１９３及び２６６において優勢であり、これはこれらの部位がＤＲ５選択性に重要であることが示された。位置１８９において、Ｇｌｎコドンにより、又はアンバー終止コドンの抑制により発現されるＧｌｎに対し、優先度が強いことが示された。
【００９９】
ファージ選択に見られる優先度に基づき、２つの変異体をｐＡＰＯＫ５．０にサブクローニングし、さらに試験した。ＤＲ５−８Ｂは、Ｙ１８９Ｑ、Ｒ１９１ｋ及びＱ１９３Ｒにより野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとは異なり、ＤＲ５−８Ｃは加えてＩ２６６Ｌの置換を有する。これらの変異体を発現させて精製し、上述したように、精製したタンパク質をＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）によりレセプター結合について、及びＳＫ−ＭＥＳ肺癌細胞上の生理活性についてアッセイした（例えばHymowitz等, (2000) Biochemistry 39, 633-640）。表ＶＩＩＩに示すように、ＤＲ５−８ＢとＤＲ５−８Ｃの両方において、ＤＲ４に対する親和性が低下し、一方ＤＲ５に対する親和性がやや増大した。変異体ＤＲ５−８Ｃは、ＥＤ５０値に反映されているように、アポトーシス誘発について活性を有し、それは野生型タンパク質に観察されるものと同等か、やや良好であった。ＤＲ５−８Ｂのアポトーシス誘発活性は３分の１に低下した。比較すると、ＤＲ５−８において、ＤＲ４に対する親和性が大きく低下しており、一方野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと同等のアポトーシス誘発活性を維持していた。この実験において、ＤＲ４に対するＤＲ５−８の親和性はＫｄ値を測定するには弱すぎた。これらの結果により、アミノ酸置換Ｈ２６４Ｒ及びＤ２６７ＱによりＤＲ４結合に対してさらなる選択が行われることが示された。
【０１００】
実施例１５
マウス異種移植モデルにおけるＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの抗腫瘍活性に対するＰＥＧ鎖長の効果
上述のようにして、マウス異種移植モデルにおいて抗ＣＯＬＯ２０５腫瘍活性に対するＰＥＧ鎖長の効果を調べた。これらの実験では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）のＫ１７９Ｃ変異体を試験した。結果として各三量体につき３つのＰＥＧ鎖（各単量体につき１つ）が付加される条件下（上記実施例９に記載）において、分子量１０００、２０００、又は５０００のメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドのモル比２：１でＫ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを反応させた。ＣＭ−セファロースのカラム上での陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ調製物から非ペグ化タンパク質のトレースレベル、及び加えて過剰非反応ＰＥＧ−マレイミドを除去した。２０００−ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃの分析的ゲル濾過（図２０）により、三量体への３−２０００分子量のＰＥＧ鎖の付加と一致する光分散データから計算されたモル質量を有する均質なペグ化三量体タンパク質が示された。ペグ化−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ調製物の各々をＳＫ−ＭＥＳ細胞でのアポトーシス活性についてアッセイした。Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌのペグ化により、このアッセイではＰＥＧ差の長さに応じてＥＤ５０が増大した。Ａｐｏ２Ｌ．０と比較した場合、１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２ＬのＥＤ５０は４．３倍に増大し、２０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２ＬのＥＤ５０は８．７倍に増大し、また５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ０−Ａｐｏ２ＬのＥＤ５０の増大は２３．２倍で活性が最も弱かった。
【０１０１】
ＰＥＧ鎖長に対するクリアランスの依存をマウスで試験した。上述のように薬物動態試験を行い、但しその際ＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌ又はＡｐｏ２Ｌ．０の注射を静脈注射により行った。注射した容量は、Ａｐｏ２Ｌ．０を５又は３０ｍｇ／ｋｇ、１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを３０ｍｇ／ｋｇ、及び２０００と５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌを５ｍｇ／ｋｇであった。対照としての５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０と、２０００及び５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌについて、血漿試料を注射の１分、２時間、６時間及び２４時間後に回収した。１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌと３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０だけは、１分後及び２４時間後の試料を採取した。Ａｐｏ２Ｌの濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、図２１に示すような薬物動態曲線を導き出した。データは、ペグ化によりＡｐｏ２Ｌのクリアランスが減少し、半減期がＰＥＧの鎖長とともに増大することを示している。２４時間後には、用量５ｍｇ／ｋｇで、２つのペグ化種の血漿濃度がインビトロのバイオアッセイで測定されたＥＤ５０を超えており、Ａｐｏ２Ｌ．０は検出不可能なレベルに低下した。
【０１０２】
マウス異種移植モデルにおいて１０００、２０００、及び５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２ＬのＣＯＬＯ２０５腫瘍の成長に対する効果を試験した。これらの実験では、静脈内投与（３０ｍｇ／ｋｇ）を１回行った。ペグ化タンパク質に対する効果を、３０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０を１回静脈内投与した場合の効果、並びに６０ｍｇ／ｋｇのＡｐｏ２Ｌ．０の腹腔内投与を５×／ｗｋで１週間行う「標準的」処置と比較した。腫瘍体積を２週間測定した。図２２に示すように、２０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌは、同量のＡｐｏ２Ｌ．０と同様に腫瘍の成長を抑制したのに対し、５０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌによる腫瘍成長の抑制効果はそれよりも小さかった。１０００分試料のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌによる腫瘍成長の抑制効果は、同量のＡｐｏ２Ｌ．０よりも大きかった。有意な点は、この活性が、１０倍のＡｐｏ２Ｌ．０を投与する標準的な治療の活性に匹敵するものであったことである。１０００分子量のＰＥＧ−Ｋ１７９Ｃ−Ａｐｏ２Ｌの半減期の増大と、生理活性が良好に保持されるという組合せにより、分子の効果が向上した。
【０１０３】
表
表Ｉ 特異的ＤＲ５−ＩｇＧ−結合の濃縮により決定されたファージ上の機能的Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのファージディスプレイ
結合してＤＲ５−ＩｇＧウェルから溶出したファージの、空のウェルに観察されたものに対する比から濃縮を計算した。２つの野生型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬファージミド構築物を２種類の成長温度で試験した。
【０１０４】
表ＩＩ ＤＲ４−選択性ファージクローンのＤＮＡ配列から推定したライブラリー位置におけるアミノ酸配列
「Ｘ」は、満足な配列決定データが無いために残基同一性が決定できない位置を示す。本開示において、例えば「ＤＲ４−８」は、表中に同定されたＤＲ４選択的変異体クローン番号８を指す。「ＷＴ」は野生型を意味する。
【０１０５】
表ＩＩＩ ＤＲ５−選択性ファージクローンのＤＮＡ配列から推定したライブラリー位置におけるアミノ酸配列
【０１０６】
表ＩＶ ＤＲ５−選択性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ突然変異体タンパク質のレセプター結合及びアポトーシス誘発活性
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの１１４−２８１作成物においてＤＲ５選択性突然変異体を生成し、精製し、ＳＫ−ＭＥＳ上のアポトーシス誘発、及びＢＩＡｃｏｒｅによるレセプター結合についてアッセイした。野生型に対する突然変異体の比を示す。
【０１０７】
表Ｖ ＤＲ４選択性及びＤＲ５選択性Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体のレセプター結合及びアポトーシス誘発（ｆｌａｇでタグをつけたもの）
ＢＩＡｃｏｒｅ分析によりＫＤ値を決定し、野生型タンパク質について計算された値に対する比で示す。アポトーシス誘発は、２μｇ／ｍＬのＭ２抗体（Sigma）がある場合と無い場合について、ＥＤ５０値（ｎｇ／ｍＬ）から評価した。
【０１０８】
表ＶＩ ＣＡＲＢ−ＡＱああ正により決定されたｆｌａｇでタグをつけたＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体のレセプター結合
ＩＣ５０値に基づいて突然変異体を野生型Ｆｌａｇ−Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと比較した。記号「＞」は、アッセイで試験した突然変異体の最高濃度よりＩＣ５０値が高く、よってレセプター結合の倍増には低い制限しか予測できないことを示す。
【０１０９】
表ＶＩＩ 復帰細胞ライブラリーから選択された配列
【０１１０】
表ＶＩＩＩ ＤＲ５−８変異体の相対的レセプター結合親和性及び生理活性
ａ：アミノ酸変化は野生型Ａｐｏ２Ｌに対するものである。
ｂ：レセプター結合と生理活性の値は野生型Ａｐｏ２Ｌに対する比である。
【０１１１】
１． 図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、次の図１（配列番号１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃのうち１又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２． 図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該変異が表ＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
３． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ４レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
４． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
５． 前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
６． 前記ＤＲ４レセプターが図２Ａ−２Ｂ（配列番号３）のアミノ酸１〜２１８を有する、請求項３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
７． 前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９３、１９９又は２０１に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
８． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
９． 図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ａ、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ｄ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ：Ｄ２６９Ｅ、及び
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｓ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６９Ｅ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１０． 図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を含んでなり、該突然変異が表ＩＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含む、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１１． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１２． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１３． 前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１４． 前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１１に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１５． 前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１６． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１７． 図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、前記突然変異が表ＶＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を有する、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１８． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
１９． 前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２０． 前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１９に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２１． 前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１８に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２２． 図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ；
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ；及び
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｉ２６６Ｌ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２３． 前記ポリペプチドが１又は複数のポリオールに抱合又は結合する、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２４． 前記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項２３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２５． 前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約１０００ダルトンから２５０００ダルトンである、請求項２４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
２６． 請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
２７． 請求項２６のコード化ＤＮＡを含んでなるベクター。
２８． 請求項２７のベクターを含んでなる宿主細胞。
２９． 前記宿主細胞が大腸菌、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞である、請求項２８の宿主細胞。
３０． 請求項２８に記載の宿主細胞を前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを前記培養物から回収することを含んでなる、Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの製造方法。
３１． 請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物。
３２． 前記組成物が、１又は複数の二価金属イオンを含む製薬的に許容可能な製剤を含む、請求項３１に記載の組成物。
３３． ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターを発現する哺乳動物細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含んでなる、哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する方法。
３４． 哺乳動物の癌細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含む、癌治療法。
３５． 前記哺乳動物の癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、神経膠腫癌細胞、或いは大腸又は結腸直腸癌細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
３６． 前記方法が、前記哺乳動物の癌細胞を、プロドラッグ、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤、又はサイトカインにさらすことを更に含む、請求項３４に記載の方法。
３７． 前記哺乳動物に対し、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫関連疾患治療法。
３８． 前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項３７に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、次の図１（配列番号１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃのうち１又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２】
図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該変異が表ＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項３】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ４レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項４】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＤＲ４レセプターが図２Ａ−２Ｂ（配列番号３）のアミノ酸１〜２１８を有する、請求項３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項７】
前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９３、１９９又は２０１に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項８】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項９】
図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ａ、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ｄ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ：Ｄ２６９Ｅ、及び
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｓ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６９Ｅ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を含んでなり、該突然変異が表ＩＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含む、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１１に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、前記突然変異が表ＶＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を有する、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１９に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１８に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２２】
図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ；
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ；及び
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｉ２６６Ｌ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが１又は複数のポリオールに抱合又は結合する、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項２３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約１０００ダルトンから２５０００ダルトンである、請求項２４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２７】
請求項２６のコード化ＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項２８】
請求項２７のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が大腸菌、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞である、請求項２８の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２８に記載の宿主細胞を前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを前記培養物から回収することを含んでなる、Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの製造方法。
【請求項３１】
請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、１又は複数の二価金属イオンを含む製薬的に許容可能な製剤を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターを発現する哺乳動物細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含んでなる、哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する方法。
【請求項３４】
哺乳動物の癌細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含む、癌治療法。
【請求項３５】
前記哺乳動物の癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、神経膠腫癌細胞、或いは大腸又は結腸直腸癌細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、前記哺乳動物の癌細胞を、プロドラッグ、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤、又はサイトカインにさらすことを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物に対し、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫関連疾患治療法。
【請求項３８】
前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項３７に記載の方法。
【請求項１】
図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、次の図１（配列番号１）の残基位置のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃのうち１又は複数を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２】
図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、該変異が表ＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項３】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ４レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項４】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項５】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項６】
前記ＤＲ４レセプターが図２Ａ−２Ｂ（配列番号３）のアミノ酸１〜２１８を有する、請求項３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項７】
前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９３、１９９又は２０１に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項８】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項９】
図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ａ、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ、
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｋ：Ｈ２６４Ｄ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ：Ｄ２６９Ｅ、及び
Ｙ１８９Ａ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｓ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６９Ｅ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１０】
図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を含んでなり、該突然変異が表ＩＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を含む、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１２に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１１に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１５】
前記１又は複数のアミノ酸突然変異が、天然Ａｐｏ−２リガンド配列の位置１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９に１又は複数のアミノ酸置換を有する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが、Ａｒｇ１４９、Ｇｌｎ２０５、Ｖａｌ２０７、Ｔｙｒ２１６、Ｇｌｕ２３６及び／又はＴｙｒ２３７に対応する位置に天然残基を保持する、請求項１０に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１７】
図１（配列番号１）の天然Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列のアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸突然変異を有し、前記突然変異が表ＶＩＩに示す１又は複数のアミノ酸置換を有する、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドがＤＲ５レセプターに対する選択的結合親和性を有する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドが少なくとも１種類の哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する、請求項１７に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞が癌細胞である、請求項１９に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＤＲ５レセプターが図３Ａ（配列番号４）のアミノ酸１〜１８４を有する、請求項１８に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２２】
図１（配列番号１）の天然配列Ａｐｏ−２リガンドポリペプチド配列とは異なり、
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｈ２６４Ｒ：Ｉ２６６Ｌ：Ｄ２６７Ｑ；
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ；及び
Ｙ１８９Ｑ：Ｒ１９１Ｋ：Ｑ１９３Ｒ：Ｉ２６６Ｌ
からなるグループから選択される、図１（配列番号１）の残基位置の１群のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが１又は複数のポリオールに抱合又は結合する、請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリオールがポリエチレングリコールである、請求項２３に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリエチレングリコールの平均分子量が約１０００ダルトンから２５０００ダルトンである、請求項２４に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１ないし２２のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２７】
請求項２６のコード化ＤＮＡを含んでなるベクター。
【請求項２８】
請求項２７のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が大腸菌、ＣＨＯ細胞又は酵母細胞である、請求項２８の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２８に記載の宿主細胞を前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、前記Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを前記培養物から回収することを含んでなる、Ａｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの製造方法。
【請求項３１】
請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドを含有する組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、１又は複数の二価金属イオンを含む製薬的に許容可能な製剤を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターを発現する哺乳動物細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含んでなる、哺乳動物細胞にアポトーシスを誘発する方法。
【請求項３４】
哺乳動物の癌細胞を、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量にさらすことを含む、癌治療法。
【請求項３５】
前記哺乳動物の癌細胞が、肺癌細胞、乳癌細胞、神経膠腫癌細胞、或いは大腸又は結腸直腸癌細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、前記哺乳動物の癌細胞を、プロドラッグ、細胞障害剤、化学療法剤、成長阻害剤、又はサイトカインにさらすことを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物に対し、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載のＡｐｏ−２リガンド変異体ポリペプチドの有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の免疫関連疾患治療法。
【請求項３８】
前記免疫関連疾患が関節炎又は多発性硬化症である、請求項３７に記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公開番号】特開２０１０−６５０３７（Ｐ２０１０−６５０３７Ａ）
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２３３８１６（Ｐ２００９−２３３８１６）
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【分割の表示】特願２００４−５１６１４２（Ｐ２００４−５１６１４２）の分割
【原出願日】平成１５年６月２３日（２００３．６．２３）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３３８１６（Ｐ２００９−２３３８１６）
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【分割の表示】特願２００４−５１６１４２（Ｐ２００４−５１６１４２）の分割
【原出願日】平成１５年６月２３日（２００３．６．２３）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]