ＡＴＬ及びＨＴＬＶ−１関連炎症疾患をターゲットとしたＮＦ−κＢ亢進抑制剤及びその用途
【課題】本発明はNF-κB亢進抑制剤とその用途に関する。詳細には、本発明は、NF-κB亢進抑制作用を有する化合物を有効成分とするものであって、そのNF-κB亢進抑制作用に基づいて、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等のNF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療するために専ら使用される組成物に関する。
【解決手段】本発明のNF-κB亢進抑制剤は、β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする。
【解決手段】本発明のNF-κB亢進抑制剤は、β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はNF-κB亢進抑制剤とその用途に関する。詳細には、本発明は、NF-κB亢進抑制作用を有する化合物を有効成分とするものであって、そのNF-κB亢進抑制作用に基づいて、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等のNF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療するために専ら使用される組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含むほ乳類が有する免疫系（自然免疫及び獲得免疫）の破綻は炎症性疾患のみならずガン発症とも密接な関連性があり、特に免疫応答反応に中心的な役割を果たす転写因子、核内因子カッパービー（以下、NF-κB）の恒常的な活性化が炎症性疾患や悪性腫瘍形成の大きな原因のひとつであることが、分子生物学的手法を用いた様々な研究成果より明らかになっている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
NF-κBの活性制御は厳密で、病原体感染などの外部刺激がないときは通常I-κBと呼ばれる負の制御因子が結合し、NF-κBの核移行を阻止している。細菌やウイルスなどの病原体感染、紫外線、外傷・熱傷・疼痛など、ストレスを伴う外部刺激でI-κBが分解されると、NF-κBは核内に移行し制御下にある遺伝子の発現を誘導する。誘導される遺伝子群は、抗体のほか各種炎症性サイトカインやアポトーシス抵抗性タンパク質などがコードされており、免疫応答や細胞死の回避といった生体防御機構が働く（非特許文献４〜８）。
【０００４】
これらの反応は通常一過性であるが、腫瘍原性ウイルスや変異原性化合物、宿主タンパク質と交叉性のある病原体の感染、あるいは免疫系制御因子の変異などにより、NF-κBの恒常的または過剰な活性化（亢進）が起こり、悪性腫瘍、アレルギーまたは自己免疫疾患などの炎症性疾患を誘発する原因となっている。この様なNF-κB活性亢進による病態を予防または改善するため、ステロイド系や非ステロイド系薬剤が開発されている（非特許文献９〜１６）。
【０００５】
しかしながら、それらの化学製剤は免疫不全、糖尿病、骨粗鬆症、抑鬱、炎症性腸疾患、肝臓障害など様々な副作用を誘発するため（非特許文献１７〜２０）、細胞増殖因子や炎症性サイトカイン及びそれらの受容体、更に下流にあるリン酸化酵素などのシグナル伝達因子に直接作用する、より特異性を高めた分子標的治療薬が開発されている（非特許文献２１〜２３）。
【０００６】
更には食品（可食農水産物）に由来する抗腫瘍または抗炎症機能性分子を緑黄色野菜、香辛料、果物、茶、海藻等から同定し、実験動物やヒトに対する薬理学的効果を検証した事例も数多く報告されている（非特許文献２４〜２８）。
【０００７】
成人Ｔ細胞白血病（ATL）は、ヒトレトロウイルスの一種ヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV-1)が主に母乳を介して乳児期に感染し、感染者(キャリアー)が40〜60年の感染期間を経て発症する極めて予後の悪い白血病である。HTLV-1キャリアーは世界中に2000万人いると推計され、日本国内においては約120万人、九州・沖縄など南西部にほぼ5割のキャリアーが偏在し、毎年約1000人がATLを発症する。発症後の3年生存率は最新の治療プロトコルであるmLSG15でも約24％にとどまり、有効な治療法の確立、特にキャリアーの発症を予防する療法の確立が求められている。
【０００８】
HTLV-1感染はまた慢性進行性の両下肢麻痺、排尿排便障害を来すHTLV-1 関連脊髄症(HAM)発症の原因となるが、この病態はHTLV-1感染細胞に対する細胞障害性Tリンパ球の過剰活性化により誘発されるため、NF-κB活性化を阻害するプレドニゾロンなどのステロイド投与が7割のHAM患者に治癒効果をもたらす。しかしステロイド薬の長期投与は感染症・糖尿病・骨粗鬆症などを誘発するため、代替治療としてインターフェロン、ジドブジン（AZT）、またはラミブジン（3TC）などの抗ウイルス薬投与も試験されているが、期待された治癒効果は確認されていない。ここでもHAM発症を抑える新規治療法の出現が望まれている。
【０００９】
上記HTLV-1感染を原因とする病態(ATL及びHAM)の形成は、感染細胞であるCD4陽性Tリンパ球内のHTLV-1プロウイルスから産生されるガン遺伝子産物Taxが、宿主因子のNEMOやTax1bp1等に結合しNF-κBを恒常的に活性化することによって引き起こされる。具体的には、NF-κBの恒常的活性化により、CD4陽性Tリンパ球の不死化(ATL)が誘導され、ウイルス蛋白質としての抗原性が高いTaxをMHC分子が発現することによって、細胞障害性T細胞が感染細胞を攻撃する(HAM)。
【００１０】
TNF-αは、炎症メディエーターであるIL-1、IL-6、プロスタグランジンE2などの産生や形質細胞による抗体産生の亢進、アポトーシスを誘導することにより感染防御や抗腫瘍作用に関与するが、過剰な発現は関節リウマチ、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬などの炎症性疾患の発症を招く。臨床においてTNF-αをターゲットとした生物製剤が用いられ、可溶性TNF受容体(sTNFR)と免疫グロブリンGの融合タンパク質エタネルセプトや、抗TNF-αモノクローナル抗体であるインフリキシマブ(マウス、ヒトキメラ)やアダリムマブ(ヒト型)が適応となっている。しかしこれらの薬剤は副作用も多く、感染症や発癌に対するリスクが高まることが警鐘されており、これらの医薬品は疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARDs）であるメトトレキサート(核酸合成阻害剤)との併用が必須の場合もある。
【００１１】
この様にTNFαは免疫や抗腫瘍反応に必須であるにも関わらず、過剰な産生は様々な疾病の原因ともなるため機能発現のコントロールが重要であり、食品中にTNF-αによるアレルギー反応の過剰活性化を緩和し、自己免疫疾患の予防に繋がる物質の探索も行われ、ウコン由来のポリフェノール、クルクミンによる抗TNFα活性並びに抗炎症活性が報告されている。
【００１２】
喘息、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎などのI型アレルギー反応に起因する病態は、主に液性免疫を活性化する２型ヘルパーT細胞（Th2）の活性亢進によるものであり、このTh2亢進はNF-κB活性化が直接または間接的に影響を及ぼしている（非特許文献４６〜５１）。
【００１３】
現在、柑橘以外の植物（ハーブ、海草、キノコなど）から様々な抗腫瘍効果または抗アレルギー効果を有する生理活性物質が発見され（非特許文献５２〜５５）、その一部は実際に治療薬として臨床の現場で使用されており、作用機序（微少管脱重合阻害、トポイソメラーゼI阻害）も詳細に解析されている（非特許文献５６〜５７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２００４−５２５１５２号公報
【非特許文献】
【００１５】
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【非特許文献３】Potential pharmacological control of the NF-kappaB pathway. Sethi G, Tergaonkar V. Trends Pharmacol Sci. 2009 Jun;30(6):313-321.
【非特許文献４】NF-kappaB regulation in the immune system. Li Q, Verma IM. Nat Rev Immunol. 2002 Oct;2(10):725-734.
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【非特許文献４４】レミケード（登録商標）点滴静注用（田辺三菱製薬） 添付文書 2007年11月改訂
【非特許文献４５】Pharmacological basis for the role of curcumin in chronic diseases: an age-old spice with modern targets. Aggarwal BB, Sung B. Trends Pharmacol Sci. 2009 Feb;30(2):85-94.
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【非特許文献５１】S.F.Ziegler et al., (2005)“Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice.”Nature Immunology, 6, 1047-1053.
【非特許文献５２】Influence of apple polyphenols on inflammatory gene expression. Jung M, Triebel S, Anke T, Richling E, Erkel G. Mol Nutr Food Res. 2009 Oct;53(10):1263-1280.
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【非特許文献５５】Blocking NF-kappaB as a potential strategy to treat adult T-cell leukemia/lymphoma. Horie R, Watanabe T, Umezawa K. Drug News Perspect. 2006 May;19(4):201-209.
【非特許文献５６】Multidisciplinary management of lung cancer. Spira A, Ettinger DS. N Engl J Med. 2004 Jan 22;350(4):379-392.
【非特許文献５７】Topoisomerase inhibitors developing in Japan. Furue H. Gan To Kagaku Ryoho. 1993 Jan;20(1):42-49.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、未だ治療方法が確立されていない成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等の、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療する組成物を提供することを目的とする。また本発明は、かかる組成物の有効成分として、ATL発症の主要因たるガン遺伝子産物Taxによって誘導される、HTLV-1感染細胞における恒常的なNF-κB活性化を抑制する作用、並びにIV型（遅延型）アレルギー反応を誘導する主要サイトカインであるTNF-αによって誘導されるNF-κB活性化を抑制する作用を有する環式セスキテルペン、並びにその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は上記課題を解決するため、成人Ｔ細胞白血病を誘発するTaxや、遅延型アレルギー反応を誘発し炎症性疾患の原因となるTNF-α（炎症性サイトカイン）が誘導するNF-κB過剰活性化（NF-κB過剰亢進）を抑制する作用を有する化合物を探索すべく鋭意検討を重ねていたところ、テルペンの中でも環式セスキテルペンであるβ−カリオフィレンに、(1)Tax導入細胞におけるNF-κB活性の抑制活性、(2)Tax分解誘導活性、及び(3)TNF-α添加細胞におけるNF-κB活性の抑制活性があることを見出し、さらに当該化合物には、(4) アポトーシス誘導活性があり、正常細胞と区別してATL細胞を特異的に生育阻害する作用があることを確認した。これらの知見から、本発明者は、β−カリオフィレン及びその薬学的に許容される塩は、NF-κB亢進抑制剤またはTax分解誘導剤として有用であるとともに、かかるNF-κB亢進抑制作用（Tax誘導性NF-κB亢進及びTNF誘導性NF-κB亢進に対する抑制作用、）及びTax分解誘導作用に基づいて、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等の、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療する組成物の有効成分となりえると確信して、本発明を完成するに至った。
【００１８】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含するものである。
【００１９】
（Ｉ）NF-κB亢進抑制剤
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進抑制剤。
【００２０】
（II）Tax分解誘導剤
β-カリオフィレン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする、Tax分解誘導剤。
【００２１】
（III）Tax誘導性／TNF誘導性・NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物
（III-1）β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物。
（III-2）上記NF-κB亢進がTax誘導性NF-κB亢進である、（III-1）に記載する組成物。
（III-3）上記NF-κB亢進がTNF誘導性NF-κB亢進である、（III-1）に記載する組成物。
（III-4）上記疾患が、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患である、（III-1）に記載する組成物。
（III-5）上記HTLV-1関連炎症性疾患が、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患からなる群より選択される少なくとも１種である、（III-4）に記載する組成物。
（III-6）ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）発症を抑制するために用いられる（III-4）に記載する組成物。
（III-7）上記成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）が急性型またはリンパ腫型ATLである（III-6）に記載する組成物。
（III-8）ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して投与される組成物であって、当該感染者が急性型またはリンパ腫型ATLに移行することを阻止する介入型のATL発症予防用組成物である、（III-4）に記載する組成物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明において有効成分として用いられるβ−カリオフィレンは、Tax誘導性NF-κB亢進およびTNF誘導性NF-κB亢進に対して抑制作用を有している。このため、かかる作用に基づいて、Tax誘導性NF-κB亢進またはTNF誘導性NF-κB亢進に起因して発症、誘導若しくは増悪する疾患や病態を予防したり、また改善することができる。
【００２３】
前述するように、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫（ATL）は未だ有効な化学療法が確立しておらず、特に悪性度の高い急性型またはリンパ腫型ATLを発症した後は最も成績のよいmLSG15においても3年生存率は24％に満たない極めて予後の悪い疾患である。本発明によれば、HTLV-1ウイルス感染者（キャリアー）に対して、Taxの分解を誘導しNF-κBの亢進を抑制することで、急性型またはリンパ腫型ATLへの移行を阻止する介入型のALT発症予防用組成物を提供することができる。
またATL発症後は、本発明によれば、NF-κB過剰活性化が抑制できるためATL細胞の無秩序な増殖を阻止し、抗カルシウム血症や皮膚炎症症状などNF-κB過剰活性化を原因とする症状・病態を軽減することが可能になる。
【００２４】
TNF-αはマクロファージなどから産生され、IV型（遅延型）アレルギー反応を誘導する主要サイトカインとしてNF-κBの活性を亢進させ、炎症メディエーター（IL-1、IL-6、プロスタグランジンE2）の産生を促進し、上記アレルギー反応を誘発する。本発明によれば、その有効成分であるβ−カリオフィレンがTNF-αによるNF-κB活性亢進をも抑制するので、かかるIV型アレルギー反応を抑制することができるものと期待される。
【００２５】
またNF-κBの亢進は、喘息、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎といったＩ型アレルギー反応に起因する疾患の発症に直接または間接的に関与している（非特許文献１３〜１８）。喘息症状を誘発するサイトカインTSLP（thymic stromal lymphopoietin）はNF-κB活性化を受け、発現が誘導され、免疫応答反応を司るモノサイトはTSLPの刺激を受けリンパ球を遊走させるケモカインを分泌する。TSLPによる喘息症状の亢進は、ほ乳類共通の生体反応であり、ヒトおよびマウスで同様の喘息誘発機序が報告されている（非特許文献１６参照）。従って、β−カリオフィレンはNF-κB活性亢進によるTSLP分泌を抑制するので、これを有効成分とする本発明によれば、喘息症状を軽減することができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実験例で被験化合物として使用したモノテルペン（チモール、ペリルアルデヒド）、環式セスキテルペン（β−カリオフィレン、ゼランボン）の化学式を示す。
【図２】17-DMAG（陽性コントロール）、及び各種テルペン（チモール、ペリルアルデヒド、β−カリオフィレン、ゼランボン）について、（Ａ）Tax誘導性NF-κB活性化に対する抑制効果、及び（Ｂ）TNF誘導性NF-κB活性化に対する抑制効果を評価した結果を示す（実験例１）。
【図３】化合物非存在（図中の符合1）、DMSO（符合２）、陽性コントロールとして17-DMAG 3μM（符合３）、及び各種テルペン〔チモール 300μM（符合４）、ペリルアルデヒド300μM（符合５）、β−カリオフィレン300μM（符合６）、ゼランボン30μM（符合７）〕について、（Ａ）Tax誘導性NF-κB活性化に対する抑制効果、及び（Ｂ）Taxの細胞内安定性に与える影響を評価した結果を示す（実験例１）。
【図４】ATL細胞に対するモノテルペン類（チモール、ペリルアルデヒド、リモネン、γ-テルピネン、ミルセン）のアポトーシス誘導活性を評価した結果を示す。
【図５】ATL細胞（株化細胞C8166、MT4、ATL04）、Jurkat、そして正常ヒトリンパ球（PBL01、PBL02、PBL03）に対する17-DMAG（陽性コントロール）、及び各種テルペン（β−カリオフィレン、ゼランボン、チモール、ペリルアルデヒド、リモネン）のアポトーシス誘導活性を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
β-カリオフィレンは、後述する実験例１および２に示すようにTax誘導性NF-κB亢進及びTNF誘導性NF-κB亢進を抑制する作用を有する。また実験例２に示すようにTaxを分解誘導する作用を有する。さらに実験例３に示すように、アポトーシス誘導活性を有し、正常リンパ球と区別して成人Ｔ細胞白血病（ATL）細胞を特異的に細胞死に至らしめる作用を有する。このため、β-カリオフィレンは、NF-κB亢進抑制剤やTax分解誘導剤の有効成分として、またTax誘導性NF-κB亢進またはTNF誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療するための組成物の有効成分として有用である。
【００２８】
本発明の「NF-κB亢進抑制剤」、「Tax分解誘導剤」、及び「NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物」（以下、これらを総称して「本発明品」という）は、いずれもかかるβ-カリオフィレン、又はその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とすることを特徴とする。
【００２９】
β-カリオフィレンは、下式で示される自体公知の化合物である。
【００３０】
【化１】
【００３１】
なお、当該化合物には、その異性体の別を問わず、下式（２）で示される（−）-β-カリオフィレン（(1R,1β,4E,9α)-4,11,11-トリメチル-8-メチレン-ビシクロ[7.2.0]ウンデカ-4-エン）及び下式（３）で示される（＋）-β-カリオフィレン（(1S,4E,9R)-4,11,11-トリメチル-8-メチレンビシクロ[7.2.0]ウンデカ-4-エン）の両方が含まれる。好ましくは（−）-β-カリオフィレンである。
【００３２】
【化２】
【００３３】
かかるβ-カリオフィレンは、高砂香料工業（株）、東京化成工業（株）、及び和光純薬工業（株）等から商業的に入手することができる。
【００３４】
本発明品において、β-カリオフィレンはフリーの形態であっても、またその薬学的に許容される塩もしくはエステル体の形態を有するものであってもよい。
【００３５】
ここで薬学的に許容される塩としては、無機塩基または有機塩基との塩、または塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。無機塩基としては。例えばナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩やアルミニウム塩を挙げることができる。また有機塩基としては、例えばエタノールアミンなどの第一級アミン；ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミンなどの第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ピリジン、ピコリンなどの第三級アミンなどを挙げることができる。塩基性アミノ酸としては、例えばリジン、アルギニンおよびオルニチンなどを挙げることができる。
【００３６】
また、エステルとしては、例えばβ-カリオフィレン中のメチル基がカルボン酸とエステル化して形成されるβ-カリオフィレンのエステル化物を挙げることができる。具体的には、例えば、メチル基がカルボン酸とエステル化して形成される14-アセトキシ-β-カリオフィレン等を挙げることができる。
【００３７】
本発明品の有効成分として用いられる上記β-カリオフィレン、またはその塩若しくはエステル（以下、これらを総称して「β-カリオフィレン類」という）は、本発明の効果を損なわない限り、必ずしも精製品である必要はなく、粗精製品であってもよい。例えば、上記β-カリオフィレン類を含む天然物から加工して得られるβ-カリオフィレン類含有画分であってもよい。かかるβ-カリオフィレン類含有画分としては、シークワサー（Citrus depressa Hayata）、カーブチー（Citrus keraji var. kabuchii Hort, ex Tanaka）、オートー（Citrus oto Hort, Y Tanaka）、タロガヨ（Citrus tarogayo Hort. ex Y. Tanaka）、クネンボ（Citrus nobilis Lour. var.kunep Tanaka）、タンカン（Citrus tankan Hayata）の果皮から得られる精油を例示することができる。好ましくは、シークワサー果皮から得られる精油である。
【００３８】
本発明のNF-κB亢進抑制剤は、β-カリオフィレン類だけからなるものであってもよいが、通常、NF-κB亢進抑制作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。なお、ここでNF-κB亢進抑制作用は、後述する実験例１に記載するように、ルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイを組み合わせることで測定評価することができる。
【００３９】
また、本発明のTax分解誘導剤もβ-カリオフィレン類だけからなるものであってもよいが、通常、Tax分解誘導作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。なお、ここでTax分解誘導作用は、後述する実験例２に記載するように、免疫ブロット法により測定評価することができる。
【００４０】
これらの点から、本発明のNF-κB亢進抑制剤及びTax分解誘導剤は、β-カリオフィレン類を通常0.04〜4重量％、好ましくは0.1〜1重量％の割合で含むことが好ましい。
【００４１】
また、本発明のTax誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物（以下、単に「本発明組成物」ともいう）は、Tax誘導性NF-κB亢進抑制作用または／およびTNF誘導性NF-κB亢進抑制作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類に加えて、通常、薬学的に許容される担体若しくは添加剤、または可食性成分を配合して調製される。ここでTax誘導性NF-κB亢進抑制作用およびTNF誘導性NF-κB亢進抑制作用は、前述するように、実験例１に記載するルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイから測定評価することができる。さらに、本発明組成物は、成人Ｔ細胞白血病（ATL）細胞に対してアポトーシス誘導作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類を含有することが好ましい。アポトーシス誘導作用は、後述する実験例３に記載するように、Caspase3/7アッセイとCCK-8アッセイを組み合わせることで測定評価することができる。
【００４２】
かかる点から、本発明組成物は、β-カリオフィレン類を通常4〜99重量％、好ましくは1〜80重量％の割合で含むことが望ましい。
【００４３】
本発明組成物が対象とするTax誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患としては、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）を挙げることができる。成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫（ATL）は未だ有効な化学療法が確立していない予後の悪い疾患である。このため、HTLV-1ウイルス感染者（キャリアー）に対しては急性型・リンパ腫型への移行を阻止する介入型の発症予防的治療が最善の策と考えられる。感染初期においてキャリアーの体内にあるHTLV-1感染細胞はT細胞全体の割合に比べそれほど高くなく、感染細胞のクローナリティーも非常に多様（ポリクローナル）である。この様な初期感染形態からTaxによるNF-κB過剰活性化を受け、50年以上の年月を経てごく一部の感染細胞がオリゴクローナルもしくはモノクローナルに増殖し、ATL臨床例の初期段階であるくすぶり型・慢性型ATLを発症する。ATL発症ハイリスクキャリアーが峻別されれば、その様なキャリアーは予防的にβカリオフィレンを含む本発明組成物を摂取し、TaxによるNF-κB過剰活性化を抑制し、ATL発症に対して介入的予防効果を得ることが期待される。また発症後もNF-κB過剰活性化を抑制できればATL細胞の無秩序な増殖を阻止し、抗カルシウム血症や皮膚炎症症状などNF-κB過剰活性化の影響とみられる症状の軽減が期待される。つまり、本発明組成物は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）発症を抑制するために好適に用いることができる。このため、本発明組成物には、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）の発症を予防し、または発症後の症状緩和・改善することを目的とする医薬組成物、および飲食物組成物（機能性食品、特定保健用途食品、健康補助食品、栄養補助食品、病人食などが含まれる）が含まれる。好ましくは医薬組成物である。
【００４４】
また本発明組成物が対象とするTNF誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患としては、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患を挙げることができる。HTLV-1関連炎症性疾患としては、具体的には、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患を例示することができる。このため、本発明組成物には、HTLV-1関連炎症性疾患の発症を予防し、または発症後の症状緩和・改善することを目的とする医薬組成物、および飲食物組成物（機能性食品、特定保健用途食品、健康補助食品、栄養補助食品、病人食などが含まれる）が含まれる。好ましくは医薬組成物である。
【００４５】
これら本発明組成物を含む本発明品の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与、静脈内投与、及び経皮投与であり、より好ましくは経口投与である。本発明の製剤は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調製することができる。以下に、各製剤（剤型）について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。
【００４６】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００４７】
また、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。
【００４８】
また、経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００４９】
本発明の製剤にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５０】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類（例えばバレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。
【００５１】
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。
【００５２】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類（たとえばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、コムギデンブン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。
【００５３】
崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。
【００５４】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。
【００５５】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００５６】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（たとえば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。
【００５７】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ、チオグリコール酸）、不活性ガス（たとえば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（たとえば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。
【００５８】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。
【００５９】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤こしては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ペンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。
【００６０】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。
【００６１】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸、等を挙げることができる。
【００６２】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。
【００６３】
基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、軽質流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。
【００６４】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤である。
【００６５】
本発明の製剤の経口投与量としては、β-カリオフィレンの量に換算して1〜10mg/kgの範囲で適宜調整することができる。静脈内投与をする場合、β-カリオフィレンの有効血中濃度が0.01〜1000μg/mL、より好ましくは0.02〜100μg/mLの範囲となるような投与量を挙げることができる。なお、これらの投与量は、年齢、性別、体型等により変動し得る。
【実施例】
【００６６】
以下、実験例により本発明及びその効果をより詳細に説明する。但し、本発明は、かかる実験例になんら制限されるものではない。
【００６７】
実験例１
ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)が産生するガン遺伝子産物Taxは、難治性の白血病・リンパ腫である成人T細胞白血病（adult T-cell leukemia：ATL）発症に必須の細胞不死化やATL患者で頻繁に観察される高カルシウム血症や皮疹などの原因となるNF-κB過剰活性（Tax誘導性NF-κB亢進）を誘導する。このTax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果を検討するため、既にTax分化誘導とNF-κB抑制効果が確認されている分子シャペロン阻害剤17-DMAG（陽性コントロール）と共に、環式セスキテルペンに該当するβカリオフィレン及びゼランボン、並びにモノテルペンに該当するペリルアルデヒド及びチモール（図２）について、Tax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果を調べた。
【００６８】
（１）実験方法
（1-1）細胞と細胞培養法
ヒト胎児腎由来HEK293細胞（以後、「293細胞」という）は、10% FBS、2mM L-グルタミン、Penicillin-Streptomycin（PC/SM）を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）（以下、この培地を「DMEM」という）を培養液とし、25cm2培養フラスコ内で37℃、5％CO2で維持、3日ごとに全体の1/10量の細胞を継代に使用した。
【００６９】
トランスフェクション実験用細胞は、下記（a）〜（c）の方法で調製し、得られたプレートを遺伝子導入実験に使用した：
（a）ほぼコンフルエントに293細胞が増殖した継代培養フラスコからDMEMを吸引除去し、PBS 5mLで１回洗浄。
（b）トリプシンおよび1mM EDTA含有PBS 1.5mLを加え5分静置後、ピペットにて293細胞をフラスコ底部から遊離・懸濁し、10%FBS、L-グルタミン、PC/SM添加DMEMを15mL加え更に懸濁。
（c）12ウェルプレートの各ウェルに、0.6mLずつ細胞懸濁培養液を移し(5x104/well)、〜60%コンフルエントになるまで培養（約一晩）。
【００７０】
（1-2）プラスミドの調製
NF-κB結合配列を有し、NF-κB依存的にホタルルシフェラーゼの転写・翻訳を誘導するベクター NF-κB-luc（Dr. M. Lienhard Schmitz. Department of Immunochemistry, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany.より入手）をNF-κB活性化を測定するためのリポータープラスミドとして、また、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター依存的にβガラクトシダーゼを発現するRSV-βgal（Dr. Kuan Teh Jeang, Molecular Virology Section, Laboratory of Molecular Microbiology, NIAID, the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.より入手）をトランスフェクションモニターとして、それぞれ使用した。さらにTax遺伝子導入実験系においては、SV40プロモーター及びβグロビンイントロン依存的にTaxを発現するpSG5-Taxか、HTLV-1 LTR依存的にTaxタンパク質を発現するベクターpLTR-Tax（Iha, H.,未発表）を用いた。
【００７１】
（1-3）トランスフェクションおよびテルペン類の投与
Tax遺伝子導入実験系では、（1-1）で調製したトランスフェクション実験用細胞に、NF-κB-luc(0.05μg)、pRSV-βgal(0.05μg)、ベクターpSG5-Tax（またはpLTR-Tax）および、対照群としてpSG5（Agilent）を0.25μg、またTNF-α投与実験系では、（1-1）で調製したトランスフェクション実験用細胞に、NF-κB-luc(0.05μg)、pRSV-βgal(0.05μg)、およびpcDNA3(Invitrogen) (0.25μg)を、それぞれ導入(トランスフェクション)した。
【００７２】
具体的には、Fugene-HD（Roche）をプラスミド：Fugene-HD =1:3となるよう調整後、DMEM 100μLと混合し、15分間室温で静置。これを各プラスミドDNA溶液と混合し15分間室温で静置した後、5% FBS含有DMEM 500μLと混合し、DNAトランスフェクション混合液600μLを培地を除去した12ウェル細胞培養用プレートのトランスフェクション実験用細胞(〜60%コンフルエント)上に、細胞が剥離しないように注意しながら静かに流し入れ、トランスフェクション操作を行なった。翌朝これに5% FBS含有DMEMを0.4mL加え、トランスフェクション操作から20時間後に、被験化合物（分子シャペロン阻害剤の17-DMAG、βカリオフィレン、ゼランボン、ペリルアルデヒド、またはチモール）を、また無添加対照群には等量（５μL）のDMSOを加えた。Tax遺伝子導入実験系では、さらに24時間後（トランスフェクション操作から44時間後）に細胞をPBS 1mLで2度洗浄し、1mM EDTA含有PBS 0.8mLで底面から遊離した細胞をピペットで懸濁し1.5ｍLマイクロチューブに回収、3,000Gx2分で細胞をペレットにし（マイクロチューブを冷却遠心機(Centrifuge 5415R, eppendorf)にて遠心分離(6000rpm、2min、20℃)）、ルシフェラーゼアッセイに供した。また、TNF投与実験系では、トランスフェクション操作(全てpSG5対照ベクターを使用)から20時間後に各被験化合物を添加し、その16時間後にDMEM 100μLに溶解したTNF-α(ProSpec)を、最終濃度が20ng/mLになるように加え8時間反応後（トランスフェクション操作から4４時間後）に、細胞をPBS 1mLで2度洗浄し、1mM EDTA含有PBS 0.8mLで底面から遊離した細胞をピペットで懸濁し1.5ｍLマイクロチューブに回収、3,000Gx2分で細胞をペレットにし、ルシフェラーゼアッセイに供した。
【００７３】
1mM EDTA含有PBS 0.8mLを吸引除去後、細胞ペレット入りのマイクロチューブは氷上で冷却した。細胞ペレットはLysis Buffer (Applied Biosystems) 100μlで溶解後ピペットで攪拌し、遠心操作(13,200rpm、5min、4℃)で不溶沈殿物をチューブ底面に分離後、上清（細胞溶解液）をルシフェラーゼアッセイ及びβ-ガラクトシダーゼアッセイに供した。
【００７４】
（1-4）ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼアッセイ
96ウェルプレートの各ウェルに細胞溶解液を5μLずつ分注し、直ちにルシフェラーゼアッセイ用基質Luciferase Assay Substrate (Promega)50μLまたはβ-ガラクトシダーゼアッセイ用基質Galacto-Star: Galacto-Star Reaction Buffer Diluent(Applied Biosystems) 1:50混合液基質を自動分注し、発光強度を測定するルミノメーター(GloMax-96 Microplate Luminometer、Promega)で解析した。
【００７５】
（1-5）ＮＦ-κＢ活性の定量解析
ＮＦ-κＢ活性（%）は、最低3回の同一実験から得られたルシフェラーゼアッセイ測定値をβ-ガラクトシダーゼアッセイ測定値で割り標準化した後、平均値±SDで示した。トランスフェクション操作から24時間後にコントロール用にPBSを加えた細胞のルシフェラーゼ値及びβ-ガラクトシダーゼ値を常に基準値（100%）とし、それに対する相対値から各細胞のNF-κB活性を算出した。
【００７６】
（２）実験結果
Tax遺伝子導入実験系における各被験化合物のNF-κB抑制効果（IC50）は、17-DMAG（177 nM）、βカリオフィレン（225μM）、ゼランボン（16.7μM）、ペリルアルデヒド（133μM）、チモール（352μM）であった（図３（Ａ））。一方、TNF-α投与実験系における各被験化合物のNF-κB抑制効果（IC50）は、17-DMAG（191 nM）、βカリオフィレン（211μM）、ゼランボン（17.7μM）、ペリルアルデヒド（197μM）、チモール（300μM）であった（図３（Ｂ））。
【００７７】
実験例２
実験例１で示されたTax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果の作用機序を検討するため、Tax遺伝子導入系における３種類の蛋白質（Tax、I-κB、Tubulin）の細胞内安定性について免疫ブロット法（WB）用いて検討した。なお、I-κBの分解はNF-κB活性化と逆相関関係にあり、またTubulinの減少は細胞の死滅と相関関係にあることが知られている。
【００７８】
（１）実験方法
細胞のトランスフェクション、テルペン類の投与と細胞の回収、溶解、ルシフェラーゼ活性の測定までは、上記実験例１と全く同様の方法で行った。
【００７９】
（1-1）免疫ブロット法
ルシフェラーゼ活性測定後の細胞融解液は、超音波処理により核染色体DNAを分解後、Protein Assay Kit (Bio-Rad)にて、蛋白質濃度を測定した。各細胞融解液を10μgずつ、βメルカプトエタノール入りSDSサンプルバッファと4:1の容量比で混和し、95℃で５分加熱処理後SDS-PAGEで泳動・展開後、半乾式蛋白転写法を用いてPVDF-membrane（Millipore）に転写し、抗Tax抗体（田中勇悦博士、琉球大学医学部免疫学講座より入手）、抗I-κB（Cell Signaling Technology）、抗Tubulin（Sigma）を用いて、それぞれの発現量を検出した。
【００８０】
（２）実験結果
結果を図４に示す。対照群（図４（Ａ）レーン１）に対してTax遺伝子導入群はNF-κBの活性が20.4倍増加した（図４（Ａ）レーン２）。その様な条件に、テルペン類を加えると以下のようにNF-κBの活性が抑制された。17-DMAG：3μM（1.2、5.9%）（図４（Ａ）レーン３）、βカリオフィレン: 300 μM（4.2、20.6%）（図４（Ａ）レーン６）、ゼランボン: 30 μM（3.5、17.2%）（図４（Ａ）レーン７）、ペリルアルデヒド: 300 μM（6.7、32.8%）（図４（Ａ）レーン５）、チモール: 300 μM（12.6、61.8%）、（図４（Ａ）レーン４）。図４（Ｂ）に、その際の上記３種類の蛋白質分子（Tax、I-κB、Tubulin）の発現を示す。
【００８１】
この結果からわかるように、対照群ではTaxの発現は無く、I-κBとTubulin共に発現が確認された（図４（Ａ）レーン１）。それに対しTax遺伝子導入群ではTaxの発現があり、それに伴いI-κBの発現が抑えられ（分解が誘導され）、Tubulinの発現に変化はない（図４（Ａ）レーン２）。17-DMAGでは、既に報告しているように（特開2009-243900号公報）、Taxの分解誘導とNF-κB抑制活性が認められた（図４（Ａ）レーン２）。被験化合物のうち、17-DMAGと同様にTaxの分解誘導とNF-κB抑制活性（I-κB分解の抑制）を示すのはβカリオフィレン（図４（Ａ）レーン６）だけでであった。ペリルアルデヒドはI-κB分解を抑制する活性はあるものの、Taxの分解誘導活性は低かった（図４（Ａ）レーン５）。チモールは双方の活性とも明確には示されず（図４（Ａ）レーン４）、またゼランボンによるルシフェラーゼ値の抑制は、細胞毒性によって細胞が死滅したことによるものと考えられた（図４（Ａ）レーン７）。
【００８２】
実験例３
上記実験例１及び２で示されたβカリオフィレン及びその他のテルペン類による、抗Tax・抗NF-κB効果が、果たして末梢血リンパ球（PBL）にはあまり影響を与えず、ATL細胞対して特異的にアポトーシス若しくは増殖の抑制を誘導するか、キャスパーゼ活性（Caspase3/7アッセイ）並びに細胞増殖活性（CCK-8アッセイ）にて検討した。
【００８３】
（１）実験方法
（1-1）細胞と細胞培養法
ATL患者由来リンパ球（ATL4、ATL9：大分大学医学部第２内科緒方正男講師より分与）及びATL細胞株C8166、MT4そして急性Tリンパ芽球性白血病株Jurkat（Dr. Kuan Teh Jeang, Molecular Virology Section, Laboratory of Molecular Microbiology, NIAID, the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.より入手）、ヒト正常リンパ球（PBL、大分大学医学部微生物学講座ボランティアより取得）は、10% FBS、2mM L-グルタミン、Penicillin-Streptomycin（PC/SM）を添加したRoswell Park Memorial Institute（RPMI1640、Gibco）を培養液とし、75cm2培養フラスコ内で37℃、5％CO2で維持、3日ごとに全体の1/10量の細胞を継代に使用した。必要に応じてIL-2を10ng/mL添加した。
【００８４】
（1-2）Caspase3/7アッセイ
上記ATL患者若しくは健常人由来リンパ球を5x105/mLのRPMI1640細胞懸濁液とし、12ウエルプレートに分注後、各被験化合物（17-DMAG、βカリオフィレン、ゼランボン、ペリルアルデヒド、チモール、リモネン、γ-テルピネンまたはミルセン）をそれぞれ図５の横軸に示す濃度（mM）になるように（5μL）、また無添加対照群には被験化合物に代えて等量（５μL）のDMSOを加えて培養した。培養開始から24、48、72、96または120時間後に50μLの細胞懸濁液を3サンプル分96ウエルプレートに分取し、25μLのCaspase-GloTM 3/7 Assay液（Promega）を加え、30分後にGloMax-96 Microplate Luminometerで発光量を測定した。
【００８５】
（1-3）CCK-8アッセイ
上記（1-2）と同様に細胞懸濁液に各化合物を添加、一定時間毎に細胞懸濁液50μLを3サンプル分、96ウエルプレートに分取し、25μLのCell Counting Kit-8（CCK-8）溶液を加え、30分後にMolecular Devices E MAXで450ｎmの吸光度を測定した。
【００８６】
（1-4）アポトーシス誘導強度(IAI: Intensity of Apoptosis Inductivity)の数値化
細胞死の誘導は大きく分けて３種類（１．アポトーシス、２．オートファジー、３．ネクローシス）あり、２と３は必ずしもカスパーゼの活性化（Caspase3/7アッセイ）を伴わない。ATL治療に求められるのはATL細胞特異的に積極的なアポトーシスを誘導させる作用であり、正常なリンパ球をアポトーシス誘導することは好ましくない。また、通常行われる細胞生存率試験はミトコンドリアの呼吸能の活性をホルマザン色素の濃淡（CCK-8アッセイ）で表しているが、この数値からは細胞死が上記３種類の何れによって誘導されているか見分けがつかない。
【００８７】
そこで、この実験ではアポトーシスによる細胞生存率の低下を鋭敏に定量化するため、ATL細胞及びリンパ球にそれぞれ各被験化合物を投与した後、一定時間経過した細胞懸濁液のCaspase3/7値とCCK-8値を同時に計測し、前者を分子、後者を分母にして数値化（アポトーシス誘導強度: IAI）した。即ちアポトーシスのシグナルが強いほど、生存細胞数が少ないほど数値は大きくなる。
［数１］
アポトーシス誘導強度（IAI） ＝ Caspase3/7値 ／ CCK-8値
【００８８】
（２）実験結果
ATL細胞（株化細胞C8166、MT4、ATL04）、Jurkat、そして正常ヒトリンパ球（PBL01、PBL02、PBL03）に対する各被験化合物のアポトーシス誘導活性をCapase3/7キットにて測定した結果を、図５に示す。これらの値は全て被験化合物投与後24時間の時点で計測した値である。ペリルアルデヒドは0.2mMから、チモール、リモネン、及びγテルピネンはいずれも0.3mMから有意なアポトーシス誘導活性を示し、特にリモネン及びγテルピネンは1mMでATL細胞並びにJurkatに対して顕著なアポトーシス誘導効果を示した。以上４種のモノテルペン（ペリルアルデヒド、チモール、リモネン、γ-テルピネン）は何れも正常ヒトリンパ球であるPBLに対してはアポトーシスを誘導しなかった。一方、モノテルペンのうちミルセンは明確な効果は認められなかった。
【００８９】
次に、ATL細胞（株化細胞C8166、MT4）と正常ヒトリンパ球（PBL01、PBL02）に対する各種テルペン類（βカリオフィレン、ゼランボン、チモール、ペリルアルデヒド）のIAI（Intensity of Apoptosis Industry）を計測した。結果を図６に示す。図６の結果から、各被験化合物のATL細胞に対するIAI最大値、PBL細胞に対するIAI最大値を求め、PBL細胞に対するIAI最大値に対するATL細胞に対するIAI最大値を算出し、ATL細胞への特異性を評価した。結果を、表１に示す。
【００９０】
【表１】
【００９１】
これからわかるように、βカリオフィレンが最も特異性高くATL細胞にアポトーシスを誘導していることが確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明はNF-κB亢進抑制剤とその用途に関する。詳細には、本発明は、NF-κB亢進抑制作用を有する化合物を有効成分とするものであって、そのNF-κB亢進抑制作用に基づいて、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等のNF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療するために専ら使用される組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含むほ乳類が有する免疫系（自然免疫及び獲得免疫）の破綻は炎症性疾患のみならずガン発症とも密接な関連性があり、特に免疫応答反応に中心的な役割を果たす転写因子、核内因子カッパービー（以下、NF-κB）の恒常的な活性化が炎症性疾患や悪性腫瘍形成の大きな原因のひとつであることが、分子生物学的手法を用いた様々な研究成果より明らかになっている（非特許文献１〜３）。
【０００３】
NF-κBの活性制御は厳密で、病原体感染などの外部刺激がないときは通常I-κBと呼ばれる負の制御因子が結合し、NF-κBの核移行を阻止している。細菌やウイルスなどの病原体感染、紫外線、外傷・熱傷・疼痛など、ストレスを伴う外部刺激でI-κBが分解されると、NF-κBは核内に移行し制御下にある遺伝子の発現を誘導する。誘導される遺伝子群は、抗体のほか各種炎症性サイトカインやアポトーシス抵抗性タンパク質などがコードされており、免疫応答や細胞死の回避といった生体防御機構が働く（非特許文献４〜８）。
【０００４】
これらの反応は通常一過性であるが、腫瘍原性ウイルスや変異原性化合物、宿主タンパク質と交叉性のある病原体の感染、あるいは免疫系制御因子の変異などにより、NF-κBの恒常的または過剰な活性化（亢進）が起こり、悪性腫瘍、アレルギーまたは自己免疫疾患などの炎症性疾患を誘発する原因となっている。この様なNF-κB活性亢進による病態を予防または改善するため、ステロイド系や非ステロイド系薬剤が開発されている（非特許文献９〜１６）。
【０００５】
しかしながら、それらの化学製剤は免疫不全、糖尿病、骨粗鬆症、抑鬱、炎症性腸疾患、肝臓障害など様々な副作用を誘発するため（非特許文献１７〜２０）、細胞増殖因子や炎症性サイトカイン及びそれらの受容体、更に下流にあるリン酸化酵素などのシグナル伝達因子に直接作用する、より特異性を高めた分子標的治療薬が開発されている（非特許文献２１〜２３）。
【０００６】
更には食品（可食農水産物）に由来する抗腫瘍または抗炎症機能性分子を緑黄色野菜、香辛料、果物、茶、海藻等から同定し、実験動物やヒトに対する薬理学的効果を検証した事例も数多く報告されている（非特許文献２４〜２８）。
【０００７】
成人Ｔ細胞白血病（ATL）は、ヒトレトロウイルスの一種ヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV-1)が主に母乳を介して乳児期に感染し、感染者(キャリアー)が40〜60年の感染期間を経て発症する極めて予後の悪い白血病である。HTLV-1キャリアーは世界中に2000万人いると推計され、日本国内においては約120万人、九州・沖縄など南西部にほぼ5割のキャリアーが偏在し、毎年約1000人がATLを発症する。発症後の3年生存率は最新の治療プロトコルであるmLSG15でも約24％にとどまり、有効な治療法の確立、特にキャリアーの発症を予防する療法の確立が求められている。
【０００８】
HTLV-1感染はまた慢性進行性の両下肢麻痺、排尿排便障害を来すHTLV-1 関連脊髄症(HAM)発症の原因となるが、この病態はHTLV-1感染細胞に対する細胞障害性Tリンパ球の過剰活性化により誘発されるため、NF-κB活性化を阻害するプレドニゾロンなどのステロイド投与が7割のHAM患者に治癒効果をもたらす。しかしステロイド薬の長期投与は感染症・糖尿病・骨粗鬆症などを誘発するため、代替治療としてインターフェロン、ジドブジン（AZT）、またはラミブジン（3TC）などの抗ウイルス薬投与も試験されているが、期待された治癒効果は確認されていない。ここでもHAM発症を抑える新規治療法の出現が望まれている。
【０００９】
上記HTLV-1感染を原因とする病態(ATL及びHAM)の形成は、感染細胞であるCD4陽性Tリンパ球内のHTLV-1プロウイルスから産生されるガン遺伝子産物Taxが、宿主因子のNEMOやTax1bp1等に結合しNF-κBを恒常的に活性化することによって引き起こされる。具体的には、NF-κBの恒常的活性化により、CD4陽性Tリンパ球の不死化(ATL)が誘導され、ウイルス蛋白質としての抗原性が高いTaxをMHC分子が発現することによって、細胞障害性T細胞が感染細胞を攻撃する(HAM)。
【００１０】
TNF-αは、炎症メディエーターであるIL-1、IL-6、プロスタグランジンE2などの産生や形質細胞による抗体産生の亢進、アポトーシスを誘導することにより感染防御や抗腫瘍作用に関与するが、過剰な発現は関節リウマチ、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬などの炎症性疾患の発症を招く。臨床においてTNF-αをターゲットとした生物製剤が用いられ、可溶性TNF受容体(sTNFR)と免疫グロブリンGの融合タンパク質エタネルセプトや、抗TNF-αモノクローナル抗体であるインフリキシマブ(マウス、ヒトキメラ)やアダリムマブ(ヒト型)が適応となっている。しかしこれらの薬剤は副作用も多く、感染症や発癌に対するリスクが高まることが警鐘されており、これらの医薬品は疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARDs）であるメトトレキサート(核酸合成阻害剤)との併用が必須の場合もある。
【００１１】
この様にTNFαは免疫や抗腫瘍反応に必須であるにも関わらず、過剰な産生は様々な疾病の原因ともなるため機能発現のコントロールが重要であり、食品中にTNF-αによるアレルギー反応の過剰活性化を緩和し、自己免疫疾患の予防に繋がる物質の探索も行われ、ウコン由来のポリフェノール、クルクミンによる抗TNFα活性並びに抗炎症活性が報告されている。
【００１２】
喘息、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎などのI型アレルギー反応に起因する病態は、主に液性免疫を活性化する２型ヘルパーT細胞（Th2）の活性亢進によるものであり、このTh2亢進はNF-κB活性化が直接または間接的に影響を及ぼしている（非特許文献４６〜５１）。
【００１３】
現在、柑橘以外の植物（ハーブ、海草、キノコなど）から様々な抗腫瘍効果または抗アレルギー効果を有する生理活性物質が発見され（非特許文献５２〜５５）、その一部は実際に治療薬として臨床の現場で使用されており、作用機序（微少管脱重合阻害、トポイソメラーゼI阻害）も詳細に解析されている（非特許文献５６〜５７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２００４−５２５１５２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】NF-kappaB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression. Karin M, Greten FR. Nat Rev Immunol. 2005 Oct;5(10):749-759.
【非特許文献２】Inflammation and cancer: how friendly is the relationship for cancer patients? Aggarwal BB, Gehlot P. Curr Opin Pharmacol. 2009 Aug;9(4):351-369.
【非特許文献３】Potential pharmacological control of the NF-kappaB pathway. Sethi G, Tergaonkar V. Trends Pharmacol Sci. 2009 Jun;30(6):313-321.
【非特許文献４】NF-kappaB regulation in the immune system. Li Q, Verma IM. Nat Rev Immunol. 2002 Oct;2(10):725-734.
【非特許文献５】Toll-like receptor signalling. Akira S, Takeda K. Nat Rev Immunol. 2004 Jul;4(7):499-511.
【非特許文献６】Estrogen, NFkappaB, and the heat shock response. Stice JP, Knowlton AA. Mol Med. 2008 Jul-Aug;14(7-8):517-527.
【非特許文献７】The IKK-NF-kappaB pathway: a source for novel molecular drug targets in pain therapy? Niederberger E, Geisslinger G. FASEB J. 2008 Oct;22(10):3432-3442.
【非特許文献８】Regulation of immune responses by NF-kappa B/Rel transcription factor. Sha WC. J Exp Med. 1998 Jan 19;187(2):143-146.
【非特許文献９】Biological and biochemical inhibitors of the NF-kappa B/Rel proteins and cytokine synthesis. Beauparlant P, Hiscott J. Cytokine Growth Factor Rev. 1996 Aug;7(2):175-190.
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【非特許文献５２】Influence of apple polyphenols on inflammatory gene expression. Jung M, Triebel S, Anke T, Richling E, Erkel G. Mol Nutr Food Res. 2009 Oct;53(10):1263-1280.
【非特許文献５３】Plant-derived small molecule albaconol suppresses LPS-triggered proinflammatory cytokine production and antigen presentation of dendritic cells by impairing NF-kappaB activation. Liu Q, Shu X, Sun A, Sun Q, Zhang C, An H, Liu J, Cao X. Int Immunopharmacol. 2008 Aug;8(8):1103-1111.
【非特許文献５４】The antinociceptive and anti-inflammatory activities of caulerpin, a bisindole alkaloid isolated from seaweeds of the genus Caulerpa. de Souza ET, de Lira DP, de Queiroz AC, da Silva DJ, de Aquino AB, Mella EA, Lorenzo VP, de Miranda GE, de Araujo-Junior JX, Chaves MC, Barbosa-Filho JM, de Athayde-Filho PF, Santos BV, Alexandre-Moreira MS. Mar Drugs. 2009 Nov 26;7(4):689-704.
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【非特許文献５７】Topoisomerase inhibitors developing in Japan. Furue H. Gan To Kagaku Ryoho. 1993 Jan;20(1):42-49.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、未だ治療方法が確立されていない成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等の、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療する組成物を提供することを目的とする。また本発明は、かかる組成物の有効成分として、ATL発症の主要因たるガン遺伝子産物Taxによって誘導される、HTLV-1感染細胞における恒常的なNF-κB活性化を抑制する作用、並びにIV型（遅延型）アレルギー反応を誘導する主要サイトカインであるTNF-αによって誘導されるNF-κB活性化を抑制する作用を有する環式セスキテルペン、並びにその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は上記課題を解決するため、成人Ｔ細胞白血病を誘発するTaxや、遅延型アレルギー反応を誘発し炎症性疾患の原因となるTNF-α（炎症性サイトカイン）が誘導するNF-κB過剰活性化（NF-κB過剰亢進）を抑制する作用を有する化合物を探索すべく鋭意検討を重ねていたところ、テルペンの中でも環式セスキテルペンであるβ−カリオフィレンに、(1)Tax導入細胞におけるNF-κB活性の抑制活性、(2)Tax分解誘導活性、及び(3)TNF-α添加細胞におけるNF-κB活性の抑制活性があることを見出し、さらに当該化合物には、(4) アポトーシス誘導活性があり、正常細胞と区別してATL細胞を特異的に生育阻害する作用があることを確認した。これらの知見から、本発明者は、β−カリオフィレン及びその薬学的に許容される塩は、NF-κB亢進抑制剤またはTax分解誘導剤として有用であるとともに、かかるNF-κB亢進抑制作用（Tax誘導性NF-κB亢進及びTNF誘導性NF-κB亢進に対する抑制作用、）及びTax分解誘導作用に基づいて、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患等の、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療する組成物の有効成分となりえると確信して、本発明を完成するに至った。
【００１８】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を包含するものである。
【００１９】
（Ｉ）NF-κB亢進抑制剤
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進抑制剤。
【００２０】
（II）Tax分解誘導剤
β-カリオフィレン又はその薬学上許容される塩を有効成分とする、Tax分解誘導剤。
【００２１】
（III）Tax誘導性／TNF誘導性・NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物
（III-1）β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物。
（III-2）上記NF-κB亢進がTax誘導性NF-κB亢進である、（III-1）に記載する組成物。
（III-3）上記NF-κB亢進がTNF誘導性NF-κB亢進である、（III-1）に記載する組成物。
（III-4）上記疾患が、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患である、（III-1）に記載する組成物。
（III-5）上記HTLV-1関連炎症性疾患が、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患からなる群より選択される少なくとも１種である、（III-4）に記載する組成物。
（III-6）ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）発症を抑制するために用いられる（III-4）に記載する組成物。
（III-7）上記成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）が急性型またはリンパ腫型ATLである（III-6）に記載する組成物。
（III-8）ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して投与される組成物であって、当該感染者が急性型またはリンパ腫型ATLに移行することを阻止する介入型のATL発症予防用組成物である、（III-4）に記載する組成物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明において有効成分として用いられるβ−カリオフィレンは、Tax誘導性NF-κB亢進およびTNF誘導性NF-κB亢進に対して抑制作用を有している。このため、かかる作用に基づいて、Tax誘導性NF-κB亢進またはTNF誘導性NF-κB亢進に起因して発症、誘導若しくは増悪する疾患や病態を予防したり、また改善することができる。
【００２３】
前述するように、成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫（ATL）は未だ有効な化学療法が確立しておらず、特に悪性度の高い急性型またはリンパ腫型ATLを発症した後は最も成績のよいmLSG15においても3年生存率は24％に満たない極めて予後の悪い疾患である。本発明によれば、HTLV-1ウイルス感染者（キャリアー）に対して、Taxの分解を誘導しNF-κBの亢進を抑制することで、急性型またはリンパ腫型ATLへの移行を阻止する介入型のALT発症予防用組成物を提供することができる。
またATL発症後は、本発明によれば、NF-κB過剰活性化が抑制できるためATL細胞の無秩序な増殖を阻止し、抗カルシウム血症や皮膚炎症症状などNF-κB過剰活性化を原因とする症状・病態を軽減することが可能になる。
【００２４】
TNF-αはマクロファージなどから産生され、IV型（遅延型）アレルギー反応を誘導する主要サイトカインとしてNF-κBの活性を亢進させ、炎症メディエーター（IL-1、IL-6、プロスタグランジンE2）の産生を促進し、上記アレルギー反応を誘発する。本発明によれば、その有効成分であるβ−カリオフィレンがTNF-αによるNF-κB活性亢進をも抑制するので、かかるIV型アレルギー反応を抑制することができるものと期待される。
【００２５】
またNF-κBの亢進は、喘息、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎といったＩ型アレルギー反応に起因する疾患の発症に直接または間接的に関与している（非特許文献１３〜１８）。喘息症状を誘発するサイトカインTSLP（thymic stromal lymphopoietin）はNF-κB活性化を受け、発現が誘導され、免疫応答反応を司るモノサイトはTSLPの刺激を受けリンパ球を遊走させるケモカインを分泌する。TSLPによる喘息症状の亢進は、ほ乳類共通の生体反応であり、ヒトおよびマウスで同様の喘息誘発機序が報告されている（非特許文献１６参照）。従って、β−カリオフィレンはNF-κB活性亢進によるTSLP分泌を抑制するので、これを有効成分とする本発明によれば、喘息症状を軽減することができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実験例で被験化合物として使用したモノテルペン（チモール、ペリルアルデヒド）、環式セスキテルペン（β−カリオフィレン、ゼランボン）の化学式を示す。
【図２】17-DMAG（陽性コントロール）、及び各種テルペン（チモール、ペリルアルデヒド、β−カリオフィレン、ゼランボン）について、（Ａ）Tax誘導性NF-κB活性化に対する抑制効果、及び（Ｂ）TNF誘導性NF-κB活性化に対する抑制効果を評価した結果を示す（実験例１）。
【図３】化合物非存在（図中の符合1）、DMSO（符合２）、陽性コントロールとして17-DMAG 3μM（符合３）、及び各種テルペン〔チモール 300μM（符合４）、ペリルアルデヒド300μM（符合５）、β−カリオフィレン300μM（符合６）、ゼランボン30μM（符合７）〕について、（Ａ）Tax誘導性NF-κB活性化に対する抑制効果、及び（Ｂ）Taxの細胞内安定性に与える影響を評価した結果を示す（実験例１）。
【図４】ATL細胞に対するモノテルペン類（チモール、ペリルアルデヒド、リモネン、γ-テルピネン、ミルセン）のアポトーシス誘導活性を評価した結果を示す。
【図５】ATL細胞（株化細胞C8166、MT4、ATL04）、Jurkat、そして正常ヒトリンパ球（PBL01、PBL02、PBL03）に対する17-DMAG（陽性コントロール）、及び各種テルペン（β−カリオフィレン、ゼランボン、チモール、ペリルアルデヒド、リモネン）のアポトーシス誘導活性を評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
β-カリオフィレンは、後述する実験例１および２に示すようにTax誘導性NF-κB亢進及びTNF誘導性NF-κB亢進を抑制する作用を有する。また実験例２に示すようにTaxを分解誘導する作用を有する。さらに実験例３に示すように、アポトーシス誘導活性を有し、正常リンパ球と区別して成人Ｔ細胞白血病（ATL）細胞を特異的に細胞死に至らしめる作用を有する。このため、β-カリオフィレンは、NF-κB亢進抑制剤やTax分解誘導剤の有効成分として、またTax誘導性NF-κB亢進またはTNF誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患を予防または治療するための組成物の有効成分として有用である。
【００２８】
本発明の「NF-κB亢進抑制剤」、「Tax分解誘導剤」、及び「NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物」（以下、これらを総称して「本発明品」という）は、いずれもかかるβ-カリオフィレン、又はその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とすることを特徴とする。
【００２９】
β-カリオフィレンは、下式で示される自体公知の化合物である。
【００３０】
【化１】
【００３１】
なお、当該化合物には、その異性体の別を問わず、下式（２）で示される（−）-β-カリオフィレン（(1R,1β,4E,9α)-4,11,11-トリメチル-8-メチレン-ビシクロ[7.2.0]ウンデカ-4-エン）及び下式（３）で示される（＋）-β-カリオフィレン（(1S,4E,9R)-4,11,11-トリメチル-8-メチレンビシクロ[7.2.0]ウンデカ-4-エン）の両方が含まれる。好ましくは（−）-β-カリオフィレンである。
【００３２】
【化２】
【００３３】
かかるβ-カリオフィレンは、高砂香料工業（株）、東京化成工業（株）、及び和光純薬工業（株）等から商業的に入手することができる。
【００３４】
本発明品において、β-カリオフィレンはフリーの形態であっても、またその薬学的に許容される塩もしくはエステル体の形態を有するものであってもよい。
【００３５】
ここで薬学的に許容される塩としては、無機塩基または有機塩基との塩、または塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。無機塩基としては。例えばナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩；カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩やアルミニウム塩を挙げることができる。また有機塩基としては、例えばエタノールアミンなどの第一級アミン；ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’-ジベンジルエチレンジアミンなどの第二級アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ピリジン、ピコリンなどの第三級アミンなどを挙げることができる。塩基性アミノ酸としては、例えばリジン、アルギニンおよびオルニチンなどを挙げることができる。
【００３６】
また、エステルとしては、例えばβ-カリオフィレン中のメチル基がカルボン酸とエステル化して形成されるβ-カリオフィレンのエステル化物を挙げることができる。具体的には、例えば、メチル基がカルボン酸とエステル化して形成される14-アセトキシ-β-カリオフィレン等を挙げることができる。
【００３７】
本発明品の有効成分として用いられる上記β-カリオフィレン、またはその塩若しくはエステル（以下、これらを総称して「β-カリオフィレン類」という）は、本発明の効果を損なわない限り、必ずしも精製品である必要はなく、粗精製品であってもよい。例えば、上記β-カリオフィレン類を含む天然物から加工して得られるβ-カリオフィレン類含有画分であってもよい。かかるβ-カリオフィレン類含有画分としては、シークワサー（Citrus depressa Hayata）、カーブチー（Citrus keraji var. kabuchii Hort, ex Tanaka）、オートー（Citrus oto Hort, Y Tanaka）、タロガヨ（Citrus tarogayo Hort. ex Y. Tanaka）、クネンボ（Citrus nobilis Lour. var.kunep Tanaka）、タンカン（Citrus tankan Hayata）の果皮から得られる精油を例示することができる。好ましくは、シークワサー果皮から得られる精油である。
【００３８】
本発明のNF-κB亢進抑制剤は、β-カリオフィレン類だけからなるものであってもよいが、通常、NF-κB亢進抑制作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。なお、ここでNF-κB亢進抑制作用は、後述する実験例１に記載するように、ルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイを組み合わせることで測定評価することができる。
【００３９】
また、本発明のTax分解誘導剤もβ-カリオフィレン類だけからなるものであってもよいが、通常、Tax分解誘導作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類に加えて、薬学的に許容される担体または添加剤を配合して調製される。なお、ここでTax分解誘導作用は、後述する実験例２に記載するように、免疫ブロット法により測定評価することができる。
【００４０】
これらの点から、本発明のNF-κB亢進抑制剤及びTax分解誘導剤は、β-カリオフィレン類を通常0.04〜4重量％、好ましくは0.1〜1重量％の割合で含むことが好ましい。
【００４１】
また、本発明のTax誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物（以下、単に「本発明組成物」ともいう）は、Tax誘導性NF-κB亢進抑制作用または／およびTNF誘導性NF-κB亢進抑制作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類に加えて、通常、薬学的に許容される担体若しくは添加剤、または可食性成分を配合して調製される。ここでTax誘導性NF-κB亢進抑制作用およびTNF誘導性NF-κB亢進抑制作用は、前述するように、実験例１に記載するルシフェラーゼアッセイとβ−ガラクトシダーゼアッセイから測定評価することができる。さらに、本発明組成物は、成人Ｔ細胞白血病（ATL）細胞に対してアポトーシス誘導作用を発揮する有効量のβ-カリオフィレン類を含有することが好ましい。アポトーシス誘導作用は、後述する実験例３に記載するように、Caspase3/7アッセイとCCK-8アッセイを組み合わせることで測定評価することができる。
【００４２】
かかる点から、本発明組成物は、β-カリオフィレン類を通常4〜99重量％、好ましくは1〜80重量％の割合で含むことが望ましい。
【００４３】
本発明組成物が対象とするTax誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患としては、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）を挙げることができる。成人Ｔ細胞白血病/リンパ腫（ATL）は未だ有効な化学療法が確立していない予後の悪い疾患である。このため、HTLV-1ウイルス感染者（キャリアー）に対しては急性型・リンパ腫型への移行を阻止する介入型の発症予防的治療が最善の策と考えられる。感染初期においてキャリアーの体内にあるHTLV-1感染細胞はT細胞全体の割合に比べそれほど高くなく、感染細胞のクローナリティーも非常に多様（ポリクローナル）である。この様な初期感染形態からTaxによるNF-κB過剰活性化を受け、50年以上の年月を経てごく一部の感染細胞がオリゴクローナルもしくはモノクローナルに増殖し、ATL臨床例の初期段階であるくすぶり型・慢性型ATLを発症する。ATL発症ハイリスクキャリアーが峻別されれば、その様なキャリアーは予防的にβカリオフィレンを含む本発明組成物を摂取し、TaxによるNF-κB過剰活性化を抑制し、ATL発症に対して介入的予防効果を得ることが期待される。また発症後もNF-κB過剰活性化を抑制できればATL細胞の無秩序な増殖を阻止し、抗カルシウム血症や皮膚炎症症状などNF-κB過剰活性化の影響とみられる症状の軽減が期待される。つまり、本発明組成物は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）発症を抑制するために好適に用いることができる。このため、本発明組成物には、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）の発症を予防し、または発症後の症状緩和・改善することを目的とする医薬組成物、および飲食物組成物（機能性食品、特定保健用途食品、健康補助食品、栄養補助食品、病人食などが含まれる）が含まれる。好ましくは医薬組成物である。
【００４４】
また本発明組成物が対象とするTNF誘導性NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患としては、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患を挙げることができる。HTLV-1関連炎症性疾患としては、具体的には、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患を例示することができる。このため、本発明組成物には、HTLV-1関連炎症性疾患の発症を予防し、または発症後の症状緩和・改善することを目的とする医薬組成物、および飲食物組成物（機能性食品、特定保健用途食品、健康補助食品、栄養補助食品、病人食などが含まれる）が含まれる。好ましくは医薬組成物である。
【００４５】
これら本発明組成物を含む本発明品の投与方法として、経口投与、ならびに静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経粘膜投与、経皮投与、および直腸内投与等の非経口投与を挙げることができる。好ましくは経口投与、静脈内投与、及び経皮投与であり、より好ましくは経口投与である。本発明の製剤は、かかる投与方法に応じて、種々の形態の製剤（剤型）に調製することができる。以下に、各製剤（剤型）について説明するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種剤型を用いることができる。
【００４６】
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤を挙げることができ、これらの中から適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００４７】
また、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を行う場合の剤型として、注射剤または点滴剤（用時調製の乾燥品を含む）等があり、適宜選択することができる。
【００４８】
また、経粘膜投与、経皮投与、または直腸内投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、パッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適応場所に応じて適宜選択することができる。また、それらの製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
【００４９】
本発明の製剤にはその剤形（経口投与または各種の非経口投与の剤形）に応じて、薬学的に許容される担体および添加剤を配合することができる。薬学的に許容される担体及び添加剤としては、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤が挙げられる。以下に、医薬上許容される担体および添加剤の具体例を列挙するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５０】
溶剤としては、精製水、滅菌精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類（例えばバレイショデンプン、コムギデンプン、トウモロコシデンプン）、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。
【００５１】
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体（たとえばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。
【００５２】
滑沢剤としては、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸およびその塩類（たとえばステアリン酸マグネシウム）、タルク、ワックス類、コムギデンブン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、シリコン油等を挙げることができる。
【００５３】
崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロースおよびその誘導体、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。
【００５４】
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。
【００５５】
粘稠剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリピニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【００５６】
乳化剤は、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、レシチン、各種界面活性剤（たとえば、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム）等を挙げることができる。
【００５７】
安定剤としては、トコフェロール、キレート剤（たとえばＥＤＴＡ、チオグリコール酸）、不活性ガス（たとえば窒素、二酸化炭素）、還元性物質（たとえば亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ロンガリット）等を挙げることができる。
【００５８】
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。
【００５９】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤こしては、局所麻酔剤（塩酸プロカイン、リドカイン）、ペンジルアルコール、ブドウ糖、ソルビトール、アミノ酸等を挙げることができる。
【００６０】
矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。
【００６１】
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール、デヒドロ酢酸、ホウ酸、等を挙げることができる。
【００６２】
コーティング剤としては、白糖、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、メチルメタアクリレート−メタアクリル酸共重合体および上記記載した高分子等を挙げることができる。
【００６３】
基剤としては、ワセリン、流動パラフィン、カルナウバロウ、牛脂、硬化油、パラフィン、ミツロウ、植物油、マクロゴール、マクロゴール脂肪酸エステル、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ベントナイト、カカオ脂、ウイテップゾール、ゼラチン、ステアリルアルコール、加水ラノリン、セタノール、軽質流動パラフィン、親水ワセリン、単軟膏、白色軟膏、親水軟膏、マクロゴール軟膏、ハードファット、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性碁剤等を挙げることができる。
【００６４】
なお、上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書にいうＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤である。
【００６５】
本発明の製剤の経口投与量としては、β-カリオフィレンの量に換算して1〜10mg/kgの範囲で適宜調整することができる。静脈内投与をする場合、β-カリオフィレンの有効血中濃度が0.01〜1000μg/mL、より好ましくは0.02〜100μg/mLの範囲となるような投与量を挙げることができる。なお、これらの投与量は、年齢、性別、体型等により変動し得る。
【実施例】
【００６６】
以下、実験例により本発明及びその効果をより詳細に説明する。但し、本発明は、かかる実験例になんら制限されるものではない。
【００６７】
実験例１
ヒトT細胞白血病ウイルス(HTLV-1)が産生するガン遺伝子産物Taxは、難治性の白血病・リンパ腫である成人T細胞白血病（adult T-cell leukemia：ATL）発症に必須の細胞不死化やATL患者で頻繁に観察される高カルシウム血症や皮疹などの原因となるNF-κB過剰活性（Tax誘導性NF-κB亢進）を誘導する。このTax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果を検討するため、既にTax分化誘導とNF-κB抑制効果が確認されている分子シャペロン阻害剤17-DMAG（陽性コントロール）と共に、環式セスキテルペンに該当するβカリオフィレン及びゼランボン、並びにモノテルペンに該当するペリルアルデヒド及びチモール（図２）について、Tax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果を調べた。
【００６８】
（１）実験方法
（1-1）細胞と細胞培養法
ヒト胎児腎由来HEK293細胞（以後、「293細胞」という）は、10% FBS、2mM L-グルタミン、Penicillin-Streptomycin（PC/SM）を添加したDulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）（以下、この培地を「DMEM」という）を培養液とし、25cm2培養フラスコ内で37℃、5％CO2で維持、3日ごとに全体の1/10量の細胞を継代に使用した。
【００６９】
トランスフェクション実験用細胞は、下記（a）〜（c）の方法で調製し、得られたプレートを遺伝子導入実験に使用した：
（a）ほぼコンフルエントに293細胞が増殖した継代培養フラスコからDMEMを吸引除去し、PBS 5mLで１回洗浄。
（b）トリプシンおよび1mM EDTA含有PBS 1.5mLを加え5分静置後、ピペットにて293細胞をフラスコ底部から遊離・懸濁し、10%FBS、L-グルタミン、PC/SM添加DMEMを15mL加え更に懸濁。
（c）12ウェルプレートの各ウェルに、0.6mLずつ細胞懸濁培養液を移し(5x104/well)、〜60%コンフルエントになるまで培養（約一晩）。
【００７０】
（1-2）プラスミドの調製
NF-κB結合配列を有し、NF-κB依存的にホタルルシフェラーゼの転写・翻訳を誘導するベクター NF-κB-luc（Dr. M. Lienhard Schmitz. Department of Immunochemistry, German Cancer Research Center, Im Neuenheimer Feld 280, 69120 Heidelberg, Germany.より入手）をNF-κB活性化を測定するためのリポータープラスミドとして、また、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター依存的にβガラクトシダーゼを発現するRSV-βgal（Dr. Kuan Teh Jeang, Molecular Virology Section, Laboratory of Molecular Microbiology, NIAID, the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.より入手）をトランスフェクションモニターとして、それぞれ使用した。さらにTax遺伝子導入実験系においては、SV40プロモーター及びβグロビンイントロン依存的にTaxを発現するpSG5-Taxか、HTLV-1 LTR依存的にTaxタンパク質を発現するベクターpLTR-Tax（Iha, H.,未発表）を用いた。
【００７１】
（1-3）トランスフェクションおよびテルペン類の投与
Tax遺伝子導入実験系では、（1-1）で調製したトランスフェクション実験用細胞に、NF-κB-luc(0.05μg)、pRSV-βgal(0.05μg)、ベクターpSG5-Tax（またはpLTR-Tax）および、対照群としてpSG5（Agilent）を0.25μg、またTNF-α投与実験系では、（1-1）で調製したトランスフェクション実験用細胞に、NF-κB-luc(0.05μg)、pRSV-βgal(0.05μg)、およびpcDNA3(Invitrogen) (0.25μg)を、それぞれ導入(トランスフェクション)した。
【００７２】
具体的には、Fugene-HD（Roche）をプラスミド：Fugene-HD =1:3となるよう調整後、DMEM 100μLと混合し、15分間室温で静置。これを各プラスミドDNA溶液と混合し15分間室温で静置した後、5% FBS含有DMEM 500μLと混合し、DNAトランスフェクション混合液600μLを培地を除去した12ウェル細胞培養用プレートのトランスフェクション実験用細胞(〜60%コンフルエント)上に、細胞が剥離しないように注意しながら静かに流し入れ、トランスフェクション操作を行なった。翌朝これに5% FBS含有DMEMを0.4mL加え、トランスフェクション操作から20時間後に、被験化合物（分子シャペロン阻害剤の17-DMAG、βカリオフィレン、ゼランボン、ペリルアルデヒド、またはチモール）を、また無添加対照群には等量（５μL）のDMSOを加えた。Tax遺伝子導入実験系では、さらに24時間後（トランスフェクション操作から44時間後）に細胞をPBS 1mLで2度洗浄し、1mM EDTA含有PBS 0.8mLで底面から遊離した細胞をピペットで懸濁し1.5ｍLマイクロチューブに回収、3,000Gx2分で細胞をペレットにし（マイクロチューブを冷却遠心機(Centrifuge 5415R, eppendorf)にて遠心分離(6000rpm、2min、20℃)）、ルシフェラーゼアッセイに供した。また、TNF投与実験系では、トランスフェクション操作(全てpSG5対照ベクターを使用)から20時間後に各被験化合物を添加し、その16時間後にDMEM 100μLに溶解したTNF-α(ProSpec)を、最終濃度が20ng/mLになるように加え8時間反応後（トランスフェクション操作から4４時間後）に、細胞をPBS 1mLで2度洗浄し、1mM EDTA含有PBS 0.8mLで底面から遊離した細胞をピペットで懸濁し1.5ｍLマイクロチューブに回収、3,000Gx2分で細胞をペレットにし、ルシフェラーゼアッセイに供した。
【００７３】
1mM EDTA含有PBS 0.8mLを吸引除去後、細胞ペレット入りのマイクロチューブは氷上で冷却した。細胞ペレットはLysis Buffer (Applied Biosystems) 100μlで溶解後ピペットで攪拌し、遠心操作(13,200rpm、5min、4℃)で不溶沈殿物をチューブ底面に分離後、上清（細胞溶解液）をルシフェラーゼアッセイ及びβ-ガラクトシダーゼアッセイに供した。
【００７４】
（1-4）ルシフェラーゼ及びβ-ガラクトシダーゼアッセイ
96ウェルプレートの各ウェルに細胞溶解液を5μLずつ分注し、直ちにルシフェラーゼアッセイ用基質Luciferase Assay Substrate (Promega)50μLまたはβ-ガラクトシダーゼアッセイ用基質Galacto-Star: Galacto-Star Reaction Buffer Diluent(Applied Biosystems) 1:50混合液基質を自動分注し、発光強度を測定するルミノメーター(GloMax-96 Microplate Luminometer、Promega)で解析した。
【００７５】
（1-5）ＮＦ-κＢ活性の定量解析
ＮＦ-κＢ活性（%）は、最低3回の同一実験から得られたルシフェラーゼアッセイ測定値をβ-ガラクトシダーゼアッセイ測定値で割り標準化した後、平均値±SDで示した。トランスフェクション操作から24時間後にコントロール用にPBSを加えた細胞のルシフェラーゼ値及びβ-ガラクトシダーゼ値を常に基準値（100%）とし、それに対する相対値から各細胞のNF-κB活性を算出した。
【００７６】
（２）実験結果
Tax遺伝子導入実験系における各被験化合物のNF-κB抑制効果（IC50）は、17-DMAG（177 nM）、βカリオフィレン（225μM）、ゼランボン（16.7μM）、ペリルアルデヒド（133μM）、チモール（352μM）であった（図３（Ａ））。一方、TNF-α投与実験系における各被験化合物のNF-κB抑制効果（IC50）は、17-DMAG（191 nM）、βカリオフィレン（211μM）、ゼランボン（17.7μM）、ペリルアルデヒド（197μM）、チモール（300μM）であった（図３（Ｂ））。
【００７７】
実験例２
実験例１で示されたTax誘導性NF-κB亢進に対する抑制効果の作用機序を検討するため、Tax遺伝子導入系における３種類の蛋白質（Tax、I-κB、Tubulin）の細胞内安定性について免疫ブロット法（WB）用いて検討した。なお、I-κBの分解はNF-κB活性化と逆相関関係にあり、またTubulinの減少は細胞の死滅と相関関係にあることが知られている。
【００７８】
（１）実験方法
細胞のトランスフェクション、テルペン類の投与と細胞の回収、溶解、ルシフェラーゼ活性の測定までは、上記実験例１と全く同様の方法で行った。
【００７９】
（1-1）免疫ブロット法
ルシフェラーゼ活性測定後の細胞融解液は、超音波処理により核染色体DNAを分解後、Protein Assay Kit (Bio-Rad)にて、蛋白質濃度を測定した。各細胞融解液を10μgずつ、βメルカプトエタノール入りSDSサンプルバッファと4:1の容量比で混和し、95℃で５分加熱処理後SDS-PAGEで泳動・展開後、半乾式蛋白転写法を用いてPVDF-membrane（Millipore）に転写し、抗Tax抗体（田中勇悦博士、琉球大学医学部免疫学講座より入手）、抗I-κB（Cell Signaling Technology）、抗Tubulin（Sigma）を用いて、それぞれの発現量を検出した。
【００８０】
（２）実験結果
結果を図４に示す。対照群（図４（Ａ）レーン１）に対してTax遺伝子導入群はNF-κBの活性が20.4倍増加した（図４（Ａ）レーン２）。その様な条件に、テルペン類を加えると以下のようにNF-κBの活性が抑制された。17-DMAG：3μM（1.2、5.9%）（図４（Ａ）レーン３）、βカリオフィレン: 300 μM（4.2、20.6%）（図４（Ａ）レーン６）、ゼランボン: 30 μM（3.5、17.2%）（図４（Ａ）レーン７）、ペリルアルデヒド: 300 μM（6.7、32.8%）（図４（Ａ）レーン５）、チモール: 300 μM（12.6、61.8%）、（図４（Ａ）レーン４）。図４（Ｂ）に、その際の上記３種類の蛋白質分子（Tax、I-κB、Tubulin）の発現を示す。
【００８１】
この結果からわかるように、対照群ではTaxの発現は無く、I-κBとTubulin共に発現が確認された（図４（Ａ）レーン１）。それに対しTax遺伝子導入群ではTaxの発現があり、それに伴いI-κBの発現が抑えられ（分解が誘導され）、Tubulinの発現に変化はない（図４（Ａ）レーン２）。17-DMAGでは、既に報告しているように（特開2009-243900号公報）、Taxの分解誘導とNF-κB抑制活性が認められた（図４（Ａ）レーン２）。被験化合物のうち、17-DMAGと同様にTaxの分解誘導とNF-κB抑制活性（I-κB分解の抑制）を示すのはβカリオフィレン（図４（Ａ）レーン６）だけでであった。ペリルアルデヒドはI-κB分解を抑制する活性はあるものの、Taxの分解誘導活性は低かった（図４（Ａ）レーン５）。チモールは双方の活性とも明確には示されず（図４（Ａ）レーン４）、またゼランボンによるルシフェラーゼ値の抑制は、細胞毒性によって細胞が死滅したことによるものと考えられた（図４（Ａ）レーン７）。
【００８２】
実験例３
上記実験例１及び２で示されたβカリオフィレン及びその他のテルペン類による、抗Tax・抗NF-κB効果が、果たして末梢血リンパ球（PBL）にはあまり影響を与えず、ATL細胞対して特異的にアポトーシス若しくは増殖の抑制を誘導するか、キャスパーゼ活性（Caspase3/7アッセイ）並びに細胞増殖活性（CCK-8アッセイ）にて検討した。
【００８３】
（１）実験方法
（1-1）細胞と細胞培養法
ATL患者由来リンパ球（ATL4、ATL9：大分大学医学部第２内科緒方正男講師より分与）及びATL細胞株C8166、MT4そして急性Tリンパ芽球性白血病株Jurkat（Dr. Kuan Teh Jeang, Molecular Virology Section, Laboratory of Molecular Microbiology, NIAID, the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA.より入手）、ヒト正常リンパ球（PBL、大分大学医学部微生物学講座ボランティアより取得）は、10% FBS、2mM L-グルタミン、Penicillin-Streptomycin（PC/SM）を添加したRoswell Park Memorial Institute（RPMI1640、Gibco）を培養液とし、75cm2培養フラスコ内で37℃、5％CO2で維持、3日ごとに全体の1/10量の細胞を継代に使用した。必要に応じてIL-2を10ng/mL添加した。
【００８４】
（1-2）Caspase3/7アッセイ
上記ATL患者若しくは健常人由来リンパ球を5x105/mLのRPMI1640細胞懸濁液とし、12ウエルプレートに分注後、各被験化合物（17-DMAG、βカリオフィレン、ゼランボン、ペリルアルデヒド、チモール、リモネン、γ-テルピネンまたはミルセン）をそれぞれ図５の横軸に示す濃度（mM）になるように（5μL）、また無添加対照群には被験化合物に代えて等量（５μL）のDMSOを加えて培養した。培養開始から24、48、72、96または120時間後に50μLの細胞懸濁液を3サンプル分96ウエルプレートに分取し、25μLのCaspase-GloTM 3/7 Assay液（Promega）を加え、30分後にGloMax-96 Microplate Luminometerで発光量を測定した。
【００８５】
（1-3）CCK-8アッセイ
上記（1-2）と同様に細胞懸濁液に各化合物を添加、一定時間毎に細胞懸濁液50μLを3サンプル分、96ウエルプレートに分取し、25μLのCell Counting Kit-8（CCK-8）溶液を加え、30分後にMolecular Devices E MAXで450ｎmの吸光度を測定した。
【００８６】
（1-4）アポトーシス誘導強度(IAI: Intensity of Apoptosis Inductivity)の数値化
細胞死の誘導は大きく分けて３種類（１．アポトーシス、２．オートファジー、３．ネクローシス）あり、２と３は必ずしもカスパーゼの活性化（Caspase3/7アッセイ）を伴わない。ATL治療に求められるのはATL細胞特異的に積極的なアポトーシスを誘導させる作用であり、正常なリンパ球をアポトーシス誘導することは好ましくない。また、通常行われる細胞生存率試験はミトコンドリアの呼吸能の活性をホルマザン色素の濃淡（CCK-8アッセイ）で表しているが、この数値からは細胞死が上記３種類の何れによって誘導されているか見分けがつかない。
【００８７】
そこで、この実験ではアポトーシスによる細胞生存率の低下を鋭敏に定量化するため、ATL細胞及びリンパ球にそれぞれ各被験化合物を投与した後、一定時間経過した細胞懸濁液のCaspase3/7値とCCK-8値を同時に計測し、前者を分子、後者を分母にして数値化（アポトーシス誘導強度: IAI）した。即ちアポトーシスのシグナルが強いほど、生存細胞数が少ないほど数値は大きくなる。
［数１］
アポトーシス誘導強度（IAI） ＝ Caspase3/7値 ／ CCK-8値
【００８８】
（２）実験結果
ATL細胞（株化細胞C8166、MT4、ATL04）、Jurkat、そして正常ヒトリンパ球（PBL01、PBL02、PBL03）に対する各被験化合物のアポトーシス誘導活性をCapase3/7キットにて測定した結果を、図５に示す。これらの値は全て被験化合物投与後24時間の時点で計測した値である。ペリルアルデヒドは0.2mMから、チモール、リモネン、及びγテルピネンはいずれも0.3mMから有意なアポトーシス誘導活性を示し、特にリモネン及びγテルピネンは1mMでATL細胞並びにJurkatに対して顕著なアポトーシス誘導効果を示した。以上４種のモノテルペン（ペリルアルデヒド、チモール、リモネン、γ-テルピネン）は何れも正常ヒトリンパ球であるPBLに対してはアポトーシスを誘導しなかった。一方、モノテルペンのうちミルセンは明確な効果は認められなかった。
【００８９】
次に、ATL細胞（株化細胞C8166、MT4）と正常ヒトリンパ球（PBL01、PBL02）に対する各種テルペン類（βカリオフィレン、ゼランボン、チモール、ペリルアルデヒド）のIAI（Intensity of Apoptosis Industry）を計測した。結果を図６に示す。図６の結果から、各被験化合物のATL細胞に対するIAI最大値、PBL細胞に対するIAI最大値を求め、PBL細胞に対するIAI最大値に対するATL細胞に対するIAI最大値を算出し、ATL細胞への特異性を評価した。結果を、表１に示す。
【００９０】
【表１】
【００９１】
これからわかるように、βカリオフィレンが最も特異性高くATL細胞にアポトーシスを誘導していることが確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進抑制剤。
【請求項２】
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物。
【請求項３】
上記疾患が、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患である、請求項２に記載する組成物。
【請求項４】
上記HTLV-1関連炎症性疾患が、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載する組成物。
【請求項５】
ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）発症を抑制するために用いられる、請求項３に記載する組成物。
【請求項１】
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進抑制剤。
【請求項２】
β-カリオフィレン、またはその薬学上許容される塩若しくはエステルを有効成分とする、NF-κB亢進に起因して発症または増悪する疾患の予防または治療用組成物。
【請求項３】
上記疾患が、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連炎症性疾患である、請求項２に記載する組成物。
【請求項４】
上記HTLV-1関連炎症性疾患が、高カルシウム血症、HTLV-1関連ブドウ膜炎、皮疹、関節リュウマチ、間質性肺炎、Tリンパ球性肺胞炎、多発性筋炎、非特異的リンパ節炎、感染性皮膚炎、悪性腫瘍、及びI又はII型アレルギー反応を伴う炎症性疾患からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載する組成物。
【請求項５】
ヒトＴ細胞白血病ウイルス感染者に対して、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ATL）発症を抑制するために用いられる、請求項３に記載する組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−７７００２（Ｐ２０１２−７７００２Ａ）
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２０４８６（Ｐ２０１０−２２０４８６）
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（３０４０２８７２６）国立大学法人 大分大学 (181)
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１９日（２０１２．４．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（３０４０２８７２６）国立大学法人 大分大学 (181)
【出願人】（５０４１４５３０８）国立大学法人 琉球大学 (100)
【Ｆターム（参考）】
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