Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原および界面活性剤の両方を含むワクチンの製造
【課題】非イオン性界面活性剤を含有する組み合わせワクチン用に、製造方法において界面活性剤を別の成分として添加する必要がない方法を提供する。
【解決手段】組み合わせワクチンにおいて使用するためのＨＢｓＡｇを調製する際に、ＨＢｓＡｇを精製した後に非イオン性界面活性剤を添加することは知られている。しかし、ＨＢｓＡｇの精製後に界面活性剤を添加することは最適ではない。それは、製造中に別の処理ステップを必要とするからである。したがって本発明は、ＨＢｓＡｇの精製中に界面活性剤を使用する。
【解決手段】組み合わせワクチンにおいて使用するためのＨＢｓＡｇを調製する際に、ＨＢｓＡｇを精製した後に非イオン性界面活性剤を添加することは知られている。しかし、ＨＢｓＡｇの精製後に界面活性剤を添加することは最適ではない。それは、製造中に別の処理ステップを必要とするからである。したがって本発明は、ＨＢｓＡｇの精製中に界面活性剤を使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用するすべての文書は、その全容を参照によって組み込む。
【０００２】
本発明は、２つ以上の病原体由来の混合型免疫原を含むワクチンであり、したがってそのワクチンの投与が２つ以上の病原体に対して対象を同時に免疫処置することができる、組み合わせワクチンの製造の分野にある。詳細には本発明は、組み合わせワクチンの製造における界面活性剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２種以上の病原性生物由来の抗原を単一用量中に含むワクチンは、「多価」または「混合」ワクチンとして知られている。ジフテリア、破傷風および百日咳に対する防御用の３価ワクチン（「ＤＴＰ」ワクチン）ならびに麻疹、おたふく風邪および風疹に対する防御用の３価ワクチン（「ＭＭＲ」ワクチン）を含めた、ヒトに使用するための様々な組み合わせワクチンが欧州および米国において承認されている。
【０００４】
組み合わせワクチンには患者にとって受ける注射の回数が少なくなるという利点があり、特に小児予防接種に関して、これはコンプライアンスが高まるという臨床上の利点をもたらす（例えば、参考文献１の２９章を参照）。しかし同時に、組み合わせワクチンは、抗原と他の成分の間の物理的および生化学的不適合性、免疫学的干渉、および安定性を含めた要因による製造上の難点を示す。
【０００５】
ワクチンに非抗原成分を含有させることは必要であるが、困難を引き起こす可能性がある。界面活性剤は組み合わせワクチンにおいて特に問題である。それは、ある抗原は最適活性のために界面活性剤を必要とする可能性があるが、別の抗原は界面活性剤が存在すると負の影響を受ける可能性があるからである。さらに、界面活性剤が一般に安全であると認められていても、小児ワクチンに界面活性剤を含有させることはある患者群にとって問題である。
【０００６】
ワクチン分野で特に興味深いのは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、特にポリソルベート２０（「Ｔｗｅｅｎ２０」またはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしても知られている）およびポリソルベート８０（「Ｔｗｅｅｎ８０」またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られている）種である。ポリソルベート２０は１価ＨＡＶＲＩＸ（商標）Ａ型肝炎ワクチンにおいて見られ、ポリソルベート８０はＴＲＩＰＥＤＩＡ（商標）およびＩＮＦＡＮＲＩＸ（商標）系のワクチンなどの組み合わせワクチンにおいて見られる。これら２つの界面活性剤は、液状ロタウイルスワクチンを安定化させるためにも使用されている［２］。
【０００７】
ポリソルベートはＢ型肝炎表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）を含む組み合わせワクチンの製造においても使用されており、例えば参考文献３（特許文献１）および４（特許文献２）は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの非イオン性界面活性剤を添加することによってＨＢｓＡｇのリン脂質成分への干渉が回避されている、４価Ｄ−Ｔ−Ｐ−ＨＢｓＡｇワクチンを作製するための方法を開示する。参考文献３（特許文献１）および４（特許文献２）の図２（本明細書の図１）中のデータから、界面活性剤はＨＢｓＡｇの抗原性を維持するために必要とされるが、他の成分にはそれほど重要でないことが示される。試験された最高界面活性剤濃度はＨＢｓＡｇ２０μｇ／ｍｌに対して１０μｇ／ｍｌであり、この濃度はまた、最良の抗原性を示した。
【０００８】
参考文献３（特許文献１）および４（特許文献２）の方法では、ＨＢｓＡｇを精製した後に非イオン性界面活性剤が添加される。しかし、ＨＢｓＡｇの精製後に界面活性剤を添加することは最適ではない。それは、製造中に別の処理ステップを必要とし、それにより処理時間が増大し、ＨＢｓＡｇが汚染されるリスクも高まるからである。組み合わせワクチンの作製時に汚染成分が使用されると、１価ワクチンの作製時より最終的な損失は大きく、例えば汚染ＨＢｓＡｇ成分が清潔なＤ−Ｔ−Ｐ成分と混合されると、ＨＢｓＡｇのみでなくＤ−Ｔ−Ｐ−ＨＢｓＡｇ混合物全体を廃棄しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／０５５１０５号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００４８３３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、非イオン性界面活性剤を含有する組み合わせワクチン用に、製造方法において界面活性剤を別の成分として添加する必要がない方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
抗原を精製した後に非イオン性界面活性剤を抗原に添加する［３、４］のではなく、本発明は抗原の精製中に非イオン性界面活性剤を使用する。したがって、この界面活性剤は最終組み合わせワクチンにおいてその機能を果たすことができるが、汚染のリスク（したがって、調製後の組み合わせワクチン全体の損失のリスクも）は低下する。
【００１２】
したがって本発明は、組み合わせワクチンを調製するための方法であって、ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、（ｉ）組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊して精製ＨＢｓＡｇ成分を得るステップを含む、酵母細胞からＨＢＶ表面抗原を精製すること、および（ｉｉ）精製ＨＢｓＡｇ成分を非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて組み合わせワクチンを得ることを含む方法を提供する。
【００１３】
前に記載した汚染の難点を回避するために、この方法は、ＨＢｓＡｇ精製後に非イオン性界面活性剤を別の成分として添加するステップを含まない。界面活性剤（または他の界面活性剤、イオン性または非イオン性）が、組み合わせワクチンを得るためにＨＢｓＡｇと組み合わせる他の抗原成分中に存在する可能性はあるが、それ自体を別の成分として界面活性剤を添加することは回避される。したがって、界面活性剤は、別の成分として精製ＨＢｓＡｇ成分に添加されず、抗原を組み合わせる際には添加されない。
【００１４】
本発明は、組み合わせワクチンを調製するための方法であって、ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、精製ＨＢＶ表面抗原を非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて組み合わせワクチンを得るステップを含み、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって精製ＨＢＶ表面抗原が調製される方法も提供する。再度、界面活性剤の別個の添加は回避される。
【００１５】
本発明は、（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによってＨＢＶ表面抗原が調製される、免疫原性組成物も提供する。再度、界面活性剤の別個の添加を回避しながらＨＢｓＡｇを調製した。この生成物は、精製中に使用する非イオン性界面活性剤がＨＢｓＡｇ粒子中に保持される可能性があるので、異なる方法によってＨＢｓＡｇを調製した生成物と区別することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
非イオン性界面活性剤
本発明は、様々な非イオン性界面活性剤［５］、詳細にはワクチン製剤において見られる非イオン性界面活性剤を使用することができる。有機界面活性剤が好ましい。これらは典型的には、アルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシド）と、高級アルコール、脂肪酸、アルキルフェノール、アルキルアミン、または少なくとも１つの活性水素原子を有する他の適切な化合物との反応生成物である。大部分の界面活性剤に関して、最も一般的なアルコール、アミンおよび酸はＣ８〜Ｃ１８の範囲の炭素鎖長を有する。最も一般的なアルキルフェノールは、ノニルフェノールおよびオクチルフェノールである。ポリ（オキシエテン）残基を含む界面活性剤が特に好ましい。
【００１７】
例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変わり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されるポリオキシエチレン脂肪族エーテル、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；およびソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮと呼ばれる）、例えばソルビタントリオレート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートだけには限られないが、これらを含めた界面活性剤と共に本発明を使用することができる。
【００１８】
本発明は、ポリソルベート２０と共に使用するのに特に適している。この界面活性剤は、ワクチン内を含めてヒトへの投与に関する立証済みの安全性プロファイルを有する。
【００１９】
界面活性剤はその「ＨＬＢ」（親水／親油平衡）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。
【００２０】
非イオン性界面活性剤は、本発明の組成物の成分である。患者への多用量の界面活性剤の投与を回避するために、組成物中の界面活性剤の濃度は３０μｇ／ｍｌを超えず、例えば２５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下などであることが好ましい。１０μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００２１】
界面活性剤の濃度を特定するための代替として、組成物中の界面活性剤の量は、ＨＢｓＡｇ各１００μｇに対して５０μｇ未満（例えば４０μｇ以下、３０μｇ以下、２５μｇ以下、２０μｇ以下、１５μｇ以下、１０μｇ以下など）であることが好ましい。参考文献３および４から、界面活性剤：ＨＢｓＡｇの質量比が５０％未満であることも示唆される。ＨＢｓＡｇ１００μｇ当たり２５μｇ未満の界面活性剤が好ましい。
【００２２】
以下でさらに詳細に言及するように、本発明の好ましい方法は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含む予め混合した成分を使用する。このＤ−Ｔ成分は非イオン性界面活性剤を実質的に含まず、および詳細にはポリソルベート２０および８０を含まないことが好ましい。同様に、予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分は非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０および８０を含まない。
【００２３】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス肝炎を引き起こす既知の因子の１つである。ＨＢＶビリオンは外側タンパク質コートまたはカプシドに囲まれた内部コアからなり、ウイルスコアはウイルスＤＮＡゲノムを含む。カプシドの主な成分は、典型的には約２４ｋＤａの分子量を有する２２６アミノ酸ポリペプチドである、ＨＢＶ表面抗原、またはより一般的に「ＨＢｓＡｇ」として知られるタンパク質である。ＨＢｓＡｇを含むすべての既存のＢ型肝炎ワクチンは、この抗原を通常なワクチンに投与すると、それはＨＢＶ感染に対して防御する抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。
【００２４】
ワクチン製造用に、ＨＢｓＡｇは２つの方法で作製することができる。第１の方法は、ＨＢＶ感染中に多量のＨＢｓＡｇが肝臓中で合成され血流中に放出されるので、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から粒子形に抗原を精製することを含む。第２の方法は、組換えＤＮＡ法によってタンパク質を発現させることを含む。本発明の方法と共に使用するためのＨＢｓＡｇは、酵母細胞中で組換えによって発現される。適切な酵母菌には、サッカロミセス属（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）またはハネンズラ属（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ）（Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）など）宿主がある。
【００２５】
天然ＨＢｓＡｇと異なり（すなわち、血漿精製産物中と同様に）、酵母菌によって発現されるＨＢｓＡｇは一般にグリコシル化されておらず、これは本発明と共に使用するためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。酵母菌によって発現されるＨＢｓＡｇは非常に免疫原性が高く、血液産物の汚染のリスクなしで調製することができる。
【００２６】
ＨＢｓＡｇは一般に、リン脂質を含む脂質マトリクスを含む、実質的に球状の粒子の形（約２０ｎｍの平均径）であるはずである。酵母菌によって発現されるＨＢｓＡｇ粒子は、天然のＨＢＶビリオン中に見られないホスファチジルイノシトールを含み得る。粒子は免疫系を刺激するために無毒量のＬＰＳも含み得る［６］。
【００２７】
ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ亜型ａｄｗ２に由来することが好ましい。
【００２８】
ＨＢｓＡｇを精製するための多くの方法が当技術分野で知られている（例えば、参考文献７〜３３を参照）。これらの方法は１価ＨＢｓＡｇ調製物を作製する際に使用するために開示されるが、参考文献３および４中に開示された方法と異なり、これらはいずれも、特に組み合わせワクチンにおいて使用するためのＨＢｓＡｇの精製に関するものではない。これらの方法および他の方法のいずれかを使用することができ、ただし、この方法は、組換え酵母細胞中での発現後の抗原を精製するのに適しており、この精製は、酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するステップを含む。
【００２９】
ＨＢｓＡｇを精製するのに好ましい方法は、細胞破壊後の、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、超遠心分離、脱塩および滅菌濾過を含む。溶解物は（例えば、ポリエチレングリコールを使用して）細胞破壊後に沈殿させ、ＨＢｓＡｇを限外濾過用に溶液中に残しておいてよい。
【００３０】
精製後ＨＢｓＡｇに透析を施すことができ（例えばシステインと）、これを使用して、ＨＢｓＡｇ調製中に使用された可能性があるチメロサールなどの任意の水銀防腐剤を除去することができる［３０、３４］。
【００３１】
ＨＢｓＡｇの量は典型的にはマイクログラムで表され、ワクチン用量当たりのＨＢｓＡｇの典型的な量は１０μｇである。
【００３２】
「Ｓ」配列以外に、表面抗原はプレ−Ｓ配列の全体または一部分、例えばプレ−Ｓ１および／またはプレ−Ｓ２配列の全体または一部分を含むことができる。
【００３３】
非ＨＢＶ抗原
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの防御抗原を含む。非ＨＢＶ病原体はウイルス性および／または細菌性であってよい。
【００３４】
典型的なウイルス性病原体には、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスがあるが、これらだけには限られない。
【００３５】
典型的な細菌性病原体には、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ｂ型および非分類系統を含めたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹを含めた髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含めた肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；およびカタラリス菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）があるが、これらだけには限られない。
【００３６】
ジフテリア菌はジフテリアを引き起こす。注射後に特異的抗トキシン抗体を誘導する能力を保持しながら、ジフテリア毒素を（例えば、ホルマリンまたはホルムアルデヒドを使用して）処理して毒性を除去することができる。これらのジフテリアトキソイドはジフテリアワクチンにおいて使用され、参考文献１の１３章中により詳細に開示される。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されるジフテリアトキソイドである。ジフテリアトキソイドは増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地、またはＬｉｎｇｇｏｕｄおよびＦｅｎｔｏｎ培地）中でジフテリア菌を増殖させることによって得ることができ、培地にウシ抽出物を補充することが可能であり、後にホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈殿が可能である。トキソイド物質は、滅菌濾過および／または透析を含む方法によって次いで処理することができる。
【００３７】
破傷風菌は破傷風を引き起こす。破傷風毒素を処理して防御トキソイドを与えることができる。これらのトキソイドは破傷風ワクチンにおいて使用され、参考文献１の２７章中により詳細に開示される。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製される破傷風トキソイドである。破傷風トキソイドは増殖培地（例えば、ウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中で破傷風菌を増殖させることによって得ることができ、後にホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈殿が可能である。滅菌濾過および／または透析を含む方法によって、次いで物質を処理することができる。
【００３８】
百日咳菌は百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（完全細胞、不活性百日咳菌細胞の形；「ｗＰ」）あるいは無細胞（「ａＰ」）のいずれかである。細胞性百日咳抗原の調製は充分に文書化されており［例えば、参考文献１の２１章を参照］、例えば、それは培養第Ｉ期の百日咳菌の熱不活化によって得ることができる。無細胞抗原を使用する場合、１つ、２つまたは（好ましくは）３つの以下の抗原が含まれる：（１）解毒した百日咳毒素（百日咳トキソイド、すなわち「ＰＴ」）；（２）繊維状ヘマグルチニン（「ＦＨＡ」）；（３）ペルタクチン（「６９キロダルトンの外膜タンパク質」としても知られている）。この３つの抗原は、改変型Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液状培地中で増殖させた百日咳菌培養物からの単離によって調製することが好ましい。ＰＴおよびＦＨＡは発酵ブロスから単離することができ（例えば、ヒドロキシアパタイトゲル上での吸着によって）、一方ペルタクチンは、熱処理および凝集反応（例えば、塩化バリウムを使用する）によって細胞からから抽出することができる。抗原は連続的なクロマトグラフィーおよび／または沈殿ステップにおいて精製することができる。ＰＴおよびＦＨＡは疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ペルタクチンはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ＦＨＡおよびペルタクチンは、本発明による使用の前にホルムアルデヒドで処理することができる。ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドを用いた処理によってＰＴを解毒することが好ましい。この化学的解毒手順に対する代替として、ＰＴは突然変異誘発によって酵素活性が低下した突然変異ＰＴであってよいが［３５］、化学的処理による解毒が好ましい。
【００３９】
ｂ型インフルエンザ菌（「Ｈｉｂ」）は細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは典型的には被膜糖抗原に基づいており［例えば、参考文献１の１４章］、その調製は充分に文書化されている［例えば、参考文献３６〜４５］。Ｈｉｂ糖は担体タンパク質と結合して、特に子供においてその免疫原性を増大させる。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、および血清型Ｂの髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体である。破傷風トキソイドは、「ＰＲＰ−Ｔ」と一般に呼ばれる生成物において使用される、好ましい担体である。臭化シアンを使用してＨｉｂ被膜多糖を活性化させ、活性糖をアジピン酸リンカー（（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなど）、典型的には塩酸塩）と結合させ、次いでリンカー−糖物体と破傷風トキソイド担体タンパク質を反応させることによってＰＲＰ−Ｔを作製することができる。複合体の糖部分は、Ｈｉｂ細菌から調製した完全長のポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）、および／または完全長ＰＲＰの断片を含み得る。１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：２と５：１の間の比、および１：１．２５と１：２．５の間の比を有する複合体を使用することができる。好ましいワクチンでは、しかし、糖と担体タンパク質の重量比は１：２．５と１：３．５の間である。破傷風トキソイドが抗原および担体タンパク質の両方として存在するワクチンでは、その時複合体中の糖と担体タンパク質の重量比は１：０．３と１：２の間である可能性がある［４６］。Ｈｉｂ複合体の投与は０．１５μｇ／ｍｌ以上、およびより好ましくは１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらすことが好ましく、これらは標準的な応答閾値である。
【００４０】
髄膜炎菌は細菌性髄膜炎を引き起こす。生物の被膜多糖に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺを含めたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの様々な血清型が同定されてきている。疾患と最も関係がある血清型は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹである。血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する現在のワクチンは被膜糖抗原に基づくものであるが、この手法は血清型Ｂには適しておらず、したがってタンパク質抗原および外膜小胞を代わりに使用する。被膜糖は担体タンパク質と結合して免疫原性を増大させる。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、およびインフルエンザ菌タンパク質Ｄである。複合体の糖部分は、髄膜炎菌から調製した完全長の糖、および／またはその断片を含み得る。血清型Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−系統のいずれかから調製することができる。血清型Ａの糖に関しては、少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）のマンノースアミン残基が、Ｃ−３位置においてＯ−アセチル化されることが好ましい。１：１０（すなわち、過剰なタンパク質）と１０：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：５と５：１の間、１：２．５と２．５：１の間の比、または１：１．２５と１．２５：１の間の比を有する髄膜炎菌複合体を使用することができる。複合体の投与によって、少なくとも４倍、および好ましくは少なくとも８倍の関連する血清型の血清細菌アッセイ（ＳＢＡ）における力価の増大をもたらすことが好ましい。ＳＢＡにおける力価は、ベビーラビット補体またはヒト補体を使用して測定することができる［４７］。
【００４１】
肺炎連鎖球菌は細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂおよび髄膜炎菌に関しては、既存のワクチンは被膜糖に基づく。肺炎連鎖球菌の２つ以上の血清型、および詳細には少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の糖を含むことが好ましい。他の血清型は１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖおよび１８Ｃから選択されることが好ましい。例えば、２３の異なる血清型に由来する多糖の混合物が広く使用されており、５〜１１の異なる血清型に由来する多糖を含む複合体ワクチンも同様である［４８］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒ（商標）［４９］は７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）に由来する複合体抗原を含む。糖は担体タンパク質と結合することが好ましい［例えば、参考文献５０〜５２］。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、およびインフルエンザ菌タンパク質Ｄである。ＰｒｅｖＮａｒ（商標）製品中の糖は、０．５ｍｌ用量当たり２μｇの各糖（４μｇの血清型６Ｂ）で、還元的アミノ化によってＣＲＭ１９７と個別に結合する。肺炎球菌に由来する糖抗原の使用に対する代替として、組成物は１つまたは複数のポリペプチド抗原を含むことができる。数系統の肺炎球菌のゲノム配列が利用可能であり［５３、５４］、これらは逆ワクチン法に供して［５５〜５８］、適切なポリペプチド抗原を同定することができる［５９、６０］。例えば組成物は、参考文献６１中に定義されるように、以下の抗原：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３０の１つまたは複数を含むことができる。組成物は、２つ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の）これらの抗原を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は肺炎球菌に由来する糖とポリペプチド抗原の両方を含むことができる。これらは単純な混合物において使用することができ、あるいは肺炎球菌糖抗原は肺炎球菌タンパク質と結合させることが可能である。このような実施形態に適した担体タンパク質には、前述の肺炎球菌タンパク質抗原がある［６１］。
【００４２】
モラクセラカタラーリスは中耳炎および副鼻腔炎を引き起こし、時折咽頭炎の原因となる。参考文献６２中に総説されるように、ワクチンは現在研究中である。
【００４３】
ＨＢＶと同様に、ＨＡＶは肝炎を引き起こす。ＨＡＶワクチンは参考文献１の１５章中に開示されている。好ましいＨＡＶ成分は不活性ウイルスに基づき、不活性化はホルマリン処理によって実施することができる。ウイルスはＭＲＣ−５細胞などのヒト胎児肺２倍体線維芽細胞において増殖し得る。好ましいＨＡＶ系統はＨＭ１７５であるが、ＣＲ３２６Ｆを使用することもできる。ウイルス増殖を可能にする条件下で、細胞を増殖させることが可能である。細胞を溶解し、生成した懸濁液は限外濾過およびゲル透過クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００４４】
ポリオウイルスは灰白髄炎を引き起こす。経口ポリオウイルスワクチンを使用する代わりに、参考文献１の２４章中により詳細に開示するように、本発明は不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）を使用する。細胞培養中にポリオウイルスを増殖させることが可能であり、好ましい培養はサル腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞系を使用する。Ｖｅｒｏ細胞は、都合良くマイクロキャリア培養することができる。増殖後、限外濾過、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーなどの技法を使用してビリオンを精製することができる。患者に投与する前に、ポリオウイルスは不活化しなければならず、これはホルムアルデヒドを用いた処理によって実施することができる。灰白髄炎は、ポリオウイルスの３つの型の１つによって引き起こされる可能性がある。３つの型は類似しており同一の症状を引き起こすが、これらは抗原的に非常に異なり、１つの型による感染は他の型による感染に対して防御しない。したがって、本発明では３つのポリオウイルス抗原：ポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ系統）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ−１系統）、およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ系統）を使用することが好ましい。これらのウイルスは個別に増殖、精製および不活化し、次いで組み合わせて本発明と共に使用するための多量の３価混合物を得ることが好ましい。ＩＰＶの量は典型的には「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」［６３］）で表す。
【００４５】
麻疹、おたふく風邪および風疹ウイルスに対して防御するための抗原は、知られている１価および３価（「ＭＭＲ」）ワクチンにおいて見られるように、典型的には生ウイルスである。麻疹ウイルスワクチンは、参考文献１の１９章中により詳細に記載されている。おたふく風邪ウイルスワクチンは、参考文献１の２０章中により詳細に記載されている。風疹ウイルスワクチンは、参考文献１の２６章中により詳細に記載されている。典型的な麻疹ウイルス系統には、Ｍｏｒａｔｅｎ；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ；Ｓｃｈｗａｒｚ；Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ−Ｚａｇｒｅｂ；ＣＡＭ−７０；ＡＩＫ−Ｃ；ＴＤ９７；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−１６；Ｓｈａｎｇｈａｉ−１９１などがある。ＳｃｈｗａｒｚおよびＭｏｒａｔｅｎ系統が、米国および欧州で最も一般的に使用されている。典型的なおたふく風邪ウイルス系統には、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ；ＲＩＴ４３８５；Ｕｒａｂｅ；Ｈｏｓｈｉｎｏ；Ｒｕｂｉｎｉ；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−３；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ；Ｍｉｙａｈａｒａ；Ｔｏｒｉｉ；ＮＫＭ−４６；Ｓ−１２などがある。Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ、ＲＩＴ４３８５、ＵｒａｂｅおよびＬｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ系統が、最も一般的な世界規模の系統である。典型的な風疹ウイルス系統には、ＲＡ２７／３；Ｍａｔｓｕｂａ；ＴＣＲＢ１９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ；Ｍａｔｓｕｕｒａ；ＴＰ−３３６などがある。ＲＡ２７／３は、西欧諸国で使用されている最も一般的な系統である。
【００４６】
水痘に対して防御するためのＶＺＶ抗原は典型的には、Ｏｋａ系統のウイルスに基づく生ウイルスである。ＶＺＶワクチンは、参考文献１の２８章中により詳細に記載されている。
【００４７】
インフルエンザウイルス抗原は、参考文献１の１７および１８章中により詳細に記載されている。広義には、インフルエンザウイルスワクチンは生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づいてよく、不活化ワクチンは完全ウイルス、「スプリット」ウイルスまたは精製表面抗原（ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ含む）に基づいてよい。ワクチンを調製するために使用するウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかで増殖させることが可能である。インフルエンザウイルス用のワクチン系統は季節ごとに変わる。現在の大流行間期では、ワクチンは典型的には２つのインフルエンザＡ系統（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ系統を含み、３価ワクチンが典型的である。本発明は、（特にインフルエンザＡウイルスの）Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９亜型系統などの流行系統（すなわち、ワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団がそれに対する免疫がない系統）由来のウイルスも使用することができ、流行系統用のインフルエンザワクチンは１価であってよく、あるいは流行系統によって補充した通常の３価ワクチンに基づくものであってよい。インフルエンザウイルスはリアソータント系統であってよく、逆遺伝学的技法によって得ることができている。ウイルスは弱毒化することができる。ウイルスは温度感受性であってよい。ウイルスは低温適応性であってよい。
【００４８】
ワクチンにおいて使用するためのこれらの病原体由来の抗原成分は、略称で一般に呼ばれる：「Ｄ」はジフテリアトキソイド、「Ｔ」は破傷風トキソイド、「Ｐ」は百日咳抗原、「Ｐａ」は無細胞、「Ｐｗ」は細胞性、「Ｈｉｂ」はｂ型インフルエンザ菌被膜糖、「ＭｅｎＡ」、「ＭｅｎＢ」、「ＭｅｎＣ」、「ＭｅｎＷ」および「ＭｅｎＹ」はそれぞれの髄膜炎菌の血清型、「ＩＰＶ」は不活化ポリオウイルス、および「Ｓｐｎ」は肺炎球菌
。
【００４９】
抗原成分をＨＢｓＡｇと組み合わせて多価組成物を調製するとき、抗原は個別に加えることができ、あるいはＨＢｓＡｇと組み合わせる前に抗原を予め混合することができる。ＤおよびＴ抗原を使用する場合、予め混合したＤ−Ｔ成分を使用することが好ましい。この２価成分は本発明の方法中で使用することができる、例えばそれをＨＢｓＡｇと組み合わせて、３価Ｄ−Ｔ−ＨＢＶ成分を作製することができる。代替として、Ｄ−Ｔ成分は他の非ＨＢＶ抗原（例えば、無細胞百日咳抗原）と組み合わせることができ、したがってその成分はＨＢｓＡｇなどと組み合わせることができる。Ｄ、ＴおよびＰｗ抗原を使用する場合、予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を使用すること、したがって本発明の方法中にこの成分を使用することが好ましい。
【００５０】
アジュバントを本発明の組成物中に含めるとき、アジュバントは様々な段階で加えることもできる。典型的には、本発明の方法中で使用する前に抗原をアジュバントと組み合わせているはずであるが（例えば、２価Ｄ−Ｔ混合物は本発明の方法中で使用する前にアルミニウム塩アジュバントに吸着しているはずであり、これはトキソイドを別々に調製し、その各々を水酸化アルミニウムアジュバントに別々に吸着させ、次いで２つの吸着トキソイドを（場合によっては他のアジュバントと）混合して本発明の方法中で使用するための物質を得ることによって都合良く実施することができる）、抗原を混合した後にアジュバントを加えること、またはアジュバントに抗原を加えることも可能である（例えば、水性アジュバントで始めるために、したがって抗原は個別あるいは予め混合して加える）。以下に記載するように、ＨＢｓＡｇ成分は、非ＨＢＶ抗原成分と組み合わせる前にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させることが好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい組成物は、ＨＢｓＡｇ以外にＤ、ＴおよびＰ抗原（例えば、参考文献３および４）を少なくとも含む。特に好ましい組成物は以下の組合せである：
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎ウイルス。
【００５２】
これらの組成物は列挙した抗原からなっていてよく、あるいは他の病原体由来の抗原をさらに含むことができる。したがって、これらは別々に、あるいは他のワクチンの成分として使用することができる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は５価Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢＶ−ＩＰＶではない［３０］。したがって組成物は、Ｐｗ成分および／または少なくとも１つの複合体を含むことができる。
【００５４】
アジュバント
本発明の好ましい免疫原性組成物はアジュバントを含み、このアジュバントは１つまたは複数のアルミニウム塩、および特にリン酸アルミニウムアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムアジュバントを含むことが好ましい。
【００５５】
本発明の方法中で使用する抗原成分は、その方法中で使用する前にアルミニウムアジュバントを含む、すなわち抗原成分は、アジュバントと「予め混合されている」あるいはアジュバントに「予め吸着している」ことが好ましい。
【００５６】
ＨＢｓＡｇおよびジフテリアトキソイドを含む組成物において、ジフテリアトキソイドを水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることが可能である。
【００５７】
ＨＢｓＡｇおよび破傷風トキソイドを含む組成物において、破傷風トキソイドを水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることは可能であるが、これは必要ではない（例えば、全破傷風トキソイドの０〜１０％の間の吸着を使用することができる）。
【００５８】
ＨＢｓＡｇおよび完全細胞百日咳抗原を含む組成物において、ｗＰ抗原は水酸化アルミニウムアジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせることが好ましい。
【００５９】
ＨＢｓＡｇおよび無細胞百日咳抗原を含む組成物において、百日咳抗原は１つまたは複数のアルミニウム塩アジュバントに吸着させることが可能であり、あるいは非吸着状態で加えることが可能である。
【００６０】
ペルタクチンが組成物中に存在する場合、ペルタクチンは、本発明の方法中で使用する前に水酸化アルミニウムアジュバントに吸着することが好ましい。ＰＴおよびＦＨＡは、本発明の方法中で使用する前に、水酸化アルミニウムアジュバントまたはリン酸アルミニウムに吸着させることが可能である。好ましい実施形態では、本発明の方法中で使用する前にＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンを別々に、水酸化アルミニウムに予め吸着させる。
【００６１】
ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ抗原を含む組成物において、Ｈｉｂ複合体は非吸着状態であり得るが、それはリン酸アルミニウムアジュバントに吸着することが好ましい［６４］。このような吸着は、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ−ＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンにおいて特に有用である。他の複合抗原（例えば、髄膜炎菌、肺炎球菌）を同様にアルミニウム塩（例えば、ホスフェート）に吸着させることが可能であり、あるいはこれらは非吸着状態であってよい［６５］。
【００６２】
ＩＰＶ抗原は典型的には、本発明の方法中で使用する前に如何なるアジュバントにも吸着しないが、しかしＩＰＶ抗原は、他の成分に源を発するアルミニウムアジュバントに吸着した状態になり得る。
【００６３】
参考文献６６中に記載された方法を使用して、組成物中のＨＢｓＡｇをリン酸アルミニウムに吸着させることが可能である。リン酸アルミニウムへの吸着はよく知られているＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（商標）製品とは対照的であるが（この場合ＨＢｓＡｇは水酸化アルミニウムに吸着する）、ＨＥＰＡＣＣＩＮＥ（商標）およびＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ（商標）製品と同じである。参考文献６７中に言及されるように、リン酸アルミニウムは水酸化アルミニウムより良いＨＢｓＡｇのアジュバントである可能性がある。（よく知られているＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（商標）製品中と同様に）ＨＢｓＡｇは最終ワクチン中の水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることが可能であり、あるいは非吸着状態を保ち得るが、それは一般にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着するはずである。さらにＨＢｓＡｇは、本発明の方法中で使用する前にリン酸アルミニウムに予め吸着させることが好ましい。
【００６４】
本発明の方法が、ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドがＨＢｓＡｇとそれらを組み合わせる前に混合されている成分を使用する場合、このＤ−Ｔ混合物は、ＤおよびＴ抗原が吸着する水酸化アルミニウムアジュバントを含むことが好ましい。
【００６５】
本発明の方法が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび完全細胞百日咳抗原がＨＢｓＡｇとそれらを組み合わせる前に混合されている成分を使用する場合、このＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物は、ＤおよびＴ抗原が吸着する水酸化アルミニウムアジュバントと、リン酸アルミニウムアジュバントの両方を含むことが好ましい。
【００６６】
現在使用されているアルミニウムアジュバントは典型的には、「水酸化アルミニウム」または「リン酸アルミニウム」アジュバントのいずれかと呼ばれている。しかし、いずれも存在する実際の化学化合物を正確に記載していないので、これらは便宜上の名称である（例えば、参考文献６８の９章を参照）。本発明は、アジュバントとして一般に使用される「水酸化物」または「リン酸」塩のいずれかを使用することができる。
【００６７】
「水酸化アルミニウム」として知られるアジュバントは典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常少なくとも一部分が結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外線（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１での吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いピークの存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物と識別することができる（参考文献６８の９章）。
【００６８】
「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは典型的には、少量のサルフェートもしばしば含むヒドロキシリン酸アルミニウムである。それらは沈殿によって得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度は、塩中のホスフェートとヒドロキシルの置換度に影響を与える。ヒドロキシリン酸は一般に０．３と０．９９の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸はヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ４と識別することができる。例えば、（例えば、２００℃に加熱したときの）３１６４ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンドは、構造ヒドロキシルの存在を示す（参考文献６８の９章）。
【００６９】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３と１．２の間、好ましくは０．８と１．２の間、およびより好ましくは０．９５±０．１であるはずである。リン酸アルミニウム、特にヒドロキシリン酸塩は一般に非晶質であるはずである。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含まれる０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは一般に微粒子であるはずである。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後に０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。
【００７０】
リン酸アルミニウムのＰＺＣはホスフェートとヒドロキシルの置換度と逆の関係にあり、沈殿によって塩を調製するために使用する反応物の反応条件および濃度に応じて、この置換度は変わる可能性がある。溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変えること（より多い量のリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によってもＰＺＣは変わる。本発明により使用するリン酸アルミニウムは、４．０と７．０の間のＰＺＣ、より好ましくは５．０と６．５の間、例えば約５．７のＰＺＣを一般に有するはずである。
【００７１】
本発明の組成物を調製するために使用するリン酸アルミニウム溶液は、バッファー（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはトリスバッファー）を含み得るが、これは常に必要なわけではない。リン酸アルミニウム溶液は、滅菌済みであり発熱物質を含まないことが好ましい。リン酸アルミニウム溶液は、例えば１．０ｍＭと２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭの間、およびより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離水性リン酸イオンを含み得る。リン酸アルミニウム溶液は、塩化ナトリウムも含み得る。塩化ナトリウムの濃度は０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることが好ましく、およびより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にする。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ポリソルベート８０、Ｓｐａｎ８５およびスクアレンの混合物を含む水中油型エマルジョンを含む組成物を除外することができる［６９］。いくつかの実施形態では、本発明は、油、α−トコフェロールおよびポリソルベート８０の混合物を含む組成物を除外することができる［７０］。いくつかの実施形態では、本発明は、サポニンアジュバント（ＱＳ２１など）および非イオン性界面活性剤（ポリソルベート４０、６０または８０など）を含む組成物を除外することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、サポニンアジュバント、代謝性油および非イオン性界面活性剤を含む組成物を除外することができる［７１］。いくつかの実施形態では、本発明は、サポニンアジュバント、水中油型エマルジョンおよびステロールを含む組成物を除外することができる［７２］。いくつかの実施形態では、本発明は、３ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、トリグリセリドおよび水中油型エマルジョンを含む組成物を除外することができる［７３］。
【００７３】
精製ＨＢｓＡｇと他の抗原の組合せ
本発明の方法は、精製ＨＢｓＡｇを少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体の由来の少なくとも１つの抗原と合わせるステップを含む。
【００７４】
抗原は個別に連続して組み合わせることができ、あるいは抗原を予め混合し、一緒に加えることができる。例えば、４価ＤＴＰ−ＨＢｓＡｇワクチンは、容器へのＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰ抗原の連続的な添加を含む方法によって、あるいはＤ、ＴおよびＰ抗原を予め混合し、次いでＨＢｓＡｇとＤＴＰ混合物を組み合わせることによって作製することができる。
【００７５】
抗原成分は任意の適切な順序で組み合わせることができる。
【００７６】
非ＨＢＶ病原体の由来の抗原は界面活性剤を含むことができ、これはＨＢｓＡｇ精製中に使用する非イオン性界面活性剤と同じであるか、あるいはそれと異なってよい。界面活性剤添加に関する多数の別ステップが回避されるので、他の抗原成分が界面活性剤を含む場合、本発明の方法は特に有用である。１つまたは複数の非ＨＢＶ成分がポリソルベート８０を含む方法が好ましい。
【００７７】
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドが本発明の組成物中に含まれる場合、それらはＨＢｓＡｇと組み合わせる前に予め混合することが好ましい。したがって本発明の方法は、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分を、Ｄ抗原とＴ抗原の両方を含む第２の成分と組み合わせることを含む。同様に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび完全細胞百日咳抗原が組成物中に含まれる場合、それらは予め混合することが好ましく、したがっ
て本発明の方法は、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分を、Ｄ、ＴおよびＰｗ抗原を含む第２の成分と組み合わせることを含む。
【００７８】
Ｄ−Ｔ混合物を使用する場合、本発明のワクチン中のジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの比は、通常（Ｌｆ単位で測定して）２：１と３：１の間、好ましくは２．４：１と２．６：１の間であり、２．５：１であることがより好ましい。
【００７９】
アジュバントを本発明の組成物中に含めるとき、様々な段階でアジュバントを加えることも可能である。典型的には、抗原は、本発明の方法で使用する前にアジュバントと組み合わせるが（例えば、２価Ｄ−Ｔ混合物は、本発明の方法で使用する前にアルミニウム塩アジュバントに吸着する）、抗原を混合した後にアジュバントを加えること、あるいは抗原をアジュバントに加えることも可能である（例えば、水性アジュバントで始め、次いで抗原を個別にまたは予め混合して添加すること）。前に記載したように、非ＨＢＶ抗原成分と組み合わせる前に、ＨＢｓＡｇ成分をリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させることが可能である。
【００８０】
組み合わせワクチン
本発明の組成物は（ａ）抗原成分、および（ｂ）非抗原成分を含むことができる。抗原成分は前に記載した抗原を含むか、あるいはそれらからなってよい。非抗原成分は、以下でさらに詳細に記載するように、担体、アジュバント、賦形剤、バッファーなどを含むことができる。これらの非抗原成分は様々な供給源を有し得る。例えばそれらは、製造中に使用する、あるいはこれらの成分と別に加えることができる抗原またはアジュバント物質の１つ中に存在する可能性がある。
【００８１】
本発明の好ましい組成物は、１つまたは複数の医薬担体および／または賦形剤を含む。
【００８２】
緊張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌの間で存在してよい。
【００８３】
組成物は一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇと３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧を有するはずであり、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入ることがより好ましいはずである。浸透圧は予防接種によって引き起こされる痛みに対して影響がないことは以前に報告されているが［７４］、この範囲の浸透圧を保つことはそれにもかかわらず好ましい。
【００８４】
本発明の組成物は１種または複数種のバッファーを含むことができる。典型的なバッファーには、リン酸バッファー、トリスバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー、またはクエン酸バッファーがある。バッファーは典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれるはずである。
【００８５】
本発明の組成物のｐＨは一般に５．０と７．５の間、およびより典型的には最適な安定性のために５．０と６．０の間、あるいはジフテリアトキソイドおよび／または破傷風トキソイドが存在する場合、６．０と７．０の間であるはずである。したがって本発明の方法は、パッケージ前にバルクワクチンのｐＨを調節するステップを含むことができる。
【００８６】
本発明の組成物は滅菌済みであることが好ましい。
【００８７】
本発明の組成物は発熱物質を含まない、例えば用量当たり１ＥＵ未満（エンドトキシン単位、標準指標）、および好ましくは用量当たり０．１ＥＵ未満を含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の組成物はグルテンを含まないことが好ましい。
【００８９】
ＨＢｓＡｇの吸着性のため、最終的なワクチン製品は、不透明な外見を有する懸濁液である可能性がある。この外見は、微生物による汚染が容易に目に見えないことを意味し、したがってワクチンは抗菌剤を含むことが好ましい。ワクチンを多用量容器中にパッケージするとき、これは特に重要である。封入するのに好ましい抗菌剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明の方法中に水銀防腐剤（例えばチメロサール）は使用しないことが好ましい。したがって、方法中で使用する成分の１つからすべてが、水銀防腐剤を実質的に含まないでよい（特に、２価Ｄ−Ｔ成分；ＩＰＶ成分；複合体成分）。しかし、本発明中で使用する前に成分（特にＨＢｓＡｇ）をこのような防腐剤で処理した場合、微量の存在が避けられない可能性がある。しかし安全性のために、最終組成物は約２５ｎｇ／ｍｌ未満の水銀を含むことが好ましい。最終的なワクチン製品は、検出可能なチメロサールを含まないことがより好ましい。これは一般に、本発明の方法中のその添加前に抗原調製物から水銀防腐剤を除去すること、または組成物を生成するために使用する成分の調製中のチメロサールの使用を避けることによって実施されるはずである。
【００９０】
２価Ｄ−Ｔ混合物を本発明の方法中で使用する場合、それはチメロサールを含まない状態でなければならない。いくつかの実施形態では、Ｄ−Ｔ混合物は２−フェノキシエタノールを含む可能性があるが、他の実施形態では、Ｄ−Ｔ混合物はチメロサールおよび２−フェノキシエタノールを含まない。３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物を本発明の方法中に使用する場合、それは２−フェノキシエタノールを含まないでよいが、チメロサールを含む可能性がある。
【００９１】
製造中、望ましい最終濃度を得るための成分の希釈は、通常ＷＦＩ（注射用水）を用いて実施するはずである。
【００９２】
Ａｌ３＋の形態で表す本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下などであることが好ましい。
【００９３】
本発明の組成物中のＨＢｓＡｇの濃度は６０μｇ／ｍｌ未満、例えば５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下などであることが好ましい。約２０μｇ／ｍｌの濃度が典型的である。
【００９４】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドの濃度は、典型的には少なくとも５０ＩＵ／ｍｌである。
【００９５】
本発明の組成物中の破傷風トキソイドの濃度は、典型的には少なくとも１００ＩＵ／ｍｌである。
【００９６】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの比は、通常（Ｌｆ単位で測定して）２：１と３：１の間、好ましくは２．４：１と２．６：１の間であり、２．５：１であることがより好ましい。
【００９７】
本発明の組成物中のｗＰ抗原の量は、典型的には少なくとも８ＩＵ／ｍｌである。
【００９８】
本発明の組成物中の糖として測定したＨｉｂ複合体の量は、典型的には１０μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの間である。
【００９９】
ＥＵ（Ｅｌｉｓａ単位）で測定したＨＡＶ抗原の量は、典型的には少なくとも６００ＥＵ／ｍｌである。
【０１００】
ＩＰＶ抗原の量は系統の血清型に依存する。１型ウイルスに関しては、組成物は約８０ＤＵ／ｍｌを典型的には含む。２型ウイルスに関しては、組成物は約１６ＤＵ／ｍｌを典型的には含む。３型ウイルスに関しては、組成物は約６５ＤＵ／ｍｌを典型的には含む。
【０１０１】
本発明の組成物中の糖として測定した髄膜炎菌複合体の量は、各血清型に関して典型的には５μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌの間である。
【０１０２】
本発明の組成物中の糖として測定した肺炎球菌複合体の量は、各血清型に関して典型的には２μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間である。
【０１０３】
本発明の組成物は、０．５ｍｌの用量で患者に投与することが好ましい。０．５ｍｌの用量という言及は、正規分布の分散、例えば０．５ｍｌ±０．０５ｍｌを含むことは理解されるはずである。
【０１０４】
本発明は、患者への投与用に次いで分配することができる、個々の用量にパッケージするのに適したバルク材料を提供することができる。前述の濃度は典型的には最終パッケージ用量における濃度であり、したがってバルクワクチンにおける濃度はさらに高い可能性がある（例えば、希釈によって最終濃度まで低下させるために）。
【０１０５】
本発明の組成物は、一般に水性形態であるはずである。
【０１０６】
個々の抗原成分由来の残留成分が、本発明の方法によって生成する最終ワクチン中に微量で存在する可能性もある。例えば、ホルムアルデヒドを使用してジフテリア、破傷風および百日咳のトキソイドを調製する場合、最終ワクチン製品は微量のホルムアルデヒド（例えば、１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは５μｇ／ｍｌ未満）を保持する可能性がある。培地または安定剤をポリオウイルス調製中に使用することができた可能性があり（例えば、培地１９９）、これらは最終ワクチンまで存続する可能性がある。同様に、遊離アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システインおよび／またはシスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリンおよび／またはヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよび／またはバリン）、ビタミン（例えば、コリン、アスコルビン酸など）、リン酸２ナトリウム、１カリウムリン酸塩、カルシウム、グルコース、硫酸アデニン、フェノールレッド、酢酸ナトリウム、塩化カリウムなどが、それぞれ１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満で最終ワクチン中に保持される可能性がある。ネオマイシン（例えば、特にＩＰＶ成分由来の硫酸ネオマイシン）、ポリミキシンＢ（例えば、特にＩＰＶ成分由来の硫酸ポリミキシンＢ）などの、抗原調製物由来の他の成分も、用量当たりナノグラム未満の量で存在する可能性がある。抗原調製物に由来する最終ワクチンの他の考えられる成分は、抗原の完全ではない精製から生じる。少量の百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌および出芽酵母のタンパク質および／またはゲノムＤＮＡが、したがって存在する可能性がある。これらの残留成分を最少にするために、本発明の方法中で抗原を使用する前に、抗原調製物を処理してそれらを除去することが好ましい。
【０１０７】
ＩＰＶ成分を使用する場合、それは一般にＶｅｒｏ細胞において増殖しているはずである。最終ワクチンは好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下、例えば５００ｐｇ／ｍｌ以下または５０ｐｇ／ｍｌ以下のＶｅｒｏ細胞ＤＮＡ、例えば１０ｎｇ／ｍｌ未満の５０塩基対長以上であるＶｅｒｏ細胞ＤＮＡを含む。
【０１０８】
本発明のパッケージ組成物
ＨＢｓＡｇとアジュバントを組み合わせた後、本発明の方法は容器に混合物の０．５ｍｌサンプルを抽出およびパッケージするステップを含むことができる。多用量の状況に関しては、多用量を抽出し、１つの容器に一緒にパッケージするはずである。
【０１０９】
本発明の方法は、使用するために容器にワクチンをパッケージする他のステップを含むことができる。適切な容器にはバイアルおよび使い捨てシリンジがある（滅菌済みであるものが好ましい）。
【０１１０】
本発明の組成物をバイアルにパッケージする場合、これらはガラスまたはプラスチック材料でできていることが好ましい。組成物をバイアルに加える前に、バイアルは滅菌済みであることが好ましい。ラテックス感受性患者に関する問題を回避するために、ラテックスを含まないストッパーでバイアルを密封することが好ましい。バイアルは１回用量のワクチンを含むことができ、あるいはバイアルは、複数回用量、例えば１０回用量を含むことができる（「多用量」バイアル）。多用量バイアルを使用する場合、バイアルの中身の汚染を回避することに注意を払って、厳密な無菌条件下で滅菌済みニードルおよびシリンジを用いて各用量を取り出さなければならない。好ましいバイアルは、無色のガラスでできている。
【０１１１】
バイアルは予め充填したシリンジをキャップに挿入することができ、シリンジの中身をバイアルに押し出すことができ（例えば、凍結乾燥物質をその中で還元するために）、バイアルの中身を除去してシリンジに戻すことができるように適合させたキャップ（例えばＬｕｅｒロック）を有することができる。バイアルからのシリンジの除去後、次いでニードルを取り付けることができ、組成物は患者に投与することができる。キャップにアクセス可能である前にシールまたはカバーを除去する必要があるように、キャップはシールまたはカバーの内側に位置することが好ましい。
【０１１２】
組成物をシリンジにパッケージする場合、シリンジはそれに取り付けられたニードルを通常有していないはずであるが、構築および使用するための別のニードルをシリンジに供給することができる。安全なニードルが好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージのニードルが典型的である。記録をとるのを容易にするために中身のロット番号および有効期限をその上に印刷することができる剥離ラベルを、シリンジに与えることができる。シリンジ内のプランジャーは、吸引中にプランジャーが偶然に除去されるのを防ぐためのストッパーを有することが好ましい。シリンジはラテックスゴム製キャップおよび／またはプランジャーを有することができる。使い捨てシリンジは１回用量のワクチンを含む。シリンジは一般にニードルの取り付け前に先端を密封するための先端キャップを有するはずであり、先端キャップはブチルゴムでできていることが好ましい。シリンジとニードルを別々にパッケージする場合、ブチルゴム製シールドをニードルに取り付けることが好ましい。グレーのブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）の商品名で市場に出ているシリンジである。
【０１１３】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウ珪酸ガラスでできた容器を使用することがしたがって好ましい。
【０１１４】
組成物を容器にパッケージした後、分配用の箱の中、例えば段ボール箱の中に容器を次いで封入することができ、ワクチンの詳細、例えばその商品名、ワクチン中の抗原の一覧（例えば、「Ｂ型肝炎組換え体」など）、容器の表示（例えば、「使い捨ての予め充填したＴｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌのシリンジ１回用量バイアル」）、その用量（例えば、「それぞれ１回０．５ｍｌの用量を含む」）、警告（例えば、「成人のみ使用」または「小児のみ使用」）、有効期限、指示（例えば、「（事前血液透析および血液透析を含めて）腎不全を有していた１５歳以上の患者に関する、すべての知られている亜型によって引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に対する能動的免疫処置」など）、特許番号などがその箱にラベルされるはずである。それぞれの箱は、２つ以上のパッケージワクチン、例えば５または１０のパッケージワクチン（特にバイアル用）を含むことができる。ワクチンがシリンジ中に含まれる場合、パッケージはシリンジの絵を示し得る。
【０１１５】
ワクチンは（例えば、同じ箱の中に）、ワクチンの詳細、例えば投与に関する指示、ワクチン中の抗原の詳細などを含む説明書と共に、１つにパッケージすることができる。指示は、警告、例えば予防接種後のアナフィラキシー反応の場合にアドレナリン溶液を容易に利用できる状態に保つなどの警告も含むことができる。
【０１１６】
パッケージワクチンは２℃と８℃の間で保存することが好ましい。それを凍結させてはならない。
【０１１７】
ワクチンは製造中に完全液状形態で与えることができ（すなわち、すべての抗原成分が水溶液または懸濁液中に存在する）、あるいはワクチンは、いくつかの成分が液状形態であり他の成分が凍結乾燥形態である形に調製することができる。したがって最終ワクチンは、２つの成分：（ａ）水性抗原を含む第１の成分と（ｂ）凍結乾燥抗原を含む第２の成分を１つに混合することによって、使用時に即時調製することができる。２つの成分は別々の容器（例えば、バイアルおよび／またはシリンジ）中に存在することが好ましく、本発明は成分（ａ）および（ｂ）を含むキットを提供する。この形式は複合体成分、特にＨｉｂおよび／または髄膜炎菌および／または肺炎球菌複合体を含むワクチンに特に有用である。それは、凍結乾燥形態でさらに安定する可能性があるからである。したがって複合体は、本発明と共にそれらを使用する前は凍結乾燥状態であってよい。他の成分を例えば安定剤として、凍結乾燥前に加えることもできる。含有するのに好ましい安定剤は、ラクトース、スクロースおよびマンニトール、ならびにこれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などである。したがって最終ワクチンは、ラクトースおよび／またはスクロースを含むことができる。スクロース／マンニトール混合物を使用することによって、乾燥プロセスをスピードアップすることが可能である。
【０１１８】
したがって本発明は、２容器の組み合わせワクチンを調製するための方法であって、
− 前に記載したように水性組み合わせワクチンを調製するが、ただし前記１つまたは複数の抗原が複合体被膜糖抗原を含まないステップ、
− 第１の容器（例えばシリンジ）中で前記組み合わせワクチンをパッケージするステップ、
− 複合体被膜糖抗原を凍結乾燥形に調製するステップ、
− 前記凍結乾燥抗原を第２の容器（例えばバイアル）中でパッケージするステップ、および
− 第１の容器と第２の容器をキットに１つにパッケージするステップを含む方法を提供する。
【０１１９】
その後、キットは医師に分配することができる。
【０１２０】
Ｄ、Ｔ、ＰおよびＨＢｓＡｇ成分は液状形態であることが好ましい。
【０１２１】
ワクチンの治療および投与法
本発明の組成物はヒト患者への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における免疫応答を増大させる方法を提供する。
【０１２２】
本発明は、医薬において使用するための本発明の組成物も提供する。
【０１２３】
本発明は、患者に投与するための医薬品の製造における、（ｉ）その精製法が非イオン性界面活性剤の存在下で酵母細胞を破壊することを含む組換え酵母細胞から精製したＨＢｓＡｇ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ＨＢＶ抗原の使用も提供する。
【０１２４】
本発明の免疫原性組成物は、少なくともＢ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療において使用するためのワクチンであることが好ましい。本発明の組成物を与えた患者は、初回免疫処置後６週間で測定して、５００ｍＩＵ／ｍｌ以上の血清抗ＨＢｓＡｇＧＭ力価を有することが好ましい。ｌ２カ月後に測定して、力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上であることがより好ましい。
【０１２５】
完全な有効性を有するために、子供用の典型的な初回免疫処置スケジュールは、２回以上の投与を施すことを含むことができる。例えば、投与は：０および６カ月（時間０は初回投与である）、０、１、２および６カ月；第０日、第２１日、および次いで６カ月と１２カ月の間に第３の投与；２、４および６カ月；３、４および５カ月；６、１０および１４週；または０、１、２、６および１２カ月であってよい。
【０１２６】
例えば２歳の子供用に、追加抗原刺激投与として組成物を使用することもできる。
【０１２７】
本発明の組成物は、例えば腕または脚への筋肉内注射によって投与することができる。
【０１２８】
本発明によって生成されるワクチンは、Ｐｒｅｖｎａｒ（商標）などの別の肺炎球菌複合体ワクチンと同時に患者に投与することができる。
【０１２９】
本発明の組成物がアルミニウム系アジュバントを含む場合、保存中に成分の沈殿が生じる可能性がある。したがって、組成物は患者に投与する前に攪拌しなければならない。攪拌した組成物は、白濁した懸濁液であるはずである。
【０１３０】
好ましいワクチン
本発明の特異的な多価免疫原性組成物は以下の組成物を含む：
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む５価組成物。ワクチンは水性形態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。Ｄ、ＴおよびＰａは水酸化アルミニウムに吸着する。１ｍｌ当たりの量：約５０Ｌｆのジフテリアトキソイド；約２０Ｌｆの破傷風トキソイド；約５０μｇのＰＴ；約５０μｇのＦＨＡ；約１６μｇのペルタクチン；約２０μｇのＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵの１型ポリオウイルス；約１６ＤＵの２型ポリオウイルス；約６４ＤＵの３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。予め充填したシリンジ中に存在してよい。
【０１３１】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む５価組成物。ワクチンは水性形態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。Ｄ、ＴおよびＰａは水酸化アルミニウムに吸着する。１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも８０ＩＵの破傷風トキソイド；約５０μｇのＰＴ；約５０μｇのＦＨＡ；約１６μｇのペルタクチン；約２０μｇのＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵの１型ポリオウイルス；約１６ＤＵの２型ポリオウイルス；約６４ＤＵの３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。予め充填したシリンジ中に存在してよい。
【０１３２】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗを含む４価組成物。成分は水性形態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。ＤおよびＴは水酸化アルミニウムに吸着する。組成物はチメロサールを含み、２−フェノキシエタノールは含まないことが好ましい。１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵの破傷風トキソイド；少なくとも８ＩＵのＰｗ、約２０μｇのＨＢｓＡｇ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１３３】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰｗおよびＨｉｂ−Ｔ複合体を含む５価組成物。ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分は水性形態であり、Ｈｉｂ−Ｔは凍結乾燥状態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＤおよびＴは水酸化アルミニウムに吸着する。ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−Ｔはリン酸アルミニウムに吸着する。凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔはラクトースを含む。水性成分はチメロサールを含み得る。１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵの破傷風トキソイド（およびＨｉｂ−Ｔ中の担体として５μｇと２５μｇの間の破傷風トキソイド）；少なくとも８ＩＵのＰｗ、約２０μｇのＨＢｓＡｇ；糖として測定して約５μｇのＨｉｂ−Ｔ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１３４】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗならびに３つの複合体：Ｈｉｂ−Ｔ複合体、ＭｅｎＡ複合体およびＭｅｎＣ複合体を含む７価組成物。ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分は水性形態であり、３つの複合体は凍結乾燥状態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＤおよびＴは水酸化アルミニウムに吸着する。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。凍結乾燥成分はラクトースおよび／またはスクロースを含み得る。水性成分はチメロサールを含み得る。考えられる１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵの破傷風トキソイド（およびＨｉｂ−Ｔ中の担体として５μｇと２５μｇの間の破傷風トキソイド）；少なくとも８ＩＵのＰｗ、約２０μｇのＨＢｓＡｇ；糖として測定して約５μｇの各複合体。用量：約０．５ｍｌ。
【０１３５】
これらの組成物はそれ自体ワクチンとして使用することができ、あるいは他のワクチンの成分として使用することができる。例えば本発明は、前に記載した５価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ複合体を含む６価組成物を提供する。凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔはアルミニウム塩に吸着しないことが好ましい。本発明は、前に記載した５価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−ＴおよびＭｅｎＣ複合体を含む７価組成物も提供する。本発明は、前に記載した５価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ、ＭｅｎＣおよびＭｅｎＹ複合体を含む８価組成物も提供する。本発明は、前に記載した４価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ複合体を含む５価組成物も提供する。本発明は、前に記載した４価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物、およびＨｉｂ−Ｔ複合体、ＭｅｎＡ複合体およびＭｅｎＣ複合体の凍結乾燥混合物を含む７価組成物も提供する。最終ワクチンは、使用時に凍結乾燥物質を水性ＨＢｓＡｇ含有物質で戻すことによって調製することができ、凍結乾燥成分と水性成分は、前に記載したようにキット内に１つにパッケージすることが好ましい。
【０１３６】
本発明の特異的な方法は以下のステップを含む方法を含む：
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；チメロサールを含まない水酸化アルミニウムアジュバントとの２価Ｄ−Ｔ混合物の入手；Ｐａ成分用のＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンの入手；好ましくはアルミニウム塩アジュバントを含まない型１、２および３としてプールするＩＰＶ抗原の入手；最終的な５価混合を得るための任意の順序でのＤ−Ｔ、Ｐａ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇの組合せ；場合によってはシリンジへのパッケージ。
【０１３７】
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物の入手；最終的な４価混合を得るためのＤ−Ｔ−ＰｗとＨＢｓＡｇの組合せ；場合によってはシリンジへのパッケージ；場合によっては凍結乾燥複合体成分、例えばＨｉｂ−Ｔ；ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣと組み合わせたパッケージ。
【０１３８】
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物の入手；凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ複合体の入手；水性４価成分を得るためのＤ−Ｔ−ＰｗとＨＢｓＡｇの組合せ；水性４価成分のガラスバイアルへのパッケージ；凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔおよび／またはＭｅｎＣおよび／またはＭｅｎＹのガラスバイアルへのパッケージ；５価組み合わせワクチンを得るための水戻し用の単一キット中に存在する２つのバイアルの組合せ。ガラスバイアルはＩ型ガラスであってよく、ブチルゴム製ストッパーを有する。
【０１３９】
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物の入手；好ましくはアルミニウム塩アジュバントを含まない型１、２および３としてプールするＩＰＶ抗原の入手；最終的な５価混合を得るための任意の順序でのＤ−Ｔ−Ｐａ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇの組合せ；場合によってはシリンジへのパッケージ；場合によっては凍結乾燥複合体成分、例えばＨｉｂ−Ｔ；ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣと組み合わせたパッケージ。
【０１４０】
他の成分、例えば塩化ナトリウム、アジュバント、防腐剤などを任意の段階で加えることができる。これらの方法を使用して、例えば前に記載したワクチンを調製することができる。
【０１４１】
異なる方法のステップは実質的に同時に実施することができ、あるいは別々に実施することができる。これらのステップは、同じ場所または異なる場所、異なる国においても実施することができ、例えばＨＢｓＡｇ精製は、Ｈｉｂ−Ｔ凍結乾燥と異なる場所で行うことができる。
【０１４２】
複合体の担体タンパク質
複合体糖抗原は、糖がそれに直接、あるいはリンカーを介して共有結合する担体タンパク質を含む。結合技法に関する一般的な情報は参考文献４５において見ることができる。
【０１４３】
担体として使用するための様々なタンパク質が知られており、好ましい担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの細菌毒素またはトキソイドである。他の適切な担体タンパク質には、ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７突然変異体［７５〜７７］、髄膜炎菌の外膜タンパク質［７８］、合成ペプチド［７９、８０］、熱ショックタンパク質［８１、８２］、百日咳タンパク質［８３、８４］、サイトカイン［８５］、リンホカイン［８５］、ホルモン［８５］、増殖因子［８５］、様々な病原体由来の抗原に由来する多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［８６］、例えばＮ１９［８７］、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ［８８、８９］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［９０］、ニューモリシン［９１］、鉄摂取タンパク質［９２］、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の毒素ＡまたはＢ［９３］、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）タンパク質［９４］などがあるが、これらだけには限られない。
【０１４４】
糖と担体の結合は、例えば担体タンパク質中のリシン残基、またはアルギニン残基の側鎖中の−ＮＨ２基を介した結合であることが好ましい。（例えば、システインの側鎖中の）−ＳＨ基との結合も考えられる。
【０１４５】
１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する複合体が好ましい。
【０１４６】
組成物は少量の遊離担体を含むことができる。別の抗原として含まれる如何なる担体も無視すると、非結合担体は全体として組成物中の担体タンパク質の全量の５重量％を超えないことが好ましく、２重量％未満で存在することがより好ましい。
【０１４７】
例えば担体抑制のリスクを低下させるために、組成物中に２種類以上の担体タンパク質を含むことが考えられる。
【０１４８】
髄膜炎菌複合体に使用する担体タンパク質は、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄであってよい。このタンパク質は参考文献９５および９６中に詳細に記載されており、複合体中の担体タンパク質としてのその使用は参考文献９７中に記載されている。用語「タンパク質Ｄ」は、参考文献９７中に開示された天然完全長タンパク質の断片、および完全長タンパク質Ｄまたはこれらの断片のいずれかを含む融合タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の断片とタンパク質Ｄの断片の融合体）も含む。これらの断片は、結合時にＴ非依存性糖抗原をＴ依存性抗原に変換する能力を保持しているはずである。典型的な断片は、タンパク質Ｄの少なくともＮ末端側１／３を含むはずである。このタンパク質は大腸菌中で好都合に発現される可能性があり［９６］、この組換え物質は本発明と共に使用するのが好ましい［９７］。
【０１４９】
一般事項
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」ならびに「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物はＸのみからなる可能性があるか、あるいは他の何かを含む、例えばＸ＋Ｙである可能性がある。
【０１５０】
語句「実質的に」は「完全に」を除外するわけではない、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物はＹを完全に含まない可能性がある。必要な場合、語句「実質的に」は本発明の定義から除外することができる。
【０１５１】
数値ｘに関する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１５２】
特に言及しない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、任意の特定の混合順を必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組合せを、第３の成分などと組み合わせることができる。
【０１５３】
ある抗原がアジュバントに「吸着する」として記載する場合、少なくとも５０％（重量）、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％あるいはそれより多くのその抗原が吸着することが好ましい。ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドは両方が完全に吸着する、すなわち上清中には何も検出できないことが好ましい。ＨＢｓＡｇの全体の吸着を使用することができる。
【０１５４】
ジフテリアトキソイドの量は国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり１６０ＩＵを含む、「吸着ジフテリアトキソイドの第３国際標準１９９９」［９８、９９］を与える。ＩＵシステムに対する代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「境界凝集用量」）を、１国際単位のアンチトキシンと混合すると最適に凝集する混合物を生成する［１００］トキソイドの量として定義する。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり３００ＬＦを含む「ジフテリアトキソイド、プレイン」［１０１］を与え、アンプル当たり９００ＬＦを含む「凝集試験のジフテリアトキソイドの第１の国際参照試薬」［１０２］も与える。
【０１５５】
破傷風トキソイドの量は国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり４６９ＩＵを含む、「吸着破傷風トキソイドの第３国際標準２０００」［１０３、１０４］を与える。ＩＵシステムに対する代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「境界凝集用量」）を、１国際単位のアンチトキシンと混合すると最適に凝集する混合物を生成する［１００］トキソイドの量として定義する。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり１０００ＬＦを含む「凝集試験の破傷風トキソイドの第１の国際参照試薬」［１０５］を与える。
【０１５６】
ｗＰ抗原の量は国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり４６ＩＵを含む「百日咳ワクチンの第３国際標準」［１０６］を与える。それぞれのアンプルは水溶液の２．０ｍｌ等分試料の凍結乾燥残留物を含み、この等分試料は８リットルのＭ／１５ＳｏｒｅｎｓｅｎのバッファーｐＨ７．０で希釈した１０リットルの細菌懸濁液（米国不透明度標準により１８０不透明度単位に等しい）を含んでいた。ＩＵシステムに対する代替として、「ＯＵ」単位（「不透明度単位」）も使用される（例えば、４ＯＵは約１ＩＵであり得る）。
【０１５７】
複合体の量は一般に、担体の選択による変動を避けるために糖の質量によって示される（すなわち、全体としての複合体の用量（担体＋糖）は述べられる用量より大きい）。
【０１５８】
動物（および特にウシ）の材料を細胞の培養において使用する場合、それらは感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から入手しなければならない。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
組み合わせワクチンを調製するためのプロセスであって、該ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、該プロセスが、（ｉ）組換え酵母細胞を該非イオン性界面活性剤の存在下で破壊して精製ＨＢｓＡｇ成分を得るステップを含む、該酵母細胞から該ＨＢＶ表面抗原を精製すること、および（ｉｉ）該精製ＨＢｓＡｇ成分を非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて、該組み合わせワクチンを得ることを含む、プロセス。
（項目２）
組み合わせワクチンを調製するためのプロセスであって、該ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、該プロセスが、精製ＨＢｓＡｇを非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて、組み合わせワクチンを得るステップを含み、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を該非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって該ＨＢｓＡｇが調製される、プロセス。
（項目３）
（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含む免疫原性組成物であって、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を該非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって該ＨＢＶ表面抗原が調製される、免疫原性組成物。
（項目４）
上記非イオン性界面活性剤がポリ（オキシエテン）残基を含む、項目１から３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目５）
上記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエステルである、項目４に記載のプロセスまたは組成物。
（項目６）
上記非イオン性界面活性剤がポリソルベート２０である、項目５に記載のプロセスまたは組成物。
（項目７）
上記非イオン性界面活性剤が３０μｇ／ｍｌ以下で最終産物中に存在する、項目１から６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目８）
上記非イオン性界面活性剤がＨＢｓＡｇ各１００μｇに対して５０μｇ以下で最終産物中に存在する、項目１から７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目９）
（ｉ）上記少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体がジフテリア菌および破傷風菌を含み、（ｉｉ）これら２つの病原体由来の該抗原がジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドであり、かつ（ｉｉｉ）該ジフテリアトキソイドと該破傷風トキソイドがポリソルベート２０を実質的に含まない混合された形態で最初に存在する、項目１から８のいずれかに記載のプロセス。
（項目１０）
上記ＨＢＶ表面抗原がグリコシル化されていない、項目１から９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１１）
上記ＨＢＶ表面抗原が、リン脂質を含む脂質マトリクスを含む粒子の形態である、項目１から１０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１２）
上記ＨＢＶ表面抗原がＨＢＶ亜型ａｄｗ２に由来する、項目１から１１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１３）
上記ＨＢＶ表面抗原が用量当たり約１０μｇで最終組成物中に存在する、項目１から１２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１４）
上記ワクチンがＨｉｂ複合体、髄膜炎菌複合体、および／または肺炎球菌複合体を含む、項目１から１３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１５）
上記最終組成物が３価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ組成物；４価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ組成物；５価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ組成物；７価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ組成物；９価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ組成物；４価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ組成物；５価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、Ｈｉｂ組成物；５価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス組成物；６価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ組成物；７価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５組成物；１０価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ組成物；２価ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ組成物；および２価ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎ウイルス組成物から選択される、項目１から１４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１６）
上記最終組成物がリン酸アルミニウムアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムアジュバントを含む、項目１から１５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１７）
上記最終組成物がリン酸アルミニウムアジュバントと水酸化アルミニウムアジュバントの両方を含む、項目１から１６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１８）
上記最終組成物中のＡｌ３＋の濃度が５ｍｇ／ｍｌ以下である、項目１６または１７に記載のプロセスまたは組成物。
（項目１９）
予め混合したＤ−Ｔ成分を加えることを含む、項目１から１８のいずれかに記載のプロセス。
（項目２０）
予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を加えることを含む、項目１から１９のいずれかに記載のプロセス。
（項目２１）
上記予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分がリン酸アルミニウムアジュバントと水酸化アルミニウムアジュバントの両方を含む、項目２０に記載のプロセス。
（項目２２）
患者に投与するための薬剤の製造における、（ｉ）組換え酵母細胞から精製したＨＢｓＡｇであって、精製プロセスが非イオン性界面活性剤の存在下で該酵母細胞を破壊することを含む、ＨＢｓＡｇ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ＨＢＶ抗原の、使用。
（項目２３）
５価組成物を調製するためのキットであって、該５価組成物がＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰｗおよびＨｉｂ−Ｔ複合体抗原を含み、該ＤおよびＴ抗原が水酸化アルミニウムアジュバントに吸着しており、該ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−Ｔがリン酸アルミニウムアジュバントに吸着しており、該ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分が第１の容器中で水性形態であり、該Ｈｉｂ−Ｔが第２の容器中でラクトースと組み合わせた凍結乾燥形態であり、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって、該ＨＢｓＡｇが調製される、キット。
（項目２４）
７価組成物を調製するためのキットであって、該７価組成物がＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ−Ｔ複合体、ＭｅｎＡ複合体およびＭｅｎＣ複合体を含み、該ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分が第１の容器中で水性形態であり、該３つの複合体が第２の容器中で凍結乾燥形態であり、該第１の容器は水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方も含み、該ＤおよびＴ抗原が水酸化アルミニウムに吸着しており、ＨＢｓＡｇがリン酸アルミニウムに吸着しており、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって該ＨＢｓＡｇが調製される、キット。
（項目２５）
上記第１の容器がチメロサールをさらに含む、項目２４に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１−１】図１は、参考文献３および４の図２のコピーであり、参考文献３および４は、吸着法に基づく抗原性および免疫をこの図が示すことを述べ、サンプル１は、過剰な水酸化アルミニウムゲルを各コンポーネントワクチンの組合せが終了した後に加えたサンプルであり、サンプル２は、同じ濃度の前記吸着剤を組合せが終了する前に事前に加えたサンプルである。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれサンプル１および２の相対的抗原性を示す。
【図１−２】図１は、参考文献３および４の図２のコピーであり、参考文献３および４は、吸着法に基づく抗原性および免疫をこの図が示すことを述べ、サンプル１は、過剰な水酸化アルミニウムゲルを各コンポーネントワクチンの組合せが終了した後に加えたサンプルであり、サンプル２は、同じ濃度の前記吸着剤を組合せが終了する前に事前に加えたサンプルである。図１Ｃおよび１Ｄは、それぞれサンプル１および２の各抗原に対する抗体形成の相対的レベルを示す。
【図２−１】図２は、組成物中のＨＢｓＡｇの安定性に関するウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａ中、レーンは（１）Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＬＳＢ）；（２）分子量マーカー；（３〜５）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（６〜８）３つの別個の５価ロットの上清；（９〜１０）ＬＳＢである。図２Ｂおよび２Ｃ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２〜４）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（５〜７）２〜８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清；（８〜１０）３６〜３８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清である。図２Ｄ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２）対照ＨＢｓＡｇ；（３〜５）３つの別個の５価ロットの上清である。
【図２−２】図２は、組成物中のＨＢｓＡｇの安定性に関するウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａ中、レーンは（１）Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＬＳＢ）；（２）分子量マーカー；（３〜５）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（６〜８）３つの別個の５価ロットの上清；（９〜１０）ＬＳＢである。図２Ｂおよび２Ｃ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２〜４）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（５〜７）２〜８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清；（８〜１０）３６〜３８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清である。図２Ｄ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２）対照ＨＢｓＡｇ；（３〜５）３つの別個の５価ロットの上清である。
【図３】図３は、５価組成物の経時的なｐＨの変化を示す。
【図４】図４は、８価組成物中のＨＢｓＡｇの安定性に関するウエスタンブロットの結果を示す。図４Ａおよび４Ｂ中、レーン１は分子量マーカーを含み、レーン２は１μｇ／ｍｌでＨＢｓＡｇ対照を含み、レーン３は８価組成物の上清を含む。図４Ｂ中、レーン４はＬＳＢを含み、レーン５はレーン２と同じ対照を含み、レーン６はＤＯＣ／ＴＣＡ抽出物を含む。
【実施例】
【０１６０】
（発明を実施するための様式）
ＨＢｓＡｇ発現および精製
ＨＢｓＡｇをコードするＨ．ポリモルファ酵母菌宿主［１０７、１０８］を調製した。３００リットルの発酵槽中で１００リットルの培地を調製し、酵母菌を接種した。１００グラム／リットルで細胞が存在するまで発酵を続けた。この段階で、宿主がメチロトローフ酵母菌であるので、メタノールを加え、発酵を停止させた。最終培養物の体積は１６０〜１７０リットルであった。遠心分離によって培養培地から細胞を採取した。
【０１６１】
精製後にＨＢｓＡｇに非イオン性界面活性剤を添加する代わりに、参考文献３および４中に記載したように、タンパク質の精製中に界面活性剤を使用した。詳細には、採取した酵母細胞を０．１〜０．２％のポリソルベート２０および１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸バッファーに懸濁させた。懸濁物を冷却し、高圧液体ホモジェナイザーを使用して破壊した。
【０１６２】
均質化した細胞懸濁液は、遠心分離によって次いで浄化した。上清にＮａＣｌを加えた後、ポリエチレングリコールを沈殿用に３〜５％の濃度までゆっくり加えた。溶液は５分間攪拌し、３０分間放置し、１０分間遠心分離にかけた。さらなるＰＥＧを８〜１０％まで上清にゆっくり加え、攪拌し２時間放置した。この溶液を１０分間遠心分離にかけた。
【０１６３】
ヒュームドシリカを１〜２％の濃度で上清に加えた。溶液を１２時間攪拌し、遠心分離にかけ、デオキシコール酸ナトリウムを含むホウ砂バッファー中で沈殿を完全に溶かした。水浴中で１００〜１２０分間攪拌した後、溶液を遠心分離にかけ、上清を回収した。流速２００ｍＬ／分でトリス／Ｃｌバッファーを用いて平衡状態にしたＤＥＡＥカラムに上清を充填し、ＮａＣｌ溶液を含むトリス／Ｃｌバッファーで溶出した。塩化セシウムを１．２ｇ／ｍＬの濃度までＤＥＡＥ溶出液に加え、溶液を４０，０００ｒｐｍで超遠心分離にかけた。脱塩したＣｓＣｌプールをＰＢＳで４００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈し、ホルマリンを０．０２５％の濃度まで加え、混合物は７２時間放置した。最後に、残留ホルマリンはＰＢＳを使用して除去した。
【０１６４】
このようにして、ＨＢｓＡｇはポリソルベート２０を含めることによって精製したが、抗原を精製した後に加えたのではなく、組換え細胞を破壊する前に界面活性剤を添加した。
【０１６５】
完全液状多価ワクチン
酵母菌発現型ＨＢｓＡｇ、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび完全細胞百日咳抗原を、アルミニウム塩アジュバントの懸濁液に加えた。混合物のｐＨを調節し、それがアルミニウムアジュバントに吸着した状態にならないようにＨｉｂ−ＣＲＭ１９７複合体を次いで加えた。この方法によって、以下の組成を有する５価ワクチンを得た：
【０１６６】
【表１】
他の実験では、血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹの各々に由来する別個の髄膜炎菌ＣＲＭ１９７複合体を、ＣＲＭ−Ｈｉｂ成分の後に加えて８価ワクチンを得た：
【０１６７】
【表２】
ワクチンの安定性および有効性に関する重要なパラメータはＨｉｂ複合体の加水分解率であり、臨床上の限界は２５％の遊離糖である（参考文献１０９は、２０％は臨床上の免疫原性に影響を与えなかったことを報告する）。このパラメータは、最少の分離および浄化でピコモルレベルにおいて非結合炭水化物の直接定量化を可能にするＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって、５価ワクチンにおいて測定した。分析は遊離糖の量に焦点を当てた。
【０１６８】
遊離糖の量をアッセイし、全体の量の割合として表した。結果は以下の通りであった：
【０１６９】
【表３】
最大２５％の遊離糖が臨床上許容される。すべての値がこの閾値未満であり、２〜８℃において４週間まで６．５％未満であった。熱ストレス条件下（３６〜３８℃で４週間）では、高レベルが見られたが、２５％の値を依然大幅に下回り、最高はロット１の１１．６％であった。多価Ｈｉｂワクチンに関する初期の実験は、３６〜３８℃での１カ月の保存は、２〜８℃での２年の保存より多くのＣＲＭ−Ｈｉｂの加水分解をもたらすことを示している。したがって許容される加水分解は、通常の保存条件下での少なくとも２年の時間規模を超えると予想することができる。
【０１７０】
遊離糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析は、２〜８℃で６カ月後にも実施した。データは以下の通りであった：
【０１７１】
【表４】
このように、４週間と比較して６カ月では遊離糖の割合の非常にわずかな増大があるのみで、値は２５％の値を依然大幅に下回る。したがってＣＲＭ１９７−Ｈｉｂは、３つの配合物において非常に安定している。
【０１７２】
図３Ａは、２〜８℃で保存した３つのロットに関する、６カ月間の５価ワクチンにおけるｐＨの変化を示す。図３Ｂは、３６〜３８℃で保存した３つのロットに関する４週間のｐＨの変化を示す。２〜８℃においてｐＨは６カ月間安定状態であったが、一方熱ストレス条件下では、２週間後に０．１ｐＨ単位のわずかな低下、および４週間後にさらにわずかな低下があった。そうではあったが、すべてのｐＨ値は６．０〜７．０の許容範囲内に留まった。
【０１７３】
全３個の５価ロットの浸透圧は、３１２ｍＯｓｍ／Ｋｇと３１５ｍＯｓｍ／Ｋｇの間、つまり注射用ワクチンに関する２４０〜３６０ｍＯｓｍ／Ｋｇの標的範囲内の中心にあった。
【０１７４】
抗原の効力および免疫原性の評価は、組み合わせワクチンの有効性を評価するために重要である。５価ワクチンにおけるジフテリア、破傷風および百日咳抗原の効力を評価し、ＣＲＭ−ＨｉｂとＨＢｓＡｇの両方の免疫原性を試験した。ＥＬＩＳＡ分析を実施して、免疫処置後の特異的抗体のレベルを評価した。ＨＢｓＡｇの免疫原性の試験は、マウスモデルおよびＨＢＶの効力に関して使用したスケジュールと異なる免疫処置スケジュールを使用して実施した。
【０１７５】
ＤＴＰの効力値は以下の通りであった：
【０１７６】
【表５】
これら３つの抗原のそれぞれに関して、効力試験の結果はいずれも許容下限を有意に上回り、これらの結果は、これら３つの抗原に関する優れた有効性を示す。
【０１７７】
ＨＢｓＡｇの免疫原性を評価するために、１０ＣＤ１マウスの群に、第０日および第１４日に皮下注射（０．５ｍｌ、生理食塩水に１：４に希釈）によって５価ワクチンを与えた。マウスは第２１日に採血し、（ａ）「Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ Ａｎｔｉ−ＨＢｓ ＩＩ」試験（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）または（ｂ）「Ａｕｓａｂ ＥＩＡ」試験（Ａｂｂｏｔｔ）のいずれかを使用してＥＬＩＳＡによってＨＢｓＡｇ特異的抗体を評価した。これらのＥＬＩＳＡ試験は、異なる形式およびＨＢｓＡｇに対する異なる感度を有する。幾何学的平均力価は、したがって２試験間で比較可能ではない。しかし、それぞれの試験の範囲内では血清に関するＧＭＴ値が最適であった。結果は以下の通りであった：
【０１７８】
【表６】
この種のマウス免疫原性アッセイを実施して得たすべてのＧＭＴ値は、文献中で報告されている値より高い。応答率は約１００％の最適レベルで両方の抗原に関して絶えず高い。
【０１７９】
Ｈｉｂの免疫原性を評価するために、８ＣＤ１マウスの群に、第０、１０および２０日に皮下注射（０．５ｍｌ、生理食塩水に１：４に希釈）によって５価ワクチンを与えた。マウスは第３４日に採血し、ＥＬＩＳＡによってＨｉｂ特異的抗体を評価した。結果は以下の通りであった：
【０１８０】
【表７】
ＨＢｓＡｇのアルミニウムアジュバントへの吸着はワクチンの免疫原性に関する重要な要因であり、このパラメータはイムノブロットによって測定した。従ったイムノブロット手順は、ほぼ以下の通りであった：１ｍｌ体積のワクチン上清をＤＯＣ／ＴＣＡ沈殿させ、ＬＳＢを用いて変性させ、次いで１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填し、１μｇの各ロットのＨＢｓＡｇを対照として充填し、ヤギ抗ＨＢｓＡｇ抗体調製物は一次抗体（希釈１：１０００）として使用し、抗ヤギＰＯＤ複合体（希釈１：２５００）は二次抗体として使用した。
【０１８１】
５価ワクチンに関する結果を図２中に示す。図２Ａのレーン６〜８は時間ゼロで組成物中に検出可能な可溶性ＨＢｓＡｇが存在しないことを示し、図２Ｂおよび２Ｃのレーン５〜１０によって、２〜８℃または３６〜３８℃での保存の２週間および４週間後、これは依然として真実であることが確認される。３つの異なるロットにおいて、これらの様々な条件で約９９％のＨＢｓＡｇがアジュバントに依然として吸着した状態であった。
【０１８２】
他の安定性アッセイを、２〜８℃での保存の６カ月後に実施した（図２Ｄ）。３つのロットの各々に関して依然として約９９％吸着した状態であった。
【０１８３】
図２中で使用した陽性対照は、１μｇのＨＢｓＡｇを含んでいた。Ｓペプチド（２４ｋＤａ）に対応する１つのバンド、および凝集に特徴的なバンド（４５ｋＤａまで）が見られた。Ｐｒｅ−Ｓ２は見られなかった。
【０１８４】
８価ワクチンも、同様の方法でＨＢｓＡｇ吸着に関して試験した。１ｍｌのサンプルを１０分間３５００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上清は新たなチューブに除去し、ＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させた。ペレットは２００μｌの抽出バッファーに再懸濁させ、５分間沸騰させ、１０分間１３００ｒｐｍで遠心分離にかけた。２０μｌのこの抽出物およびＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させた上清を、ウエスタンブロット用に１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填した。
【０１８５】
図４Ａは時間ゼロでの８価ワクチンを示し、図４Ｂは２〜８℃での保存の８カ月後のワクチンを示す。図４Ｂのレーン３および６における任意の有意な染色の不在（対照レーン２および５中の１μｇのＨＢｓＡｇで見られるより確実に染色されていないこと）は、この保存期間中ＨＢｓＡｇの吸着は依然として安定状態であることを示す。
【０１８６】
液状／凍結乾燥多価ワクチン
３つの抗原成分を以下のように回収する：
− ３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分：水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したジフテリアトキソイド、さらに水酸化アルミニウムアジュバントに吸着した破傷風トキソイド、および完全細胞百日咳抗原を含むＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を調製した。Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分はリン酸アルミニウムアジュバントも含む。この成分はチメロサールを含むが、２−フェノキシエタノールは含まない。
【０１８７】
− ＨＢｓＡｇ成分：ＨＢｓＡｇを組換え酵母菌から発現させ精製し、リン酸アルミニウム抗原に吸着させる［１１０］。
【０１８８】
− Ｈｉｂ複合体成分：Ｈｉｂ多糖をＨｉｂ、系統２０７５２から調製し、臭化シアンを用いた活性化およびアジピン酸ヒドラジドを用いた誘導体化後、約１：３の糖：担体重量比で、スペーサーをカルボジイミド系縮合によって破傷風トキソイドと共有結合させる。結合体はリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させ［６４］、次いでラクトースと共に凍結乾燥させる。
【０１８９】
Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分はＨＢｓＡｇ成分と混合させる。ＨＢｓＡｇのレベルは２０μｇ／ｍｌである。Ｄのレベルは６０ＩＵ以上である。Ｔのレベルは１２０ＩＵ以上である。Ｐｗのレベルは８ＩＵ以上である。白濁した懸濁液の形態である４価混合物は、ブチルゴム製ストッパーを有するガラスバイアルに水性形態でパッケージして、１用量（０．５ｍｌ）、２用量（１ｍｌ）または１０用量（５ｍｌ）を含ませる。凍結乾燥Ｈｉｂ成分もバイアル中に置く。バイアル当たりの粉末の量は、バイアル当たり１用量、２用量または１０用量での水戻し後、（糖として測定して）５μｇ／ｍｌを得るように定量する。
【０１９０】
２つのバイアルは箱中に１つにパッケージする。箱は１バイアルの各成分（１用量または多用量バイアルのいずれか）または１００バイアルの各成分のいずれかを含む。
【０１９１】
患者への投与用に、水性Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ物質をシリンジに取り出し、凍結乾燥複合体用バイアル中に導入する。凍結乾燥物質を再度活性化させた後、新しいニードルを介してそれをシリンジに再度取り出し、患者にすぐに投与することができる５価ワクチンを得る。様々な３用量の初回免疫処置スケジュール：２、４および６カ月；３、４、および５カ月；または６、１０および１４週を使用することができる。ワクチンは２年時の追加抗原刺激投与として使用することもできる。
【０１９２】
１０用量のバイアルは、１バイアルで１０患者を免疫処置するのに充分な物質を与える。水戻しは第１のシリンジを使用し、次いで１シリンジ当たり１用量で、新たなシリンジを用いて個々の用量を抽出する。他の（あまり好ましくない）アレンジメントでは、１０用量を１シリンジに取り出し、ニードルは患者ごとに変える。
【０１９３】
本発明は単なる実施例によって記載しており、本発明の範囲および精神中に留まりながら変更形態を作製することができることは理解されるはずである。
【０１９４】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０１９５】
【化１】
【０１９６】
【化２】
【０１９７】
【化３】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用するすべての文書は、その全容を参照によって組み込む。
【０００２】
本発明は、２つ以上の病原体由来の混合型免疫原を含むワクチンであり、したがってそのワクチンの投与が２つ以上の病原体に対して対象を同時に免疫処置することができる、組み合わせワクチンの製造の分野にある。詳細には本発明は、組み合わせワクチンの製造における界面活性剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
２種以上の病原性生物由来の抗原を単一用量中に含むワクチンは、「多価」または「混合」ワクチンとして知られている。ジフテリア、破傷風および百日咳に対する防御用の３価ワクチン（「ＤＴＰ」ワクチン）ならびに麻疹、おたふく風邪および風疹に対する防御用の３価ワクチン（「ＭＭＲ」ワクチン）を含めた、ヒトに使用するための様々な組み合わせワクチンが欧州および米国において承認されている。
【０００４】
組み合わせワクチンには患者にとって受ける注射の回数が少なくなるという利点があり、特に小児予防接種に関して、これはコンプライアンスが高まるという臨床上の利点をもたらす（例えば、参考文献１の２９章を参照）。しかし同時に、組み合わせワクチンは、抗原と他の成分の間の物理的および生化学的不適合性、免疫学的干渉、および安定性を含めた要因による製造上の難点を示す。
【０００５】
ワクチンに非抗原成分を含有させることは必要であるが、困難を引き起こす可能性がある。界面活性剤は組み合わせワクチンにおいて特に問題である。それは、ある抗原は最適活性のために界面活性剤を必要とする可能性があるが、別の抗原は界面活性剤が存在すると負の影響を受ける可能性があるからである。さらに、界面活性剤が一般に安全であると認められていても、小児ワクチンに界面活性剤を含有させることはある患者群にとって問題である。
【０００６】
ワクチン分野で特に興味深いのは、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、特にポリソルベート２０（「Ｔｗｅｅｎ２０」またはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしても知られている）およびポリソルベート８０（「Ｔｗｅｅｎ８０」またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られている）種である。ポリソルベート２０は１価ＨＡＶＲＩＸ（商標）Ａ型肝炎ワクチンにおいて見られ、ポリソルベート８０はＴＲＩＰＥＤＩＡ（商標）およびＩＮＦＡＮＲＩＸ（商標）系のワクチンなどの組み合わせワクチンにおいて見られる。これら２つの界面活性剤は、液状ロタウイルスワクチンを安定化させるためにも使用されている［２］。
【０００７】
ポリソルベートはＢ型肝炎表面抗原（「ＨＢｓＡｇ」）を含む組み合わせワクチンの製造においても使用されており、例えば参考文献３（特許文献１）および４（特許文献２）は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの非イオン性界面活性剤を添加することによってＨＢｓＡｇのリン脂質成分への干渉が回避されている、４価Ｄ−Ｔ−Ｐ−ＨＢｓＡｇワクチンを作製するための方法を開示する。参考文献３（特許文献１）および４（特許文献２）の図２（本明細書の図１）中のデータから、界面活性剤はＨＢｓＡｇの抗原性を維持するために必要とされるが、他の成分にはそれほど重要でないことが示される。試験された最高界面活性剤濃度はＨＢｓＡｇ２０μｇ／ｍｌに対して１０μｇ／ｍｌであり、この濃度はまた、最良の抗原性を示した。
【０００８】
参考文献３（特許文献１）および４（特許文献２）の方法では、ＨＢｓＡｇを精製した後に非イオン性界面活性剤が添加される。しかし、ＨＢｓＡｇの精製後に界面活性剤を添加することは最適ではない。それは、製造中に別の処理ステップを必要とし、それにより処理時間が増大し、ＨＢｓＡｇが汚染されるリスクも高まるからである。組み合わせワクチンの作製時に汚染成分が使用されると、１価ワクチンの作製時より最終的な損失は大きく、例えば汚染ＨＢｓＡｇ成分が清潔なＤ−Ｔ−Ｐ成分と混合されると、ＨＢｓＡｇのみでなくＤ−Ｔ−Ｐ−ＨＢｓＡｇ混合物全体を廃棄しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／０５５１０５号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００４８３３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、非イオン性界面活性剤を含有する組み合わせワクチン用に、製造方法において界面活性剤を別の成分として添加する必要がない方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（要旨）
抗原を精製した後に非イオン性界面活性剤を抗原に添加する［３、４］のではなく、本発明は抗原の精製中に非イオン性界面活性剤を使用する。したがって、この界面活性剤は最終組み合わせワクチンにおいてその機能を果たすことができるが、汚染のリスク（したがって、調製後の組み合わせワクチン全体の損失のリスクも）は低下する。
【００１２】
したがって本発明は、組み合わせワクチンを調製するための方法であって、ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、（ｉ）組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊して精製ＨＢｓＡｇ成分を得るステップを含む、酵母細胞からＨＢＶ表面抗原を精製すること、および（ｉｉ）精製ＨＢｓＡｇ成分を非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて組み合わせワクチンを得ることを含む方法を提供する。
【００１３】
前に記載した汚染の難点を回避するために、この方法は、ＨＢｓＡｇ精製後に非イオン性界面活性剤を別の成分として添加するステップを含まない。界面活性剤（または他の界面活性剤、イオン性または非イオン性）が、組み合わせワクチンを得るためにＨＢｓＡｇと組み合わせる他の抗原成分中に存在する可能性はあるが、それ自体を別の成分として界面活性剤を添加することは回避される。したがって、界面活性剤は、別の成分として精製ＨＢｓＡｇ成分に添加されず、抗原を組み合わせる際には添加されない。
【００１４】
本発明は、組み合わせワクチンを調製するための方法であって、ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、精製ＨＢＶ表面抗原を非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて組み合わせワクチンを得るステップを含み、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって精製ＨＢＶ表面抗原が調製される方法も提供する。再度、界面活性剤の別個の添加は回避される。
【００１５】
本発明は、（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによってＨＢＶ表面抗原が調製される、免疫原性組成物も提供する。再度、界面活性剤の別個の添加を回避しながらＨＢｓＡｇを調製した。この生成物は、精製中に使用する非イオン性界面活性剤がＨＢｓＡｇ粒子中に保持される可能性があるので、異なる方法によってＨＢｓＡｇを調製した生成物と区別することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
非イオン性界面活性剤
本発明は、様々な非イオン性界面活性剤［５］、詳細にはワクチン製剤において見られる非イオン性界面活性剤を使用することができる。有機界面活性剤が好ましい。これらは典型的には、アルキレンオキシド（例えば、エチレンオキシド）と、高級アルコール、脂肪酸、アルキルフェノール、アルキルアミン、または少なくとも１つの活性水素原子を有する他の適切な化合物との反応生成物である。大部分の界面活性剤に関して、最も一般的なアルコール、アミンおよび酸はＣ８〜Ｃ１８の範囲の炭素鎖長を有する。最も一般的なアルキルフェノールは、ノニルフェノールおよびオクチルフェノールである。ポリ（オキシエテン）残基を含む界面活性剤が特に好ましい。
【００１７】
例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）の商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変わり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）から誘導されるポリオキシエチレン脂肪族エーテル、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；およびソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮと呼ばれる）、例えばソルビタントリオレート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウレートだけには限られないが、これらを含めた界面活性剤と共に本発明を使用することができる。
【００１８】
本発明は、ポリソルベート２０と共に使用するのに特に適している。この界面活性剤は、ワクチン内を含めてヒトへの投与に関する立証済みの安全性プロファイルを有する。
【００１９】
界面活性剤はその「ＨＬＢ」（親水／親油平衡）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。
【００２０】
非イオン性界面活性剤は、本発明の組成物の成分である。患者への多用量の界面活性剤の投与を回避するために、組成物中の界面活性剤の濃度は３０μｇ／ｍｌを超えず、例えば２５μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、１５μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、５μｇ／ｍｌ以下などであることが好ましい。１０μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００２１】
界面活性剤の濃度を特定するための代替として、組成物中の界面活性剤の量は、ＨＢｓＡｇ各１００μｇに対して５０μｇ未満（例えば４０μｇ以下、３０μｇ以下、２５μｇ以下、２０μｇ以下、１５μｇ以下、１０μｇ以下など）であることが好ましい。参考文献３および４から、界面活性剤：ＨＢｓＡｇの質量比が５０％未満であることも示唆される。ＨＢｓＡｇ１００μｇ当たり２５μｇ未満の界面活性剤が好ましい。
【００２２】
以下でさらに詳細に言及するように、本発明の好ましい方法は、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含む予め混合した成分を使用する。このＤ−Ｔ成分は非イオン性界面活性剤を実質的に含まず、および詳細にはポリソルベート２０および８０を含まないことが好ましい。同様に、予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分は非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート２０および８０を含まない。
【００２３】
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス肝炎を引き起こす既知の因子の１つである。ＨＢＶビリオンは外側タンパク質コートまたはカプシドに囲まれた内部コアからなり、ウイルスコアはウイルスＤＮＡゲノムを含む。カプシドの主な成分は、典型的には約２４ｋＤａの分子量を有する２２６アミノ酸ポリペプチドである、ＨＢＶ表面抗原、またはより一般的に「ＨＢｓＡｇ」として知られるタンパク質である。ＨＢｓＡｇを含むすべての既存のＢ型肝炎ワクチンは、この抗原を通常なワクチンに投与すると、それはＨＢＶ感染に対して防御する抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。
【００２４】
ワクチン製造用に、ＨＢｓＡｇは２つの方法で作製することができる。第１の方法は、ＨＢＶ感染中に多量のＨＢｓＡｇが肝臓中で合成され血流中に放出されるので、慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿から粒子形に抗原を精製することを含む。第２の方法は、組換えＤＮＡ法によってタンパク質を発現させることを含む。本発明の方法と共に使用するためのＨＢｓＡｇは、酵母細胞中で組換えによって発現される。適切な酵母菌には、サッカロミセス属（出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）など）またはハネンズラ属（Ｈａｎｅｎｓｕｌａ）（Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）など）宿主がある。
【００２５】
天然ＨＢｓＡｇと異なり（すなわち、血漿精製産物中と同様に）、酵母菌によって発現されるＨＢｓＡｇは一般にグリコシル化されておらず、これは本発明と共に使用するためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。酵母菌によって発現されるＨＢｓＡｇは非常に免疫原性が高く、血液産物の汚染のリスクなしで調製することができる。
【００２６】
ＨＢｓＡｇは一般に、リン脂質を含む脂質マトリクスを含む、実質的に球状の粒子の形（約２０ｎｍの平均径）であるはずである。酵母菌によって発現されるＨＢｓＡｇ粒子は、天然のＨＢＶビリオン中に見られないホスファチジルイノシトールを含み得る。粒子は免疫系を刺激するために無毒量のＬＰＳも含み得る［６］。
【００２７】
ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ亜型ａｄｗ２に由来することが好ましい。
【００２８】
ＨＢｓＡｇを精製するための多くの方法が当技術分野で知られている（例えば、参考文献７〜３３を参照）。これらの方法は１価ＨＢｓＡｇ調製物を作製する際に使用するために開示されるが、参考文献３および４中に開示された方法と異なり、これらはいずれも、特に組み合わせワクチンにおいて使用するためのＨＢｓＡｇの精製に関するものではない。これらの方法および他の方法のいずれかを使用することができ、ただし、この方法は、組換え酵母細胞中での発現後の抗原を精製するのに適しており、この精製は、酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するステップを含む。
【００２９】
ＨＢｓＡｇを精製するのに好ましい方法は、細胞破壊後の、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、超遠心分離、脱塩および滅菌濾過を含む。溶解物は（例えば、ポリエチレングリコールを使用して）細胞破壊後に沈殿させ、ＨＢｓＡｇを限外濾過用に溶液中に残しておいてよい。
【００３０】
精製後ＨＢｓＡｇに透析を施すことができ（例えばシステインと）、これを使用して、ＨＢｓＡｇ調製中に使用された可能性があるチメロサールなどの任意の水銀防腐剤を除去することができる［３０、３４］。
【００３１】
ＨＢｓＡｇの量は典型的にはマイクログラムで表され、ワクチン用量当たりのＨＢｓＡｇの典型的な量は１０μｇである。
【００３２】
「Ｓ」配列以外に、表面抗原はプレ−Ｓ配列の全体または一部分、例えばプレ−Ｓ１および／またはプレ−Ｓ２配列の全体または一部分を含むことができる。
【００３３】
非ＨＢＶ抗原
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの防御抗原を含む。非ＨＢＶ病原体はウイルス性および／または細菌性であってよい。
【００３４】
典型的なウイルス性病原体には、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスがあるが、これらだけには限られない。
【００３５】
典型的な細菌性病原体には、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ｂ型および非分類系統を含めたインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹを含めた髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含めた肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；およびカタラリス菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）があるが、これらだけには限られない。
【００３６】
ジフテリア菌はジフテリアを引き起こす。注射後に特異的抗トキシン抗体を誘導する能力を保持しながら、ジフテリア毒素を（例えば、ホルマリンまたはホルムアルデヒドを使用して）処理して毒性を除去することができる。これらのジフテリアトキソイドはジフテリアワクチンにおいて使用され、参考文献１の１３章中により詳細に開示される。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製されるジフテリアトキソイドである。ジフテリアトキソイドは増殖培地（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ培地、またはＬｉｎｇｇｏｕｄおよびＦｅｎｔｏｎ培地）中でジフテリア菌を増殖させることによって得ることができ、培地にウシ抽出物を補充することが可能であり、後にホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈殿が可能である。トキソイド物質は、滅菌濾過および／または透析を含む方法によって次いで処理することができる。
【００３７】
破傷風菌は破傷風を引き起こす。破傷風毒素を処理して防御トキソイドを与えることができる。これらのトキソイドは破傷風ワクチンにおいて使用され、参考文献１の２７章中により詳細に開示される。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理によって調製される破傷風トキソイドである。破傷風トキソイドは増殖培地（例えば、ウシカゼイン由来のＬａｔｈａｍ培地）中で破傷風菌を増殖させることによって得ることができ、後にホルムアルデヒド処理、限外濾過および沈殿が可能である。滅菌濾過および／または透析を含む方法によって、次いで物質を処理することができる。
【００３８】
百日咳菌は百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（完全細胞、不活性百日咳菌細胞の形；「ｗＰ」）あるいは無細胞（「ａＰ」）のいずれかである。細胞性百日咳抗原の調製は充分に文書化されており［例えば、参考文献１の２１章を参照］、例えば、それは培養第Ｉ期の百日咳菌の熱不活化によって得ることができる。無細胞抗原を使用する場合、１つ、２つまたは（好ましくは）３つの以下の抗原が含まれる：（１）解毒した百日咳毒素（百日咳トキソイド、すなわち「ＰＴ」）；（２）繊維状ヘマグルチニン（「ＦＨＡ」）；（３）ペルタクチン（「６９キロダルトンの外膜タンパク質」としても知られている）。この３つの抗原は、改変型Ｓｔａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ液状培地中で増殖させた百日咳菌培養物からの単離によって調製することが好ましい。ＰＴおよびＦＨＡは発酵ブロスから単離することができ（例えば、ヒドロキシアパタイトゲル上での吸着によって）、一方ペルタクチンは、熱処理および凝集反応（例えば、塩化バリウムを使用する）によって細胞からから抽出することができる。抗原は連続的なクロマトグラフィーおよび／または沈殿ステップにおいて精製することができる。ＰＴおよびＦＨＡは疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ペルタクチンはイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。ＦＨＡおよびペルタクチンは、本発明による使用の前にホルムアルデヒドで処理することができる。ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドを用いた処理によってＰＴを解毒することが好ましい。この化学的解毒手順に対する代替として、ＰＴは突然変異誘発によって酵素活性が低下した突然変異ＰＴであってよいが［３５］、化学的処理による解毒が好ましい。
【００３９】
ｂ型インフルエンザ菌（「Ｈｉｂ」）は細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは典型的には被膜糖抗原に基づいており［例えば、参考文献１の１４章］、その調製は充分に文書化されている［例えば、参考文献３６〜４５］。Ｈｉｂ糖は担体タンパク質と結合して、特に子供においてその免疫原性を増大させる。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、および血清型Ｂの髄膜炎菌由来の外膜タンパク質複合体である。破傷風トキソイドは、「ＰＲＰ−Ｔ」と一般に呼ばれる生成物において使用される、好ましい担体である。臭化シアンを使用してＨｉｂ被膜多糖を活性化させ、活性糖をアジピン酸リンカー（（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなど）、典型的には塩酸塩）と結合させ、次いでリンカー−糖物体と破傷風トキソイド担体タンパク質を反応させることによってＰＲＰ−Ｔを作製することができる。複合体の糖部分は、Ｈｉｂ細菌から調製した完全長のポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）、および／または完全長ＰＲＰの断片を含み得る。１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：２と５：１の間の比、および１：１．２５と１：２．５の間の比を有する複合体を使用することができる。好ましいワクチンでは、しかし、糖と担体タンパク質の重量比は１：２．５と１：３．５の間である。破傷風トキソイドが抗原および担体タンパク質の両方として存在するワクチンでは、その時複合体中の糖と担体タンパク質の重量比は１：０．３と１：２の間である可能性がある［４６］。Ｈｉｂ複合体の投与は０．１５μｇ／ｍｌ以上、およびより好ましくは１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらすことが好ましく、これらは標準的な応答閾値である。
【００４０】
髄膜炎菌は細菌性髄膜炎を引き起こす。生物の被膜多糖に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺを含めたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの様々な血清型が同定されてきている。疾患と最も関係がある血清型は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹである。血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する現在のワクチンは被膜糖抗原に基づくものであるが、この手法は血清型Ｂには適しておらず、したがってタンパク質抗原および外膜小胞を代わりに使用する。被膜糖は担体タンパク質と結合して免疫原性を増大させる。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、およびインフルエンザ菌タンパク質Ｄである。複合体の糖部分は、髄膜炎菌から調製した完全長の糖、および／またはその断片を含み得る。血清型Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−系統のいずれかから調製することができる。血清型Ａの糖に関しては、少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上）のマンノースアミン残基が、Ｃ−３位置においてＯ−アセチル化されることが好ましい。１：１０（すなわち、過剰なタンパク質）と１０：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）、例えば１：５と５：１の間、１：２．５と２．５：１の間の比、または１：１．２５と１．２５：１の間の比を有する髄膜炎菌複合体を使用することができる。複合体の投与によって、少なくとも４倍、および好ましくは少なくとも８倍の関連する血清型の血清細菌アッセイ（ＳＢＡ）における力価の増大をもたらすことが好ましい。ＳＢＡにおける力価は、ベビーラビット補体またはヒト補体を使用して測定することができる［４７］。
【００４１】
肺炎連鎖球菌は細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂおよび髄膜炎菌に関しては、既存のワクチンは被膜糖に基づく。肺炎連鎖球菌の２つ以上の血清型、および詳細には少なくとも血清型６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の糖を含むことが好ましい。他の血清型は１、３、４、５、７Ｆ、９Ｖおよび１８Ｃから選択されることが好ましい。例えば、２３の異なる血清型に由来する多糖の混合物が広く使用されており、５〜１１の異なる血清型に由来する多糖を含む複合体ワクチンも同様である［４８］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒ（商標）［４９］は７つの血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）に由来する複合体抗原を含む。糖は担体タンパク質と結合することが好ましい［例えば、参考文献５０〜５２］。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイドのＣＲＭ１９７誘導体、およびインフルエンザ菌タンパク質Ｄである。ＰｒｅｖＮａｒ（商標）製品中の糖は、０．５ｍｌ用量当たり２μｇの各糖（４μｇの血清型６Ｂ）で、還元的アミノ化によってＣＲＭ１９７と個別に結合する。肺炎球菌に由来する糖抗原の使用に対する代替として、組成物は１つまたは複数のポリペプチド抗原を含むことができる。数系統の肺炎球菌のゲノム配列が利用可能であり［５３、５４］、これらは逆ワクチン法に供して［５５〜５８］、適切なポリペプチド抗原を同定することができる［５９、６０］。例えば組成物は、参考文献６１中に定義されるように、以下の抗原：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３０の１つまたは複数を含むことができる。組成物は、２つ以上（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個の）これらの抗原を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は肺炎球菌に由来する糖とポリペプチド抗原の両方を含むことができる。これらは単純な混合物において使用することができ、あるいは肺炎球菌糖抗原は肺炎球菌タンパク質と結合させることが可能である。このような実施形態に適した担体タンパク質には、前述の肺炎球菌タンパク質抗原がある［６１］。
【００４２】
モラクセラカタラーリスは中耳炎および副鼻腔炎を引き起こし、時折咽頭炎の原因となる。参考文献６２中に総説されるように、ワクチンは現在研究中である。
【００４３】
ＨＢＶと同様に、ＨＡＶは肝炎を引き起こす。ＨＡＶワクチンは参考文献１の１５章中に開示されている。好ましいＨＡＶ成分は不活性ウイルスに基づき、不活性化はホルマリン処理によって実施することができる。ウイルスはＭＲＣ−５細胞などのヒト胎児肺２倍体線維芽細胞において増殖し得る。好ましいＨＡＶ系統はＨＭ１７５であるが、ＣＲ３２６Ｆを使用することもできる。ウイルス増殖を可能にする条件下で、細胞を増殖させることが可能である。細胞を溶解し、生成した懸濁液は限外濾過およびゲル透過クロマトグラフィーによって精製することができる。
【００４４】
ポリオウイルスは灰白髄炎を引き起こす。経口ポリオウイルスワクチンを使用する代わりに、参考文献１の２４章中により詳細に開示するように、本発明は不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）を使用する。細胞培養中にポリオウイルスを増殖させることが可能であり、好ましい培養はサル腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞系を使用する。Ｖｅｒｏ細胞は、都合良くマイクロキャリア培養することができる。増殖後、限外濾過、ダイアフィルトレーション、およびクロマトグラフィーなどの技法を使用してビリオンを精製することができる。患者に投与する前に、ポリオウイルスは不活化しなければならず、これはホルムアルデヒドを用いた処理によって実施することができる。灰白髄炎は、ポリオウイルスの３つの型の１つによって引き起こされる可能性がある。３つの型は類似しており同一の症状を引き起こすが、これらは抗原的に非常に異なり、１つの型による感染は他の型による感染に対して防御しない。したがって、本発明では３つのポリオウイルス抗原：ポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ系統）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ−１系統）、およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ系統）を使用することが好ましい。これらのウイルスは個別に増殖、精製および不活化し、次いで組み合わせて本発明と共に使用するための多量の３価混合物を得ることが好ましい。ＩＰＶの量は典型的には「ＤＵ」単位（「Ｄ抗原単位」［６３］）で表す。
【００４５】
麻疹、おたふく風邪および風疹ウイルスに対して防御するための抗原は、知られている１価および３価（「ＭＭＲ」）ワクチンにおいて見られるように、典型的には生ウイルスである。麻疹ウイルスワクチンは、参考文献１の１９章中により詳細に記載されている。おたふく風邪ウイルスワクチンは、参考文献１の２０章中により詳細に記載されている。風疹ウイルスワクチンは、参考文献１の２６章中により詳細に記載されている。典型的な麻疹ウイルス系統には、Ｍｏｒａｔｅｎ；Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ；Ｓｃｈｗａｒｚ；Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ−Ｚａｇｒｅｂ；ＣＡＭ−７０；ＡＩＫ−Ｃ；ＴＤ９７；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−１６；Ｓｈａｎｇｈａｉ−１９１などがある。ＳｃｈｗａｒｚおよびＭｏｒａｔｅｎ系統が、米国および欧州で最も一般的に使用されている。典型的なおたふく風邪ウイルス系統には、Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ；ＲＩＴ４３８５；Ｕｒａｂｅ；Ｈｏｓｈｉｎｏ；Ｒｕｂｉｎｉ；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−３；Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ；Ｍｉｙａｈａｒａ；Ｔｏｒｉｉ；ＮＫＭ−４６；Ｓ−１２などがある。Ｊｅｒｙｌ Ｌｙｎｎ、ＲＩＴ４３８５、ＵｒａｂｅおよびＬｅｎｉｎｇｒａｄ−Ｚａｇｒｅｂ系統が、最も一般的な世界規模の系統である。典型的な風疹ウイルス系統には、ＲＡ２７／３；Ｍａｔｓｕｂａ；ＴＣＲＢ１９；Ｔａｋａｈａｓｈｉ；Ｍａｔｓｕｕｒａ；ＴＰ−３３６などがある。ＲＡ２７／３は、西欧諸国で使用されている最も一般的な系統である。
【００４６】
水痘に対して防御するためのＶＺＶ抗原は典型的には、Ｏｋａ系統のウイルスに基づく生ウイルスである。ＶＺＶワクチンは、参考文献１の２８章中により詳細に記載されている。
【００４７】
インフルエンザウイルス抗原は、参考文献１の１７および１８章中により詳細に記載されている。広義には、インフルエンザウイルスワクチンは生ウイルスまたは不活化ウイルスに基づいてよく、不活化ワクチンは完全ウイルス、「スプリット」ウイルスまたは精製表面抗原（ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ含む）に基づいてよい。ワクチンを調製するために使用するウイルスは、卵または細胞培養物のいずれかで増殖させることが可能である。インフルエンザウイルス用のワクチン系統は季節ごとに変わる。現在の大流行間期では、ワクチンは典型的には２つのインフルエンザＡ系統（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ系統を含み、３価ワクチンが典型的である。本発明は、（特にインフルエンザＡウイルスの）Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９亜型系統などの流行系統（すなわち、ワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団がそれに対する免疫がない系統）由来のウイルスも使用することができ、流行系統用のインフルエンザワクチンは１価であってよく、あるいは流行系統によって補充した通常の３価ワクチンに基づくものであってよい。インフルエンザウイルスはリアソータント系統であってよく、逆遺伝学的技法によって得ることができている。ウイルスは弱毒化することができる。ウイルスは温度感受性であってよい。ウイルスは低温適応性であってよい。
【００４８】
ワクチンにおいて使用するためのこれらの病原体由来の抗原成分は、略称で一般に呼ばれる：「Ｄ」はジフテリアトキソイド、「Ｔ」は破傷風トキソイド、「Ｐ」は百日咳抗原、「Ｐａ」は無細胞、「Ｐｗ」は細胞性、「Ｈｉｂ」はｂ型インフルエンザ菌被膜糖、「ＭｅｎＡ」、「ＭｅｎＢ」、「ＭｅｎＣ」、「ＭｅｎＷ」および「ＭｅｎＹ」はそれぞれの髄膜炎菌の血清型、「ＩＰＶ」は不活化ポリオウイルス、および「Ｓｐｎ」は肺炎球菌
。
【００４９】
抗原成分をＨＢｓＡｇと組み合わせて多価組成物を調製するとき、抗原は個別に加えることができ、あるいはＨＢｓＡｇと組み合わせる前に抗原を予め混合することができる。ＤおよびＴ抗原を使用する場合、予め混合したＤ−Ｔ成分を使用することが好ましい。この２価成分は本発明の方法中で使用することができる、例えばそれをＨＢｓＡｇと組み合わせて、３価Ｄ−Ｔ−ＨＢＶ成分を作製することができる。代替として、Ｄ−Ｔ成分は他の非ＨＢＶ抗原（例えば、無細胞百日咳抗原）と組み合わせることができ、したがってその成分はＨＢｓＡｇなどと組み合わせることができる。Ｄ、ＴおよびＰｗ抗原を使用する場合、予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を使用すること、したがって本発明の方法中にこの成分を使用することが好ましい。
【００５０】
アジュバントを本発明の組成物中に含めるとき、アジュバントは様々な段階で加えることもできる。典型的には、本発明の方法中で使用する前に抗原をアジュバントと組み合わせているはずであるが（例えば、２価Ｄ−Ｔ混合物は本発明の方法中で使用する前にアルミニウム塩アジュバントに吸着しているはずであり、これはトキソイドを別々に調製し、その各々を水酸化アルミニウムアジュバントに別々に吸着させ、次いで２つの吸着トキソイドを（場合によっては他のアジュバントと）混合して本発明の方法中で使用するための物質を得ることによって都合良く実施することができる）、抗原を混合した後にアジュバントを加えること、またはアジュバントに抗原を加えることも可能である（例えば、水性アジュバントで始めるために、したがって抗原は個別あるいは予め混合して加える）。以下に記載するように、ＨＢｓＡｇ成分は、非ＨＢＶ抗原成分と組み合わせる前にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させることが好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい組成物は、ＨＢｓＡｇ以外にＤ、ＴおよびＰ抗原（例えば、参考文献３および４）を少なくとも含む。特に好ましい組成物は以下の組合せである：
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５
− ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ
− ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ
− ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎ウイルス。
【００５２】
これらの組成物は列挙した抗原からなっていてよく、あるいは他の病原体由来の抗原をさらに含むことができる。したがって、これらは別々に、あるいは他のワクチンの成分として使用することができる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は５価Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＨＢＶ−ＩＰＶではない［３０］。したがって組成物は、Ｐｗ成分および／または少なくとも１つの複合体を含むことができる。
【００５４】
アジュバント
本発明の好ましい免疫原性組成物はアジュバントを含み、このアジュバントは１つまたは複数のアルミニウム塩、および特にリン酸アルミニウムアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムアジュバントを含むことが好ましい。
【００５５】
本発明の方法中で使用する抗原成分は、その方法中で使用する前にアルミニウムアジュバントを含む、すなわち抗原成分は、アジュバントと「予め混合されている」あるいはアジュバントに「予め吸着している」ことが好ましい。
【００５６】
ＨＢｓＡｇおよびジフテリアトキソイドを含む組成物において、ジフテリアトキソイドを水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることが可能である。
【００５７】
ＨＢｓＡｇおよび破傷風トキソイドを含む組成物において、破傷風トキソイドを水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることは可能であるが、これは必要ではない（例えば、全破傷風トキソイドの０〜１０％の間の吸着を使用することができる）。
【００５８】
ＨＢｓＡｇおよび完全細胞百日咳抗原を含む組成物において、ｗＰ抗原は水酸化アルミニウムアジュバントおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせることが好ましい。
【００５９】
ＨＢｓＡｇおよび無細胞百日咳抗原を含む組成物において、百日咳抗原は１つまたは複数のアルミニウム塩アジュバントに吸着させることが可能であり、あるいは非吸着状態で加えることが可能である。
【００６０】
ペルタクチンが組成物中に存在する場合、ペルタクチンは、本発明の方法中で使用する前に水酸化アルミニウムアジュバントに吸着することが好ましい。ＰＴおよびＦＨＡは、本発明の方法中で使用する前に、水酸化アルミニウムアジュバントまたはリン酸アルミニウムに吸着させることが可能である。好ましい実施形態では、本発明の方法中で使用する前にＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンを別々に、水酸化アルミニウムに予め吸着させる。
【００６１】
ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ抗原を含む組成物において、Ｈｉｂ複合体は非吸着状態であり得るが、それはリン酸アルミニウムアジュバントに吸着することが好ましい［６４］。このような吸着は、Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−Ｈｉｂ−ＨＢｓＡｇ抗原を含むワクチンにおいて特に有用である。他の複合抗原（例えば、髄膜炎菌、肺炎球菌）を同様にアルミニウム塩（例えば、ホスフェート）に吸着させることが可能であり、あるいはこれらは非吸着状態であってよい［６５］。
【００６２】
ＩＰＶ抗原は典型的には、本発明の方法中で使用する前に如何なるアジュバントにも吸着しないが、しかしＩＰＶ抗原は、他の成分に源を発するアルミニウムアジュバントに吸着した状態になり得る。
【００６３】
参考文献６６中に記載された方法を使用して、組成物中のＨＢｓＡｇをリン酸アルミニウムに吸着させることが可能である。リン酸アルミニウムへの吸着はよく知られているＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（商標）製品とは対照的であるが（この場合ＨＢｓＡｇは水酸化アルミニウムに吸着する）、ＨＥＰＡＣＣＩＮＥ（商標）およびＲＥＣＯＭＢＩＶＡＸ（商標）製品と同じである。参考文献６７中に言及されるように、リン酸アルミニウムは水酸化アルミニウムより良いＨＢｓＡｇのアジュバントである可能性がある。（よく知られているＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ（商標）製品中と同様に）ＨＢｓＡｇは最終ワクチン中の水酸化アルミニウムアジュバントに吸着させることが可能であり、あるいは非吸着状態を保ち得るが、それは一般にリン酸アルミニウムアジュバントに吸着するはずである。さらにＨＢｓＡｇは、本発明の方法中で使用する前にリン酸アルミニウムに予め吸着させることが好ましい。
【００６４】
本発明の方法が、ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドがＨＢｓＡｇとそれらを組み合わせる前に混合されている成分を使用する場合、このＤ−Ｔ混合物は、ＤおよびＴ抗原が吸着する水酸化アルミニウムアジュバントを含むことが好ましい。
【００６５】
本発明の方法が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび完全細胞百日咳抗原がＨＢｓＡｇとそれらを組み合わせる前に混合されている成分を使用する場合、このＤ−Ｔ−Ｐｗ混合物は、ＤおよびＴ抗原が吸着する水酸化アルミニウムアジュバントと、リン酸アルミニウムアジュバントの両方を含むことが好ましい。
【００６６】
現在使用されているアルミニウムアジュバントは典型的には、「水酸化アルミニウム」または「リン酸アルミニウム」アジュバントのいずれかと呼ばれている。しかし、いずれも存在する実際の化学化合物を正確に記載していないので、これらは便宜上の名称である（例えば、参考文献６８の９章を参照）。本発明は、アジュバントとして一般に使用される「水酸化物」または「リン酸」塩のいずれかを使用することができる。
【００６７】
「水酸化アルミニウム」として知られるアジュバントは典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは通常少なくとも一部分が結晶である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外線（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ−１での吸着バンドおよび３０９０〜３１００ｃｍ−１での強いピークの存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などの他のアルミニウム化合物と識別することができる（参考文献６８の９章）。
【００６８】
「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは典型的には、少量のサルフェートもしばしば含むヒドロキシリン酸アルミニウムである。それらは沈殿によって得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度は、塩中のホスフェートとヒドロキシルの置換度に影響を与える。ヒドロキシリン酸は一般に０．３と０．９９の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸はヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ４と識別することができる。例えば、（例えば、２００℃に加熱したときの）３１６４ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンドは、構造ヒドロキシルの存在を示す（参考文献６８の９章）。
【００６９】
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に０．３と１．２の間、好ましくは０．８と１．２の間、およびより好ましくは０．９５±０．１であるはずである。リン酸アルミニウム、特にヒドロキシリン酸塩は一般に非晶質であるはずである。典型的なアジュバントは、０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌで含まれる０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは一般に微粒子であるはずである。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後に０．５〜２０μｍ（例えば、約５〜１０μｍ）の範囲である。
【００７０】
リン酸アルミニウムのＰＺＣはホスフェートとヒドロキシルの置換度と逆の関係にあり、沈殿によって塩を調製するために使用する反応物の反応条件および濃度に応じて、この置換度は変わる可能性がある。溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変えること（より多い量のリン酸＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジンバッファーなどのバッファーを加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によってもＰＺＣは変わる。本発明により使用するリン酸アルミニウムは、４．０と７．０の間のＰＺＣ、より好ましくは５．０と６．５の間、例えば約５．７のＰＺＣを一般に有するはずである。
【００７１】
本発明の組成物を調製するために使用するリン酸アルミニウム溶液は、バッファー（例えば、リン酸またはヒスチジンまたはトリスバッファー）を含み得るが、これは常に必要なわけではない。リン酸アルミニウム溶液は、滅菌済みであり発熱物質を含まないことが好ましい。リン酸アルミニウム溶液は、例えば１．０ｍＭと２０ｍＭの間、好ましくは５ｍＭと１５ｍＭの間、およびより好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離水性リン酸イオンを含み得る。リン酸アルミニウム溶液は、塩化ナトリウムも含み得る。塩化ナトリウムの濃度は０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．５〜５０ｍｇ／ｍｌ、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、２〜１０ｍｇ／ｍｌ）の範囲であることが好ましく、およびより好ましくは約３±１ｍｇ／ｍｌである。ＮａＣｌの存在は、抗原の吸着前のｐＨの正確な測定を容易にする。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ポリソルベート８０、Ｓｐａｎ８５およびスクアレンの混合物を含む水中油型エマルジョンを含む組成物を除外することができる［６９］。いくつかの実施形態では、本発明は、油、α−トコフェロールおよびポリソルベート８０の混合物を含む組成物を除外することができる［７０］。いくつかの実施形態では、本発明は、サポニンアジュバント（ＱＳ２１など）および非イオン性界面活性剤（ポリソルベート４０、６０または８０など）を含む組成物を除外することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、サポニンアジュバント、代謝性油および非イオン性界面活性剤を含む組成物を除外することができる［７１］。いくつかの実施形態では、本発明は、サポニンアジュバント、水中油型エマルジョンおよびステロールを含む組成物を除外することができる［７２］。いくつかの実施形態では、本発明は、３ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１、トリグリセリドおよび水中油型エマルジョンを含む組成物を除外することができる［７３］。
【００７３】
精製ＨＢｓＡｇと他の抗原の組合せ
本発明の方法は、精製ＨＢｓＡｇを少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体の由来の少なくとも１つの抗原と合わせるステップを含む。
【００７４】
抗原は個別に連続して組み合わせることができ、あるいは抗原を予め混合し、一緒に加えることができる。例えば、４価ＤＴＰ−ＨＢｓＡｇワクチンは、容器へのＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰ抗原の連続的な添加を含む方法によって、あるいはＤ、ＴおよびＰ抗原を予め混合し、次いでＨＢｓＡｇとＤＴＰ混合物を組み合わせることによって作製することができる。
【００７５】
抗原成分は任意の適切な順序で組み合わせることができる。
【００７６】
非ＨＢＶ病原体の由来の抗原は界面活性剤を含むことができ、これはＨＢｓＡｇ精製中に使用する非イオン性界面活性剤と同じであるか、あるいはそれと異なってよい。界面活性剤添加に関する多数の別ステップが回避されるので、他の抗原成分が界面活性剤を含む場合、本発明の方法は特に有用である。１つまたは複数の非ＨＢＶ成分がポリソルベート８０を含む方法が好ましい。
【００７７】
ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドが本発明の組成物中に含まれる場合、それらはＨＢｓＡｇと組み合わせる前に予め混合することが好ましい。したがって本発明の方法は、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分を、Ｄ抗原とＴ抗原の両方を含む第２の成分と組み合わせることを含む。同様に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび完全細胞百日咳抗原が組成物中に含まれる場合、それらは予め混合することが好ましく、したがっ
て本発明の方法は、ＨＢｓＡｇを含む第１の成分を、Ｄ、ＴおよびＰｗ抗原を含む第２の成分と組み合わせることを含む。
【００７８】
Ｄ−Ｔ混合物を使用する場合、本発明のワクチン中のジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの比は、通常（Ｌｆ単位で測定して）２：１と３：１の間、好ましくは２．４：１と２．６：１の間であり、２．５：１であることがより好ましい。
【００７９】
アジュバントを本発明の組成物中に含めるとき、様々な段階でアジュバントを加えることも可能である。典型的には、抗原は、本発明の方法で使用する前にアジュバントと組み合わせるが（例えば、２価Ｄ−Ｔ混合物は、本発明の方法で使用する前にアルミニウム塩アジュバントに吸着する）、抗原を混合した後にアジュバントを加えること、あるいは抗原をアジュバントに加えることも可能である（例えば、水性アジュバントで始め、次いで抗原を個別にまたは予め混合して添加すること）。前に記載したように、非ＨＢＶ抗原成分と組み合わせる前に、ＨＢｓＡｇ成分をリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させることが可能である。
【００８０】
組み合わせワクチン
本発明の組成物は（ａ）抗原成分、および（ｂ）非抗原成分を含むことができる。抗原成分は前に記載した抗原を含むか、あるいはそれらからなってよい。非抗原成分は、以下でさらに詳細に記載するように、担体、アジュバント、賦形剤、バッファーなどを含むことができる。これらの非抗原成分は様々な供給源を有し得る。例えばそれらは、製造中に使用する、あるいはこれらの成分と別に加えることができる抗原またはアジュバント物質の１つ中に存在する可能性がある。
【００８１】
本発明の好ましい組成物は、１つまたは複数の医薬担体および／または賦形剤を含む。
【００８２】
緊張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌの間で存在してよい。
【００８３】
組成物は一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇと３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧を有するはずであり、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入ることがより好ましいはずである。浸透圧は予防接種によって引き起こされる痛みに対して影響がないことは以前に報告されているが［７４］、この範囲の浸透圧を保つことはそれにもかかわらず好ましい。
【００８４】
本発明の組成物は１種または複数種のバッファーを含むことができる。典型的なバッファーには、リン酸バッファー、トリスバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー、またはクエン酸バッファーがある。バッファーは典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含まれるはずである。
【００８５】
本発明の組成物のｐＨは一般に５．０と７．５の間、およびより典型的には最適な安定性のために５．０と６．０の間、あるいはジフテリアトキソイドおよび／または破傷風トキソイドが存在する場合、６．０と７．０の間であるはずである。したがって本発明の方法は、パッケージ前にバルクワクチンのｐＨを調節するステップを含むことができる。
【００８６】
本発明の組成物は滅菌済みであることが好ましい。
【００８７】
本発明の組成物は発熱物質を含まない、例えば用量当たり１ＥＵ未満（エンドトキシン単位、標準指標）、および好ましくは用量当たり０．１ＥＵ未満を含むことが好ましい。
【００８８】
本発明の組成物はグルテンを含まないことが好ましい。
【００８９】
ＨＢｓＡｇの吸着性のため、最終的なワクチン製品は、不透明な外見を有する懸濁液である可能性がある。この外見は、微生物による汚染が容易に目に見えないことを意味し、したがってワクチンは抗菌剤を含むことが好ましい。ワクチンを多用量容器中にパッケージするとき、これは特に重要である。封入するのに好ましい抗菌剤は、２−フェノキシエタノールおよびチメロサールである。しかし、本発明の方法中に水銀防腐剤（例えばチメロサール）は使用しないことが好ましい。したがって、方法中で使用する成分の１つからすべてが、水銀防腐剤を実質的に含まないでよい（特に、２価Ｄ−Ｔ成分；ＩＰＶ成分；複合体成分）。しかし、本発明中で使用する前に成分（特にＨＢｓＡｇ）をこのような防腐剤で処理した場合、微量の存在が避けられない可能性がある。しかし安全性のために、最終組成物は約２５ｎｇ／ｍｌ未満の水銀を含むことが好ましい。最終的なワクチン製品は、検出可能なチメロサールを含まないことがより好ましい。これは一般に、本発明の方法中のその添加前に抗原調製物から水銀防腐剤を除去すること、または組成物を生成するために使用する成分の調製中のチメロサールの使用を避けることによって実施されるはずである。
【００９０】
２価Ｄ−Ｔ混合物を本発明の方法中で使用する場合、それはチメロサールを含まない状態でなければならない。いくつかの実施形態では、Ｄ−Ｔ混合物は２−フェノキシエタノールを含む可能性があるが、他の実施形態では、Ｄ−Ｔ混合物はチメロサールおよび２−フェノキシエタノールを含まない。３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物を本発明の方法中に使用する場合、それは２−フェノキシエタノールを含まないでよいが、チメロサールを含む可能性がある。
【００９１】
製造中、望ましい最終濃度を得るための成分の希釈は、通常ＷＦＩ（注射用水）を用いて実施するはずである。
【００９２】
Ａｌ３＋の形態で表す本発明の組成物中のリン酸アルミニウムの濃度は５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば４ｍｇ／ｍｌ以下、３ｍｇ／ｍｌ以下、２ｍｇ／ｍｌ以下、１ｍｇ／ｍｌ以下などであることが好ましい。
【００９３】
本発明の組成物中のＨＢｓＡｇの濃度は６０μｇ／ｍｌ未満、例えば５５μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、４５μｇ／ｍｌ以下、４０μｇ／ｍｌ以下などであることが好ましい。約２０μｇ／ｍｌの濃度が典型的である。
【００９４】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドの濃度は、典型的には少なくとも５０ＩＵ／ｍｌである。
【００９５】
本発明の組成物中の破傷風トキソイドの濃度は、典型的には少なくとも１００ＩＵ／ｍｌである。
【００９６】
本発明の組成物中のジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの比は、通常（Ｌｆ単位で測定して）２：１と３：１の間、好ましくは２．４：１と２．６：１の間であり、２．５：１であることがより好ましい。
【００９７】
本発明の組成物中のｗＰ抗原の量は、典型的には少なくとも８ＩＵ／ｍｌである。
【００９８】
本発明の組成物中の糖として測定したＨｉｂ複合体の量は、典型的には１０μｇ／ｍｌと３０μｇ／ｍｌの間である。
【００９９】
ＥＵ（Ｅｌｉｓａ単位）で測定したＨＡＶ抗原の量は、典型的には少なくとも６００ＥＵ／ｍｌである。
【０１００】
ＩＰＶ抗原の量は系統の血清型に依存する。１型ウイルスに関しては、組成物は約８０ＤＵ／ｍｌを典型的には含む。２型ウイルスに関しては、組成物は約１６ＤＵ／ｍｌを典型的には含む。３型ウイルスに関しては、組成物は約６５ＤＵ／ｍｌを典型的には含む。
【０１０１】
本発明の組成物中の糖として測定した髄膜炎菌複合体の量は、各血清型に関して典型的には５μｇ／ｍｌと２５μｇ／ｍｌの間である。
【０１０２】
本発明の組成物中の糖として測定した肺炎球菌複合体の量は、各血清型に関して典型的には２μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの間である。
【０１０３】
本発明の組成物は、０．５ｍｌの用量で患者に投与することが好ましい。０．５ｍｌの用量という言及は、正規分布の分散、例えば０．５ｍｌ±０．０５ｍｌを含むことは理解されるはずである。
【０１０４】
本発明は、患者への投与用に次いで分配することができる、個々の用量にパッケージするのに適したバルク材料を提供することができる。前述の濃度は典型的には最終パッケージ用量における濃度であり、したがってバルクワクチンにおける濃度はさらに高い可能性がある（例えば、希釈によって最終濃度まで低下させるために）。
【０１０５】
本発明の組成物は、一般に水性形態であるはずである。
【０１０６】
個々の抗原成分由来の残留成分が、本発明の方法によって生成する最終ワクチン中に微量で存在する可能性もある。例えば、ホルムアルデヒドを使用してジフテリア、破傷風および百日咳のトキソイドを調製する場合、最終ワクチン製品は微量のホルムアルデヒド（例えば、１０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは５μｇ／ｍｌ未満）を保持する可能性がある。培地または安定剤をポリオウイルス調製中に使用することができた可能性があり（例えば、培地１９９）、これらは最終ワクチンまで存続する可能性がある。同様に、遊離アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システインおよび／またはシスチン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、プロリンおよび／またはヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよび／またはバリン）、ビタミン（例えば、コリン、アスコルビン酸など）、リン酸２ナトリウム、１カリウムリン酸塩、カルシウム、グルコース、硫酸アデニン、フェノールレッド、酢酸ナトリウム、塩化カリウムなどが、それぞれ１００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満で最終ワクチン中に保持される可能性がある。ネオマイシン（例えば、特にＩＰＶ成分由来の硫酸ネオマイシン）、ポリミキシンＢ（例えば、特にＩＰＶ成分由来の硫酸ポリミキシンＢ）などの、抗原調製物由来の他の成分も、用量当たりナノグラム未満の量で存在する可能性がある。抗原調製物に由来する最終ワクチンの他の考えられる成分は、抗原の完全ではない精製から生じる。少量の百日咳菌、ジフテリア菌、破傷風菌および出芽酵母のタンパク質および／またはゲノムＤＮＡが、したがって存在する可能性がある。これらの残留成分を最少にするために、本発明の方法中で抗原を使用する前に、抗原調製物を処理してそれらを除去することが好ましい。
【０１０７】
ＩＰＶ成分を使用する場合、それは一般にＶｅｒｏ細胞において増殖しているはずである。最終ワクチンは好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以下、例えば５００ｐｇ／ｍｌ以下または５０ｐｇ／ｍｌ以下のＶｅｒｏ細胞ＤＮＡ、例えば１０ｎｇ／ｍｌ未満の５０塩基対長以上であるＶｅｒｏ細胞ＤＮＡを含む。
【０１０８】
本発明のパッケージ組成物
ＨＢｓＡｇとアジュバントを組み合わせた後、本発明の方法は容器に混合物の０．５ｍｌサンプルを抽出およびパッケージするステップを含むことができる。多用量の状況に関しては、多用量を抽出し、１つの容器に一緒にパッケージするはずである。
【０１０９】
本発明の方法は、使用するために容器にワクチンをパッケージする他のステップを含むことができる。適切な容器にはバイアルおよび使い捨てシリンジがある（滅菌済みであるものが好ましい）。
【０１１０】
本発明の組成物をバイアルにパッケージする場合、これらはガラスまたはプラスチック材料でできていることが好ましい。組成物をバイアルに加える前に、バイアルは滅菌済みであることが好ましい。ラテックス感受性患者に関する問題を回避するために、ラテックスを含まないストッパーでバイアルを密封することが好ましい。バイアルは１回用量のワクチンを含むことができ、あるいはバイアルは、複数回用量、例えば１０回用量を含むことができる（「多用量」バイアル）。多用量バイアルを使用する場合、バイアルの中身の汚染を回避することに注意を払って、厳密な無菌条件下で滅菌済みニードルおよびシリンジを用いて各用量を取り出さなければならない。好ましいバイアルは、無色のガラスでできている。
【０１１１】
バイアルは予め充填したシリンジをキャップに挿入することができ、シリンジの中身をバイアルに押し出すことができ（例えば、凍結乾燥物質をその中で還元するために）、バイアルの中身を除去してシリンジに戻すことができるように適合させたキャップ（例えばＬｕｅｒロック）を有することができる。バイアルからのシリンジの除去後、次いでニードルを取り付けることができ、組成物は患者に投与することができる。キャップにアクセス可能である前にシールまたはカバーを除去する必要があるように、キャップはシールまたはカバーの内側に位置することが好ましい。
【０１１２】
組成物をシリンジにパッケージする場合、シリンジはそれに取り付けられたニードルを通常有していないはずであるが、構築および使用するための別のニードルをシリンジに供給することができる。安全なニードルが好ましい。１−インチ２３−ゲージ、１−インチ２５−ゲージおよび５／８−インチ２５−ゲージのニードルが典型的である。記録をとるのを容易にするために中身のロット番号および有効期限をその上に印刷することができる剥離ラベルを、シリンジに与えることができる。シリンジ内のプランジャーは、吸引中にプランジャーが偶然に除去されるのを防ぐためのストッパーを有することが好ましい。シリンジはラテックスゴム製キャップおよび／またはプランジャーを有することができる。使い捨てシリンジは１回用量のワクチンを含む。シリンジは一般にニードルの取り付け前に先端を密封するための先端キャップを有するはずであり、先端キャップはブチルゴムでできていることが好ましい。シリンジとニードルを別々にパッケージする場合、ブチルゴム製シールドをニードルに取り付けることが好ましい。グレーのブチルゴムが好ましい。好ましいシリンジは、「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」（商標）の商品名で市場に出ているシリンジである。
【０１１３】
ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）を使用する場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウ珪酸ガラスでできた容器を使用することがしたがって好ましい。
【０１１４】
組成物を容器にパッケージした後、分配用の箱の中、例えば段ボール箱の中に容器を次いで封入することができ、ワクチンの詳細、例えばその商品名、ワクチン中の抗原の一覧（例えば、「Ｂ型肝炎組換え体」など）、容器の表示（例えば、「使い捨ての予め充填したＴｉｐ−Ｌｏｋシリンジ」または「１０×０．５ｍｌのシリンジ１回用量バイアル」）、その用量（例えば、「それぞれ１回０．５ｍｌの用量を含む」）、警告（例えば、「成人のみ使用」または「小児のみ使用」）、有効期限、指示（例えば、「（事前血液透析および血液透析を含めて）腎不全を有していた１５歳以上の患者に関する、すべての知られている亜型によって引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染に対する能動的免疫処置」など）、特許番号などがその箱にラベルされるはずである。それぞれの箱は、２つ以上のパッケージワクチン、例えば５または１０のパッケージワクチン（特にバイアル用）を含むことができる。ワクチンがシリンジ中に含まれる場合、パッケージはシリンジの絵を示し得る。
【０１１５】
ワクチンは（例えば、同じ箱の中に）、ワクチンの詳細、例えば投与に関する指示、ワクチン中の抗原の詳細などを含む説明書と共に、１つにパッケージすることができる。指示は、警告、例えば予防接種後のアナフィラキシー反応の場合にアドレナリン溶液を容易に利用できる状態に保つなどの警告も含むことができる。
【０１１６】
パッケージワクチンは２℃と８℃の間で保存することが好ましい。それを凍結させてはならない。
【０１１７】
ワクチンは製造中に完全液状形態で与えることができ（すなわち、すべての抗原成分が水溶液または懸濁液中に存在する）、あるいはワクチンは、いくつかの成分が液状形態であり他の成分が凍結乾燥形態である形に調製することができる。したがって最終ワクチンは、２つの成分：（ａ）水性抗原を含む第１の成分と（ｂ）凍結乾燥抗原を含む第２の成分を１つに混合することによって、使用時に即時調製することができる。２つの成分は別々の容器（例えば、バイアルおよび／またはシリンジ）中に存在することが好ましく、本発明は成分（ａ）および（ｂ）を含むキットを提供する。この形式は複合体成分、特にＨｉｂおよび／または髄膜炎菌および／または肺炎球菌複合体を含むワクチンに特に有用である。それは、凍結乾燥形態でさらに安定する可能性があるからである。したがって複合体は、本発明と共にそれらを使用する前は凍結乾燥状態であってよい。他の成分を例えば安定剤として、凍結乾燥前に加えることもできる。含有するのに好ましい安定剤は、ラクトース、スクロースおよびマンニトール、ならびにこれらの混合物、例えばラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物などである。したがって最終ワクチンは、ラクトースおよび／またはスクロースを含むことができる。スクロース／マンニトール混合物を使用することによって、乾燥プロセスをスピードアップすることが可能である。
【０１１８】
したがって本発明は、２容器の組み合わせワクチンを調製するための方法であって、
− 前に記載したように水性組み合わせワクチンを調製するが、ただし前記１つまたは複数の抗原が複合体被膜糖抗原を含まないステップ、
− 第１の容器（例えばシリンジ）中で前記組み合わせワクチンをパッケージするステップ、
− 複合体被膜糖抗原を凍結乾燥形に調製するステップ、
− 前記凍結乾燥抗原を第２の容器（例えばバイアル）中でパッケージするステップ、および
− 第１の容器と第２の容器をキットに１つにパッケージするステップを含む方法を提供する。
【０１１９】
その後、キットは医師に分配することができる。
【０１２０】
Ｄ、Ｔ、ＰおよびＨＢｓＡｇ成分は液状形態であることが好ましい。
【０１２１】
ワクチンの治療および投与法
本発明の組成物はヒト患者への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を患者に投与するステップを含む、患者における免疫応答を増大させる方法を提供する。
【０１２２】
本発明は、医薬において使用するための本発明の組成物も提供する。
【０１２３】
本発明は、患者に投与するための医薬品の製造における、（ｉ）その精製法が非イオン性界面活性剤の存在下で酵母細胞を破壊することを含む組換え酵母細胞から精製したＨＢｓＡｇ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ＨＢＶ抗原の使用も提供する。
【０１２４】
本発明の免疫原性組成物は、少なくともＢ型肝炎ウイルス感染の予防および／または治療において使用するためのワクチンであることが好ましい。本発明の組成物を与えた患者は、初回免疫処置後６週間で測定して、５００ｍＩＵ／ｍｌ以上の血清抗ＨＢｓＡｇＧＭ力価を有することが好ましい。ｌ２カ月後に測定して、力価が５００ｍＩＵ／ｍｌ以上であることがより好ましい。
【０１２５】
完全な有効性を有するために、子供用の典型的な初回免疫処置スケジュールは、２回以上の投与を施すことを含むことができる。例えば、投与は：０および６カ月（時間０は初回投与である）、０、１、２および６カ月；第０日、第２１日、および次いで６カ月と１２カ月の間に第３の投与；２、４および６カ月；３、４および５カ月；６、１０および１４週；または０、１、２、６および１２カ月であってよい。
【０１２６】
例えば２歳の子供用に、追加抗原刺激投与として組成物を使用することもできる。
【０１２７】
本発明の組成物は、例えば腕または脚への筋肉内注射によって投与することができる。
【０１２８】
本発明によって生成されるワクチンは、Ｐｒｅｖｎａｒ（商標）などの別の肺炎球菌複合体ワクチンと同時に患者に投与することができる。
【０１２９】
本発明の組成物がアルミニウム系アジュバントを含む場合、保存中に成分の沈殿が生じる可能性がある。したがって、組成物は患者に投与する前に攪拌しなければならない。攪拌した組成物は、白濁した懸濁液であるはずである。
【０１３０】
好ましいワクチン
本発明の特異的な多価免疫原性組成物は以下の組成物を含む：
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む５価組成物。ワクチンは水性形態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。Ｄ、ＴおよびＰａは水酸化アルミニウムに吸着する。１ｍｌ当たりの量：約５０Ｌｆのジフテリアトキソイド；約２０Ｌｆの破傷風トキソイド；約５０μｇのＰＴ；約５０μｇのＦＨＡ；約１６μｇのペルタクチン；約２０μｇのＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵの１型ポリオウイルス；約１６ＤＵの２型ポリオウイルス；約６４ＤＵの３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。予め充填したシリンジ中に存在してよい。
【０１３１】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰａおよびＩＰＶを含む５価組成物。ワクチンは水性形態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。Ｄ、ＴおよびＰａは水酸化アルミニウムに吸着する。１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも８０ＩＵの破傷風トキソイド；約５０μｇのＰＴ；約５０μｇのＦＨＡ；約１６μｇのペルタクチン；約２０μｇのＨＢｓＡｇ；約８０ＤＵの１型ポリオウイルス；約１６ＤＵの２型ポリオウイルス；約６４ＤＵの３型ポリオウイルス。用量：約０．５ｍｌ。予め充填したシリンジ中に存在してよい。
【０１３２】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗを含む４価組成物。成分は水性形態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。ＤおよびＴは水酸化アルミニウムに吸着する。組成物はチメロサールを含み、２−フェノキシエタノールは含まないことが好ましい。１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵの破傷風トキソイド；少なくとも８ＩＵのＰｗ、約２０μｇのＨＢｓＡｇ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１３３】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰｗおよびＨｉｂ−Ｔ複合体を含む５価組成物。ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分は水性形態であり、Ｈｉｂ−Ｔは凍結乾燥状態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＤおよびＴは水酸化アルミニウムに吸着する。ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−Ｔはリン酸アルミニウムに吸着する。凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔはラクトースを含む。水性成分はチメロサールを含み得る。１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵの破傷風トキソイド（およびＨｉｂ−Ｔ中の担体として５μｇと２５μｇの間の破傷風トキソイド）；少なくとも８ＩＵのＰｗ、約２０μｇのＨＢｓＡｇ；糖として測定して約５μｇのＨｉｂ−Ｔ。用量：約０．５ｍｌ。
【０１３４】
・ ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗならびに３つの複合体：Ｈｉｂ−Ｔ複合体、ＭｅｎＡ複合体およびＭｅｎＣ複合体を含む７価組成物。ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分は水性形態であり、３つの複合体は凍結乾燥状態である。それは水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方を含む。ＤおよびＴは水酸化アルミニウムに吸着する。ＨＢｓＡｇはリン酸アルミニウムに吸着する。凍結乾燥成分はラクトースおよび／またはスクロースを含み得る。水性成分はチメロサールを含み得る。考えられる１ｍｌ当たりの量：少なくとも６０ＩＵのジフテリアトキソイド；少なくとも１２０ＩＵの破傷風トキソイド（およびＨｉｂ−Ｔ中の担体として５μｇと２５μｇの間の破傷風トキソイド）；少なくとも８ＩＵのＰｗ、約２０μｇのＨＢｓＡｇ；糖として測定して約５μｇの各複合体。用量：約０．５ｍｌ。
【０１３５】
これらの組成物はそれ自体ワクチンとして使用することができ、あるいは他のワクチンの成分として使用することができる。例えば本発明は、前に記載した５価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ複合体を含む６価組成物を提供する。凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔはアルミニウム塩に吸着しないことが好ましい。本発明は、前に記載した５価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−ＴおよびＭｅｎＣ複合体を含む７価組成物も提供する。本発明は、前に記載した５価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐａ−ＩＰＶ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ、ＭｅｎＣおよびＭｅｎＹ複合体を含む８価組成物も提供する。本発明は、前に記載した４価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物、および凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ複合体を含む５価組成物も提供する。本発明は、前に記載した４価ＨＢｓＡｇ−Ｄ−Ｔ−Ｐｗ組成物、およびＨｉｂ−Ｔ複合体、ＭｅｎＡ複合体およびＭｅｎＣ複合体の凍結乾燥混合物を含む７価組成物も提供する。最終ワクチンは、使用時に凍結乾燥物質を水性ＨＢｓＡｇ含有物質で戻すことによって調製することができ、凍結乾燥成分と水性成分は、前に記載したようにキット内に１つにパッケージすることが好ましい。
【０１３６】
本発明の特異的な方法は以下のステップを含む方法を含む：
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；チメロサールを含まない水酸化アルミニウムアジュバントとの２価Ｄ−Ｔ混合物の入手；Ｐａ成分用のＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンの入手；好ましくはアルミニウム塩アジュバントを含まない型１、２および３としてプールするＩＰＶ抗原の入手；最終的な５価混合を得るための任意の順序でのＤ−Ｔ、Ｐａ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇの組合せ；場合によってはシリンジへのパッケージ。
【０１３７】
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物の入手；最終的な４価混合を得るためのＤ−Ｔ−ＰｗとＨＢｓＡｇの組合せ；場合によってはシリンジへのパッケージ；場合によっては凍結乾燥複合体成分、例えばＨｉｂ−Ｔ；ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣと組み合わせたパッケージ。
【０１３８】
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物の入手；凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔ複合体の入手；水性４価成分を得るためのＤ−Ｔ−ＰｗとＨＢｓＡｇの組合せ；水性４価成分のガラスバイアルへのパッケージ；凍結乾燥Ｈｉｂ−Ｔおよび／またはＭｅｎＣおよび／またはＭｅｎＹのガラスバイアルへのパッケージ；５価組み合わせワクチンを得るための水戻し用の単一キット中に存在する２つのバイアルの組合せ。ガラスバイアルはＩ型ガラスであってよく、ブチルゴム製ストッパーを有する。
【０１３９】
・ 本発明によるＨＢｓＡｇの精製；ＨＢｓＡｇのリン酸アルミニウムアジュバントへの吸着；２−フェノキシエタノールを含まずチメロサールを含む水酸化アルミニウムアジュバントおよびリン酸アルミニウムアジュバントとの３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ混合物の入手；好ましくはアルミニウム塩アジュバントを含まない型１、２および３としてプールするＩＰＶ抗原の入手；最終的な５価混合を得るための任意の順序でのＤ−Ｔ−Ｐａ、ＩＰＶおよびＨＢｓＡｇの組合せ；場合によってはシリンジへのパッケージ；場合によっては凍結乾燥複合体成分、例えばＨｉｂ−Ｔ；ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣと組み合わせたパッケージ。
【０１４０】
他の成分、例えば塩化ナトリウム、アジュバント、防腐剤などを任意の段階で加えることができる。これらの方法を使用して、例えば前に記載したワクチンを調製することができる。
【０１４１】
異なる方法のステップは実質的に同時に実施することができ、あるいは別々に実施することができる。これらのステップは、同じ場所または異なる場所、異なる国においても実施することができ、例えばＨＢｓＡｇ精製は、Ｈｉｂ−Ｔ凍結乾燥と異なる場所で行うことができる。
【０１４２】
複合体の担体タンパク質
複合体糖抗原は、糖がそれに直接、あるいはリンカーを介して共有結合する担体タンパク質を含む。結合技法に関する一般的な情報は参考文献４５において見ることができる。
【０１４３】
担体として使用するための様々なタンパク質が知られており、好ましい担体タンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイドなどの細菌毒素またはトキソイドである。他の適切な担体タンパク質には、ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７突然変異体［７５〜７７］、髄膜炎菌の外膜タンパク質［７８］、合成ペプチド［７９、８０］、熱ショックタンパク質［８１、８２］、百日咳タンパク質［８３、８４］、サイトカイン［８５］、リンホカイン［８５］、ホルモン［８５］、増殖因子［８５］、様々な病原体由来の抗原に由来する多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［８６］、例えばＮ１９［８７］、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ［８８、８９］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［９０］、ニューモリシン［９１］、鉄摂取タンパク質［９２］、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の毒素ＡまたはＢ［９３］、Ｂ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）タンパク質［９４］などがあるが、これらだけには限られない。
【０１４４】
糖と担体の結合は、例えば担体タンパク質中のリシン残基、またはアルギニン残基の側鎖中の−ＮＨ２基を介した結合であることが好ましい。（例えば、システインの側鎖中の）−ＳＨ基との結合も考えられる。
【０１４５】
１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち、過剰な糖）の間の糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する複合体が好ましい。
【０１４６】
組成物は少量の遊離担体を含むことができる。別の抗原として含まれる如何なる担体も無視すると、非結合担体は全体として組成物中の担体タンパク質の全量の５重量％を超えないことが好ましく、２重量％未満で存在することがより好ましい。
【０１４７】
例えば担体抑制のリスクを低下させるために、組成物中に２種類以上の担体タンパク質を含むことが考えられる。
【０１４８】
髄膜炎菌複合体に使用する担体タンパク質は、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄであってよい。このタンパク質は参考文献９５および９６中に詳細に記載されており、複合体中の担体タンパク質としてのその使用は参考文献９７中に記載されている。用語「タンパク質Ｄ」は、参考文献９７中に開示された天然完全長タンパク質の断片、および完全長タンパク質Ｄまたはこれらの断片のいずれかを含む融合タンパク質（例えば、インフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質の断片とタンパク質Ｄの断片の融合体）も含む。これらの断片は、結合時にＴ非依存性糖抗原をＴ依存性抗原に変換する能力を保持しているはずである。典型的な断片は、タンパク質Ｄの少なくともＮ末端側１／３を含むはずである。このタンパク質は大腸菌中で好都合に発現される可能性があり［９６］、この組換え物質は本発明と共に使用するのが好ましい［９７］。
【０１４９】
一般事項
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」ならびに「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物はＸのみからなる可能性があるか、あるいは他の何かを含む、例えばＸ＋Ｙである可能性がある。
【０１５０】
語句「実質的に」は「完全に」を除外するわけではない、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物はＹを完全に含まない可能性がある。必要な場合、語句「実質的に」は本発明の定義から除外することができる。
【０１５１】
数値ｘに関する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１５２】
特に言及しない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含む方法は、任意の特定の混合順を必要としない。したがって、成分は任意の順序で混合することができる。３つの成分が存在する場合、２成分を互いに組み合わせることができ、次いでその組合せを、第３の成分などと組み合わせることができる。
【０１５３】
ある抗原がアジュバントに「吸着する」として記載する場合、少なくとも５０％（重量）、例えば５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％あるいはそれより多くのその抗原が吸着することが好ましい。ジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドは両方が完全に吸着する、すなわち上清中には何も検出できないことが好ましい。ＨＢｓＡｇの全体の吸着を使用することができる。
【０１５４】
ジフテリアトキソイドの量は国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり１６０ＩＵを含む、「吸着ジフテリアトキソイドの第３国際標準１９９９」［９８、９９］を与える。ＩＵシステムに対する代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「境界凝集用量」）を、１国際単位のアンチトキシンと混合すると最適に凝集する混合物を生成する［１００］トキソイドの量として定義する。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり３００ＬＦを含む「ジフテリアトキソイド、プレイン」［１０１］を与え、アンプル当たり９００ＬＦを含む「凝集試験のジフテリアトキソイドの第１の国際参照試薬」［１０２］も与える。
【０１５５】
破傷風トキソイドの量は国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり４６９ＩＵを含む、「吸着破傷風トキソイドの第３国際標準２０００」［１０３、１０４］を与える。ＩＵシステムに対する代替として、「Ｌｆ」単位（「凝集単位」または「境界凝集用量」）を、１国際単位のアンチトキシンと混合すると最適に凝集する混合物を生成する［１００］トキソイドの量として定義する。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり１０００ＬＦを含む「凝集試験の破傷風トキソイドの第１の国際参照試薬」［１０５］を与える。
【０１５６】
ｗＰ抗原の量は国際単位（ＩＵ）で表すことができる。例えばＮＩＢＳＣは、アンプル当たり４６ＩＵを含む「百日咳ワクチンの第３国際標準」［１０６］を与える。それぞれのアンプルは水溶液の２．０ｍｌ等分試料の凍結乾燥残留物を含み、この等分試料は８リットルのＭ／１５ＳｏｒｅｎｓｅｎのバッファーｐＨ７．０で希釈した１０リットルの細菌懸濁液（米国不透明度標準により１８０不透明度単位に等しい）を含んでいた。ＩＵシステムに対する代替として、「ＯＵ」単位（「不透明度単位」）も使用される（例えば、４ＯＵは約１ＩＵであり得る）。
【０１５７】
複合体の量は一般に、担体の選択による変動を避けるために糖の質量によって示される（すなわち、全体としての複合体の用量（担体＋糖）は述べられる用量より大きい）。
【０１５８】
動物（および特にウシ）の材料を細胞の培養において使用する場合、それらは感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から入手しなければならない。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
組み合わせワクチンを調製するためのプロセスであって、該ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、該プロセスが、（ｉ）組換え酵母細胞を該非イオン性界面活性剤の存在下で破壊して精製ＨＢｓＡｇ成分を得るステップを含む、該酵母細胞から該ＨＢＶ表面抗原を精製すること、および（ｉｉ）該精製ＨＢｓＡｇ成分を非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて、該組み合わせワクチンを得ることを含む、プロセス。
（項目２）
組み合わせワクチンを調製するためのプロセスであって、該ワクチンが（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含み、該プロセスが、精製ＨＢｓＡｇを非ＨＢＶ病原体由来の少なくとも１つの他の抗原と合わせて、組み合わせワクチンを得るステップを含み、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を該非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって該ＨＢｓＡｇが調製される、プロセス。
（項目３）
（ｉ）非イオン性界面活性剤、（ｉｉ）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原、および（ｉｉｉ）少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体由来の抗原を含む免疫原性組成物であって、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を該非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって該ＨＢＶ表面抗原が調製される、免疫原性組成物。
（項目４）
上記非イオン性界面活性剤がポリ（オキシエテン）残基を含む、項目１から３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目５）
上記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエステルである、項目４に記載のプロセスまたは組成物。
（項目６）
上記非イオン性界面活性剤がポリソルベート２０である、項目５に記載のプロセスまたは組成物。
（項目７）
上記非イオン性界面活性剤が３０μｇ／ｍｌ以下で最終産物中に存在する、項目１から６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目８）
上記非イオン性界面活性剤がＨＢｓＡｇ各１００μｇに対して５０μｇ以下で最終産物中に存在する、項目１から７のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目９）
（ｉ）上記少なくとも１つの非ＨＢＶ病原体がジフテリア菌および破傷風菌を含み、（ｉｉ）これら２つの病原体由来の該抗原がジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドであり、かつ（ｉｉｉ）該ジフテリアトキソイドと該破傷風トキソイドがポリソルベート２０を実質的に含まない混合された形態で最初に存在する、項目１から８のいずれかに記載のプロセス。
（項目１０）
上記ＨＢＶ表面抗原がグリコシル化されていない、項目１から９のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１１）
上記ＨＢＶ表面抗原が、リン脂質を含む脂質マトリクスを含む粒子の形態である、項目１から１０のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１２）
上記ＨＢＶ表面抗原がＨＢＶ亜型ａｄｗ２に由来する、項目１から１１のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１３）
上記ＨＢＶ表面抗原が用量当たり約１０μｇで最終組成物中に存在する、項目１から１２のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１４）
上記ワクチンがＨｉｂ複合体、髄膜炎菌複合体、および／または肺炎球菌複合体を含む、項目１から１３のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１５）
上記最終組成物が３価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ組成物；４価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ組成物；５価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ組成物；７価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ組成物；９価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ組成物；４価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ組成物；５価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、Ｈｉｂ組成物；５価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス組成物；６価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ組成物；７価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＹ組成物；８価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ１３５組成物；１０価ＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐａ、ポリオウイルス、Ｈｉｂ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＷ１３５、ＭｅｎＹ組成物；２価ＨＢｓＡｇ、Ｈｉｂ組成物；および２価ＨＢｓＡｇ、Ａ型肝炎ウイルス組成物から選択される、項目１から１４のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１６）
上記最終組成物がリン酸アルミニウムアジュバントおよび／または水酸化アルミニウムアジュバントを含む、項目１から１５のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１７）
上記最終組成物がリン酸アルミニウムアジュバントと水酸化アルミニウムアジュバントの両方を含む、項目１から１６のいずれかに記載のプロセスまたは組成物。
（項目１８）
上記最終組成物中のＡｌ３＋の濃度が５ｍｇ／ｍｌ以下である、項目１６または１７に記載のプロセスまたは組成物。
（項目１９）
予め混合したＤ−Ｔ成分を加えることを含む、項目１から１８のいずれかに記載のプロセス。
（項目２０）
予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を加えることを含む、項目１から１９のいずれかに記載のプロセス。
（項目２１）
上記予め混合したＤ−Ｔ−Ｐｗ成分がリン酸アルミニウムアジュバントと水酸化アルミニウムアジュバントの両方を含む、項目２０に記載のプロセス。
（項目２２）
患者に投与するための薬剤の製造における、（ｉ）組換え酵母細胞から精製したＨＢｓＡｇであって、精製プロセスが非イオン性界面活性剤の存在下で該酵母細胞を破壊することを含む、ＨＢｓＡｇ、および（ｉｉ）１つまたは複数の非ＨＢＶ抗原の、使用。
（項目２３）
５価組成物を調製するためのキットであって、該５価組成物がＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、ＰｗおよびＨｉｂ−Ｔ複合体抗原を含み、該ＤおよびＴ抗原が水酸化アルミニウムアジュバントに吸着しており、該ＨＢｓＡｇおよびＨｉｂ−Ｔがリン酸アルミニウムアジュバントに吸着しており、該ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分が第１の容器中で水性形態であり、該Ｈｉｂ−Ｔが第２の容器中でラクトースと組み合わせた凍結乾燥形態であり、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって、該ＨＢｓＡｇが調製される、キット。
（項目２４）
７価組成物を調製するためのキットであって、該７価組成物がＨＢｓＡｇ、Ｄ、Ｔ、Ｐｗ、Ｈｉｂ−Ｔ複合体、ＭｅｎＡ複合体およびＭｅｎＣ複合体を含み、該ＨＢｓＡｇ、Ｄ、ＴおよびＰｗ成分が第１の容器中で水性形態であり、該３つの複合体が第２の容器中で凍結乾燥形態であり、該第１の容器は水酸化アルミニウムアジュバントとリン酸アルミニウムアジュバントの両方も含み、該ＤおよびＴ抗原が水酸化アルミニウムに吸着しており、ＨＢｓＡｇがリン酸アルミニウムに吸着しており、ＨＢｓＡｇ発現組換え酵母細胞を非イオン性界面活性剤の存在下で破壊するプロセスによって該ＨＢｓＡｇが調製される、キット。
（項目２５）
上記第１の容器がチメロサールをさらに含む、項目２４に記載のキット。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１−１】図１は、参考文献３および４の図２のコピーであり、参考文献３および４は、吸着法に基づく抗原性および免疫をこの図が示すことを述べ、サンプル１は、過剰な水酸化アルミニウムゲルを各コンポーネントワクチンの組合せが終了した後に加えたサンプルであり、サンプル２は、同じ濃度の前記吸着剤を組合せが終了する前に事前に加えたサンプルである。図１Ａおよび１Ｂは、それぞれサンプル１および２の相対的抗原性を示す。
【図１−２】図１は、参考文献３および４の図２のコピーであり、参考文献３および４は、吸着法に基づく抗原性および免疫をこの図が示すことを述べ、サンプル１は、過剰な水酸化アルミニウムゲルを各コンポーネントワクチンの組合せが終了した後に加えたサンプルであり、サンプル２は、同じ濃度の前記吸着剤を組合せが終了する前に事前に加えたサンプルである。図１Ｃおよび１Ｄは、それぞれサンプル１および２の各抗原に対する抗体形成の相対的レベルを示す。
【図２−１】図２は、組成物中のＨＢｓＡｇの安定性に関するウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａ中、レーンは（１）Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＬＳＢ）；（２）分子量マーカー；（３〜５）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（６〜８）３つの別個の５価ロットの上清；（９〜１０）ＬＳＢである。図２Ｂおよび２Ｃ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２〜４）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（５〜７）２〜８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清；（８〜１０）３６〜３８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清である。図２Ｄ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２）対照ＨＢｓＡｇ；（３〜５）３つの別個の５価ロットの上清である。
【図２−２】図２は、組成物中のＨＢｓＡｇの安定性に関するウエスタンブロットの結果を示す。図２Ａ中、レーンは（１）Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（ＬＳＢ）；（２）分子量マーカー；（３〜５）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（６〜８）３つの別個の５価ロットの上清；（９〜１０）ＬＳＢである。図２Ｂおよび２Ｃ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２〜４）１μｇの３つの別個の対照ＨＢｓＡｇ調製物；（５〜７）２〜８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清；（８〜１０）３６〜３８℃で２週間保存した、３つの別個の５価ロットの上清である。図２Ｄ中、レーンは（１）分子量マーカー；（２）対照ＨＢｓＡｇ；（３〜５）３つの別個の５価ロットの上清である。
【図３】図３は、５価組成物の経時的なｐＨの変化を示す。
【図４】図４は、８価組成物中のＨＢｓＡｇの安定性に関するウエスタンブロットの結果を示す。図４Ａおよび４Ｂ中、レーン１は分子量マーカーを含み、レーン２は１μｇ／ｍｌでＨＢｓＡｇ対照を含み、レーン３は８価組成物の上清を含む。図４Ｂ中、レーン４はＬＳＢを含み、レーン５はレーン２と同じ対照を含み、レーン６はＤＯＣ／ＴＣＡ抽出物を含む。
【実施例】
【０１６０】
（発明を実施するための様式）
ＨＢｓＡｇ発現および精製
ＨＢｓＡｇをコードするＨ．ポリモルファ酵母菌宿主［１０７、１０８］を調製した。３００リットルの発酵槽中で１００リットルの培地を調製し、酵母菌を接種した。１００グラム／リットルで細胞が存在するまで発酵を続けた。この段階で、宿主がメチロトローフ酵母菌であるので、メタノールを加え、発酵を停止させた。最終培養物の体積は１６０〜１７０リットルであった。遠心分離によって培養培地から細胞を採取した。
【０１６１】
精製後にＨＢｓＡｇに非イオン性界面活性剤を添加する代わりに、参考文献３および４中に記載したように、タンパク質の精製中に界面活性剤を使用した。詳細には、採取した酵母細胞を０．１〜０．２％のポリソルベート２０および１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸バッファーに懸濁させた。懸濁物を冷却し、高圧液体ホモジェナイザーを使用して破壊した。
【０１６２】
均質化した細胞懸濁液は、遠心分離によって次いで浄化した。上清にＮａＣｌを加えた後、ポリエチレングリコールを沈殿用に３〜５％の濃度までゆっくり加えた。溶液は５分間攪拌し、３０分間放置し、１０分間遠心分離にかけた。さらなるＰＥＧを８〜１０％まで上清にゆっくり加え、攪拌し２時間放置した。この溶液を１０分間遠心分離にかけた。
【０１６３】
ヒュームドシリカを１〜２％の濃度で上清に加えた。溶液を１２時間攪拌し、遠心分離にかけ、デオキシコール酸ナトリウムを含むホウ砂バッファー中で沈殿を完全に溶かした。水浴中で１００〜１２０分間攪拌した後、溶液を遠心分離にかけ、上清を回収した。流速２００ｍＬ／分でトリス／Ｃｌバッファーを用いて平衡状態にしたＤＥＡＥカラムに上清を充填し、ＮａＣｌ溶液を含むトリス／Ｃｌバッファーで溶出した。塩化セシウムを１．２ｇ／ｍＬの濃度までＤＥＡＥ溶出液に加え、溶液を４０，０００ｒｐｍで超遠心分離にかけた。脱塩したＣｓＣｌプールをＰＢＳで４００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈し、ホルマリンを０．０２５％の濃度まで加え、混合物は７２時間放置した。最後に、残留ホルマリンはＰＢＳを使用して除去した。
【０１６４】
このようにして、ＨＢｓＡｇはポリソルベート２０を含めることによって精製したが、抗原を精製した後に加えたのではなく、組換え細胞を破壊する前に界面活性剤を添加した。
【０１６５】
完全液状多価ワクチン
酵母菌発現型ＨＢｓＡｇ、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび完全細胞百日咳抗原を、アルミニウム塩アジュバントの懸濁液に加えた。混合物のｐＨを調節し、それがアルミニウムアジュバントに吸着した状態にならないようにＨｉｂ−ＣＲＭ１９７複合体を次いで加えた。この方法によって、以下の組成を有する５価ワクチンを得た：
【０１６６】
【表１】
他の実験では、血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹの各々に由来する別個の髄膜炎菌ＣＲＭ１９７複合体を、ＣＲＭ−Ｈｉｂ成分の後に加えて８価ワクチンを得た：
【０１６７】
【表２】
ワクチンの安定性および有効性に関する重要なパラメータはＨｉｂ複合体の加水分解率であり、臨床上の限界は２５％の遊離糖である（参考文献１０９は、２０％は臨床上の免疫原性に影響を与えなかったことを報告する）。このパラメータは、最少の分離および浄化でピコモルレベルにおいて非結合炭水化物の直接定量化を可能にするＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによって、５価ワクチンにおいて測定した。分析は遊離糖の量に焦点を当てた。
【０１６８】
遊離糖の量をアッセイし、全体の量の割合として表した。結果は以下の通りであった：
【０１６９】
【表３】
最大２５％の遊離糖が臨床上許容される。すべての値がこの閾値未満であり、２〜８℃において４週間まで６．５％未満であった。熱ストレス条件下（３６〜３８℃で４週間）では、高レベルが見られたが、２５％の値を依然大幅に下回り、最高はロット１の１１．６％であった。多価Ｈｉｂワクチンに関する初期の実験は、３６〜３８℃での１カ月の保存は、２〜８℃での２年の保存より多くのＣＲＭ−Ｈｉｂの加水分解をもたらすことを示している。したがって許容される加水分解は、通常の保存条件下での少なくとも２年の時間規模を超えると予想することができる。
【０１７０】
遊離糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析は、２〜８℃で６カ月後にも実施した。データは以下の通りであった：
【０１７１】
【表４】
このように、４週間と比較して６カ月では遊離糖の割合の非常にわずかな増大があるのみで、値は２５％の値を依然大幅に下回る。したがってＣＲＭ１９７−Ｈｉｂは、３つの配合物において非常に安定している。
【０１７２】
図３Ａは、２〜８℃で保存した３つのロットに関する、６カ月間の５価ワクチンにおけるｐＨの変化を示す。図３Ｂは、３６〜３８℃で保存した３つのロットに関する４週間のｐＨの変化を示す。２〜８℃においてｐＨは６カ月間安定状態であったが、一方熱ストレス条件下では、２週間後に０．１ｐＨ単位のわずかな低下、および４週間後にさらにわずかな低下があった。そうではあったが、すべてのｐＨ値は６．０〜７．０の許容範囲内に留まった。
【０１７３】
全３個の５価ロットの浸透圧は、３１２ｍＯｓｍ／Ｋｇと３１５ｍＯｓｍ／Ｋｇの間、つまり注射用ワクチンに関する２４０〜３６０ｍＯｓｍ／Ｋｇの標的範囲内の中心にあった。
【０１７４】
抗原の効力および免疫原性の評価は、組み合わせワクチンの有効性を評価するために重要である。５価ワクチンにおけるジフテリア、破傷風および百日咳抗原の効力を評価し、ＣＲＭ−ＨｉｂとＨＢｓＡｇの両方の免疫原性を試験した。ＥＬＩＳＡ分析を実施して、免疫処置後の特異的抗体のレベルを評価した。ＨＢｓＡｇの免疫原性の試験は、マウスモデルおよびＨＢＶの効力に関して使用したスケジュールと異なる免疫処置スケジュールを使用して実施した。
【０１７５】
ＤＴＰの効力値は以下の通りであった：
【０１７６】
【表５】
これら３つの抗原のそれぞれに関して、効力試験の結果はいずれも許容下限を有意に上回り、これらの結果は、これら３つの抗原に関する優れた有効性を示す。
【０１７７】
ＨＢｓＡｇの免疫原性を評価するために、１０ＣＤ１マウスの群に、第０日および第１４日に皮下注射（０．５ｍｌ、生理食塩水に１：４に希釈）によって５価ワクチンを与えた。マウスは第２１日に採血し、（ａ）「Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ Ａｎｔｉ−ＨＢｓ ＩＩ」試験（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）または（ｂ）「Ａｕｓａｂ ＥＩＡ」試験（Ａｂｂｏｔｔ）のいずれかを使用してＥＬＩＳＡによってＨＢｓＡｇ特異的抗体を評価した。これらのＥＬＩＳＡ試験は、異なる形式およびＨＢｓＡｇに対する異なる感度を有する。幾何学的平均力価は、したがって２試験間で比較可能ではない。しかし、それぞれの試験の範囲内では血清に関するＧＭＴ値が最適であった。結果は以下の通りであった：
【０１７８】
【表６】
この種のマウス免疫原性アッセイを実施して得たすべてのＧＭＴ値は、文献中で報告されている値より高い。応答率は約１００％の最適レベルで両方の抗原に関して絶えず高い。
【０１７９】
Ｈｉｂの免疫原性を評価するために、８ＣＤ１マウスの群に、第０、１０および２０日に皮下注射（０．５ｍｌ、生理食塩水に１：４に希釈）によって５価ワクチンを与えた。マウスは第３４日に採血し、ＥＬＩＳＡによってＨｉｂ特異的抗体を評価した。結果は以下の通りであった：
【０１８０】
【表７】
ＨＢｓＡｇのアルミニウムアジュバントへの吸着はワクチンの免疫原性に関する重要な要因であり、このパラメータはイムノブロットによって測定した。従ったイムノブロット手順は、ほぼ以下の通りであった：１ｍｌ体積のワクチン上清をＤＯＣ／ＴＣＡ沈殿させ、ＬＳＢを用いて変性させ、次いで１２％アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填し、１μｇの各ロットのＨＢｓＡｇを対照として充填し、ヤギ抗ＨＢｓＡｇ抗体調製物は一次抗体（希釈１：１０００）として使用し、抗ヤギＰＯＤ複合体（希釈１：２５００）は二次抗体として使用した。
【０１８１】
５価ワクチンに関する結果を図２中に示す。図２Ａのレーン６〜８は時間ゼロで組成物中に検出可能な可溶性ＨＢｓＡｇが存在しないことを示し、図２Ｂおよび２Ｃのレーン５〜１０によって、２〜８℃または３６〜３８℃での保存の２週間および４週間後、これは依然として真実であることが確認される。３つの異なるロットにおいて、これらの様々な条件で約９９％のＨＢｓＡｇがアジュバントに依然として吸着した状態であった。
【０１８２】
他の安定性アッセイを、２〜８℃での保存の６カ月後に実施した（図２Ｄ）。３つのロットの各々に関して依然として約９９％吸着した状態であった。
【０１８３】
図２中で使用した陽性対照は、１μｇのＨＢｓＡｇを含んでいた。Ｓペプチド（２４ｋＤａ）に対応する１つのバンド、および凝集に特徴的なバンド（４５ｋＤａまで）が見られた。Ｐｒｅ−Ｓ２は見られなかった。
【０１８４】
８価ワクチンも、同様の方法でＨＢｓＡｇ吸着に関して試験した。１ｍｌのサンプルを１０分間３５００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上清は新たなチューブに除去し、ＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させた。ペレットは２００μｌの抽出バッファーに再懸濁させ、５分間沸騰させ、１０分間１３００ｒｐｍで遠心分離にかけた。２０μｌのこの抽出物およびＤＯＣ／ＴＣＡで沈殿させた上清を、ウエスタンブロット用に１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填した。
【０１８５】
図４Ａは時間ゼロでの８価ワクチンを示し、図４Ｂは２〜８℃での保存の８カ月後のワクチンを示す。図４Ｂのレーン３および６における任意の有意な染色の不在（対照レーン２および５中の１μｇのＨＢｓＡｇで見られるより確実に染色されていないこと）は、この保存期間中ＨＢｓＡｇの吸着は依然として安定状態であることを示す。
【０１８６】
液状／凍結乾燥多価ワクチン
３つの抗原成分を以下のように回収する：
− ３価Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分：水酸化アルミニウムアジュバントに吸着したジフテリアトキソイド、さらに水酸化アルミニウムアジュバントに吸着した破傷風トキソイド、および完全細胞百日咳抗原を含むＤ−Ｔ−Ｐｗ成分を調製した。Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分はリン酸アルミニウムアジュバントも含む。この成分はチメロサールを含むが、２−フェノキシエタノールは含まない。
【０１８７】
− ＨＢｓＡｇ成分：ＨＢｓＡｇを組換え酵母菌から発現させ精製し、リン酸アルミニウム抗原に吸着させる［１１０］。
【０１８８】
− Ｈｉｂ複合体成分：Ｈｉｂ多糖をＨｉｂ、系統２０７５２から調製し、臭化シアンを用いた活性化およびアジピン酸ヒドラジドを用いた誘導体化後、約１：３の糖：担体重量比で、スペーサーをカルボジイミド系縮合によって破傷風トキソイドと共有結合させる。結合体はリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させ［６４］、次いでラクトースと共に凍結乾燥させる。
【０１８９】
Ｄ−Ｔ−Ｐｗ成分はＨＢｓＡｇ成分と混合させる。ＨＢｓＡｇのレベルは２０μｇ／ｍｌである。Ｄのレベルは６０ＩＵ以上である。Ｔのレベルは１２０ＩＵ以上である。Ｐｗのレベルは８ＩＵ以上である。白濁した懸濁液の形態である４価混合物は、ブチルゴム製ストッパーを有するガラスバイアルに水性形態でパッケージして、１用量（０．５ｍｌ）、２用量（１ｍｌ）または１０用量（５ｍｌ）を含ませる。凍結乾燥Ｈｉｂ成分もバイアル中に置く。バイアル当たりの粉末の量は、バイアル当たり１用量、２用量または１０用量での水戻し後、（糖として測定して）５μｇ／ｍｌを得るように定量する。
【０１９０】
２つのバイアルは箱中に１つにパッケージする。箱は１バイアルの各成分（１用量または多用量バイアルのいずれか）または１００バイアルの各成分のいずれかを含む。
【０１９１】
患者への投与用に、水性Ｄ−Ｔ−Ｐｗ−ＨＢｓＡｇ物質をシリンジに取り出し、凍結乾燥複合体用バイアル中に導入する。凍結乾燥物質を再度活性化させた後、新しいニードルを介してそれをシリンジに再度取り出し、患者にすぐに投与することができる５価ワクチンを得る。様々な３用量の初回免疫処置スケジュール：２、４および６カ月；３、４、および５カ月；または６、１０および１４週を使用することができる。ワクチンは２年時の追加抗原刺激投与として使用することもできる。
【０１９２】
１０用量のバイアルは、１バイアルで１０患者を免疫処置するのに充分な物質を与える。水戻しは第１のシリンジを使用し、次いで１シリンジ当たり１用量で、新たなシリンジを用いて個々の用量を抽出する。他の（あまり好ましくない）アレンジメントでは、１０用量を１シリンジに取り出し、ニードルは患者ごとに変える。
【０１９３】
本発明は単なる実施例によって記載しており、本発明の範囲および精神中に留まりながら変更形態を作製することができることは理解されるはずである。
【０１９４】
参考文献（これらの内容は、参考として本明細書に援用される）
【０１９５】
【化１】
【０１９６】
【化２】
【０１９７】
【化３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書の一部に記載の発明。
【請求項１】
本明細書の一部に記載の発明。
【図１−１】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【図１−２】
【図２−１】
【図２−２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１３−５６９４０（Ｐ２０１３−５６９４０Ａ）
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２７９０５８（Ｐ２０１２−２７９０５８）
【出願日】平成２４年１２月２１日（２０１２．１２．２１）
【分割の表示】特願２００８−５３９５３６（Ｐ２００８−５３９５３６）の分割
【原出願日】平成１８年１１月７日（２００６．１１．７）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２７９０５８（Ｐ２０１２−２７９０５８）
【出願日】平成２４年１２月２１日（２０１２．１２．２１）
【分割の表示】特願２００８−５３９５３６（Ｐ２００８−５３９５３６）の分割
【原出願日】平成１８年１１月７日（２００６．１１．７）
【出願人】（５０７２３８２８５）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (35)
【Ｆターム（参考）】
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