Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法
【課題】実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構を解明し、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法は、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつクロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球を、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒト末梢血単核球投与工程と、を含む。
【解決手段】Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法は、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつクロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球を、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒト末梢血単核球投与工程と、を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染および発症の際における免疫応答に関連する、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎ウイルス感染によって引き起こる肝炎は、時に慢性化、重症化する予後不良の病症である。当該病症の病態の解明および治療のためには、肝炎ウイルス感染モデル動物、特にＢ型肝炎ウイルス感染モデル動物が必要とされている。Ｂ型肝炎ウイルスは、ヒトおよびチンパンジーにのみ感染可能であり、チンパンジーは優れたＢ型肝炎ウイルス感染モデル動物となり得る。しかし、倫理的、経済的に問題があるとされている。
【０００３】
ヒト肝細胞キメラマウスとは、肝臓が部分的にヒト肝細胞に置換されているマウスのことである。近年、肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換されたヒト肝細胞キメラマウスが多く利用されている。このようなヒト肝細胞キメラマウスの作製方法を具体的に説明すると、まず、免疫不全マウスと肝不全マウスとを掛け合わせ、ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）を作製する。次いで、当該ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）にヒト肝細胞を移植し作製する。ヒト肝細胞キメラマウスは成熟したＴ細胞およびＢ細胞の欠損した重症免疫不全マウスである。しかし、マウス樹状細胞やＮＫ細胞は存在するため、前処置を行わずにヒト末梢血単核球を投与するとこのヒト末梢血単核球はこれらの細胞により排除されてしまう。そのためヒト末梢血単核球を生着させるためには、細胞移植前に、マウス樹状細胞およびマウスＮＫ細胞を排除しておく必要があり、これらの排除には、例えば、クロドロネートまたは抗アシアロＧＭ１抗体等が利用され得る（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００４】
クロドロネートと種々の細胞（樹状細胞およびマクロファージも含む）との代謝メカニズムの詳細については、非特許文献３および非特許文献４に記載されている。また、抗アシアロＧＭ１抗体によるマウスＮＫ細胞の排除は、マウスのリンパ球系組織の全てからアシアロＧＭ１陽性細胞が消失し、マウスＮＫ細胞活性が除去されるということである。
【０００５】
なお、このような肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換されているヒト肝細胞キメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルスを接種することにより、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラマウスとすることが可能となる。さらには、当該Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラマウスの肝臓内においてＢ型肝炎ウイルスを増殖させることも可能である（非特許文献１および非特許文献５）。そのため、現在、このようなヒト肝細胞キメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルス以外にも最も有効な肝炎ウイルス感染モデル動物として多く利用されている（非特許文献５ないし非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mercer DF. et al., Nat Med 7, 927-933, 2001
【非特許文献２】Tateno C. et al., Am J Pathol 165, 901-912, 2004
【非特許文献３】Nico Van Rooijen. et al., Journal of Immunological Methods 174, 83-93, 1994
【非特許文献４】Julie C. et al., JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH Volume 12 Number 9, 1358-1367, 1997
【非特許文献５】Tsuge C. et al., Hepatology 42, 1046-1054, 2005
【非特許文献６】Hiraga M. et al., FEBS Letts 581, 1983-1987, 2007
【非特許文献７】Matsumura T. et al., Gastroenterology 137, 673-681, 2009
【非特許文献８】Ohira M. et al., J Clin Invest 119, 3226-3235, 2009
【非特許文献９】Kamiya N. et al., J Gen Virol 91, 1668-1677, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述したように、肝臓が高度かつ安定的に置換されたヒト肝細胞キメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルスに感染させることが可能である。そのため、優れたＢ型肝炎ウイルス感染動物モデルとなる。しかし、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラマウスは成熟したＴ細胞およびＢ細胞の欠損した重症免疫不全マウスであるため、肝炎は発症しない。
【０００８】
また、これまでにいくつかの肝炎発症モデルは開発されているが（例えば、Ando K. et al., J Exp. Med. 178, 1541-1554, 1993、Cote PJ. et al., Hepatology 32, 807-817, 2000、または、Wieland SF. et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 6669-6674, 2004）、いずれも実際のヒト肝細胞での現象を反映しているものではない。すなわち、実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの免疫メカニズムの全ては解明されていないため、肝炎に関する医薬開発および病態治療の進退に著しく影響を与えている。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構を解明し、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、ヒト末梢血単核球生着のために使用していたクロドロネートが、マウス樹状細胞およびマクロファージだけでなく、ヒト樹状細胞にも影響を与えているということを発見した。詳細には、クロドロネートの影響でヒト樹状細胞が減少し、ヒトリンパ球の活性化に影響を与え、その結果、肝炎の発症が抑制されることを解明した。
【００１１】
さらに、このような新規に発見した免疫機構を利用し、クロドロネートの投与時期の調整を行うことで、免疫応答を行うＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製に成功した。なお、当該Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製の際の、ヒト末梢血単核球の移植前に、抗Ｆａｓ Ligand抗体を投与すると、やはりＢ型肝炎の発症は抑制されることがわかり、クロドロネートと、ヒト樹状細胞と、ヒトＮＫ細胞と、Ｆａｓ／Ｆａｓ Ligand pathwayとの間には免疫応答に係る関係があることについても確認された。
【００１２】
そこで、本発明の第１の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法は、
Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、
前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、
前記抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつ前記クロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球を、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒト末梢血単核球投与工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１３】
好ましくは、モデル動物は、マウスであることを特徴とする。
【００１４】
より好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス−Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｄ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｅ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｆ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｇ型およびＢ型肝炎ウイルス−Ｈ型、からなる群より選ばれる１以上のウイルスであることを特徴とする。
【００１５】
また、前記Ｂ型肝炎ウイルスは、ＨＢｅ抗原、および／または、ＨＢｓ抗原を発現することを特徴とする。
【００１６】
さらに好ましくは、前記ヒト末梢血単核球投与工程は、前記クロドロネート投与工程の３日後ないし４日後に実施されることを特徴とする。
【００１７】
また、好ましくは、前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、６μＬ／ｇないし１４μＬ／ｇ投与することを特徴とする。
【００１８】
より好ましくは、前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、８μＬ／ｇないし１２μＬ／ｇ投与することを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記抗アシアロＧＭ１抗体、前記クロドロネートおよび前記ヒト末梢血単核球は、腹腔内投与することを特徴とする。
【００２０】
また、好ましくは、モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、２×１０７cells／mouseないし６×１０７cells／mouse投与することを特徴とする。
【００２１】
また、好ましくは、モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、３×１０７cells／mouseないし５×１０７cells／mouse投与することを特徴とする。
【００２２】
本発明の第２の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、第１の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法によって作製されることを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、前記Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスであることを特徴とする。
【００２４】
本発明の第３の態様に係るＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法は、
第２の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に被検化合物を投与する工程と、
前記被検化合物を投与された前記ヒト肝細胞キメラモデル動物のＢ型肝炎の病症の程度を測定する工程と、
前記被検化合物を投与しない場合と比較して、前記Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構が解明され、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１に係るヒト末梢血単核球（末梢血単核球をＰＢＭＣと略記する）が存在するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの調製スケジュールを示す図である。
【図２】実施例１に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスのマウス肝臓組織の染色結果を示す図である。
【図３】実施例１に係る３日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。
【図４】実施例１に係る０日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。
【図５】実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織の染色結果を示す図である。
【図６】実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞およびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞のＦａｓｍＲＮＡ量を示す図である。
【図７】実施例２に係るヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００２８】
（Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法）
本発明の実施の形態１は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法に関する。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルスを（以下、ＨＢＶ）感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、ＨＢＶを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつクロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球（以下、ヒトＰＢＭＣという）をＨＢＶを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒトＰＢＭＣ投与工程と、を含む。
【００２９】
本明細書において「Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物」（以下、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物、とも言う）とは、肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換されており、ＨＢＶに感染しているモデル動物を示す。「ＨＢＶ」とは、広く一般の任意のＨＢＶを含有し、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス−Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｄ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｅ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｆ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｇ型およびＢ型肝炎ウイルス−Ｈ型、からなる群より選ばれる１以上のウイルスを挙げることができる。また、ＨＢｅ抗原、および／または、ＨＢｓ抗原を発現するＨＢＶも挙げることができる。ＨＢｅ抗原の発現に関わるＨＢＶゲノムに変異を有し、ＨＢｅ抗原が発現していないＨＢＶに感染すると、臨床的に劇症肝炎となることが知られている。「モデル動物」とは、最も好ましくはマウス（Mus musculus）であり、その他ラット（Rattus norvegicus）またはモルモット（Cavia porcellus）等の実験動物として使用され得る動物でも構わない。
【００３０】
このようなＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法は、例えば、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの場合、まず、免疫不全マウスと肝不全マウスとを掛け合わせ、ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）を作製する。次いで、当該ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞キメラマウスを作製し、ＨＢＶを接種することによって作製することができる。その他、当該技術分野において公知の作製方法を用いても構わない。また、「肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換」とは、当該ヒト肝細胞キメラモデル動物がＨＢＶに感染可能である程度置換されていればよい。
【００３１】
ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製後、抗アシアロＧＭ１抗体およびクロドロネートを投与、注入する。なお、いずれについてもリポソームにて封入し、投与、注入してもよい。好ましくは、抗アシアロＧＭ１抗体および／またはクロドロネートは、注射器等を使用し腹腔内投与を行う。また、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、クロドロネート投与工程は、いずれを先に行っても構わない。抗アシアロＧＭ１抗体またはクロドロネートは、購入することによって容易に入手することが可能である。
【００３２】
抗アシアロＧＭ１抗体投与工程について詳細に説明する。抗アシアロＧＭ１抗体は、前述した通り、腹腔内に投与するとマウスＮＫ細胞活性が除去され、後の工程において投与されるヒトＰＢＭＣが排除されることはない。なお、抗アシアロＧＭ１抗体が、ヒトＮＫ細胞活性には影響を与えないことは公知である。抗アシアロＧＭ１抗体投与工程は、ヒトＰＢＭＣ投与工程の１日前に行うと好ましい。抗アシアロＧＭ１抗体の投与量については、投与するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓の大きさ、体重等に適宜合わせればよい。
【００３３】
クロドロネート投与工程について詳細に説明する。クロドロネートは、前述した通り、腹腔内に投与するとマウス樹状細胞（以下、樹状細胞をＤＣと略記する）およびマクロファージだけでなく、ヒトＤＣまで排除してしまう。そのため、後述するヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前ないし１日前においてクロドロネートを投与する（すなわち、クロドロネート投与工程の１日後ないし４日後においてヒトＰＢＭＣを投与する）。より好ましくは、ヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前ないし３日前においてクロドロネートを投与する（すなわち、クロドロネート投与工程の３日後ないし４日後においてヒトＰＢＭＣを投与する）。
【００３４】
しかし、このように具体的な「ヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前ないし１日前」等といった期間でなくとも、ヒトＰＢＭＣ投与工程の際にクロドロネートが適量マウス体内に残存していれば、本実施の形態１と同様のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することは可能である。適量とは、例えば、ヒトＰＢＭＣ投与工程の当日に投与した場合は、クロドロネートの残存量が多量となりヒトＤＣを殆ど排除してしまうが、ヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前に投与した場合はクロドロネートの残存量が適量となり、ヒトＤＣも適量残存することになる。また、例えば、ヒトＰＢＭＣ投与工程の１０日前に投与した場合は、クロドロネートがマウス体内に残存していない状態となってしまう。
【００３５】
クロドロネートの投与量は、投与するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓の大きさ、体重等に適宜合わせればよい。例えば、前述したような期間においてクロドロネートを投与する場合は、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の体重に対し、好ましくは６μＬ／ｇないし１４μＬ／ｇ、さらに好ましくは８μＬ／ｇないし１２μＬ／ｇ、最も好ましくは１０μＬ／ｇ投与すればよい。さらには、クロドロネートの投与時期と、クロドロネートの投与量とを適宜合わせ、ヒトＰＢＭＣ投与工程の際にクロドロネートが適量マウス体内に残存している状態に調整することで、前述と同様に本実施の形態１と同様のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することは可能である。
【００３６】
ヒトＰＢＭＣ投与工程について詳細に説明する。ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物に、前述した通りの抗アシアロＧＭ１抗体投与工程およびクロドロネート投与工程を行い、その後ヒトＰＢＭＣを投与（移植）することによって、Ｂ型肝炎を発症するヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することが可能となる。ヒトＰＢＭＣはヒトの末梢血を用い、密度勾配遠心分離等を行うことによって得ることができる。
【００３７】
ヒトＰＢＭＣ投与工程は２回（特に隔日にて）行うと好ましいし、複数回行っても構わない。ヒトＰＢＭＣ投与工程を複数回行う場合、本明細書において述べているクロドロネートの投与時期とヒトＰＢＭＣの投与時期との間隔は、全て、最初に行うヒトＰＢＭＣ投与工程の時期との間隔を意味している。ヒトＰＢＭＣの投与量は、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓の大きさ、体重に適宜合わせればよい。例えば、モデル動物がマウスの場合、好ましくは２×１０７cells／mouseないし６×１０７cells／mouse、さらに好ましくは３×１０７cells／mouseないし５×１０７cells／mouse、最も好ましくは４×１０７cells／mouse程度を投与すればよい（複数回ヒトＰＢＭＣを投与する場合は、合計量を示す）。
【００３８】
このように、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程およびクロドロネート投与工程と、その後のヒトＰＢＭＣ投与工程を経ることによって、Ｂ型肝炎を実際に発症するヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することができる。本実施の形態１の変形例として、上述した方法によって作製された、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を挙げることができる。好ましくは、当該Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスである。また、本実施の形態１において作製されるＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、前述したように、クロドロネートと、ヒトＤＣと、ヒトＮＫ細胞と、Ｆａｓ／Ｆａｓ Ligand pathway（以下、Ｆａｓ／ＦａｓＬ pathway）との間には免疫応答に係る関係があることを示唆している。そのため、本発明を利用することにより、ＨＢＶだけでなくその他のウイルス性肝炎の病態の解明および治療・予防薬の開発が可能となり、今後、さらに医療へ応用されることが期待される。
【００３９】
（Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態２は、Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法に関する。具体的には、前述の実施の形態１の変形例のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に被検化合物を投与する工程と、当該被検化合物を投与された当該ヒト肝細胞キメラモデル動物のＢ型肝炎の病症の程度を測定する工程と、当該被検化合物を投与しない場合と比較して、Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する工程と、を含む。
【００４０】
本発明において「被検化合物」（「化合物」）とは、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に投与でき、その被検化合物によるＢ型肝炎の病症の程度の変化を評価できるあらゆる物質、組成物を示す。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液等であっても被検化合物として使用することができる。また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体において、本実施の形態２のスクリーニング方法により評価をすることも可能である。
【００４１】
このような被検化合物の投与は、直接当該ヒト肝細胞キメラモデル動物に投与したり、その他の成分も含有する化合物を構成し、これを当該ヒト肝細胞キメラモデル動物に投与してもよい。本発明における「投与」とは、注射器等を使用した腹腔内投与が最も好ましい。その他、経口投与、静脈内投与、動脈内投与または皮下注射等の公知の方法を用いることが可能である。
【００４２】
次の工程である、Ｂ型肝炎の病症の程度を測定する工程とは、当該Ｂ型肝炎を発症しているヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓組織または肝細胞において、炎症の進行度合を、免疫染色等の既知の技術を用い、確認または評価することを示す。確認または評価方法の詳細については、実施例を参照されたい。
【００４３】
最後は、被検化合物を投与していないこと以外は同様であるＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の場合と比較して、Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する。ここで、Ｂ型肝炎の病症の程度が「緩和」とは、当該Ｂ型肝炎を発症しているモデル動物の肝臓組織または肝細胞において、炎症の進行度合が抑制されること、または炎症の進行が停止すること等を意味する。このような方法で、Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物をスクリーニングする。
【００４４】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語等は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様のまたは等しい方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書中に言及するすべての公開物および他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【実施例】
【００４５】
以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【００４６】
（調製例）
まず、後述する実施例にて使用する、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスを調製した。免疫不全マウスと肝不全マウスとを掛け合わせ、ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）を作製し、次いでＨＬＡ（白血球抗原）−Ａ０２０１を有するヒト肝細胞を移植した。この方法は、非特許文献２および非特許文献５、ならびにHiraga N., et al., Journal of Hepatology 51, 1046-1054, 2009に記載の作製方法と同様の方法を用いた。使用した全てのマウスにおいて、同じドナーから得て冷凍しておいたヒト肝細胞を移植した。感染、血清サンプル抽出および安楽死の際には、それぞれ麻酔の下で行った。
【００４７】
ＨＢＶのＤＮＡを含むヒト血清のサンプル（５．３×１０６copies／ｍＬ）は、提供に同意した慢性肝炎の患者から得た。当該ＨＢＶ陽性ヒト血清のサンプルは、使用するまで少量ずつ一定量に分け、液体窒素を用い保存しておいた。このように調製されたＨＢＶ陽性ヒト血清は、５０μＬずつヒト肝細胞キメラマウスに静脈注射にて注入し、ヒト肝細胞キメラマウスをＨＢＶに感染させた。
【００４８】
（実施例１）
本実施例１では、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびヒトＰＢＭＣ移植によって作製された、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスに係る実施例について詳細に説明する。
【００４９】
まず、ヒトＰＢＭＣを調製した。調製方法は、ＨＬＡ−Ａ０２０１を有する健康的なドナーの血液から分離した後、フィコール・ハイパックの密度勾配遠心分離機を使用し、分離調製した。次いで、前述の調製例の方法において作製したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの腹腔内に１２０μＬの抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬工業）を含む２００μＬのＰＢＳを注入した。抗アシアロＧＭ１抗体の注入は、マウスＮＫ細胞を排除し、ヒトＰＢＭＣの排除を防ぐためである。その１日後にヒトＰＢＭＣの１回目の腹腔内移植（投与）を行った。図１は、実施例１に係るヒトＰＢＭＣが存在するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの調製スケジュールを示す図である。
【００５０】
図１では、抗アシアロＧＭ１抗体（anti-asialoＧＭ１）を投与した日をday０として記載している。図１に示すように、１回目のヒトＰＢＭＣの腹腔内投与（ＰＢＭＣ１）（２×１０７cells／mouse）の３日前（day−２）において、１０μＬ／ｇのリポソームクロドロネートをＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスに投与した（clodronate）。これは、マウスのマクロファージおよびマウスＤＣを排除するためである。２回目のヒトＰＢＭＣ腹腔内投与（ＰＢＭＣ２）（２×１０７cells／mouse）は、day３において行った。また、ＨＢＶの感染（ＨＢＶ infection）は、調製例にて示した方法で、８週間前に行われた。
【００５１】
ここで、図１に記載のday７およびday１４に行われたliver samplingについて説明する。前述のような投与、調製スケジュールを経たＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織はどのように変化しているのかを免疫染色によって調べた。すなわち、３日前においてリポソームクロドロネートを投与した場合は、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織はどのように変化したのかを調べた。
【００５２】
まず、day７またはday１４のヒト肝細胞キメラマウスにジエチルエーテルを用いて麻酔を行い、肝臓を取り出した。次いで、各肝臓を薄片とし、ホルマリン（登録商標）固定後、パラフィン包埋した。その後、各薄片を用い、ＨＥ染色、ならびに抗ヒトアルブミン抗体および抗ＨＢｃ抗体による免疫染色を行った。なお免疫染色は、ストレプトアビジン−ビオチン染色キット（Histofine SAB-PO kit、ニチレイ）およびジアミノベンジジンを用いて行った。なお、ヒトＰＢＭＣを後に投与していないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスについても、同様の実験を行った。
【００５３】
図２は、実施例１に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスのマウス肝臓組織の染色結果を示す図である。図２における、Ａ、ＢおよびＣは、それぞれヒトＰＢＭＣを投与していないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（−））の薄片の、ＨＥ染色、ならびに抗ヒトアルブミン抗体および抗ＨＢｃ抗体での免疫染色の写真である。
【００５４】
Ｄ、ＥおよびＦ、ならびにＧ、ＨおよびＩについても、同様の条件の染色の写真であり、それぞれday７またはday１４にliver samplingが行われ、ＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（day７またはday１４））である。なお、それぞれの写真は各々のＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの薄片の代表例を示し、４０倍で撮影され、Ｈはヒトの肝細胞の部分を示し、Ｍはマウスの肝細胞の部分を示す。
【００５５】
図２に示すように、３日前においてリポソームクロドロネートを投与した場合では、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓は、ヒトＰＢＭＣを投与した場合のみ、劇症肝炎の際に見られるヒト肝細胞の死細胞の範囲と同様の広範囲の死細胞が確認された。すなわち、肝炎が発症し病態が進行し劇症肝炎となり、ヒト肝細胞は殆ど完全に除去され、day７またはday１４には低ヒトアルブミンであるマウス肝細胞に置き換わっていた。
【００５６】
さらに、３日前においてリポソームクロドロネートを投与した場合のヒト肝細胞キメラマウスの血清について、ヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量を調べた。なお、検体は、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスと、ヒトＰＢＭＣを投与していないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスと、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの３種類である。ヒトアルブミン量の測定については、当該技術分野における常法を用いた。
【００５７】
ＨＢＶのＤＮＡ量の測定方法について述べる。まず、各ヒト肝細胞キメラマウスの血清からＳＭＩＴＥＳＴ（Genome Science Laboratories）を用いＤＮＡを抽出し、２０μＬの水に溶解させた。次に、溶解させたサンプルを使用し、Light Cycler（Roche, Mannheim, Germany）によってリアルタイムＰＣＲでＨＢＶのＤＮＡ量を測定した。増幅のために使用したプライマーは配列番号１および配列番号２に記す。増幅条件は、最初の変性反応を９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間の変性を４５サイクル、アニーリングは５８℃で５秒間行い、最後に伸長反応を７２℃で６秒間行った。本測定の検出下限は３００コピーで行った。
【００５８】
図３は、実施例１に係る３日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢ実施例１に係る３日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。ヒトアルブミン量（Human albumin（ｎｇ／ｍＬ））の変化を見ると、ＨＢＶに感染しており、かつヒトＰＢＭＣを投与されているヒト肝細胞キメラマウスでなければ、ヒトアルブミン量の減少、すなわちヒト肝細胞障害は起こらず、肝炎の発症の病態とはならないということが確認された。
【００５９】
また、ＨＢＶのＤＮＡ量（ＨＢＶ ＤＮＡ（copies／ｍＬ））についても同様であり、ＨＢＶに感染しており、かつヒトＰＢＭＣを投与されているヒト肝細胞キメラマウスでなければ、ＨＢＶのＤＮＡ量は減少しない、すなわちＨＢＶ感染ヒト肝細胞が減少する肝炎発症の病態にはならないということが確認された。
【００６０】
一方、０日前（２４時間前以内）においてリポソームクロドロネートをヒト肝細胞キメラマウスに投与した場合、血清中のヒトアルブミン量、およびＨＢＶのＤＮＡ量はどう変化するのかについても調べた。検体は、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスと、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスのみの、２種類である。ヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の測定方法については、前述と同様である。
【００６１】
図４は、実施例１に係る０日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。０日前とは、前述の通り、クロドロネート投与後２４時間以内にヒトＰＢＭＣを投与することを意味する。いずれもヒトＰＢＭＣを投与したヒト肝細胞キメラマウスのデータである。なお、controlとは、前述の図３に示した、３日前のクロドロネート投与における、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスのデータを記載したものである。
【００６２】
ヒトアルブミン量（Human albmin（ｎｇ／ｍＬ））の変化を見ると、いずれのヒト肝細胞キメラマウスもヒトアルブミンの減少、すなわちヒト肝細胞障害は起こらず肝炎発症の病態となることはなかった。また、ＨＢＶのＤＮＡ量（ＨＢＶ ＤＮＡ（copies／ｍＬ））についても同様であり、いずれのヒト肝細胞キメラマウスもＨＢＶのＤＮＡ量が減少することはなく、すなわちＨＢＶ感染ヒト肝細胞が減少する肝炎発症の病態となることはなかった。
【００６３】
これらの結果および現在までの種々の研究結果から、本発明者は、リポソームクロドロネート投与を以てマウスのマクロファージおよびＤＣを排除する際に、例えばヒトＰＢＭＣ投与０日前等に投与すると、ヒトＰＢＭＣ投与時に残存したクロドロネートがヒトＤＣに影響を与え、ヒトリンパ球の活性化を抑制し、肝炎を発症しないのではないかと考察した。
【００６４】
従って、肝炎を発症するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製するには、使用するモデル動物の肝臓組織および肝細胞等に適宜合うよう、特定の量および特定の時期に、モデル動物のマクロファージおよびＤＣを排除する物質、主にクロドロネートを投与すべきであると示唆される。
【００６５】
（実施例２）
本実施例２では、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスにおける肝炎発症の機序、特にＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayとの関係に関する実施例について詳細に説明する。
【００６６】
実施例１にて前述したように、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスにおけるヒトリンパ球の活性化の抑制は、マウスのマクロファージおよびＤＣを排除するために使用されていたクロドロネートによってひきおこされることが示唆された。ここで、本発明者は、１回目のヒトＰＢＭＣ投与時の３日前または０日前にリポソームクロドロネートを投与したマウスの肝臓を取り出し、フローサイトメトリーによって、肝臓内に生着したヒトＮＫ細胞の表面のＦａｓＬの量を測定した。その結果、３日前にクロドロネートを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの方のみ発現が亢進していた（図示せず）。
【００６７】
これらの結果から、本発明者は、現在までに解明されているＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayと細胞死との間には関連があると考え、残存したクロドロネートがヒトＤＣまで除去するため、ヒトリンパ球の活性化が抑制され、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞の障害が起こらないのではないかとの推論に至った。
【００６８】
そこで、前述の実施例１の３日前のクロドロネート投与の場合と同様のスケジュールを経たヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織を用い、より詳細な免疫染色およびＴＵＮＥＬアッセイを行った。薄片の製法は、実施例１にて前述した方法と同様である。また、ＨＥ染色、ならびに抗ヒトアルブミン抗体および抗Ｆａｓ抗体による免疫染色も同様に、ストレプトアビジン−ビオチン染色キット（Histofine SAB-PO kit、ニチレイ）およびジアミノベンジジンを用いて行った。ＴＵＮＥＬアッセイは、In Situ Cell Death Detection KitのＰＯＤ（Roche Diagnostics Japan）を使用した。
【００６９】
図５は、実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織の染色結果を示す図である。図５における、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれday７にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（−）、ＰＢＭＣ（＋、day７））の薄片の、ＨＥ染色、抗ヒトアルブミン抗体および抗Ｆａｓ抗体での免疫染色、ならびにＴＵＮＥＬアッセイでの染色の写真である。
【００７０】
Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ、ならびに、Ｍ、Ｎ、ＯおよびＰについても、同様の条件の染色写真である。それぞれ、ヒトＰＢＭＣが投与されていないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（−））の薄片、day４にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（＋、day４））の薄片、および、day７にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（＋、day７））の薄片の写真である。なお、それぞれの写真は各々のヒト肝細胞キメラマウスの薄片の代表例を示し、１００倍で撮影さている。Ｈはヒトの肝細胞の部分を示し、Ｍはマウスの肝細胞の部分を示す。
【００７１】
図５に示すように、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスで抗ヒトアルブミン抗体が陽性のヒト肝細胞においてのみ、抗Ｆａｓ抗体に対して陽性であった。ＴＵＮＥＬアッセイの染色についても、day４またはday７にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣを投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの薄片のみ染色されていた。
【００７２】
さらに、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞およびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞のＦａｓのｍＲＮＡ量についてＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した。まず、それぞれのヒト肝細胞からトータルＲＮＡをRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出した。次に、それぞれのＲＮＡを１μｇずつを、ReverseTra Ace（東洋紡）およびランダムプライマー（タカラバイオ）を用い、逆転写を行った。その後、それぞれのヒト肝細胞のＦａｓのｍＲＮＡレベルを分析した。なお、Ｆａｓフォワードプライマーの塩基配列を配列番号３に、Ｆａｓリバースプライマーを配列番号４に記す。
【００７３】
図６は、実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞およびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞のＦａｓｍＲＮＡ量を示す図である。なお、図６は、ＨＢＶ非感染ヒト肝細胞（Uninfected liver、ｎ＝４）のＦａｓｍＲＮＡ量を１とし、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞（HBV-infected liver、ｎ＝５）のＦａｓｍＲＮＡ量の割合（Ratio）を示している（有意水準：ｐ＝０．０１）。図６に示すように、ヒト肝細胞のＦａｓｍＲＮＡレベルは、ＨＢＶに感染すると著しく増加することが解明した。
【００７４】
これらの結果から、ヒトＰＢＭＣによるＨＢＶ感染ヒト肝細胞の肝炎発症による細胞死はＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayが影響していると示唆される。そこで、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスを用い、ヒトＤＣが産生するヒトインターフェロンαと、ヒトインターフェロンγの作用を阻害するために、抗ヒトインターフェロンα抗体および抗ヒトインターフェロンγ抗体の前投与と、活性化したヒトリンパ球が発現するヒトＦａｓＬの作用を阻害するために抗ヒトＦａｓＬ抗体を前投与し、ヒトアルブミン量およびＨＢＶ ＤＮＡ量の推移についての比較を行った。ヒトアルブミン量およびＨＢＶ ＤＮＡ量の測定方法は、前述の実施例１と同様である。ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの作製スケジュールは、前述の実施例１に係る３日前でのクロドロネート投与におけるスケジュールにて行った。なお、それぞれの抗体は１回目のヒトＰＢＭＣ投与時の１日前に腹腔投与で行った。
【００７５】
図７は、実施例２に係るヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。図７に示すように、抗ヒトインターフェロンγ抗体（anti-interferon gamma、１．５ｍｇ／mouse、R&G Systems）、抗ヒトインターフェロンα抗体（anti-interferon alpha、１．５ｍｇ／mouse、PBL Biomedical Laboratories）、および、アイソタイプコントロール（control antibody）と比較すると、抗ヒトＦａｓＬ抗体（anti-FasL、１．５ｍｇ／mouse、R&G Systems）を投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスにおいて、ヒトアルブミン量（Human albumin（ｎｇ／ｍＬ））の減少を認めなかった。また、ＨＢＶのＤＮＡ量（copies／ｍＬ）についても、抗ヒトインターフェロンγ抗体、抗ヒトインターフェロンα抗体、および、アイソタイプコントロールと比較すると、抗ヒトＦａｓＬ抗体で減少を認めなかった。すなわち、抗ヒトＦａｓＬ抗体によって肝炎の発症をより抑制できることを示唆している。
【００７６】
これらの実施例の結果から、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞は、ＮＫ細胞およびＤＣにおけるＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayに媒介されている可能性が高く、Ｆａｓ／ＦａｓＬ pathwayの媒介機能を利用し、肝炎発症抑制剤の研究、開発に繋がることを示唆している。
【００７７】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００７８】
本明細書の中で明示した論文等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明者が鋭意研究を重ねた結果、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの作製に使用していたクロドロネートが、マウスＤＣおよびマクロファージだけでなく、ヒトＤＣにも影響を与えているということを発見した。詳細には、クロドロネートの影響でヒトＤＣが減少し、ヒトリンパ球の活性化に影響を与え、その結果、肝炎の発生が抑制されることを解明した。さらに、このような新規に発見した免疫機構を利用し、クロドロネートの投与時期の調整を行うことで、免疫応答を行うＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製に成功した。なお、当該Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製の際のヒトＰＢＭＣ移植前に、抗ＦａｓＬ抗体を投与すると、やはりＢ型肝炎の発症は抑制され、クロドロネートと、ヒトＤＣと、ヒトリンパ球と、Ｆａｓ／ＦａｓＬ pathwayとの免疫応答における関係についても確認した。
【００８０】
そこで、本発明によれば、実際のヒト肝細胞でのＨＢＶ感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構が解明されたため、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法が提供される。さらには、本発明により解明された新規な免疫機構の関係から、ＨＢＶだけでなくその他のウイルス性肝炎の病態の解明および治療薬の開発が可能となり、今後さらに医療へ応用されることが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染および発症の際における免疫応答に関連する、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎ウイルス感染によって引き起こる肝炎は、時に慢性化、重症化する予後不良の病症である。当該病症の病態の解明および治療のためには、肝炎ウイルス感染モデル動物、特にＢ型肝炎ウイルス感染モデル動物が必要とされている。Ｂ型肝炎ウイルスは、ヒトおよびチンパンジーにのみ感染可能であり、チンパンジーは優れたＢ型肝炎ウイルス感染モデル動物となり得る。しかし、倫理的、経済的に問題があるとされている。
【０００３】
ヒト肝細胞キメラマウスとは、肝臓が部分的にヒト肝細胞に置換されているマウスのことである。近年、肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換されたヒト肝細胞キメラマウスが多く利用されている。このようなヒト肝細胞キメラマウスの作製方法を具体的に説明すると、まず、免疫不全マウスと肝不全マウスとを掛け合わせ、ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）を作製する。次いで、当該ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）にヒト肝細胞を移植し作製する。ヒト肝細胞キメラマウスは成熟したＴ細胞およびＢ細胞の欠損した重症免疫不全マウスである。しかし、マウス樹状細胞やＮＫ細胞は存在するため、前処置を行わずにヒト末梢血単核球を投与するとこのヒト末梢血単核球はこれらの細胞により排除されてしまう。そのためヒト末梢血単核球を生着させるためには、細胞移植前に、マウス樹状細胞およびマウスＮＫ細胞を排除しておく必要があり、これらの排除には、例えば、クロドロネートまたは抗アシアロＧＭ１抗体等が利用され得る（非特許文献１および非特許文献２）。
【０００４】
クロドロネートと種々の細胞（樹状細胞およびマクロファージも含む）との代謝メカニズムの詳細については、非特許文献３および非特許文献４に記載されている。また、抗アシアロＧＭ１抗体によるマウスＮＫ細胞の排除は、マウスのリンパ球系組織の全てからアシアロＧＭ１陽性細胞が消失し、マウスＮＫ細胞活性が除去されるということである。
【０００５】
なお、このような肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換されているヒト肝細胞キメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルスを接種することにより、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラマウスとすることが可能となる。さらには、当該Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラマウスの肝臓内においてＢ型肝炎ウイルスを増殖させることも可能である（非特許文献１および非特許文献５）。そのため、現在、このようなヒト肝細胞キメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルス以外にも最も有効な肝炎ウイルス感染モデル動物として多く利用されている（非特許文献５ないし非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mercer DF. et al., Nat Med 7, 927-933, 2001
【非特許文献２】Tateno C. et al., Am J Pathol 165, 901-912, 2004
【非特許文献３】Nico Van Rooijen. et al., Journal of Immunological Methods 174, 83-93, 1994
【非特許文献４】Julie C. et al., JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH Volume 12 Number 9, 1358-1367, 1997
【非特許文献５】Tsuge C. et al., Hepatology 42, 1046-1054, 2005
【非特許文献６】Hiraga M. et al., FEBS Letts 581, 1983-1987, 2007
【非特許文献７】Matsumura T. et al., Gastroenterology 137, 673-681, 2009
【非特許文献８】Ohira M. et al., J Clin Invest 119, 3226-3235, 2009
【非特許文献９】Kamiya N. et al., J Gen Virol 91, 1668-1677, 2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述したように、肝臓が高度かつ安定的に置換されたヒト肝細胞キメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルスに感染させることが可能である。そのため、優れたＢ型肝炎ウイルス感染動物モデルとなる。しかし、Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラマウスは成熟したＴ細胞およびＢ細胞の欠損した重症免疫不全マウスであるため、肝炎は発症しない。
【０００８】
また、これまでにいくつかの肝炎発症モデルは開発されているが（例えば、Ando K. et al., J Exp. Med. 178, 1541-1554, 1993、Cote PJ. et al., Hepatology 32, 807-817, 2000、または、Wieland SF. et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 6669-6674, 2004）、いずれも実際のヒト肝細胞での現象を反映しているものではない。すなわち、実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの免疫メカニズムの全ては解明されていないため、肝炎に関する医薬開発および病態治療の進退に著しく影響を与えている。
【０００９】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構を解明し、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、ヒト末梢血単核球生着のために使用していたクロドロネートが、マウス樹状細胞およびマクロファージだけでなく、ヒト樹状細胞にも影響を与えているということを発見した。詳細には、クロドロネートの影響でヒト樹状細胞が減少し、ヒトリンパ球の活性化に影響を与え、その結果、肝炎の発症が抑制されることを解明した。
【００１１】
さらに、このような新規に発見した免疫機構を利用し、クロドロネートの投与時期の調整を行うことで、免疫応答を行うＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製に成功した。なお、当該Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製の際の、ヒト末梢血単核球の移植前に、抗Ｆａｓ Ligand抗体を投与すると、やはりＢ型肝炎の発症は抑制されることがわかり、クロドロネートと、ヒト樹状細胞と、ヒトＮＫ細胞と、Ｆａｓ／Ｆａｓ Ligand pathwayとの間には免疫応答に係る関係があることについても確認された。
【００１２】
そこで、本発明の第１の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法は、
Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、
前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、
前記抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつ前記クロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球を、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒト末梢血単核球投与工程と、
を含むことを特徴とする。
【００１３】
好ましくは、モデル動物は、マウスであることを特徴とする。
【００１４】
より好ましくは、前記Ｂ型肝炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス−Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｄ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｅ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｆ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｇ型およびＢ型肝炎ウイルス−Ｈ型、からなる群より選ばれる１以上のウイルスであることを特徴とする。
【００１５】
また、前記Ｂ型肝炎ウイルスは、ＨＢｅ抗原、および／または、ＨＢｓ抗原を発現することを特徴とする。
【００１６】
さらに好ましくは、前記ヒト末梢血単核球投与工程は、前記クロドロネート投与工程の３日後ないし４日後に実施されることを特徴とする。
【００１７】
また、好ましくは、前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、６μＬ／ｇないし１４μＬ／ｇ投与することを特徴とする。
【００１８】
より好ましくは、前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、８μＬ／ｇないし１２μＬ／ｇ投与することを特徴とする。
【００１９】
さらに好ましくは、前記抗アシアロＧＭ１抗体、前記クロドロネートおよび前記ヒト末梢血単核球は、腹腔内投与することを特徴とする。
【００２０】
また、好ましくは、モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、２×１０７cells／mouseないし６×１０７cells／mouse投与することを特徴とする。
【００２１】
また、好ましくは、モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、３×１０７cells／mouseないし５×１０７cells／mouse投与することを特徴とする。
【００２２】
本発明の第２の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、第１の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法によって作製されることを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、前記Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスであることを特徴とする。
【００２４】
本発明の第３の態様に係るＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法は、
第２の態様に係るＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に被検化合物を投与する工程と、
前記被検化合物を投与された前記ヒト肝細胞キメラモデル動物のＢ型肝炎の病症の程度を測定する工程と、
前記被検化合物を投与しない場合と比較して、前記Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、実際のヒト肝細胞でのＢ型肝炎ウイルス感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構が解明され、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１に係るヒト末梢血単核球（末梢血単核球をＰＢＭＣと略記する）が存在するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの調製スケジュールを示す図である。
【図２】実施例１に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスのマウス肝臓組織の染色結果を示す図である。
【図３】実施例１に係る３日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。
【図４】実施例１に係る０日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。
【図５】実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織の染色結果を示す図である。
【図６】実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞およびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞のＦａｓｍＲＮＡ量を示す図である。
【図７】実施例２に係るヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書において「有する」、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。
【００２８】
（Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法）
本発明の実施の形態１は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法に関する。具体的には、Ｂ型肝炎ウイルスを（以下、ＨＢＶ）感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、ＨＢＶを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつクロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球（以下、ヒトＰＢＭＣという）をＨＢＶを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒトＰＢＭＣ投与工程と、を含む。
【００２９】
本明細書において「Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物」（以下、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物、とも言う）とは、肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換されており、ＨＢＶに感染しているモデル動物を示す。「ＨＢＶ」とは、広く一般の任意のＨＢＶを含有し、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス−Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｄ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｅ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｆ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｇ型およびＢ型肝炎ウイルス−Ｈ型、からなる群より選ばれる１以上のウイルスを挙げることができる。また、ＨＢｅ抗原、および／または、ＨＢｓ抗原を発現するＨＢＶも挙げることができる。ＨＢｅ抗原の発現に関わるＨＢＶゲノムに変異を有し、ＨＢｅ抗原が発現していないＨＢＶに感染すると、臨床的に劇症肝炎となることが知られている。「モデル動物」とは、最も好ましくはマウス（Mus musculus）であり、その他ラット（Rattus norvegicus）またはモルモット（Cavia porcellus）等の実験動物として使用され得る動物でも構わない。
【００３０】
このようなＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法は、例えば、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの場合、まず、免疫不全マウスと肝不全マウスとを掛け合わせ、ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）を作製する。次いで、当該ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）にヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞キメラマウスを作製し、ＨＢＶを接種することによって作製することができる。その他、当該技術分野において公知の作製方法を用いても構わない。また、「肝臓が高度かつ安定的にヒト肝細胞に置換」とは、当該ヒト肝細胞キメラモデル動物がＨＢＶに感染可能である程度置換されていればよい。
【００３１】
ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製後、抗アシアロＧＭ１抗体およびクロドロネートを投与、注入する。なお、いずれについてもリポソームにて封入し、投与、注入してもよい。好ましくは、抗アシアロＧＭ１抗体および／またはクロドロネートは、注射器等を使用し腹腔内投与を行う。また、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、クロドロネート投与工程は、いずれを先に行っても構わない。抗アシアロＧＭ１抗体またはクロドロネートは、購入することによって容易に入手することが可能である。
【００３２】
抗アシアロＧＭ１抗体投与工程について詳細に説明する。抗アシアロＧＭ１抗体は、前述した通り、腹腔内に投与するとマウスＮＫ細胞活性が除去され、後の工程において投与されるヒトＰＢＭＣが排除されることはない。なお、抗アシアロＧＭ１抗体が、ヒトＮＫ細胞活性には影響を与えないことは公知である。抗アシアロＧＭ１抗体投与工程は、ヒトＰＢＭＣ投与工程の１日前に行うと好ましい。抗アシアロＧＭ１抗体の投与量については、投与するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓の大きさ、体重等に適宜合わせればよい。
【００３３】
クロドロネート投与工程について詳細に説明する。クロドロネートは、前述した通り、腹腔内に投与するとマウス樹状細胞（以下、樹状細胞をＤＣと略記する）およびマクロファージだけでなく、ヒトＤＣまで排除してしまう。そのため、後述するヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前ないし１日前においてクロドロネートを投与する（すなわち、クロドロネート投与工程の１日後ないし４日後においてヒトＰＢＭＣを投与する）。より好ましくは、ヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前ないし３日前においてクロドロネートを投与する（すなわち、クロドロネート投与工程の３日後ないし４日後においてヒトＰＢＭＣを投与する）。
【００３４】
しかし、このように具体的な「ヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前ないし１日前」等といった期間でなくとも、ヒトＰＢＭＣ投与工程の際にクロドロネートが適量マウス体内に残存していれば、本実施の形態１と同様のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することは可能である。適量とは、例えば、ヒトＰＢＭＣ投与工程の当日に投与した場合は、クロドロネートの残存量が多量となりヒトＤＣを殆ど排除してしまうが、ヒトＰＢＭＣ投与工程の４日前に投与した場合はクロドロネートの残存量が適量となり、ヒトＤＣも適量残存することになる。また、例えば、ヒトＰＢＭＣ投与工程の１０日前に投与した場合は、クロドロネートがマウス体内に残存していない状態となってしまう。
【００３５】
クロドロネートの投与量は、投与するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓の大きさ、体重等に適宜合わせればよい。例えば、前述したような期間においてクロドロネートを投与する場合は、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の体重に対し、好ましくは６μＬ／ｇないし１４μＬ／ｇ、さらに好ましくは８μＬ／ｇないし１２μＬ／ｇ、最も好ましくは１０μＬ／ｇ投与すればよい。さらには、クロドロネートの投与時期と、クロドロネートの投与量とを適宜合わせ、ヒトＰＢＭＣ投与工程の際にクロドロネートが適量マウス体内に残存している状態に調整することで、前述と同様に本実施の形態１と同様のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することは可能である。
【００３６】
ヒトＰＢＭＣ投与工程について詳細に説明する。ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物に、前述した通りの抗アシアロＧＭ１抗体投与工程およびクロドロネート投与工程を行い、その後ヒトＰＢＭＣを投与（移植）することによって、Ｂ型肝炎を発症するヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することが可能となる。ヒトＰＢＭＣはヒトの末梢血を用い、密度勾配遠心分離等を行うことによって得ることができる。
【００３７】
ヒトＰＢＭＣ投与工程は２回（特に隔日にて）行うと好ましいし、複数回行っても構わない。ヒトＰＢＭＣ投与工程を複数回行う場合、本明細書において述べているクロドロネートの投与時期とヒトＰＢＭＣの投与時期との間隔は、全て、最初に行うヒトＰＢＭＣ投与工程の時期との間隔を意味している。ヒトＰＢＭＣの投与量は、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓の大きさ、体重に適宜合わせればよい。例えば、モデル動物がマウスの場合、好ましくは２×１０７cells／mouseないし６×１０７cells／mouse、さらに好ましくは３×１０７cells／mouseないし５×１０７cells／mouse、最も好ましくは４×１０７cells／mouse程度を投与すればよい（複数回ヒトＰＢＭＣを投与する場合は、合計量を示す）。
【００３８】
このように、抗アシアロＧＭ１抗体投与工程およびクロドロネート投与工程と、その後のヒトＰＢＭＣ投与工程を経ることによって、Ｂ型肝炎を実際に発症するヒト肝細胞キメラモデル動物を作製することができる。本実施の形態１の変形例として、上述した方法によって作製された、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を挙げることができる。好ましくは、当該Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスである。また、本実施の形態１において作製されるＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、前述したように、クロドロネートと、ヒトＤＣと、ヒトＮＫ細胞と、Ｆａｓ／Ｆａｓ Ligand pathway（以下、Ｆａｓ／ＦａｓＬ pathway）との間には免疫応答に係る関係があることを示唆している。そのため、本発明を利用することにより、ＨＢＶだけでなくその他のウイルス性肝炎の病態の解明および治療・予防薬の開発が可能となり、今後、さらに医療へ応用されることが期待される。
【００３９】
（Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態２は、Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法に関する。具体的には、前述の実施の形態１の変形例のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に被検化合物を投与する工程と、当該被検化合物を投与された当該ヒト肝細胞キメラモデル動物のＢ型肝炎の病症の程度を測定する工程と、当該被検化合物を投与しない場合と比較して、Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する工程と、を含む。
【００４０】
本発明において「被検化合物」（「化合物」）とは、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に投与でき、その被検化合物によるＢ型肝炎の病症の程度の変化を評価できるあらゆる物質、組成物を示す。例えば、低分子化合物、核酸またはポリペプチド等が挙げられる。低分子化合物、核酸またはポリペプチド等は、天然物から抽出および精製されたものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。また、精製されたものに限らず、例えば、未精製の細胞抽出液等であっても被検化合物として使用することができる。また、新規な物質に限らず、公知の物質またはその改良物であってもよい。例えば、既存の治療薬もしくは予防薬またはその誘導体において、本実施の形態２のスクリーニング方法により評価をすることも可能である。
【００４１】
このような被検化合物の投与は、直接当該ヒト肝細胞キメラモデル動物に投与したり、その他の成分も含有する化合物を構成し、これを当該ヒト肝細胞キメラモデル動物に投与してもよい。本発明における「投与」とは、注射器等を使用した腹腔内投与が最も好ましい。その他、経口投与、静脈内投与、動脈内投与または皮下注射等の公知の方法を用いることが可能である。
【００４２】
次の工程である、Ｂ型肝炎の病症の程度を測定する工程とは、当該Ｂ型肝炎を発症しているヒト肝細胞キメラモデル動物の肝臓組織または肝細胞において、炎症の進行度合を、免疫染色等の既知の技術を用い、確認または評価することを示す。確認または評価方法の詳細については、実施例を参照されたい。
【００４３】
最後は、被検化合物を投与していないこと以外は同様であるＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の場合と比較して、Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する。ここで、Ｂ型肝炎の病症の程度が「緩和」とは、当該Ｂ型肝炎を発症しているモデル動物の肝臓組織または肝細胞において、炎症の進行度合が抑制されること、または炎症の進行が停止すること等を意味する。このような方法で、Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物をスクリーニングする。
【００４４】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語等は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様のまたは等しい方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書中に言及するすべての公開物および他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法および具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【実施例】
【００４５】
以下、調製例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【００４６】
（調製例）
まず、後述する実施例にて使用する、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスを調製した。免疫不全マウスと肝不全マウスとを掛け合わせ、ｕＰＡ＋／＋／ＳＣＩＤ＋／＋マウス（重度免疫不全肝障害マウス）を作製し、次いでＨＬＡ（白血球抗原）−Ａ０２０１を有するヒト肝細胞を移植した。この方法は、非特許文献２および非特許文献５、ならびにHiraga N., et al., Journal of Hepatology 51, 1046-1054, 2009に記載の作製方法と同様の方法を用いた。使用した全てのマウスにおいて、同じドナーから得て冷凍しておいたヒト肝細胞を移植した。感染、血清サンプル抽出および安楽死の際には、それぞれ麻酔の下で行った。
【００４７】
ＨＢＶのＤＮＡを含むヒト血清のサンプル（５．３×１０６copies／ｍＬ）は、提供に同意した慢性肝炎の患者から得た。当該ＨＢＶ陽性ヒト血清のサンプルは、使用するまで少量ずつ一定量に分け、液体窒素を用い保存しておいた。このように調製されたＨＢＶ陽性ヒト血清は、５０μＬずつヒト肝細胞キメラマウスに静脈注射にて注入し、ヒト肝細胞キメラマウスをＨＢＶに感染させた。
【００４８】
（実施例１）
本実施例１では、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびヒトＰＢＭＣ移植によって作製された、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスに係る実施例について詳細に説明する。
【００４９】
まず、ヒトＰＢＭＣを調製した。調製方法は、ＨＬＡ−Ａ０２０１を有する健康的なドナーの血液から分離した後、フィコール・ハイパックの密度勾配遠心分離機を使用し、分離調製した。次いで、前述の調製例の方法において作製したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの腹腔内に１２０μＬの抗アシアロＧＭ１抗体（和光純薬工業）を含む２００μＬのＰＢＳを注入した。抗アシアロＧＭ１抗体の注入は、マウスＮＫ細胞を排除し、ヒトＰＢＭＣの排除を防ぐためである。その１日後にヒトＰＢＭＣの１回目の腹腔内移植（投与）を行った。図１は、実施例１に係るヒトＰＢＭＣが存在するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの調製スケジュールを示す図である。
【００５０】
図１では、抗アシアロＧＭ１抗体（anti-asialoＧＭ１）を投与した日をday０として記載している。図１に示すように、１回目のヒトＰＢＭＣの腹腔内投与（ＰＢＭＣ１）（２×１０７cells／mouse）の３日前（day−２）において、１０μＬ／ｇのリポソームクロドロネートをＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスに投与した（clodronate）。これは、マウスのマクロファージおよびマウスＤＣを排除するためである。２回目のヒトＰＢＭＣ腹腔内投与（ＰＢＭＣ２）（２×１０７cells／mouse）は、day３において行った。また、ＨＢＶの感染（ＨＢＶ infection）は、調製例にて示した方法で、８週間前に行われた。
【００５１】
ここで、図１に記載のday７およびday１４に行われたliver samplingについて説明する。前述のような投与、調製スケジュールを経たＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織はどのように変化しているのかを免疫染色によって調べた。すなわち、３日前においてリポソームクロドロネートを投与した場合は、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織はどのように変化したのかを調べた。
【００５２】
まず、day７またはday１４のヒト肝細胞キメラマウスにジエチルエーテルを用いて麻酔を行い、肝臓を取り出した。次いで、各肝臓を薄片とし、ホルマリン（登録商標）固定後、パラフィン包埋した。その後、各薄片を用い、ＨＥ染色、ならびに抗ヒトアルブミン抗体および抗ＨＢｃ抗体による免疫染色を行った。なお免疫染色は、ストレプトアビジン−ビオチン染色キット（Histofine SAB-PO kit、ニチレイ）およびジアミノベンジジンを用いて行った。なお、ヒトＰＢＭＣを後に投与していないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスについても、同様の実験を行った。
【００５３】
図２は、実施例１に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスのマウス肝臓組織の染色結果を示す図である。図２における、Ａ、ＢおよびＣは、それぞれヒトＰＢＭＣを投与していないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（−））の薄片の、ＨＥ染色、ならびに抗ヒトアルブミン抗体および抗ＨＢｃ抗体での免疫染色の写真である。
【００５４】
Ｄ、ＥおよびＦ、ならびにＧ、ＨおよびＩについても、同様の条件の染色の写真であり、それぞれday７またはday１４にliver samplingが行われ、ＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（day７またはday１４））である。なお、それぞれの写真は各々のＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの薄片の代表例を示し、４０倍で撮影され、Ｈはヒトの肝細胞の部分を示し、Ｍはマウスの肝細胞の部分を示す。
【００５５】
図２に示すように、３日前においてリポソームクロドロネートを投与した場合では、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓は、ヒトＰＢＭＣを投与した場合のみ、劇症肝炎の際に見られるヒト肝細胞の死細胞の範囲と同様の広範囲の死細胞が確認された。すなわち、肝炎が発症し病態が進行し劇症肝炎となり、ヒト肝細胞は殆ど完全に除去され、day７またはday１４には低ヒトアルブミンであるマウス肝細胞に置き換わっていた。
【００５６】
さらに、３日前においてリポソームクロドロネートを投与した場合のヒト肝細胞キメラマウスの血清について、ヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量を調べた。なお、検体は、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスと、ヒトＰＢＭＣを投与していないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスと、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの３種類である。ヒトアルブミン量の測定については、当該技術分野における常法を用いた。
【００５７】
ＨＢＶのＤＮＡ量の測定方法について述べる。まず、各ヒト肝細胞キメラマウスの血清からＳＭＩＴＥＳＴ（Genome Science Laboratories）を用いＤＮＡを抽出し、２０μＬの水に溶解させた。次に、溶解させたサンプルを使用し、Light Cycler（Roche, Mannheim, Germany）によってリアルタイムＰＣＲでＨＢＶのＤＮＡ量を測定した。増幅のために使用したプライマーは配列番号１および配列番号２に記す。増幅条件は、最初の変性反応を９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間の変性を４５サイクル、アニーリングは５８℃で５秒間行い、最後に伸長反応を７２℃で６秒間行った。本測定の検出下限は３００コピーで行った。
【００５８】
図３は、実施例１に係る３日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢ実施例１に係る３日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。ヒトアルブミン量（Human albumin（ｎｇ／ｍＬ））の変化を見ると、ＨＢＶに感染しており、かつヒトＰＢＭＣを投与されているヒト肝細胞キメラマウスでなければ、ヒトアルブミン量の減少、すなわちヒト肝細胞障害は起こらず、肝炎の発症の病態とはならないということが確認された。
【００５９】
また、ＨＢＶのＤＮＡ量（ＨＢＶ ＤＮＡ（copies／ｍＬ））についても同様であり、ＨＢＶに感染しており、かつヒトＰＢＭＣを投与されているヒト肝細胞キメラマウスでなければ、ＨＢＶのＤＮＡ量は減少しない、すなわちＨＢＶ感染ヒト肝細胞が減少する肝炎発症の病態にはならないということが確認された。
【００６０】
一方、０日前（２４時間前以内）においてリポソームクロドロネートをヒト肝細胞キメラマウスに投与した場合、血清中のヒトアルブミン量、およびＨＢＶのＤＮＡ量はどう変化するのかについても調べた。検体は、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスと、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスのみの、２種類である。ヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の測定方法については、前述と同様である。
【００６１】
図４は、実施例１に係る０日前のクロドロネート投与における、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。０日前とは、前述の通り、クロドロネート投与後２４時間以内にヒトＰＢＭＣを投与することを意味する。いずれもヒトＰＢＭＣを投与したヒト肝細胞キメラマウスのデータである。なお、controlとは、前述の図３に示した、３日前のクロドロネート投与における、ヒトＰＢＭＣを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスのデータを記載したものである。
【００６２】
ヒトアルブミン量（Human albmin（ｎｇ／ｍＬ））の変化を見ると、いずれのヒト肝細胞キメラマウスもヒトアルブミンの減少、すなわちヒト肝細胞障害は起こらず肝炎発症の病態となることはなかった。また、ＨＢＶのＤＮＡ量（ＨＢＶ ＤＮＡ（copies／ｍＬ））についても同様であり、いずれのヒト肝細胞キメラマウスもＨＢＶのＤＮＡ量が減少することはなく、すなわちＨＢＶ感染ヒト肝細胞が減少する肝炎発症の病態となることはなかった。
【００６３】
これらの結果および現在までの種々の研究結果から、本発明者は、リポソームクロドロネート投与を以てマウスのマクロファージおよびＤＣを排除する際に、例えばヒトＰＢＭＣ投与０日前等に投与すると、ヒトＰＢＭＣ投与時に残存したクロドロネートがヒトＤＣに影響を与え、ヒトリンパ球の活性化を抑制し、肝炎を発症しないのではないかと考察した。
【００６４】
従って、肝炎を発症するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラモデル動物を作製するには、使用するモデル動物の肝臓組織および肝細胞等に適宜合うよう、特定の量および特定の時期に、モデル動物のマクロファージおよびＤＣを排除する物質、主にクロドロネートを投与すべきであると示唆される。
【００６５】
（実施例２）
本実施例２では、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスにおける肝炎発症の機序、特にＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayとの関係に関する実施例について詳細に説明する。
【００６６】
実施例１にて前述したように、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスにおけるヒトリンパ球の活性化の抑制は、マウスのマクロファージおよびＤＣを排除するために使用されていたクロドロネートによってひきおこされることが示唆された。ここで、本発明者は、１回目のヒトＰＢＭＣ投与時の３日前または０日前にリポソームクロドロネートを投与したマウスの肝臓を取り出し、フローサイトメトリーによって、肝臓内に生着したヒトＮＫ細胞の表面のＦａｓＬの量を測定した。その結果、３日前にクロドロネートを投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの方のみ発現が亢進していた（図示せず）。
【００６７】
これらの結果から、本発明者は、現在までに解明されているＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayと細胞死との間には関連があると考え、残存したクロドロネートがヒトＤＣまで除去するため、ヒトリンパ球の活性化が抑制され、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞の障害が起こらないのではないかとの推論に至った。
【００６８】
そこで、前述の実施例１の３日前のクロドロネート投与の場合と同様のスケジュールを経たヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織を用い、より詳細な免疫染色およびＴＵＮＥＬアッセイを行った。薄片の製法は、実施例１にて前述した方法と同様である。また、ＨＥ染色、ならびに抗ヒトアルブミン抗体および抗Ｆａｓ抗体による免疫染色も同様に、ストレプトアビジン−ビオチン染色キット（Histofine SAB-PO kit、ニチレイ）およびジアミノベンジジンを用いて行った。ＴＵＮＥＬアッセイは、In Situ Cell Death Detection KitのＰＯＤ（Roche Diagnostics Japan）を使用した。
【００６９】
図５は、実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスおよびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウスの肝臓組織の染色結果を示す図である。図５における、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれday７にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ非感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（−）、ＰＢＭＣ（＋、day７））の薄片の、ＨＥ染色、抗ヒトアルブミン抗体および抗Ｆａｓ抗体での免疫染色、ならびにＴＵＮＥＬアッセイでの染色の写真である。
【００７０】
Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ、Ｉ、Ｊ、ＫおよびＬ、ならびに、Ｍ、Ｎ、ＯおよびＰについても、同様の条件の染色写真である。それぞれ、ヒトＰＢＭＣが投与されていないＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（−））の薄片、day４にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（＋、day４））の薄片、および、day７にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣが投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウス（HBV infection（＋）、ＰＢＭＣ（＋、day７））の薄片の写真である。なお、それぞれの写真は各々のヒト肝細胞キメラマウスの薄片の代表例を示し、１００倍で撮影さている。Ｈはヒトの肝細胞の部分を示し、Ｍはマウスの肝細胞の部分を示す。
【００７１】
図５に示すように、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスで抗ヒトアルブミン抗体が陽性のヒト肝細胞においてのみ、抗Ｆａｓ抗体に対して陽性であった。ＴＵＮＥＬアッセイの染色についても、day４またはday７にliver samplingが行われヒトＰＢＭＣを投与されたＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの薄片のみ染色されていた。
【００７２】
さらに、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞およびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞のＦａｓのｍＲＮＡ量についてＲＴ−ＰＣＲ法によって測定した。まず、それぞれのヒト肝細胞からトータルＲＮＡをRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出した。次に、それぞれのＲＮＡを１μｇずつを、ReverseTra Ace（東洋紡）およびランダムプライマー（タカラバイオ）を用い、逆転写を行った。その後、それぞれのヒト肝細胞のＦａｓのｍＲＮＡレベルを分析した。なお、Ｆａｓフォワードプライマーの塩基配列を配列番号３に、Ｆａｓリバースプライマーを配列番号４に記す。
【００７３】
図６は、実施例２に係るＨＢＶ感染ヒト肝細胞およびＨＢＶ非感染ヒト肝細胞のＦａｓｍＲＮＡ量を示す図である。なお、図６は、ＨＢＶ非感染ヒト肝細胞（Uninfected liver、ｎ＝４）のＦａｓｍＲＮＡ量を１とし、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞（HBV-infected liver、ｎ＝５）のＦａｓｍＲＮＡ量の割合（Ratio）を示している（有意水準：ｐ＝０．０１）。図６に示すように、ヒト肝細胞のＦａｓｍＲＮＡレベルは、ＨＢＶに感染すると著しく増加することが解明した。
【００７４】
これらの結果から、ヒトＰＢＭＣによるＨＢＶ感染ヒト肝細胞の肝炎発症による細胞死はＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayが影響していると示唆される。そこで、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスを用い、ヒトＤＣが産生するヒトインターフェロンαと、ヒトインターフェロンγの作用を阻害するために、抗ヒトインターフェロンα抗体および抗ヒトインターフェロンγ抗体の前投与と、活性化したヒトリンパ球が発現するヒトＦａｓＬの作用を阻害するために抗ヒトＦａｓＬ抗体を前投与し、ヒトアルブミン量およびＨＢＶ ＤＮＡ量の推移についての比較を行った。ヒトアルブミン量およびＨＢＶ ＤＮＡ量の測定方法は、前述の実施例１と同様である。ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの作製スケジュールは、前述の実施例１に係る３日前でのクロドロネート投与におけるスケジュールにて行った。なお、それぞれの抗体は１回目のヒトＰＢＭＣ投与時の１日前に腹腔投与で行った。
【００７５】
図７は、実施例２に係るヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの血清のヒトアルブミン量およびＨＢＶのＤＮＡ量の変化を示す図である。図７に示すように、抗ヒトインターフェロンγ抗体（anti-interferon gamma、１．５ｍｇ／mouse、R&G Systems）、抗ヒトインターフェロンα抗体（anti-interferon alpha、１．５ｍｇ／mouse、PBL Biomedical Laboratories）、および、アイソタイプコントロール（control antibody）と比較すると、抗ヒトＦａｓＬ抗体（anti-FasL、１．５ｍｇ／mouse、R&G Systems）を投与したＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスにおいて、ヒトアルブミン量（Human albumin（ｎｇ／ｍＬ））の減少を認めなかった。また、ＨＢＶのＤＮＡ量（copies／ｍＬ）についても、抗ヒトインターフェロンγ抗体、抗ヒトインターフェロンα抗体、および、アイソタイプコントロールと比較すると、抗ヒトＦａｓＬ抗体で減少を認めなかった。すなわち、抗ヒトＦａｓＬ抗体によって肝炎の発症をより抑制できることを示唆している。
【００７６】
これらの実施例の結果から、ＨＢＶ感染ヒト肝細胞は、ＮＫ細胞およびＤＣにおけるＦａｓ／ＦａｓＬ pathwayに媒介されている可能性が高く、Ｆａｓ／ＦａｓＬ pathwayの媒介機能を利用し、肝炎発症抑制剤の研究、開発に繋がることを示唆している。
【００７７】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【００７８】
本明細書の中で明示した論文等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明者が鋭意研究を重ねた結果、ヒトＰＢＭＣが生存するＨＢＶ感染ヒト肝細胞キメラマウスの作製に使用していたクロドロネートが、マウスＤＣおよびマクロファージだけでなく、ヒトＤＣにも影響を与えているということを発見した。詳細には、クロドロネートの影響でヒトＤＣが減少し、ヒトリンパ球の活性化に影響を与え、その結果、肝炎の発生が抑制されることを解明した。さらに、このような新規に発見した免疫機構を利用し、クロドロネートの投与時期の調整を行うことで、免疫応答を行うＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製に成功した。なお、当該Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスの作製の際のヒトＰＢＭＣ移植前に、抗ＦａｓＬ抗体を投与すると、やはりＢ型肝炎の発症は抑制され、クロドロネートと、ヒトＤＣと、ヒトリンパ球と、Ｆａｓ／ＦａｓＬ pathwayとの免疫応答における関係についても確認した。
【００８０】
そこで、本発明によれば、実際のヒト肝細胞でのＨＢＶ感染からＢ型肝炎発症までの新規な免疫機構が解明されたため、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法、ならびに、作製したＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物を利用するＢ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法が提供される。さらには、本発明により解明された新規な免疫機構の関係から、ＨＢＶだけでなくその他のウイルス性肝炎の病態の解明および治療薬の開発が可能となり、今後さらに医療へ応用されることが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、
前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、
前記抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつ前記クロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球を、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒト末梢血単核球投与工程と、
を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項２】
モデル動物は、マウスであることを特徴とする、請求項１に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項３】
前記Ｂ型肝炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス−Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｄ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｅ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｆ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｇ型およびＢ型肝炎ウイルス−Ｈ型、からなる群より選ばれる１以上のウイルスであることを特徴とする、請求項１または２に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項４】
前記Ｂ型肝炎ウイルスは、ＨＢｅ抗原、および／または、ＨＢｓ抗原を発現することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項５】
前記ヒト末梢血単核球投与工程は、前記クロドロネート投与工程の３日後ないし４日後に実施されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項６】
前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、６μＬ／ｇないし１４μＬ／ｇ投与することを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項７】
前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、８μＬ／ｇないし１２μＬ／ｇ投与することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項８】
前記抗アシアロＧＭ１抗体、前記クロドロネートおよび前記ヒト末梢血単核球は、腹腔内投与することを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項９】
モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、２×１０７cells／mouseないし６×１０７cells／mouse投与することを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項１０】
モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、３×１０７cells／mouseないし５×１０７cells／mouse投与することを特徴とする、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法によって作製されることを特徴とする、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物。
【請求項１２】
前記Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスであることを特徴とする、請求項１１に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に被検化合物を投与する工程と、
前記被検化合物を投与された前記ヒト肝細胞キメラモデル動物のＢ型肝炎の病症の程度を測定する工程と、
前記被検化合物を投与しない場合と比較して、前記Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に抗アシアロＧＭ１抗体を投与する抗アシアロＧＭ１抗体投与工程と、
前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物にクロドロネートを投与するクロドロネート投与工程と、
前記抗アシアロＧＭ１抗体投与工程の後、かつ前記クロドロネート投与工程の１日後ないし４日後に、ヒト末梢血単核球を、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に投与するヒト末梢血単核球投与工程と、
を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項２】
モデル動物は、マウスであることを特徴とする、請求項１に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項３】
前記Ｂ型肝炎ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルス−Ａ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｂ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｃ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｄ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｅ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｆ型、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｇ型およびＢ型肝炎ウイルス−Ｈ型、からなる群より選ばれる１以上のウイルスであることを特徴とする、請求項１または２に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項４】
前記Ｂ型肝炎ウイルスは、ＨＢｅ抗原、および／または、ＨＢｓ抗原を発現することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項５】
前記ヒト末梢血単核球投与工程は、前記クロドロネート投与工程の３日後ないし４日後に実施されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項６】
前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、６μＬ／ｇないし１４μＬ／ｇ投与することを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項７】
前記クロドロネートは、前記Ｂ型肝炎ウイルスを感染させたヒト肝細胞キメラモデル動物に対し、８μＬ／ｇないし１２μＬ／ｇ投与することを特徴とする、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項８】
前記抗アシアロＧＭ１抗体、前記クロドロネートおよび前記ヒト末梢血単核球は、腹腔内投与することを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項９】
モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、２×１０７cells／mouseないし６×１０７cells／mouse投与することを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項１０】
モデル動物はマウスであり、前記ヒト末梢血単核球は、３×１０７cells／mouseないし５×１０７cells／mouse投与することを特徴とする、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物の作製方法によって作製されることを特徴とする、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物。
【請求項１２】
前記Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物は、Ｂ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラマウスであることを特徴とする、請求項１１に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載のＢ型肝炎発症ヒト肝細胞キメラモデル動物に被検化合物を投与する工程と、
前記被検化合物を投与された前記ヒト肝細胞キメラモデル動物のＢ型肝炎の病症の程度を測定する工程と、
前記被検化合物を投与しない場合と比較して、前記Ｂ型肝炎の病症の程度が緩和する化合物を選択する工程と、
を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎治療および／または進行抑制化合物のスクリーニング方法。
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図５】
【図４】
【図６】
【図７】
【図１】
【図２】
【図５】
【公開番号】特開２０１３−４８６０６（Ｐ２０１３−４８６０６Ａ）
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８９３１７（Ｐ２０１１−１８９３１７）
【出願日】平成２３年８月３１日（２０１１．８．３１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月１４日（２０１３．３．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月３１日（２０１１．８．３１）
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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