本発明は、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、核酸、抗体、アンタゴニストおよびアゴニスト、そしてこれらを作製するおよび使用する方法を提供する。本発明の組成物を使用する、診断、スクリーニングおよび治療法が提供される。例えば、本発明の組成物は、炎症性腸疾患の診断および処置のため、そして抗原に対する粘膜免疫応答を促進するために使用することが可能である。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年１２月２３日に出願された米国仮出願第６０／４３６，１８５号および２００３年１１月２６日に出願された米国仮出願第６０／５２５，２９８号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明はブチロフィリン様タンパク質、特に、例えばＢ細胞および／またはＴ細胞のごとき免疫エフェクター細胞の機能を変調することが知られている、Ｂ７サブファミリーのブチロフィリン様タンパク質に関する。こうしたタンパク質をコードする核酸、こうしたタンパク質を産生するためのプロセス、こうしたタンパク質へ結合する抗体、こうしたタンパク質または抗体を含む医薬組成物、こうした核酸、タンパク質およびこうしたタンパク質に対する抗体を使用する方法もまた含まれている。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
免疫または炎症性応答の変調は、自己免疫疾患、異常な炎症および／または免疫応答により特徴付けられる疾患、並びに感染を含む、多様な種類の疾患の制御において、役に立つ手段であることが可能である。炎症性腸疾患および自己免疫または炎症性疾患のごとき、異常な炎症および／または免疫応答により特徴付けられる疾患の処置においては、免疫応答の下方変調が望まれる。他の事態、例えば、感染性疾患に対する免疫性を与えるために患者にワクチン接種する場合、免疫応答の刺激が望まれる。ワクチン設定において、同時投与される抗原に対する免疫応答を高めることが可能なアジュバントは、疾患に対する長期の保護を提供することにおいて役立つことが可能である。特に当該分野において欠けていることは、粘膜免疫応答を刺激することが可能なアジュバントである。全身性免疫応答に対する粘膜免疫応答は、まさしく共通の侵入地点、即ち、粘膜表面で感染を攻撃できるので、価値がある。本発明は、不適当なおよび／または異常な炎症および／または免疫応答により特徴付けられる疾患を診断そして処置するための治療剤、および免疫応答、特に粘膜免疫応答を刺激するためのアジュバントとして作用可能な治療剤を提供することにより、当該分野でのこれらの要求に取り組んでいる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
概要
本発明は、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、核酸、抗体、ＢＴＬ−ＩＩ阻害剤およびアゴニスト、そしてこれらの組成物を使用するための方法を包含する。
【０００５】
配列番号４のアミノ酸ｘ−ｙ、ここにおいてｘは配列番号４の１から３５位のいずれかのアミノ酸であり、そしてｙは配列番号４の４５２−４６２位からのいずれかのアミノ酸である、から成るアミノ酸配列を含んでなる、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質が提供される。こうしたＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、配列番号４のアミノ酸３０から４５３、１から４５３、２９から４５７、１から４５７、１から４８２および／または２９から４８２を含むことができる。本発明はさらに、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、または９８％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んでなる、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を提供し、ここにおいて、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と並列された（ａｌｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ）アミノ酸配列の同一性領域は少なくとも２０、所望により少なくとも２５または３０アミノ酸長であり、そしてポリペプチドはＢ細胞またはＴ細胞上に発現された細胞表面レセプターへ結合可能であり、および／またはＴ細胞の増殖を阻害可能である。こうしたアミノ酸配列は少なくとも１５０アミノ酸長であり得、そして配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一であり得、ここにおいて、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも１５０、所望により少なくとも２００、２５０または３００アミノ酸長である。さらに、アミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と少なくとも９０％、所望により少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一であり得、および／または配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８を含んでなることが可能である。
【０００６】
本発明の別の態様は、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第一のアミノ酸配列から成る第一のポリペプチドを含んでなる、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を包含しており、ここにおいて、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と並列された第一のアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも１５０アミノ酸であり、ここにおいて第一のポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第二のアミノ酸配列から成る第二のポリペプチドを含んでなり、ここにおいて、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と並列された、第二のアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも２０アミノ酸長であり、そしてここにおいて、第一のポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である。第一のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と同一であることが可能である。
【０００７】
あるいは、本発明は、配列番号４のアミノ酸３０から４５７と少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んでなる、単離されたＢＴＬ−ＩＩタンパク質を提供し、ここにおいてポリペプチドはわずか２のまたはそれより少ないＩｇ様ドメインを含んでなり、そしてここにおいて、ポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である。アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸３０から２４７または配列番号１２のアミノ酸３０から２４３と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一であり得る。アミノ酸配列は配列番号４のアミノ酸３０から４５７と少なくとも９０％、所望により少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、９９．５％または１００％同一であり得る。
【０００８】
あるいは、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、配列番号４のアミノ酸２４７から４５２または配列番号６のアミノ酸２４８から４４７と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第一のアミノ酸配列から成る第一のポリペプチドを含んでなることが可能であり、ここにおいて第一のアミノ酸配列は、少なくとも２５，所望により少なくとも５０、７５、１００または１５０のアミノ酸の、配列番号４と並列された第一のアミノ酸配列との同一性領域を有する、配列番号４のアミノ酸３２から２３２または配列番号６のアミノ酸２７から２３２と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでおらず、そしてここにおいて、該タンパク質は、配列番号４のアミノ酸３２から２３２または配列番号６のアミノ酸２７から２３２と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第二のアミノ酸配列から成る第二のポリペプチドを含んでおらず、少なくとも２５，所望により少なくとも５０、７５、１００または１５０のアミノ酸の、配列番号４と並列された第二のアミノ酸配列との同一性領域を有し、そしてここにおいて、第一のポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である。
【０００９】
別の態様において、本発明の単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、配列番号８または配列番号１２のアミノ酸３２から２４２と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第一のアミノ酸配列から成る第一のポリペプチドを含んでなることが可能であり、ここにおいて、配列番号８または配列番号１２と並列された第一のアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも約５０，所望により少なくとも約７５、１００、１５０または２００アミノ酸長であり、ここにおいて、第一のポリペプチドは、配列番号８または配列番号１２のアミノ酸１０から４０と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第二のアミノ酸配列から成る第二のポリペプチドを含んでなり、ここにおいて、配列番号８または配列番号１２と並列された第二のアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも約２０，所望により少なくとも約２５または３０アミノ酸長であり、そしてここにおいて、第一のポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んでなる、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を包含しており、ここにおいて、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は、少なくとも２５０、所望により少なくとも２７５または３００アミノ酸であり、そしてここにおいて、ポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である。
【００１１】
本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、長さが長くて約４８０アミノ酸、約３８０アミノ酸、約２７０アミノ酸または約１６０アミノ酸であることができ、Ｔ細胞の増殖を阻害可能であるポリペプチドを含んでなることが可能である。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号１０のアミノ酸３２から３５８と、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％同一である第一のアミノ酸配列から成る第一のポリペプチドを含んでなる、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を包含し、ここにおいて、配列番号１０と並列された第一のアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも約１７５、所望により約２００、２５０、２７５または３００アミノ酸長であり、ここにおいて、第一のアミノ酸配列は、長さが約３８０を超えず、所望により長くて約３９０、２７０または１７０アミノ酸であり、ここにおいて、第一のポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能であり、ここにおいて、第一のアミノ酸配列は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０または７５アミノ酸の、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と並列された第一のアミノ酸配列の同一性領域を有する、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と少なくとも８０％同一ではなく、そしてここにおいて、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０または７５アミノ酸の、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と並列された第二のアミノ酸配列の同一性領域を有する、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と少なくとも８０％同一である第二のアミノ酸配列を含んでいない。こうしたＢＴＬ−ＩＩタンパク質は配列番号８または配列番号１２のアミノ酸３２から２４２を含んでなることができる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質および、抗体のＦｃ領域またはロイシンジッパーであることが可能な異種ポリペプチドを含んでなる、ＢＴＬ−ＩＩ組換え融合タンパク質を含んでなる。本発明はまた、少なくとも１０アミノ酸長であり、そして配列番号４の３６０位に及ぶ断片へ特異的に結合する抗体を惹起可能である、配列番号４のアミノ酸２９から４５７の免疫原性断片も包含する。少なくとも１０アミノ酸長の、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１６、および配列番号１８の免疫原性断片が提供され、ここにおいて、免疫原性断片は配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８または配列番号１６の１４１から１４３位に及び、そして断片に特異的に結合する抗体を惹起可能である。あるいは、免疫原性は配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８の１４２位、または配列番号１６の１４１位に及ぶことが可能である。
【００１４】
代わりの態様において、マウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質を提供する。特に、本発明は、配列番号６のアミノ酸ｘ−ｙから成るアミノ酸配列を含んでなる、単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を提供し、ここにおいて、ｘは配列番号４の１から３５位の任意のアミノ酸であり、そしてｙは配列番号６の４５０−４６０位の任意のアミノ酸である。こうしたＢＴＬ−ＩＩタンパク質は配列番号６のアミノ酸３２−４５０、２０から４５６および／または２９から５１４を含んでなることが可能である。
【００１５】
他の態様は、配列番号４のアミノ酸１−４５７、配列番号６のアミノ酸１−４５６、配列番号８のアミノ酸１−２４７、配列番号１０のアミノ酸１−３６３、配列番号１２のアミノ酸１−２４３、配列番号１４のアミノ酸１−３５９、配列番号１６のアミノ酸１−３５８または配列番号１８のアミノ酸１−３６２から成るＢＴＬ−ＩＩタンパク質に特異的に結合する単離された抗体を含む。こうした抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることが可能であり、そしてそのレセプターに対するＢＴＬ−ＩＩの結合を阻害することができる。本発明は、こうした抗体をコードする核酸、そしてこうした抗体を産生することが可能な細胞を包含し、該細胞は、こうした抗体を産生するように遺伝子操作されたハイブリドーマ細胞または細胞であることができる。本発明はさらに、抗体を分泌することができるこうした細胞を培養することによる、抗体を産生する方法も包含する。
【００１６】
他の態様はＢＴＬ−ＩＩ核酸を含んでいる。本発明は、配列番号３のヌクレオチドｘからｙより成るポリヌクレオチドを含んでなる、または該ポリヌクレオチドの相補体を含んでなる単離されたＢＴＬ−ＩＩ核酸を包含し、ここにおいて、ｘはヌクレオチド１から１０５であり、そしてｙはヌクレオチド１３４５から１３７５である。こうした核酸は、配列番号３のヌクレオチド１０５から１３４５、または１から１３７１を含んでなることが可能である。さらに、いずれかの上記ＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしているＢＴＬ−ＩＩ核酸であるような、免疫原性断片をコードしている核酸が提供される。
【００１７】
本発明はさらに、いずれかの上記ＢＴＬ−ＩＩ核酸または抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体をコードしている核酸を含んでなるベクター、そしてこうしたベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。あるいは、本発明は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、ＢＴＬ−ＩＩの免疫原性断片、若しくはＢＴＬ−ＩＩに対する抗体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を提供する。こうした宿主細胞は、ＣＨＯ細胞を含む哺乳動物細胞であってよい。こうした宿主細胞を、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、免疫原性断片、若しくはＢＴＬ−ＩＩに対する抗体の発現を可能にする条件下で培養することを含んでなる、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、免疫原性断片、若しくはＢＴＬ−ＩＩに対する抗体を産生するための方法もまた本発明に包含される。この方法はさらに、宿主細胞または培地から、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、免疫原性断片、若しくは抗体を単離することを含んでなることができる。こうした方法により産生されたＢＴＬ−ＩＩタンパク質、免疫原性断片、若しくは抗体もまた意図される。本発明はさらに、ハイブリドーマまたは骨髄腫細胞を含む、ＢＴＬ−ＩＩに対する抗体を産生する哺乳動物細胞、およびこれらの細胞を培養することによる、抗体を作製するための方法を包含する。
【００１８】
本発明により包含される組成物を用いる、多様な治療法もまた意図される。本発明は、治療的に有効量のＢＴＬ−ＩＩタンパク質、所望により可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を投与することを含んでなる、炎症性腸疾患、所望によりクローン病かまたは潰瘍性大腸炎を患っている患者の腸管における炎症を軽減するための方法を提供する。治療的に有効量のＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストおよび抗原を投与することを含んでなる、全身性および／または粘膜免疫応答を含む、抗原に対する免疫応答を誘導するための方法もまた提供される。ＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストは、抗体または小分子であることが可能であり、そして抗原は、粘膜表面に直接投与することが可能であり、若しくは全身的に投与することが可能である。さらに提供されるのは、ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡまたはタンパク質が過剰発現されているかどうかを決定するため、患者の腸管からの組織試料をアッセイすることを含んでなる、炎症性腸疾患を診断するまたは炎症性腸疾患の発症を予測するための方法である。組織は、抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体を使用して、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質発現をアッセイすることが可能である。本発明はさらに、抗原および可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を同時投与することを含んでなる、抗原、特に自己免疫または炎症性疾患を患っている患者における自己抗原に対する免疫応答の勢いを弱めるための方法も提供する。抗原は、粘膜表面を経て投与することが可能である。
【００１９】
さらなる態様において、本発明はＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を阻害するための方法を包含する。１つの態様において、本発明は、Ｔ細胞とＢＴＬ−ＩＩポリペプチドを接触させることを含んでなる、Ｔ細胞増殖を阻害する阻害するために方法を含んでなる。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であることが可能であり、そしてインビボでＢＴＬ−ＩＩポリペプチドと接触させることが可能である。ＢＴＬ−ＩＩポリペプチドの代替物として、Ｔ細胞上に発現されたＢＴＬ−ＩＩレセプターへ結合するアゴニスト性抗体（それがＴ細胞の増殖を阻害することが可能であれば）を使用することが可能である。別の態様において、本発明は、Ｔ細胞とＢＴＬ−ＩＩポリペプチドを接触させることを含んでなる、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を抑制するための方法を含んでいる。Ｔ細胞はヒトＴ細胞であることが可能であり、そしてインビボでＢＴＬ−ＩＩポリペプチドと接触させることが可能である。サイトカインは、例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン２（ＩＬ２）またはインターロイキン５（ＩＬ５）であることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、寄託番号ＮＭ＿０１９６０２でのアメリカ国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）エントリーからの、ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２は、寄託番号ＮＭ＿０１９６０２でのＮＣＢＩエントリーのｃＤＮＡ配列から予測された、ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３は、本発明の完全長ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号４は、配列番号３によりコードされた完全長ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号５は、本発明の完全長マウスＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号６は、配列番号５によりコードされた完全長マウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ヒトＢＴＬ−ＩＩスプライス変異体の第一のカテゴリーの代表的メンバーからの、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である（図３ａ）。
【００２４】
配列番号８は、配列番号７によりコードされたアミノ酸配列である。
配列番号９は、ヒトＢＴＬ−ＩＩスプライス変異体の第二のカテゴリーの代表的メンバーからの、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列である（図４ａ）。
【００２５】
配列番号１０は、配列番号９によりコードされたアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ヒトＢＴＬ−ＩＩスプライス変異体の第三のカテゴリーの代表的メンバーからの、ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列である（図５ａ）。
【００２６】
配列番号１２は、配列番号１１によりコードされたアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ヒトＢＴＬ−ＩＩスプライス変異体の第四のカテゴリーの代表的メンバーからの、ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列である（図６ａ）。
【００２７】
配列番号１４は、配列番号１３によりコードされたアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ヒトＢＴＬ−ＩＩスプライス変異体の第五のカテゴリーの代表的メンバーからの、ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド配列である（図７ａ）。
【００２８】
配列番号１６は、配列番号１５によりコードされたアミノ酸配列である。
配列番号１７は、マウスＢＴＬ−ＩＩスプライス変異体の第一のカテゴリーの代表的メンバーのヌクレオチド配列である（図９ａ）。
【００２９】
配列番号１８は、配列番号１７によりコードされたアミノ酸配列である。
配列番号１９は、実施例５に記載したＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号２０は、実施例５に記載したＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストであることが可能である、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体をコードしている組換えベクターを含む、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質および核酸、ならびに、これらの分子を産生するそして使用するための方法、およびこれらを含んでいる医薬組成物を提供する。ＢＴＬ−ＩＩ発現は少数の組織型に限定されている。実施例４に例示されているように、ＢＴＬ−ＩＩは、マウス炎症性腸疾患モデルシステムにおいて、症状の発症に先立って、および症状段階の間に、腸管中で過剰発現される。それ故、ＢＴＬ−ＩＩ抗体は炎症性腸疾患を診断するため、若しくは発症の可能性を予測するために働くことが可能である。加えて、本発明はＢＴＬ−ＩＩヌクレオチド配列の多数のアリル（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体を提供する（図５ａから７ａ）。これらは、炎症性腸疾患に対する感受性の予測における効用を見出すことが可能である。さらに、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質はＴ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害することが可能であるので（実施例６−１０）、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は自己免疫および炎症性疾患の処置に効用を見出すことが可能である。
【００３２】
さらに、ＢＴＬ−ＩＩは、腸管における免疫試料採取に役割を演じていることが知られている特殊化した構造であるパイエル板で発現される。ＢＴＬ−ＩＩが好ましく発現されるのは、パイエル板に観察される他の細胞と比較して、他の樹状細胞を含んでも、パイエル板に観察されるＣＤ１１ｃ^＋（低発現）ＣＤ８^＋Ｂ２２０^＋樹状細胞（形質細胞様樹状細胞とも称される）である。パイエル板樹状細胞は、Ｔ細胞分化に対するその影響力のため、粘膜表面での免疫寛容の誘導において役割を演じているとの仮説が立てられている。Ｗｅｉｎｅｒ（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（８）：６７１−７１；Ｗｅｉｎｅｒ（２００１），Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：２０７−１４；ＩｗａｓａｋｉおよびＫｅ１ｓａｌｌ（１９９９），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２７６（５）：Ｇ１０７４−７８。それ故、抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、パイエル板内のＣＤ１１ｃ^＋（低発現）ＣＤ８^＋Ｂ２２０^＋樹状細胞を同定するために使用することが可能である。
【００３３】
以下に説明するように、ＢＴＬ−ＩＩは、ＴおよびＢ細胞仲介応答の調節に役割を演じるブチロフィリン様タンパク質のＢ７サブファミリー内に存在する。ＢＴＬ−ＩＩは、特に腸管において、免疫システム仲介炎症の勢いを弱めるか、および／または促進することに役割を演じることができる。免疫システムの複雑さを仮定すれば、単一の細胞表面タンパク質は、ある場合には、エフェクター細胞上のいかなるレセプターが相互作用する分子に利用可能であるかに依存して、免疫エフェクター細胞による免疫応答を刺激する若しくは勢いを弱めるの両方を行うことができる。以下に議論されるＢ７−１およびＢ７−２タンパク質は、免疫エフェクター細胞、この場合Ｔ細胞に刺激性および勢いを弱める両方の効果を有する免疫調節細胞表面タンパク質の例である。この故に、ＢＴＬ−ＩＩはインビボで同様の二重の役割を果たすことができる。しかしながら、腸管は、食品抗原および共生微生物に対するその免疫寛容により証明されるように、全体的にみて外来抗原に対して高度に免疫寛容である。それ故、ＢＴＬ−ＩＩは、少なくともいくつかの状況において、インビボで免疫応答または炎症を弱めることに役割を演じることがありそうである。それ故、インビトロで選択されたＢＴＬ−ＩＩアンタゴニスト（抗体を含むことが可能）結合タンパク質若しくは小分子は、抗原に対する粘膜免疫応答を刺激するように働くことができる。さらに、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、または機能的に均等な抗イディオタイプ抗体は、腸管における、または肺のごとき体内の他の粘膜表面における免疫応答を弱めることができる。
【００３４】
本明細書において、“抗体”は、キメラ抗体であることが可能であり、単量体または一本鎖の、二量体の、三量体の、四量体のまたは多量体の抗体であることが可能であり、そして組換えタンパク質または非組換えタンパク質であることが可能である。“ドメイン”とは、一次配列モチーフおよび／または三次構造特性により区別することが可能な、タンパク質の一部または全てである。タンパク質ドメインを位置づけるために設計されたプログラムには、例えば、Ｐｆａｍ（Ｂａｔｅｍａｎら（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６０−６２；Ｂａｔｅｍａｎら（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２６３−６６）、ＰｒｏＤｏｍ（Ｃｏｒｐｅｔら（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２６３−６７；Ｃｏｒｐｅｔら（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２６７−６９）、Ｄｏｍｏ（ＧｒａｃｙおよびＡｒｇｏｓ（１９９８），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４：１６４−８７）およびＳＭＡＲＴ（Ｐｏｎｔｉｎｇら（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２２９−３２）が含まれる。三次構造は、例えば、Ｘ−線結晶学により経験的に決定することが可能であり、若しくはこうした使用のために設計されたコンピューターソフトウェアーを使用して予測することが可能である。例えば、構造データは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ＤａｔａｂａｓｅからのＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚウェブサイトを通して（Ｗａｎｇら（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１）：２４３−４５）、またはＤＡＬＩ（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３３：１２３−３８）のごときソフトウェアーの使用により、アクセスすることが可能である。例えば、免疫グロブリン様ドメイン（Ｉｇ様）は、一次配列相同性よりもむしろ、その三次構造により主として区別される。例えば、Ｂｏｒｋら（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−２０；ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ（１９８９），Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１−６３；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５、を参照されたい。しかしながら、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインは、それらの一次アミノ酸配列内の保存位置に出現するほんの少しの高度に保存されたアミノ酸を実際に含んでいる。例えば、Ｋａｂａｔら（１９９１）、免疫学的に興味が持たれるタンパク質の配列、米国保健福祉省、公衆衛生サービス、国立保健研究所、ＮＩＨ出版番号９１−３２４２、を参照されたい。適切な間隔で出現しているこうした高度に保存されたアミノ酸の存在は、ＩｇＣ様またはＩｇＶ様ドメインの存在を示すことが可能である。
【００３５】
タンパク質を“コードする”核酸とは、本明細書において、核酸またはその相補体がタンパク質をコードしているコドンを含んでなる場合を意味している。
タンパク質の発現を可能にする組換え核酸配列が、ウイルス感染、トランスフェクション、形質転換または電気穿孔法のごとき“遺伝子操作”の方法を使用して、細胞内へ導入された場合、細胞は特異的タンパク質を発現するように“遺伝子操作され”ている。例えば、Ｋａｕｆｍａｎら（１９９０），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１、を参照されたい。このことは、例えば、細胞内へのタンパク質をコードしている核酸の導入、またはＣｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号に記載されているような、タンパク質をコードしている宿主遺伝子の発現を促進するための、調節配列の導入を含むことが可能である。“遺伝子操作”の方法は、限定するわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応を使用する核酸の増幅、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へそれらをクローン化することによる組換えＤＮＡ分子の組み立て、核酸の制限酵素消化、核酸のライゲーション、核酸のインビトロ合成、そして核酸の末端への塩基の移送、なかでも当該技術分野でよく知られている多数の方法、を含む多数の方法を包含している。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，１−３巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９、を参照されたい。
【００３６】
“異種ポリペプチド”とは、本明細書で意味しているようなＢＴＬ−ＩＩポリペプチドではなく、少なくとも３アミノ酸長である、任意のポリペプチドである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列同一性を決定するための比較に関連して、“同一性領域”により意味されることは、以下に述べたパラメーターを使用するコンピュータープログラムＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−９５）により、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと一致した（部分的にまたは正確に）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの一部である。例えば、２０アミノ酸のポリペプチドが相当により長いタンパク質と並列された場合、最初の１０アミノ酸がより長いタンパク質と正確に一致し、そして最後の１０アミノ酸はより長いタンパク質と少しも一致しないとすれば、同一性領域は１０アミノ酸である。一方、もし２０アミノ酸ポリペプチドの最初および最後のアミノ酸がより長いタンパク質と一致し、そして八つの他の一致が間に散在すると、同一性領域は２０アミノ酸である。しかしながら、少なくとも、例えば、２０アミノ酸または６０ヌクレオチドの同一のまたは保存的に置換されたアミノ酸または同一のヌクレオチドを有しない、並列された両鎖における長い伸展は、本明細書で意味するような同一性領域の終点を構成する。
【００３７】
“Ｉｇ様”ドメインは免疫グロブリン様ドメインであり、そしてＩｇＶ様かまたはＩｇＣ様ドメインであってもよいし、または免疫グロブリン構造内へ折り畳むことが可能であるが、しかしＩｇＶ様かまたはＩｇＣ様としては明白に分類できないドメインであってもよい。
【００３８】
“ＩｇＶ様”ドメインは、免疫グロブリン可変領域ドメインに共通の特性で免疫グロブリン内へ折り畳むことが可能である、アミノ酸配列を有している。Ｂｏｒｋら，上記文献；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３７７−８１；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５、を参照されたい。当業者は、保存された位置でのＩｇＶドメイン中の高度に保存されたアミノ酸の存在から、ドメインをＩｇＶ様として同定することが可能であることを承知している。
【００３９】
“ＩｇＣ様”ドメインは、免疫グロブリン定常領域ドメインに共通の特性で免疫グロブリン内へ折り畳むことが可能である、アミノ酸配列を有している。Ｂｏｒｋら，上記文献；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ，上記文献、を参照されたい。当業者は、保存された位置でのＩｇＣドメイン中の高度に保存されたアミノ酸の存在から、ドメインをＩｇＣ様として同定することが可能であることを承知している。
【００４０】
“炎症性腸疾患”は、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎、および胃腸管の慢性炎症により特徴付けられる他の疾患を含んでいる。
タンパク質は、二つのＩｇ様ドメインを含み、そして別のＩｇ様ドメインの、全てのまたはいくつかの認識可能な部分を含んでいない場合、“わずか２のまたはそれより少ないＩｇ様ドメイン”を含んでなる。しかしながら、こうしたタンパク質は、Ｉｇ様ドメインではない他のアミノ酸配列、および“わずか２のまたはそれより少ないＩｇ様ドメイン”をなお含むことが可能である。それ故、句“ほどのまたはそれより少ない”とは、Ｉｇ様ドメインのみを示し、タンパク質の一部であることができる他のアミノ酸配列を示してはいない。
【００４１】
ポリペプチドが“Ｔ細胞の増殖を阻害する”ことが可能である、またはいくつかの他の生物学的機能を実行することが可能であると言われる場合、それはポリペプチドを含んでなるタンパク質が機能を実行できること、そして、生物学的機能を実行できない、少なくともいくつかのタンパク質へのポリペプチドの添加により、これらのタンパク質が機能を実行するのを可能にすることを意味している。いくつかの場合、生物学的機能を実行することが可能なポリペプチドは、追加の配列なしでそうすることが可能である。他の場合、生物学的機能を実行するには、他の配列（例えば、オリゴマー化配列）を必要とすることができる。一つのシナリオにおいて、一つのポリペプチドがＦｃ領域またはロイシンジッパーまたはいくつかの二量体化ドメインに連結された場合、それは特定の生物学的機能を効率的に実行することが可能であるが、二量体化ドメインなしでは実行できない。本明細書中の意味として、そのようなポリペプチドは生物学的機能を実行することが可能である。
【００４２】
“タンパク質”とは、少なくとも１０アミノ酸、所望により少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０および／または３００アミノ酸を含んでなる任意のポリペプチドである。
【００４３】
ポリペプチドまたはタンパク質に適用されるような“組換え”とは、タンパク質の産生が、核酸（タンパク質をコードしていてもしていなくてもよい）を、それらが天然には観察されない細胞内へ導入する、少なくとも一つの工程に依存していることを意味している。
【００４４】
“組換え融合タンパク質”とは、天然には一緒に融合されることが観察されない、単一のポリペプチド鎖内へ融合された、少なくとも二つのタンパク質の一部または全てを含んでなる組換えタンパク質である。
【００４５】
核酸配列における“サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異”とは、核酸によりコードされたタンパク質の配列を変化させることなく、核酸の配列を変化させることである。
“可溶性”タンパク質とは、膜貫通ドメイン、または通常はタンパク質が膜へ埋め込まれるまたは膜に会合されることを引き起こす、ＧＰＩアンカー配列のごときいくつかの他のアミノ酸配列を欠いているタンパク質である。こうしたタンパク質は典型的には、膜貫通タンパク質の細胞外領域の全てまたは一部を含んでなることができる。
【００４６】
本発明の目的のためには、二つのタンパク質または核酸は、もしそれらがアミノ酸または核酸配列において、少なくとも８０％、所望により少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．７％お互いに同一であり、そして非改変タンパク質の生物学的機能を維持しまたは望ましい様式に改変していれば、“実質的に類似”している。二つのアミノ酸または二つの核酸配列のパーセント同一性は、視覚的な点検および数学的計算により決定することが可能であり、またはより好ましくは、コンピュータープログラムを使用して配列情報を比較することにより比較を行う。コンピュータープログラムの例はＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム，ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−９５）である。ＧＡＰプログラムのための好ましいデフォルトパラメーターには以下のものが含まれる：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、および「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」，ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）に記載されているような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５）の加重アミノ酸比較マトリックス、または他の比較可能な比較マトリックスでのＧＣＧ実行；（２）各ギャップに対する８のペナルティおよびアミノ酸配列に対する各ギャップ中の各記号に対しさらに２のペナルティ、または各ギャップに対する５０のペナルティおよびヌクレオチド配列に対する各ギャップ中の各記号に対しさらに３のペナルティ；（３）末端ギャップに対するペナルティなし、および（４）長いギャップに対し最大ペナルティなし。配列比較の分野で当業者により使用される他のプログラムもまた使用可能である。
【００４７】
ブチロフィリン様タンパク質
現在まで報告されているブチロフィリン様タンパク質は、いくつかの構造特性を共有しており、そして多くは主要組織適合性座位（ＭＨＣ）内にまたは隣接してコードされている。例えば、Ｈｅｎｒｙら（１９９９），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２０（６）：２８５−８８、を参照されたい。ブチロフィリンは、ウシミルクの脂肪小球に会合されている全タンパク質の４０％を構成するタンパク質であり、そしてヒト相同体が存在する。Ｒｕｄｄｙら（１９９７），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７：４４１−５６，ＪａｃｋおよびＭａｔｈｅｒ（１９９０），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４４８１−８６を引用している。ブチロフィリン様タンパク質間のアミノ酸配列レベルでの類似性は低くてもよいが、しかしドメイン構造は幾分保存されている。全てのメンバーは、通常ＩｇＶ様ドメインであると報告されている、Ｉｇ様ドメインが続いたアミノ末端シグナルペプチドを含んでなる。多くの場合において、通常ＩｇＣ様ドメインであると報告されている、別のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、そして細胞質ドメインが続いている。ＢＴＬ−ＩＩまたはＢ７−Ｈ３におけるように、二つのＩｇ様ドメインはそれらの最初の出現に続いて直ちに反復されることが可能である。このドメイン構造は図１に例示されている。図１に図示されたタンパク質のほとんどは、ブチロフィリン様タンパク質のＢ７サブファミリーのメンバーである；三つ（ヒトＢＴＮ２Ａ１、ヒトブチロフィリンおよびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質）のみがそうではない。
【００４８】
Ｉｇ様ドメインは、その配列は非常に多岐にわたることが可能であるが、四つのβ鎖を含んでなる共通構造コアを全てが含む、多数の保存された折り畳みパターンの一つをそれでも保持している。免疫グロブリン定常および可変領域は、バレル（ｂａｒｒｅｌ）様形状を形成している、７から９の逆平行βストランドにより特徴付けられる三次構造を有している。Ｂｏｒｋら（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−２０。ＩｇＶおよびＩｇＣ様免疫グロブリンドメインは各々、特有で、高度な保存残基をほんの少し含んでいる。ＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ（１９８９），Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１−６３；Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４３７７−８１；ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ（１９８８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５。保存残基は多分構造または機能のために重要である。こうした保存残基は、ＢＴＬ−ＩＩのＩｇ様ドメイン中に観察される。例えば、ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質の第一のＩｇ様ドメイン（配列番号４）は、ＩｇＶ様ドメインに特徴的な、こうした高度に保存された残基を、適切な位置、例えば、Ｇ４３、Ｃ５０、Ｗ６５、Ｌ１０９、Ｄ１１８、Ｇ１２０、Ｙ１２２およびＣ１２４位に含んでいる。表３を参照されたい。第三のＩｇ様ドメインもまた、ＩｇＶ様ドメインで保存されている残基に対応する残基を含んでいる。ヒトＢＴＬ−ＩＩの第二および第四のＩｇ様ドメインは、ＩｇＣ様ドメインで高度に保存されている残基に対応する残基を含んでいる。表３。
【００４９】
膜貫通および細胞質ドメインは、ブチロフィリン様タンパク質が第二のＩｇ様ドメインを有しているかどうかに関わらず、ブチロフィリン様タンパク質中に出現する。膜貫通ドメインには、αへリックスコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ）モチーフに典型的な７アミノ酸繰り返しを思い出させる、一つまたはそれより多くの７アミノ酸単位が続いていてもよいし、続いていなくてもよい。７アミノ酸繰り返しはまた、ブチロフィリン様タンパク質中の別の位置に出現することもできる。７アミノ酸繰り返しの議論については、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：４３７７−８１、を参照されたい。膜貫通ドメインを予測する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｉｋｅｄａら（２００２），Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ Ｂｉｏｌ．２（１）：１９−３３；ＴｕｓｎａｄｙおよびＳｉｍｏｎ（１９９８），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８３（２）：４８９−５０６、を参照されたい。ブチロフィリン様タンパク質は細胞質ドメインを有することが可能である。こうした細胞質ドメインは、Ｂ３０．２ドメインを含んでいても、または含んでいなくてもよい。多様なＢ３０．２ドメインの配列が示されており、そしてＢ３０．２ドメインの推定機能がＨｅｎｒｙら（（１９９８），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１５（１２）：１６９６−１７０５）により議論されている。Ｂ３０．２ドメインはいろいろなタンパク質に観察され、そしてＢ３０．２ドメインの機能は未知である。提案されたＢ３０．２ドメインのリガンドはキサンチンオキシダーゼであり、それはブチロフィリンの細胞質ドメインと相互作用する。二つの異なったＢ３０．２含有タンパク質のＢ３０．２ドメインにおける突然変異は、二つの異なった疾患と関連付けられたが、突然変異および疾患表現型間の因果関係は確立されていない。Ｈｅｎｒｙら、上記文献。
【００５０】
ブチロフィリン様タンパク質のＢ７サブファミリー
ＢＴＬ−ＩＩは、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞のごとき、免疫エフェクター細胞の調節に役割を演じる、Ｂ３０．２ドメインを欠く多数のブチロフィリン様免疫調節タンパク質とドメイン構造を共有している。このサブファミリーは、ブチロフィリン様タンパク質の“Ｂ７サブファミリー”として本明細書において称される。本明細書で意味しているように、Ｂ７サブファミリーメンバーの特性には、限定ではなく、以下の項目が含まれる：（１）一つまたはそれより多くの細胞外Ｉｇ様ドメインを有し；（２）膜貫通および細胞質ドメインを有し；（３）Ｂ３０．２ドメインを欠き；（４）抗原提示細胞上で発現されており；（５）活性化された免疫応答の間に発現の調節を起こし；そして（６）免疫応答を変調する。免疫応答を変調する、膜貫通ドメインを欠く、分泌、可溶性Ｂ７タンパク質は現在まで報告されていない。ほとんどのＢ７タンパク質は二つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有しているが、Ｂ７−Ｈ３のいくつかのアイソフォームは四つ有している。図１を参照されたい。ヒトＢＴＬ−ＩＩは、２から４の細胞外Ｉｇ様ドメインを有することが可能で、そして上にリストした、Ｂ７ファミリーメンバーの特性の全てを有している。それ故、我々はそれがブチロフィリン様タンパク質のＢ７サブファミリーのメンバーであると考えた。Ｂ７サブファミリーの全ての他の既知メンバーは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞のごとき免疫エフェクター細胞上のレセプターと相互作用し、その相互作用は免疫応答を変調するためのシグナルとして働く。それ故、ＢＴＬ−ＩＩは、Ｔ細胞のごとき免疫エフェクター細胞上のレセプターと相互作用し、それ故免疫応答を変調すると予想される。
【００５１】
Ｂ７ファミリーメンバーは免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞の活性を変調することに役割を演じている。Ｈｅｎｒｙら（１９９９），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２０（６）：２８５−８８；ＳｈａｒｐｅおよびＦｒｅｅｍａｎ（２００２），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１６−２６。最もよく特徴付けられた例は、ＣＤ８０およびＣＤ８６（各々Ｂ７−１およびＢ７−２とも称される）であり、それらは抗原提示細胞上で発現され、Ｔ細胞の表面上に構成的に発現されるＣＤ２８と相互作用した場合、Ｔ細胞活性化を促進可能であり、またはＴ細胞の表面上にまた発現されるＣＴＬＡ−４と相互作用した場合、Ｔ細胞活性化を阻害可能である。ＣＴＬＡ−４発現は構成的ではないが、しかしＴ細胞活性化に続いて迅速に上方調節される。例えば、Ｍａｓｔｅｌｌｅｒら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５３１９−２７；Ｈｅｈｎｅｒら（２０００），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２４）：１８１６０−７１；ＳｈａｒｐｅおよびＦｒｅｅｍａｎ（２００２），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１６−２６、を参照されたい。さらに、ＣＤ８０の両方のＩｇ様ドメイン中の、多数の個々のアミノ酸残基がＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８への結合に重要であることが報告されている。Ｐｅａｃｈら（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３６）：２１１８１−８７。ＣＤ８６は構成的に低レベルで発現され、そして活性化後に迅速に上方調節され、一方、ＣＤ８０は、活性化後に誘導的に発現される。ＳｈａｒｐｅおよびＦｒｅｅｍａｎ（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：１１６−２６。
【００５２】
本明細書においてＢ７ＲＰ−１と称される、別のＴ細胞調節分子は多血症（ｐｌｅｔｈｏｒａ）の名前を有している、ＫＩＡＡ０６５３（Ｉｓｈｉｋａｗａら（１９９８），ＤＮＡ Ｒｅｓ．５：１６９−７６）、Ｂ７ｈ（Ｓｗａｌｌｏｗら（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：４２３−３２）、ＧＬ５０（Ｌｉｎｇら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１６５３−５７）、Ｂ７ＲＰ−１（Ｙｏｓｈｉｎａｇａら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ ４０２：８２７−３２）、ＬＩＣＯＳ（Ｂｒｏｄｉｅら（２０００），Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：３３３−３６）、Ｂ７−Ｈ２（Ｗａｎｇら（２０００），Ｂｌｏｏｄ ９６：２８０８−１３）およびＩＣＯＳＬ（ＳｈａｒｐｅおよびＦｒｅｅｍａｎ，上記文献）。Ｂ７ＲＰ−１は末梢リンパ組織、脾臓、リンパ節、肺、胸腺、脾細胞およびＢ細胞中で発現される。Ｂ７ＲＰ−１とＴ細胞の相互作用は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を増加させることが可能である。Ｂ７ＲＰ−１は、活性化Ｔ細胞上に発現されるＩＣＯＳレセプターを通してＴ細胞にシグナルを伝達する。Ｙｏｓｈｉｎａｇａら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ ４０２：８２７−３２；Ｓｗａｌｌｏｗら（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：４２３−３２。Ｂ７ＲＰ−１は非刺激Ｂ細胞株で構成的に発現され、そしてその発現は、インターフェロンγにより単球中で誘導することが可能である。Ａｉｃｈｅｒら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４６８９−９６。調節Ｔ細胞の発生および調節機能は、Ｂ７ＲＰ−１およびＴ細胞上のそのレセプター間の相互作用に依存している。Ａｋｂａｒｉら（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８（９）：１０２４−３２。
【００５３】
さらに、三つの他のＴ細胞調節分子、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１とも称される）、ＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとも称される）およびＢ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１およびＢ７ｘとも称される）は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を阻害することが可能である。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞上に発現される、それらの共通のレセプター、ＰＤ−１を通して作用する。Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（７）：１０２７−３４；Ｄｏｎｇら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５（１２）：１３６５−６９；Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（３）：２６１−６８；Ｔａｍｕｒａら（２００１），Ｂｌｏｏｄ ９７（６）：１８０９−１６；およびＴｓｅｎｇら（２００１），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３（７）：８３９−４５。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現は、一般的な前炎症性サイトカインである、インターフェロンγにより誘導することが可能である。Ｌａｔｃｈｍａｎら，上記文献。Ｂ７−Ｈ４はＢ細胞、マクロファージおよび樹状細胞上で発現され、ＢおよびＴ細胞上に発現される阻害的レセプターである、ＢＴＬＡを通して作用するようである。Ｗａｔａｎａｂｅら（２００３），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４（７）：６７０−７９；Ｚａｎｇら（２００３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００（１８）：１０３８８−９２；Ｓｉｃａら（２００３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８：８４９−６１；Ｐｒａｓａｄら（２００３），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １８：８６３−７３；ＣａｒｒｅｎｏおよびＣｏｌｌｉｎｓ（２００３），Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１０）：５２４−２７。
【００５４】
Ｔ細胞を刺激することにおいて、同時刺激性役割を果たすさらに別のブチロフィリン様タンパク質はＢ７−Ｈ３である。Ｃｈａｐｏｖａｌら（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（３）：２６９−７４。他のＢ７ファミリーメンバーと同様に、Ｂ７−Ｈ３はシグナル配列、細胞外Ｉｇ様ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有している。ヒトＢ７−Ｈ３遺伝子は、二つまたは四つの細胞外Ｉｇ様ドメインを有するアイソフォームをコードしている。Ｓｕｎら（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：６２９４−９７。Ｂ７−Ｈ３の発現は、炎症性サイトカインにより、樹状細胞上で誘導することが可能である。Ｂ７−Ｈ３は、Ｔ細胞の増殖および細胞毒性応答を刺激することが可能である。Ｂ７−Ｈ３は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１とは異なる推定上のＴ細胞レセプターを通して作用する。Ｃｈａｐｏｖａｌら、上記文献。
【００５５】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質
ヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質の存在は、ゲノム配列から予想されていた。Ｓｔａｍｍｅｒｓら（２０００），Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５１：３７３−８２。しかしながら、これらの著者は、ゲノム分析に基づいた、ヒトまたはマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質中の膜貫通または細胞質ドメインの証拠、そしてマウスＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡを検出するために設計されたＰＣＲ実験において、エキソン１−４（各々、シグナルペプチド、二つのＩｇ様ドメインおよび７アミノ酸繰り返し領域をコードする）とエキソン５および６（各々、別の二つのＩｇ様ドメインをコードする）を連結している転写体の証拠を見出していない。Ｓｔａｍｍｅｒｓら、上記文献。これらの知見に基づき、ＢＴＬ−ＩＩは、細胞表面、免疫変調タンパク質のＢ７サブファミリーには加えられなかった。これら同一の著者による、公共データベースへのその後の配列提出は、４５５アミノ酸をコードしているエキソン５および６を含んでおり、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠いている、１３６８ヌクレオチドのヒトＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡを予測している（配列番号１（ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡ配列）および配列番号２（ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質配列）を開示している、ＮＣＢＩ寄託番号第ＮＭ＿０１９６０２号）。
【００５６】
本発明のＢＴＬ−ＩＩ核酸およびタンパク質配列は、多くの点でこれらの配列と異なっている。ｃＤＮＡ配列は、膜貫通または細胞質ドメインを含んでいない、以前に報告されているＢＴＬ−ＩＩタンパク質配列とは違って、シグナル配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインをコードしている。ＢＴＬ−ＩＩの発現パターンと一緒に加えて、これらの特性のため、ＢＴＬ−ＩＩはブチロフィリン様タンパク質のＢ７サブファミリー内に加えられる。表１（下記）は、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質および以前に報告されている配列間の相違を強調している。本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は上段に示されており（配列番号４）、そしてＮＣＢＩ寄託番号第ＮＭ＿０１９６０２号に報告されているＢＴＬ−ＩＩタンパク質は下段に示されている（配列番号２）。この比較から、二つの配列間には三つのミスマッチがあり（３６０、４５４および４５５位に）、そして配列番号４は、細胞外ドメインの追加の配列ならびに膜貫通および細胞質ドメインを構成する、さらに２７のアミノ酸を有している。これらの配列は、上に列挙したパラメーターを使用するＧＡＰプログラムに従うと、９９．３％同一である。
【００５７】
【表１】

【００５８】
図１に例示したようなドメイン構造における総合的な類似性に加え、Ｂ７サブファミリータンパク質は、一次配列レベルでの類似性を有している。例えば、コンピュータープログラムＧＡＰを使用して、対様式で並列した場合、ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質配列（配列番号４）は、下記表２に示されているように、他のＢ７サブファミリーメンバーに類似している。
【００５９】
【表２】

【００６０】
当業者は、任意のこれらの並列で保存されている残基は、保存されていない残基よりも、ヒトＢＴＬ−ＩＩの構造または機能においておそらく本質的役割を演じることを了解するであろう。
【００６１】
表３（下記）において、ヒトＢＴＬ−ＩＩアミノ酸配列（配列番号４、上段）とマウスＢＴＬ−ＩＩアミノ酸配列（配列番号６、下段）が並列されている。同一アミノ酸は垂直線で結ばれており、類似のアミノ酸は、それらの間に一つのまたは二つのドットを有している。ＧＡＰ（上記）により決定された、これらの配列間のパーセント同一性は約６２％であり、そしてパーセント類似性は約６８％である。ＩｇＶまたはＩｇＣ様ドメイン、またはいわゆるＩｇＶ免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの“Ｉセット”中に観察される残基、またはこうした残基の保存的置換はボールド体で示されている。Ｐｅａｃｈら、上記文献；ＨａｒｐａｚおよびＣｈｏｔｈｉａ（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：５２８−３９。こうした残基は構造的に重要であるようであり、それ故、機能的効果を有することができる。適正な間隔をあけたこうしたアミノ酸のかなりの数の出現で、配列をＩｇＶ様またはＩｇＣ様として同定可能である。
【００６２】
【表３】

【００６３】
構造は配列よりも進化においてより保存されているので、非保存残基は保存残基よりも、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の全体の三次構造を決定することにおいて役割を演じそうもないことを当業者は理解するであろう。Ｂｏｒｋら（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２：３０９−２０。本明細書において、“非保存残基”とは、表３におけるように、ヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質配列が比較された場合に保存されていない、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質内のアミノ酸である。スプライス変異体によりコードされているＢＴＬ−ＩＩタンパク質において、こうした残基は、配列内の異なった番号位置で出現するであろう。例えば、配列番号４の３９７位の非保存残基は、配列番号８の１８７位でみられる同一の非保存残基である。当業者は、タンパク質構造がタンパク質機能に影響可能であることを認識するであろう。さらに、非保存アミノ酸は、ＢＴＬ−ＩＩ機能において直接的な役割を演じることもありそうもない。例えば、残基４、６、２５、２６、３５、３６および多くの他の残基は、同一でもなくまたは類似してもいない。それ故、当業者は、こうした残基の改変がＢＴＬ−ＩＩタンパク質機能に影響することは、保存されたまたは類似の残基の改変よりもありそうもないことを了解するであろう。さらに、保存的置換が、非保存的置換よりもタンパク質機能へ影響することは、よりありそうもないようである。生物学的活性へ影響することがありそうもない保存的置換であるアミノ酸置換の例には以下の置換が含まれる：Ｓｅｒに対するＡｌａ、Ｉｌｅに対するＶａｌ、Ｇｌｕに対するＡｓｐ、Ｓｅｒに対するＴｈｒ、Ｇｌｙに対するＡｌａ、Ｔｈｒに対するＡｌａ、Ａｓｎに対するＳｅｒ、Ｖａｌに対するＡｌａ、Ｇｌｙに対するＳｅｒ、Ｐｈｅに対するＴｙｒ、Ｐｒｏに対するＡｌａ、Ａｒｇに対するＬｙｓ、Ａｓｎに対するＡｓｐ、Ｉｌｅに対するＬｅｕ、Ｖａｌに対するＬｅｕ、Ｇｌｕに対するＡｌａ、Ｇｌｙに対するＡｓｐ、およびこれらの変化の逆。例えば、Ｎｅｕｒａｔｈら，「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）を参照されたい。さらに、グループ内の一つのアミノ酸の、同一のグループ内の別のアミノ酸への交換は保存的置換であり、ここでグループとは以下のようである：（１）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ノルロイシンおよびフェニルアラニン；（２）ヒスチジン、アルギニン、リジン、グルタミンおよびアスパラギン；（３）アスパラギン酸およびグルタミン酸；（４）セリン、スレオニン、アラニン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびシステイン；（５）グリシン、プロリンおよびアラニン。
【００６４】
ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質はいくつかの認識可能ドメインを含んでなる。第一は、配列番号４の残基１から、配列番号４の残基２２から２９付近までからの第二の位置に及ぶシグナル配列（エキソン１によりコードされている）である。次は、残基ｘから残基ｙに及ぶＩｇ様ドメイン（エキソン２によりコードされている）であり、ここでｘは配列番号４の残基２２から３２までからであり、そしてｙは残基１３８から１４８までからである。これに続くのは、残基ｖから残基ｗに及ぶ別のＩｇ様ドメイン（エキソン３によりコードされている）であり、ここでｖは配列番号４の残基１３８から１４８までからであり、そしてｗは残基２３２から２４２までからである。次は、残基ｔから残基ｕに及ぶ７アミノ酸反復領域（エキソン４によりコードされている）であり、ここでｔは配列番号４の残基２３４から２３９までからであり、そしてｕは残基２４０から２４７までからである。別のＩｇ様領域が残基ｒから残基ｓに及んでおり、ここでｒは配列番号４の残基２４０から２４７までからであり、そしてｓは残基３５４から３６４までからである。第四のＩｇ様領域が残基ｐから残基ｑに及んでおり、ここでｐは配列番号４の残基３５５から３６５までからであり、そしてｑは残基４５２から４６２までからである。ヒトＢＴＬ−ＩＩのこれらの第一の６ドメインは、ヒトＢＴＬ−ＩＩの細胞外領域を作り上げている。シグナル配列はタンパク質の分泌時にタンパク質の残り部分から切断されてもよいが、切断が必要とされるわけではない。膜貫通ドメインは残基ｎから残基ｏに及んでおり、ここでｎは配列番号４の残基４５４から４６２までからであり、そしてｏは残基４７３から４８１までからである。最後は、残基ｋから残基ｍに及ぶ細胞質ドメインであり、ここでｋは配列番号４の残基４７４から４８１までからであり、そしてｍは残基４８２付近である。
【００６５】
マウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質は類似の組のドメインを含んでなる。第一は、配列番号６の残基１から始まり、残基２０付近から残基２７付近までからの位置で終わるシグナル配列である。第二は、残基ｘから残基ｙに及ぶＩｇ様ドメインであり、ここでｘは配列番号６の残基２１から２７までからであり、そしてｙは残基１３８から１４８までからである。第三は、残基ｖから残基ｗの別のＩｇ様ドメインであり、ここでｖは配列番号６の残基１３９から１４８までからであり、そしてｗは残基２３２から２４２までからである。７アミノ酸反復領域は残基ｔから残基ｕに及んでおり、ここでｔは配列番号６の残基２３３から２４２までからであり、そしてｕは残基２３８から２４８までからである。別のＩｇ様領域が残基ｒからｓに及んでおり、ここでｒは配列番号６の残基２３９から２４８までからであり、そしてｓは残基３５５から３６５までからである。最後のＩｇ様領域が残基ｐからｑに及んでおり、ここでｐは配列番号６の残基３５６から３６５までからであり、そしてｑは残基４４７から４５７までからである。これらの第一の６ドメインは、マウスＢＴＬ−ＩＩの細胞外領域を作り上げている。膜貫通ドメインは残基ｎからｏに及んでおり、ここでｎは配列番号６の残基４４８から４５９までからであり、そしてｏは残基４７０から４７８までからである。最後は、残基ｋからｍに及ぶ細胞質ドメインであり、ここでは配列番号６の残基４７１から４７８までからであり、そしてｍは残基５１４付近である。
【００６６】
本発明はＢＴＬ−ＩＩの分泌された、可溶性バージョン、ならびに、細胞表面上に発現することが可能である膜貫通ドメインを含んでなるバージョンを包含している。本発明はさらに、以下に記載するようなＢＴＬ−ＩＩ核酸によりコードされたＢＴＬ−ＩＩタンパク質も含んでいる。これらのタンパク質全ての組換え体バージョンは、本明細書で記載するように、抗体を産生するため、スクリーニングに、および／または治療剤として使用することが可能である。例えば、本発明は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８の全て若しくは一部を含んでなるＢＴＬ−ＩＩタンパク質を包含する。本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、一次アミノ酸配列の挿入、欠失、改変または置換により、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８とは異なったタンパク質を含んでいる。こうした変異体配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．７％同一であり、そして上述の配列とＧＡＰを使用して並列させた場合、１０アミノ酸を超える内部ギャップを含んでいない。こうした配列の例には、図５ｂ、６ｂおよび７ｂに示した、ＢＴＬ−ＩＩの天然に存在するヒトアリル（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体が含まれる。もしこうした変異体配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８と比較した場合にアミノ酸置換を含んでいれば、これらの置換は保存的アミノ酸置換であろう。さらに、変異体ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８に関して、単一アミノ酸のわずか３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５の挿入、欠失または置換を含むことができる。
【００６７】
本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、ヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの多様なスプライス変異体によりコードされているタンパク質を含む。こうした変異体ヒトＢＴＬ−ＩＩタンパク質の配列は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６に示されている。変異体マウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質の配列は配列番号１８に示されている。ヒトスプライス変異体は、エキソン３単独かまたはエキソン２および３の両方を欠いており、そして開示されているマウススプライス変異体は、エキソン３のみを欠いている。配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５および配列番号１７；図３ａ、４ａ、５ａ、６ａ、７ａ、および９ａを参照されたい。これらの配列および、１０アミノ酸より長いギャップを含んでいないＧＡＰを使用して、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８から成る群の少なくとも一つを有するタンパク質配列と並列した場合、実質的に類似の配列によりコードされているタンパク質は本発明に包含される。もしこれらのタンパク質が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８と比較した場合にアミノ酸置換を含んでいれば、これらの置換は好ましくは保存的アミノ酸置換である。本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、Ｔ細胞の表面上のレセプターへ結合することが可能であり、そしてＴ細胞の増殖および／またはＴ細胞によるサイトカイン産生を阻害することが可能である。
【００６８】
さらに、本発明はエキソン１および４（配列番号８および配列番号１２）またはエキソン２および４（配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８）のスプライス接合部にまたがる核酸によりコードされているＢＴＬ−ＩＩタンパク質、そしてＴ細胞の表面上に発現されたレセプターへ結合可能で、並びに／あるいは増殖および／またはＴ細胞によるサイトカイン産生を阻害可能な実質的に類似のタンパク質を提供する。これには特に、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．７％または１００％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んでなるＢＴＬ−ＩＩタンパク質が含まれる。配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は、好ましくは少なくとも２０、２３、２５、２７、３０、３５または４０アミノ酸長である。こうしたアミノ酸配列は少なくとも１５０アミノ酸長であることが可能であり、そして配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．７％または１００％同一であることが可能である。配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は、少なくとも５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００または３００アミノ酸であることが可能である。
【００６９】
本発明はまた、わずか２のまたはそれより少ないＩｇ様ドメインを含み、そしてＢ細胞またはＴ細胞上に発現された細胞表面レセプターへ結合可能である、配列番号４のアミノ酸３０から４５７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．７％または１００％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチドを含んでなるＢＴＬ−ＩＩタンパク質も提供する。アミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸３０から２４７または配列番号１２のアミノ酸３０から２４３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．７％または１００％同一であることが可能である。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は配列番号１１のヌクレオチド３４から１２４から成るポリヌクレオチドと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．７％または１００％同一であるポリヌクレオチドを含んでなる核酸によりコードされているタンパク質を提供し、ここにおいて同一性領域は少なくとも６０、７０、８０、９０または１００ヌクレオチド長である。こうしたポリヌクレオチドによりコードされている成熟ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、このポリヌクレオチドにより少なくとも一部がコードされているシグナル配列（タンパク質の未成熟バージョンに存在する）を欠いていてもよいが、それは必須ではない。こうしたタンパク質はＴ細胞へ結合することが可能であり、および／またはＴ細胞の増殖および／またはＴ細胞によるサイトカイン産生を阻害することが可能である。
【００７１】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は異なる程度までグリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。例として、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８を含んでなるタンパク質中にすでに観察されるものに加え、一つまたはそれより多くのＮまたはＯ連結グリコシル化部位を含んでなることができる。こうしたＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、それに結合されたより多いシアル酸部分を有することができるので、非改変タンパク質よりも長いインビボ半減期を有することが可能である。ＢＴＬ−ＩＩタンパク質はまた、ヒトまたはマウスＢＴＬ−ＩＩのＩｇ様ドメインまたは実質的に類似のドメインのどれか一つ、どれか二つ、どれか三つまたは四つ全てを含んでなるタンパク質も含んでいる。
【００７２】
変異体
任意の型の改変（例えば、限定されるわけではないが、アミノ酸の挿入、欠失または置換；ポリペプチドのグリコシル化状態の変化；その三次元構造または自己会合状態を変化させるための再折り畳みまたは異性化；および他のポリペプチドまたは分子とのその会合の変化）により任意のＢＴＬ−ＩＩタンパク質から誘導されたポリペプチドもまた、本明細書において意味するＢＴＬ−ＩＩタンパク質である。本発明により提供されるＢＴＬ−ＩＩタンパク質には、Ｔ細胞の表面に発現したレセプターに結合することが可能であり、および／またはＴ細胞の増殖および／またはＴ細胞によるサイトカイン産生を阻害することが可能である、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８のアミノ酸配列と実質的に類似しているアミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドが含まれる。同一性の領域は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８の３０またはより高い位置から出発することが可能である。配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６および／または配列番号１８の少なくとも一つを有するこうした変異体タンパク質のＧＡＰ並列は、１０アミノ酸より長い内部ギャップを有しないことができる。配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８と実質的に類似しているＢＴＬ−ＩＩタンパク質の部分は、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００または少なくとも２５０アミノ酸長であることが可能である。こうしたタンパク質における修飾は、天然に提供されるか、または故意に操作される。例えば、配列番号１１（図６ａ）は、複数の位置を含んだほんの少しの位置での塩基変化を含んでいる、配列番号９（図４ａ）のアリルまたは多型性変異体である。
【００７３】
本発明は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８の配列に関して、単一アミノ酸の挿入、欠失または置換であることが可能である、単一または多アミノ酸改変を含む、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質変異体を提供し、ここにおいて、ＢＴＬ−ＩＩ変異体タンパク質は、Ｔ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害することが可能である。改変は保存的アミノ酸置換であり得る。例えば、表３に示したヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質の並列により、機能に影響することなくどのアミノ酸を変化させることが可能であるかについて、当業者は導かれる。ヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩにおいて同一または類似しているアミノ酸は、そうではないアミノ酸より機能のために重要であるようである。さらに、ＩｇＶまたはＩｇＣドメインにおいて高度に保存されているアミノ酸（表３においてボールド体で示されている）もまた、機能的に重要であるようである。こうしたアリルまたは多型性変異体は、疾患の素因を決定するための診断剤として有用であることが可能である。配列番号３とは異なった配列を有するヒトアリル変異体は、図５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａおよび７ｂに開示されている。例えば、炎症性腸疾患の症状がない正常の人々間で、配列番号３の配列を有するｃＤＮＡをコードしているＢＴＬ−ＩＩ遺伝子を有している数と、図５ａ、６ａおよび７ａにおいて３−６でラベルされたアリル変異体突然変異をコードしているＢＴＬ−ＩＩ遺伝子を有している数の間には特定の比が存在することが可能である。炎症性腸疾患の症状を有する患者の大部分が、図５ａ、６ａおよび７ａにおいて３−６でラベルされたアリル変異体突然変異を伴ったＢＴＬ−ＩＩ遺伝子を有するように、これらのアリルの出現比率を患者間で改変することができる。患者の組織における多様なアリル変異体の存在は、例えば、多型性部位に広がっているＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントのＰＣＲ増幅により決定することが可能である。上述のように、特にヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質配列間で保存されていない部位での保存的アミノ酸置換は、保存的部位での非保存的置換よりも生物学的機能を保つようである。当業者はまた、例えば、ＤＡＬＩ（ＨｏｌｍおよびＳａｎｄｅｒ（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３３：１２３−３８）のごときプログラムにより予測されるような、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の三次構造を実質的にひっくり返す置換もまた、機能を害しそうであることを理解するであろう。
【００７４】
断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８の断片、またはこれらの配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．７％同一である断片を含んでなるタンパク質は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質に含まれている。好ましくは、こうした断片はＴ細胞の表面上に発現されたレセプターへ結合することが可能であり、そして少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸長である。好ましくは、こうした断片は水性溶液に可溶であり、そしてＢＴＬ−ＩＩタンパク質の細胞外領域一部または全てを含んでなる。こうした断片を含んでなるタンパク質は分泌されることが可能である。例えば、上記ヒトまたはマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質または実質的に類似したタンパク質のドメインの少なくとも一つを含んでなるＢＴＬ−ＩＩタンパク質は本発明に包含され、ここにおいて該ドメインはＢＴＬ−ＩＩタンパク質の少なくとも一つの生物学的特性を有している。例えば、こうしたタンパク質はＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン産生を阻害可能である。
【００７５】
さらに本発明に包含されるのは、ヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質または実質的に類似のタンパク質の、以下の改変バージョンである：（１）エキソン３によりコードされている第二のＩｇ様ドメイン（図１参照）を欠いているヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質のバージョン；（２）エキソン２および３によりコードされている第一および第二のＩｇ様ドメインを欠いているヒトおよびマウスＢＴＬ−ＩＩタンパク質のバージョン；（３）エキソン５および６によりコードされている第三および第四のＩｇ様ドメインを欠いているバージョン；（４）四つのＩｇ様ドメインの任意の二つを欠いているバージョン；および（５）Ｉｇ様ドメインの任意の一つを欠いているバージョン。
【００７６】
また本発明内に包含されるのは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８の免疫原性断片であり、それは断片へ特異的に結合する抗体を惹起することが可能である。こうした断片は好ましくは少なくとも１０アミノ酸長であり、そして好ましくは、上述の配列からの隣接アミノ酸残基を含んでなる。こうした断片で免疫化された動物により産生された抗体は、本出願の別のところで議論されているように、炎症性腸疾患の予測、診断および処置に有用であることが可能である。こうした断片はスプライス接合部によりコードされているこれらのタンパク質の領域に及ぶことが可能であり、スプライス変異体または完全長タンパク質によりコードされているタンパク質に特異的な抗体の発生に利点を有している。あるいは、エキソン３によりコードされているＢＴＬ−ＩＩの一部に対する抗体は、完全長ＢＴＬ−ＩＩタンパク質によってのみ検出され、エキソン３を欠く全ての他のスプライス変異体によりコードされているタンパク質では検出されない。
【００７７】
組換え融合タンパク質
本発明はさらに、上述の少なくとも一つのＢＴＬ−ＩＩポリペプチド（ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の一つである）、変異体または断片、そして少なくとも一つの他の部分を含んでなる融合タンパク質を包含する。他の部分は、異種ポリペプチド、即ち、ＢＴＬ−ＩＩポリペプチド以外のポリペプチドであることが可能である。他の部分はまた、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、または細胞毒性、細胞分裂抑制性、発光および／または放射活性部分のごとき、非タンパク質部分であることが可能である。ＰＥＧの結合は、少なくともいくつかのタンパク質のインビボ半減期を増加させることが知られている。さらに、細胞毒性、細胞分裂抑制性、発光および／または放射活性部分は、例えば、抗体が結合可能な細胞に位置させるための、細胞の増殖を阻害するための、または細胞を殺すための、診断または治療目的のために抗体へ融合されてきた。同様に、こうした部分へ融合されたＢＴＬ−ＩＩポリペプチドは、ＢＴＬ−ＩＩが結合する細胞に位置させるために、細胞の増殖を阻害するために、または細胞を殺すために使用することが可能である。こうした細胞毒性、細胞分裂抑制性、発光および／または放射活性部分は、例えば、マイタンシン誘導体（ＤＭ１のごとき）、エンテロトキシン（ブドウ球菌エンテロトキシンのごとき）、ヨウ素同位元素（ヨード−１２５のごとき）、テクネチウム同位元素（Ｔｃ−９９ｍのごとき）、シアニン蛍光色素（Ｃｙ５．５．１８のごとき）、リボソーム不活性化タンパク質（ブーガニン、ゲロニンまたはサポリン−Ｓ６のごとき）、および商標ＭＹＬＯＴＡＲＧ^ＴＭ（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）の名で売買されている製品の一部である、細胞毒性物質のカリケアミシン、である。
【００７８】
多様な異種ポリペプチドを、例えば、タンパク質のインビボ半減期を増加させるため、タンパク質の同定、単離および／または精製を容易にするため、タンパク質の活性を増加させるため、そしてタンパク質のオリゴマー化を促進するためのごとき、多様な目的のためにＢＴＬ−ＩＩポリペプチドへ融合することが可能である。例えば、ＣＤ８０のごときＢ７サブファミリーのいくつかのタンパク質は、主としてオリゴマー形でそれらのレセプターへ結合するので（ＣＤ８０の場合は二量体、Ｃｏｌｌｉｎｓら（２００２），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：２０１−１０、を参照されたい）、オリゴマー化は可溶性タンパク質の生物学的活性を保存するためには非常に重要であろう。
【００７９】
多くの異種ポリペプチドは、それらがその一部である組換え融合タンパク質の同定および／または精製を容易にすることを可能にする。例には、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、または、固定化された金属イオンに対して高い親和性を所有する非隣接ヒスチジンの天然に存在する配列であるＨＡＴ^ＴＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。これらの異種ポリペプチドを含んでなるタンパク質は、例えば、固定化されたニッケル、または固定化されたコバルトイオンを含んでなるＴＡＬＯＮ^ＴＭ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが可能である。例えば、Ｋｎｏｌら（１９９６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７（２６）：１５３５８−１５３６６、を参照されたい。ポリアルギニンを含んでなる異種ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーによる効率的な精製を可能にする。他の有用な異種ポリペプチドには、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら（１９８８），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、に記載されている抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの一つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、それは高度に抗原性であり、そして特異的モノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された組換え融合タンパク質の、迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にしている。４Ｅ１１と称されるマウスハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、特定の二価金属カチオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを結合する、モノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、第ＨＢ９２５９号の寄託番号でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを結合するモノクローナル抗体は、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを含んでなるポリペプチド精製試薬を回収するための親和性試薬として使用することが可能である。他の適したタンパク質タグ（ｔａｇ）および親和性試薬は以下のものである：１）固定化グルタチオンに対するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の親和性を利用する、ＧＳＴ−Ｂｉｎｄ^ＴＭ）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているもの；２）モノクローナル抗体に対するＴ７遺伝子１０タンパク質のアミノ末端１１アミノ酸の親和性を利用する、Ｔ７−Ｔａｇ（登録商標）アフィニティー精製キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているもの；または３）タンパク質タグに対するストレプトアビジンの操作された形の親和性を利用する、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）システム（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているもの。上述のタンパク質タグのいくつか、並びにその他がＳａｓｓｅｎｆｅｌｄ（１９９０），ＴＩＢＴＥＣＨ ８：８８−９３，Ｂｒｅｗｅｒら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」中，ｐｐ．２３９−２６６，ＳｅｅｔｈａｒａｍおよびＳｈａｒｍａ（監修），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９１），およびＢｒｅｗｅｒおよびＳａｓｓｅｎｆｅｌｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」中，ｐｐ．９１−１１１，ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（監修），Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）、に記載されている。さらに、二つまたはそれより多い上述のタグの融合、例えば、ＦＬＡＧタグおよびポリヒスチジンタグの融合を本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ融合することが可能である。
【００８０】
他の異種ポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質は、例えば、二量体、三量体またはより高度な多量体を形成する性向、増加したインビボ半減期、および／または増加した生物学的活性のごとき、他の種類の独特な利点を有している。融合タンパク質を製造するための技術は既知であり、そして例えば、ＷＯ ９９／３１２４１およびＣｏｓｍａｎら（（２００１），Ｉｍｍｎｕｎｉｔｙ １４：１２３−１３３）、に記載されている。例示として、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域、または実質的に類似したタンパク質を含んでなる異種ポリペプチドを、ＢＴＬ−ＩＩポリペプチドまたは断片へ融合することが可能である。抗体のＦｃ領域は、ヒトまたは動物起源の抗体からのＣ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３ドメインまたはこれらに実質的に類似した免疫グロブリンドメインを含んでなるポリペプチドである。議論のためには、ＨａｓｅｍａｎｎおよびＣａｐｒａ，免疫グロブリン：構造および機能，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．Ｐａｕｌ，監修，「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，第２版，２１２−２１３（１９８９）、を参照されたい。二量体化を促進するヒンジ領域を含んでなる、Ｆｃ領域の一部切断形もまた使用することが可能である。抗体および他の免疫グロブリンアイソタイプの他の部分を使用することが可能である。ＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含んでなる組換え融合タンパク質は、二量体を形成するようである。抗体由来のタンパク質のいろいろな部分を含んでなる融合タンパク質は、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−３９）、Ｂｙｒｎら（（１９９０），Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７−７０）、ＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（「免疫学における最新のプロトコール」中，補４，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１（１９９２））、Ｂａｕｍら（（１９９４），ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１）および米国特許第５，４５７，０３５号およびＷＯ ９３／１０１５１、に記載されている。いくつかの態様において、改変Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃレセプターに対するより低い親和性を有しているという利点を持つことが可能である。このことは、こうした組換え融合タンパク質が免疫エフェクター細胞により結合した細胞の溶解を少なくすることができるので都合がよい。実施例５は、ヒトＦｃ領域へ融合されたマウスＢＴＬ−ＩＩの細胞外領域を含んでいる融合タンパク質の製造を記載している。このタンパク質をコードしている核酸配列およびそのアミノ酸配列は、各々、配列番号１９および配列番号２０に開示されている。
【００８１】
別の代替物として、本発明の組換え融合タンパク質は、ロイシンジッパーを含んでなる異種ポリペプチドを含んでなることが可能である。既知のロイシンジッパー配列の中で、二量体化を促進する配列および三量体化を促進する配列である。例えば、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９−６４、を参照されたい。ロイシンジッパーは、しばしば、他のアミノ酸と共に散らばる４または５のロイシン残基を持つ、７アミノ酸反復を含んでなる。ロイシンジッパーの使用および製造は、当該技術分野ではよく知られている。
【００８２】
もしくは、組換え融合タンパク質の異種ポリペプチド形成部分は、二つまたはそれより多くのＢＴＬ−ＩＩポリペプチドを連結している、一つまたはそれより多くのペプチドリンカーであり得る。一般に、ペプチドリンカーは、複数の同一の、類似のまたは異なったポリペプチドを連結するために働き、そしてタンパク質の連結された部分の望まれる機能に必要とされる可動性または強剛性を提供する、アミノ酸の伸長である。典型的には、ペプチドリンカーは、長さ約１および３０アミノ酸の間である。ペプチドリンカーの例には、限定されるわけではないが、−−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号３）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号５）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号６）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号７）またはＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号８）が含まれる。連結部分は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−８３（１９８８）、Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：９８９−９５（１９９３）、およびＮｅｗｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：５４５−５３（１９９６）に記載されている。他の適切なペプチドリンカーは、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されているものである。
【００８３】
さらに、組換え融合タンパク質は、その正常なシグナル配列を欠き、そしてその代わりとして、それに置き換わる異種シグナル配列を有するＢＴＬ−ＩＩタンパク質を含んでなることが可能である。シグナル配列の選択は、組換えタンパク質が産生されるべき宿主細胞の型に依存しており、そして天然のシグナル配列を異種シグナル配列に置き換えることが可能である。哺乳動物宿主細胞中で機能的であるシグナル配列には以下のものが含まれる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のためのシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら（（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）により記載されているインターロイキン−２レセプターのためのシグナル配列；ＥＰ特許第０ ３６７ ５６６号に記載されているインターロイキン−４レセプターシグナル配列；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているタイプＩ インターロイキン−１レセプターシグナル配列；ＥＰ特許第０ ４６０ ８４６号に記載されているタイプＩＩ インターロイキン−１レセプターシグナル配列。
【００８４】
ＢＴＬ−ＩＩ核酸
本発明は、変異体、断片、組換え融合タンパク質、完全長タンパク質、可溶性タンパク質および分泌タンパク質を含む、上記のＢＴＬ−ＩＩタンパク質、断片または免疫原性断片をコードする単離核酸を包含する。これらの核酸は、なかでも、組換えタンパク質を製造するため、および組織試料中のＢＴＬ−ＩＩ核酸の存在を検出するために、例えば、診断使用のために有用である。こうした核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。核酸は、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしている、中断されていないオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を含んでなることが可能である。本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖形両方の形でのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びに、対応する相補的配列が含まれる。“単離核酸”とは、天然に存在する起源から単離された核酸の場合、該核酸が単離されたゲノムまたは生物体中に存在する、隣接する遺伝子配列から分離されている核酸である。オリゴヌクレオチドのごとく、化学的に、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物またはｃＤＮＡのごとく、鋳型から酵素的に合成された核酸の場合、こうしたプロセスから生じる核酸は単離核酸であることを理解されたい。単離核酸分子は、別々の断片の形での、またはより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子も指している。
【００８５】
さらに、本発明は、（１）例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーションなど、当該技術分野ではよく知られた多数の方法によりＢＴＬ−ＩＩ核酸を検出するためのプローブとして、（２）ＢＴＬ−ＩＩ核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして、または（３）例えば、アンチセンス核酸（ペプチド核酸を含んで）、リボザイム、三重らせん形成分子による発現の阻害を通して、または任意のこれらのＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡを妨害することによる、ＢＴＬ−ＩＩ核酸の発現を調節するための手段として、働くことが可能であるＢＴＬ−ＩＩをコードしている核酸の断片を包含する。ＰＣＲプライマーは、ＢＴＬ−ＩＩ核酸配列に加えて、増幅された核酸の使用を容易にする制限酵素切断部位のごとき他の配列を含んでなることが可能である。ＰＣＲは以下の文献に記載されている：Ｓａｉｋｉら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：４８７−９１；「ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」，Ｅｒｌｉｃｈ，監修，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）。以下に説明するように、ＰＣＲはＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの過剰発現を検出するために有用であることが可能であり、そしてＰＣＲプライマーは、遺伝子の多様な部分から採ることが可能であり、そしてまた、異なったスプライス変異体間を区別するために選択することが可能である。アンチセンスＲＮＡ（およびそれらをコードしているＤＮＡ）、ＤＮＡまたは合成ヌクレオチド、そして発現を調節するためのそれらの使用は、当該技術分野ではよく知られており、例えば以下の文献に記載されている：ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８４），Ｃｅｌｌ ３６（４）：１００７−１５；ＩｚａｎｔおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１１）：３４５−５２；Ｈａｚｅｌ−Ｂｅｌｌａｎら（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（６）：２３０９−１８；Ｓａｒｉｎら（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（２０）：７４４８−５１；Ｚｏｎ（１９８８），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５（９）：５３９−４９；Ｈａｒｅｌ−Ｂｅｌｌａｎら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０（７）：２４３１−３５；Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａら（１９８７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１４）：５７４９−６３；Ｇａｍｂａｒｉ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．７（１７）：１８３９−６２；およびＬｅｍａｉｔｒｅら（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４（３）：６４８−５２。同様に、選択された遺伝子の発現を阻害するための干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ（およびそれらをコードしているＤＮＡ）そしてそれらの使用は、当該技術分野ではよく知られており、以下の文献に記載されている：Ｆｊｏｓｅら（２００１），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．７：３１−５７；ＢｏｓｈｅｒおよびＬａｂｏｕｅｓｓｅ（２０００），Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：Ｅ３１−Ｅ３６。さらに、リボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅは、特異的ＲＮＡを切断するように標的化することが可能であり、そして従って、ＬｅｗｉｎおよびＨａｕｓｗｉｒｔｈ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７（５）：２２１−２８；ＭｅｎｋｅおよびＨｏｂｏｍ（１９９７），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１）：１７−３３；Ｎｏｒｒｉｓら（２０００），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：２９３−３０１；Ｓｉｏｕｄ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１（５）：５７５−８８；およびＳａｎｔｉａｇｏおよびＫｈａｃｈｉｇｉａｎ（２００１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７９（１２）：６９５−７０６、に記載されているように、遺伝子発現を阻害するために使用することが可能である。ＢＴＬ−ＩＩ発現を調節可能な核酸は、ＢＴＬ−ＩＩ機能のインビボまたはインビトロ研究における、または治療剤として、所望により遺伝子治療剤としての使用を見出すことが可能である。
【００８６】
本発明はまた、中程度のストリンジェント条件下、より好ましくは高ストリンジェント条件下で、本明細書に記載したＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしている核酸へハイブリダイズする核酸も含んでいる。こうした核酸には、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７が含まれる。好ましくは、こうした核酸は、Ｔ細胞の表面上のレセプターへ結合可能で、および／またはＴ細胞増殖および／またはサイトカイン産生を阻害可能なタンパク質をコードしている。ハイブリダイゼーション技術は当該技術分野ではよく知られており、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ＮＹ，第９章および第１１章，（１９８９））および「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら監修，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，２．１０および６．３−６．４節（１９９５））により記載されている。中程度にストリンジェントな条件は、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣ中、約４２から５５℃の温度でのハイブリダイゼーション、そして約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄が含まれる。高ストリンジェントな条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件と定義されるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、および１．２６ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に対して置換することが可能である；洗浄は、好ましくは少なくとも２回、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間行う。
【００８７】
当業者に知られるように、そして以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、必要に応じて、望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するよう、洗浄温度および洗浄塩濃度を調整可能であることを理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献を参照されたい）。既知の配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長は、核酸の配列を並列し、そして最適配列相補性を持つ、一つまたは複数の領域を同定することによって、決定可能である。長さが５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）より５から１０℃低くなければならず、Ｔ_ｍは、以下の等式に従って決定する。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔ_ｍ（度Ｃ）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）である。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドに関しては、Ｔ_ｍ（度Ｃ）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ^＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ^＋］＝０．１６５Ｍ）。各々のこうしたハイブリダイズする核酸は、少なくとも１５ヌクレオチド（または少なくとも１８ヌクレオチド）、または少なくとも２０、または少なくとも２５、または少なくとも３０、または少なくとも４０、または少なくとも５０、または少なくとも１００である長さを有する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献。
【００８８】
ＢＴＬ−ＩＩ核酸は、以下のポリヌクレオチドを含んでなる核酸を含んでいる：（１）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７の全てまたは断片、ここにおいて、断片はＴ細胞の表面上に発現されたレセプターへ結合可能で、および／またはＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン産生を阻害可能なＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしている；（２）少なくとも１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、３００、４００、５００、６００、８００、１０００、１２００、１４００または１６００ヌクレオチド長であり、そしてＴ細胞の表面上に発現されたレセプターへ結合可能で、および／またはＴ細胞の増殖および／またはサイトカイン産生を阻害可能なＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしている、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．７％同一である配列；（３）本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしている核酸を検出するまたは増幅するために、またはＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現を調節するために有用である、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７または実質的に類似した配列の断片；（４）配列番号７または配列番号１１のヌクレオチド３０から１３０から成るポリヌクレオチド、または配列番号９、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７のヌクレオチド３７７−４７７と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．７％同一であるポリヌクレオチドを含んでなる核酸、ここにおいて、同一性の領域は少なくとも６０，７０，８０，９０または１００ヌクレオチド長であり、そして核酸によりコードされているタンパク質は、Ｔ細胞の増殖および／またはサイトカイン産生を阻害可能である；および（５）配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７と比較して少なくとも１、２、３、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０または７５の改変を含んでなる核酸、ここにおいて、改変は、単一ヌクレオチドの挿入、欠失または置換であることが可能である。
【００８９】
ＢＴＬ−ＩＩポリペプチドへ特異的に結合する抗体
変異体、断片および組換え融合タンパク質を含む、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する抗体は、本発明により包含される。本明細書において、別のタンパク質（抗体のごとき）によるＢＴＬ−ＩＩ上のエピトープの特異的結合とは、同一のエピトープを含んでなる別のタンパク質により、特異的に結合されているタンパク質は、それが結合されているＢＴＬ−ＩＩタンパク質の分子から置き換えられることが可能であるが、このエピトープを含んでいない別のタンパク質によっては置き換えられないことを意味している。多数の競合的結合アッセイが当該技術分野では知られている。エピトープは近接アミノ酸のみを含んでなることができるが、しかしまたＢＴＬ−ＩＩタンパク質の三次の折り畳みにより近くにもたらされた非近接アミノ酸を含んでなることもできる。エピトープは当該技術分野では既知の方法により同定することが可能である。例えば、Ｌｅｉｎｏｎｅｎら（２００２），Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８（１２）：２２０８−１６；Ｋｒｏｇｅｒら（２００２），Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１７（１１−１２）：９３７−４４；Ｚｈｕら（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８２（４）：９２１−２７、を参照されたい。本発明はまた、本明細書において免疫原性断片と称される、抗体を発生するために有用である、本明細書に記載したＢＴＬ−ＩＩタンパク質のエピトープも包含する。免疫原性断片は、好ましくは少なくとも１０アミノ酸長であり、そして好ましくは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８からの近接アミノ酸を含んでなる。こうしたエピトープは、スプライス接合部によりコードされているＢＴＬ−ＩＩタンパク質の領域に及んでおり、特異的スプライス変異体によりコードされているタンパク質への特異的結合の利点を有することができる。
【００９０】
抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることが可能であり、そして当該技術分野ではよく知られている方法により産生可能である。例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ」，Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８０）；および「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー，ＮＹ，（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：２１９７；Ｋｏｚｂｏｒら（１９８４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−３００５（ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を記載している）；Ｃｏｌｅら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６（１９８５）（ＥＢＶハイブリドーマ技術を記載している）；Ｋｕｂｙ，「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第２版，ｐ．１６２−６４，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ニューヨーク（１９９４）、を参照されたい。本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することが可能である。さらに、本発明の抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ、ＮＳＩ）またはＷＩ３８細胞、酵母細胞、昆虫細胞および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ ｃｏｌｉ）を含む細菌細胞、を含む他の培養細胞中で産生することが可能である。こうした抗体は、抗体に加えてこれらの抗体の発現を可能にする核酸をコードしている核酸を所望の細胞内へ導入することにより産生することが可能である。抗体は、それから、これらの核酸が導入されている細胞を培養することにより産生することが可能である。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい。
【００９１】
あるいは、抗体は重および軽鎖可変領域様ドメイン、そして所望により、また一つまたはそれより多くの定常領域様ドメインを含んでなる単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄら（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−８３）、二量体または多価抗体（例えば、Ｌａｎｔｔｏら（２００２），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：２００１−０５；ＨｕｄｓｏｎおよびＳｏｕｒｉａｕ（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１（５）：８４５−５５）、四量体抗体（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら，「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ」，第５版，第ＩＩ部，第３章，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１））、キメラ抗体（ＨｕｄｓｏｎおよびＳｏｕｒｉａｕ，上記文献；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３−４６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−５５；Ｔａｋｅｄａら（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−５４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８−７０）、異なったトランスジェニック動物で産生された完全ヒト抗体（例えば、米国特許第６，１５０，５８４に記載されている）またはインビトロ選択（米国特許出願第２００２／００５８０３３号）またはヒト化抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，上記文献；Ｔａｋｅｄａら，上記文献；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，上記文献）であってもよい。さらに、抗体は、インビトロ選択スキームにより“成熟させる”ことが可能であり、例えば、それが結合するエピトープに対してより高い親和性のごとき、改変された特性を有する抗体を得る。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−１９；ＰｉｎｉおよびＢｒａｃｃｉ（２０００），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．１（２）：１５５−６９；Ｅ１１ｍａｒｋら（２００２），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９（５−６）：３４９；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら（２００２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２１（１）：４９−５６；Ｈｕｌｓら（２００１），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１；ＨｕｄｓｏｎおよびＳｏｕｒｉａｕ，上記文献；ＡｄａｍｓおよびＳｃｈｉｅｒ（１９９９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１−２）：２４９−６０；Ｓｃｈｍｉｔｚら（２０００），Ｐｌａｃｅｎｔａ ２１ 補Ａ：Ｓ１０６−１２、を参照されたい。あるいは、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合可能な、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片または単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ’ｓ）のごとき抗体の断片も、本明細書において抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体として意味されるものに包含される。ＦａｂおよびＦｖ断片についての議論は、Ｋｕｂｙ，上記文献，ｐｐ．１０９−１１２およびＪａｎｅｗａｙら，上記文献、を参照されたい。本発明はまた、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する抗体に特異的に結合する、そしてＢＴＬ−ＩＩタンパク質の効果を模倣する、抗イディオタイプ抗体も包含する。こうした抗イディオタイプ抗体は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質としての同様の使用を発見した。抗イディオタイプ抗体を産生する方法は当該技術分野ではよく知られている。例えば、Ｋｕｂｙら，上記文献，３７１−７２、を参照されたい。本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質および別のエピトープへ特異的に結合可能な、多様な種類の組換えおよび非組換え二重特異性抗体もまた意図される。多様な種類の二重特異性抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、米国特許第４，４７４，８９３，６，０６０，２８５および６，１０６，８３３号に記載されている。
【００９２】
抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、ＢＴＬ−ＩＩのそのレセプターへの結合のごときＢＴＬ−ＩＩの生物学的機能を遮断するアンタゴニスト抗体、若しくはＢＴＬ−ＩＩの生物学的機能を促進するまたはＢＴＬ−ＩＩの機能を模倣するアゴニスト抗体であることができる。アゴニスト抗体は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の機能を模倣するアゴニスト性抗イディオタイプ抗体を含むことが可能である。ＢＴＬ−ＩＩ機能のためのアッセイは本明細書に記載されている。こうしたアッセイで決定された、ＢＴＬ−ＩＩの生物学的機能を遮断する抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、本明細書において意味されるようにアンタゴニスト抗体である。アンタゴニスト抗体は、例えば、ＢＴＬ−ＩＩのそのレセプターへの結合を遮断することができる。こうしたアッセイへ加えた場合、ＢＴＬ−ＩＩの生物学的機能を促進するまたは増強する抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、本明細書において意味されるようにアゴニスト抗体である。アンタゴニスト性抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、例えば、粘膜免疫応答を増強するためのアジュバントとして使用可能である。さらに、ＢＴＬ−ＩＩレセプターに対するアゴニスト性抗は、例えば、クローン病または炎症性腸疾患のごとき、腸の不適切な炎症により特徴付けられる疾患を処置するため、粘膜免疫応答を抑制するために使用可能である。
【００９３】
本発明の抗体はまた、インビトロまたはインビボの両方で、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質の存在を検出するためのアッセイにも使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによる本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質の精製においても用いることが可能である。抗体はまた、免疫親和性クロマトグラフィーによる、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質の精製に用いることが可能である。
【００９４】
本発明は、本発明の抗体をコードしている核酸、およびこうした核酸を細胞に導入し、そして核酸を含んでいる細胞を培養することによる、抗体を産生するための方法を包含する。
【００９５】
ＢＴＬ−ＩＩポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はＢＴＬ−ＩＩのアゴニストおよびアンタゴニスト、そしてアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするための方法、並びにアゴニストおよびアンタゴニストを使用するための方法を包含する。インビボまたはインビトロにおけるＢＴＬ−ＩＩタンパク質の過剰または過少発現、またはインビボまたはインビトロにおけるＢＴＬ−ＩＩ発現の完全非存在を含んでいる、例えば、細胞増殖アッセイ、サイトカイン分泌アッセイ、結合アッセイおよび遺伝子アッセイのごとき、ＢＴＬ−ＩＩ生物学的活性のためのアッセイが本明細書に記載されている。候補分子をこうしたアッセイに加えることが可能であり、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の生物学的活性に対するそれらの効果を決定する。ＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストは、例えば、ＢＴＬ−ＩＩと、好ましくはＢ細胞またはＴ細胞上に発現されたそのレセプターとの相互作用を、遮断可能である。アンタゴニストはアンタゴニスト抗体を含み、そしてアゴニストはアゴニスト抗体を含む。加えて、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（Ｒｏｎｎｍａｒｋら（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６１（１−２）：１９９−２１１）のような、本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合可能である他の抗体関連分子、および本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質に特異的に結合し、そしてＢＴＬ−ＩＩタンパク質の生物学的活性を阻害する、ＷＯ ００／２４７８２に記載されている生物学的に活性なペプチドが本発明に包含される。さらに、ＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストには、例えば、干渉ＲＮＡ（またはそれらをコードしているＤＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡのごとき、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質および／またはｍＲＮＡの発現を変調するために有用である上述の核酸が含まれる。
【００９６】
アンタゴニストにはさらに、ＢＴＬ−ＩＩまたはそのレセプターへ結合するためにインビトロで選択されたアミノ酸配列を含んでなる、そして、所望により、ＢＴＬ−ＩＩまたはそのレセプターの相互作用を妨害可能な、タンパク質が含まれる。あるいは、こうしたタンパク質は、ＢＴＬ−ＩＩの生物学的機能を促進するまたは模倣するＢＴＬ−ＩＩアゴニストであることが可能である。ＢＴＬ−ＩＩまたはそのレセプターへ結合するタンパク質は、ＢＴＬ−ＩＩとそのレセプターとの相互作用を妨害する能力でスクリーニングすることが可能であり、または、選択は、こうしたタンパク質を直接得るように設計することが可能である。
【００９７】
タンパク質は、例えば、ファージディスプレイまたは細菌の表面のディスプレイのごとき、多くの方法により選択することができる。例えば、ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ（１９８９），Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−２１８；Ｌｕｚｚａｇｏら（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．１：１４９−８３；Ｌｕら（１９９５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１３（４）：３６６−３７２、を参照されたい。これらの方法において、結合ドメインのライブラリーの各々のメンバーは、個々のファージ粒子または細菌細胞上にディスプレイすることが可能であり、そして選ばれた条件下で目的のタンパク質へ結合する細菌またはファージを選択可能である。選択された結合ドメインをコードする核酸は、選択されたファージまたは細菌を成長させ、そしてそれらから核酸を単離することにより得ることが可能である。
【００９８】
あるいは、タンパク質を全くインビトロで選択することが可能である。例えば、潜在的結合ドメインのライブラリー中の、個々のポリペプチドの各々を、それをコードする核酸へ付着可能であり、そして選ばれた条件下で目的のタンパク質へ結合するものを選択することが可能である。ポリペプチドはそれらをコードする核酸へ付着されているので、増幅、クローニング、または有効な結合ドメインをコードする核酸の配列決定のごとき、続いての操作が容易である。抗体−リボソーム−ｍＲＮＡ粒子、リボソームディスプレイ、共有結合的ＲＮＡ−ペプチド融合、または共有結合的ＤＮＡ−ＲＮＡ−ペプチド融合を含む、こうした選択のための多様なスキームが当該技術分野では知られている。ＨｅおよびＴａｕｓｓｉｇ（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５（２４）：５１３２−５１３４；ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２；ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１２２９７−１２３０２；ＬｏｈｓｅおよびＷｒｉｇｈｔ（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．４（２）：１９８−２０４；Ｋｕｒｚら（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（１８）：Ｅ８３；Ｌｉｕら（２０００），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１８：２６８−９３；Ｎｅｍｏｔｏら（１９９７），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４（２）：４０５−０８；米国特許第６，２６１，８０４号；ＷＯ００３２８２３；およびＷＯ００３４７８４。こうしたタンパク質はアンタゴニストまたはアゴニストであると選択することが可能である。
【００９９】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の生物学的活性のためのアッセイ
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の生物学的活性を検出するため、およびＢＴＬ−ＩＩの結合パートナー（ｐａｒｔｎｅｒ）を同定するために、多様なアッセイを使用することが可能である。ＢＴＬ−ＩＩタンパク質、ＢＴＬ−ＩＩのレセプター、および両方のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを、こうしたアッセイに使用することが可能である。
【０１００】
結合パートナーを同定するためのアッセイ
ＢＴＬ−ＩＩの結合パートナーは、最初にどの細胞の型に可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質が結合可能かを決定することにより同定可能である。ブチロフィリン様タンパク質のＢ７サブファミリーのメンバーのための既知レセプターはすべてＴ細胞上で発現されるので、構成的に（ＣＤ２８）かまたは活性化後に（ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１）、これらへＢＴＬ−ＩＩが結合可能かどうかを決定するために、Ｔ細胞を試験することが可能である。ＢＴＬ−ＩＩの発現パターンのため、正常および炎症性腸から単離されたＴ細胞を、こうした試験に含むことが可能である。加えて、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞および多様な活性化状態のＴ細胞を含む、多様なサブセットのＴ細胞を試験することが可能である。
【０１０１】
こうした実験は、当該技術分野ではよく知られている方法を使用して実施可能である。例えば、マウスＢＴＬ−ＩＩの細胞外ドメインに加えて抗体のＦｃ領域を含んでなるＢＴＬ−ＩＩ組換え融合タンパク質を、試験されている細胞へ結合させるために使用可能である。組換え融合タンパク質中のＦｃ領域へ結合可能な蛍光標識抗体を、加えることが可能である。洗浄後、細胞は、ＢＴＬ−ＩＩが細胞へ結合可能かどうかを決定するため、蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）装置を使用して分析可能である。こうしたアッセイの一つはＣｈａｐｏｖａｌら（（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（３）：２６９−７４により記載されている。当該技術分野で既知の他の方法もまた、ＢＴＬ−ＩＩが特異的細胞集団へ結合するかどうかを決定するのに適切であり得る。
【０１０２】
さらに、Ｂ７サブファミリーメンバーの既知のレセプターは、ＢＴＬ−ＩＩがいかなるこれらのタンパク質にも結合するかどうかを決定するために試験されるであろう。Ｂ７サブファミリーメンバーの細胞外ドメイン（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１およびＢ７−２のためのレセプター）および抗体のＦｃ領域を含んでなる組換え融合タンパク質は、こうしたＢＴＬ−ＩＩ融合タンパク質を作製するために使用した方法と類似の方法により作製可能である。細胞表面に発現される、膜貫通および細胞質ドメインを含むＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードする、ＢＴＬ−ＩＩ核酸の完全長形で細胞をトランスフェクトすることが可能である。試験されるべきレセプター：Ｆｃ融合タンパク質を、Ｆｃ領域へ結合可能である蛍光標識抗体と一緒に、こうした細胞へ加えることが可能である。洗浄後、トランスフェクトされた細胞上に発現されたＢＴＬ−ＩＩタンパク質へレセプター：Ｆｃ融合タンパク質が結合しているかどうかを決定するため、ＦＡＣＳにより細胞を分析することが可能である。逆実験もまた実行することが可能であり、ここでは、可溶性ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質を使用し、そして完全長レセプタータンパク質を導入し、そしてトランスフェクションにより発現させる。こうした実験は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質および他のＢ７サブファミリーメンバーの既知のレセプター間の結合相互作用を明らかにすることが可能である。
【０１０３】
もし、ＢＴＬ−ＩＩが多様なＴ細胞の少なくとも一つとは結合するが、既知のレセプターへは結合しないとすれば、当該技術分野では既知の多様な発現クローニングまたはタンパク質精製法を、ＢＴＬ−ＩＩが結合するレセプターを同定するために使用可能である。例として、放射活性スライド（ｓｌｉｄｅ）結合ｃＤＮＡ発現クローニング法が使用可能である。簡単には、可溶性ＢＴＬ−ＩＩへ最も強い結合を有する細胞源を同定し、ｍＲＮＡを単離し、そして哺乳動物発現ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築する。スライド上で哺乳動物細胞をｃＤＮＡのプールでトランスフェクトし、そして発現を可能にするために適切にインキュベーションした後、可溶性ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ融合タンパク質を細胞へ結合させる。レセプターを運んでいる細胞への特異的結合を、以下の一連の工程により検出する：結合されたＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃタンパク質への放射活性抗Ｆｃ試薬の結合；スライドへのフィルム乳剤の適用；暴露させるためのインキュベーション；銀粒子を沈着させるためのフィルム現像；そして顕微鏡による粒子の検出。レセプター発現クローンは次ぎに、プールを副分画することによりプールから単離し、そして単一レセプタークローンを同定するためにスライド結合アッセイを反復する。こうした方法は、ＭｃＭａｈｏｎら（１９９１），ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１−３２、に記載されている。
【０１０４】
細胞への結合が達成された場合、多様な手段（動物免疫化またはファージディスプレイ技術を通して）を、ＢＴＬ−ＩＩを結合している抗体を単離するため、そして細胞へのその結合を破壊するために使用可能である。こうした抗体は、内在性ＢＴＬ−ＩＩの活性に拮抗するために、そして従って、免疫応答、および例えば、Ｃｏｏｐｅｒら（（１９９３），Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９（２）：２３８−４９）およびＴｏｋｏｉら（（１９９６），Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３１（２）：１８２−８８）により記載されているような、炎症性腸疾患モデルのごとき疾患モデルにおいて、ＢＴＬ−ＩＩの有効量を低下させる効果を決定するためのアッセイに使用可能である。
【０１０５】
ＢＴＬ−ＩＩ機能を決定するためのアッセイ
Ｂ７サブファミリータンパク質は、“抗原”の用量を変化させ、Ｔ細胞レセプターを通してＴ細胞を活性化させることを含む、Ｔ細胞“同時刺激”アッセイにおいて活性を有することが示されている。Ｂ７サブファミリータンパク質の活性は、“最適以下”のＴ細胞レセプター刺激で、最も明らかである。例えば、Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（３）：２６１−６８、を参照されたい。組織培養皿結合抗ＣＤ３ε抗体のごとき“代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）抗原”または照射抗原提示細胞上のＭＨＣ分子により提示される抗原を使用可能である。可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を、“抗原”についてのＴ細胞の応答に対するその効果を決定するために加えることが可能である。Ｔ細胞が刺激されているか、または抑制されているかを決定するため、多様なパラメーターが測定可能である。細胞増殖、細胞表面レセプター発現、そしてタンパク質および／またはｍＲＮＡレベルでの免疫変調分子（例えば、インターフェロンγおよび／またはＩＬ−２のごとき）の発現レベル、を測定することが可能である。こうした方法は、例えば、Ｆｉｔｃｈら，「Ｔ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｐｐ．６８−８５（１９９５）；Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２（７）：１０２７−３４；Ｓｗａｌｌｏｗら（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：４２３−３２；Ｈｕｔｌｏｆｆら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３−６６；Ｙｏｓｈｉｎａｇａら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ ４０２：８２７−３２；Ｌａｔｃｈｍａｎら，上記文献、に使用され、説明されている。ＢＴＬ−ＩＩの発現パターンを仮定すれば、こうしたアッセイは、粘膜組織またはこうした組織を排出するリンパ節に由来するＴ細胞を含むことが可能である。加えて、ナイーブおよびメモリーＴ細胞、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびαβＴ細胞レセプター以外のＴ細胞レセプターを発現しているＴ細胞、を試験することが可能である。こうした実験から、ＢＴＬ−ＩＩが多数の異なった種類のＴ細胞の応答を改変できるかどうかを明らかにすることが可能である。こうした実験は以下に記載されており、そしてＢＴＬ−ＩＩの可溶性バージョンが、細胞増殖を阻害する、およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）インターロイキン２（ＩＬ２）およびインターロイキン５（ＩＬ５）を含むサイトカインの産生を抑制可能であることを示している。実施例６−１０；図１２−１７。
【０１０６】
この種類の実験の変法には、同時刺激性が可能である、他の可溶性Ｂ７サブファミリータンパク質または多様なＴＮＦファミリーメンバーで観察される同時刺激応答について、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の可溶性形を含んだ効果を試験することが含まれる。このことは、ＢＴＬ−ＩＩが他の分子で見られる同時刺激を改変するかどうかを定義する助けとなるであろう。さらなる変法は、多様な種類の非照射抗原提示細胞の使用を含むことが可能である。このことは、抗原提示細胞の機能に対する、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の添加の効果を定義する助けとなるであろう。さらに別の変法においては、細胞へのＢＴＬ−ＩＩ結合を遮断する抗体（上記参照）もまた、結合を防止する効果を決定するため、こうした同時刺激実験に導入可能である。
【０１０７】
別の種類の実験において、ＢＴＬ−ＩＩを発現する抗原提示細胞（例えば、パイエル板からの樹状細胞またはＢ細胞、または腸管上皮細胞（ＩＥＣ）のごとき）をＴ細胞（上にリストした多様な種類のもののごとき）と組み合わせることが可能で、そして上にリストした一つまたはそれより多くのパラメーターを測定することが可能である。これらの細胞で得られた結果は、ＢＴＬ−ＩＩ発現を低くするために設計された、これらをコードしている干渉ＲＮＡまたはＤＮＡが抗原提示細胞内へ導入された場合に得られた結果と比較可能である。
【０１０８】
Ｔ調節（Ｔ ｒｅｇ）細胞は、炎症性腸疾患モデルシステムにおいて、一部、Ｔ調節細胞の分化を誘導することにより、または調節機能を促進することにより、自己免疫応答を抑制するように、そしてそのようにすることを助けるように作用する。Ｔ ｒｅｇ細胞には、例えば、なかでも、Ｔｒ１細胞（Ｃｏｎｇら（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（１１）：６１１２−１９；Ｇｒｏｕｘら（１９９７），Ｎａｔｕｒｅ ３８９：７３７−４２）、Ｔｈ３細胞、ＣＤ４^＋Ｃｄ２５^＋Ｔ ｒｅｇ細胞（例えば、ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（９）：８１６−２２）を参照されたい）、ＣＤ４^＋Ｒｂ^ｌｏＣＤ２５^＋Ｔ ｒｅｇ細胞、およびＣＤ８^＋ Ｔ ｒｅｇ細胞（Ａｌｌｅｚら（２００２），Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２３：１５１６−２６）が含まれる。従って、Ｔ調節細胞増殖および機能に対するＢＴＬ−ＩＩの効果を評価することは、インビボにおけるＢＴＬ−ＩＩの正確な役割を決定するために必要とされる。例えば、Ｔｒ１細胞存在下での、抗原特異的Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞によるサイトカイン産生を測定可能である。こうしたアッセイは、Ｃｏｎｇら、上記文献、に記載されている。ＢＴＬ−ＩＩの可溶性形、遮断抗体または干渉ＲＮＡを使用するＢＴＬ−ＩＩ発現の阻害は、ＢＴＬ−ＩＩが、Ｔ調節細胞またはＴｒ１細胞の増殖、維持、または他のＴ細胞の抗原活性を抑制する能力において役割を演じているかどうかを決定するために使用可能である。
【０１０９】
一つのＴ細胞サブセット、Ｔｈ３細胞は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）を産生し、そして粘膜抗原に対する経口免疫寛容と結びつけられている。例えば、Ｆｕｋａｕｒａら（１９９６），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８（１）：７０−７７；Ｉｎｏｂｅら（１９９８），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２７８０−９０、を参照されたい。こうした細胞は、ＴＧＦβ存在下、抗原による広範培養により、ナイーブＴ細胞から発生させることが可能である。可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または遮断抗体は、上述の方法と同様の方法により、ＢＴＬ−ＩＩがこれらの細胞の増殖または機能を改変することが可能かどうかを問うために使用可能である。
【０１１０】
単純で明確な抗原（例えば、卵白アルブミンのごとき）または複雑な抗原（細菌またはウイルスを含んだ）を使用するモデルＴ細胞システムにおいて、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または拮抗性抗体を投与することの効果が確かめられるであろう。こうした抗原に対するＴ細胞応答（増殖および／またはインターフェロンγまたはＩＬ−２のごとき分子の産生を含んで）を、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または抗体の存在下および非存在下で測定可能である。
【０１１１】
動物システムにおける同様の効果が試験可能である。初期の焦点は、特に粘膜免疫応答に関連するシステムであろう。これには、動物へ抗原を与えるモデルシステム（例えば、Ｙａｍａｓｈｉｒｏら（１９９４），Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊｐｎ．３６：５５０−５６；Ｊａｉｎら（１９９６），Ｖａｃｃｉｎｅ １４（１３）：１２９１−９７；Ｃｈｅｎら（２００２），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０５：１７１−８０、を参照されたい）、デキストラン硫酸ナトリウム誘導炎症性腸疾患モデルにおけるごとき炎症性腸疾患システム（Ｃｏｏｐｅｒら（１９９３），Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９（２）：２３８−４９；Ｔｏｋｏｉら（１９９６），Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．３１（２）：１８２−８８）、ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ／ＣＤ４^＋Ｔ細胞誘導萎縮病モデル（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２３７−４４）、および／またはマウス卵白アルブミン誘導喘息モデルのごとき、免疫応答を誘発するために気道内へ抗原を与えるまたは滴下するモデル喘息システム（Ｂｒｕｓｓｅｌｌｅら（１９９４），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ ２４（１）：７３−８０）、が含まれる。特に、体液または細胞仲介応答の大きさが測定されるであろう、そして産生された免疫変調サイトカインの型が測定されるであろう。こうした実験は、増加したまたは減少したＢＴＬ−ＩＩが、抗原（自己抗原を含んで）に対する応答を低下させることにおいて、または同種抗原に対する応答を増加させることにおいて役に立つことができるかどうかを明らかにすることが可能である。ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体の効果はまた、炎症性疾患の他のモデルにおいても確かめることが可能である。
【０１１２】
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖のためのアッセイには、以下のものが含まれるが、限定されるわけではない：「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（ｐｐ．３．１−３．１９：マウスリンパ球機能のインビトロアッセイ；第７章：ヒトにおける免疫学的研究）；Ｔａｋａｉら（１９８６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６−１７１２；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３；Ｂｏｗｍａｎら（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６−１７６１。
【０１１３】
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖のためのアッセイには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ（１９９４）ポリクローナルＴ細胞刺激，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）；およびＳｃｈｒｉｂｅｒ，（１９９４），マウスおよびヒトインターフェロンガンマの測定，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．６．８．１−６．８．８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）。
【０１１４】
造血およびリンパ球新生細胞の増殖および分化のためのアッセイには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：Ｂｏｔｔｏｍｌｙら，１９９１，ヒトおよびマウスインターロイキン２およびインターロイキン４の測定，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．６．３．１−６．３．１２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）；ｄｅＶｒｉｅｓら（１９９１），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５−１２１１；Ｍｏｒｅａｕら（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０−６９２；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら（１９８３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２９３１−２９３８；Ｎｏｒｄａｎ，マウスおよびヒトインターロイキン６の測定，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．６．６．１−６．６．５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）；Ｓｍｉｔｈら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１８５７−１８６１；Ｂｅｎｎｅｔｔら，１９９１，ヒトインターロイキン１１の測定，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．６．１５．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）；Ｃｉａｒｌｅｔｔａら，マウスおよびヒトインターロイキン９の測定，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．６．１３，１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）。
【０１１５】
抗原に対するＴ細胞クローン応答のためのアッセイ（それは、なかでも、増殖およびサイトカイン産生を測定することにより、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響するポリペプチド、ならびに直接的Ｔ細胞効果を同定するであろう）には、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章：マウスリンパ球機能のインビトロアッセイ；第６章：サイトカインおよびそれらの細胞レセプター；第７章：ヒトにおける免疫学的研究）（１９９１）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら（１９８０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：６０９１−６０９５；Ｔａｋａｉら（１９８６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００；Ｔａｋａｉら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２。
【０１１６】
胸腺細胞または脾細胞細胞毒性のためのアッセイには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章：マウスリンパ球機能のインビトロアッセイ，３．１−３．１９；第７章：ヒトにおける免疫学的研究）（１９９１）；ＨｅｒｒｍａｎｎおよびＭｅｓｃｈｅｒ（１９８１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２；Ｈｅｒｒｍａｎｎら（１９８２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１９６８−１９７４；Ｈａｎｄａら（１９８５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５６４−１５７２；Ｔａｋａｉら（１９８６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００；Ｔａｋａｉら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２；Ｂｒｏｗｎら（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：３０７９−３０９２。
【０１１７】
免疫グロブリン応答およびＢ細胞によるアイソタイプ転換のためのアッセイ（それは、なかでも、Ｔ細胞依存性抗体応答を変調し、そしてＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響するポリペプチドを同定するであろう）には、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ（１９９０），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８−３０３３；およびＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｂ細胞機能のアッセイ：インビトロ抗体産生，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，第１巻，ｐｐ．３．８．１−３．８．１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，トロント（１９９１）。
【０１１８】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（それは、なかでも、主としてＴｈ１およびＣＴＬ応答を発生するポリペプチドを同定するであろう）には、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章：マウスリンパ球機能のインビトロアッセイ，３．１−３．１９；第７章：ヒトにおける免疫学的研究）；Ｔａｋａｉら（１９８６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４−３５００；Ｔａｋａｉら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８−５１２；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら（１９９２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８−３７８３。
【０１１９】
樹状細胞依存性アッセイ（それは、なかでも、ナイーブＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現されるポリペプチドを同定するであろう）には、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：ＧｕｅｒｙおよびＡｄｏｒｉｎｉ（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５３６−５４４；Ｉｎａｂａら（１９９１），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５４９−５５９；Ｍａｃａｔｏｎｉａら（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５０７１−５０７９；ＰｏｒｇａｄｏｒおよびＧｉｌｂｏａ（１９９５），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：２５５−２６０；Ｎａｉｒら（１９９３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：４０６２−４０６９；Ｈｕａｎｇら（１９９４），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５；Ｍａｃａｔｏｎｉａら（１９８９），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１２５５−１２６４；Ｂｈａｒｄｗａｊら（１９９４），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：７９７−８０７；およびＩｎａｂａら（１９９０），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：６３１−６４０。
【０１２０】
Ｔ細胞傾倒および発生の初期段階に影響するポリペプチドのためのアッセイには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：Ａｎｔｉｃａら（１９９４），Ｂｌｏｏｄ ８４：１１１−１１７；Ｆｉｎｅら（１９９４），Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１１１−１２２；Ｇａｌｙら（１９９５），Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７８；Ｔｏｋｉら（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５１。
【０１２１】
レセプター−リガンド活性のためのアッセイには、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，Ｃｏｌｉｇａｎら監修，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第７．２８章：静的条件下での細胞接着の測定 ７．２８．１−７．２８．２２）；Ｔａｋａｉら（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６８６４−６８６８；Ｂｉｅｒｅｒら（１９８８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５−１１５６；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら（１９８９），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９−１６０；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５９−６８；Ｓｔｉｔｔら（１９９５），Ｃｅｌｌ ８０：６６１−６７０。
【０１２２】
トランスジェニック動物を利用した機能のための遺伝子アッセイ
本明細書に開示したＢＴＬ−ＩＩ核酸に対応する遺伝子（類）の複数のコピーを有し、好ましくは形質転換された細胞およびそれらの子孫内に安定的に維持されている遺伝子構築物を有する細胞の形質転換により産生されたトランスジェニック動物、好ましくはマウスを提供する。遺伝子発現レベルを増加させるまたは減少させる、または遺伝子発現の時間的または空間的パターンを変化させる、修飾された遺伝子制御領域を有するトランスジェニック動物もまた提供する（欧州特許第０ ６４９ ４６４ Ｂ１を参照されたい）。加えて、対応する遺伝子内への外来性配列の挿入を通して、または対応する遺伝子の全てまたは一部の欠失を通して、ＢＴＬ−ＩＩ遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されている生物体を提供する。部分的なまたは完全な遺伝子不活性化は、転位性要素の挿入（好ましくは続いての不正確な切除により）を通して（Ｐｌａｓｔｅｒｋ（１９９２），Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １４（９）：６２９−６３３；Ｚｗａａｌら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１６）：７４３１−７４３５；Ｃｌａｒｋら（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２）：７１９−７２２）、または相同的組換え（好ましくは陽性／陰性遺伝子選択戦略により検出される）を通して（Ｍａｎｓｏｕｒら（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；米国特許第５，４６４，７６４；５，４８７，９９２；５，６２７，０５９；５，６３１，１５３；５，６１４，３９６；５，６１６，４９１；および５，６７９，５２３号）、達成可能である。代替法として、ＢＴＬ−ＩＩ遺伝子の発現は、トランスジェニック動物内へ導入されたＤＮＡによりコードすることができる、干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムの導入により、トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物中で阻害可能である。こうした生物体の表現型は、ＢＴＬ−ＩＩ遺伝子のインビボ機能を解明することを可能にする。例えば、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を発現せずに、デキストラン硫酸ナトリウムの給餌に応答して炎症性腸疾患の症状を示す、トランスジェニック動物において増加した性向（野生型動物と比較して）から、ＢＴＬ−ＩＩは常態では腸管における炎症を低下させること、を示すことが可能である。あるいは、トランスジェニック動物はＢＴＬ−ＩＩを過剰発現することが可能である。こうしたトランスジェニック動物の表現型もまた、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質のインビボ機能に対する手掛かりを与えることが可能である。
【０１２３】
本発明のタンパク質、抗体、アンタゴニストおよびアゴニストの使用
特殊化した解剖学的構造、粘液膜の組内で作用する粘膜免疫システム、およびそれらが発生する免疫応答は、体内の他の解剖学的区画で発生する免疫応答からそれを区別する特性を有している。粘液膜はいくつかの独特な解剖学的区画のまさに一つであり、末梢リンパ節および脾臓、体腔（即ち、腹膜および胸膜）および免疫システムが活性である皮膚も含んでいる。粘膜表面は、肺、腸管、眼、鼻、口、のど、子宮および膣に観察される。粘膜表面は薄いシートまたは、体腔、仕切または隔壁、または二つの構造間の接合部の裏打ちのごとき、身体構造の被覆または外皮として働いている柔軟な組織の層である。粘膜表面は、大多数の感染性病原体の侵入経路であるので、粘膜免疫応答を増進可能であるアジュバントが特に望まれている。Ｊａｎｅｗａｙら，「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第５版，第ＩＶ部，第１０章，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨークおよびロンドン（２００１）。例えば、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のごとき、典型的には粘膜表面を通して侵入する感染性疾患は、しばしば１週間のみの粘膜免疫応答を発生させる。Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９９），４２（１）：５８−６３。
【０１２４】
腸管はいくつかの様式で独特である。腸管を裏打ちしているのは、集合的に腸管付随リンパ組織（ＧＡＬＴ）として知られている多数の特殊化した形のリンパ組織であり、以下のものが含まれる：扁桃腺およびアデノイド、それらは一緒になって口の奥の方でワルダイヤ輪を形成する；小腸中のパイエル板；虫垂；および大腸および直腸中の孤立リンパ濾胞。腸管中で外来抗原と遭遇することによるリンパ球の活性化は、粘液免疫システム中のいたるところでの抗原に対する適応性免疫応答の広がりを導くことが可能である。活性化リンパ球はリンパ系にそして、そこから血流へ入ることが可能である。血流は体中いたるところの粘膜部位へ活性化リンパ球を搬送可能であり、それは、粘膜組織で発現される粘膜アドレッシン（ａｄｄｒｅｓｓｉｎ）ＭＡｄＣＡＭ−１のごとき分子を使って、リンパ球により認識可能である。Ｊａｎｅｗａｙら、上記文献。腸管により産生される主抗体型はＩｇＡであり、それは発現時に、腸管上皮の表面を覆う粘膜層中に主として観察される。加えて、多数の別々の種類のＴ細胞が腸管中に観察される。Ｊａｎｅｗａｙら、上記文献。
【０１２５】
外来抗原の腸管内への導入は、通常は免疫寛容を導くが、特異的免疫応答を導くこともできる。腸管は、普通は、外来抗原の莫大なアレイ、即ち、食物および腸管中に住む共生微生物、を受けおよび寛容する（免疫学的な意味で）。後でのタンパク質の注射が、アジュバント存在下でさえも、抗体応答を起こさないように、特別な外来タンパク質の給餌が、経口免疫寛容として知られている、そのタンパク質への特別な無応答性の状態を導くことが可能である。この現象は、脾臓およびリンパ節、ならびに粘膜免疫系が関与することができる。Ｇｕｔｇｅｍａｎｎら（１９９８），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：６６７−７３、を参照されたい。しかしながら、例えば、サルモネラ−エルシニア（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｙｅｒｓｉｎｉａ）またはエンタモエバ−ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）のごとき腸病原体は、局所的（または全身的さえも）免疫応答を惹起することが可能である。腸管内への外来抗原の導入が免疫応答を惹起するかどうかを制御している因子は完全には理解されていない。Ｊａｎｅｗａｙら、上記文献、第５部、第１４章。
【０１２６】
多くのワクチンは、抗原に対する免疫応答を促進するためにアジュバントを用いる。アジュバントは、抗原に対する免疫応答の特異性を強化するまたは広幅化する。免疫応答は、抗体力価の増加または抗原反応性Ｔ細胞数の増加を含むことができる。こうしたパラメーターを測定するための方法は当該技術分野に存在している。例えば、Ｚｉｇｔｅｒｍａｎら（１９８８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０６（１）：１０１−０７。アジュバントが免疫応答を促進する機構は完全には理解されていないが、それらの使用は必須であろう。ごくわずかのワクチンが、選択された抗原に対する強い粘膜免疫応答を惹起可能である。
【０１２７】
本発明は、治療的有効量のＢＴＬ−ＩＩのアンタゴニストおよび抗原を投与することを含んでなる、抗原に対する全身的または粘膜免疫応答を増進する方法を包含する。本発明を実施するために使用可能なＢＴＬ−ＩＩのアンタゴニストには、ＢＴＬ−ＩＩの細胞外領域へ特異的に結合する拮抗的抗体またはインビトロ選択結合タンパク質、およびＢＴＬ−ＩＩの生物学的活性を阻害可能な小分子が含まれる。所望により、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質のアンタゴニストおよび抗原は、経口的に、経鼻的に、経膣的に、胃を経由して、または直腸を経由して、または吸入によるごとく、直接的に粘膜表面に投与可能である。例えば、少なくとも一つの場合においては、持続性免疫応答の誘導において膣投与よりも経鼻投与がより有効であることが報告されている。Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００２），Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（５）：２６５−６８。あるいは、ＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストおよび／または抗原は、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内または腹腔内に注射可能である。いくつかの態様において、抗体のごときＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストは注射可能であり、そして抗原は直接的に粘膜表面へ投与可能である。
【０１２８】
本発明の実施のために適した抗原には、任意の感染性病原体の全部もしくは一部、または感染性病原体に類似している病原体が含まれる。感染性病原体は、生きているまたは殺されたウイルス、細菌、およびアメーバ、鞭毛虫または蠕虫のごとき感染性真核動物を含むことが可能である。こうした感染性病原体に類似している病原体は、例えば、ワクチン接種されている哺乳動物へ感染可能なウイルスに類似しているが、しかし、それ自身ではワクチン接種されている哺乳動物へ感染できないウイルスであることができる。この例は、ワクチニアウイルス（ウシにおいては疾患を生じることが可能であるが、ヒトでは疾患を生じない）であり、それは天然痘（ヒトに疾患を生じる類似のウイルス）に対するワクチンを産生するためにジェンナーにより使用された。Ｊａｎｅｗａｙら、上記文献、第５部、第１４章。表４は本発明を実施するために使用可能である、抗原の具体例を示している。
【０１２９】
【表４】

【０１３０】
【表５】

【０１３１】
あるいは、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を、自己免疫または炎症性疾患に関係づけられている抗原に対する寛容を促進するために使用可能である。例えば、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症に多くの点で類似している状態を、例えば、ミエリン塩基性タンパク質またはミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）の多様なエピトープの注射により齧歯動物で誘導可能である。ＭＯＧ誘導ＥＡＥは、いくつかの場合において、ＭＯＧまたはブチロフィリンの少量を前もって給餌することにより寛解可能である。Ｓｔｅｆｆｅｒｌら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：２８５９−６５。可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、抗原に対する寛容性を促進し、そしてそれにより自己免疫疾患の症状を寛解するため、自己免疫疾患において標的とされていることが知られている抗原と同時投与することが可能である。所望により、抗原は、例えば、経鼻的に粘膜表面へ直接投与することが可能である。
【０１３２】
クローン病および潰瘍性大腸炎を含んだ炎症性腸疾患は、胃腸管の慢性炎症を含んでおり、多分、正常腸管フローラ（ｆｌｏｒａ）の抗原に対する異常に促進された免疫応答のせいであろう。両方の疾患とも、発生は家族で集中発生する傾向があり、そしていくつかの遺伝子マーカーと関係づけることが可能であるので、少なくともいくらかの遺伝子的基盤を有しているようである。例えば、多薬剤耐性遺伝子（ｍｄｒ１ａ）を発現しないマウスは自然発症的に大腸炎を発生する。Ｐａｎｗａｌａら（１９９８），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７３３−４４。クローン病および潰瘍性大腸炎両方の発生は、都市化した集団中で増加した発生が観察されるので、環境的因子にも影響されるようである。また、こうした疾患は、正常腸管フローラの非存在下では発生しない。
【０１３３】
クローン病には、口から肛門までの消化管のいずれかの部分の異常炎症が含まれるけれども、ほとんどの患者の異常炎症は回結腸、小腸および結腸−肛門直腸領域に限られている。典型的には、炎症は不連続である。共通の症状には、腹部痛、食欲不振、体重減少、発熱、下痢、腹部右下４分部位におけるふくらみおよび圧痛、便秘、嘔吐および肛門周囲不快および放出が含まれる。他の可能な症状には、なかでも、末梢関節炎、成長遅延、上強膜炎、アフタ性口内炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、腎結石、尿希釈およびアルカリ化障害、吸収不良および胆石が含まれる。例えば、Ｓｔｒｏｂｅｒら，「Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」，第１０版，ＩＩＩ節，第３５章（２００１）；「Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」，第１７版，３節，第３１章，（１９９９）、を参照されたい。クローン病の患者から単離されたマクロファージは、増量されたＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＴＨＦαおよび他の炎症性サイトカインを産生する。
【０１３４】
潰瘍性大腸炎は、しばしばクローン病と区別するのが難しいが、いくつかの点でクローン病とは性質が異なっている。第一に、それは一般に結腸に限定され、一方、クローン病は消化管を通して発生することができる。第二に、クローン病においては炎症が腸管または消化管の他の位置での壁を通してずっと入り込むことが可能であるのとは違って、潰瘍性大腸炎は主として腸管の浅層のみの炎症を含んでいる。最後に、潰瘍性大腸炎は、クローン病で典型的な炎症の非連続的部位よりもむしろ、炎症の連続的領域を典型的には含んでいる。クローン病同様に、潰瘍性大腸炎は主として都市領域で観察される。また、家族性集積の場合があるので、遺伝子的因子も潰瘍性大腸炎において役割を演じているらしい。自己抗体は、潰瘍性大腸炎患者において、クローン病患者よりもより頻繁に観察される。自己抗体はしばしば結腸上皮細胞成分に方向付けられる。最も普通であるのは、カタラーゼ、α−エノラーゼおよびラクトフェリンに特異性を有する、抗好中球細胞質抗体である。いくつかの場合、抗体は結腸微生物と交差反応する。
【０１３５】
潰瘍性大腸炎の症状は色々である。これらは、下痢、しぶり、腹部痙攣、便中の血液および粘液、発熱および直腸出血を含むことができる。結腸が６センチメーターを超えて拡張し、そしてその筋肉が緊張を失うおよび／または穿孔が起こってもよい、生命を脅かす可能性のある中毒性巨大結腸症もまた発生してもよい。潰瘍性大腸炎に伴ってもよい他の症状には、末梢関節炎、強直性脊髄炎、仙腸骨炎、前部ブドウ膜炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、上強膜炎、自己免疫肝炎、原発性硬化性胆管炎、硬変症、および小児における成長および発育遅延を含むことができる。
【０１３６】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する抗体またはインビトロ選択結合タンパク質は、炎症性腸疾患の発症を診断または予測するために使用可能である。下記実施例４に例示したように、炎症性腸疾患のモデルマウスにおいて、ＢＴＬ−ＩＩは、腸管において症状の発症に先立って、そして症状相の間に過剰発現される。従って、ＢＴＬ−ＩＩの過剰発現は、炎症性腸疾患の存在を示すことが可能であり、そしてその発症を予測可能である。抗ＢＴＬ−ＩＩ抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイまたは当該技術分野では既知の他の免疫に基づいたアッセイを使用し、患者の腸管からの組織試料をアッセイすることにより、ＢＴＬ−ＩＩの過剰発現を検出するために使用可能である。例えば、Ｒｅｅｎ（１９９４），酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ），「Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，」中， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：４６１−４６６、を参照されたい。過剰発現はまた、当該技術分野では既知のｍＲＮＡ発現アッセイのなかでも、例えば、逆転写プラスＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のごとき、ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡ発現を測定するための、核酸に基づいた方法によっても検出可能である。例えば、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９０），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９（４５）：１０３５１−５６、を参照されたい。
【０１３７】
別の態様において、本発明の可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、炎症性腸疾患を処置するために使用可能である。可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、Ｂ細胞またはＴ細胞上に発現される特異的レセプターへ結合可能であり、それにより免疫応答の下方調節を可能にしている。こうした下方調節は、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によりマクロファージまたはＢ細胞の活性化を防止すること、または抗原によりＴ細胞の活性化を防止することが可能である。あるいは、こうした下方調節は、Ｔ細胞が、Ｔ細胞レセプターが特異的に結合可能な抗原に遭遇した場合、Ｔ細胞が反応不顕性（ａｎｅｒｇｉｃ）になることを起こすことが可能である。
【０１３８】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する抗体またはインビトロ選択結合タンパク質はまた、炎症性腸疾患を患った、または炎症性腸疾患を発生する危険性のある患者を同定するための診断試薬としての使用も見いだせる。マウスモデルシステムにおいて、ＢＴＬ−ＩＩは炎症性腸疾患症状の発症に先立ってそしてその間に過剰発現されるので（実施例４）、ＢＴＬ−ＩＩ発現の異常に高いレベルは、腸管における炎症性疾患の存在、または腸管において炎症性疾患を発生する高い危険性を示すことが可能である。
【０１３９】
加えて、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、移植（Ｍａｎｉｌａｙら，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５３２−５３８）、移植片対宿主疾患、移植片拒絶、自己免疫または炎症性疾患、遺伝子治療（Ｈａｃｋｅｔｔら，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２：３７６−３８２）などのごとき、免疫応答の下方調節が望まれる状態において有用であり得る。例えば、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、哺乳動物への遺伝子治療ベクターの投与、移植、または所望の免疫抑制が適切な別の状態に先だって、ほとんど同時に（またはすぐ前かすぐ後に）、または同時に投与可能である。またこうした処置に適切であるのは、ＢＴＬ−ＩＩの機能を模倣した抗イディオタイプ抗体である。
【０１４０】
アゴニストＢＴＬ−ＩＩ抗体、可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または抗イディオタイプ抗体は、検出可能自己抗体の数を減少させるため、免疫エフェクター細胞の活性化を減少させるため、および／または疾患の症状を軽減または除去するため、自己免疫または炎症性疾患を患っている患者へ投与可能である。自己免疫および炎症性疾患には、患者自身の組織が患者の免疫系により引き起こされる有害な効果を受けやすい、すべての状態が含まれる。こうした効果は、可能性のなかでも、自己抗体により、および／または免疫エフェクター細胞の活性化により仲介可能である。自己免疫および炎症性疾患の原因は通常明らかではないが、多様な種類の感染と多様な自己免疫疾患の間の相関がいくつかの場合に確立されており、そして科学論文における議論の繰り返される主題である。例えば、Ｃｏｒａｐｃｉｏｇｌｕら（２００２），Ｔｈｙｒｏｉｄ １２：６１３−１７；Ｓｅｗｅｌｌら（２００２），Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．８２：１０１−１０；Ｒｏｓｅ（１９９８），Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（１）：５−１３；Ｍａｔｓｉｏｔａ−Ｂｅｒｎａｒｄ（１９９６），Ｃｌｉ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０４：２２８−３５；およびＭｃＭｕｒｒａｙおよびＥｌｂｏｕｎｅ（１９９７），Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２６：６９０−７０１、を参照されたい。
【０１４１】
当業者は、自己免疫および炎症性疾患の症状が非常に広範で、そしてどの組織が患者の免疫系の標的にされているかに依存可能なことを認識するであろう。自己免疫および炎症性疾患は器官特異的または全身的であり得る。自己免疫および炎症性疾患には、多くの中でも、例えば、関節炎、アジソン病、インシュリン依存性糖尿病（タイプＩ糖尿病）、喘息、多発性内分泌障害症候群、全身性紅斑性エリテマトーデス、慢性活性肝炎、多様な形の甲状腺炎（ハシモト甲状腺炎、一過性甲状腺炎症候群およびグレーブス病を含んで）、リンパ球性腺下垂体炎、早期卵巣不全、特発性フィオパラサイロイディズム、悪性貧血、腎炎、自己免疫好中球減少症、グッドパスチャー症候群、多発性硬化症、白斑、重症筋無力症、リューマチ様関節炎、強皮症、原発性シェーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫溶血性貧血、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含んで）、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎、自己免疫血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、急性リウマチ熱、混合本態性クリオグロブリン血症、および中程度自己免疫溶血性貧血が含まれる。
【０１４２】
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の核酸を含んでいるベクター、ならびにこうしたベクターで形質転換した宿主細胞も提供する。本発明の核酸のいずれも、一般に選択可能マーカーおよび宿主中での増殖のための複製起点を含むベクターを含むことができる。ベクターはさらに、機能可能であるようにＢＴＬ−ＩＩ核酸に連結された、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子からのもののごとき、適した転写または翻訳調節配列を含んでいる。こうした調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および転写および翻訳を制御する適切な配列が含まれる。調節配列が、標的タンパク質をコードしているＤＮＡへ機能的に関連している場合、ヌクレオチド配列は機能可能なように連結されている。それ故、もし、プロモーターヌクレオチド配列がＢＴＬ−ＩＩ配列の転写を方向付けるならば、プロモーターヌクレオチド配列はＢＴＬ−ＩＩ核酸配列へ機能可能なように連結されている。
【０１４３】
本発明の標的ＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしているＢＴＬ−ＩＩ核酸のクローニングのために適したベクターの選択は、ベクターが形質転換されるであろう宿主細胞、そして、当てはまる場合、標的ポリペプチドが発現されるべき宿主細胞に依存するであろう。ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、昆虫そしてより高等な真核生物が含まれ、その各々が以下に議論されている。
【０１４４】
こうした宿主細胞中で発現されるべきＢＴＬ−ＩＩタンパク質はまた、異種タンパク質からの領域を含む融合タンパク質であることができる。上で議論したように、こうした領域は、例えば、分泌、改良された安定性、容易にされた精製、標的化またはＢＴＬ−ＩＩのオリゴマー化を可能にするために含ませることができる。例えば、適切なシグナル配列をコードしている核酸配列を発現ベクター内へ取り込むことが可能である。シグナル配列（分泌リーダー）をコードしている核酸配列は、ＢＴＬ−ＩＩがシグナル配列を含んでなる融合タンパク質として翻訳されるように、ＢＴＬ−ＩＩ配列へインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合することができる。意図された宿主細胞内で機能的に可能であるシグナル配列は、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の細胞外分泌を促進することが可能である。異種シグナルペプチドは、天然のシグナル配列と置き換えることが可能である。哺乳動物宿主細胞中で機能的であるシグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のためのシグナル配列、Ｃｏｓｍａｎら（（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）により記載されているインターロイキン−２レセプターのためのシグナル配列；欧州特許第０ ３６７ ５６６に記載されているインターロイキン−４レセプターシグナル配列；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているタイプＩインターロイキン−１レセプターシグナル配列；欧州特許第０ ４６０ ８４６に記載されているタイプＩＩインターロイキン−１レセプターシグナル配列；ヒトＩｇＫのシグナル配列（それはＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧである）；およびヒト成長ホルモンのシグナル配列（それはＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡである）が含まれる。好ましくは、シグナル配列は、細胞からのＢＴＬ−ＩＩタンパク質の分泌と同時にＢＴＬ−ＩＩタンパク質から切断されるであろう。本発明の実施で使用可能である他のシグナル配列には、Ｓｆ９昆虫細胞中の、酵母α因子およびミツバチメラチンリーダーが含まれる。Ｂｒａｋｅ（１９８９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：２６９−２８０；Ｈｏｍａら（１９９５），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．６：１４１−１４８；Ｒｅａｖｙら（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．６：２２１−２２８。
【０１４５】
本発明のタンパク質の発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母、そしてより高等な真核生物細胞が含まれる。これらのポリペプチドの発現に使用されるのに適した原核生物宿主には、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属の細菌、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバーが含まれる。原核生物細胞中、例えば、大腸菌中での発現のためには、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子は、好ましくは、組換えポリペプチドの発現を容易にするために、Ｎ末端メチオニン残基を含んでいる。Ｎ末端Ｍｅｔは所望により発現されたポリペプチドから切断されてもよい。
【０１４６】
細胞性宿主中で使用するための発現ベクターは、一般に一つまたはそれより多くの表現型選択可能マーカー遺伝子を含んでなる。こうした遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるまたは栄養要求性要求を供給するタンパク質をコードしている。広範囲の種類のこうしたベクターは、商業源から容易に入手可能である。例には、ｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＳＰＯＲＴベクターおよびｐＰＲＯＥＸベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カールスバッド，ＣＡ），Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）が含まれる。
【０１４７】
ＢＴＬ−ＩＩはまた、サッカロミセス、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）およびクルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）を含む属からの酵母宿主細胞で発現可能である。好ましい酵母宿主は、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｒｉｓ）である。酵母ベクターはしばしば２μ酵母プラスミドからの複製配列起点、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含んでいるであろう。酵母および大腸菌の両方で複製可能なベクター（シャトルベクターと名付けられている）もまた使用することができる。酵母ベクターの上述の特性に加え、シャトルベクターはまた、大腸菌中での複製および選択のための配列を含んでいるであろう。酵母宿主中で発現された標的ポリペプチドの直接分泌は、ＢＴＬ−ＩＩコードヌクレオチド配列の５’末端に、酵母α因子リーダー配列をコードしているヌクレオチドの包含により達成することができる。Ｂｒａｋｅ（１９８９），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：２６９−２８０。
【０１４８】
昆虫宿主細胞培養系もまた、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の発現のために使用可能である。本発明のタンパク質は好ましくは、例えば、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７）による総説に記載されているような、バキュロウイルス発現系を使用して発現する。
【０１４９】
本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、哺乳動物宿主細胞においても発現可能である。適した哺乳動物宿主細胞の非制限例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（Ｇｌｕｚｍａｎら（１９８１），Ｃｅｌｌ ２３：１７５−１８２）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋら（１９５８），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ６０：１２７５−１２８１）ＣＶ−１（Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９７０），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５：２１−２７）およびヒト頚部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）が含まれる。
【０１５０】
本発明のＢＴＬ−ＩＩタンパク質の発現に適した発現ベクターの選択は、使用されるべき特別の哺乳動物宿主細胞に依存するであろう。適した発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＣ４０９（ＭｃＭａｈａｎら（１９９１），ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１−２８３２）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）が含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用するための発現ベクターは、ウイルスゲノムに由来する転写および翻訳制御配列を含むことが可能である。ＢＴＬ−ＩＩを発現するために使用可能な、普通に使用されるプロモーター配列およびエンハンサー配列には、限定されるわけではないが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス２、ポリオーマウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するものが含まれる。哺乳動物発現ベクターの構築法は、例えば、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０）、Ｃｏｓｍａｎら（（１９８６）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５−９４１）、Ｃｏｓｍａｎら（（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８−７７１）、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６およびＷＯ ９１／１８９８２、に開示されている。
【０１５１】
特定のベクター内への挿入を容易にするためのＢＴＬ−ＩＩ核酸の修飾（例えば、制限部位を修飾することにより）、特定の発現系または宿主における使用の容易さ（例えば、好ましい宿主コドンを使用して）などは既知であり、本発明での使用に意図されている。ＢＴＬ−ＩＩタンパク質の産生のための遺伝子操作法は、既知の方法に従った、無細胞発現系、細胞性宿主、組織および動物におけるポリヌクレオチド分子の発現を含んでいる。
【０１５２】
治療法
本明細書で言及したいかなる病気の“処置”も、疾患の少なくとも一つの症状の軽減、疾患の重度の軽減、または、いくつかの場合、疾患を伴うことができるより重度な症状への、または少なくとも一つの他の疾患への疾患進行の遅延または防止を包含している。処置は、疾患がすっかり治癒されることを意味する必要はない。有用な治療剤は、疾患の重度を軽減し、疾患またはその処置に付随する症状の重度を軽減し、または処置状態に続いていくらかの頻度で生じる可能性があるより重大な症状またはより重大な疾患の発症を遅延させることのみを必要とする。例えば、もし疾患が炎症性腸疾患であれば、治療剤は、腸管中の別々な部位の炎症の数を軽減し、影響を受けた腸管の全範囲を軽減し、痛みおよび／または膨潤を軽減し、下痢、便秘または嘔吐のごとき症状を軽減し、および／または腸管の穿孔を防止することができる。患者の状態は、バリウム浣腸または注腸に続いて実施されるＸ−線、内視鏡検査、大腸鏡検査および／または生検のごとき標準技術により評価可能である。適した方法は患者の状態および症状に従って変化する。
【０１５３】
本発明は、自己免疫疾患、移植片対宿主疾患および炎症性腸疾患を含んだ炎症性疾患を処置する方法を包含し、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または抗体の量を、特定の障害の重度または障害により引き起こされる症状の重度を反映する指標のベースラインを超えた持続性の改良を誘導するために、またはいくつかのまたは全ての場合において、処置された状態に続くより重大な疾患の発症を遅延させるまたは防止するために十分な時間使用する。本発明の処置は、問題とする障害のために通常使用する他の処置の前、後もしくは間に使用することができ、または他の処置なしでも使用することができる。例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎は通常、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸またはコルチコステロイドで処置する。これらの処置は、本発明の処置の前、間または後に使用することができる。
【０１５４】
上述の治療剤はいずれも組成物の形で、即ち、生理的に受容可能な坦体、賦形剤または希釈剤のごとき一つまたはそれより多くの追加の成分とともに投与可能である。例えば、組成物は本明細書に記載したような可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質に加えて、緩衝液、アスコルビン酸のごとき抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０より少ないアミノ酸を有しているもののごとき）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンのごとき炭水化物、ＥＤＴＡのごときキレート剤、グルタチオンおよび／または他の安定化剤、賦形剤および／または保存剤を含んでなる。組成物は液体または凍結乾燥物として処方することができる。医薬処方に用いることができる成分のさらなる例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，第１６版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，イーストン，Ｐａ．（１９８０）、に示されている。
【０１５５】
上述の治療分子を含んでなる組成物は、限定するわけではないが、非経口、局所、経口、経鼻、経膣、直腸または肺（吸入により）投与を含んだ任意の適切な手段により投与可能である。もし注射するならば、組成物は関節内、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内または皮下で、大量注射または連続的注入により投与可能である。経皮搬送および移植物からの徐放性放出、皮膚パッチまたは座剤であるような、局所投与（即ち、疾患の部位での）が意図される。吸入による搬送には、例えば、経鼻または経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形での吸入などが含まれる。体腔内へ挿入された座剤を経る投与は、例えば、選ばれた体腔中に固形の組成物を挿入し、そしてそれを融解させることにより達成可能である。炎症性腸疾患を処置するための可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質またはアゴニストの場合、治療剤が適切に局在化するので、直腸座剤を経た投与が特に適切であることができる。他の代替物には、点眼、錠剤、ロゼンジ、シロップおよびチューインガムのごとき経口製剤、そしてローション、ゲル、スプレーおよび軟膏のごとき局所製剤が含まれる。ほとんどの場合、ポリペプチドである治療分子は、局所的または注射により、または吸入により投与可能である。
【０１５６】
上述の治療分子は、処置されている状態を処置するため、有効であり得るいかなる量、頻度および期間でも投与可能である。用量は、治療分子の分子的性質および処置されている障害の性質に依存する。処置は、所望の結果を達成するために必要な限り続けることができる。本発明の治療分子は、可能な投与計画の中でも、単一用量として、または１日数回、毎日、１日おき、週２回、週３回、毎週、１週おき、および毎月用量を含んだ、定期的に与える一連の用量として投与可能である。処置の定期性は、処置の期間を通して一定であってもよいし、一定でなくてもよい。例えば、処置を最初は週間隔で行い、そして後では１週おきに行うことができる。日、週、月または年の期間を有する処置が本発明に包含される。処置を中断し、その後再び始めることもできる。維持用量を最初の処置の後で投与することができる。
【０１５７】
用量は、体重キログラム当たりのミリグラムとして（ｍｇ／ｋｇ）、または皮膚表面の平方メーター当たりのミリグラムとして（ｍｇ／ｍ^２）、または身長または体重に関係なく固定用量として計ることができる。これらの全ては、当該技術分野における標準容量単位である。ヒト皮膚表面面積は、標準式を使用して、身長および体重から計算する。
本発明を特定の例を参照して説明してきた。これらの例はいかようにも本発明を限定することを意味していない。十分に本発明の範囲内である、多様な変更および修飾を本発明に行うことができることは、本開示の目的のためには言うまでもない。多くの他の変更を行うことができることを当業者は容易に思いつくであろうが、それは本明細書に開示されている、そして付随する特許請求の範囲に定義されているように、本発明の精神に包含される。
【０１５８】
本明細書は多くの特許、特許出願および出版物の引用を含んでいる。すべての目的のため、各々は本明細書において援用される。
【０１５９】
実施例１：ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡの単離
ＲＮＡはいくつかの起源、クローン病または潰瘍性大腸炎患者からのヒト結腸組織試料、ヒト結腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＨＴＢ−３７）およびＴ８４と称される結腸上皮細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４８）、から単離した。ＲＮＡを逆転写し、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿０１９６０２に開示されている核酸配列に基づいて設計したプライマーを使用するＰＣＲにより増幅した。これにより、完全長ＢＴＬ−ＩＩの配列の上流部分（配列番号３）および配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５に開示されているスプライス変異体配列を得た。ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの３’末端を含んでいるｃＤＮＡの単離は、３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）、即ち、本質的にＦｒｏｈｍａｎら（（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（２３）：８９９８−９００２）のプロトコールを使用して達成した。３’ＲＡＣＥによるＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡの多くの変異体の分析から、可溶性タンパク質をコードする変異体は膜貫通ドメインを欠いていないことを明らかにした。図５ａ、６ａおよび７ａに示したように、変異体の多くがＢＴＬ−ＩＩ配列の多くの部位に配列多型を含んでいた（またはアリル変異体）。
【０１６０】
実施例２：マウスＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡの単離
マウスＢＴＬ−ＩＩ ｃＤＮＡは以下のように単離した。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してマウス結腸および小腸から単離し、そして、製造元の推奨に従って、ＤＮＡｓｅ Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、残余染色体ＤＮＡを除去した。精製ＲＮＡを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各々１ｍＭのｄＮＴＰ、２．５μＭランダムヘキサマープライマ一、ｌＵ／μｌ ＲＮＡｓｅ阻害剤、および２．５Ｕ／μｌ ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に単離されたＲＮＡを含んでいる反応混合物を使用して、ｃＤＮＡに転写した。反応混合物を２５℃で１０分、続いて４８℃で３０分、続いて９５℃で５分インキュベー卜した。ＢＴＬ−ＩＩ遺伝子のＰＣＲ増幅反応は、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、各々２００μＭのｄＮＴＰおよび２．５Ｕ ａｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、および両方２５ピコモルの上流（５’−ＴＴＡＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＧＧＧＣＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣ）および下流（５’−ＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣ）プライマー、を含んでいる１００μｌの最終容量で実施した。増幅反応は、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒および７２℃で４０秒を、３５サイクル実施した。増幅生成物は２％アガロースゲルで分析し、エチジウムブロミドにより可視化し、そして配列決定した。視覚的判断によると、エキソン３を欠くスプライス変異体（図９ａ）はエキソン１から８を含んでいる変異体（図８）よりも豊富であった。
【０１６１】
実施例３：多様な起源の細胞および組織中でのＢＴＬ−ＩＩの発現
ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの発現は、本質的にＨｅｉｄら（（１９９６），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６（１０）：９８６−９４）のプロトコールに従ったリアルタイムＰＣＲを使用し、そして後にＰＣＲが続く標準逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ；例えば、Ｆｕｑｕａら（ｌ９９０），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ９（２）：２０６−１１、を参照されたい）を使用して測定した。試験された全ての細胞型は、マウスからであるバイエル板からのＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ８^＋Ｂ２２０^＋（または形質球様）樹状細胞を除いて、ヒト起源であった。ＢＴＬ−ＩＩ発現が検出された細胞は以下のものである：非刺激または殺したスタフィロコッカス アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ＣＤ４０リガンドおよびインターロイキン４で刺激したヒトＢ細胞；インターフェロンγで刺激した正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＥＢＥ細胞；Ｌｅｃｈｅｒら（１９８３），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３（１２ｐｔ．１）：５９１５−２１、を参照されたい）；Ｃａｌｕ−３細胞、肺上皮細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−５５）、非刺激；Ｔ８４、結腸上皮細胞株、非刺激またはインターフェロンγで刺激；Ｃａｃｏ−２細胞、ヒト結腸癌細胞株、非刺激；マウスパイエル板からのＣＤ１１ｃ^＋（低発現）ＣＤ８^＋Ｂ２２０^＋細胞、それは主に樹状細胞である；およびマウス末梢血リンパ球。絶対スケール上、発現は、試験されたほとんどの細胞で低かった。ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの発現は、樹状細胞型への分化を誘導するため、ヒト末梢血単球のインビトロ処理から生じた樹状細胞では検出されなかった。しかしながら、ヒト末梢血から精製された、ヒト血液から精製されたＣＤ１２３^＋形質球様樹状細胞では、ＢＴＬ−ＩＩ発現を検出した。ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡは、パイエル板からのマウス樹状細胞のＣＤ１１ｃ^＋（低発現）ＣＤ８^＋Ｂ２２０^＋サブセットにおいて高度に濃縮されていた。ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡ発現を、脾臓、リンパ節、胃、腸管膜リンパ節、骨髄、小腸、盲腸、肺、大腸、パイエル板および胸腺を含んだ多くのマウス組織型で、同様の方法により検出した。最も高いレベルの発現は、小腸、パイエル板および盲腸組織で検出した。
【０１６２】
実施例４：炎症性腸疾患のためのマウスモデルにおけるＢＴＬ−ＩＩの発現
ｍｄｒ１ａ−／−マウスは、慢性炎症性腸疾患の研究のモデルシステムとなり得る。Ｐａｎｗａｌａら（１９９８）,Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：５７３３−４４。マウス多薬剤耐性遺伝子、ｍｄｒ１ａは、腸上皮細胞およびリンパ様細胞を含む多くの組織において発現される、１７０ｋＤａ膜貫通タンパク質をコードしている。ｍｄｒ１ａを欠失しているマウスは、調節不全の上皮細胞成長および大腸の粘膜固有層内への大量白血球湿潤により特徴付けられる、重度の自発的腸炎症を発生しやすい。経口抗生物質でｍｄｒ１ａ− ／−マウスを処置すると、疾患の発生を防止し、そして活性な炎症を消散させる。活性な大腸炎を有するマウスから単離されたリンパ様細胞は、腸細菌抗原に対する促進された反応性を示した。ｍｄｒ１ａは上皮細胞および白血球の両方により発現されるけれども、大腸炎の発生は、上皮細胞上でのｍｄｒ１ａ発現の欠損と相関する。
【０１６３】
使用されたｍｄｒ１ａ−／−マウスは、ＦＶＢ遺伝子バックグラウンドであった。典型的には、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの群の約２０％が、１８から２０週齢で大腸炎を自発的に発生し、一方、ｍｄｒ１ａ−／−マウスの残りのマウスは健康に残存し、そして大腸炎を発生しない。疾患を発生した動物のパーセンテージは、動物施設の清潔度に依存している。
【０１６４】
最初に、ＲＮＡを腸管組織から調製し、逆転写後に、得られたｃＤＮＡ内へ蛍光標識を取り込ませ、使用して、Ｓｔａｍｍｅｒら（（２０００），Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５１：３７３−３４２）により発表されている配列に基づき、ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡを検出するために設計されたオリゴヌクレオチドを含んでいる、注文製作のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップ上のプローブのアレイヘハイブリダイズさせた。ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの過剰発現を、炎症性腸疾患症状の発症前および症状の間の両方で、ｍｄｒ１ａ−／−マウスにおいて検出した（ＦＶＢ株の野生型個体と比較して）。こうしたデータの実例は、図１０に示されている。これらのデータは、ＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡは野生型ＦＶＢ マウスよりもｍｄｒ1ａ−／−マウスにおいてより大きな程度で発現されていることを示している。さらに、より高いＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの発現が、炎症性腸疾患の症状の発症に伴っている。
【０１６５】
これらの結果は、リアルタイムＰＣＲ技術（Ｈｅｉｄら（１９９６），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６（１０）：９８６−９４）を使用する、同一ＲＮＡの分析により確認した。この分析は、２匹の健康な野生型ＦＶＢマウスと比較して、２匹の症状性ｍｄｒ１ａ−／−マウスによるＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの過剰発現を示した。このデータは図１１に図示されている。２匹の親マウスは、図１１の向かって左の対角の縞で印を付けられた２本の棒線で示されており、２匹の症状性ｍｄｒ１ａ−／−は、図１１の向かって右の市松模様（ｃｈｅｃｋｅｒｅｄ ｐａｔｔｅｒｎ）で印を付けられた２本の棒線で示されている。これらのデータは、野生型および症状性ｍｄｒ１ａ−／−マウス間の発現に約２から５倍の相違が存在することを示している。従って 、症状のない野生型マウスよりも、より高いレベルのＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡが炎症性腸疾患の症状を有するマウスで発現されている。
【０１６６】
実施例５：ＢＴＬ−ＩＩ：ＦＣ融合タンパク質の構築
ヒトＦｃ領域へ融合されたマウスＢＴＬ−ＩＩの細胞外領域から成る可溶性ＢＴＬ−ＩＩタンパク質（ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ）は以下の方法で製造した。ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃをコードしている融合ｃＤＮＡ構築物は、マウスＢＴＬ−ＩＩの細胞外領域をコードしている核酸を、ヒトＩｇＧ１をコードしている核酸へ融合することにより（インフレーム）製造した。ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃタンパク質を製造するため、哺乳動物細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ^ＴＭ２０００トランスフェクション法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールスバッド，カリフォルニア，米国）を使用して、融合ｃＤＮＡでトランスフェクトした。ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃタンパク質含有上清は、トランスフェクション６−７日後に収集し、そしてＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃタンパク質は、プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製した。ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃタンパク質をコードしている核酸配列およびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃアミノ酸配列は、各々配列番号１９および配列番号２０にみられる。
【０１６７】
実施例６：ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃによるヒトＴ細胞増殖の抑制
以下の実験は、ＢＴＬ−ＩＩの可溶性形が、他の同時刺激性分子とともに、またはなしで、モノクローナル抗ＣＤ３ε抗体に応答して、インビトロでのＴ細胞増殖を抑制可能かどうか試験している。
【０１６８】
ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃは実施例５に記載したように作製した。９６ウェル、Ｕ底マイクロタイタープレートを、一つまたはそれより多くの他のタンパク質とともに、またはなしで、濃度を変化させた抗ＣＤ３ε抗体で被覆した。図１２は、以下のような、何のタンパク質が各々の試料に使用されたかを示している：抗ＣＤ３ε抗体単独、
【０１６９】
【化１】

【０１７０】
；抗ＣＤ３ε抗体およびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０１７１】
【化２】

【０１７２】
；抗ＣＤ３ε抗体およびＢ７ＲＰ−１：Ｆｃ、
【０１７３】
【化３】

【０１７４】
；抗ＣＤ３ε抗体、Ｂ７ＲＰ−１：ＦｃおよびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０１７５】
【化４】

【０１７６】
；抗ＣＤ３ε抗体およびＢ７−２：Ｆｃ、
【０１７７】
【化５】

【０１７８】
；抗ＣＤ３ε抗体、Ｂ７−２：ＦｃおよびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０１７９】
【化６】

【０１８０】
。
Ｂ７ＲＰ−１：Ｆｃは、抗体のＦｃ領域へ融合されたＢ７ＲＰ−１の細胞外領域（Ｂ７ｈとして知られている）から成り、そしてＢ７−２：Ｆｃは、抗体のＦｃ領域へ融合されたＢ７−２の細胞外領域から成っている。これらのタンパク質の両方とも、抗原に応答するＴ細胞を変調することが知られているＢ７ファミリーのタンパク質のメンバーである。これらの融合タンパク質は、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス，ミネソタ，米国）のごとき商業的製造供給元から購入することが可能であり、またはＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃタンパク質のために実施例５に記載したように単離可能である。Ｂ７−２はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、そしてＢ７ＲＰ−１は、Ｂ７−Ｈ２／Ｆｃの名前でＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能であるが、本質的に実施例５で記載したように作製した。マイクロタイタープレートウェルは、一つまたはそれより多くのタンパク質（それはＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）、Ｂ７ＲＰ１：Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）および／またはＢ７−２：Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ）である）とともにまたはなしで、図１２に示された抗ＣＤ３ε抗体の濃度を含んでいる、１００μｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加えることにより被覆した。プレートは４℃で一夜インキュベートし、その後ＰＢＳで２回洗浄した。ヒトＴ細胞は、磁気的標識により機能し、そしてＣＤ４^＋Ｔ細胞以外の末梢血細胞を枯渇させ、比較的純粋なもとのままのＣＤ４^＋Ｔ細胞の集団を生じる、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ）からのＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キットを使用して、ヒト末梢血単核細胞から精製した。約ｌｘｌ０^５精製Ｔ細胞を、２００μｌの容量の培養培地（ｌ０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ）中で各々のウェルへ加えた。細胞を総計で７２時間インキュベートした。６４時間目、１μＣｉの^３Ｈ−チミジンを各々のウェルに加えた。７２時間終了後、取り込まれなかったチミジンは、細胞をフィルター上に沈着し、そして培養培地を洗い流す、自動細胞収穫器（Ｔｏｍｔｅｃ，ハムデン、コネチカット，米国、から得た）を使用して除去した。その上に細胞を含むフィルターは次ぎに、どのくらいの放射活性を細胞が取り込んでいたかを決定するため、シンチレーションカウンター中でカウン卜した。結果は図ｌ２ａおよび１２ｂに示されており、それらは、図１２ａが対数目盛りであり、図１２ｂは直線目盛りであることのみが、異なっている。
【０１８１】
結果は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃが、抗ＣＤ３ε抗体により誘導されるＴ細胞増殖を抑制可能であることを示している。図１２ａおよび図１２ｂ。図１２ａにおいて、試験された最も高い抗体濃度では、ＢＴＬ−ＩＩプラス抗ＣＤ３ε抗体
【０１８２】
【化７】

【０１８３】
を含んでいる試料は、抗ＣＤ３ε抗体のみ
【０１８４】
【化８】

【０１８５】
を含んでいる試料よりも増殖が悪かった。さらに、Ｂ７−２
【０１８６】
【化９】

【０１８７】
およびＢ７ＲＰ−７
【０１８８】
【化１０】

【０１８９】
の両方とも抗ＣＤ３ε抗体誘導Ｔ細胞増殖を刺激することは明らかである。Ｂ７−２：Ｆｃ添加によるＴ細胞増殖の効果を見るために必要とされる抗ＣＤ３ε抗体の濃度は、Ｂ７ＲＰ−１：Ｆｃの添加による同様の効果を見るために必要とされる濃度よりも低い。さらに、ＢＴＬ−ＩＩはまた、Ｂ７−２：Ｆｃ
【０１９０】
【化１１】

【０１９１】
およびＢ７ＲＰ−１：Ｆｃ
【０１９２】
【化１２】

【０１９３】
の添加に応答した、この増強されたＴ細胞増殖も抑制することが可能である。Ｂ７−２：Ｆｃプラス抗ＣＤ３ε抗体により誘導された増殖に対するＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃの効果は、試験された抗ＣＤ３ε抗体の最も低い濃度でのみ明らかであり、一方 、Ｂ７ＲＰ１：Ｆｃにより誘導された増殖に対するＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃの効果は、試験された三つのより高い濃度でより明白である。従って、観察された効果は、抗ＣＤ３ε抗体の濃度に依存している。
【０１９４】
図１３は、ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃによるヒトＴ細胞増殖の抑制はまた、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ濃度にも依存していることを示している。実験は、上述のように、ただし、抗ＣＤ３ε抗体濃度を０．５μｇ／ｍｌで一定に保って実行した。ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ濃度は、図１３に示されているように、０から１０μｇ／ｍｌへ変化させた。図１３に示されている結果は、抗ＣＤ３ε誘導Ｔ細胞増殖の抑制が、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃの濃度に依存していることを示している。
【０１９５】
実施例７：ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃはマウスＴ細胞増殖を抑制する
この実験は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃがマウス、並びにヒトＴ細胞の増殖を抑制できるかどうかを決定するために行われた。Ｔ細胞増殖アッセイは、本質的に実施例６に記載したように行われ、ただし、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ）から購入された磁気マイクロビーズを使用して精製されたマウスＴ細胞がヒトＴ細胞の代わりに使用された。トランスフェクトＣＨＯ細胞から作製された、ヒトＦｃ領域から成るタンパク質が対照として働いた。ウェルは、図１４に示した濃度の抗ＣＤ３ε抗体単独
【０１９６】
【化１３】

【０１９７】
で、または、抗ＣＤ３ε抗体プラス１０μｇ／ｍｌのＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ
【０１９８】
【化１４】

【０１９９】
かまたは１０μｇ／ｍｌのヒトＦｃ領域から成るタンパク質
【０２００】
【化１５】

【０２０１】
で被覆した。結果は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃは抗ＣＤ３ε抗体に応答したマウスＴ細胞増殖を抑制できたが、ヒトＦｃ領域から成るタンパク質単独では抑制できなかったことを示している。図１４。
【０２０２】
実施例８：ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃはマウスＢ細胞増殖を抑制しない
以下の実験は、ヒトＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃが、ＴＡＬＬ−１およびＩｇＭ抗体により誘導されるマウスＢ細胞の増殖を阻害できるかどうかを決定するために設計された。実験は本質的に、Ｋｈａｒｅら（（２０００），Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７（７）：３３７０−７５）に記載されているように実行した。簡単には、マウスＢ細胞は、最初に密度勾配遠心分離によりリンパ球を精製し、次ぎにリンパ球は、単球／マクロファージおよびＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞を除去するＢ細胞カラム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ，ウエストベリー,ＮＹ）を通過させることにより、脾臓から精製した。１０％熱不活性化ウシ胎児血清を加えたＭＥＭ中の約１ｘｌ０^５精製Ｂ細胞を、ヤギＦ（ａｂ’）_２抗マウスＩｇＭ（２μｇ／ｍｌ）、ヒトＴＡＬＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）とともに、またはなしで、９６ウェルマイクロタイタープレート中、３７℃にて４日インキュベー卜した。^３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）は、インキュベーションの最後の８時間の間に加えた。４日の終了時に、実施例６に記載したように細胞を採取し、シンチレーションカウンターでカウントした。図１５の印付けは、以下の細胞およびタンパク質の組み合わせを示している：Ｂ細胞単独、
【０２０３】
【化１６】

【０２０４】
（これは図１５に示したグラフ上、最も左の棒線であるが、検出可能なシグナルは存在しない）；Ｂ細胞プラスＴＡＬＬ−１、
【０２０５】
【化１７】

【０２０６】
；Ｂ細胞プラス抗ＩｇＭ抗体、
【０２０７】
【化１８】

【０２０８】
；Ｂ細胞プラスＴＡＬＬ−１および抗ＩｇＭ抗体、
【０２０９】
【化１９】

【０２１０】
；並びにＢ細胞プラスＴＡＬＬ−１、抗ＩｇＭ抗体およびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０２１１】
【化２０】

【０２１２】
。結果は、ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃはＴＡＬＬ−１および抗ＩｇＭ抗体により誘導されたＢ細胞の増殖には効果がないことを示している。図１５。それ故、ＢＴＬ−ＩＩはＴ細胞の増殖を阻害するが、Ｂ細胞の増殖は阻害しないと思われる。
【０２１３】
実施例９：Ｔ細胞によるサイトカイン産生に対するＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃの効果
以下の実験は、ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃがＴ細胞によるサイトカイン産生に対して効果を有するかどうかを決定することを目的にしている。Ｔ細胞を精製し、マイクロタイタープレートを実施例６に記載したようにタンパク質で被覆した。約１ｘ１０^５の細胞を、２００μｌ容量の培地（１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ）を含む各々のウェルへ加えた。細胞は、３７℃で６４時間インキュベートした。次ぎに、サイトカイン濃度を決定するために１５０μｌを除き、各々のウェル中に残っている５０μｌへ ^３Ｈ−チミジンを加えた。マイクロタイタープレートは続いてさらに３７℃で追加の８時間インキュベートし、続いて洗浄し、増殖の違いを確かめるため、実施例６に記載したようにカウントした（図１６ａに示されている）。何のタンパク質がウェルを被覆するために使用されたかを示す印付けは、図１２ａおよび図１２ｂの通りである（実施例６に説明されている）。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、インターロイキン２（ＩＬ２）およびインターロイキン５（ＩＬ５）の濃度は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．の系列であるＭＳＤ，ガイサースブルグ，メリーランド ，米国）により販売されている多サイトカインの同時検出のための、電気化学に基づいたイムノアッセイシステムを使用して決定した。この種のサイトカイン検出の原理および操作は、例えば、Ｓｅｎｎｉｋｏｖら（２００３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７５：８１−８８、に説明されている。サイトカイン量の単位は、ＭＳＤの機械により発生された読み取り値から採られた。培地中のサイトカインの実際の濃度は、既知の濃度のタンパク質で発生させた検量線との比較なしでは、このデータから決定することはできず、それはこの特定の実験では付随していない。しかしながら、単一の実験内での読み取り値間の比較は、対照対実験試料に存在するサイトカインの相対量を提供することが可能である。
【０２１４】
結果は図１６ａ−１６ｄに示されている。図１６ａは、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃは、抗ＣＤ３ε抗体または抗ＣＤ３ε抗体プラスＢ７ＲＰ−１：Ｆｃに応答した増殖を阻害するが、使用された抗ＣＤ３ε抗体の濃度では、抗ＣＤ３ε抗体プラスＢ７−２：Ｆｃに応答した増殖は阻害しないことを示している。しかしながら、実施例６で指摘したように（図１２ａおよび図１２ｂ）、より低い抗ＣＤ３ε抗体濃度、即ち、０．１μｇ／ｍｌでは、抗ＣＤ３ε抗体プラスＢ７−２：Ｆｃに応答した細胞増殖が、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃにより阻害される。ＩＦＮγ、ＩＬ２およびＩＬ５の産生は、抗ＣＤ３ε抗体単独で被覆されたウェルにおいては低く、そしてＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃの添加は、さらに有意にはそれを減少させなかった。図１６ａ−１６ｄ。抗ＣＤ３ε抗体へのＢ７ＲＰ−ｌ：ＦｃかまたはＢ７−２：Ｆｃの添加に応答したＩＦＮγ産生の増加は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃにより阻害された。図１６ｂ。加えて、抗ＣＤ３ε抗体へのＢ７−２：Ｆｃの添加に応答したＩＬ２およびＩＬ５産生の増加は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃにより阻害された。図１６ｃおよび１６ｄ。試験された濃度では、抗ＣＤ３ε抗体へのＢ７ＲＰ−１：Ｆｃの添加は、ＩＬ２またはＩＬ５産生を評価できるほどは増加させなかった。図１６ｃおよび１６ｄ。これらの結果は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃが、抗ＣＤ３ε抗体プラスＢ７−２：ＦｃかまたはＢ７ＲＰ−１：Ｆｃの組み合わせに応答した、少なくともいくつかのサイトカインの産生を阻害できることを示している。
【０２１５】
実施例１０：ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃによるＴ細胞の処置は、大量細胞死を生じさせない
以下の実験は、ＢＴＬ−ＩＩ：ＦｃによるＴ細胞増殖の阻害が大量細胞死を伴うかどうかを決定するために行われた。Ｔ細胞増殖アッセイは本質的に実施例６に記載したように実施したが、ただし細胞は^３Ｈ−チミジンでは標識しなかった。細胞は培養７２時間後に、血球計数器でカウントし、そして細胞生存度は、トリパンブルー染色により決定した。マイクロタイタープレートウェルを被覆するために使用したタンパク質は、実施例６で説明し、そして図１２ａおよび図１２ｂに示されているように図１７でも示されている。抗ＣＤ３ε抗体は２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。結果は、各々のウェル中の死亡細胞の数は、ウェルを被覆するために使用されたタンパク質に関わらず、約０．５ｘｌ０^４から０.７５ｘｌ０^４細胞の範囲であったことを示している。図１７。それ故、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ存在下で観察された細胞増殖の相違は、ＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃの実質の毒性効果を反映していない。
【０２１６】
実施例１１：マウスＢＴＬ−ＩＩはマウスＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳまたはＰＤ−１とは結合しない
以下の組の実験は、ＢＴＬ−ＩＩが他のＢ７タンパク質の、いくつかの既知の結合パートナーの一つと結合するかどうかの疑問に取り組んでいる。例えば、Ｂ７ＲＰ−１はＩＣＯＳと結合することが知られており（Ｙｏｓｈｉｎａｇａら（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ４０２：８２７−３２）、ＣＤ８０（Ｂ７−１とも称されている）は、ＣＤ８６（Ｂ７−２とも称されている）が行うように、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８へ結合することが知られている、例えば、ＳｈａｒｐｅおよびＦｒｅｅｍａｎ（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：１１６−２６）、そしてＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１へ結合することが知られている（Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（３）：２６１−６８）。
【０２１７】
実験は以下のように行った。第一に、Ｂ７タンパク質へ結合することが知られているタンパク質の細胞外領域に加えてヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域を含んでなる融合タンパク質を得た、または単離した。ヒト抗体のＦｃ領域に加えてマウスＣＤ２８（ｍＣＤ２８−ｈｕＦｃ）かまたはマウスＰＤ−１（ＰＤ１−ｈｕＦｃ）の細胞外領域を含んでなる融合タンパク質は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス，ミネソタ，米国）から購入した。他の二つのＢ７結合タンパク質（ＣＴＬＡ４−ｈｕＦｃおよびＩＣＯＳ−ｈｕＦｃ）もまたＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能であるが、以下のように作製した。マウスＣＴＬＡ４の細胞外領域をコードしているｃＤＮＡおよびマウスＩＣＯＳの細胞外領域をコードしている別のｃＤＮＡを、哺乳動物細胞での発現に適したベクター中のヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域をコードしているｃＤＮＡへ各々融合させた。これらの構築物の各々の細胞をトランスフェクトのために使用し、そして融合タンパク質は、プロテインＡクロマトグラフィーにより、トランスフェクトされた細胞の培養培地から精製した。
【０２１８】
三つのマウスｃＤＮＡの各々の完全長バージョン（ＢＴＬ−ＩＩ、Ｂ７ＲＰ−１、ＣＤ８０をコードしている）を発現に適したベクター内へ挿入した。これらの構築物の各々の約１０μｇを、空ベクターと共に、トランスフェクト２９３細胞に対して別々に使用した。トランスフェクション２日後、四つのトランスフェクションの各々から約１００万細胞を、上述の融合タンパク質の各々で染色した。結合したタンパク質は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に対する蛍光標識抗体を使用して検出した。染色細胞はＦＡＣＳにより分析した。結果は図１８に示されている。
【０２１９】
予測されるように、空ベクターでトランスフェクトされた細胞（図１８の上段）は、四つの融合タンパク質のいずれによっても染色されなかった。マウスＢＴＬ−ＩＩでトランスフェクトされた細胞（図１８の二段目）は同様に挙動し、融合タンパク質のどれもＢＴＬ−ＩＩへ結合しないことを示している。予測されるように、マウスＢ７ＲＰ−１でトランスフェクトされた細胞はＩＣＯＳ−ｈｕＦｃで染色されたが、他の融合タンパク質のいずれでも染色されなかった。また予測されるように、マウスＣＤ８Ｏでトランスフェク卜された細胞はＣＴＬＡ４−ｈｕＦｃまたはｍＣＤ２８−ｈｕＦｃで染色されたが、ＩＣＯＳ−ｈｕＦｃまたはＰＤ−１−ｈｕＦｃでは染色されなかった。これらの結果は、ＢＴＬ−ＩＩは、四つのタンパク質、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＩＣＯＳおよびＣＤ２８（その各々はＢ７ファミリー中の少なくとも一つのタンパク質へ結合することが知られている）へ結合できないことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】図１は、ブチロフィリン様タンパク質のファミリーの、選択されたメンバーのドメイン構造を示している。選択されたタンパク質のほとんどは、以下に議論するＢ７サブファミリーのメンバーである。各々のタンパク質の名前は、その構造が描かれている図の左に示されている。“Ｉｇ様”ドメインは以下に説明するように、免疫グロブリン様ドメインである。“７”とラベルされたドメインは以下に説明するように、７アミノ酸反復領域である。 “ＴＭ” とラベルされたドメインは膜貫通ドメインである。白四角は未同定の細胞質ドメインであり、ドメインの特別なファミリーの一部である。“Ｂ３０．２” とラベルされたドメインは以下に説明するように、Ｂ３０．２ドメインである。ＢＴＬ−ＩＩタンパク質は本明細書において、四つのＩｇ様ドメインを有するように描かれているが、ＢＴＬ−ＩＩの形はまた、二つまたは三つのＩｇ様ドメインを有するものも存在する。Ｂ７−Ｈ３は四つのＩｇ様ドメインで描かれているが、それはまた二つのみのＩｇ様ドメインを含んでいる形でも存在する。
【図２】図２は、ヒトＢＴＬ−ＩＩ遺伝子およびｍＲＮＡの構造の図である。黒四角はエキソンを示している。四角の下に示されている水平線下の数字は、エキソンの配列番号３内の位置を示している。図の最下部の水平線は、細胞外ドメインおよび膜貫通および細胞質ドメイン（“ＴＭ／Ｃｙｔｏ”）をコードし、そして３’非翻訳領域（“３ＵＴＲ”）を形成している配列番号３の範囲を表示している。停止コドンは、日輪型（ｓｕｎｂｕｒｓｔ）または小さな爆発として記載することが可能な印により表示されている。
【図３ａ】図３ａは、ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡのスプライス変異体の、第一のカテゴリーの構造の図である。記号は、図２で説明したものと同じである。エキソン２および３にかぶっている大きなＸは、これらのエキソンが、スプライス変異体のこのカテゴリーでは失われていることを示している。
【図３ｂ】図３ｂは、配列番号３の一部（上のライン）と並列された、スプライス変異体の第一のカテゴリーのメンバーの代表的配列（下のライン）である。失われたエキソン２および３により創造されたギャップ以外のミスマッチは存在しない。
【図４ａ】図４ａは、ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡのスプライス変異体の、第二のカテゴリーの構造を示している。記号は、図２で説明したものと同じである。エキソン３にかぶっている大きなＸは、このエキソンが、スプライス変異体のこのカテゴリーでは失われていることを示している。
【図４ｂ】図４ｂは、配列番号３の一部（上のライン）と並列された、スプライス変異体の第二のカテゴリーのメンバーの代表的配列（下のライン）を示している。失われたエキソン３により創造されたギャップ以外のミスマッチは存在しない。
【図５ａ】図５ａは、ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡのスプライス変異体の、第三のカテゴリーの構造を示している。記号は、図３で説明したものと同じである。エキソン２および３にかぶっている大きなＸは、これらのエキソンが、スプライス変異体のこのカテゴリーでは失われていることを示している。黒四角に隣接する、数字を伴った星印は、スプライス変異体のこのカテゴリーに存在する配列多型の位置を示している。変異は、配列番号３内の以下の位置に存在する：変異２は１０５０位であり；変異３は１１３６および１１４０位であり；変異４は１１７８および１１７９位であり；変異５は１２１２位であり；および変異６は１２４２位である。
【図５ｂ】図５ｂは、配列番号３の一部（上のライン）と並列された、スプライス変異体の第三のカテゴリーのメンバーの代表的配列（下のライン）を示している。ミスマッチ塩基はボールド体で示されている。
【図６ａ】図６ａは、ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡのスプライス変異体の、第四のカテゴリーの構造を示している。エキソン３にかぶっている大きなＸは、このエキソンが、スプライス変異体のこのカテゴリーでは失われていることを示している。配列多型は、図５ａと同様に示されており、そして変異２から６は図５ａと同様である。
【図６ｂ】図６ｂは、配列番号３の一部（上のライン）と並列された、スプライス変異体の第四のカテゴリーのメンバーの代表的配列（下のライン）を示している。ミスマッチ塩基はボールド体で示されている。
【図７ａ】図７ａは、ヒトＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡのスプライス変異体の、第五のカテゴリーの構造を示している。エキソン３にかぶっている大きなＸは、このエキソンが、スプライス変異体のこのカテゴリーでは失われていることを示している。配列多型は、図５ａと同様に示されており、そして変異２から６は図５ａと同様である。変異１は、配列番号３のヌクレオチド７８から８０の欠失である。
【図７ｂ】図７ｂは、配列番号３の一部（上のライン）と並列された、スプライス変異体の第五のカテゴリーのメンバーの代表的配列（下のライン）を示している。ミスマッチ塩基はボールド体で示されている。
【図８】図８はマウスＢＴＬ−ＩＩ遺伝子およびｍＲＮＡの構造の図である。番号が配列番号５における位置を指していることを除いて、記号は図５で説明したものと同じである。
【図９ａ】図９ａは、マウスＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡのスプライス変異体の、第一のカテゴリーの構造を示している。エキソン３にかぶっている大きなＸは、このエキソンが、スプライス変異体のこのカテゴリーでは失われていることを示している。
【図９ｂ】図９ｂは、配列番号５（上のライン）と並列された、マウススプライス変異体の第一のカテゴリーのメンバーの代表的配列（下のライン）を示している。失われたエキソン３により創造されたギャップ以外のミスマッチは存在しない。
【図１０】図１０は、非症状性、野生型の結腸組織におけるＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの発現と比較した、炎症性腸疾患の症状を示していない場合（横縞）または炎症性腸疾患の症状を示している場合（市松模様）のｍｄｒ１ａ−／−マウス（ＦＶＢバックグラウンドにｍｄｒ１ａヌル変異を運んでいる）の結腸組織におけるＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの発現を表している。測定は、蛍光標識ｃＤＮＡをＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含んでいるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップへハイブリダイズさせることにより行った。
【図１１】図１１は、ＦＶＢ株の２匹の異なった野生型マウス（ＦＶＢ＃１および＃２；対角の線）からの、および炎症性腸疾患の症状を示している２匹のｍｄｒ１ａ−／−マウス（Ｍｄｒ１ａ−／−＃１および＃２；市松模様）からの結腸組織のリアルタイムＰＣＲアッセイにより検出されたＢＴＬ−ＩＩ ｍＲＮＡの相対濃度を示しているグラフである。
【図１２ａ】図１２ａは以下のタンパク質と培養された、精製ヒトＴ細胞の増殖（^３Ｈ−チミジンの取り込みにより証明された）を示している棒グラフである：抗ＣＤ３ε抗体単独、
【０２２１】
【化２１】

【０２２２】
；抗ＣＤ３ε抗体およびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０２２３】
【化２２】

【０２２４】
；抗ＣＤ３ε抗体およびＢ７ＲＰ−１：Ｆｃ、
【０２２５】
【化２３】

【０２２６】
；抗ＣＤ３ε抗体、Ｂ７ＲＰ−１：ＦｃおよびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０２２７】
【化２４】

【０２２８】
；抗ＣＤ３ε抗体およびＢ７−２：Ｆｃ、
【０２２９】
【化２５】

【０２３０】
；および抗ＣＤ３ε抗体、Ｂ７−２：ＦｃおよびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０２３１】
【化２６】

【０２３２】
。
【図１２ｂ】図１２ｂは図１２ａと同一であるが、ただし対数目盛りではなく、直線目盛りが使用されている。
【図１３】図１３は、一定量の抗ＣＤ３ε抗体および示されているように量を変化させたＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃに応答した、精製ヒトＴ細胞の増殖を示している棒グラフである。
【図１４】図１４は、抗ＣＤ３ε抗体単独、
【０２３３】
【化２７】

【０２３４】
、抗ＣＤ３ε抗体プラスＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０２３５】
【化２８】

【０２３６】
、または抗ＣＤ３ε抗体プラスヒトＦｃ領域から成る対照タンパク質、
【０２３７】
【化２９】

【０２３８】
、に応答したマウスＴ細胞の増殖を示している棒グラフである。
【図１５】図１５は、タンパク質添加なし、
【０２３９】
【化３０】

【０２４０】
、ＴＡＬＬ−１単独、
【０２４１】
【化３１】

【０２４２】
、抗ＩｇＭ抗体単独、
【０２４３】
【化３２】

【０２４４】
、ＴＡＬＬ−１および抗ＩｇＭ抗体、
【０２４５】
【化３３】

【０２４６】
、およびＴＡＬＬ−１、抗ＩｇＭ抗体およびＢＴＬ−ＩＩ：Ｆｃ、
【０２４７】
【化３４】

【０２４８】
、に応答したマウスＢ細胞の増殖を示している棒グラフである。
【図１６ａ】図１６ａは、図１２ａに示したようなタンパク質の多様な組み合わせに応答した、精製ヒトＴ細胞の増殖を示している。
【図１６ｂ】図１６ｂは、図１２ａに示したようなタンパク質の多様な組み合わせに応答した、相対インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生を示している。
【図１６ｃ】図１６ｃは、図１２ａに示したようなタンパク質の多様な組み合わせに応答した、相対インターロイキン２（ＩＬ２）産生を示している。
【図１６ｄ】図１６ｄは、図１２ａに示したようなタンパク質の多様な組み合わせに応答した、相対インターロイキン５（ＩＬ５）産生を示している。
【図１７】図１７は、図１２ａに示されているような、タンパク質の多様な組み合わせで培養された精製Ｔ細胞の培養において、死んだ細胞の総数を示している棒グラフである。
【図１８】図１８は、空ベクター（一番上の行）、かまたはマウスＢＴＬ−ＩＩ（二番目の行）、マウスＢ７ＲＰ−１（三番目の行）またはマウスＣＤ８０（一番下の行）をコードしているｃＤＮＡを含んでいるベクターでトランスフェクされた細胞のＦＡＣＳスキャンを示している。細胞は次のタンパク質で染色した：（１）ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ領域に融合されたマウスＣＴＬＡ４の細胞外領域（一番目の列）；（２）ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ領域に融合されたマウスＣＤ２８の細胞外領域（二番目の列）；（３）ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ領域に融合されたマウスＩＣＯＳの細胞外領域（三番目の列）；および（４）ＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ領域に融合されたＰＤ１の細胞外領域（四番目の列）。各々のスキャンの縦軸（“カウント”とラベルされている）は細胞数を表し、そして横軸（“ＦＬ２−Ｈ”とラベルされている）は蛍光を表している。“Ｍ１”とラベルされた水平線は、“ゲート（ｇａｔｅ）” がＦＡＣＳ機器に使用されたところを示している。このゲートに含まれる細胞が陽性と考えられる；全ての他の細胞は陰性と考えられる。各々のＦＡＣＳスキャン上の文字は、個々の試料番号を示している。
【配列表】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質であって、配列番号４のアミノ酸ｘからｙ、から成るアミノ酸配列、ここにおいて、ｘは配列番号４の１から３５位までからのいずれかのアミノ酸であり、そしてｙは配列番号４の４５２から４６２位までからのいずれかのアミノ酸である、を含んでなる、前記ＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項２】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質が配列番号４のアミノ酸３０から４５３を含んでなる、請求項１に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項３】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質が配列番号４のアミノ酸２９から４５７を含んでなる、請求項２に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸２９から４８２を含んでなる、請求項１に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項５】
単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質であって、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、ここにおいて配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも１５０アミノ酸であり、
ここにおいてアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７と、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と少なくとも８０％同一であり、ここにおいて配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７と、または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも２０アミノ酸長であり、そして
ここにおいてポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である、
を含んでなる、前記ＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８と少なくとも９０％同一である、請求項５に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項７】
アミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸１２７から１５７，または配列番号１６のアミノ酸１２６から１５６と少なくとも９０％同一である、請求項５または６に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項８】
配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３０から３５８を含んでなる、請求項５から７のいずれか一項に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項９】
単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質であって、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３２から３５８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列から成るポリペプチド、
ここにおいて配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３２から３５８と並列されたアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも２７５アミノ酸であり、そして
ここにおいてポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能である、
を含んでなる、前記ＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１０】
アミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３２から３５８と少なくとも９０％同一である、請求項９に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１１】
アミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８のアミノ酸３２から３５８を含んでなる、請求項１０に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１２】
単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質であって、配列番号１０のアミノ酸３２から３５８と少なくとも８０％同一である第一のアミノ酸配列から成る第一のポリペプチド、ここにおいて配列番号１０に並列された第一のアミノ酸配列の同一性領域は少なくとも約１７５アミノ酸長であり、
ここにおいて第一のアミノ酸配列は長さが約３９０アミノ酸を超えず、
ここにおいて第一のポリペプチドはＴ細胞の増殖を阻害可能であり、
ここにおいて第一のアミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と少なくとも８０％同一ではなく、少なくとも約４０アミノ酸の、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と並列された第一のアミノ酸配列の同一性領域を有し、そして
ここにおいてＢＴＬ−ＩＩタンパク質は、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と少なくとも８０％同一で、少なくとも約４０アミノ酸の、配列番号４のアミノ酸１４８から２３２と並列された第二のアミノ酸配列の同一性領域を有する、第二のアミノ酸配列を含んでいない、
を含んでなる、前記ＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１３】
第一のアミノ酸配列は長さが約２７０アミノ酸を超えない、請求項１２に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１４】
第一のアミノ酸配列が、配列番号１０と少なくとも９０％同一である、請求項１２または１３に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１５】
配列番号８または配列番号１２のアミノ酸３２から２４２を含んでなる、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１６】
異種ポリペプチドをさらに含んでなる、請求項１、５、９または１２に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１７】
異種ポリペプチドが、抗体のＦｃ領域である、請求項１６に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項１８】
配列番号４の免疫原性断片であって、
ここにおいて免疫原性断片は、免疫原性断片へ特異的に結合する抗体を惹起することが可能であり、
ここにおいて免疫原性断片は少なくとも１０アミノ酸長であり、そして
ここにおいて免疫原性断片は配列番号４の３６０位に及ぶ、
前記断片。
【請求項１９】
配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８から成る群より選択される配列の免疫原性断片であって、
ここにおいて免疫原性断片は配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８の１４１から１４３位に及び、
ここにおいて免疫原性断片は、免疫原性断片へ特異的に結合する抗体を惹起することが可能であり、
ここにおいて免疫原性断片は少なくとも１０アミノ酸長である、
前記断片。
【請求項２０】
単離ＢＴＬ−ＩＩタンパク質であって、配列番号６のアミノ酸ｘからｙまでから成るアミノ酸配列、ここにおいてｘは配列番号６の１から３５位までからのいずれかのアミノ酸であり、そしてｙは配列番号６の４５０から４６０位までからのいずれかのアミノ酸である、を含んでなる、前記ＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項２１】
配列番号６のアミノ酸３２から４５０を含んでなる、請求項２０に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項２２】
配列番号６のアミノ酸２９から４５６を含んでなる、請求項２１に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項２３】
配列番号６のアミノ酸２９から５１４を含んでなる、請求項２２に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸１から４５７、から成る、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する単離抗体。
【請求項２５】
配列番号６のアミノ酸１から４５６、から成る、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する単離抗体。
【請求項２６】
配列番号８のアミノ酸１から２４７；
配列番号１０のアミノ酸１から３６３；
配列番号１２のアミノ酸１から２４３；
配列番号１４のアミノ酸１から３５９；
配列番号１６のアミノ酸１から３５８；および
配列番号１８のアミノ酸１から３６２
から成る群より選択されるアミノ酸配列から成るＢＴＬ−ＩＩタンパク質へ特異的に結合する単離抗体。
【請求項２７】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体がヒト抗体である、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体がＢＴＬ−ＩＩのアンタゴニストである、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
単離ＢＴＬ−ＩＩ核酸であって、配列番号３のヌクレオチドｘからｙ、ここにおいてｘはヌクレオチド１から１０５よりであり、そしてｙはヌクレオチド１３４５から１３７５よりである、より成るポリヌクレオチドまたはその相補体を含んでなる、前記ＢＴＬ−ＩＩ核酸。
【請求項３１】
配列番号３のヌクレオチド１０５から１３４５を含んでなる、請求項３０に記載のＢＴＬ−ＩＩ核酸。
【請求項３２】
配列番号３のヌクレオチド１から１３７１を含んでなる、請求項３１に記載のＢＴＬ−ＩＩ核酸。
【請求項３３】
ＢＴＬ−ＩＩ核酸が、請求項１から２３のいずれか一項のＢＴＬ−ＩＩタンパク質または免疫原性断片をコードする、単離ＢＴＬ−ＩＩ核酸またはその相補体。
【請求項３４】
請求項３０から３３のいずれか一項に記載のＢＴＬ−ＩＩ核酸を含んでなるベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項３６】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または免疫原性断片を産生するための方法であって、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または免疫原性断片の発現を可能にする条件下、請求項３５に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
【請求項３７】
請求項１から２３のいずれかの一項に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質または免疫原性断片を発現するように遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項３８】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または免疫原性断片を産生するための方法であって、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質または免疫原性断片の発現を可能にする条件下、請求項３７の宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
【請求項４１】
宿主細胞または培地から、ＢＴＬ−ＩＩタンパク質を単離することをさらに含んでなる、請求項３６または４０に記載の方法。
【請求項４２】
炎症性腸疾患を患っている患者に、治療的に有効量の、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質を投与することを含んでなる方法。
【請求項４３】
患者がクローン病を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
患者が潰瘍性大腸炎を患っている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
抗原に対する免疫応答を誘導するための方法であって、治療的に有効量のＢＴＬ−ＩＩアンタゴニストおよび抗原を哺乳動物に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４６】
免疫応答が、抗原に対する粘膜免疫応答を含んでなる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アンタゴニストが請求項２９の抗体である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
抗原が粘膜表面を経て投与される、請求項４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
抗原に対する免疫応答を弱めるための方法であって、抗原および請求項１から１７および２０から２３のいずれか一項に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質を哺乳動物に投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項５０】
抗原が粘膜表面を経て投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
Ｔ細胞増殖を阻害するための方法であって、Ｔ細胞と請求項１から１７および２０から２３のいずれか一項に記載のＢＴＬ−ＩＩタンパク質を接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項５２】
Ｔ細胞をインビボでＢＴＬ−ＩＩタンパク質と接触させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
Ｔ細胞によるサイトカイン産生を阻害するための方法であって、Ｔ細胞と請求項１から１７および２０から２３のいずれか一項に記載のポリペプチドを接触させることを含んでなる、前記方法。
【請求項５５】
Ｔ細胞をインビボでポリペプチドと接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｔ細胞がヒトＴ細胞である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
インターフェロンガンマ産生が阻害される、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
ＩＬ２産生が阻害される、請求項５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ＩＬ５産生が阻害される、請求項５４から５８のいずれか一項に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３ａ】

【図３ｂ】

【図４ａ】

【図４ｂ】

【図５ａ】

【図５ｂ】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図７ａ】

【図７ｂ】

【図８】

【図９ａ】

【図９ｂ】

【図１０】

【図１１】

【図１２ａ】

【図１２ｂ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６ａ】

【図１６ｂ】

【図１６ｃ】

【図１６ｄ】

【図１７】

【図１８】

【公表番号】特表２００６−５２５７８６（Ｐ２００６−５２５７８６Ａ）
【公表日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６３７４７（Ｐ２００４−５６３７４７）
【出願日】平成１５年１２月１９日（２００３．１２．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４０３３８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８９８６
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５９１１２３６０９）イミュネックス・コーポレーション (24)
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＭＵＮＥＸ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】