説明

BacillusThuringiensisの新規な結晶ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの組成物

【課題】広い活性スペクトルを有する新しい殺虫性タンパク質の開発。
【解決手段】Bacillus Cry2ポリペプチドに関連する殺虫性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドをコードする核酸もまた、提供される。昆虫による捕食に対する抵抗性を向上させるポリペプチドおよび核酸を使用するための方法が、包含される。該核酸および/またはポリペプチドを発現するトランスジェニック植物に関する。このトランスジェニック植物は、当該分野において公知である任意の方法で導入遺伝子を発現し得、この方法としては、構成的発現、発生的に制御された発現、組織特異的な発現などが挙げられるが、これらに限定されない。該トランスジェニック植物から得られる種子もまた、包含される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(1:発明の分野)
本発明は、一般的に、防除の分野に関し、そしてBacillus Cry2ポリペプチドに関連する殺虫性ポリペプチドおよびその殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチドを提供する。本発明はまた、昆虫による捕食に対する植物の抵抗性を変化させるための方法および組成物に関し、それとしては、トランスジェニック植物の産生が挙げられるが、これに限定されない。
【背景技術】
【0002】
(2:発明の背景)
一般的な農作物を含む多くの商業的に有益な植物は、昆虫および線虫である害虫による攻撃に影響されやすい。これらの害虫は、作物の収量および品質の実質的な低下を引き起こし得る。伝統的に、農業従事者は、害虫による損害と戦うために、化学的農薬に大きく依存してきた。しかし、化学的農薬の使用は、それ自体、農薬を適用する費用および不都合を含む一連の問題を引き起こす。さらに、化学的残留物は、環境的および健康的な不安を生じる。これらの理由および他の理由に起因して、代替的な殺虫剤に対する需要が存在する。
【0003】
害虫を制御する環境的に優しいアプローチは、土壌細菌Bacillus thuringiensis(「Bt」)に由来する殺害虫性(pesticidal)結晶タンパク質の使用であり、このタンパク質は、一般的に「Cryタンパク質」といわれる。これらのタンパク質の多くは、特定の標的昆虫に対して非常に有毒であるが、植物および他の標的とされない生物に対しては無害である。いくつかのCryタンパク質は、作物植物中で組換え的(recombinantly)に発現されて、害虫抵抗性トランスジェニック植物を提供してきた。とりわけ、Bt−トランスジェニック綿およびBt−トランスジェニックトウモロコシは、幅広く栽培されてきた。
【0004】
非常に多くのCryタンパク質が、単離され、特徴付けされ、そしてアミノ酸配列の相同性に基づいて分類されてきた(非特許文献1)。この分類スキームは、新規に見出されたCryタンパク質を命名および類別するための系統的な機構を提供する。
【0005】
個々のCryタンパク質は、Cry2Aを除いて、比較的に狭い活性スペクトルを有することが、一般的に見出されてきた。Cry2Aは、Cryタンパク質のこのサブセットが鱗翅目の昆虫および双翅目の昆虫の両方に対する毒性を含む広い有効範囲を有する点で特異である。Cry2Aタンパク質は、Trichoplusia ni(ウワバの幼虫(cabbage looper))およびAedes taeniorhynchus(蚊)に対する二重の活性を示す毒素であることが見出された(非特許文献2)。Cry2Aタンパク質をコードする核酸分子(Cry2Aaと称される)は、B.megateriumにおいてクローニングされ、かつ発現され、そして鱗翅目の昆虫および双翅目の昆虫の両方に対して活性であることが見出された(非特許文献3)。Cry2Aaと相同的なさらなるコード配列(Cry2Abと称される)が、クローニングされ、そして鱗翅目の幼生のみに対して活性であることが見出された(非特許文献4)。
【0006】
第2世代のトランスジェニック作物は、複数および/または新規のBt遺伝子を発現し得る場合、昆虫に対してさらに抵抗性であり得る。したがって、広い活性スペクトルを有する新しい殺虫性タンパク質は、非常に望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Crickmoreら、「Microbiol.Mol.Biol.Rev.」、1998年、第62巻、807〜813ページ
【非特許文献2】YamamotoおよびMcLaughlin、「Biochem.Biophys.Res.Comm.」、1982年、第130巻、414〜421ページ
【非特許文献3】Donovanら、「J.Bacteriol.」、1988年、第170巻、4732〜4738ページ
【非特許文献4】WidnerおよびWhiteley、「J.Bacteriol.」、1989年、第171巻、2ページ
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
(3:発明の要旨)
本発明は、新規なCry2ポリペプチド(Cry2Ax)(配列番号2)に関し、これは、Bacillus thuringiensisから単離される。Cry2Ax由来のポリペプチド(配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260)もまた本発明によって包含される。Cry2AxおよびCry2Ax由来のポリペプチドのポリペプチド配列に加えて、本発明のポリペプチドはまた、それらの改変体を包含し、その改変体としては、任意のフラグメント、アナログ、ホモログ、天然に存在するアレル、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。本発明のポリペプチドはまた、任意の本発明のCry2AxまたはCry2Ax由来の核酸によってコードされるポリペプチドを包含する。1つの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも1つのCry2Axの機能的活性(例えば、殺虫活性)を有し、そして配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260またはそれらの改変体のいずれかのポリペプチド配列に、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一である。別の実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも1つのCry2Axの機能的活性(例えば、殺虫活性)を有し、少なくとも25アミノ酸長、50アミノ酸長、75アミノ酸長、100アミノ酸長、125アミノ酸長、150アミノ酸長、175アミノ酸長、200アミノ酸長、225アミノ酸長、250アミノ酸長、275アミノ酸長、300アミノ酸長、325アミノ酸長、350アミノ酸長、375アミノ酸長、400アミノ酸長、425アミノ酸長、450アミノ酸長、475アミノ酸長、500アミノ酸長、525アミノ酸長、550アミノ酸長、575アミノ酸長、600アミノ酸長または625アミノ酸長の連続したアミノ酸であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260、またはそれらの改変体のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドを産生する方法(例えば、組換え手段による)もまた、提供される。本発明の1種以上のポリペプチドを含有する組成物もまた、包含される。
【0009】
本発明はまた、Cry2Ax(配列番号1)の核酸分子およびCry2Ax由来の核酸分子(配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259)に関する。少なくとも部分的に、機能的に活性であるポリペプチド(すなわち、そのポリペプチドが、野生型Cry2Axポリペプチドに関する1つ以上の公知である機能的活性を示し得る)をコードするフラグメントおよびアナログもまた、本発明によって包含される。1つの実施形態において、本発明は、以下:i)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一であるヌクレオチド配列;ii)ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸プローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列;および/あるいはiii)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むヌクレオチド配列、を含む単離された核酸配列を包含する。本発明の核酸を含むベクターもまた、包含される。本発明のベクターを含有する細胞または植物もまた、包含される。
【0010】
本発明はまた、本発明の核酸および/またはポリペプチドを発現するトランスジェニック植物に関する。このトランスジェニック植物は、当該分野において公知である任意の方法で導入遺伝子を発現し得、この方法としては、構成的発現、発生的に制御された発現、組織特異的な発現などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック植物から得られる種子もまた、本発明に包含される。
【0011】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259、またはそれらの相補体のいずれかを含む単離された核酸分子。
(項目2)
単離された核酸分子であって、以下:
a)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259、またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子;
b)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
c)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259、またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸プローブと、55℃で20分間の0.2×SSCにおける少なくとも1回の洗浄後にハイブリダイズする核酸分子;および
d)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259のいずれかの少なくとも600個の連続したヌクレオチドを含むフラグメント、
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
(項目3)
上記核酸分子が、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むポリペプチドをコードする、項目2に記載の単離された核酸分子。
(項目4)
上記核酸分子が、殺虫活性を有するポリペプチドをコードする、項目1または2に記載の単離された核酸分子。
(項目5)
双翅目または鱗翅目が、上記ポリペプチドの上記殺虫活性に感受性である、項目4に記載の単離された核酸分子。
(項目6)
項目1または2に記載の核酸分子を含有するベクター。
(項目7)
上記ベクターが、発現ベクターである、項目6に記載のベクター。
(項目8)
項目6に記載のベクターを含有する宿主細胞。
(項目9)
上記細胞が、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞からなる群より選択される、項目8に記載の宿主細胞。
(項目10)
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれか1つを含む単離されたポリペプチド。
(項目11)
単離されたポリペプチドであって、以下:
a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるポリペプチド;
b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259、またはそれらの相補体のいずれか1つと少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるポリペプチド;
c)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259、またはそれらの相補体のいずれかのヌクレオチド配列からなる核酸プローブと、55℃で20分間の0.2×SSCにおける少なくとも1回の洗浄後にハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチド;
d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかの少なくとも200個の連続したアミノ酸を含むフラグメント、
からなる群より選択される、単離されたポリペプチド。
(項目12)
上記ポリペプチドが、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R
129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸を含む、項目11に記載のポリペプチド。
(項目13)
上記ポリペプチドが、殺虫活性を有する、項目10または11に記載の単離されたポリペプチド。
(項目14)
双翅目または鱗翅目が、上記ポリペプチドの上記殺虫活性に感受性である、項目13に記載の単離されたポリペプチド。
(項目15)
トランスジェニック植物であって、以下:
(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかのポリペプチド;または
(b)配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259のいずれか1つの核酸分子、
を発現する導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。
(項目16)
上記植物が、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、および綿からなる群より選択される、項目15に記載のトランスジェニック植物。
(項目17)
上記トランスジェニック植物が、遺伝子組換えではない植物に比べて、害虫に対する増加した抵抗性を有する、項目15に記載のトランスジェニック植物。
(項目18)
双翅目または鱗翅目が、上記害虫である、項目17に記載のトランスジェニック植物。
(項目19)
トランスジェニック植物であって、以下:
(a)項目11に記載のポリペプチド、または
(b)項目2に記載の核酸分子、
を発現する導入遺伝子を含む、トランスジェニック植物。
(項目20)
上記植物が、トウモロコシ、大豆、ジャガイモ、および綿からなる群より選択される、項目19に記載のトランスジェニック植物。
(項目21)
上記トランスジェニック植物が、遺伝子組換えではない植物に比べて、害虫に対する増加した抵抗性を有する、項目19に記載のトランスジェニック植物。
(項目22)
双翅目または鱗翅目が、上記害虫である、項目21に記載のトランスジェニック植物。
(項目23)
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260の1つ以上のポリペプチド、および薬剤を含有する組成物であって、該薬剤が、拡散−固着補助剤、安定化剤、殺虫剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、および分散剤からなる群より選択される、組成物。
(項目24)
上記組成物が、細胞をさらに含有する、項目23に記載の組成物。
(項目25)
上記細胞が、完全な細胞または溶解した細胞である、項目24に記載の組成物。
(項目26)
上記細胞が、懸濁物またはペレットである、項目25に記載の組成物。
(項目27)
上記組成物が、Bacillus thuringiensisの胞子−結晶複合体をさらに含有する、項目23に記載の組成物。
(項目28)
上記ポリペプチドが、精製される、項目23に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】図1は、第2回のシャッフリングから得たDNAクローンの殺虫活性を示す。各クローンは、強制的な浸潤を使用してN.benthamianaの葉において発現された。各葉の花盤は、単一の三齢のH.zeaの幼生に供給された。24時間のインキュベーション期間の後、摂食活性は、目視観察によって決定され、そして残った葉の面積のおおよその割合として示された。y軸は、昆虫に対する曝露後に残った葉の花盤の%である。x軸は、この葉の花盤中に発現したクローンである。数種のクローン(例えば、7K(D_S01000779)(配列番号10)、15K(D_S00999080)(配列番号12)、16K(D_S01000269)(配列番号14)、16R(D_S01037143)(配列番号16)、および473R(D_S01037677) (配列番号18))は、増加した殺虫活性を示した(shoed)。
【図2】図2は、第1回にシャッフリングされたクローン44(D_S00503970)の殺虫活性および第3回にシャッフリングされたクローンD_S01764701の殺虫活性を示す。各クローンは、強制的な浸潤を使用してN.benthamianaの葉において発現された。各葉の花盤は、単一の三齢のH.zeaの幼生に供給された。24時間のインキュベーション期間の後、摂食活性は、この葉の花盤のビデオキャプチャーによって決定された。y軸は、取り込まれた葉の花盤の画像の画素の%の数である。x軸は、この葉の花盤中に発現したクローンである。結果は、3つの実験の平均について示される。それぞれの実験に対して、少なくとも8個の葉の花盤が、各クローンについて試験された。
【図3】図3A〜3Bは、第1回にシャッフリングされたクローン44をプラスチド区画(左のパネル)または細胞質(右のパネル)に発現する、トランスジェニックタバコ植物についての効力の結果を示す。(A)H.zea阻害または(B)S.exigua阻害の効力は、これらの虫と一緒に葉を24時間インキュベーションした後に決定された。残った葉の量を、相対的な残りの葉の面積(画素の数)を正確に計算するためのビデオキャプチャー装置によって観察した。各トランスジェニック植物、分析のために採取された6個の葉の花盤を有した。25個のトランスジェニック植物は、それぞれの導入遺伝子構築物を使用して作製されたので、この番号は、特定の構築物を使用する異なる植物を区別する。
【図4】図4A〜4Bは、第1回にシャッフリングされたクローン44を発現するトランスジェニック植物中の導入遺伝子の発現レベルを示す。このシャッフリングされたCry2由来のポリペプチドは、pMAXY5469またはpMAXY5471を用いる形質転換によって、(A)プラスチドの細胞内区画または(B)細胞質の細胞内区画にそれぞれ発現した。ウェスタンブロット分析は、第1回にシャッフリングされたクローン44ポリペプチドの毒素領域を指向するポリクローナル抗体を使用して、トランスジェニック植物抽出物に対して行われた。ネガティブコントロールは、非形質転換植物から採取された抽出物であった。ポジティブコントロールは、20ngまたは40ngのいずれかの、精製したCry2Ax毒素であった。ポジティブコントロールCry2Axの分子量は、この植物抽出物中のCry2Ax由来のポリペプチドの分子量とは異なる(なぜなら前者はトリプシンによって活性化され、そして後者はプロ毒素であるからである)。
【発明を実施するための形態】
【0013】
(5:詳細な説明)
本発明は、Bacillus Cry2ポリペプチドに関連する殺虫性ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子もまた、提供される。昆虫による捕食に対する植物の抵抗性を向上させる本発明のポリペプチドおよび核酸を使用するための方法が、包含される。
【0014】
(5.1:本発明のポリペプチド)
本発明は、Bacillus thuringiensisから単離された新規のCry2ポリペプチド、Cry2Ax(配列番号2)に関する。Cry2Ax由来のポリペプチド(配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260)もまた、本発明に包含される。本発明のポリペプチドはまた、本発明の任意のCry2AxまたはCry2Ax由来の核酸によってコードされるポリペプチドを包含する(節5.2を参照のこと)。
【0015】
Cry2AxおよびCry2Ax由来のポリペプチドのポリペプチド配列に加えて、本発明のポリペプチドはまた、その改変体を包含し、それらとしては、任意の実質的に同様の配列、任意のフラグメント、アナログ、ホモログ、天然に存在するアレル、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。本発明に包含される改変体は、少なくとも部分的に、機能上活性であるポリペプチド、すなわち、野生型Cry2Axポリペプチドに関する1つ以上の公知である機能的活性を示し得るポリペプチドである。このような機能的活性としては、生物学的活性(例えば、殺虫活性;抗原性(すなわち、抗Cry2Ax抗体への結合に関してCry2Axと結合または競合する能力);免疫原性(すなわち、Cry2Axポリペプチドに結合する抗体を産生する能力))が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、この改変体は、その親ポリペプチドと実質的に同様である少なくとも1つの機能的活性を有する(例えば、Cry2Axの改変体は、Cry2Axと実質的に同様である少なくとも1つの機能的活性を有する)。本明細書中で使用される場合、上記改変体の機能的活性は、それが親の1標準偏差内である場合、その親ポリペプチドと「実質的に同様」と見なされる。
【0016】
1つの実施形態において、少なくとも1つのCry2Axの機能的活性(例えば、殺虫活性)を有し、かつ配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかのポリペプチド配列と少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一であるポリペプチドが、本発明に包含される。本発明のこのようなポリペプチドは、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群に由来する少なくとも1つのアミノ酸残基、少なくとも5つのアミノ酸残基、少なくとも10個のアミノ酸残基、少なくとも20個のアミノ酸残基、少なくとも30個のアミノ酸残基、または全40個のアミノ酸残基を含む。この下付きの数字は、そのポリペプチド配列と配列番号2との最適なアラインメントにおける、配列番号2の位置に対応するアミノ酸残基の位置を示す。参照配列と最適に整列されるアミノ酸配列に関して、アミノ酸は、その残基が、そのアラインメントにおいて対となる参照配列中の位置に「対応する」。
【0017】
本明細書中で使用される場合、配列が参照配列と「少なくともX%同一」であると定義される場合(例えば、「配列番号2と少なくとも95%同一であるポリペプチド」)、特に明記されない限り、「X%同一」とは、同一性の絶対的な%をいう。用語「同一性の絶対的な%」とは、ミスマッチのアミノ酸またはミスマッチの核酸の類似度に関わらず、同一のアミノ酸または核酸を1、および任意の置換を0としてスコアリングすることによって決定された配列同一性の百分率をいう。代表的な配列アラインメントにおいて、2つの配列の「同一性の絶対的な%」は、アミノ酸または核酸の「同一性」の百分率として表される。2つの配列の最適なアラインメントが、その配列の一方または両方におけるギャップの挿入を必要とする場合において、一方の配列中のギャップと整列する他方の配列中のアミノ酸残基は、同一性の%を決定する目的のためのミスマッチとして数えられる。ギャップは、内部または外部(すなわち、切断)であり得る。同一性の絶対的な%は、例えば、初期設定のパラメーターを使用するClustal Wプログラム,バージョン1.8,1999年6月を使用して容易に決定され得る(Thompsonら、1994、Nucleic Acids Research 22:4673−4680)。
【0018】
別の実施形態において、Cry2AxおよびCry2Ax由来のポリペプチドのフラグメントは、本発明に包含される。ポリペプチドには、少なくとも1つのCry2Axの機能的活性(例えば、殺虫活性)を有し、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかの、少なくとも25個、50個、75個、100個、125個、150個、175個、200個、225個、250個、275個、300個、325個、350個、375個、400個、425個、450個、475個、500個、525個、550個、575個、600個、または625個の連続したアミノ酸長であり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかをコードする核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものが包含される。本発明のフラグメントが、配列番号2のアミノ酸残基2、7、27、35、36、43、44、45、51、58、69、78、79、99、118、124、125、129、138、139、141、161、165、166、183、192、211、213、217、218、324、386、399、405、445、551、587、591、610、631に対応するアミノ酸残基のいずれかを含む場合の実施形態において、本発明のこのようなポリペプチドは、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群に由来する少なくとも1アミノ酸残基、少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、または全40アミノ酸残基を含む。
【0019】
特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、プロセシングされたプロ毒素(pro−toxin)の長さに対応する。全長プロ毒素Cry2とプロセシングされたCry2毒素との間の分子量に、5〜6kDaの差が存在する。これは、プロ毒素Cry2ポリペプチドから、約40個のアミノ酸が切断された結果である(Rukminiら、2000、Biochimie 82:109−116;Aronsonら、1993、Mol.Microbiol.7:489−496;Morseら、2001、Structure 9:409−17)。このプロセシングされたCry2フラグメントに対応するポリペプチドは、本発明の方法においてプロ毒素のプロセシングに対する必要性を回避するために、直接的に提供され得る。
【0020】
別の特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、Cry2ドメインに対応する。Cry2ポリペプチドは、以下を含む3つのドメインを有する:i)昆虫の頂端中腸膜への挿入に関係し、そしてイオンチャネルの機能に影響を与えるドメインI;ii)昆虫中腸の上皮細胞膜上のレセプター結合に関係するドメインII;およびiii)イオンチャネルの機能、レセプター結合、および膜への挿入に関係するドメインIII(Deanら、1996、Gene 179:111−117;Schnepfら、1998、Microbiol.Molec.Biol.Rev.62:775−806)。
【0021】
別の実施形態において、アナログポリペプチドは、本発明に包含される。アナログポリペプチドは、改変(すなわち、Cry2AxポリペプチドまたはCry2Ax由来のポリペプチドに対する任意の型の分子の共有結合によって)された残基を有し得る。例えば、本発明のアナログポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護/封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、細胞のリガンドまたは他のタンパク質に対する連結などによって改変され得るが、これらに限定されない。本発明のアナログポリペプチドは、当業者に公知である技術を使用する化学的改変をによって改変され、この技術としては、特定の化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のポリペプチドアナログは、1種以上の非古典的なアミノ酸を含む。
【0022】
本発明のポリペプチドを産生する方法(例えば、組換え技術による)もまた、提供される(節5.6を参照のこと)。
【0023】
1つ以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物もまた、包含される。本発明の組成物は、さらなる薬剤をさらに含有し得、この薬剤としては、拡散−固着補助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、希釈剤、例えば、界面活性剤、乳化剤、分散剤、および/またはポリマーのようなこの組成物のレオロジー特性または安定性を最適化する薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
(5.2:本発明の核酸)
本発明はまた、Cry2Axの核酸分子(配列番号1)およびCry2Ax由来の核酸分子(配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259)に関する。本発明の核酸分子はまた、本発明の任意のCry2AxまたはCry2Ax由来のポリペプチドをコードする核酸分子を包含する(節5.1を参照のこと)。
【0025】
Cry2Axの核酸分子およびCry2Ax由来の核酸分子に加えて、本発明の核酸はまた、それらの改変体を含み、この改変体としては、実質的に類似する任意の配列、任意のフラグメント、ホモログ、天然に存在するアレル、またはそれらの変異体が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。本発明に包含される改変体核酸分子は、少なくとも部分的に、機能的に活性であるポリペプチド(すなわち、それらは野生型Cry2Axポリペプチドに関する1つ以上の公知の機能的活性を示し得る)をコードする。このような機能的活性としては、生物学的活性(例えば、殺虫活性;抗原性(すなわち、抗Cry2Ax抗体への結合に関してCry2Axと結合または競合する能力);免疫原性(すなわち、Cry2Axポリペプチドに結合する抗体を産生する能力))が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、この改変体は、その親核酸分子と実質的に同様である少なくとも1つの機能的活性を有する(例えば、Cry2Ax核酸分子の改変体は、Cry2Ax核酸分子によってコードされるポリペプチドの機能的活性と実質的に同様である少なくとも1つの機能的活性を有するポリペプチドをコードする)。本明細書中で使用される場合、上記改変体の機能的活性は、それが親の1標準偏差内である場合、その親ポリペプチドと「実質的に同様」と見なされる。
【0026】
1つの実施形態において、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259の核酸分子のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一である核酸分子が、本発明に包含される。本発明のこのような核酸分子は、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群に由来する少なくとも1アミノ酸残基、少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、または全40アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする。
【0027】
2つの核酸分子の同一性の%を決定するために、その配列は、最適な比較を目的として整列される(例えば、ギャップが、第2の核酸分子の配列または核酸分子との最適なアラインメントのために第1の核酸分子の配列中に導入され得る)。その後、対応するヌクレオチドの位置におけるヌクレオチドが、比較される。第1の配列中の位置が第2の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合、その分子は、その位置において同一である。その2つの配列の間の同一性の%は、その配列によって共有される同一の位置の数の関数(すなわち、同一性の%=同一の重複する位置の数/位置の総数×100%)である。1つの実施形態において、その2つの配列は、同じ長さである。
【0028】
2つの配列の間の同一性の%の決定はまた、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、KarlinおよびAltschulのアルゴリズムである(KarlinおよびAltschul、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.90:5873〜5877において改変されたKarlinおよびAltschul、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.87:2264〜2268)。このようなアルゴリズムは、NBLASTプログラムおよびXBLASTプログラムに組み込まれる(Altschulら、1990、J.Mol.Biol.215:403およびAltschulら、1997、Nucleic Acid Res.25:3389−3402)。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、公に利用可能(例えば、National Center for Biotechnology Informationを介して)である。このアルゴリズムは、クエリー配列における長さWの短いワード(word)を同定することによって、最初に高スコア配列対(HSP)を同定する工程を備え、データベースの配列中の同じ長さのワードと整列した場合に、いくつかの正の数の閾値スコアTと一致するか、またはそれを満たす。Tは、その最初の近傍ワードのスコア閾値といわれる(Altschulら、前出)。これらの最初の近傍ワードヒット(word hit)は、検索を開始して、近傍ワードを含む、より長いHSPを見出すためのシードとして働く。その後このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加され得る範囲まで、各々の配列に沿って両方向に伸ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に対して、パラメータM(一致する残基の対に対する報酬スコア;常に>0)およびパラメータN(一致しない残基に対するペナルティースコア;常に<0)を使用して計算され得る。アミノ酸配列に関して、得点マトリックスが使用されて、累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止される:累積アラインメントスコアが、量Xによってその最大到達スコアから減少する場合;累積スコアが、1つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積に起因して0以下になった場合;またはいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムのパラメータW、T、およびXは、そのアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列に対して)は、初期設定として、11のワード長(W)、10の期待値(E)、100のカットオフ、M=5、N=4、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、初期設定として、3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62得点マトリックス(HenikoffおよびHenikoff、1989、PNAS、89:10915を参照のこと)を使用する。
【0029】
Clustal V方法のアラインメントもまた、同一性の%を決定するために使用され(HigginsおよびSharp、1989、CABIOS.5:151〜153)、そしてLASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのMegalignプログラム中に見出され得る(DNASTAR Inc.、Madison、WI)。「初期設定のパラメータ」は、プログラムの製造者によって予め設定されたパラメータのプリセットであり、そしてそれらは、複数の配列に関して、GAP PENALTY=10およびGAP LENGTH PENALTY=10に該当する一方で、対をなすアラインメントに関して、KTUPLE 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5およびDIAGONALS SAVED=5である。Clustal Vプログラムを使用する配列のアラインメント後、同じプログラムにおける「配列距離」の表を見ることによって「同一性の%」を得ることが可能である。
【0030】
2つの配列の間の同一性の%は、ギャップを許容してか、またはギャップを許容せずに、上記されるものと同様の技術を使用して決定され得る。同一性の%計算において、代表的に、正確な一致のみが、数えられる。
【0031】
別の実施形態において、Cry2Axの核酸分子およびCry2Ax由来の核酸分子のフラグメントが、本発明に包含される。核酸分子には、少なくとも1つのCry2Axの機能的活性(例えば、殺虫活性)を有し、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259のいずれかの少なくとも100個、250個、500個、750個、1000個、1500個、または1800個の連続したヌクレオチド長であり、そして/またはストリンジェントな条件下で、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかをコードする核酸分子とハイブリダイズするものが包含される。本発明の核酸フラグメントが、配列番号2のアミノ酸残基2、7、27、35、36、43、44、45、51、58、69、78、79、99、118、124、125、129、138、139、141、161、165、166、183、192、211、213、217、218、324、386、399、405、445、551、587、591、610、631に対応するアミノ酸残基のいずれかを含むポリペプチドをコードする場合の実施形態において、本発明のこのような核酸分子は、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群に由来する少なくとも1アミノ酸残基、少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、または全40アミノ酸残基に対するコード配列を含む。
【0032】
特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、プロセシングされたプロ毒素をコードする核酸の長さに対応する。全長プロ毒素Cry2とプロセシングされたCry2毒素との間の分子量に、5〜6kDaの差が存在する。これは、プロ毒素Cry2ポリペプチドから、約40個のアミノ酸が切断された結果である(Rukminiら、2000、Biochimie 82:109−116;Aronsonら、1993、Mol.Microbiol.7:489−496;Morseら、2001、Structure
9:409−17)。
【0033】
別の特定の実施形態において、本発明のフラグメントは、Cry2ドメインに対応するポリペプチドをコードする。
【0034】
別の実施例において、ストリンジェントな条件下で、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、配列番号95、配列番号97、配列番号99、配列番号101、配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111、配列番号113、配列番号115、配列番号117、配列番号119、配列番号121、配列番号123、配列番号125、配列番号127、配列番号129、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139、配列番号141、配列番号143、配列番号145、配列番号147、配列番号149、配列番号151、配列番号153、配列番号155、配列番号157、配列番号159、配列番号161、配列番号163、配列番号165、配列番号167、配列番号169、配列番号171、配列番号173、配列番号175、配列番号177、配列番号179、配列番号181、配列番号183、配列番号185、配列番号187、配列番号189、配列番号191、配列番号193、配列番号195、配列番号197、配列番号199、配列番号201、配列番号203、配列番号205、配列番号207、配列番号209、配列番号211、配列番号213、配列番号215、配列番号217、配列番号219、配列番号221、配列番号223、配列番号225、配列番号227、配列番号229、配列番号231、配列番号233、配列番号235、配列番号237、配列番号239、配列番号241、配列番号243、配列番号245、配列番号247、配列番号249、配列番号251、配列番号253、配列番号255、配列番号257、配列番号259のいずれか1つとハイブリダイズする核酸分子が、本発明に包含される。本発明のこのような核酸分子は、H、S、Q27、Q35、E36、K43、D44、N45、D51、A58、V69、R78、N79、K99、T118、V124、E125、R129、N138、R139、A141、T162、Q165、M166、L183、I192、H211、R213、R217、D218、V324、I386、T399、S405、Q445、I551、S587、I591、L610、およびL631からなる群に由来する少なくとも1アミノ酸残基、少なくとも5アミノ酸残基、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも20アミノ酸残基、少なくとも30アミノ酸残基、または全40アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする。
【0035】
語句「ストリンジェントな条件」とは、代表的に、核酸の複雑な混合物において、核酸がその標的核酸にハイブリダイズするが、本質的に他の核酸にはハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境において異なる。より長い核酸は、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての多くの指針は、当該分野において見出され得る(例えば、Tijssen、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−−Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of hybridization and the strategy
of nucleic acid assays」(1993))。一般的に、非常にストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度であるpHにおける、特定の核酸についての熱融点(T)より約5〜10℃低く選択される。低ストリンジェンシー条件は、一般的に、Tを約15〜30℃下回って選択される。Tは、標的と相補的なプローブの50%が、平衡状態においてその標的核酸とハイブリダイズする(その標的核酸が、Tにおいて過剰に存在し、そのプローブの50%が、平衡状態において占有されるような)温度(定義されたイオン強度(pH)および核酸濃度下における)である。ハイブリダイゼーション条件は、代表的に、pH7.0〜8.3において、塩濃度が約1.0Mのナトリウムイオン未満(代表的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン濃度)(または他の塩)の条件であり、そしてその温度は、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)に対しては少なくとも約30℃であり、そして長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより長い)に対しては少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた、安定化剤(例えば、ホルムアミド)の添加によって達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは、ハイブリダイゼーションのバックグラウンドの少なくとも2倍であり、そして好ましくはハイブリダイゼーションのバックグラウンドの10倍である。1つの実施形態において、ストリンジェントな条件は、少なくとも約50℃(通常は約55℃、またはときとして、60℃もしくは65℃)の温度で20分間の0.2×SSC中、または実質的に等価な条件における、少なくとも1回(通常は2回)の洗浄を含む。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、配列番号96、配列番号98、配列番号100、配列番号102、配列番号104、配列番号106、配列番号108、配列番号110、配列番号112、配列番号114、配列番号116、配列番号118、配列番号120、配列番号122、配列番号124、配列番号126、配列番号128、配列番号130、配列番号132、配列番号134、配列番号136、配列番号138、配列番号140、配列番号142、配列番号144、配列番号146、配列番号148、配列番号150、配列番号152、配列番号154、配列番号156、配列番号158、配列番号160、配列番号162、配列番号164、配列番号166、配列番号168、配列番号170、配列番号172、配列番号174、配列番号176、配列番号178、配列番号180、配列番号182、配列番号184、配列番号186、配列番号188、配列番号190、配列番号192、配列番号194、配列番号196、配列番号198、配列番号200、配列番号202、配列番号204、配列番号206、配列番号208、配列番号210、配列番号212、配列番号214、配列番号216、配列番号218、配列番号220、配列番号222、配列番号224、配列番号226、配列番号228、配列番号230、配列番号232、配列番号234、配列番号236、配列番号238、配列番号240、配列番号242、配列番号244、配列番号246、配列番号248、配列番号250、配列番号252、配列番号254、配列番号256、配列番号258、配列番号260のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、55℃で20分間の0.2×SSCにおける少なくとも1回の洗浄後に、特異的にハイブリダイズする。別の実施形態において、ストリンジェントな条件は、約45℃における6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)に続いて、50〜65℃の0.2×SSC、0.1% SDSにおける1回以上の洗浄によるハイブリダイゼーションを包含する。
【0036】
語句「特異的にハイブリダイズする」とは、その配列が複雑な混合物(例えば、全細胞もしくはライブラリーのDNAまたはRNA)中にある場合の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下における、特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二重鎖形成(duplexing)、またはハイブリダイズをいう。
【0037】
本発明の核酸を含有するベクターもまた、包含される。本発明のベクターを含有する細胞または植物もまた、包含される。
【0038】
用語「核酸」または「核酸分子」とは、本明細書中において、5’末端から3’末端に読み取られる、デオキシヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基の1本鎖ポリマーまたは2本鎖ポリマーをいう。それとしては、染色体DNA、自己複製プラスミドおよび一次構造の役割を果たすDNAまたはRNAが挙げられる。用語「コード配列(encoding)」とは、1つ以上のアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、開始コドンまたは停止コドンを要求しない。アミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列およびその相補体によって与えられる6つの異なるリーディングフレームのいずれか1つにコードされ得る。
【0039】
表1は、Cry2Axの配列およびCry2Ax由来の配列ならびに対応する配列同一性の番号を開示する。
【0040】
(5.3:Cry2Ax由来の配列)
本発明のCry2Ax由来のポリペプチドおよび核酸は、1つ以上のアミノ酸の置換、付加および/または削除がコードされるタンパク質に導入されるように、Cry2Axまたは関連する核酸のヌクレオチド配列中へ1つ以上のヌクレオチドの、置換、付加および/または削除を導入することによって形成され得る。一般的に、Cry2Ax由来の配列は、Cry2Axポリペプチドの望ましい特徴を際立たせるかまたは望ましくない特徴を低減させるために形成される。1つの実施形態において、Cry2Ax由来のポリペプチドは、Cry2Axに対して改良された殺虫活性を有し、この活性としては、より強い効力および/または増加した害虫の範囲が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、Cry2Ax由来のポリペプチドは、Cry2Axより良好に発現し、このこととしては、上昇した半減期、分解に対する感受性の減少、および/またはより効率的な転写もしくは翻訳が挙げられるが、これらに限定されない。
【0041】
1つの実施形態において、Cry2Ax(配列番号1)の核酸分子が、Cry2Ax由来のヌクレオチドを形成するための鋳型として使用される。別の実施例において、Cry2Axに関連した核酸が、Cry2Ax由来のヌクレオチドを形成するための鋳型として使用される。特定の実施形態において、Cry2Abが、鋳型として使用される。Cry2Abは、野生型Cry2Abに対して、2つのアミノ酸の変化を有する(GenBank登録番号M23724の、位置36におけるKからR、および位置241のMからT)。別の特定の実施形態において、1回目の改変から単離されたクローンが、さらなる改変のための鋳型として使用され得る(例えば、クローン38、44、および473R;節6.2および節6.4を参照のこと。
【0042】
配列の改変は、定方向の分子的進化技術のような標準的な技術(例えば、DNAシャッフリング法(例えば、Christiansら、1999、Nature Biotechnology 17:259−264;Crameriら、1998、Nature、391:288−291;Crameriら、1997、Nature Biotechnology 15:436−438;Crameriら、1996、Nature Biotechnology 14:315−319;Stemmer、1994、Nature 370:389−391;Stemmerら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.、91:10747−10751;米国特許第5,605,793号;同第6,117,679号;同第6,132,970号;同第5,939,250号;同第5,965,408号;同第6,171,820号;国際公開番号WO 95/22625;同WO 97/0078;同WO 97/35966;同WO 98/27230;同WO 00/42651;およびWO 01/75767を参照のこと);部位特異的変異(例えば、Kunkel、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.、82:488−492;Oliphantら、1986、Gene 44:177−183を参照のこと);オリゴヌクレオチド指向性変異誘発(例えば、Reidhaar−Olsonら、1988、Science 241:53−57を参照のこと);化学的変異誘発(例えば、Eckertら、1987、Mutat.Res.178:1−10を参照のこと);誤差的(error prone)PCR(例えば、Caldwell & Joyce、1992、PCR Methods Applic.2:28−33を参照のこと);およびカセット変異誘発(例えば、Arkinら、Proc.Natl.Acad.Sci.、1992、89:7871−7815を参照のこと);(一般的には、例えば、Arnold、1993、Curr.Opinion Biotechnol.4:450−455;Lingら、1997、Anal.Biochem.、254(2):157−78;Daleら、1996、Methods Mol.Biol.57:369−74;Smith、1985、Ann.Rev.Genet.19:423−462;Botsteinら、1985、Science、229:1193−1201;Carter、1986、Biochem.J.237:1−7;Kramerら、1984、Cell 38:879−887;Wellsら、1985、Gene 34:315−323;Minshullら、1999、Current Opinion
in Chemical Biology 3:284−290を参照のこと)。
【0043】
1つの実施形態において、DNAシャッフリングが、Cry2Ax由来のヌクレオチドを形成するために使用される。DNAシャッフリングは、インビトロ、インビボ、インシリコ、またはそれらの組み合わせにおいて達成される。組換えのインシリコ方法は、遺伝的アルゴリズムが相同的(または非相同的でさえ)な核酸に対応する配列の文字列を組換えるためにコンピューターにおいて使用されて成立し得る。得られる組換えられた配列の文字列は、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成遺伝子の再構築技術と協力して、組換えられた配列に対応する核酸の合成によって核酸に変換される。このアプローチは、ランダム(random)(特に、ランダムな改変または設計された改変)を生成し得る。対応する核酸の生成および設計された核酸の組み合わせ(例えば、交差部位の選定に基づく)ならびに設計された、仮性ランダム(pseudo−random)組換え方法またはランダム組換え方法と相まった、コンピューターシステムにおける遺伝的アルゴリズム、遺伝的演算子などの使用を含むインシリコ組換えに関する多くの詳細は、当該分野において記載される(例えば、国際公開番号WO 00/42560および同WO 00/42559)。
【0044】
別の実施形態において、標的化変異誘発が使用されて、改変のための特定のヌクレオチド配列またはCry2Axの核酸もしくは関連した核酸の位置を選択することによってCry2Ax由来のヌクレオチドを形成する。このような標的化された変異誘発は、核酸中の任意の位置に導入され得る。例えば、標的化変異誘発は、「必須でない」または「必須な」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を生じるヌクレオチド置換をなし得る。「必須でない」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させずに野生型の配列から変更され得る残基であるが、「必須な」アミノ酸残基は、このポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性に必要とされる。例えば、さまざまな種のホモログの間で保存されないかまたは半分しか保存されないアミノ酸残基は、活性にとって必須でないかもしれない。あるいは、さまざまな種のホモログの間で保存されるアミノ酸残基は、活性にとって必須であり得る。
【0045】
このような標的化変異誘発は、保存的または非保存的であり得る。「非保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン)、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。
【0046】
非保存的アミノ酸残基置換に代えてか、またはこれに加えて、このような標的化変異誘発は、保存的であり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。変異誘発後、コードされたタンパク質は、組換え的に発現され得、そしてタンパク質の活性が、決定され得る。
【0047】
別の実施例において、ランダム変異誘発が使用されて、Cry2Ax由来のヌクレオチドを形成する。突然変異は、そのコード配列の全てまたは一部にそってランダムに導入され得る(例えば、飽和変異誘発によって)。特定の実施形態において、同様のドメイン、構成的モチーフ、活性部位を有するか、またはミスマッチもしくは不完全なミスマッチを伴って本発明のCry2Axの一部との整列する他の関連したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列の多様性を生じるために変異誘発プロセスにおいて使用され得る。
【0048】
上記の技術のいくつかにおけるそれぞれの変異誘発工程について、その工程のいずれかまたは全てに関する多くの反復性の周期が、配列の多様性を最適化するために行われ得ることが理解されるべきである。上記の方法は、任意の所望の順序で組み合わせて使用され得る。多くの場合において、この方法は、変更された核酸配列のプールまたは変更された核酸配列を含む組換え宿主細胞のプールを生じる。所望の特性を有する、変更された核酸配列または変更された核酸配列を発現する宿主細胞は、当該分野において公知である1種以上のアッセイを用いるスクリーニングによって同定され得る。このアッセイは、所望の物理的特性または化学的特性を有するポリペプチドを選択する条件下において実施され得る。この核酸配列における変更は、そのクローンにおいて変更されたポリペプチドをコードする核酸分子を配列決定することによって決定され得る。
【0049】
さらに、Cry2Axの核酸分子およびCry2Ax由来の核酸分子は、完全にまたは部分的に、最適化されたコドンであり得る。任意の1種のアミノ酸(メチオニンを除く)は、多くのコドンによってコードされる(表2)ので、その核酸分子の配列は、コードされるアミノ酸を変えずに変化され得る。コドンの最適化は、アミノ酸は変えられないが、特定の宿主生物における発現が増加するように、1つ以上のコドンが核酸レベルで変更される場合である。当業者は、広範な生物についての優先性の情報を提供する表および他の参考文献が当該分野において利用可能であることを認識する。
【0050】
(5.4:殺虫活性をアッセイする方法)
本明細書中で使用される場合、用語「殺虫活性」とは、ポリペプチドを摂取した際に、昆虫の摂食を減少もしくは阻害しそして/または昆虫の死亡率を増加させるそのポリペプチドの能力をいう。任意の昆虫に作用するが、好ましくは鱗翅目および双翅目の昆虫が影響を受ける。
【0051】
種々のアッセイが使用されて、本発明の特定のポリペプチドが殺虫活性を有するか否かを決定され得、そして殺虫活性を有する場合、どの程度であるかが決定され得る。一般的に、昆虫の害虫は、摂取され得る任意の形態で本発明のポリペプチドを与えられる。本発明のポリペプチドの摂取に対する昆虫の害虫の反応が、観察される(例えば、約1日間〜3日間)。本発明のポリペプチドを摂取した後の摂食の減少もしくは阻害および/または昆虫の害虫の死亡率の増加が、殺虫活性の指標である。非公知である殺虫活性を有する本発明のポリペプチドは、正および/または負のコントロールと比較されて、より正確にアッセイの結果を評価されるべきである。
【0052】
1つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、精製(可溶化形態および結晶形態のいずれか)され、そして昆虫の食餌に添加される。
【0053】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、組換え微生物(例えば、E.coli)中で発現される。この組換え微生物は、上記昆虫の害虫に直接摂食される(Moellenbeckら、2001、Nat.Biotechnol.19:668を参照のこと)。
【0054】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、植物中で発現され、そしてこの植物は、上記昆虫の害虫に摂食される。潜伏期間の後、この昆虫の害虫の摂食活性は、通常は昆虫の害虫によって食べられる植物の部分の目視観察(例えば、残った葉の面積のおおよその割合の)またはビデオキャプチャー(video capture)(例えば、残った葉の面積の画素の数)によって決定され得る。特定の実施形態において、植物中での本発明のポリペプチドの発現は、一時的である。このような実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、植物発現ベクター中にクローニングされ、そしてAgrobacterium tumefaciens中にトランスフェクトされる。この形質転換された細菌は、N.benthamianaから得た葉と共に培養され、そして強制的な浸潤を使用して、この葉は本発明のポリペプチドを発現する。しかし、このポリペプチドの発現は、葉の共培養物の間で可変である。別の特定の実施形態において、植物中での本発明のポリペプチドの発現は、安定である。このような実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物が、作製される。
【0055】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドの殺虫活性は、培養細胞を使用して細胞死および/または細胞増殖を測定することによってアッセイされ得る。このようなアッセイは、代表的にはスクリーニングされる特定の毒素に感受性である培養昆虫細胞、または天然にかもしくは異種遺伝子の発現の結果としてのいずれかによって特定の細胞に対するレセプターを発現する細胞の使用を包含する。したがって、昆虫細胞に加えて、哺乳動物細胞、細菌細胞、および酵母細胞は、とりわけインビトロのアッセイに有用な細胞である。培養細胞に対する毒性を測定するインビトロのバイオアッセイは、当該分野において記載される(例えば、Johnson、1994、J.Invertebr.Pathol.63:123−129)。
【0056】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドの殺虫活性は、標的とする昆虫由来の中腸上皮膜小胞における細孔形成を測定することによってアッセイされ得る(JuttnerおよびEbel、1998、Biochim.Biophys.Acta 1370:51−63.;Englishら、1991、Insect Biochem.21:177−184)。このようなアッセイは、膜小胞の内腔からの、リガンドが活性化する基質の毒素制御性の放出によって構成され得る。このことは、このリガンドがこの小胞の外側にあることを必要とする。あるいは、逆のシナリオが利用され得る。このシナリオによって、そのリガンドは小胞の内腔にあり、活性化される用意をされた基質がその小胞の外側に位置する。毒素活性がより高ければ、より大きい数またサイズの細孔が形成される。
【0057】
(5.5:植物の虫害抵抗性を増強する方法)
本発明は、Cry2に関連する殺虫性ポリペプチドの使用によって昆虫の害虫に対する植物の抵抗性を増強する方法を提供し、この害虫としては、Helicoverpa種(例えば、Helicoverpa Zea)および/またはSpodoptera種(例えば、Spodopter exigua)のメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。当該分野において公知である任意の方法が使用されて、植物を摂食する過程の間に、昆虫の害虫に本発明の1種以上のポリペプチドを摂取させ得る。このようにして、昆虫の害虫は、殺虫性の量の1種以上の本発明のポリペプチドを摂取し、そして植物の摂食をやめ得る。いくつかの実施形態において、この昆虫の害虫は、1種以上の本発明のポリペプチドの摂取によって殺傷される。他の実施形態において、この昆虫の害虫は、殺傷されることなく植物の摂食を阻害されるか、またはやめされられる。
【0058】
1つの実施形態において、トランスジェニック植物は、1種以上の本発明のポリペプチドを発現するように作製され得る(一般的に、トランスジェニック植物産生の方法に関する節5.7を参照のこと)。このトランスジェニック植物は、全ての組織中で1種以上の本発明のポリペプチドを発現し得る(例えば、全体的発現(global expression))。あるいは、1種以上の本発明のポリペプチドは、組織の小集団においてのみ発現(例えば、組織特異的発現)され得、好ましくは昆虫の害虫によって食べられる組織において発現され得る。本発明のポリペプチドは、植物中で構成的に発現され得るか、または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
【0059】
別の実施形態において、1種以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物が、上記昆虫の害虫の影響を受けやすい植物の外側に塗布され得る。この組成物の外面塗布としては、この植物の全体もしくは一部のいずれかに対する直接の塗布、および/または間接的な塗布(例えば、土壌のような植物を取り巻く環境に対する)が挙げられる。この組成物は、当該分野において公知である任意の方法によって塗布され得、この方法としては、噴霧、散布、散水などが挙げられるが、これらに限定されない。一般的に、この組成物は、植物の成長の間にいつでも塗布され得る。当業者は、当該分野において公知である方法を使用して、この組成物の投与に最適な時期を実験的に決定し得る。最適な投与時期に影響する因子としては、影響を受けやすい植物の型、昆虫の害虫の型、本発明の1種以上のポリペプチドのどれがその組成物において投与されるかが挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
1種以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物は、実質的に精製されたポリペプチド、細胞懸濁物、細胞ペレット、細胞上清、細胞抽出物、またはBacillus thuringiensis細胞の胞子−結晶複合体であり得る(一般的に、組変えポリペプチド合成技術に関する節5.6を参照のこと)。1種以上の本発明のポリペプチドを含有する組成物は、溶液の形態、エマルジョンの形態、懸濁物の形態、または粉末の形態であり得る。液体処方物は、水性ベースでも非水性ベースでもよく、そして発泡体、ゲル、懸濁物、乳剤などとして提供されてもよい。この処方物は、1種以上の本発明のポリペプチドに加えて薬剤を含み得る。例えば、組成物は、拡散−固着補助剤、安定化剤、他の殺虫性添加剤、希釈剤、この組成物のレオロジー特性または安定性を最適化する薬剤(例えば、界面活性剤、乳化剤、分散剤、またはポリマー)をさらに含有し得る。
【0061】
別の実施形態において、1種以上の本発明のポリペプチドを発現する組換え宿主は、昆虫の害虫による攻撃に影響を受けやすい植物に適用されるか、または近づけられる。この組換え宿主としては、細菌宿主、および1種以上の本発明の核酸分子によって形質転換され、そして1種以上の本発明の核酸分子(従って、ポリペプチド)を発現する昆虫ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、この組換え宿主は、本発明のポリペプチドを、昆虫の害虫と接触するように宿主の周囲の環境に分泌する。他の実施形態において、この組換え宿主は、昆虫の蔓延に影響を受けやすい1つ以上の植物組織に定着する。
【0062】
(5.6:組換え体の発現)
本発明の核酸分子およびポリペプチドは、当該分野において周知である標準的な組換えDNA技術および分子クローニング技術を使用して組換え的に発現され得る(例えば、Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor、1989)。さらに、組換えDNA技術が使用されて、トランスジェニック植物の作製に使用するのに適した核酸構築物が生成され得る(節5.7を参照のこと)。
【0063】
したがって、本発明のある局面は、本発明の核酸分子を含むベクター(好ましくは発現ベクター)またはその改変体に関連する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、そのベクターに連結された別の核酸を運び得るポリヌクレオチドをいう。ベクターの1つの型は、「プラスミド」であり、プラスミドとは、さらなるDNAセグメントが導入され得る環状二本鎖DNAの環をいう。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、さらなるDNAセグメントが、ウイルスゲノム中に導入され得る。
【0064】
特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自立的に複製可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソームベクター)。他のベクター(例えば、非エピソームベクター)は、宿主細胞中への導入の際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主のゲノムにしたがって複製される。一般的に、多くの場合、組換えDNA技術に利用される発現ベクターは、プラスミド(ベクター)の形態である。しかし、本発明は、このような発現ベクターの他の形態(例えば、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス))を包含することを意図される。
【0065】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸分子の発現に適した形態である本発明の核酸分子を含む。このことは、その組換え発現ベクターが、1つ以上の制御配列を含み、この配列は、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、この配列は、発現されるポリヌクレオチドと作動可能に結合されることを意味する。組換え発現ベクターに関して、「作動可能に結合される」は、目的のヌクレオチド配列がこのヌクレオチド配列の発現を可能(例えば、インビトロ転写/翻訳システムまたはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において)にする様式で制御配列に連結されることを意味することを意図される。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことを意図される。このような制御配列は、当該分野において記載される(例えば、Goeddel、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology、1990、Academic Press、San Diego、CA)。制御配列としては、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を導く配列、および特定の宿主細胞においてのみこのヌクレオチド配列の発現を導く配列が挙げられる(例えば、組織特異的制御配列)。発現ベクター設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベル、発現が望まれる生物の領域などのような要因に依存し得ることが当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、それによってタンパク質またはペプチドを産生し得、このタンパク質およびペプチドとしては、本明細書に記載されるような核酸分子によってコードされる融合タンパク質または融合ペプチドが挙げられる。
【0066】
いくつかの実施形態において、プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸は、本発明のポリヌクレオチドの発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために、本発明のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置(一般的には上流)に導入され得る。例えば、内在性プロモーターは、変異、欠失、および/または置換によってインビボで変えられ得るか(米国特許第5,565,350号;国際特許出願番号PCT/US93/03868を参照のこと)、または単離されたプロモーターは、遺伝子の発現を制御するために、本発明のポリヌクレオチドの同起源の遺伝子から適切な方向および適切な距離で植物細胞に導入され得る。遺伝子の発現は、植物細胞中の本発明のポリペプチドの総濃度および/または組成を変えるために、植物の成長に適した条件下で調節され得る。従って、本発明は、ネイティブな内因性(すなわち、非異種)の形態の本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結された異種プロモーターおよび/または異種エンハンサーを作製するための組成物、および方法を提供する。
【0067】
ポリペプチドの発現が望まれる場合、ポリヌクレオチドコード領域の3’末端にポリアデニル化領域を含むことが、一般的には望ましい。このポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物の遺伝子、またはT−DNAに由来し得る。付加される3’末端の配列は、例えば、ノパリンシンターゼ遺伝子またはオクトピンシンターゼ遺伝子に由来し得るか、または代替的に別の植物の遺伝子に由来し得るか、またはあまり好ましくないが任意の他の真核生物の遺伝子に由来し得る。
【0068】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物(例えば、腸内細菌科(例えば大腸菌属;バシラス属);根粒菌科(Rhizoboceae)(例えば、根粒菌属および根圏細菌);スピリリウム科(例えば、フォトバクテリウム属;ザイモモナス属;セラチア属;エアロモナス族;ビブリオ属;デスルフォビブリオ属;スピリルム属); 乳酸桿菌科;シュードモナス科(例えば、シュードモナス属および酢酸菌属);アゾトバクター科およびニトロバクター科)、または真核細胞(例えば、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞)における本発明のポリペプチドの発現のために設計され得る(Goeddel、前出の、適切な宿主細胞についての議論を参照のこと)。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター制御配列およびT7ポリメラーゼを使用してインビトロで転写および翻訳され得る。
【0069】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を導く構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含むベクターを有するE.coliで実施される。融合ベクターは、そこにコードされたタンパク質に多くのアミノ酸を付加し、通常はこの組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、代表的に、以下の少なくとも3つの目的を果たす:1)組換えタンパク質の発現を増加すること;2)組換えタンパク質の可溶性を増加すること;および/または3)アフィニティー精製のリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助すること。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性の切断部位が、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質の分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接続部分に導入される。このような酵素、およびこれらの同起源の認識配列としては、Factor Xa、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、pGEX(Pharmacia Biotech Inc;SmithおよびJohnson、1988、Gene 67:31−40)、pMAL(New England Biolabs、Beverly、MA)およびpRIT5(Pharmacia、Piscataway、NJ)が挙げられ、これらは、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはタンパク質Aを標的組換えタンパク質に、それぞれ融合させる。
【0070】
別の実施形態において、上記発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S.cerevisiaeにおける発現のためのベクターの例としては、pYepSec1(Baldariら、1987、EMBO J.6:229〜234)、pMFa(KurjanおよびHerskowitz、1982、Cell 30:933〜943)、pJRY88(Schultzら、1987、Gene 54:113〜123)、pYES2(Invitrogen Corp.、San Diego、CA)、およびpPicZ(Invitrogen Corp.、San Diego、CA)が挙げられる。
【0071】
あるいは、上記発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)におけるタンパク質の発現に使用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ(Smithら、1983、Mol.Cell Biol.3:2156〜2165)およびpVLシリーズ(LucklowおよびSummers、1989、Virology 170:31〜39)が挙げられる。
【0072】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、植物発現ベクターを使用して植物細胞において発現され、このベクターとしては、タバコモザイクウイルス発現ベクターおよびジャガイモウイルス発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
原核細胞および真核細胞の両方に対する他の適切な発現系は、当該分野において公知である(例えば、Sambrookら 1990、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NYの第16章および第17章を参照のこと)。
【0074】
多くのプロモーターが、本発明の実施に使用され得る。このプロモーターは、所望の結果に基づいて選択され得る。上記核酸は、宿主生物における発現のために、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導プロモーター、または他のプロモーターと結合され得る。
【0075】
「組織特異的プロモーター」は、特異的な組織の型、生物の型または細胞の型において、本発明の核酸の発現を導き得る。組織特異的プロモーターは、誘導性であり得る。同様に、組織特異的プロモーターは、特定の時間枠またはその組織の発達段階内で転写を促進するのみであり得る。他の組織特異的プロモーターは、特定の組織の生活環にわたって活性であり得る。当業者は、組織特異的プロモーターが、標的組織以外の組織において作動可能に連結した配列の発現を駆動し得ることを認識する。従って、本明細書中で使用される場合、組織特異的プロモーターは、標的とする組織の型または細胞の型において優先的に発現を駆動するが、他の組織においても同様に、ある程度の発現を引き起こし得るプロモーターである。多くの組織特異的プロモーターが、本発明において使用され得る。適切なプロモーターによって、任意の器官(例えば、苗条栄養器官/構造体(例えば、葉、茎および塊茎)、根、花および花の器官/構造体(例えば、苞葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯および珠柄)、種子(胚、胚乳、および種皮を含む)および果実)が、標的化され得る。例えば、葉、根、または花において核酸の発現を導くプロモーターは、これらの器官に影響を及ぼす害虫に対する抵抗性を増強するために有用である。植物の地上(aerial)の栄養器官における本発明のポリヌクレオチドの発現に関して、光合成組織特異的プロモーター(例えば、RBCSプロモーター(Khoudiら、Gene 197:343、1997))が、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドの根に特異的な発現は、根特異的プロモーター(例えば、ANR1遺伝子由来のプロモーター(ZhangおよびForde、Science、279:407、1998)の制御下で達成され得る。他の例示的なプロモーターとしては、大豆由来の根特異的グルタミンシンテターゼ遺伝子(Hirelら、1992、Plant Molecular Biology 20:207−218)およびサヤインゲンのGRP 1.8遺伝子における根特異的制御エレメント(Kellerら、1991、The Plant Cell 3:1051−1061)が挙げられる。
【0076】
「構成的プロモーター」は、全組織において遺伝子の発現を導き、そして大部分の環境条件および発育の段階または細胞の分化の下で活性であるプロモーターとして定義される。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35S転写開始領域、Agrobacterium tumafaciensのT−DNAに由来する1’−プロモーターまたは 2’−プロモーター、および当業者に公知である種々の植物の遺伝子由来の他の転写開始領域が挙げられる。このような遺伝子としては、例えば、Arabidopsis由来のACT11(Huangら、1996、Plant
Mol.Biol.33:125−139)、Arabidopsis由来のCat3(GenBank登録番号U43147、Zhongら、1996、Mol.Gen.Genet.251:196−203)、Brassica napus由来のステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子(Genbank登録番号X74782、Solocombeら、1994、Plant Physiol.104:1167−1176)、トウモロコシ由来のGPc1(GenBank登録番号X15596、Martinezら、1989、J.Mol.Biol.208:551−565)、およびトウモロコシ由来のGpc2(GenBank登録番号U45855、Manjunathら、1997、Plant Mol.Biol.33:97−112)が挙げられる。任意の強力な構成的プロモーター(例えば、CaMV 35Sプロモーター)が、植物全体での本発明のポリヌクレオチドの発現のために使用され得る。
【0077】
用語「誘導プロモーター」とは、的確な環境制御または発育制御下にあるプロモーターをいう。誘導プロモーターによって転写を達成し得る環境条件の例としては、嫌気性条件、高温、光の存在、または化学物質/ホルモンの噴霧が挙げられる。
【0078】
植物の宿主細胞における使用のための適切な構成的プロモーターとしては、例えば、Rsyn7プロモーターのコアプロモーターおよび他の関連した構成的プロモーター(国際公開番号WO 99/43838および米国特許第6,072,050号);コアCaMV 35Sプロモーター(Odellら、1985、Nature 313:810−812);イネのアクチン(McElroyら、1990、Plant Cell 2:163−171);ユビキチン(Christensenら、1989、Plant Mol.Biol.12:619−632およびChristensenら、1992、Plant Mol.Biol.18:675−689);pEMU(Lastら、1991、Theor.Appl.Genet.81:581−588);MAS(Veltenら、1984、EMBO J.3:2723−2730);ALSプロモーター(米国特許第5,659,026号)、など(例えば、米国特許第5,608,149号;同第5,608,144号;同第5,604,121号;同第5,569,597号;同第5,466,785号;同第5,399,680号;同第5,268,463号;同第5,608,142号;および同第6,177,611号)が挙げられる。
【0079】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関連する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される。このような用語が特定の被検体細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。特定の改変が、突然変異または環境的影響のいずれかに起因してその後の世代に生じ得るので、実際に、このような子孫は、親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書中で使用される場合は、その用語の範囲内になお含まれる。
【0080】
したがって、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクター、またはその改変体を有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞(例えば、E.coli、Bacillus thuringiensis)または真核細胞(例えば、昆虫細胞、酵母細胞または植物細胞)であり得る。本発明はまた、以下の工程を包含する、本発明の核酸を発現しそれによってコードされたポリペプチドを作製するための方法を提供する:i)コードされたポリペプチドの産生を可能にする条件下で本発明の核酸分子を含む細胞を培養する工程;およびii)発現したポリペプチドを単離する工程。
【0081】
ベクターDNAは、慣習的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、宿主細胞に外来の核酸分子を導入するための種々のその分野で認識された技術をいうことを意図され、この技術としては、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、当該分野において見出され得る(例えば、Sambrookら、前出)。
【0082】
(5.7:トランスジェニック植物の産生)
当該分野において公知である任意の方法が、本発明の核酸分子によって植物または植物細胞を形質転換するために使用され得る。核酸分子は、植物のDNA(例えば、ゲノムDNAまたはクロロプラストDNA)中に組み込まれても植物のDNA中への挿入を伴わずに維持(例えば、人工染色体の使用によって)されてもよい。植物細胞に核酸分子を導入する適切な方法としては、マイクロインジェクション(Crosswayら、1986、Biotechniques 4:320−334);エレクトロポレーション(Riggsら、1986、Proc.Natl.Acad.Sci.83:5602−5606;D’Halluinら、1992、Plant Cell 4:1495−1505);アグロバクテリウム媒介性形質転換(米国特許第5,563,055号および同第5,981,840号、Osjodaら、1996、Nature Biotechnology 14:745−750;Horschら、1984、Science 233:496−498、Fraleyら、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.80:4803、ならびにGene Transfer to Plants、Potrykus編、Springer−Verlag、Berlin 1995);遺伝子直接導入(direct gene transfer)(Paszkowskiら、1984、EMBO J.3:2717〜2722);弾道粒子加速(ballistic particle acceleration)(米国特許第4,945,050号;同第5,879,918号;同第5,886,244号;同第5,932,782号;Tomesら、1995、「Direct DNA Transfer into Intact
Plant Cells via Microprojectile Bombardment,in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture: Fundamental Methods編、GamborgおよびPhillips、Springer−Verlag、Berlin;ならびにMcCabeら、1988、Biotechnology 6:923〜926);ウイルス媒介性形質転換(米国特許第5,889,191号、同第5,889,190号、同第5,866,785号、同第5,589,367号および同第5,316,931号);花粉の形質転換(pollen transformation)(The Experimental Manipulation of Ovule Tissues編のDe Wetら、1985、Chapmanら、Longman、New York、pp.197−209);Lec 1形質転換(米国特許出願番号09/435,054;国際公開番号WO 00/28058);ウィスカー媒介性形質転換(Kaepplerら、1990、Plant Cell Reports 9:415−418;Kaepplerら、1992、Theor.Appl.Genet.84:560−566);およびクロロプラスト形質転換技術(Bogorad、2000、Trends in Biotechnology 18:257−263;Rameshら、2004、Methods Mol Biol.274:301−7;Houら、2003、Transgenic Res.12:111−4;Kindleら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.88:1721−5;BatemanおよびPurton、2000、Mol Gen Genet.263:404−10;Sidorovら、1999、Plant J.19:209−216)が挙げられる。
【0083】
トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞を産生するために使用される形質転換プロトコルの選択は、形質転換の標的される植物または植物細胞の型(すなわち、単子葉植物または双子葉植物)に依存して変わり得る。特定の植物の型に特に適した形質転換プロトコルの例としては:ジャガイモ(Tuら、1998、Plant Molecular Biology 37:829−838;Chongら、2000、Transgenic Research 9:71−78);大豆(Christouら、1988、Plant Physiol.87:671〜674;McCabeら、1988、BioTechnology 6:923〜926;FinerおよびMcMullen、1991、In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175−182;Singhら、1998、Theor.Appl.Genet.96:319−324);トウモロコシ(Kleinら、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.85:4305〜4309;Kleinら、1988、Biotechnology 6:559〜563;Kleinら、1988、Plant Physiol.91:440〜444;Frommら、1990、Biotechnology 8:833〜839;Plant Cell,Tissue,and Organ CultureのTomesら、1995、「Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,」:Fundamental Methods編、Gamborg(Springer−Verlag、Berlin));穀類(Hooykaas−Van Slogterenら、1984、Nature 311:763−764;米国特許第5,736,369)についてのプロトコルが挙げられる。
【0084】
いくつかの実施形態において、1つより多い構築物が、トランスジェニック植物およびトランスジェニック植物細胞の産生における形質転換のために使用される。複数の構築物は、シス位またはトランス位に含まれ得る。好ましい実施形態において、各構築物は、プロモーターおよび他の制御配列を有する。
【0085】
上記の形質転換技術のいずれかによって誘導される形質転換植物細胞が培養されて、植物全体が再生され、この植物は、形質転換された遺伝子型を有し、したがって所望の表現型を有する。このような再生技術は、組織培養物の増殖培地中の特定の植物ホルモンの操作に依存し、代表的には所望のヌクレオチド配列と一緒に導入される殺虫マーカーおよび/または除草マーカーに依存する。培養されたプロトプラストからの植物の再生は、当該分野において記載される(例えば、Evansら、Protoplasts Isolation and Culture、Handbook of Plant Cell Culture、pp.124−176、MacMillilan Publishing Company、New York、1983;およびBinding、Regeneration of Plants、Plant Protoplasts、pp.21−73、CRC Press、Boca Raton、1985)。再生はまた、植物のカルス、外植片、器官、またはそれらの一部から得られ得る。このような再生技術もまた、当該分野において記載される(例えば、Plant Phys.38:467−486のKleeら、1987、Ann.Rev.)。
【0086】
用語「植物」は、植物全体、苗条の栄養器官/構造体(例えば、葉、茎および塊茎)、根、花および花の器官/構造体(例えば、苞葉、萼片、花弁、雄ずい、心皮、葯および珠柄)、種子(胚、胚乳、および種皮を含む)および果実(成熟した子房)、植物組織(例えば、維管束組織、基本組織など)および細胞(例えば、孔辺細胞、卵細胞、毛状突起など)、ならびにそれらの子孫を含む。本発明の方法に使用され得る植物の分類は、形質転換技術を受け入れやすい高等植物および下等植物の分類を含み、この分類としては、被子植物(単子葉植物および双子葉植物)、裸子植物、シダ類、および多細胞性の藻類が挙げられる。種々の倍数性レベル(異数体の植物、倍数体の植物、二倍体の植物、半数体の植物および半接合体の植物が挙げられる)の植物もまた、含まれる。
【0087】
本発明の核酸分子が使用されて、本質的に任意の植物に対して所望の形質が与えられる。したがって、本発明は、広範な植物に対する用途を有し、これらの植物としては、ヌカボ属(Agrotis)、ネギ属、パイナップル属、カシューナッツ属、セロリ属、ラッカセイ属、アスパラガス属、Athamantha属、ベラドンナ属、カラスコムギ属、ホウライチク属、ベタ属、アブラナ属、イヌムギ属、Browaalia属、ツバキ属、アサ属、パパイヤ属、イナゴマメ属、ヒヨコマメ属、アカザ属、キコリウム属、ミカン属、スイカ属、トウガラシ属、ベニバナ属、ココヤシ属、コーヒー属、ハトムギ属、キュウリ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、カモガヤ属、チョウセンアサガオ属、ニンジン属、カワラナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、アブラヤシ属、Eliusine属、トウダイグサ属、ウシノケグサ属、イチジク属、オランダイチゴ属、ゲンノショウコ属、ダイズ属、イネ科(Graminae)、ワタ属、ヒマワリ属、Heterocallis属、パラゴムノキ属、フヨウ属、オオムギ属、ヒヨス属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、スイートピー属、ヒラマメ属、ユリ属、アマ属、ドクムギ属、ミヤコグサ属、ルピナス属、トマト属、マカダミア属、アジサイ属(Macrophylla)、リンゴ属、マンゴー属、キャッサバ属、オリガヌム属(Majorana)、ウマゴヤシ属、バショウ属、スイセン属、ネメシア属、タバコ属、オノブリキス属、オリーブ属、Olyreae属、イネ属、キビ属(Panicum)、キビ属(Panicum)、Panieum属、Pannisetum属、キカラシバ属、ペチュニア属、ペラルゴニウム属、アボガド属、Pharoideae属、インゲンマメ属、アワガエリ属、トウヒ属、イチゴツナギ属、マツ属、トリバハゼノキ属(Pistachia)、エンドウ属、ドロノキ属、トガサワラ属、ナシ属、サクラ属、Pseutotsuga属、バンジロウ属、カシ属、キンポウゲ属、ダイコン属、スグリ属、ヒマ属、ツツジ属、バラ属、サトウキビ属、サルメンバナ属、ライムギ属、キオン属、セタリア属、コウヤマキ属、カラシ属、ナス属、モロコシ属、イヌシバ属、カカオノキ属(Theobromus)、レイリョウコウ属(Trigonella)、クローバー属、レイリョウコウ属(Trigonella)、パンコムギ属、ツガ属、チューリップ属、ソラマメ属、ブドウ属、アズキ属、およびトウモロコシ属由来の種が挙げられる。
【0088】
特定の実施形態において、トランスジェニック植物は、トウモロコシ植物、ジャガイモ植物、米植物、大豆植物または綿植物である。
【0089】
トランスジェニック植物は、育てられ得、そして同じ形質転換株または異なる株のいずれかによって受粉され得る。この植物の2つ以上の世代が育てられて、所望の核酸分子、ポリペプチドおよび/または表現型の特性の発現が安定に維持され、そして遺伝されることが確実にされ得る。当業者は、本発明の核酸分子が安定にトランスジェニック植物に組み込まれ、そして作動可能である確認された後、この核酸分子が雌雄の交雑によって他の植物に導入され得ることを認識する。多くの標準的な育種技術のいずれかが使用され得、交雑される種に依存する。
【0090】
(5.8:トランスジェニック植物中の発現の決定)
当該分野において公知である任意の方法が、本発明の核酸分子またはそれにコードされるポリペプチドの植物中の発現のレベルを決定するために使用され得る。例えば、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドの植物中の発現レベルは、イムノアッセイ、定量的なゲル電気泳動などによって決定され得る。さらに、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドの植物中の発現レベルは、この植物の表現型が変化する程度によって決定され得る。特定の実施形態において、増強された昆虫抵抗性は、アッセイされるべき表現型である。
【0091】
本明細書中で使用される場合、「増強した昆虫抵抗性」とは、本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して、害虫による消費および/または蔓延に対する本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物の上昇した抵抗性をいう。増強した抵抗性は、多くの手段で測定され得る。1つの実施形態において、増強した抵抗性は、同じ期間の昆虫の潜伏期間後に、本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して、本発明のポリペプチドを発現する植物に対する減少した損傷によって測定される。昆虫による損傷は、視覚的に評価され得る。例えば、綿植物において、蔓延後の損傷は、昆虫による消費の跡について綿植物のボウルを直接見ることによって測定され得る。別の実施形態において、増強した抵抗性は、同じ期間の昆虫の潜伏期間後に、本発明のポリペプチドを発現しない植物と比較して、本発明のポリペプチドを発現する植物から得られる増加した作物の収量によって測定される。特定の実施形態において、昆虫の害虫は、鱗翅目および/または双翅目に由来する。
【0092】
決定は、全植物、全植物の組織、または植物細胞培養物を使用して行われ得る。
【0093】
0.97MBであり、そして2005年2月24日に作成され、そして一緒に提出された配列表は、その全体が参考として援用される。
【0094】
本明細書中に列挙される全ての刊行された文献、書籍、リファレンスマニュアルおよび抄録の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用され、これらは、本発明が関連する分野の状態をより完全に記載する。
【0095】
種々の変更が、本発明の範囲および精神から逸脱せずに上記の内容においてなされ得る場合、上記の記載に含まれ、そして/または添付の特許請求の範囲に定義される全ての内容は、本発明の説明および例示として解釈されるべきことが意図される。本発明の改変およびバリエーションが、上述の教示を考慮して可能である。
【実施例】
【0096】
(6.1:実施例1:第一次昆虫スクリーニング)
第一次昆虫スクリーニングは、Helicoverpa種に対する活性を有する多様な生物の収集物からBt培養物を同定した。このスクリーニングを、Helicoverpa zeaの生まれたばかりの幼生に対して1回の高用量で、胞子−結晶複合体サンプルによって行った。
【0097】
胞子−結晶複合体サンプルを、1mlのCYS胞子形成培地(Yamamoto、1990、Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis 432:46−60)を含む深いウェルの生成プレートにおいて調製した。この生成プレートを、10μlの種培養物で播種した。この種培養物は、−80℃にて凍結を維持し、そして30℃でインキュベートし、ほとんどの培養物が胞子形成し、そして遊離の胞子および結晶を放出するまで350rpmで3日間インキュベートしていた。このプレートを、4000rpmで40分間遠心分離して、胞子、結晶および溶解していない細胞を沈殿させた。この沈殿した胞子−結晶複合体を、100μgのリソチームを含む1.2mlの15mM酢酸カリウムに懸濁し、そして30℃、250rpmで16時間インキュベートして完全な胞子形成および細胞の溶解を確実にした。16時間のインキュベーションの後、胞子−結晶複合体を、遠心分離によって回収し、そして15mMの酢酸カリウムに懸濁した。この酢酸カリウム工程を、1回繰り返した。最終的な胞子−結晶懸濁物を、1mlの15mM酢酸カリウム中に作製し、そしてH.zea活性についてのスクリーニングに使用した。
【0098】
昆虫スクリーニングを、各ウェルに150μlの人工の昆虫用食餌を含む浅い96ウェルプレートにおいて行った。20μlの胞子−結晶懸濁物を、この昆虫用食餌上においた。約5匹の生まれたばかりの幼生を、各ウェル中においた。この昆虫アッセイプレートを29℃で3日間インキュベートした。Bt結晶に応答する昆虫としては、摂食の阻害および死亡が挙げられた。約400個の培養物は、実質的な死亡を示し、そしてこれによって陽性として同定した。Cry2Axは、とりわけ陽性であった。
【0099】
(6.2:実施例2:Cry2Ax由来のポリペプチドを単離するためのDNAシャッフリング)
Cry2Axポリペプチド(配列番号2)およびCry2Ab*ポリペプチド(Cry2Abは、野生型Cry2Abに対して2つのアミノ酸の変化を有する;GenBank登録番号M23724の位置36におけるKからRおよび位置241におけるMからT)を初めとして、合成DNAの鋳型を、DNAシャッフリングのために生成した。Cry2Ab(GenBank登録番号M23724)およびCry2Ax(配列番号2)の系統的な比較を使用して、ライブラリーを作製し、このライブラリーは40個のアミノ酸の位置を変化させ(節5.1を参照のこと)、これらは、これらの2つのポリペプチド配列の間で異なっていた。シャッフリングしたDNAライブラリーを、親DNAの鋳型として作用するCry2Axをコードする合成遺伝子とのシャッフリングを導いたオリゴヌクレオチドを使用して作製した。PCR DNAライブラリーを、Cry2Ab遺伝子を置換することによってpMAXY3219にクローニングした。この毒素のクローンを、これらがE.coliマルトース結合タンパク質(MBP)への融合として発現されるように構築した。第一次昆虫スクリーニングは、Helicoverpa種に対して活性な培養物を同定した。このスクリーニングを、人工食餌中の1つの低用量にて、MBP::Cry2Ax由来のポリペプチド融合体を発現する少量のE.coli培養物を組み込み、次いでH.zeaの幼生を蔓延させることによって行った。スクリーニングは、各ウェル中に人工の昆虫用食餌を含む150μlの浅い96ウェルプレートにおいて行った。約0.5μlのMBP::Cry2Ax由来のポリペプチド融合体を発現する培養物を、昆虫用食餌に組み込んだ。約5匹のH.zeaの生まれたばかりの幼生を、各ウェル中においた。この昆虫アッセイプレートを、29℃で4日間インキュベートした。E.coliサンプルへの昆虫の応答としては、摂食の阻害および死亡が挙げられた。この幼生に深刻な発育阻止または死を引き起こすサンプルを、さらなる分析のために再び配列した。
【0100】
この第1回のライブラリーのスクリーニングは、Cry2AxおよびCry2Abに対して改良された殺虫活性を有する数種のクローンの発見を生じた。特に、クローン38(D_S00503480)(配列番号4)およびクローン44(D_S00503970)(配列番号6)が、発現した場合に非常に活性であることが見出された(データは示さず)。したがって、これらのクローンを、次の回のDNAシャッフリングのために選択した。
【0101】
第2回のシャッフリングのために、クローン38(D_S00503480)(配列番号4)およびクローン44(D_S00503970)(配列番号6)に由来する親DNAの鋳型を、ウラシルの存在下においてPCRで増幅し、次いでウラシルN−グリコシラーゼによってフラグメント化した。次いでこのフラグメント化した鋳型を、混合し、組換え鋳型をPCRによって増幅する前に再び集めた。これらのシャッフリングした鋳型のライブラリーを、上記に記載したように、pMAXY3219において作製した。第1回および第2回のシャッフリングから単離したクローンのいくつかの配列を表3に示し、変化したアミノ酸残基を示した。
【0102】
第2回のシャッフリングでヒットした最も活性を有するものの1つ(クローン473R(D_S01037677)(配列番号18))をさらに多様化するために、ポリペプチドのアミノ末端領域における最初の46個のアミノ酸残基を改変して、8個のCry2ポリペプチド配列(すなわち、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2Ac、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ag、およびCry2Ax)中に見出される残基を含ませた。さらに、2個の残基(I13およびD15)を、保存的残基であるバリンおよびグルタミン酸でそれぞれ置換した(表4を参照のこと)。この改変したクローンを、クローン473N(配列番号8)と称した。
【0103】
(6.3:実施例3:Cry2Ax由来ポリペプチドの活性)
シャッフリングしたクローンの活性のスクリーニングを、数種の段階において実施した。最初に、このクローンを、一齢のH.zeaの幼生に対する人工食餌にクローンの融合タンパク質を発現する少量のE.coliを提供することによって、高い殺虫活性についてスクリーニングした。この幼生の完全な死または完全な発育阻止のいずれかを引き起こすクローンを、さらなる研究のために選択した。次いで高い殺虫活性を実証したクローンを使用して、Agrobacterium tumefaciens中の植物発現ベクターにおける新しいライブラリーを作製した。このライブラリーを、4つの複製物における各クローンをN.benthamianaの幼生と一緒に培養し(それぞれの培養物の強制的な浸潤を使用する)、次いで単一の三齢のH.zeaの幼生にそれぞれ対応する花盤(disk)を供給することによってスクリーニングした。24時間のインキュベーション期間の後、この摂食活性を、目視観察によって決定し、そして残った葉の面積のおおよその割合として示した。
【0104】
E.coli発現/食餌組み込みアッセイのさらなる繰り返しを通過したクローンを、植物発現ベクターpMAXY4384に個々に再びクローニングし、そして上記のように、インプランタ(in planta)での効力について試験した。E.coli発現重層アッセイおよび植物ライブラリーアプローチから得た最良のヒットの最終的なインプランタ活性の評価を、図1に示す。この分析から、数種のクローン(7K(D_S01000779)(配列番号10)、15K(D_S00999080)(配列番号12)、16K(D_S01000269)(配列番号14)、16R(D_S01037143)(配列番号16)、および473R(D_S01037677)(配列番号18)が挙げられる)は、増加した殺虫活性を有するようであった。
【0105】
(6.4:実施例4:さらなるCry2Ax由来のポリペプチドを単離するためのDNAシャッフリング)
節6.2に記載される通り、第1回および第2回のシャッフリングで的中したものであるクローン44(D_S00503970)(配列番号6)、473R(D_S01037677)(配列番号18)およびCry2Ab*を、さらなるシャッフリングのための鋳型として使用した。これらの鋳型およびシャッフリングを導いたオリゴヌクレオチドを使用して、野生型Cry2ポリペプチド(すなわち、Cry2AeおよびCry2Ag)からのアミノ酸多様性を有する誘導されたポリペプチドを産生し、そしてコンピューターにより、特定の構造的ループ領域のセグメント内にランダムな保存的アミノ酸置換およびランダムな置換を生成した。シャッフリングしたDNAライブラリーを、Cry2Ab*遺伝子を置換することによってpMAXY3219にクローニングした。この毒素のクローンを、これらのクローンがE.coliマルトース結合タンパク質(MBP)と融合して発現されるように構築した。単離した配列の概要を、表5〜7に示す。
【0106】
(6.5:実施例5:さらなるCry2Ax由来のポリペプチドの活性)
綿の害虫Helicoverpa zeaに対するシャッフリングされた誘導ポリペプチドの活性を評価するするために、クローン融合タンパク質を発現する全E.coli細胞を含む人工食餌を使用するハイスループットスクリーニングを、上記のように実施した。高レベルの活性を有するクローンを、インプランタ活性についてさらに試験して、それぞれの誘導したポリペプチドに伴う変化が、植物細胞中の遺伝子発現またはタンパク質の蓄積に負の影響を与えないことを確認した。このプロセスを開始するために、各Cry2Ax由来のポリペプチドを、Agrobacterium tumefaciensベースの植物発現ベクターにクローニングし、宿主Agrobacterium株を形質転換し、次いでマイクロタイターディッシュに並べた。次いで上記のヒットしたクローンを、4つの複製物の各々についてN.benthamianaの幼生と一緒に培養し(それぞれの培養物の強制的な浸潤を使用する)、次いで単一の三齢のH.zeaの幼生にそれぞれ対応する花盤(disk)を供給することによってスクリーニングした。24時間のインキュベーション期間の後、各花盤に対する摂食活性を、映像取り込みおよび上記のような分析方法によって決定した。このプロセスから得たいくつかの誘導したポリペプチドは、親のクローンに比べて改良されていた。このようなクローンの1つは、D_S01764701(配列番号134)であり、これは、クローン44を超える改良された活性を示した。摂食アッセイの結果を、3つの実験について図2に示した。
【0107】
(6.6:実施例6:クローン44を発現するトランスジェニック植物)
クローン44(D_S00503970)を発現するトランスジェニックタバコ植物を、バイナリーベクターpMAXY5469およびpMAXY5471を使用してグリフォサート選択で、Agrobacterium媒介性形質転換によって産生した。これらのベクターは、dSVBV駆動性GAT遺伝子およびdMMV駆動性クローン44核酸分子のクローン44(配列番号5)を含む。pMAXY5469は、pMAXY5469が、この毒素改変体がプラスミドの区画に蓄積するように、クローン44のコード領域に融合されたシグナルを標的とするプラスチドを含む点で、pMAXY5471とは異なる。約25個の形質転換体を、各構築物について産生した。クローン44を発現する葉の花盤(leaf disk)を、48ウェルタイタートレイ中の寒天の床上におき、次いで三齢のHelicoverpa zeaの幼生または四齢のSpodoptera exiguaの幼生いずれかを蔓延させた。これらの葉を、上記の虫と共に24時間インキュベートし、次いで後で取り除かれる幼生およびこれらの葉の残りを、相対的な残りの葉の面積(画素数)を正確に計算するためのビデオキャプチャー装置によって観察した。各ベクターに対する最高の形質転換体を使用した結果を、H.zeaに関しては図3Aに示し、そしてS.exiguaに関しては図3Bに示す。各トランスジェニック植物は、示される通り、分析のために採取された6個の葉の花盤を有する。
【0108】
プラスチド(図4A)または細胞質区画(図4B)におけるトランスジェニックタバコ植物中のその後のクローン44ポリペプチドの発現を、クローン44ポリペプチドを指向するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによってアッセイした。図4におけるレーンの番号は、図3における植物の番号に対応する。
【0109】
ウェスタンブロッティングにおいて使用されるポリクローナル抗体を、トリプシンで短縮した精製クローン44ポリペプチドによってニワトリを免疫し、次いで基質としてトリプシンで短縮したクローン44ポリペプチドを用いて作製したアフィニティーカラムを使用してCry2特異的抗体を精製することによって調製した。
【0110】
2つの型のトランスジェニック植物の間の最も明らかな違いは、S.exiguaの阻害は、プラスチドに蓄積した毒素のほうが非常に大きい点である(図3Bの右および左のパネルを比較する)。発現のデータ(図4)と組み合わせたこれらのデータは、5469に由来するT−DNAを有する植物(図4A)が、5471の植物(図4B)よりずっと多く毒素を産生し得ることを示す。
【0111】
【表1−1】

【0112】
【表1−2】

【0113】
【表1−3】

【0114】
【表2】

【0115】
【表3】

【0116】
【表4】

【0117】
【表5−1】

【0118】
【表5−2】

【0119】
【表5−3】

【0120】
【表5−4】

【0121】
【表5−5】

【0122】
【表5−6】

【0123】
【表5−7】

【0124】
【表5−8】

【0125】
【表5−9】

【0126】
【表5−10】

【0127】
【表6】

【0128】
【表7−1】

【0129】
【表7−2】

【0130】
【表7−3】


【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書中に記載の発明。

【図1】
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【図2】
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【図3】
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【図4】
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【公開番号】特開2011−182793(P2011−182793A)
【公開日】平成23年9月22日(2011.9.22)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2011−61374(P2011−61374)
【出願日】平成23年3月18日(2011.3.18)
【分割の表示】特願2007−501041(P2007−501041)の分割
【原出願日】平成17年2月25日(2005.2.25)
【出願人】(500207899)パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル, インコーポレイテッド (7)
【Fターム(参考)】