Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα
【課題】
概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにすること。
【解決手段】
本発明者らは、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、以下同じ）が、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進すること、及び、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されること、を新規に見出した。このことは、低酸素状態などで、ＲＯＲαの発現が促進されると、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進され、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されると、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合が促進され、Ｐｅｒ遺伝子又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導が促進される、という概日リズムの調節メカニズムの存在を強く示唆する。従って、本発明に係る本発明は、時差ぼけ調整剤、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにすること。
【解決手段】
本発明者らは、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、以下同じ）が、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進すること、及び、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されること、を新規に見出した。このことは、低酸素状態などで、ＲＯＲαの発現が促進されると、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進され、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されると、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合が促進され、Ｐｅｒ遺伝子又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導が促進される、という概日リズムの調節メカニズムの存在を強く示唆する。従って、本発明に係る本発明は、時差ぼけ調整剤、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時計遺伝子の作用メカニズム及びその周辺技術に関する。より詳細には、Ｂｍａｌ１（ｂｒａｉｎ−ｍｕｓｃｌｅ ＡＲＮＴ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現誘導を促進するＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、並びに抗がん剤、時差ぼけ調整剤、それらの薬剤のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間を周期とする生物リズムであり、単細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。各生物は、概日リズムの制御に関わる遺伝子を有し、概日リズム制御遺伝子が、概日リズムの調整を行っている。
【０００３】
哺乳類では、概日リズム制御遺伝子の発現量が脳視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）で特に高く、個体レベルでの概日リズム調整の中枢を担っている。一方、生体内のその他の組織（概日リズム末梢組織）においても、概日リズム制御遺伝子は発現しており、概日リズム中枢と同様に、概日リズム制御遺伝子による細胞・組織ごとの概日リズム調整が行われている。
【０００４】
哺乳類における概日リズム制御遺伝子としては、Ｐｅｒ遺伝子（Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３）、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｂｍａｌ２、Ｂｍａｌ３）、Ｃｒｙ遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ）などが知られている。
【０００５】
そのうち、ＢＭＡＬ１（Ｂｍａｌ１遺伝子の転写産物、以下同じ）は、ＣＬＯＣＫ（Ｃｌｏｃｋ遺伝子の転写産物、以下同じ）と二量体を形成し、Ｅ−ｂｏｘ（Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域）を介して、Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子などの発現を活性化することが示唆されている（非特許文献１など参照）。
また、Ｂｍａｌ１遺伝子は、ＲＥＶ−ＥＲＢ（Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子の転写産物、以下同じ）などによって、発現が調節されることが示唆されている（非特許文献２など参照）。
【０００６】
ここで、本発明にかかわりのあるタンパク質、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、以下同じ）について、説明する。ＲＯＲαは、ＲＯＲＡ（Ｒａｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ）などとも呼ばれるタンパク質で、ＲＯＲα１、ＲＯＲα４などのスプライシングバリアントが明らかになっている。なお、「スプライシングバリアント」は、同一遺伝子に由来する、アミノ酸配列の一部が異なったタンパク質のことであり、スプライシングの際のつながり方が異なるために生じる。
また、ＲＯＲαは、低酸素状態において、発現が促進されることが報告されている（非特許文献３参照）。
【非特許文献１】Gekakis, N. et al. “Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism.” Science 280, 1564-9 (1998)
【非特許文献２】Preitner, N. et al. “The orphan nuclear receptor REV-ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian clock” Cell 110, 251-60 (2002)
【非特許文献３】Chauvet, C. et al. “Retinoic acid receptor-related orphan receptor (ROR)alpha4 is the predominant isoform of the nuclear receptor RORalpha in the liver and is up-regulated by hypoxia in HepG2 human hepatoma cells.” Biochem J364, 449-56 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
哺乳類における概日リズムの調節メカニズムは、特に、未解明な部分が多い。一方、概日リズムは、睡眠、覚醒だけでなく、体温調節、ホルモン分泌など、生物の恒常性や体内調節機構にも深くかかわっていることが示唆されている。また、がんをはじめとする多くの疾患の発症機構にも関与している可能性がある。
【０００８】
そこで、本発明は、概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにすることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、以下同じ）が、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進すること、及び、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されること、を新規に見出した。
【００１０】
そこで、本発明では、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα、及び、低酸素状態で、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα、を提供する。
【００１１】
本発明は、次のような概日リズムの調節メカニズムの存在を強く示唆する。
低酸素状態などで、ＲＯＲαの発現が促進されると、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進される。Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されると、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合が促進され、Ｐｅｒ遺伝子及び／又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導が促進される。
【００１２】
また、本発明では、ＲＯＲαが、ＲＥＶ−ＥＲＢα又はＲＥＶ−ＥＲＢβと競合的に、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進することを、新規に見出した。従って、本発明は、ＲＯＲαとＲＥＶ−ＥＲＢの両者がＢｍａｌ１の発現誘導を調節することにより、概日リズムを調整するメカニズムの存在をも強く示唆する。
【００１３】
本発明により、ＲＯＲαとＢｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）との相互作用が明らかになった。従って、Ｂｍａｌ１の発現リズムの変調などにより、概日リズムの変調が引き起こされた場合、本発明により、概日リズムを調整できる可能性がある。
【００１４】
例えば、ＲＯＲαを抑制する物質は、時差ぼけ調整剤としての適用可能性がある。その他、概日リズムが変調した場合として、例えば、睡眠障害、覚醒障害、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆、夜間勤務・交代勤務など生活リズムの不規則化による体調の悪化、自閉症などにおける生活リズムの不規則化による消耗、などが挙げられる。これらの疾患に対しても、本発明は適用可能性がある。
【００１５】
加えて、本発明は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
一般に、がん組織では、低酸素状態に陥ることが多い。また、例えば、夜間勤務による看護婦などの乳がん発生率上昇などは、概日リズムの変調が誘因であると指摘されている。
それに対し、本発明では、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されることを明らかにした。従って、ＲＯＲαを抑制する物質は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
【００１６】
その他、本発明は、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用、抗がん剤又は時差ぼけ調整剤のスクリーニング方法などに適用できる可能性がある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＲＯＲαがＢｍａｌ１の発現誘導をを促進することが明らかになったため、本知見に基づき、概日リズムを調整できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
＜本発明に係るＲＯＲαについて＞
はじめに、本発明に係るＲＯＲαについて、以下説明する。
【００１９】
本発明に係るＲＯＲαは、ＲＯＲα１、ＲＯＲα４などのスプライシングバリアントを有する。ヒトにおけるＲＯＲα１のアミノ酸配列を配列番号１に、ＲＯＲα４のアミノ酸配列を配列番号２に記載する。また、マウスにおけるＲＯＲα１のアミノ酸配列を配列番号３に、ＲＯＲα４のアミノ酸配列を配列番号４に記載する。
【００２０】
なお、本発明に係るＲＯＲαは、ＲＯＲα１、ＲＯＲα４、若しくは前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列と相同性を有し、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）と相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記いずれかのタンパク質の他のスプライシングバリアントや、前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＲＯＲαに包含される。
【００２１】
＜本発明に係る概日リズムの調節メカニズムについて＞
続いて、ＲＯＲαに関わる概日リズムの調節メカニズムについて、図１を参照にしながら、以下説明する。
【００２２】
本発明により、ＲＯＲαは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥｓ）に結合し、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進することが明らかになった。従って、次のような概日リズムの調節メカニズムが存在すると推測される。
【００２３】
低酸素状態などにより、ＲＯＲαの発現が促進されると、ＲＯＲαは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥｓ）に作用し、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進する。発現したＢＭＡＬ１は、ＣＬＯＣＫと二量体を形成し、Ｅ−ｂｏｘ（Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子などのプロモーター領域）を介して、Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子の発現誘導を促進する。発現したＰＥＲ（Ｐｅｒ遺伝子の転写産物）及びＣＲＹ（Ｃｒｙ遺伝子の転写産物）は、概日リズムの形成に直接的に関与する。
【００２４】
なお、図中、「ＲＥα／β」は、ＲＥＶ−ＥＲＢを示す。ＲＥＶ−ＥＲＢは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥｓ）に、ＲＯＲαと競合的に結合し、Ｂｍａｌ１の発現を抑制すると考えられている。
【００２５】
また、図中、「Ｌｉｇａｎｄ」は、ＲＯＲαの発現を促進又は抑制する物質である。上記の通り、ＲＯＲαの発現は、概日リズムの調整に深く関わる。従って、その物質（ｌｉｇａｎｄ）をスクリーニングすることにより、新規時差ぼけ調整剤、抗がん剤などを探索できる。即ち、本発明に係る概日リズムの調節メカニズムに基づいて、スクリーニング系を構築できる。
【００２６】
＜本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質について＞
続いて、本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質（ＲＯＲαを抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤・時差ぼけ調整剤など）について、以下説明する。
【００２７】
後述する実施例において、概日リズムがシフトした場合（明条件の開始時間が変更された場合など）、ＲＯＲαの発現を抑制することにより、通常よりも早く、新しい概日リズムに同調できる、という結果が得られた。従って、本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質は、時差ぼけ調整剤としての適用可能性がある。
【００２８】
また、本発明では、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されることを明らかにした。一方、上述の通り、がん組織では、低酸素状態に陥ることが知られている。従って、本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
【００２９】
ＲＯＲαを抑制する物質として、例えば、抗ＲＯＲα抗体、ＲＯＲαのコード配列の一部を有するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸などが挙げられる。
抗ＲＯＲα抗体は、ＲＯＲαと特異的に結合することにより、ＲＯＲαの機能を抑制する。
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を抑制する、短い二本鎖ＲＮＡである。ＲＯＲαのコード配列の一部を有するｓｉＲＮＡは、ＲＯＲαの発現を抑制するため、ＲＯＲαの機能を抑制できる。
アンチセンス核酸は、ＲＯＲαのコード配列の一部を有する核酸で、人工的に合成されたもの、安定化するために修飾・加工などを施したもの、を広く包含する。アンチセンス核酸は、ＲＯＲαの転写産物（ｍＲＮＡ）と相補的に結合することにより、ＲＯＲαの発現を抑制するため、ＲＯＲαの機能を抑制できる。
抗ＲＯＲα抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸は、いずれも、公知方法により、作製できる。
【００３０】
＜本発明に係るＤＮＡチップ、プロテインチップについて＞
続いて、本発明に係るＤＮＡチップ及びプロテインチップについて、以下説明する。
【００３１】
ＲＯＲαをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、又は、前記遺伝子の一部分の塩基配列を有する核酸は、ＤＮＡチップに適用可能である。ＤＮＡチップにそれらの核酸を固定することにより、例えば、血液中や所定の組織中のＲＯＲα発現量を検出できるため、概日リズムの変調などの検出に、有用な可能性がある。ＤＮＡチップへの核酸の固定は、公知方法により行うことができる。
【００３２】
同様に、ＲＯＲαと特異的に結合する抗体は、プロテインチップに適用可能である。プロテインチップに、この抗体を固定することにより、例えば、血液中や所定の組織中のＲＯＲα発現量を検出できるため、概日リズムの変調などの検出に、有用な可能性がある。プロテインチップへの抗体の固定も、公知方法により行うことができる。
【００３３】
＜本発明に係る概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用について＞
続いて、本発明に係る概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用について、以下説明する。
【００３４】
上述の通り、本発明に係るＲＯＲαは、概日リズムを調整するメカニズムにおいて、重要な役割を果たしているため、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。具体的には、例えば、血液中や所定の組織中のＲＯＲα量をＥＬＩＳＡ法（公知方法）などで検出し、ＲＯＲα発現量の変調を検出することにより、概日リズムの変調を検出できる可能性がある。
【００３５】
＜本発明に係るスクリーニング方法について＞
続いて、本発明に係るスクリーニング方法の一例について、以下説明する。
【００３６】
ＲＯＲαを抑制する物質を探索することにより、スクリーニングを行う場合、例えば、反応系に標的物質を供給した後、ＲＯＲαとＢｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）との相互作用を検出することにより、目的の物質を探索できる。即ち、反応系に標的物質を供給することにより相互作用が抑制された場合、その標的物質は、抗がん剤又は時差ぼけ調整剤として有効な可能性がある。
【００３７】
スクリーニング方法の具体例として、例えば、予め、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）のオリゴヌクレオチドを、カラム、ビーズなどに固定しておき、ＲＯＲαと標的物質を供給した後、ＲＯＲαとＢｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）との相互作用を検出する方法、が考えられる。その場合、相互作用を検出する方法として、例えば、共免疫沈降法、カラム又はビーズを用いたプルダウン法、などを適用できる。
【００３８】
なお、本発明に係るスクリーニング方法は、キット化が可能である。その場合、例えば、ＲＯＲα、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）のオリゴヌクレオチド、抗ＲＯＲα抗体、相互作用検出試薬（共免疫沈降法、カラム又はビーズを用いたプルダウン法、ウエスタンブロットなどに用いる試薬）、などを、相互作用検出方法などに応じて適宜組み合わせ、キット化する。その場合、前記タンパク質及びオリゴヌクレオチドは、変異体を用いてもよい。
【実施例１】
【００３９】
実施例１及び実施例２では、予備的実験として、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを調べた。
【００４０】
実施例１では、マウスから複数の組織を採取し、それらの組織における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを調べた。
【００４１】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、実験に用いたマウスの概日リズムを同調させた。マウスを、２週間、８時から２０時まで明条件、２０時から翌８時までを暗条件にした部屋で飼育し、マウスの概日リズムを同調させた。
（２）次に、マウスから概日リズム末梢組織として、肝臓、心臓、腎臓、肺、胃を所定の時刻に採取した。なお、各臓器の採取時刻は、概日リズムの同調を行った直後の８時から、４時間ごとに設定した（８時、１２時、１６時、２０時、２４時、翌４時）。
（３）次に、採取した各臓器をホモジナイズ後、Ｐｒｏｍｅｇａ ｔｏｔａｌ ＳＶ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
（４）次に、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応）を行い、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の各遺伝子の発現量を測定した。
【００４２】
結果を図２に示す。
図中、「ｌｉｖｅｒ」は肝臓を、「ｈｅａｒｔ」は心臓を、「ｋｉｄｎｅｙ」は腎臓を、「ｌｕｎｇ」は肺を、「ｓｔｏｍａｃｈ」は胃を、それぞれ示す。
各グラフ中、横軸「ＺＴ（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ Ｔｉｍｅｓ）」は、概日時間を示す。また、縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸の発現量の値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｌｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を１とした場合の相対的な値である。
【実施例２】
【００４３】
実施例２では、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを、実施例１と同様の手順で調べた。
【００４４】
結果を図３に示す。
図中、横軸は、概日時間を示す。また、縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸の発現量の値は、実施例１と同様、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｌｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を１とした場合の相対的な値である。
【００４５】
以上、実施例１及び実施例２より、各組織における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の３つの遺伝子の発現パターンを確認できた。
【実施例３】
【００４６】
続いて、実施例３及び実施例４は、ＲＯＲαがＢｍａｌ１の発現を誘導するかどうかを、ルシフェラーゼアッセイにより調べた実験である。
【００４７】
「ルシフェラーゼアッセイ」の概要について、以下説明する。
ルシフェラーゼは、生物発光を触媒する酵素タンパク質である。
例えば、所定の遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼをコードする遺伝子とを連結させた組換え遺伝子を作製し、その組換え遺伝子を培養細胞に組み込んだ場合、その遺伝子の発現が誘導されると、ルシフェラーゼが発現する。
そこで、ルシフェラーゼによる生物発光を測定し、ルシフェラーゼの発現レベルを取得することにより、その遺伝子の発現誘導レベルを推定することができる。
【００４８】
実施例３では、ＲＯＲファミリータンパク質（ＲＯＲα１、ＲＯＲα４、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ）が、Ｂｍａｌ１の発現を誘導するかどうかを、ルシフェラーゼアッセイにより調べた。
【００４９】
実験手順の概要を以下に示す。
（１）まず、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。この組換えベクターは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する。
（２）また、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、ＲＯＲファミリータンパク質をコードするＤＮＡ配列を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（３）次に、（１）及び（２）で作製した組換えベクターを、共に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションした。次に、トランスフェクションした培養細胞を、単離・継代し、両たんぱく質を共発現させた。そして、トランスフェクションの３６時間後に、継代した細胞を集め、溶解させた。
（４）次に、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、溶解させた細胞溶液を調製した後、発光強度を測定し、Ｂｍａｌ１の発現誘導レベルを取得した。
【００５０】
結果を図４に示す。
図中、「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを、「ＲＯＲα１」は、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、「ＲＯＲα４」は、ＲＯＲα４をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、「ＲＯＲβ」は、ＲＯＲβをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、「ＲＯＲγ」は、ＲＯＲγをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、それぞれ示し、「＋」は、それらの組換えベクターを、培養細胞に組み込んだことを表す。
縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、発光強度を表す。この値は、「ＢＭ−Ｌｕｃ」のみを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「１」とした場合の相対値である。
【００５１】
図４に示す結果は、ＲＯＲファミリータンパク質、特に、ＲＯＲα１及びＲＯＲα４が、Ｂｍａｌ１の発現を誘導することを強く示唆する。
【実施例４】
【００５２】
実施例４では、ＲＯＲα４の発現レベルを変動させた場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導レベルも変動するかどうかについて調べた。
【００５３】
実験は、実施例３と同様の方法により行った。
なお、組換えベクターを培養細胞にトランスフェクションする際、ＲＯＲα４をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターの添加量を、それぞれ、０（コントロール）、１、５、１０、２５、５０、１００ｎｇとした。
【００５４】
結果を図５に示す。
図中、「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを示し、「＋」は、組換えベクターを、培養細胞に組み込んだことを表す。
「ＲＯＲα４」は、ＲＯＲα４をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを示し、数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、発光強度を表す。この値は、図４と同様、「ＢＭ−Ｌｕｃ」のみを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「１」とした場合の相対値である。
【００５５】
図５の結果は、ＲＯＲα４の発現量の増大に伴い、Ｂｍａｌ１の発現誘導も促進されることを強く示唆する。従って、この結果は、ＲＯＲα４の促進がＢｍａｌ１の発現を誘導することを強く示唆する。
【実施例５】
【００５６】
Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子は、概日リズム制御遺伝子として知られ、ＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）に結合して、Ｂｍａｌ１の発現を抑制することが知られている。
そこで、実施例５では、ＲＯＲαタンパク質とＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質を共発現させた場合、Ｂｍａｌ１の発現が誘導されるかどうかについて、調べた。
【００５７】
実験手順の概要は、以下の通りである。
（１）まず、実施例３などと同様の手順により、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んだ組換えベクター、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクター、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子を組み込んだ組換えベクター、をそれぞれ作製した。
（２）次に、その３つの組み換えベクターを、共に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションし、各タンパク質を共発現させた。
（３）そして、その培養細胞を溶解させた後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、溶解させた細胞溶液を調製し、発光強度を測定した。
【００５８】
結果を図６に示す。
図中、「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを示し、「＋」は、組換えベクターを、培養細胞に組み込んだことを表す。
「ＲＯＲα１」は、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを示し、カッコ書きの数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
「β−Ｇａｌ」は、前記と同様の手順でβ−ガラクトシダーゼを共発現させた場合を示し、コントロールである。数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
「ＲＥα」、「ＲＥβ」は、それぞれ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ遺伝子を組み込んだ組換えベクターを示し、数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
【００５９】
図６の結果は、ＲＯＲαとＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域に競合的に作用することを強く示唆する。
【実施例６】
【００６０】
実施例６では、ＲＯＲαのドミナントネガティブ変異体の存在下で細胞を培養した場合の、Ｂｍａｌ１発現量の概日変化について調べた。
【００６１】
実験手順の概要は次の通りである。
まず、実施例３などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
次に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔに、その組み換えベクターをトランスフェクションし、その培養細胞を単離・継代した。
次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
次に、培養液に、ＲＯＲα１のドミナントネガティブ変異体を加えた後、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【００６２】
結果を図７に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸は発光強度（単位はＭ ｃｐｍ；Ｍｉｌｌｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｕｎｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｎｕｔｅｓ）を、それぞれ示す。
「ｖｅｃｔｏｒ」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりに空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）を加えた場合（コントロール）の実験結果であることを示す。
「β−Ｇａｌ」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりにβ−ガラクトシダーゼを加えた場合（コントロール）の実験結果であることを示す。
「ｈＲＯＲα１ΔＬＢＤ」は、ヒトＲＯＲα１のドミナントネガティブ変異体を加えた場合の実験結果であることを示す。
【００６３】
図７に示す通り、ＲＯＲα１のドミナントネガティブ変異体を加えた場合、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムが抑制された。即ち、この結果は、ＲＯＲαが、ｂｍａｌ１の発現を誘導するだけでなく、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムの発現に、重要な役割を果たしていることを強く示唆する。
【実施例７】
【００６４】
実施例７及び実施例８では、ＲＯＲαによるＢｍａｌ１の発現誘導に関して、ＲＯＲαの、Ｂｍａｌ１の配列における作用部位を調べた。
【００６５】
実施例７では、Ｂｍａｌ１遺伝子の上流領域のＤＮＡ配列について、それぞれ長さの異なるものを作製し、実施例３などと同様の手順により、ＲＯＲαによるＢｍａｌ１の発現誘導レベルを取得した。
【００６６】
実験手順の概要について、以下説明する。
（１）まず、図８に示すＤＮＡ配列を有する組換えベクターを、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、それぞれ作製した。
図中、「Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ」は、その領域が、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列であることを示し、「Ｅｘｏｎ１」は、その領域が、Ｂｍａｌ１遺伝子の一番目のエクソン部分の配列を有することを示す。なお、「ｈＢｍａｌ１」は、ヒトのＢｍａｌ１遺伝子を表す。
「ＲＯＲＥ１」及び「ＲＯＲＥ２」は、その領域が、それぞれ、Ｂｍａｌ１遺伝子のプロモーター領域であることを示す。
「−３４６５」は、そのＤＮＡ配列が、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の３４６５塩基分上流までの配列を有することを示す。他の数字も同様である。
「ｍｔ」は、変異体（ｍｕｔａｎｔ）を表し、ＲＯＲＥ１、ＲＯＲＥ２、又は両者の配列の一部分が変異したものであることを示す。
（２）そして、実施例３などと同様の手順により、ＲＯＲα１とルシフェラーゼを共発現させた後、発光強度を測定し、Ｂｍａｌ１の発現誘導レベルを取得した。
【００６７】
結果を図９に示す。
図中、 「ＲＯＲα１」は、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを示し、「＋」は、その組換えベクターを培養細胞に組み込んだことを、「−」は、組み込んでいないことを、それぞれ表す。
「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを示す。
「−３４６５」は、その組換えベクターが、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の３４６５塩基分上流までの配列を含むことを示し、「−８２９」は、その組換えベクターが、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の８２９塩基分上流までの配列を含むことを示し、「−２３０」は、その組換えベクターが、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の２３０塩基分上流までの配列を含むことを示す。
また、「ＲＯＲＥ１ｍｕｔ／ＲＯＲＥ２」はＲＯＲＥ１を欠損させた場合、「ＲＯＲＥ１／ＲＯＲＥ２ｍｕｔ」はＲＯＲＥ２を欠損させた場合、「ＲＯＲＥ１ｍｕｔ／ＲＯＲＥ２ｍｕｔ」はＲＯＲＥ１とＲＯＲＥ２の両方を欠損させた場合、を表す。なお、「ｍｕｔ」は、変異体（ｍｕｔａｎｔ）を表す。
【実施例８】
【００６８】
次に、実施例８では、実施例７で作製した組換えベクター（図８参照）を用いて、実施例６などと同様の手順により、Ｂｍａｌ１発現量の概日変化について調べた。
【００６９】
結果を図１０に示す。
図中の表示は、図７及び図９と同様である。
【００７０】
以上、実施例７（図９）及び実施例８（図１０）の結果は、ＲＯＲαによるＢｍａｌ１の発現誘導が、Ｂｍａｌ１遺伝子の両方のプロモーター領域（ＲＯＲＥ１、ＲＯＲＥ２）を必要とすることを示す。従って、ＲＯＲαは、Ｂｍａｌ１遺伝子の両方のプロモーター領域に作用して、Ｂｍａｌ１の発現を誘導していることを強く示唆する。
【実施例９】
【００７１】
実施例９では、プルダウン法により、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）とＲＯＲαとの結合を調べた。
【００７２】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、所定時刻に、マウスの肝臓を採取後、ホモジナイズし、マウス肝臓の抽出物を得た。
（２）また、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドをビオチン化した。ビオチン化したオリゴヌクレオチドは、ストレプトアヴィジン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に固定した。
（３）次に、（１）で取得したマウス肝臓抽出物に、（２）のビーズを加え、インキュベートした。
（４）次に、ビーズを回収（プルダウン）した後、抗ＲＯＲα抗体を用いてウエスタンブロットし、ＲＯＲαを検出した。
【００７３】
以上の手順により、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドとＲＯＲα（肝臓抽出物中に存在）が結合しているかどうかを調べることができる。
【００７４】
結果を図１１に示す。
図中、「ｎｏ ＯＤＮ（ｎｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、ビオチンにオリゴヌクレオチドを結合させていない場合（コントロール）を示す。
「ＢＭ−ＲＯＲＥｓ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドをビオチン化した場合の結果を示す。
「ＢＭ−ｍＲＯＲＥｓ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を一部変化させたオリゴヌクレオチド（変異体）をビオチン化した場合の結果を示す。なお、「ｍ」は変異体（ｍｕｔａｎｔ）を表す。
「ＣＴ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｔｉｍｅ）」は、概日時間を表す。即ち、マウスから肝臓を採取した時刻を表し、概日時間（明条件の開始時間を０時とした時刻）で示している。
「ＲＯＲα１」、「ＲＯＲα４」は、ウエスタンブロットに用いた抗体を示し、バンドの現れる位置を表している。
【００７５】
図１１に示す通り、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドを用いた場合、「ＲＯＲα１」、「ＲＯＲα４」の両方において、バンドが確認できた。それに対し、変異体のオリゴヌクレオチドを用いた場合、バンドが消失した。
【００７６】
従って、以上の結果は、ＲＯＲαが、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）に結合することにより、Ｂｍａｌ１の発現を誘導することを強く示唆する。
【実施例１０】
【００７７】
実施例１０では、ＲＯＲα遺伝子を欠損した変異体マウスを用いて、アクトグラムを行い、ＲＯＲα遺伝子欠損が、マウスの概日リズムに与える影響について、調べた。
【００７８】
「アクトグラム」は、マウスの飲食行動を検出することにより、マウスの活動時間を連続的に記録する方法である。
【００７９】
図１２は、１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件でフリーラン（自由継続）させた場合のアクトグラムである。
図中、「＋／＋」は野生型を、「＋／ｓｇ」はヘテロのＲＯＲα遺伝子欠損型を、「ｓｇ／ｓｇ」はホモのＲＯＲα遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
「ＬＤ」は明条件（ｌｉｇｈｔ）と暗条件（ｄａｒｋ）を繰り返す環境を示し、「ＤＤ」は暗条件（ｄａｒｋ）を続ける環境、即ち、フリーラン（自由継続）させた場合、を示す。
【００８０】
図１２に示す通り、飼育環境を２４時間暗条件に変更した場合、野生型と比較して、変異体マウスでは、行動時間の開始時刻が早くなった。即ち、概日周期が短くなった。この結果は、ＲＯＲαが、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進することにより、個体の概日リズムにも影響を与えていることを示唆する。
【００８１】
図１３は、図１２に示した実験結果に基づいて、飼育環境を２４時間暗条件に変更した後の、マウスの概日周期の平均値を取得した図である。図１３が示す通り、野生型マウスでは、概日周期が、約２３．８時間であったのに対し、ホモのＲＯＲα遺伝子欠損型マウスでは、概日周期が約２３．４時間に減少していた。
【００８２】
次に、図１４は、１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件の開始時刻を４時間早め、時差のある状態にした場合のアクトグラムである。
図中の表示は、図１２と同様である。
【００８３】
図１４に示す通り、暗条件の開始時刻を４時間早めた場合、ＲＯＲα遺伝子欠損型マウスは、野生型マウスよりも早く、新しい環境条件に順応した。
【００８４】
図１５は、１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、環境条件を、６時間ごとに明条件と暗条件を繰り返す環境に変化させた場合のアクトグラムである。
図中の表示は、図１２と同様である。
【００８５】
図１５に示す通り、野生型マウスでは、環境の変化にかかわらず、概日リズムを維持したのに対し、ＲＯＲα遺伝子欠損型マウスは、概日リズムを維持したものと、概日リズムが完全に乱れたものの両者が存在した。
【実施例１１】
【００８６】
実施例１１では、ＲＮＡ干渉により、ＲＯＲαの発現を抑制した場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導も抑制されるかどうか、調べた。
【００８７】
実験手順の概要は、次に通りである。
（１）まず、組換えｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製した。ＲＯＲα４をコードする遺伝子配列の第８４９〜１３９１塩基の中から、１９塩基からなる配列（配列番号５）を選択した。そして、その配列を、ｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製した。
（２）また、実施例３などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（３）次に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔに、組換えｓｉＲＮＡ発現ベクターとＢｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んだ組換えベクターとを、共に、トランスフェクションした後、その培養細胞を単離・継代した。
（４）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（５）次に、培養液に、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【００８８】
結果を図１６に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「ｖｅｃｔｏｒ」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりに空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）を加えた場合（コントロール）の実験結果であることを示す。
「ＲＮＡｉ（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、ＲＯＲαの配列とは関係のないｓｉＲＮＡを用いた場合であり、コントロールである。
「ＲＮＡｉ（ＲＯＲα）」は、ＲＯＲαをコードする塩基配列の一部を有するｓｉＲＮＡを用いた場合である。
【００８９】
図１６に示す通り、ＲＯＲαをコードする塩基配列の一部を有するｓｉＲＮＡを用いた場合（図中、一番下のグラフ）、空ベクターを用いた場合（そのグラフの上側の曲線）と比較して、Ｂｍａｌ１の発現誘導の振幅が減少した（そのグラフ中の下側の曲線）。従って、本実験結果は、ＲＮＡ干渉を用いてＲＯＲの発現を抑制した場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導も抑制されることを示す。
【実施例１２】
【００９０】
実施例１２及び実施例１３では、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ；Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を用いて、ＲＯＲαにＢｍａｌ１の発現誘導を促進する作用があるかどうか、調べた。
【００９１】
実施例１２では、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体を用いて、Ｂｍａｌ１発現誘導の概日変化を調べた。
【００９２】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、前記と同様、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（２）次に、その組換えベクターを、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体にトランスフェクションした後、その培養細胞を単離・継代した。
（３）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（４）次に、培養液に、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【００９３】
結果を図１７に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「＋／＋」は野生型を、「＋／ｓｇ」はヘテロのＲＯＲα遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
【００９４】
図１７に示す通り、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体では、Ｂｍａｌ１発現誘導の振幅が減少した。
【実施例１３】
【００９５】
次に、実施例１３では、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体における、Ｂｍａｌ１発現量の概日変化を調べた。
【００９６】
マウス胚繊維芽細胞をホモジナイズ後、Ｐｒｏｍｅｇａ ｔｏｔａｌ ＳＶ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現量を測定した。
【００９７】
結果を図１８に示す。
図中、横軸は、時間（単位は分）を示す。縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸の発現量の値は、実施例１と同様、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｌｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を１とした場合の相対的な値である。
「＋／＋」は野生型を、「＋／ｓｇ」はヘテロのＲＯＲα遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
【００９８】
図１８に示す通り、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体では、Ｂｍａｌ１発現量の振幅が減少した。なお、この結果は、図１７の結果ともほぼ一致した。
以上、図１７及び図１８の結果は、細胞レベルでも、ＲＯＲαがＢｍａｌ１の発現誘導を促進することを、強く示唆する。
【実施例１４】
【００９９】
実施例１７では、アンチセンス核酸を用いてＲＯＲαの発現を抑制した場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導も抑制されるかどうか、調べた。
【０１００】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、アンチセンス核酸発現ベクターを作製した。ＲＯＲαをコードする遺伝子のうち、所定の領域と同じ塩基配列を有するＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３に組み込んで、アンチセンス核酸発現ベクターを作製した。
なお、ＤＮＡフラグメントとして、ＲＯＲαをコードする遺伝子の第６５〜５７４塩基までの配列を有するフラグメント、第５９９〜１１２２塩基までの配列を有するフラグメント、第８４９〜１３９１塩基までの配列を有するフラグメント、の３種類を用いた。
（２）また、実施例３などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（３）次に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔに、アンチセンス発現ベクターとＢｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んだ組換えベクターとを、コトランスフェクションし、その培養細胞を単離・継代した。
（４）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（５）次に、培養液に、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【０１０１】
結果を図１９に示す。
図中、図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「ＡＳ（ＲＯＲα１）」は、アンチセンス核酸として、ＲＯＲαをコードする遺伝子の第６５〜５７４塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、「ＡＳ（ＲＯＲα２）」は、アンチセンスとして、第５９９〜１１２２塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、「ＡＳ（ＲＯＲα３）」は、アンチセンスとして、第８４９〜１３９１塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、を示す。
【０１０２】
図１９に示す通り、いずれの場合も、アンチセンス核酸を用いてＲＯＲαの発現を抑制することにより、Ｂｍａｌ１の発現誘導の振幅も抑制された。
【実施例１５】
【０１０３】
上述の通り、ＲＯＲαは低酸素状態において発現が誘導されることが明らかになっている。そこで、実施例１５では、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導も促進されるかどうかについて調べた。
【０１０４】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、前記と同様、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（２）次に、その組換えベクターを、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体にトランスフェクションし、その培養細胞を単離・継代した。
（３）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（４）次に、培養液に、０．０１ｍＭＣｏＣｌ２を加えた後、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
なお、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を加えた条件下で、細胞を培養することにより、低酸素状態を作り出すことができる。
【０１０５】
結果を図２０に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「＋０．０１ｍＭＣｏＣｌ２」は、培養液に０．０１ｍＭＣｏＣｌ２を加えた場合を、「＋０．１ｍＭＮａＣｌ」は、培養液に、０．０１ｍＭＣｏＣｌ２の代わりに、０．１ｍＭＮａＣｌを加えた場合（コントロール）を、それぞれ示す。
【０１０６】
図２０の結果は、低酸素状態では、Ｂｍａｌ１の発現誘導も促進されることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにして点で、有用である。従って、本発明は、概日リズムの調節メカニズムに関与する疾患、例えば、がん、睡眠障害、時差ぼけ、覚醒障害、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆などの疾患の予防剤、治療剤として、適用可能性がある。また、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、概日リズムの変調を検出するためのマーカー、抗がん剤・時差ぼけ調整剤などのスクリーニング方法やスクリーニングキットなどに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】概日リズムの調節メカニズムを示す図。
【図２】各組織における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを示す図。
【図３】培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを示す図。
【図４】ＲＯＲαがＢｍａｌの発現を誘導したことを示す図。
【図５】ＲＯＲα４の発現量の増大に伴い、Ｂｍａｌの発現誘導も促進されることを示す図。
【図６】ＲＯＲαとＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質が、Ｂｍａｌのプロモーター領域に競合的に作用することを示す図。
【図７】ＲＯＲαのドミナントネガティブ変異体の存在下で細胞を培養した場合の、Ｂｍａｌ発現量の概日変化を示す図。
【図８】作製した組換えベクターの配列を示す図。
【図９】Ｂｍａｌ１の上流領域の長さをかえた場合における、ＲＯＲαによるＢｍａｌの発現誘導レベルを示す図。
【図１０】Ｂｍａｌ１の上流領域の長さをかえた場合における、Ｂｍａｌ発現量の概日変化を示す図。
【図１１】プルダウン法による、ウエスタンブロット写真（図面代用写真）。
【図１２】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件でフリーラン（自由継続）させた場合のアクトグラム。
【図１３】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、飼育環境を２４時間暗条件にした場合の、マウスの概日周期を取得した図。
【図１４】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件の開始時刻を４時間早め、時差のある状態にした場合のアクトグラム。
【図１５】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、環境条件を、６時間ごとに明条件と暗条件を繰り返す環境に変化させた場合のアクトグラム。
【図１６】ＲＮＡ干渉により、ＲＯＲαの発現を抑制した場合の、Ｂｍａｌの発現誘導を示す図。
【図１７】マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体を用いた場合の、Ｂｍａｌ発現誘導の概日変化を示す図。
【図１８】マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体を用いた場合における、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる、Ｂｍａｌ発現量の概日変化を示す図。
【図１９】アンチセンスを用いてＲＯＲαの発現を抑制した場合における、Ｂｍａｌの発現誘導を示す図。
【図２０】低酸素状態において、Ｂｍａｌの発現誘導が促進されたことを示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、時計遺伝子の作用メカニズム及びその周辺技術に関する。より詳細には、Ｂｍａｌ１（ｂｒａｉｎ−ｍｕｓｃｌｅ ＡＲＮＴ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現誘導を促進するＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、並びに抗がん剤、時差ぼけ調整剤、それらの薬剤のスクリーニング方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
概日リズム（サーカディアンリズム）は、約２４時間を周期とする生物リズムであり、単細胞生物からヒトに至るまで、多くの生物に普遍的に見られる生体内現象である。各生物は、概日リズムの制御に関わる遺伝子を有し、概日リズム制御遺伝子が、概日リズムの調整を行っている。
【０００３】
哺乳類では、概日リズム制御遺伝子の発現量が脳視床下部の視交叉上核（ＳＣＮ）で特に高く、個体レベルでの概日リズム調整の中枢を担っている。一方、生体内のその他の組織（概日リズム末梢組織）においても、概日リズム制御遺伝子は発現しており、概日リズム中枢と同様に、概日リズム制御遺伝子による細胞・組織ごとの概日リズム調整が行われている。
【０００４】
哺乳類における概日リズム制御遺伝子としては、Ｐｅｒ遺伝子（Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３）、Ｃｌｏｃｋ遺伝子、Ｂｍａｌ遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｂｍａｌ２、Ｂｍａｌ３）、Ｃｒｙ遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ）などが知られている。
【０００５】
そのうち、ＢＭＡＬ１（Ｂｍａｌ１遺伝子の転写産物、以下同じ）は、ＣＬＯＣＫ（Ｃｌｏｃｋ遺伝子の転写産物、以下同じ）と二量体を形成し、Ｅ−ｂｏｘ（Ｐｅｒ１遺伝子のプロモーター領域）を介して、Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子などの発現を活性化することが示唆されている（非特許文献１など参照）。
また、Ｂｍａｌ１遺伝子は、ＲＥＶ−ＥＲＢ（Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子の転写産物、以下同じ）などによって、発現が調節されることが示唆されている（非特許文献２など参照）。
【０００６】
ここで、本発明にかかわりのあるタンパク質、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、以下同じ）について、説明する。ＲＯＲαは、ＲＯＲＡ（Ｒａｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ）などとも呼ばれるタンパク質で、ＲＯＲα１、ＲＯＲα４などのスプライシングバリアントが明らかになっている。なお、「スプライシングバリアント」は、同一遺伝子に由来する、アミノ酸配列の一部が異なったタンパク質のことであり、スプライシングの際のつながり方が異なるために生じる。
また、ＲＯＲαは、低酸素状態において、発現が促進されることが報告されている（非特許文献３参照）。
【非特許文献１】Gekakis, N. et al. “Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism.” Science 280, 1564-9 (1998)
【非特許文献２】Preitner, N. et al. “The orphan nuclear receptor REV-ERBalpha controls circadian transcription within the positive limb of the mammalian circadian clock” Cell 110, 251-60 (2002)
【非特許文献３】Chauvet, C. et al. “Retinoic acid receptor-related orphan receptor (ROR)alpha4 is the predominant isoform of the nuclear receptor RORalpha in the liver and is up-regulated by hypoxia in HepG2 human hepatoma cells.” Biochem J364, 449-56 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
哺乳類における概日リズムの調節メカニズムは、特に、未解明な部分が多い。一方、概日リズムは、睡眠、覚醒だけでなく、体温調節、ホルモン分泌など、生物の恒常性や体内調節機構にも深くかかわっていることが示唆されている。また、がんをはじめとする多くの疾患の発症機構にも関与している可能性がある。
【０００８】
そこで、本発明は、概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにすることを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＲＯＲα（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ、以下同じ）が、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進すること、及び、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されること、を新規に見出した。
【００１０】
そこで、本発明では、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα、及び、低酸素状態で、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα、を提供する。
【００１１】
本発明は、次のような概日リズムの調節メカニズムの存在を強く示唆する。
低酸素状態などで、ＲＯＲαの発現が促進されると、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進される。Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されると、ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合が促進され、Ｐｅｒ遺伝子及び／又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導が促進される。
【００１２】
また、本発明では、ＲＯＲαが、ＲＥＶ−ＥＲＢα又はＲＥＶ−ＥＲＢβと競合的に、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進することを、新規に見出した。従って、本発明は、ＲＯＲαとＲＥＶ−ＥＲＢの両者がＢｍａｌ１の発現誘導を調節することにより、概日リズムを調整するメカニズムの存在をも強く示唆する。
【００１３】
本発明により、ＲＯＲαとＢｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）との相互作用が明らかになった。従って、Ｂｍａｌ１の発現リズムの変調などにより、概日リズムの変調が引き起こされた場合、本発明により、概日リズムを調整できる可能性がある。
【００１４】
例えば、ＲＯＲαを抑制する物質は、時差ぼけ調整剤としての適用可能性がある。その他、概日リズムが変調した場合として、例えば、睡眠障害、覚醒障害、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆、夜間勤務・交代勤務など生活リズムの不規則化による体調の悪化、自閉症などにおける生活リズムの不規則化による消耗、などが挙げられる。これらの疾患に対しても、本発明は適用可能性がある。
【００１５】
加えて、本発明は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
一般に、がん組織では、低酸素状態に陥ることが多い。また、例えば、夜間勤務による看護婦などの乳がん発生率上昇などは、概日リズムの変調が誘因であると指摘されている。
それに対し、本発明では、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されることを明らかにした。従って、ＲＯＲαを抑制する物質は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
【００１６】
その他、本発明は、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用、抗がん剤又は時差ぼけ調整剤のスクリーニング方法などに適用できる可能性がある。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、ＲＯＲαがＢｍａｌ１の発現誘導をを促進することが明らかになったため、本知見に基づき、概日リズムを調整できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
＜本発明に係るＲＯＲαについて＞
はじめに、本発明に係るＲＯＲαについて、以下説明する。
【００１９】
本発明に係るＲＯＲαは、ＲＯＲα１、ＲＯＲα４などのスプライシングバリアントを有する。ヒトにおけるＲＯＲα１のアミノ酸配列を配列番号１に、ＲＯＲα４のアミノ酸配列を配列番号２に記載する。また、マウスにおけるＲＯＲα１のアミノ酸配列を配列番号３に、ＲＯＲα４のアミノ酸配列を配列番号４に記載する。
【００２０】
なお、本発明に係るＲＯＲαは、ＲＯＲα１、ＲＯＲα４、若しくは前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列と相同性を有し、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）と相互作用する領域を保持するタンパク質である。即ち、例えば、前記いずれかのタンパク質の他のスプライシングバリアントや、前記いずれかのタンパク質のアミノ酸配列中の一部に、置換、欠損、挿入、付加部分が含まれる場合も、本発明に係るＲＯＲαに包含される。
【００２１】
＜本発明に係る概日リズムの調節メカニズムについて＞
続いて、ＲＯＲαに関わる概日リズムの調節メカニズムについて、図１を参照にしながら、以下説明する。
【００２２】
本発明により、ＲＯＲαは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥｓ）に結合し、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進することが明らかになった。従って、次のような概日リズムの調節メカニズムが存在すると推測される。
【００２３】
低酸素状態などにより、ＲＯＲαの発現が促進されると、ＲＯＲαは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥｓ）に作用し、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進する。発現したＢＭＡＬ１は、ＣＬＯＣＫと二量体を形成し、Ｅ−ｂｏｘ（Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子などのプロモーター領域）を介して、Ｐｅｒ遺伝子、Ｃｒｙ遺伝子の発現誘導を促進する。発現したＰＥＲ（Ｐｅｒ遺伝子の転写産物）及びＣＲＹ（Ｃｒｙ遺伝子の転写産物）は、概日リズムの形成に直接的に関与する。
【００２４】
なお、図中、「ＲＥα／β」は、ＲＥＶ−ＥＲＢを示す。ＲＥＶ−ＥＲＢは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥｓ）に、ＲＯＲαと競合的に結合し、Ｂｍａｌ１の発現を抑制すると考えられている。
【００２５】
また、図中、「Ｌｉｇａｎｄ」は、ＲＯＲαの発現を促進又は抑制する物質である。上記の通り、ＲＯＲαの発現は、概日リズムの調整に深く関わる。従って、その物質（ｌｉｇａｎｄ）をスクリーニングすることにより、新規時差ぼけ調整剤、抗がん剤などを探索できる。即ち、本発明に係る概日リズムの調節メカニズムに基づいて、スクリーニング系を構築できる。
【００２６】
＜本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質について＞
続いて、本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質（ＲＯＲαを抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤・時差ぼけ調整剤など）について、以下説明する。
【００２７】
後述する実施例において、概日リズムがシフトした場合（明条件の開始時間が変更された場合など）、ＲＯＲαの発現を抑制することにより、通常よりも早く、新しい概日リズムに同調できる、という結果が得られた。従って、本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質は、時差ぼけ調整剤としての適用可能性がある。
【００２８】
また、本発明では、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導が促進されることを明らかにした。一方、上述の通り、がん組織では、低酸素状態に陥ることが知られている。従って、本発明に係るＲＯＲαを抑制する物質は、抗がん剤として、適用できる可能性がある。
【００２９】
ＲＯＲαを抑制する物質として、例えば、抗ＲＯＲα抗体、ＲＯＲαのコード配列の一部を有するｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸などが挙げられる。
抗ＲＯＲα抗体は、ＲＯＲαと特異的に結合することにより、ＲＯＲαの機能を抑制する。
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を抑制する、短い二本鎖ＲＮＡである。ＲＯＲαのコード配列の一部を有するｓｉＲＮＡは、ＲＯＲαの発現を抑制するため、ＲＯＲαの機能を抑制できる。
アンチセンス核酸は、ＲＯＲαのコード配列の一部を有する核酸で、人工的に合成されたもの、安定化するために修飾・加工などを施したもの、を広く包含する。アンチセンス核酸は、ＲＯＲαの転写産物（ｍＲＮＡ）と相補的に結合することにより、ＲＯＲαの発現を抑制するため、ＲＯＲαの機能を抑制できる。
抗ＲＯＲα抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸は、いずれも、公知方法により、作製できる。
【００３０】
＜本発明に係るＤＮＡチップ、プロテインチップについて＞
続いて、本発明に係るＤＮＡチップ及びプロテインチップについて、以下説明する。
【００３１】
ＲＯＲαをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、又は、前記遺伝子の一部分の塩基配列を有する核酸は、ＤＮＡチップに適用可能である。ＤＮＡチップにそれらの核酸を固定することにより、例えば、血液中や所定の組織中のＲＯＲα発現量を検出できるため、概日リズムの変調などの検出に、有用な可能性がある。ＤＮＡチップへの核酸の固定は、公知方法により行うことができる。
【００３２】
同様に、ＲＯＲαと特異的に結合する抗体は、プロテインチップに適用可能である。プロテインチップに、この抗体を固定することにより、例えば、血液中や所定の組織中のＲＯＲα発現量を検出できるため、概日リズムの変調などの検出に、有用な可能性がある。プロテインチップへの抗体の固定も、公知方法により行うことができる。
【００３３】
＜本発明に係る概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用について＞
続いて、本発明に係る概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用について、以下説明する。
【００３４】
上述の通り、本発明に係るＲＯＲαは、概日リズムを調整するメカニズムにおいて、重要な役割を果たしているため、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとして使用できる可能性がある。具体的には、例えば、血液中や所定の組織中のＲＯＲα量をＥＬＩＳＡ法（公知方法）などで検出し、ＲＯＲα発現量の変調を検出することにより、概日リズムの変調を検出できる可能性がある。
【００３５】
＜本発明に係るスクリーニング方法について＞
続いて、本発明に係るスクリーニング方法の一例について、以下説明する。
【００３６】
ＲＯＲαを抑制する物質を探索することにより、スクリーニングを行う場合、例えば、反応系に標的物質を供給した後、ＲＯＲαとＢｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）との相互作用を検出することにより、目的の物質を探索できる。即ち、反応系に標的物質を供給することにより相互作用が抑制された場合、その標的物質は、抗がん剤又は時差ぼけ調整剤として有効な可能性がある。
【００３７】
スクリーニング方法の具体例として、例えば、予め、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）のオリゴヌクレオチドを、カラム、ビーズなどに固定しておき、ＲＯＲαと標的物質を供給した後、ＲＯＲαとＢｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）との相互作用を検出する方法、が考えられる。その場合、相互作用を検出する方法として、例えば、共免疫沈降法、カラム又はビーズを用いたプルダウン法、などを適用できる。
【００３８】
なお、本発明に係るスクリーニング方法は、キット化が可能である。その場合、例えば、ＲＯＲα、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）のオリゴヌクレオチド、抗ＲＯＲα抗体、相互作用検出試薬（共免疫沈降法、カラム又はビーズを用いたプルダウン法、ウエスタンブロットなどに用いる試薬）、などを、相互作用検出方法などに応じて適宜組み合わせ、キット化する。その場合、前記タンパク質及びオリゴヌクレオチドは、変異体を用いてもよい。
【実施例１】
【００３９】
実施例１及び実施例２では、予備的実験として、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを調べた。
【００４０】
実施例１では、マウスから複数の組織を採取し、それらの組織における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを調べた。
【００４１】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、実験に用いたマウスの概日リズムを同調させた。マウスを、２週間、８時から２０時まで明条件、２０時から翌８時までを暗条件にした部屋で飼育し、マウスの概日リズムを同調させた。
（２）次に、マウスから概日リズム末梢組織として、肝臓、心臓、腎臓、肺、胃を所定の時刻に採取した。なお、各臓器の採取時刻は、概日リズムの同調を行った直後の８時から、４時間ごとに設定した（８時、１２時、１６時、２０時、２４時、翌４時）。
（３）次に、採取した各臓器をホモジナイズ後、Ｐｒｏｍｅｇａ ｔｏｔａｌ ＳＶ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
（４）次に、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応）を行い、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の各遺伝子の発現量を測定した。
【００４２】
結果を図２に示す。
図中、「ｌｉｖｅｒ」は肝臓を、「ｈｅａｒｔ」は心臓を、「ｋｉｄｎｅｙ」は腎臓を、「ｌｕｎｇ」は肺を、「ｓｔｏｍａｃｈ」は胃を、それぞれ示す。
各グラフ中、横軸「ＺＴ（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ Ｔｉｍｅｓ）」は、概日時間を示す。また、縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸の発現量の値は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｌｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を１とした場合の相対的な値である。
【実施例２】
【００４３】
実施例２では、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを、実施例１と同様の手順で調べた。
【００４４】
結果を図３に示す。
図中、横軸は、概日時間を示す。また、縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸の発現量の値は、実施例１と同様、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｌｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を１とした場合の相対的な値である。
【００４５】
以上、実施例１及び実施例２より、各組織における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の３つの遺伝子の発現パターンを確認できた。
【実施例３】
【００４６】
続いて、実施例３及び実施例４は、ＲＯＲαがＢｍａｌ１の発現を誘導するかどうかを、ルシフェラーゼアッセイにより調べた実験である。
【００４７】
「ルシフェラーゼアッセイ」の概要について、以下説明する。
ルシフェラーゼは、生物発光を触媒する酵素タンパク質である。
例えば、所定の遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼをコードする遺伝子とを連結させた組換え遺伝子を作製し、その組換え遺伝子を培養細胞に組み込んだ場合、その遺伝子の発現が誘導されると、ルシフェラーゼが発現する。
そこで、ルシフェラーゼによる生物発光を測定し、ルシフェラーゼの発現レベルを取得することにより、その遺伝子の発現誘導レベルを推定することができる。
【００４８】
実施例３では、ＲＯＲファミリータンパク質（ＲＯＲα１、ＲＯＲα４、ＲＯＲβ、ＲＯＲγ）が、Ｂｍａｌ１の発現を誘導するかどうかを、ルシフェラーゼアッセイにより調べた。
【００４９】
実験手順の概要を以下に示す。
（１）まず、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。この組換えベクターは、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する。
（２）また、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、ＲＯＲファミリータンパク質をコードするＤＮＡ配列を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（３）次に、（１）及び（２）で作製した組換えベクターを、共に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションした。次に、トランスフェクションした培養細胞を、単離・継代し、両たんぱく質を共発現させた。そして、トランスフェクションの３６時間後に、継代した細胞を集め、溶解させた。
（４）次に、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、溶解させた細胞溶液を調製した後、発光強度を測定し、Ｂｍａｌ１の発現誘導レベルを取得した。
【００５０】
結果を図４に示す。
図中、「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを、「ＲＯＲα１」は、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、「ＲＯＲα４」は、ＲＯＲα４をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、「ＲＯＲβ」は、ＲＯＲβをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、「ＲＯＲγ」は、ＲＯＲγをコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを、それぞれ示し、「＋」は、それらの組換えベクターを、培養細胞に組み込んだことを表す。
縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、発光強度を表す。この値は、「ＢＭ−Ｌｕｃ」のみを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「１」とした場合の相対値である。
【００５１】
図４に示す結果は、ＲＯＲファミリータンパク質、特に、ＲＯＲα１及びＲＯＲα４が、Ｂｍａｌ１の発現を誘導することを強く示唆する。
【実施例４】
【００５２】
実施例４では、ＲＯＲα４の発現レベルを変動させた場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導レベルも変動するかどうかについて調べた。
【００５３】
実験は、実施例３と同様の方法により行った。
なお、組換えベクターを培養細胞にトランスフェクションする際、ＲＯＲα４をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターの添加量を、それぞれ、０（コントロール）、１、５、１０、２５、５０、１００ｎｇとした。
【００５４】
結果を図５に示す。
図中、「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを示し、「＋」は、組換えベクターを、培養細胞に組み込んだことを表す。
「ＲＯＲα４」は、ＲＯＲα４をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを示し、数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｕｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、発光強度を表す。この値は、図４と同様、「ＢＭ−Ｌｕｃ」のみを培養細胞に組み込んだ場合の発光強度を「１」とした場合の相対値である。
【００５５】
図５の結果は、ＲＯＲα４の発現量の増大に伴い、Ｂｍａｌ１の発現誘導も促進されることを強く示唆する。従って、この結果は、ＲＯＲα４の促進がＢｍａｌ１の発現を誘導することを強く示唆する。
【実施例５】
【００５６】
Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子は、概日リズム制御遺伝子として知られ、ＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）に結合して、Ｂｍａｌ１の発現を抑制することが知られている。
そこで、実施例５では、ＲＯＲαタンパク質とＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質を共発現させた場合、Ｂｍａｌ１の発現が誘導されるかどうかについて、調べた。
【００５７】
実験手順の概要は、以下の通りである。
（１）まず、実施例３などと同様の手順により、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んだ組換えベクター、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクター、Ｒｅｖ−ｅｒｂ遺伝子を組み込んだ組換えベクター、をそれぞれ作製した。
（２）次に、その３つの組み換えベクターを、共に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３にトランスフェクションし、各タンパク質を共発現させた。
（３）そして、その培養細胞を溶解させた後、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、溶解させた細胞溶液を調製し、発光強度を測定した。
【００５８】
結果を図６に示す。
図中、「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを示し、「＋」は、組換えベクターを、培養細胞に組み込んだことを表す。
「ＲＯＲα１」は、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを示し、カッコ書きの数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
「β−Ｇａｌ」は、前記と同様の手順でβ−ガラクトシダーゼを共発現させた場合を示し、コントロールである。数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
「ＲＥα」、「ＲＥβ」は、それぞれ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ遺伝子を組み込んだ組換えベクターを示し、数字は、トランスフェクションの際の、組換えベクターの添加量（単位はｎｇ）を表す。
【００５９】
図６の結果は、ＲＯＲαとＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域に競合的に作用することを強く示唆する。
【実施例６】
【００６０】
実施例６では、ＲＯＲαのドミナントネガティブ変異体の存在下で細胞を培養した場合の、Ｂｍａｌ１発現量の概日変化について調べた。
【００６１】
実験手順の概要は次の通りである。
まず、実施例３などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
次に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔに、その組み換えベクターをトランスフェクションし、その培養細胞を単離・継代した。
次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
次に、培養液に、ＲＯＲα１のドミナントネガティブ変異体を加えた後、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【００６２】
結果を図７に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸は発光強度（単位はＭ ｃｐｍ；Ｍｉｌｌｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｕｎｔｓ Ｐｅｒ Ｍｉｎｕｔｅｓ）を、それぞれ示す。
「ｖｅｃｔｏｒ」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりに空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）を加えた場合（コントロール）の実験結果であることを示す。
「β−Ｇａｌ」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりにβ−ガラクトシダーゼを加えた場合（コントロール）の実験結果であることを示す。
「ｈＲＯＲα１ΔＬＢＤ」は、ヒトＲＯＲα１のドミナントネガティブ変異体を加えた場合の実験結果であることを示す。
【００６３】
図７に示す通り、ＲＯＲα１のドミナントネガティブ変異体を加えた場合、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムが抑制された。即ち、この結果は、ＲＯＲαが、ｂｍａｌ１の発現を誘導するだけでなく、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムの発現に、重要な役割を果たしていることを強く示唆する。
【実施例７】
【００６４】
実施例７及び実施例８では、ＲＯＲαによるＢｍａｌ１の発現誘導に関して、ＲＯＲαの、Ｂｍａｌ１の配列における作用部位を調べた。
【００６５】
実施例７では、Ｂｍａｌ１遺伝子の上流領域のＤＮＡ配列について、それぞれ長さの異なるものを作製し、実施例３などと同様の手順により、ＲＯＲαによるＢｍａｌ１の発現誘導レベルを取得した。
【００６６】
実験手順の概要について、以下説明する。
（１）まず、図８に示すＤＮＡ配列を有する組換えベクターを、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、それぞれ作製した。
図中、「Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ」は、その領域が、ルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列であることを示し、「Ｅｘｏｎ１」は、その領域が、Ｂｍａｌ１遺伝子の一番目のエクソン部分の配列を有することを示す。なお、「ｈＢｍａｌ１」は、ヒトのＢｍａｌ１遺伝子を表す。
「ＲＯＲＥ１」及び「ＲＯＲＥ２」は、その領域が、それぞれ、Ｂｍａｌ１遺伝子のプロモーター領域であることを示す。
「−３４６５」は、そのＤＮＡ配列が、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の３４６５塩基分上流までの配列を有することを示す。他の数字も同様である。
「ｍｔ」は、変異体（ｍｕｔａｎｔ）を表し、ＲＯＲＥ１、ＲＯＲＥ２、又は両者の配列の一部分が変異したものであることを示す。
（２）そして、実施例３などと同様の手順により、ＲＯＲα１とルシフェラーゼを共発現させた後、発光強度を測定し、Ｂｍａｌ１の発現誘導レベルを取得した。
【００６７】
結果を図９に示す。
図中、 「ＲＯＲα１」は、ＲＯＲα１をコードするＤＮＡ配列を組み込んだ組換えベクターを示し、「＋」は、その組換えベクターを培養細胞に組み込んだことを、「−」は、組み込んでいないことを、それぞれ表す。
「ＢＭ−Ｌｕｃ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子をコードする領域を有する組換えベクターを示す。
「−３４６５」は、その組換えベクターが、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の３４６５塩基分上流までの配列を含むことを示し、「−８２９」は、その組換えベクターが、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の８２９塩基分上流までの配列を含むことを示し、「−２３０」は、その組換えベクターが、Ｂｍａｌ１遺伝子配列の２３０塩基分上流までの配列を含むことを示す。
また、「ＲＯＲＥ１ｍｕｔ／ＲＯＲＥ２」はＲＯＲＥ１を欠損させた場合、「ＲＯＲＥ１／ＲＯＲＥ２ｍｕｔ」はＲＯＲＥ２を欠損させた場合、「ＲＯＲＥ１ｍｕｔ／ＲＯＲＥ２ｍｕｔ」はＲＯＲＥ１とＲＯＲＥ２の両方を欠損させた場合、を表す。なお、「ｍｕｔ」は、変異体（ｍｕｔａｎｔ）を表す。
【実施例８】
【００６８】
次に、実施例８では、実施例７で作製した組換えベクター（図８参照）を用いて、実施例６などと同様の手順により、Ｂｍａｌ１発現量の概日変化について調べた。
【００６９】
結果を図１０に示す。
図中の表示は、図７及び図９と同様である。
【００７０】
以上、実施例７（図９）及び実施例８（図１０）の結果は、ＲＯＲαによるＢｍａｌ１の発現誘導が、Ｂｍａｌ１遺伝子の両方のプロモーター領域（ＲＯＲＥ１、ＲＯＲＥ２）を必要とすることを示す。従って、ＲＯＲαは、Ｂｍａｌ１遺伝子の両方のプロモーター領域に作用して、Ｂｍａｌ１の発現を誘導していることを強く示唆する。
【実施例９】
【００７１】
実施例９では、プルダウン法により、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）とＲＯＲαとの結合を調べた。
【００７２】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、所定時刻に、マウスの肝臓を採取後、ホモジナイズし、マウス肝臓の抽出物を得た。
（２）また、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドをビオチン化した。ビオチン化したオリゴヌクレオチドは、ストレプトアヴィジン−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に固定した。
（３）次に、（１）で取得したマウス肝臓抽出物に、（２）のビーズを加え、インキュベートした。
（４）次に、ビーズを回収（プルダウン）した後、抗ＲＯＲα抗体を用いてウエスタンブロットし、ＲＯＲαを検出した。
【００７３】
以上の手順により、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドとＲＯＲα（肝臓抽出物中に存在）が結合しているかどうかを調べることができる。
【００７４】
結果を図１１に示す。
図中、「ｎｏ ＯＤＮ（ｎｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、ビオチンにオリゴヌクレオチドを結合させていない場合（コントロール）を示す。
「ＢＭ−ＲＯＲＥｓ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドをビオチン化した場合の結果を示す。
「ＢＭ−ｍＲＯＲＥｓ」は、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を一部変化させたオリゴヌクレオチド（変異体）をビオチン化した場合の結果を示す。なお、「ｍ」は変異体（ｍｕｔａｎｔ）を表す。
「ＣＴ（ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｔｉｍｅ）」は、概日時間を表す。即ち、マウスから肝臓を採取した時刻を表し、概日時間（明条件の開始時間を０時とした時刻）で示している。
「ＲＯＲα１」、「ＲＯＲα４」は、ウエスタンブロットに用いた抗体を示し、バンドの現れる位置を表している。
【００７５】
図１１に示す通り、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）の配列を含むオリゴヌクレオチドを用いた場合、「ＲＯＲα１」、「ＲＯＲα４」の両方において、バンドが確認できた。それに対し、変異体のオリゴヌクレオチドを用いた場合、バンドが消失した。
【００７６】
従って、以上の結果は、ＲＯＲαが、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域（ＲＯＲＥ）に結合することにより、Ｂｍａｌ１の発現を誘導することを強く示唆する。
【実施例１０】
【００７７】
実施例１０では、ＲＯＲα遺伝子を欠損した変異体マウスを用いて、アクトグラムを行い、ＲＯＲα遺伝子欠損が、マウスの概日リズムに与える影響について、調べた。
【００７８】
「アクトグラム」は、マウスの飲食行動を検出することにより、マウスの活動時間を連続的に記録する方法である。
【００７９】
図１２は、１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件でフリーラン（自由継続）させた場合のアクトグラムである。
図中、「＋／＋」は野生型を、「＋／ｓｇ」はヘテロのＲＯＲα遺伝子欠損型を、「ｓｇ／ｓｇ」はホモのＲＯＲα遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
「ＬＤ」は明条件（ｌｉｇｈｔ）と暗条件（ｄａｒｋ）を繰り返す環境を示し、「ＤＤ」は暗条件（ｄａｒｋ）を続ける環境、即ち、フリーラン（自由継続）させた場合、を示す。
【００８０】
図１２に示す通り、飼育環境を２４時間暗条件に変更した場合、野生型と比較して、変異体マウスでは、行動時間の開始時刻が早くなった。即ち、概日周期が短くなった。この結果は、ＲＯＲαが、Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進することにより、個体の概日リズムにも影響を与えていることを示唆する。
【００８１】
図１３は、図１２に示した実験結果に基づいて、飼育環境を２４時間暗条件に変更した後の、マウスの概日周期の平均値を取得した図である。図１３が示す通り、野生型マウスでは、概日周期が、約２３．８時間であったのに対し、ホモのＲＯＲα遺伝子欠損型マウスでは、概日周期が約２３．４時間に減少していた。
【００８２】
次に、図１４は、１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件の開始時刻を４時間早め、時差のある状態にした場合のアクトグラムである。
図中の表示は、図１２と同様である。
【００８３】
図１４に示す通り、暗条件の開始時刻を４時間早めた場合、ＲＯＲα遺伝子欠損型マウスは、野生型マウスよりも早く、新しい環境条件に順応した。
【００８４】
図１５は、１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、環境条件を、６時間ごとに明条件と暗条件を繰り返す環境に変化させた場合のアクトグラムである。
図中の表示は、図１２と同様である。
【００８５】
図１５に示す通り、野生型マウスでは、環境の変化にかかわらず、概日リズムを維持したのに対し、ＲＯＲα遺伝子欠損型マウスは、概日リズムを維持したものと、概日リズムが完全に乱れたものの両者が存在した。
【実施例１１】
【００８６】
実施例１１では、ＲＮＡ干渉により、ＲＯＲαの発現を抑制した場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導も抑制されるかどうか、調べた。
【００８７】
実験手順の概要は、次に通りである。
（１）まず、組換えｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製した。ＲＯＲα４をコードする遺伝子配列の第８４９〜１３９１塩基の中から、１９塩基からなる配列（配列番号５）を選択した。そして、その配列を、ｓｉＲＮＡ発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製した。
（２）また、実施例３などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（３）次に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔに、組換えｓｉＲＮＡ発現ベクターとＢｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んだ組換えベクターとを、共に、トランスフェクションした後、その培養細胞を単離・継代した。
（４）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（５）次に、培養液に、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【００８８】
結果を図１６に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「ｖｅｃｔｏｒ」は、ドミナントネガティブ変異体の代わりに空ベクター（ｐｃＤＮＡ３）を加えた場合（コントロール）の実験結果であることを示す。
「ＲＮＡｉ（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、ＲＯＲαの配列とは関係のないｓｉＲＮＡを用いた場合であり、コントロールである。
「ＲＮＡｉ（ＲＯＲα）」は、ＲＯＲαをコードする塩基配列の一部を有するｓｉＲＮＡを用いた場合である。
【００８９】
図１６に示す通り、ＲＯＲαをコードする塩基配列の一部を有するｓｉＲＮＡを用いた場合（図中、一番下のグラフ）、空ベクターを用いた場合（そのグラフの上側の曲線）と比較して、Ｂｍａｌ１の発現誘導の振幅が減少した（そのグラフ中の下側の曲線）。従って、本実験結果は、ＲＮＡ干渉を用いてＲＯＲの発現を抑制した場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導も抑制されることを示す。
【実施例１２】
【００９０】
実施例１２及び実施例１３では、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ；Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を用いて、ＲＯＲαにＢｍａｌ１の発現誘導を促進する作用があるかどうか、調べた。
【００９１】
実施例１２では、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体を用いて、Ｂｍａｌ１発現誘導の概日変化を調べた。
【００９２】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、前記と同様、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（２）次に、その組換えベクターを、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体にトランスフェクションした後、その培養細胞を単離・継代した。
（３）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（４）次に、培養液に、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【００９３】
結果を図１７に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「＋／＋」は野生型を、「＋／ｓｇ」はヘテロのＲＯＲα遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
【００９４】
図１７に示す通り、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体では、Ｂｍａｌ１発現誘導の振幅が減少した。
【実施例１３】
【００９５】
次に、実施例１３では、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体における、Ｂｍａｌ１発現量の概日変化を調べた。
【００９６】
マウス胚繊維芽細胞をホモジナイズ後、Ｐｒｏｍｅｇａ ｔｏｔａｌ ＳＶ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、各臓器からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現量を測定した。
【００９７】
結果を図１８に示す。
図中、横軸は、時間（単位は分）を示す。縦軸「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍＲＮＡ ａｂｕｎｄａｎｃｅ」は、相対的な発現量（発現レベル）を示す。なお、縦軸の発現量の値は、実施例１と同様、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（ＧｌｙｃｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ−３−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ＤｅＨｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現量を１とした場合の相対的な値である。
「＋／＋」は野生型を、「＋／ｓｇ」はヘテロのＲＯＲα遺伝子欠損型を、それぞれ示す。
【００９８】
図１８に示す通り、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体では、Ｂｍａｌ１発現量の振幅が減少した。なお、この結果は、図１７の結果ともほぼ一致した。
以上、図１７及び図１８の結果は、細胞レベルでも、ＲＯＲαがＢｍａｌ１の発現誘導を促進することを、強く示唆する。
【実施例１４】
【００９９】
実施例１７では、アンチセンス核酸を用いてＲＯＲαの発現を抑制した場合、Ｂｍａｌ１の発現誘導も抑制されるかどうか、調べた。
【０１００】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、アンチセンス核酸発現ベクターを作製した。ＲＯＲαをコードする遺伝子のうち、所定の領域と同じ塩基配列を有するＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３に組み込んで、アンチセンス核酸発現ベクターを作製した。
なお、ＤＮＡフラグメントとして、ＲＯＲαをコードする遺伝子の第６５〜５７４塩基までの配列を有するフラグメント、第５９９〜１１２２塩基までの配列を有するフラグメント、第８４９〜１３９１塩基までの配列を有するフラグメント、の３種類を用いた。
（２）また、実施例３などと同様に、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（３）次に、培養細胞ＮＩＨ３Ｔに、アンチセンス発現ベクターとＢｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んだ組換えベクターとを、コトランスフェクションし、その培養細胞を単離・継代した。
（４）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（５）次に、培養液に、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
【０１０１】
結果を図１９に示す。
図中、図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「ＡＳ（ＲＯＲα１）」は、アンチセンス核酸として、ＲＯＲαをコードする遺伝子の第６５〜５７４塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、「ＡＳ（ＲＯＲα２）」は、アンチセンスとして、第５９９〜１１２２塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、「ＡＳ（ＲＯＲα３）」は、アンチセンスとして、第８４９〜１３９１塩基までの配列を有するフラグメントを用いた場合、を示す。
【０１０２】
図１９に示す通り、いずれの場合も、アンチセンス核酸を用いてＲＯＲαの発現を抑制することにより、Ｂｍａｌ１の発現誘導の振幅も抑制された。
【実施例１５】
【０１０３】
上述の通り、ＲＯＲαは低酸素状態において発現が誘導されることが明らかになっている。そこで、実施例１５では、低酸素状態において、Ｂｍａｌ１の発現誘導も促進されるかどうかについて調べた。
【０１０４】
実験手順の概要は次の通りである。
（１）まず、前記と同様、ルシフェラーゼ発光ベクターｐＧＬ３ ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、Ｂｍａｌ１のプロモーター領域を組み込んで、組換えベクターを作製した。
（２）次に、その組換えベクターを、マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体にトランスフェクションし、その培養細胞を単離・継代した。
（３）次に、その培養細胞に血清刺激を加えることにより、概日リズムを発生させた。
（４）次に、培養液に、０．０１ｍＭＣｏＣｌ２を加えた後、１５分おきに、ルシフェリン（ルシフェラーゼの基質）を加え、ルシフェラーゼ活性（発光強度）を測定した。そして、その発光強度の概日変化より、Ｂｍａｌ１の転写概日リズムを取得した。
なお、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）を加えた条件下で、細胞を培養することにより、低酸素状態を作り出すことができる。
【０１０５】
結果を図２０に示す。
図中、横軸は時間（単位は分）を、縦軸（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｐｍ）は発光強度を示す。なお、発光強度は、最初の発光強度のピークを「１」とした時の相対値である。
「＋０．０１ｍＭＣｏＣｌ２」は、培養液に０．０１ｍＭＣｏＣｌ２を加えた場合を、「＋０．１ｍＭＮａＣｌ」は、培養液に、０．０１ｍＭＣｏＣｌ２の代わりに、０．１ｍＭＮａＣｌを加えた場合（コントロール）を、それぞれ示す。
【０１０６】
図２０の結果は、低酸素状態では、Ｂｍａｌ１の発現誘導も促進されることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明は、概日リズムの調節メカニズムのうち、未解明な部分を明らかにして点で、有用である。従って、本発明は、概日リズムの調節メカニズムに関与する疾患、例えば、がん、睡眠障害、時差ぼけ、覚醒障害、不眠症、自律神経失調症、うつ病、老人性痴呆などの疾患の予防剤、治療剤として、適用可能性がある。また、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、概日リズムの変調を検出するためのマーカー、抗がん剤・時差ぼけ調整剤などのスクリーニング方法やスクリーニングキットなどに適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】概日リズムの調節メカニズムを示す図。
【図２】各組織における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを示す図。
【図３】培養細胞ＮＩＨ３Ｔ３における、Ｒｅｖ−ｅｒｖα、Ｒｏｒα、Ｂｍａｌ１の発現パターンを示す図。
【図４】ＲＯＲαがＢｍａｌの発現を誘導したことを示す図。
【図５】ＲＯＲα４の発現量の増大に伴い、Ｂｍａｌの発現誘導も促進されることを示す図。
【図６】ＲＯＲαとＲＥＶ−ＥＲＢタンパク質が、Ｂｍａｌのプロモーター領域に競合的に作用することを示す図。
【図７】ＲＯＲαのドミナントネガティブ変異体の存在下で細胞を培養した場合の、Ｂｍａｌ発現量の概日変化を示す図。
【図８】作製した組換えベクターの配列を示す図。
【図９】Ｂｍａｌ１の上流領域の長さをかえた場合における、ＲＯＲαによるＢｍａｌの発現誘導レベルを示す図。
【図１０】Ｂｍａｌ１の上流領域の長さをかえた場合における、Ｂｍａｌ発現量の概日変化を示す図。
【図１１】プルダウン法による、ウエスタンブロット写真（図面代用写真）。
【図１２】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件でフリーラン（自由継続）させた場合のアクトグラム。
【図１３】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、飼育環境を２４時間暗条件にした場合の、マウスの概日周期を取得した図。
【図１４】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、暗条件の開始時刻を４時間早め、時差のある状態にした場合のアクトグラム。
【図１５】１５日間、１２時間ごとに明条件と暗条件を繰り返した後、環境条件を、６時間ごとに明条件と暗条件を繰り返す環境に変化させた場合のアクトグラム。
【図１６】ＲＮＡ干渉により、ＲＯＲαの発現を抑制した場合の、Ｂｍａｌの発現誘導を示す図。
【図１７】マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体を用いた場合の、Ｂｍａｌ発現誘導の概日変化を示す図。
【図１８】マウス胚繊維芽細胞のＲＯＲα遺伝子欠損変異体を用いた場合における、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる、Ｂｍａｌ発現量の概日変化を示す図。
【図１９】アンチセンスを用いてＲＯＲαの発現を抑制した場合における、Ｂｍａｌの発現誘導を示す図。
【図２０】低酸素状態において、Ｂｍａｌの発現誘導が促進されたことを示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα。
【請求項２】
低酸素状態で発現が促進されることを特徴とする請求項１記載のＲＯＲα。
【請求項３】
ＲＥＶ−ＥＲＢα又はＲＥＶ−ＥＲＢβと競合的に作用することを特徴とする請求項１記載のＲＯＲα。
【請求項４】
ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合を促進することを特徴とする請求項１記載のＲＯＲα。
【請求項５】
Ｐｅｒ遺伝子及び／又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導を促進することを特徴とする請求項４記載のＲＯＲα。
【請求項６】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項７】
前記物質は、抗ＲＯＲα抗体であることを特徴とする請求項６記載の抗がん剤。
【請求項８】
前記物質は、ＲＯＲαの発現を抑制するｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項６記載の抗がん剤。
【請求項９】
前記物質は、アンチセンス核酸であることを特徴とする請求項６記載の抗がん剤。
【請求項１０】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を少なくとも含有する時差ぼけ調整剤。
【請求項１１】
前記物質は、抗ＲＯＲα抗体であることを特徴とする請求項１０記載の時差ぼけ調整剤。
【請求項１２】
前記物質は、ＲＯＲαの発現を抑制するｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１０記載の時差ぼけ調整剤。
【請求項１３】
前記物質は、アンチセンス核酸であることを特徴とする請求項１０記載の時差ぼけ調整剤。
【請求項１４】
請求項１記載のＲＯＲαをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、又は、前記遺伝子の一部分の塩基配列を有する核酸が少なくとも固定されたＤＮＡチップ。
【請求項１５】
請求項１記載のＲＯＲαと特異的に結合する抗体が少なくとも固定されたプロテインチップ。
【請求項１６】
請求項１記載のＲＯＲαの、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用。
【請求項１７】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を探索することによる、時差ぼけ調整剤のスクリーニング方法。
【請求項１】
Ｂｍａｌ１の発現誘導を促進するＲＯＲα。
【請求項２】
低酸素状態で発現が促進されることを特徴とする請求項１記載のＲＯＲα。
【請求項３】
ＲＥＶ−ＥＲＢα又はＲＥＶ−ＥＲＢβと競合的に作用することを特徴とする請求項１記載のＲＯＲα。
【請求項４】
ＢＭＡＬ１とＣＬＯＣＫとの結合を促進することを特徴とする請求項１記載のＲＯＲα。
【請求項５】
Ｐｅｒ遺伝子及び／又はＣｒｙ遺伝子の発現誘導を促進することを特徴とする請求項４記載のＲＯＲα。
【請求項６】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を少なくとも含有する抗がん剤。
【請求項７】
前記物質は、抗ＲＯＲα抗体であることを特徴とする請求項６記載の抗がん剤。
【請求項８】
前記物質は、ＲＯＲαの発現を抑制するｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項６記載の抗がん剤。
【請求項９】
前記物質は、アンチセンス核酸であることを特徴とする請求項６記載の抗がん剤。
【請求項１０】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を少なくとも含有する時差ぼけ調整剤。
【請求項１１】
前記物質は、抗ＲＯＲα抗体であることを特徴とする請求項１０記載の時差ぼけ調整剤。
【請求項１２】
前記物質は、ＲＯＲαの発現を抑制するｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１０記載の時差ぼけ調整剤。
【請求項１３】
前記物質は、アンチセンス核酸であることを特徴とする請求項１０記載の時差ぼけ調整剤。
【請求項１４】
請求項１記載のＲＯＲαをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、又は、前記遺伝子の一部分の塩基配列を有する核酸が少なくとも固定されたＤＮＡチップ。
【請求項１５】
請求項１記載のＲＯＲαと特異的に結合する抗体が少なくとも固定されたプロテインチップ。
【請求項１６】
請求項１記載のＲＯＲαの、概日リズムの変調を検出するためのマーカーとしての使用。
【請求項１７】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を探索することによる、抗がん剤のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１記載のＲＯＲαを抑制する物質を探索することによる、時差ぼけ調整剤のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００６−２７３７６０（Ｐ２００６−２７３７６０Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−９６４５９（Ｐ２００５−９６４５９）
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２９日（２００５．３．２９）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
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