Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法
【課題】Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することができるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤などを提供することを課題とする。
【解決手段】本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴としている。
【解決手段】本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＢ６、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有することを特徴としている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞に存在する「時計遺伝子」は、「概日リズム」と称される約２４時間の周期性を生体において維持する機能を有していることが知られている。即ち、時計遺伝子は、地球の自転に伴って起こる明暗などの約２４時間周期の環境サイクルに生体が適応できるように概日リズムを制御している。時計遺伝子としては、複数の種類が知られており、例えば、昼に発現が活性化されるＰｅｒｉｏｄ、Ｃｒｙや、夜に発現が活性化されるＢｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋなどが知られている。
【０００３】
また、時計遺伝子は、概日リズムを刻む生体現象を制御しており、該生体現象としては、睡眠及び覚醒、血圧及び体温の上下、副腎皮質ホルモン、メラトニン、若しくは成長ホルモン等の分泌量の変動等が知られている。
さらに、時計遺伝子は、全身の細胞の概日リズムを統括すべく中枢組織としての視床下部の視交叉上核（suprachiasmatic nucleus : SCN）を制御するだけでなく、末梢組織の各細胞が概日リズムを刻むように末梢組織細胞をも直接的に制御する。
【０００４】
近年、時計遺伝子が概日リズムを制御する機構が知られるようになり、該機構としては、例えば、上述したＢｍａｌ１及びＣｌｏｃｋの遺伝子産物の２量体（ＢＭＡＬ／ＣＬＯＣＫ複合体）が、Ｅ−ｂｏｘ配列に結合してＰｅｒｉｏｄ及びＣｒｙの転写を活性化し、該活性化によって増加したＰＥＲＩＯＤ及びＣＲＹが複合体を形成して核内に移行し、ＢＭＡＬ／ＣＬＯＣＫ複合体を抑制するため、Ｐｅｒｉｏｄ及びＣｒｙの転写が減少するというフィードバック機構が知られている。そして、該フィードバック機構により、約２４時間周期の概日リズムが生み出されることが知られている。従って、各時計遺伝子の発現を活性化又は抑制することにより、概日リズムを制御できると考えられている。
【０００５】
従来、時計遺伝子の発現を活性化し得る時計遺伝子の発現活性化剤としては、具体的には、例えば、特定のアルキレンジオキシベンゼン誘導体を含むものが知られている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、斯かる時計遺伝子の発現活性化剤は、光照射によって高められたＰｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現を維持するものであり、直接的にＰｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現を活性化できるものではない。
また、斯かる時計遺伝子の発現活性化剤は、Ｐｅｒｉｏｄ１遺伝子に作用するものであり、概日リズムに関わる時計遺伝子のフィードバック機構において最も中心的な役割を担うとされるＢｍａｌ１遺伝子の発現を直接的に活性化するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３３５６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、概日リズムを調整するために重要な役割を有するＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化できるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤が要望されている。
【０００９】
本発明は、上記要望点等に鑑み、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することができるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を提供することを課題とする。また、本発明は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することができるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むことを特徴としている。
【００１１】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも２種を含むことが好ましい。
【００１２】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤によってＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性させることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１及び２のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図２】実施例３及び４のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図３】実施例５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図４】実施例６〜８のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図５】実施例９〜１１のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図６】実施例１２〜１５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図７】比較例１のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図８】実施例１６のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図９】実施例１７及び１８のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１０】実施例１９及び２０のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１１】実施例２１及び２２のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１２】実施例２３及び２４のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１３】実施例２５〜２７のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１４】比較例２及び３のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１５】比較例４及び５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１６】比較例６及び７のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１７】実施例２８〜３１のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１８】実施例３２〜３５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤の実施形態について以下に説明する。
【００１６】
本実施形態のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むものである。
【００１７】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも２種を含むことが好ましい。
【００１８】
前記ビタミンＢ６は、ピリドキシン、ピリドキサール、若しくはピリドキサミン、又は、これらの塩若しくはリン酸エステルである。
前記塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。
前記ビタミンＢ６としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ピリドキシン又はその塩が好ましく、ピリドキシン塩酸塩がより好ましい。
【００１９】
前記ビタミンＣは、Ｌ−アスコルビン酸又はその誘導体である。Ｌ−アスコルビン酸誘導体は、分子内にＬ−アスコルビン酸構造を有し、生体内においてＬ−アスコルビン酸を生成するものである。
【００２０】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、水溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体、又は油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体などが挙げられる。
【００２１】
前記水溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、リン酸Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムやリン酸Ｌ−アスコルビン酸マグネシウムなどのリン酸Ｌ−アスコルビン酸塩、アスコルビン酸グルコシドなどが挙げられる。
前記油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ステアリン酸Ｌ−アスコルビル、Ｌ−アスコルビン酸−２リン酸−６パルミチン酸などが挙げられる。
【００２２】
前記ビタミンＣとしては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、Ｌ−アスコルビン酸誘導体が好ましく、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体がより好ましく、テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル、又はジパルミチン酸Ｌ−アスコルビルがさらに好ましい。
【００２３】
前記ビタミンＤは、エルゴカルシフェロール、又は、コレカルシフェロールである。
【００２４】
前記ビタミンＤとしては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、エルゴカルシフェロールが好ましい。
【００２５】
前記ビタミンＥは、α−トコフェロール又はその誘導体である。α−トコフェロール誘導体は、分子内にα−トコフェロール構造を有し、生体内においてα−トコフェロールを生成するものである。なお、前記ビタミンＥにおけるα−トコフェロールは、ｄ体であってもｌ体であってもよい。
【００２６】
前記α−トコフェロール誘導体としては、例えば、α−トコフェロール酢酸エステルなどのα−トコフェロールエステル誘導体が挙げられる。
【００２７】
前記ビタミンＥとしては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、α−トコフェロール誘導体が好ましく、α−トコフェロールエステル誘導体がより好ましく、α−トコフェロール酢酸エステルがさらに好ましい。
【００２８】
前記発現活性化剤としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくともビタミンＣを含むものが好ましい。同様の理由により、上述したビタミンのうち少なくとも２種を含むものが好ましい。また、少なくともビタミンＣを含み且つ上述したビタミンのうち少なくとも２種を含むものがさらに好ましい。
【００２９】
前記少なくとも２種のビタミンを含むＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤としては、具体的には例えば、ビタミンＢ６とビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものが挙げられる。
また、例えば、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むもの、又は、ビタミンＢ６とビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものなどが挙げられる。
【００３０】
前記発現活性化剤としては、ビタミンＢ６とビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものがより好ましく、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、又はビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものがさらに好ましい。
【００３１】
前記発現活性化剤としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をさらに活性化できるという点で、ピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）との混合物を含むもの、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）との混合物を含むもの、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むもの、ピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むもの、又は、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むものがより好ましい。
【００３２】
前記発現活性化剤においては、複数種のビタミンが含まれる場合、各ビタミンの含有量の比が、特に限定されず適宜設定されている。
【００３３】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、及びポミフェリンからなる群より選ばれた少なくとも１種を含むことが好ましい。
【００３４】
前記ゲニステインは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１）で示される化合物である。
【００３５】
【化１】
【００３６】
前記ゲニスチンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（２）で示される化合物（ゲニステイン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記ゲニスチンは、アグリコンとしての前記ゲニステインとグルコースとからなる配糖体である。
【００３７】
【化２】
【００３８】
前記グリシテインは、イソフラボン類の１種であり、下記式（３）で示される化合物である。
【００３９】
【化３】
【００４０】
前記グリシチンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（４）で示される化合物（グリシテイン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記グリシチンは、アグリコンとしての前記グリシテインとグルコースとからなる配糖体である。
【００４１】
【化４】
【００４２】
前記イリゲニンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（５）で示される化合物である。
【００４３】
【化５】
【００４４】
前記イリジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（６）で示される化合物（イリゲニン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記イリジンは、アグリコンとしての前記イリゲニンとグルコースとからなる配糖体である。
【００４５】
【化６】
【００４６】
前記テクトリゲニンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（７）で示される化合物である。
【００４７】
【化７】
【００４８】
前記テクトリジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（６）で示される化合物（テクトリゲニン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記テクトリジンは、アグリコンとしての前記テクトリゲニンとグルコースとからなる配糖体である。
【００４９】
【化８】
【００５０】
前記クメステロールは、イソフラボン類の１種であり、下記式（９）で示される化合物である。
【００５１】
【化９】
【００５２】
前記ダイジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１０）で示される化合物（ダイゼイン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記ダイジンは、アグリコンとしての前記ダイゼインとグルコースとからなる配糖体である。
【００５３】
【化１０】
【００５４】
前記オサジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１１）で示される化合物である。
【００５５】
【化１１】
【００５６】
前記ポミフェリンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１２）で示される化合物である。
【００５７】
【化１２】
【００５８】
上述したビタミン類、又はイソフラボン類としては、市販されているものを用いることができる。
【００５９】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及びカカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むことが好ましい
【００６０】
前記ヒオウギ抽出物は、アヤメ科のヒオウギ（Belamcanda chinensis De Candolle (Iridaceae)）を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００６１】
前記ヒオウギの抽出部位としては、特に限定されず、例えば、花、葉、種子、根茎などが挙げられる。なかでも、抽出される部位としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、根茎が好ましい。
【００６２】
前記抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。
また、前記抽出溶媒としては、水酸化ナトリウムなどを加えることによりｐＨ１０以上の調整されたアルカリ性水溶液、又は、塩酸などを加えることによりｐＨ４以下に調整された酸性水溶液が挙げられる。
これらの抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられ得る。混合された抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整される。
【００６３】
前記ヒオウギ抽出物における抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも水を含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒がより好ましい。
具体的には、該抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールとしてのエタノールと、脂肪族多価アルコールとしての１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒が好ましい。
【００６４】
前記イリス根抽出物は、アヤメ科のイリス（Iris florentina Linne (Iridaceae)）の根茎を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００６５】
前記イリス根抽出物における抽出溶媒としては、上述したものと同様のものが挙げられ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも水を含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒がより好ましく、脂肪族多価アルコールとしての１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒がさらに好ましい。
【００６６】
前記プルーン抽出物は、バラ科のプルーン（Prunus domestica L.）の果肉を、水含有抽出溶媒で抽出し、さらに酵素処理したものを濾別することにより得られるものである。
【００６７】
前記酵素処理前の抽出における水含有抽出溶媒としては、水が好ましい。
また、前記酵素処理においては、果肉細胞を分解する酵素を採用することができ、具体的には例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、又はペクチナーゼを採用することができる。なお、前記酵素処理の後には、通常、酵素を失活させるべく加熱処理が行われる。
【００６８】
前記コメ種子抽出物は、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））の種子、即ち精白米を抽出溶媒で少なくとも抽出することにより得られるものである。
【００６９】
前記コメ種子抽出物としては、抽出溶媒によって抽出処理のみを施したコメ種子溶媒抽出物、又は、抽出溶媒によって抽出処理を施した後に蛋白質分解酵素によって加水分解処理した加水分解コメ種子抽出物などが挙げられる。
【００７０】
前記コメ種子溶媒抽出物は、上記の精白米を少なくとも水を含む抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００７１】
該抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、エタノール、グリセリン又は１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００７２】
前記加水分解コメ種子抽出物は、上記の精白米を抽出溶媒で抽出し、さらに、加水分解処理することにより得られるものである。
【００７３】
前記加水分解コメ種子抽出物の抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液が好ましい。
なお、該ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液による抽出は、通常、１５〜２５℃の室温で行われる。
【００７４】
前記加水分解コメ種子抽出物の製造における加水分解処理としては、蛋白質分解酵素による加水分解処理、酸による加水分解処理、アルカリによる加水分解処理などが採用され、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、蛋白質分解酵素による加水分解処理を採用することが好ましい。
【００７５】
前記蛋白質分解酵素による加水分解処理としては、アクチナーゼ（至適ｐＨ８．０）、ペプシン（至適ｐＨ２．０）、又はトリプシン（至適ｐＨ８．０）等による加水分解処理が好ましい。
【００７６】
前記酸による加水分解処理は、ｐＨ４以下の酸性水溶液により５０℃以上に加温して行うものである。また、前記アルカリによる加水分解処理は、ｐＨ１０以上のアルカリ性水溶液により５０℃以上に加温して行うものである。
【００７７】
前記加水分解コメヌカ抽出物は、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））のコメヌカ、即ち、イネの果皮、種皮、澱粉層、又は胚芽の少なくとも１種を抽出溶媒で抽出し、さらに加水分解処理したものである。
【００７８】
前記加水分解コメヌカ抽出物の抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液が好ましい。
なお、該ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液による抽出は、通常、１５〜２５℃の室温で行われる。
【００７９】
前記加水分解コメヌカ抽出物の製造における加水分解処理としては、上述した前記加水分解コメ種子抽出物において挙げたものを採用することができ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、蛋白質分解酵素による加水分解処理を採用することが好ましく、アクチナーゼ、ペプシン、又はトリプシンによる加水分解処理を採用することがより好ましい。
【００８０】
前記褐藻抽出物は、褐藻類（Phaeohpyta）を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００８１】
前記褐藻類としては、ウミウチワ（Padina arborescens Holmes）、コンブ（Laminaria angustata）、ヒジキ（Hizikia fusiforme）、ヒバマタ（Fucus distichus Linnaeus subsp. evanescens (C. Agardh) Powell）、ワカメ（Undaria pinnatifida）などが挙げられる。
【００８２】
前記褐藻類の抽出部位は、特に限定されないが、該抽出部位としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも胞子葉（めかぶ）を含む全藻が好ましい。
【００８３】
前記褐藻抽出物としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、上記のウミウチワ、コンブ、ヒジキ、ヒバマタ、及びワカメを混合したものを抽出したものが好ましい。
【００８４】
前記褐藻抽出物における抽出溶媒としては、上述したものと同様のものが挙げられ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、水が好ましい。
【００８５】
前記カカオ種子殻抽出物は、カカオ（Theobroma cacao）の種子殻を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００８６】
前記カカオ種子殻抽出物における抽出溶媒としては、上述したものと同様のものが挙げられ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも水を含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒がより好ましく、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、又は１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒がさらに好ましい。
【００８７】
上述した各抽出物は、通常、前記抽出溶媒による抽出液、その希釈液、その濃縮液、又はその抽出溶媒を除去した乾燥物の態様になり得る。具体的には、各抽出物は、例えば、液体状、ペースト状、ゲル状、粉末状などの態様になり得る。
【００８８】
前記抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法を採用することができる。抽出においては、抽出原料をそのまま若しくは乾燥させて用いることができる。また、通常、抽出溶媒量が抽出原料の１〜１５倍量（質量比）であり、抽出温度が１０℃〜９０℃であり、抽出時間が１時間〜５日間である。抽出した後においては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理を行うことができる。
【００８９】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤に含まれる上記各抽出物の濃度としては、特に限定されず、例えば、乾燥物換算で０．０１〜４５．０質量％が挙げられる。
なお、乾燥物換算とは、抽出物から抽出溶媒を除いた残渣である乾燥物の質量に換算することである。
【００９０】
なお、前記各抽出物としては、市販されているものを用いることができる。
【００９１】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、上述したビタミン類、イソフラボン類、及び上述した抽出物のうちの１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００９２】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、必要に応じて、適宜、溶媒、界面活性剤等を含み得る。
また、前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧料、食品などに配合されて使用され得る。
【００９３】
次に、本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法の実施形態について説明する。
【００９４】
本実施形態のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤によってＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させるものである。
【００９５】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、例えば、生体外において、又は生体において前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤によりＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させることができる。
【００９６】
具体的には、生体外でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、例えば、生体組織の細胞が所定期間培養された培地に対して、前記発現活性化剤を添加し、細胞中のＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させる方法などを実施することができる。細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子発現の程度は、例えば、Ｂｍａｌ１遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結した遺伝子を含む細胞を用いて、リアルタイムリポーターアッセイ等を採用し、ルシフェラーゼ発光量を測定することにより評価できる。
このような生体外でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、比較的簡便に実施できることから、例えば、後述する生体でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法における発現活性化剤の最適濃度を決定する目的で予備実験的に実施することができる。
【００９７】
一方、生体でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、例えば、所定の体内組織に前記発現活性化剤を含有させる処置を施し、その組織における細胞のＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化する方法などを実施することができる。より具体的には、例えば、皮膚の表皮組織に前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を塗布などにより含有させて、表皮組織の細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化する方法などを実施することができる。
【００９８】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、脊柱動物の生体において実施することができる。
前記脊柱動物としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が夜に活性化する動物であれば、必ずしも昼行性の動物でなくてもよい。前記脊柱動物としては、例えば、魚類動物、は虫類動物、鳥類動物、哺乳類動物などが挙げられる。
前記哺乳類動物としては、例えば、昼行性哺乳類動物としてのヒト、チンパンジー、ローランドゴリラ、イエネコ、ニホンザル、ウサギ、ヤギ等が挙げられる。また、例えば、夜行性哺乳類動物としてのマウス、ラット等が挙げられる。
【００９９】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、ヒトの生体において、具体的には例えば美容上の目的で、非治療的に実施することが好ましい。
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、ヒトへの医療行為を除くものであり、具体的には例えば、ヒトの皮膚に塗布して皮膚細胞のＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化し、皮膚細胞の概日リズムを調整することによって、皮膚のくすみを抑制したり、皮膚のハリを維持したりする皮膚の美容方法に適用できる。
【０１００】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、希釈などによって前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を適宜適当な濃度に調整して使用することができる。希釈するための液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、細胞培養用液体培地などを用いることができる。
【０１０１】
具体的には、前記発現活性化方法においては、例えば、上述したビタミン類の合計量の濃度が０．０００１〜１０質量％となるように希釈等して使用することができる。また、例えば、前記式（１）〜（１２）に示す化合物の濃度が１×１０-7〜１×１０-4質量％となるように希釈等して使用することができる。また、例えば、上記の抽出物の濃度が乾燥物換算で１×１０-7〜５質量％となるように希釈等して使用することができる。
【０１０２】
本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０４】
［事前準備］
まず、下記に示す油溶性のビタミン類のそれぞれを予めエタノールに溶かして３質量％濃度のエタノール溶液を調製しておいた。
ビタミンＣ：ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（Ｌ−アスコルビン酸誘導体）
ビタミンＣ：テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル
（Ｌ−アスコルビン酸誘導体）
ビタミンＤ：エルゴカルシフェロール
ビタミンＥ：酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（α−トコフェロール誘導体）
ビタミンＡ：パルミチン酸レチノール
一方、ビタミンＢ６としてのピリドキシン塩酸塩を純水に溶解させて３質量％の水溶液を調製しておいた。
【０１０５】
（実施例１）
１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ （Ｇｉｂｃｏ）培地（以下、「１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ」という）を希釈用溶媒として用い、上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液を０．１質量％濃度に希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０６】
（実施例２）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０７】
（実施例３）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のテトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０８】
（実施例４）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０９】
（実施例５）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１０】
（実施例６）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１１】
（実施例７）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１２】
（実施例８）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１３】
（実施例９）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１４】
（実施例１０）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１５】
（実施例１１）
上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１６】
（実施例１２）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１７】
（実施例１３）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１８】
（実施例１４）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１９】
（実施例１５）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２０】
（比較例１）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の比較サンプルを調製した。
【０１２１】
以下のイソフラボン類に関しては、それぞれを予めジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして２０ｍＭ濃度のＤＭＳＯ溶液を調製しておいた。
【０１２２】
（実施例１６）
試験研究用試薬として市販されているゲニステインを用いて上述のごとく調製したゲニステインのＤＭＳＯ溶液を、ゲニステインが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２３】
（実施例１７）
試験研究用試薬として市販されているゲニスチンを用いて上述のごとく調製したゲニスチンのＤＭＳＯ溶液を、ゲニスチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２４】
（実施例１８）
試験研究用試薬として市販されているグリシテインを用いて上述のごとく調製したグリシテインのＤＭＳＯ溶液を、グリシテインが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２５】
（実施例１９）
試験研究用試薬として市販されているグリシチンを用いて上述のごとく調製したグリシチンのＤＭＳＯ溶液を、グリシチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２６】
（実施例２０）
試験研究用試薬として市販されているイリゲニンを用いて上述のごとく調製したイリゲニンのＤＭＳＯ溶液を、イリゲニンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２７】
（実施例２１）
試験研究用試薬として市販されているイリジンを用いて上述のごとく調製したイリジンのＤＭＳＯ溶液を、イリジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２８】
（実施例２２）
試験研究用試薬として市販されているテクトリゲニンを用いて上述のごとく調製したテクトリゲニンのＤＭＳＯ溶液を、テクトリゲニンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２９】
（実施例２３）
試験研究用試薬として市販されているテクトリジンを用いて上述のごとく調製したテクトリジンのＤＭＳＯ溶液を、テクトリジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３０】
（実施例２４）
試験研究用試薬として市販されているクメステロールを用いて上述のごとく調製したクメステロールのＤＭＳＯ溶液を、クメステロールが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３１】
（実施例２５）
試験研究用試薬として市販されているダイジンを用いて上述のごとく調製したダイジンのＤＭＳＯ溶液を、ダイジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３２】
（実施例２６）
試験研究用試薬として市販されているオサジンを用いて上述のごとく調製したオサジンのＤＭＳＯ溶液を、オサジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３３】
（実施例２７）
試験研究用試薬として市販されているポミフェリンを用いて上述のごとく調製したポミフェリンのＤＭＳＯ溶液を、ポミフェリンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３４】
（比較例２）
試験研究用試薬として市販されているダイゼイン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したダイゼインのＤＭＳＯ溶液を、ダイゼインが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３５】
（比較例３）
試験研究用試薬として市販されているビオカニンＡ（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したビオカニンＡのＤＭＳＯ溶液を、ビオカニンＡが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３６】
（比較例４）
試験研究用試薬として市販されているフォルモネチン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したフォルモネチンのＤＭＳＯ溶液を、フォルモネチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３７】
（比較例５）
試験研究用試薬として市販されているプルネチン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したプルネチンのＤＭＳＯ溶液を、プルネチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３８】
（比較例６）
試験研究用試薬として市販されているオノニン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したオノニンのＤＭＳＯ溶液を、オノニンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３９】
（比較例７）
試験研究用試薬として市販されているプエラリン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したプエラリンのＤＭＳＯ溶液を、プエラリンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１４０】
（実施例２８）
ヒオウギ抽出物として、１，３−ブチレングリコール、エタノール、及び水（１：１：３容積比）の混合抽出溶媒により、ヒオウギ（Belamcanda chinensis De Candolle (Iridaceae)）の根茎１００ｇを室温にて５日間抽出処理した液体状のヒオウギ抽出物（乾燥物換算０．５質量％）を製造した。
【０１４１】
（実施例２９）
イリス根抽出物として、１，３−ブチレングリコール及び水の混合抽出溶媒（９０％１，３−ブチレングリコール含有）でイリス（Iris florentina Linne (Iridaceae)）の根茎を室温にて５日間抽出処理した液体状のイリス根抽出物（乾燥物換算２．８質量％）を製造した。
【０１４２】
（実施例３０）
プルーン抽出物を以下のようにして製造した。即ち、プルーン（Prunus domestica L.）の果肉１００ｇに水１００ｍＬを加え、９０℃にて３時間静置した後、圧搾してスラリー状にした。さらにセルラーゼにより酵素分解処理し、加熱により酵素を失活させ、室温に冷却後、残存した固形物をろ過により取り除き、液体状のプルーン抽出物（乾燥物換算２８．７質量％）を製造した。
【０１４３】
（実施例３１）
コメ種子抽出物としてのコメ種子溶媒抽出物を製造した。即ち、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））の種子（精白米）を、１，３−ブチレングリコール及び水の混合抽出溶媒中に室温にて浸漬し、ろ過により固形物を取り除いた液体状のコメ種子溶媒抽出物を製造した。
【０１４４】
（実施例３２）
コメ種子抽出物としての加水分解コメ種子抽出物を製造した。即ち、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））の種子１００ｇ（精白米）を室温にて、４００ｇのアルカリ水溶液（ＮａＯＨでｐＨ１２に調整したもの）中に２４時間浸漬し、アルカリ性水溶液による抽出処理を施し、液体状の抽出物を得た。
続いて、斯かる抽出物に対して、蛋白質分解酵素としてのアクチナーゼ、ペプシン、トリプシンをそれぞれ順番に５ｍｇ加えて、加水分解処理をそれぞれ４０℃で２時間施した。さらに、得られた処理液を９０℃に加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、ろ過により液体状の加水分解コメ種子抽出物（乾燥物換算１．２質量％）を製造した。
【０１４５】
（実施例３３）
加水分解コメヌカ抽出物を以下のようにして製造した。即ち、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））のコメヌカ、即ち、イネの果皮、種皮、澱粉層、及び胚芽の合計１００ｇを室温にて、４００ｇのアルカリ水溶液（ＮａＯＨでｐＨ１２に調整したもの）中に２４時間浸漬し、アルカリ性水溶液による抽出処理を施し、液体状の抽出物を得た。
続いて、斯かる抽出物に対して、蛋白質分解酵素としてのアクチナーゼ、ペプシン、トリプシンをそれぞれ順番に５ｍｇ加えて、加水分解処理をそれぞれ４０℃で２時間施した。さらに、得られた処理液を９０℃に加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、ろ過により液体状の加水分解コメヌカ抽出物（乾燥物換算４．１質量％）を製造した。
【０１４６】
（実施例３４）
褐藻抽出物を以下のようにして製造した。即ち、抽出溶媒として、水１０００ｍＬを用い、ウミウチワ（Padina arborescens Holmes）、コンブ（Laminaria angustata）、ヒジキ（Hizikia fusiforme）、ヒバマタ（Fucus distichus Linnaeus subsp. evanescens (C. Agardh) Powell）、ワカメ（Undaria pinnatifida）それぞれの全藻（胞子葉の部分を含む乾燥物合計量１００ｇ）を８０℃で５時間抽出処理し、液体状の褐藻抽出物（乾燥物換算０．６７質量％）を製造した。
【０１４７】
（実施例３５）
カカオ種子殻抽出物を以下のようにして製造した。即ち、７０容量％の１，３−ブチレングリコール水溶液（５００ｍＬ）を用い、カカオ（Theobroma cacao）の種子殻（１００ｇ）を８０℃にて２時間抽出処理し、ろ過によって液体状のカカオ種子殻抽出物（乾燥物換算２．４質量％）を製造した。
【０１４８】
＜Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能の評価＞
上記した各実施例のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤、及び、各比較例の比較サンプルついて、下記のリアルタイムリポーターアッセイにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能を評価した。
【０１４９】
リアルタイムリポーターアッセイの詳細
マウスの時計遺伝子Ｂｍａｌ１プロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結した遺伝子を安定的に発現するマウス由来繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−Ｂｍａｌ−Ｌｕｃ」という）を、３５ｍｍ培養ディシュに約２．５×１０5個 播種した。その後、上述した１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ中にて２日間培養を行った。
そして、時計遺伝子Ｂｍａｌ１を同調させるべく培地中にデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、１００ｎＭ濃度デキサメタゾン／ＤＭＥＭにおいて２時間培養した。その後、培地を、０．１ｍＭ濃度のＤ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を含む１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭに交換し、リアルタイムリポーターアッセイ用発光測定装置（製品名「Ｋｒｏｎｏｓ Ｄｉｏ ＡＢ−２５５０」 ＡＴＴＯ社製）により、各発現活性化剤を用いたものについて遺伝子の発現を測定した。
測定条件は、測定時間１分、計測間隔１０分とした。詳しくは、計測約２４時間後のルシフェラーゼ発光量が下限ピークをむかえたタイミングで、各発現活性化剤を所定濃度となるように各ディシュに添加し、その後、ルシフェラーゼ発光量の経時変化を測定し、各発現活性化剤のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能を調べた。
陰性対照（コントロール）においては、発現活性化剤を添加しない点以外は、上記と同様の操作を行った。
【０１５０】
上記測定においては、各実施例及び各比較例において製造した活性化剤を上述した１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭにより希釈して使用した。また、上記測定における各発現活性化剤の濃度は、細胞毒性が認められない範囲に設定した。詳しくは、下記の通りに濃度を設定した。
ビタミン類：各０．００５質量％（単独の場合は、０．０１０質量％濃度あり）
イソフラボン類：２５μＭ、又は、２．５μＭ
各抽出物：それぞれ、表３に記載した濃度に設定
なお、実施例２（０．０１０％濃度）においては、細胞毒性が認められたため、上記の評価を実施できなかった。同様に、実施例２６及び２７における２５μM濃度においても上記の評価を実施できなかった。
【０１５１】
実施例１〜１５及び比較例１の評価結果をグラフに表したものを図１〜図７に示す。なお、図１〜図７における縦軸の値は、陰性対照（コントロール）におけるルシフェラーゼ発光量の最大値を１としたときのルシフェラーゼ発光量の相対値を示している。
同様に、実施例１６〜２７、及び比較例２〜７の評価結果をグラフに表したものを図８〜図１６に示す。
また、同様に、実施例２８〜３５の評価結果をグラフに表したものを図１７及び図１８に示す。
【０１５２】
さらに、陰性対照（コントロール）のルシフェラーゼ発光量の最大値を１としたとき、各実施例及び比較例におけるルシフェラーゼ発光量の最大値を相対値で表した一覧表を表１〜表３に示す。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
【表２】
【０１５５】
【表３】
【０１５６】
表１〜表３から、各実施例のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤がＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化できることが把握される。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、概日リズムを調整するために、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化する用途において好適に使用できる。具体的には、例えば、皮膚表皮細胞などの外胚葉性の細胞、肝臓細胞などの内胚葉性の細胞、心臓細胞などの中胚葉性の細胞における概日リズムを調整するために好適に使用できる。より具体的には、例えば、皮膚外用剤に配合されて皮膚細胞の概日リズムを調整するために使用される。
なお、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が活性化すると、時計遺伝子としてのＰｅｒｉｏｄ遺伝子やＣｒｙ遺伝子の発現が活性化され得ることから、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することにより、時計遺伝子の発現リズムを調整でき、また、概日リズムを調整できると考えられる。
概日リズムを調製することにより、加齢、時差ぼけ、若しくは交代勤務などによる概日リズムの乱れ、又は、睡眠相後退症候群や非２４時間睡眠覚醒症候群といった睡眠障害を改善できることが期待できる。また、皮膚細胞の概日リズムを調整することにより、具体的には例えば、皮膚のハリを維持する、皮膚のくすみを抑制する、表皮におけるターンオーバーを正常化する、皮膚のシワを抑制する、又は、ニキビや目の下のくまを抑制すること等が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の細胞に存在する「時計遺伝子」は、「概日リズム」と称される約２４時間の周期性を生体において維持する機能を有していることが知られている。即ち、時計遺伝子は、地球の自転に伴って起こる明暗などの約２４時間周期の環境サイクルに生体が適応できるように概日リズムを制御している。時計遺伝子としては、複数の種類が知られており、例えば、昼に発現が活性化されるＰｅｒｉｏｄ、Ｃｒｙや、夜に発現が活性化されるＢｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋなどが知られている。
【０００３】
また、時計遺伝子は、概日リズムを刻む生体現象を制御しており、該生体現象としては、睡眠及び覚醒、血圧及び体温の上下、副腎皮質ホルモン、メラトニン、若しくは成長ホルモン等の分泌量の変動等が知られている。
さらに、時計遺伝子は、全身の細胞の概日リズムを統括すべく中枢組織としての視床下部の視交叉上核（suprachiasmatic nucleus : SCN）を制御するだけでなく、末梢組織の各細胞が概日リズムを刻むように末梢組織細胞をも直接的に制御する。
【０００４】
近年、時計遺伝子が概日リズムを制御する機構が知られるようになり、該機構としては、例えば、上述したＢｍａｌ１及びＣｌｏｃｋの遺伝子産物の２量体（ＢＭＡＬ／ＣＬＯＣＫ複合体）が、Ｅ−ｂｏｘ配列に結合してＰｅｒｉｏｄ及びＣｒｙの転写を活性化し、該活性化によって増加したＰＥＲＩＯＤ及びＣＲＹが複合体を形成して核内に移行し、ＢＭＡＬ／ＣＬＯＣＫ複合体を抑制するため、Ｐｅｒｉｏｄ及びＣｒｙの転写が減少するというフィードバック機構が知られている。そして、該フィードバック機構により、約２４時間周期の概日リズムが生み出されることが知られている。従って、各時計遺伝子の発現を活性化又は抑制することにより、概日リズムを制御できると考えられている。
【０００５】
従来、時計遺伝子の発現を活性化し得る時計遺伝子の発現活性化剤としては、具体的には、例えば、特定のアルキレンジオキシベンゼン誘導体を含むものが知られている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、斯かる時計遺伝子の発現活性化剤は、光照射によって高められたＰｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現を維持するものであり、直接的にＰｅｒｉｏｄ１遺伝子の発現を活性化できるものではない。
また、斯かる時計遺伝子の発現活性化剤は、Ｐｅｒｉｏｄ１遺伝子に作用するものであり、概日リズムに関わる時計遺伝子のフィードバック機構において最も中心的な役割を担うとされるＢｍａｌ１遺伝子の発現を直接的に活性化するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３３５６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、概日リズムを調整するために重要な役割を有するＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化できるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤が要望されている。
【０００９】
本発明は、上記要望点等に鑑み、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することができるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を提供することを課題とする。また、本発明は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することができるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むことを特徴としている。
【００１１】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも２種を含むことが好ましい。
【００１２】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤によってＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性させることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１及び２のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図２】実施例３及び４のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図３】実施例５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図４】実施例６〜８のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図５】実施例９〜１１のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図６】実施例１２〜１５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図７】比較例１のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図８】実施例１６のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図９】実施例１７及び１８のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１０】実施例１９及び２０のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１１】実施例２１及び２２のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１２】実施例２３及び２４のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１３】実施例２５〜２７のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１４】比較例２及び３のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１５】比較例４及び５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１６】比較例６及び７のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１７】実施例２８〜３１のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【図１８】実施例３２〜３５のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤におけるルシフェラーゼ発光量の相対値を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤の実施形態について以下に説明する。
【００１６】
本実施形態のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むものである。
【００１７】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも２種を含むことが好ましい。
【００１８】
前記ビタミンＢ６は、ピリドキシン、ピリドキサール、若しくはピリドキサミン、又は、これらの塩若しくはリン酸エステルである。
前記塩としては、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩などが挙げられる。
前記ビタミンＢ６としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ピリドキシン又はその塩が好ましく、ピリドキシン塩酸塩がより好ましい。
【００１９】
前記ビタミンＣは、Ｌ−アスコルビン酸又はその誘導体である。Ｌ−アスコルビン酸誘導体は、分子内にＬ−アスコルビン酸構造を有し、生体内においてＬ−アスコルビン酸を生成するものである。
【００２０】
前記Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、水溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体、又は油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体などが挙げられる。
【００２１】
前記水溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、リン酸Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムやリン酸Ｌ−アスコルビン酸マグネシウムなどのリン酸Ｌ−アスコルビン酸塩、アスコルビン酸グルコシドなどが挙げられる。
前記油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体としては、テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル、ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル、ステアリン酸Ｌ−アスコルビル、Ｌ−アスコルビン酸−２リン酸−６パルミチン酸などが挙げられる。
【００２２】
前記ビタミンＣとしては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、Ｌ−アスコルビン酸誘導体が好ましく、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体がより好ましく、テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル、又はジパルミチン酸Ｌ−アスコルビルがさらに好ましい。
【００２３】
前記ビタミンＤは、エルゴカルシフェロール、又は、コレカルシフェロールである。
【００２４】
前記ビタミンＤとしては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、エルゴカルシフェロールが好ましい。
【００２５】
前記ビタミンＥは、α−トコフェロール又はその誘導体である。α−トコフェロール誘導体は、分子内にα−トコフェロール構造を有し、生体内においてα−トコフェロールを生成するものである。なお、前記ビタミンＥにおけるα−トコフェロールは、ｄ体であってもｌ体であってもよい。
【００２６】
前記α−トコフェロール誘導体としては、例えば、α−トコフェロール酢酸エステルなどのα−トコフェロールエステル誘導体が挙げられる。
【００２７】
前記ビタミンＥとしては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、α−トコフェロール誘導体が好ましく、α−トコフェロールエステル誘導体がより好ましく、α−トコフェロール酢酸エステルがさらに好ましい。
【００２８】
前記発現活性化剤としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくともビタミンＣを含むものが好ましい。同様の理由により、上述したビタミンのうち少なくとも２種を含むものが好ましい。また、少なくともビタミンＣを含み且つ上述したビタミンのうち少なくとも２種を含むものがさらに好ましい。
【００２９】
前記少なくとも２種のビタミンを含むＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤としては、具体的には例えば、ビタミンＢ６とビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものが挙げられる。
また、例えば、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むもの、又は、ビタミンＢ６とビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものなどが挙げられる。
【００３０】
前記発現活性化剤としては、ビタミンＢ６とビタミンＣとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＢ６とビタミンＣとビタミンＥとの混合物を含むもの、ビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものがより好ましく、ビタミンＣとビタミンＤとの混合物を含むもの、又はビタミンＣとビタミンＤとビタミンＥとの混合物を含むものがさらに好ましい。
【００３１】
前記発現活性化剤としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をさらに活性化できるという点で、ピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）との混合物を含むもの、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）との混合物を含むもの、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むもの、ピリドキシン又はその塩（ビタミンＢ６）と油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むもの、又は、油溶性Ｌ−アスコルビン酸誘導体（ビタミンＣ）とエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）とα−トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）との混合物を含むものがより好ましい。
【００３２】
前記発現活性化剤においては、複数種のビタミンが含まれる場合、各ビタミンの含有量の比が、特に限定されず適宜設定されている。
【００３３】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、及びポミフェリンからなる群より選ばれた少なくとも１種を含むことが好ましい。
【００３４】
前記ゲニステインは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１）で示される化合物である。
【００３５】
【化１】
【００３６】
前記ゲニスチンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（２）で示される化合物（ゲニステイン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記ゲニスチンは、アグリコンとしての前記ゲニステインとグルコースとからなる配糖体である。
【００３７】
【化２】
【００３８】
前記グリシテインは、イソフラボン類の１種であり、下記式（３）で示される化合物である。
【００３９】
【化３】
【００４０】
前記グリシチンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（４）で示される化合物（グリシテイン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記グリシチンは、アグリコンとしての前記グリシテインとグルコースとからなる配糖体である。
【００４１】
【化４】
【００４２】
前記イリゲニンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（５）で示される化合物である。
【００４３】
【化５】
【００４４】
前記イリジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（６）で示される化合物（イリゲニン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記イリジンは、アグリコンとしての前記イリゲニンとグルコースとからなる配糖体である。
【００４５】
【化６】
【００４６】
前記テクトリゲニンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（７）で示される化合物である。
【００４７】
【化７】
【００４８】
前記テクトリジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（６）で示される化合物（テクトリゲニン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記テクトリジンは、アグリコンとしての前記テクトリゲニンとグルコースとからなる配糖体である。
【００４９】
【化８】
【００５０】
前記クメステロールは、イソフラボン類の１種であり、下記式（９）で示される化合物である。
【００５１】
【化９】
【００５２】
前記ダイジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１０）で示される化合物（ダイゼイン−７−Ｏ−グルコシド）である。なお、前記ダイジンは、アグリコンとしての前記ダイゼインとグルコースとからなる配糖体である。
【００５３】
【化１０】
【００５４】
前記オサジンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１１）で示される化合物である。
【００５５】
【化１１】
【００５６】
前記ポミフェリンは、イソフラボン類の１種であり、下記式（１２）で示される化合物である。
【００５７】
【化１２】
【００５８】
上述したビタミン類、又はイソフラボン類としては、市販されているものを用いることができる。
【００５９】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及びカカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むことが好ましい
【００６０】
前記ヒオウギ抽出物は、アヤメ科のヒオウギ（Belamcanda chinensis De Candolle (Iridaceae)）を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００６１】
前記ヒオウギの抽出部位としては、特に限定されず、例えば、花、葉、種子、根茎などが挙げられる。なかでも、抽出される部位としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、根茎が好ましい。
【００６２】
前記抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。
また、前記抽出溶媒としては、水酸化ナトリウムなどを加えることによりｐＨ１０以上の調整されたアルカリ性水溶液、又は、塩酸などを加えることによりｐＨ４以下に調整された酸性水溶液が挙げられる。
これらの抽出溶媒は、１種が単独で、又は２種以上が混合されて用いられ得る。混合された抽出溶媒の混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整される。
【００６３】
前記ヒオウギ抽出物における抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも水を含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒がより好ましい。
具体的には、該抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールとしてのエタノールと、脂肪族多価アルコールとしての１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒が好ましい。
【００６４】
前記イリス根抽出物は、アヤメ科のイリス（Iris florentina Linne (Iridaceae)）の根茎を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００６５】
前記イリス根抽出物における抽出溶媒としては、上述したものと同様のものが挙げられ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも水を含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒がより好ましく、脂肪族多価アルコールとしての１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒がさらに好ましい。
【００６６】
前記プルーン抽出物は、バラ科のプルーン（Prunus domestica L.）の果肉を、水含有抽出溶媒で抽出し、さらに酵素処理したものを濾別することにより得られるものである。
【００６７】
前記酵素処理前の抽出における水含有抽出溶媒としては、水が好ましい。
また、前記酵素処理においては、果肉細胞を分解する酵素を採用することができ、具体的には例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、又はペクチナーゼを採用することができる。なお、前記酵素処理の後には、通常、酵素を失活させるべく加熱処理が行われる。
【００６８】
前記コメ種子抽出物は、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））の種子、即ち精白米を抽出溶媒で少なくとも抽出することにより得られるものである。
【００６９】
前記コメ種子抽出物としては、抽出溶媒によって抽出処理のみを施したコメ種子溶媒抽出物、又は、抽出溶媒によって抽出処理を施した後に蛋白質分解酵素によって加水分解処理した加水分解コメ種子抽出物などが挙げられる。
【００７０】
前記コメ種子溶媒抽出物は、上記の精白米を少なくとも水を含む抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００７１】
該抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、エタノール、グリセリン又は１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒がより好ましい。
【００７２】
前記加水分解コメ種子抽出物は、上記の精白米を抽出溶媒で抽出し、さらに、加水分解処理することにより得られるものである。
【００７３】
前記加水分解コメ種子抽出物の抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液が好ましい。
なお、該ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液による抽出は、通常、１５〜２５℃の室温で行われる。
【００７４】
前記加水分解コメ種子抽出物の製造における加水分解処理としては、蛋白質分解酵素による加水分解処理、酸による加水分解処理、アルカリによる加水分解処理などが採用され、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、蛋白質分解酵素による加水分解処理を採用することが好ましい。
【００７５】
前記蛋白質分解酵素による加水分解処理としては、アクチナーゼ（至適ｐＨ８．０）、ペプシン（至適ｐＨ２．０）、又はトリプシン（至適ｐＨ８．０）等による加水分解処理が好ましい。
【００７６】
前記酸による加水分解処理は、ｐＨ４以下の酸性水溶液により５０℃以上に加温して行うものである。また、前記アルカリによる加水分解処理は、ｐＨ１０以上のアルカリ性水溶液により５０℃以上に加温して行うものである。
【００７７】
前記加水分解コメヌカ抽出物は、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））のコメヌカ、即ち、イネの果皮、種皮、澱粉層、又は胚芽の少なくとも１種を抽出溶媒で抽出し、さらに加水分解処理したものである。
【００７８】
前記加水分解コメヌカ抽出物の抽出溶媒としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液が好ましい。
なお、該ｐＨ１０以上に調整されたアルカリ性水溶液による抽出は、通常、１５〜２５℃の室温で行われる。
【００７９】
前記加水分解コメヌカ抽出物の製造における加水分解処理としては、上述した前記加水分解コメ種子抽出物において挙げたものを採用することができ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、蛋白質分解酵素による加水分解処理を採用することが好ましく、アクチナーゼ、ペプシン、又はトリプシンによる加水分解処理を採用することがより好ましい。
【００８０】
前記褐藻抽出物は、褐藻類（Phaeohpyta）を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００８１】
前記褐藻類としては、ウミウチワ（Padina arborescens Holmes）、コンブ（Laminaria angustata）、ヒジキ（Hizikia fusiforme）、ヒバマタ（Fucus distichus Linnaeus subsp. evanescens (C. Agardh) Powell）、ワカメ（Undaria pinnatifida）などが挙げられる。
【００８２】
前記褐藻類の抽出部位は、特に限定されないが、該抽出部位としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも胞子葉（めかぶ）を含む全藻が好ましい。
【００８３】
前記褐藻抽出物としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、上記のウミウチワ、コンブ、ヒジキ、ヒバマタ、及びワカメを混合したものを抽出したものが好ましい。
【００８４】
前記褐藻抽出物における抽出溶媒としては、上述したものと同様のものが挙げられ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、水が好ましい。
【００８５】
前記カカオ種子殻抽出物は、カカオ（Theobroma cacao）の種子殻を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。
【００８６】
前記カカオ種子殻抽出物における抽出溶媒としては、上述したものと同様のものが挙げられ、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現をより活性化できるという点で、少なくとも水を含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコール又は脂肪族多価アルコールなどの脂肪族アルコールと水とを含む抽出溶媒がより好ましく、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、又は１，３−ブチレングリコールと、水とを含む抽出溶媒がさらに好ましい。
【００８７】
上述した各抽出物は、通常、前記抽出溶媒による抽出液、その希釈液、その濃縮液、又はその抽出溶媒を除去した乾燥物の態様になり得る。具体的には、各抽出物は、例えば、液体状、ペースト状、ゲル状、粉末状などの態様になり得る。
【００８８】
前記抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法を採用することができる。抽出においては、抽出原料をそのまま若しくは乾燥させて用いることができる。また、通常、抽出溶媒量が抽出原料の１〜１５倍量（質量比）であり、抽出温度が１０℃〜９０℃であり、抽出時間が１時間〜５日間である。抽出した後においては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理を行うことができる。
【００８９】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤に含まれる上記各抽出物の濃度としては、特に限定されず、例えば、乾燥物換算で０．０１〜４５．０質量％が挙げられる。
なお、乾燥物換算とは、抽出物から抽出溶媒を除いた残渣である乾燥物の質量に換算することである。
【００９０】
なお、前記各抽出物としては、市販されているものを用いることができる。
【００９１】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、上述したビタミン類、イソフラボン類、及び上述した抽出物のうちの１種を単独で、又は２種以上を混合して用いることができる。
【００９２】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、必要に応じて、適宜、溶媒、界面活性剤等を含み得る。
また、前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧料、食品などに配合されて使用され得る。
【００９３】
次に、本発明に係るＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法の実施形態について説明する。
【００９４】
本実施形態のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤によってＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させるものである。
【００９５】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、例えば、生体外において、又は生体において前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤によりＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させることができる。
【００９６】
具体的には、生体外でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、例えば、生体組織の細胞が所定期間培養された培地に対して、前記発現活性化剤を添加し、細胞中のＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化させる方法などを実施することができる。細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子発現の程度は、例えば、Ｂｍａｌ１遺伝子の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結した遺伝子を含む細胞を用いて、リアルタイムリポーターアッセイ等を採用し、ルシフェラーゼ発光量を測定することにより評価できる。
このような生体外でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、比較的簡便に実施できることから、例えば、後述する生体でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法における発現活性化剤の最適濃度を決定する目的で予備実験的に実施することができる。
【００９７】
一方、生体でのＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、例えば、所定の体内組織に前記発現活性化剤を含有させる処置を施し、その組織における細胞のＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化する方法などを実施することができる。より具体的には、例えば、皮膚の表皮組織に前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を塗布などにより含有させて、表皮組織の細胞におけるＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化する方法などを実施することができる。
【００９８】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、脊柱動物の生体において実施することができる。
前記脊柱動物としては、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が夜に活性化する動物であれば、必ずしも昼行性の動物でなくてもよい。前記脊柱動物としては、例えば、魚類動物、は虫類動物、鳥類動物、哺乳類動物などが挙げられる。
前記哺乳類動物としては、例えば、昼行性哺乳類動物としてのヒト、チンパンジー、ローランドゴリラ、イエネコ、ニホンザル、ウサギ、ヤギ等が挙げられる。また、例えば、夜行性哺乳類動物としてのマウス、ラット等が挙げられる。
【００９９】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、ヒトの生体において、具体的には例えば美容上の目的で、非治療的に実施することが好ましい。
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、ヒトへの医療行為を除くものであり、具体的には例えば、ヒトの皮膚に塗布して皮膚細胞のＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化し、皮膚細胞の概日リズムを調整することによって、皮膚のくすみを抑制したり、皮膚のハリを維持したりする皮膚の美容方法に適用できる。
【０１００】
前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法においては、希釈などによって前記Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を適宜適当な濃度に調整して使用することができる。希釈するための液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、細胞培養用液体培地などを用いることができる。
【０１０１】
具体的には、前記発現活性化方法においては、例えば、上述したビタミン類の合計量の濃度が０．０００１〜１０質量％となるように希釈等して使用することができる。また、例えば、前記式（１）〜（１２）に示す化合物の濃度が１×１０-7〜１×１０-4質量％となるように希釈等して使用することができる。また、例えば、上記の抽出物の濃度が乾燥物換算で１×１０-7〜５質量％となるように希釈等して使用することができる。
【０１０２】
本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤及びＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０４】
［事前準備］
まず、下記に示す油溶性のビタミン類のそれぞれを予めエタノールに溶かして３質量％濃度のエタノール溶液を調製しておいた。
ビタミンＣ：ジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（Ｌ−アスコルビン酸誘導体）
ビタミンＣ：テトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル
（Ｌ−アスコルビン酸誘導体）
ビタミンＤ：エルゴカルシフェロール
ビタミンＥ：酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（α−トコフェロール誘導体）
ビタミンＡ：パルミチン酸レチノール
一方、ビタミンＢ６としてのピリドキシン塩酸塩を純水に溶解させて３質量％の水溶液を調製しておいた。
【０１０５】
（実施例１）
１０％牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ （Ｇｉｂｃｏ）培地（以下、「１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ」という）を希釈用溶媒として用い、上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液を０．１質量％濃度に希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０６】
（実施例２）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０７】
（実施例３）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のテトラ２−ヘキシルデカン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０８】
（実施例４）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１０９】
（実施例５）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１０】
（実施例６）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１１】
（実施例７）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１２】
（実施例８）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１３】
（実施例９）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１４】
（実施例１０）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１５】
（実施例１１）
上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１６】
（実施例１２）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１７】
（実施例１３）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１８】
（実施例１４）
上記のピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１１９】
（実施例１５）
上記のジパルミチン酸Ｌ−アスコルビル（ビタミンＣ）のエタノール溶液と、上記のエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）のエタノール溶液と、上記の酢酸ｄｌ−α−トコフェロール（ビタミンＥ）のエタノール溶液とを１：１：１の質量比で混合し、それぞれが０．１質量％濃度となるように実施例１と同様に希釈することにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２０】
（比較例１）
ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）の水溶液に代えて、上記のパルミチン酸レチノール（ビタミンＡ）のエタノール溶液を用いた点以外は、実施例１と同様にして、０．１質量％濃度の比較サンプルを調製した。
【０１２１】
以下のイソフラボン類に関しては、それぞれを予めジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かして２０ｍＭ濃度のＤＭＳＯ溶液を調製しておいた。
【０１２２】
（実施例１６）
試験研究用試薬として市販されているゲニステインを用いて上述のごとく調製したゲニステインのＤＭＳＯ溶液を、ゲニステインが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２３】
（実施例１７）
試験研究用試薬として市販されているゲニスチンを用いて上述のごとく調製したゲニスチンのＤＭＳＯ溶液を、ゲニスチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２４】
（実施例１８）
試験研究用試薬として市販されているグリシテインを用いて上述のごとく調製したグリシテインのＤＭＳＯ溶液を、グリシテインが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２５】
（実施例１９）
試験研究用試薬として市販されているグリシチンを用いて上述のごとく調製したグリシチンのＤＭＳＯ溶液を、グリシチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２６】
（実施例２０）
試験研究用試薬として市販されているイリゲニンを用いて上述のごとく調製したイリゲニンのＤＭＳＯ溶液を、イリゲニンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２７】
（実施例２１）
試験研究用試薬として市販されているイリジンを用いて上述のごとく調製したイリジンのＤＭＳＯ溶液を、イリジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２８】
（実施例２２）
試験研究用試薬として市販されているテクトリゲニンを用いて上述のごとく調製したテクトリゲニンのＤＭＳＯ溶液を、テクトリゲニンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１２９】
（実施例２３）
試験研究用試薬として市販されているテクトリジンを用いて上述のごとく調製したテクトリジンのＤＭＳＯ溶液を、テクトリジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３０】
（実施例２４）
試験研究用試薬として市販されているクメステロールを用いて上述のごとく調製したクメステロールのＤＭＳＯ溶液を、クメステロールが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３１】
（実施例２５）
試験研究用試薬として市販されているダイジンを用いて上述のごとく調製したダイジンのＤＭＳＯ溶液を、ダイジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３２】
（実施例２６）
試験研究用試薬として市販されているオサジンを用いて上述のごとく調製したオサジンのＤＭＳＯ溶液を、オサジンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３３】
（実施例２７）
試験研究用試薬として市販されているポミフェリンを用いて上述のごとく調製したポミフェリンのＤＭＳＯ溶液を、ポミフェリンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤を製造した。
【０１３４】
（比較例２）
試験研究用試薬として市販されているダイゼイン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したダイゼインのＤＭＳＯ溶液を、ダイゼインが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３５】
（比較例３）
試験研究用試薬として市販されているビオカニンＡ（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したビオカニンＡのＤＭＳＯ溶液を、ビオカニンＡが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３６】
（比較例４）
試験研究用試薬として市販されているフォルモネチン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したフォルモネチンのＤＭＳＯ溶液を、フォルモネチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３７】
（比較例５）
試験研究用試薬として市販されているプルネチン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したプルネチンのＤＭＳＯ溶液を、プルネチンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３８】
（比較例６）
試験研究用試薬として市販されているオノニン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したオノニンのＤＭＳＯ溶液を、オノニンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１３９】
（比較例７）
試験研究用試薬として市販されているプエラリン（イソフラボン類の１種）を用いて上述のごとく調製したプエラリンのＤＭＳＯ溶液を、プエラリンが０．０５ｍＭ濃度となるように上記の１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭで希釈し、比較サンプルを調製した。
【０１４０】
（実施例２８）
ヒオウギ抽出物として、１，３−ブチレングリコール、エタノール、及び水（１：１：３容積比）の混合抽出溶媒により、ヒオウギ（Belamcanda chinensis De Candolle (Iridaceae)）の根茎１００ｇを室温にて５日間抽出処理した液体状のヒオウギ抽出物（乾燥物換算０．５質量％）を製造した。
【０１４１】
（実施例２９）
イリス根抽出物として、１，３−ブチレングリコール及び水の混合抽出溶媒（９０％１，３−ブチレングリコール含有）でイリス（Iris florentina Linne (Iridaceae)）の根茎を室温にて５日間抽出処理した液体状のイリス根抽出物（乾燥物換算２．８質量％）を製造した。
【０１４２】
（実施例３０）
プルーン抽出物を以下のようにして製造した。即ち、プルーン（Prunus domestica L.）の果肉１００ｇに水１００ｍＬを加え、９０℃にて３時間静置した後、圧搾してスラリー状にした。さらにセルラーゼにより酵素分解処理し、加熱により酵素を失活させ、室温に冷却後、残存した固形物をろ過により取り除き、液体状のプルーン抽出物（乾燥物換算２８．７質量％）を製造した。
【０１４３】
（実施例３１）
コメ種子抽出物としてのコメ種子溶媒抽出物を製造した。即ち、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））の種子（精白米）を、１，３−ブチレングリコール及び水の混合抽出溶媒中に室温にて浸漬し、ろ過により固形物を取り除いた液体状のコメ種子溶媒抽出物を製造した。
【０１４４】
（実施例３２）
コメ種子抽出物としての加水分解コメ種子抽出物を製造した。即ち、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））の種子１００ｇ（精白米）を室温にて、４００ｇのアルカリ水溶液（ＮａＯＨでｐＨ１２に調整したもの）中に２４時間浸漬し、アルカリ性水溶液による抽出処理を施し、液体状の抽出物を得た。
続いて、斯かる抽出物に対して、蛋白質分解酵素としてのアクチナーゼ、ペプシン、トリプシンをそれぞれ順番に５ｍｇ加えて、加水分解処理をそれぞれ４０℃で２時間施した。さらに、得られた処理液を９０℃に加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、ろ過により液体状の加水分解コメ種子抽出物（乾燥物換算１．２質量％）を製造した。
【０１４５】
（実施例３３）
加水分解コメヌカ抽出物を以下のようにして製造した。即ち、イネ（Oryza sativa Linne.（Gramineae））のコメヌカ、即ち、イネの果皮、種皮、澱粉層、及び胚芽の合計１００ｇを室温にて、４００ｇのアルカリ水溶液（ＮａＯＨでｐＨ１２に調整したもの）中に２４時間浸漬し、アルカリ性水溶液による抽出処理を施し、液体状の抽出物を得た。
続いて、斯かる抽出物に対して、蛋白質分解酵素としてのアクチナーゼ、ペプシン、トリプシンをそれぞれ順番に５ｍｇ加えて、加水分解処理をそれぞれ４０℃で２時間施した。さらに、得られた処理液を９０℃に加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、ろ過により液体状の加水分解コメヌカ抽出物（乾燥物換算４．１質量％）を製造した。
【０１４６】
（実施例３４）
褐藻抽出物を以下のようにして製造した。即ち、抽出溶媒として、水１０００ｍＬを用い、ウミウチワ（Padina arborescens Holmes）、コンブ（Laminaria angustata）、ヒジキ（Hizikia fusiforme）、ヒバマタ（Fucus distichus Linnaeus subsp. evanescens (C. Agardh) Powell）、ワカメ（Undaria pinnatifida）それぞれの全藻（胞子葉の部分を含む乾燥物合計量１００ｇ）を８０℃で５時間抽出処理し、液体状の褐藻抽出物（乾燥物換算０．６７質量％）を製造した。
【０１４７】
（実施例３５）
カカオ種子殻抽出物を以下のようにして製造した。即ち、７０容量％の１，３−ブチレングリコール水溶液（５００ｍＬ）を用い、カカオ（Theobroma cacao）の種子殻（１００ｇ）を８０℃にて２時間抽出処理し、ろ過によって液体状のカカオ種子殻抽出物（乾燥物換算２．４質量％）を製造した。
【０１４８】
＜Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能の評価＞
上記した各実施例のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤、及び、各比較例の比較サンプルついて、下記のリアルタイムリポーターアッセイにより、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能を評価した。
【０１４９】
リアルタイムリポーターアッセイの詳細
マウスの時計遺伝子Ｂｍａｌ１プロモーター領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結した遺伝子を安定的に発現するマウス由来繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−Ｂｍａｌ−Ｌｕｃ」という）を、３５ｍｍ培養ディシュに約２．５×１０5個 播種した。その後、上述した１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ中にて２日間培養を行った。
そして、時計遺伝子Ｂｍａｌ１を同調させるべく培地中にデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、１００ｎＭ濃度デキサメタゾン／ＤＭＥＭにおいて２時間培養した。その後、培地を、０．１ｍＭ濃度のＤ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を含む１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭに交換し、リアルタイムリポーターアッセイ用発光測定装置（製品名「Ｋｒｏｎｏｓ Ｄｉｏ ＡＢ−２５５０」 ＡＴＴＯ社製）により、各発現活性化剤を用いたものについて遺伝子の発現を測定した。
測定条件は、測定時間１分、計測間隔１０分とした。詳しくは、計測約２４時間後のルシフェラーゼ発光量が下限ピークをむかえたタイミングで、各発現活性化剤を所定濃度となるように各ディシュに添加し、その後、ルシフェラーゼ発光量の経時変化を測定し、各発現活性化剤のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化性能を調べた。
陰性対照（コントロール）においては、発現活性化剤を添加しない点以外は、上記と同様の操作を行った。
【０１５０】
上記測定においては、各実施例及び各比較例において製造した活性化剤を上述した１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭにより希釈して使用した。また、上記測定における各発現活性化剤の濃度は、細胞毒性が認められない範囲に設定した。詳しくは、下記の通りに濃度を設定した。
ビタミン類：各０．００５質量％（単独の場合は、０．０１０質量％濃度あり）
イソフラボン類：２５μＭ、又は、２．５μＭ
各抽出物：それぞれ、表３に記載した濃度に設定
なお、実施例２（０．０１０％濃度）においては、細胞毒性が認められたため、上記の評価を実施できなかった。同様に、実施例２６及び２７における２５μM濃度においても上記の評価を実施できなかった。
【０１５１】
実施例１〜１５及び比較例１の評価結果をグラフに表したものを図１〜図７に示す。なお、図１〜図７における縦軸の値は、陰性対照（コントロール）におけるルシフェラーゼ発光量の最大値を１としたときのルシフェラーゼ発光量の相対値を示している。
同様に、実施例１６〜２７、及び比較例２〜７の評価結果をグラフに表したものを図８〜図１６に示す。
また、同様に、実施例２８〜３５の評価結果をグラフに表したものを図１７及び図１８に示す。
【０１５２】
さらに、陰性対照（コントロール）のルシフェラーゼ発光量の最大値を１としたとき、各実施例及び比較例におけるルシフェラーゼ発光量の最大値を相対値で表した一覧表を表１〜表３に示す。
【０１５３】
【表１】
【０１５４】
【表２】
【０１５５】
【表３】
【０１５６】
表１〜表３から、各実施例のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤がＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性化できることが把握される。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
本発明のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤は、概日リズムを調整するために、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化する用途において好適に使用できる。具体的には、例えば、皮膚表皮細胞などの外胚葉性の細胞、肝臓細胞などの内胚葉性の細胞、心臓細胞などの中胚葉性の細胞における概日リズムを調整するために好適に使用できる。より具体的には、例えば、皮膚外用剤に配合されて皮膚細胞の概日リズムを調整するために使用される。
なお、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現が活性化すると、時計遺伝子としてのＰｅｒｉｏｄ遺伝子やＣｒｙ遺伝子の発現が活性化され得ることから、Ｂｍａｌ１遺伝子の発現を活性化することにより、時計遺伝子の発現リズムを調整でき、また、概日リズムを調整できると考えられる。
概日リズムを調製することにより、加齢、時差ぼけ、若しくは交代勤務などによる概日リズムの乱れ、又は、睡眠相後退症候群や非２４時間睡眠覚醒症候群といった睡眠障害を改善できることが期待できる。また、皮膚細胞の概日リズムを調整することにより、具体的には例えば、皮膚のハリを維持する、皮膚のくすみを抑制する、表皮におけるターンオーバーを正常化する、皮膚のシワを抑制する、又は、ニキビや目の下のくまを抑制すること等が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤。
【請求項２】
ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも２種を含む請求項１記載のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の発現活性化剤によってＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性させるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法。
【請求項１】
ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ゲニステイン、ゲニスチン、グリシテイン、グリシチン、イリゲニン、イリジン、テクトリゲニン、テクトリジン、クメステロール、ダイジン、オサジン、ポミフェリン、ヒオウギ抽出物、イリス根抽出物、プルーン抽出物、コメ種子抽出物、加水分解コメヌカ抽出物、褐藻抽出物、及び、カカオ種子殻抽出物からなる群より選ばれた少なくとも１種を含むＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤。
【請求項２】
ビタミンＣ、ビタミンＢ６、ビタミンＤ、及びビタミンＥからなる群より選ばれた少なくとも２種を含む請求項１記載のＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の発現活性化剤によってＢｍａｌ１遺伝子の発現を活性させるＢｍａｌ１遺伝子の発現活性化方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公開番号】特開２０１３−５６８６６（Ｐ２０１３−５６８６６Ａ）
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１９７３６８（Ｐ２０１１−１９７３６８）
【出願日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（０００１１２２６６）ピアス株式会社 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月２８日（２０１３．３．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月９日（２０１１．９．９）
【出願人】（０００１１２２６６）ピアス株式会社 (49)
【Ｆターム（参考）】
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