Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法およびそれに用いられる予測キット
【課題】Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法を提供すること。
【解決手段】Ｃ型肝炎の患者の血清中のＣ３ｆ分解産物の量を指標として、その患者に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果を予測する。患者の血清中のＣ３ｆ分解産物の量を測定し、Ｃ３ｆ分解産物が所定の値より多いとき、その患者にはペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定する。
【解決手段】Ｃ型肝炎の患者の血清中のＣ３ｆ分解産物の量を指標として、その患者に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果を予測する。患者の血清中のＣ３ｆ分解産物の量を測定し、Ｃ３ｆ分解産物が所定の値より多いとき、その患者にはペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法およびそれに用いられる予測キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus；以下「ＨＣＶ」と略記する）の感染により発症するウイルス性肝炎の一種である。ＨＣＶに感染すると、多くの場合は慢性肝炎状態となり、この状態を放置しておくと肝硬変、肝細胞癌へと進行することもある。現在、ＨＣＶの感染者は、日本に約２００万人存在し、世界に２億人存在すると推定されている。
【０００３】
現在、Ｃ型肝炎に対する治療方法として最も一般的なものが、ペグインターフェロン・リバビリン併用療法（以下「ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法」と略記する）である（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の有効例は約６割であり、残りの４割が無効例または再燃例である。
【０００４】
ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法では、ほぼ全例において発熱などの副作用が生じるため、無効例または再燃例となる患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施することは好ましくない。したがって、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施する前に、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果を予測できる検査方法の開発が望まれている。これまで、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーとしては、１）ウイルスの量やアミノ酸変異などのウイルス因子、２）ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶの投与量などの薬剤因子、３）患者の年齢や性別、肝線維化進展度、インシュリン抵抗性などの宿主因子などが報告されている。しかしながら、これらの因子による治療効果の予測方法は、感度および特異度が低く、確立されたものとはいえない。
【０００５】
一方、ヒトの血液中には、補体と総称されるタンパク質群が存在する。補体は、Ｃ１〜Ｃ９の９つの補体成分（タンパク質）を含み、成体防御に寄与する。９つの補体成分の中でも補体成分Ｃ３は、補体系の活性化を担う重要なタンパク質である。Ｃ３は、補体系を活性化する過程で分解され、様々な種類の分解産物を生成する。Ｃ３の分解産物の一つとして、１７残基のアミノ酸からなる補体成分Ｃ３ｆが挙げられる。このＣ３ｆも、さらに分解されて新たな分解産物を生成しうることが知られている。近年、血清中の特定のＣ３ｆ分解産物の増減が、特定の疾患のバイオマーカーとなりうることが報告されている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】McHutchison JG, Gordon SC, Schiff ER, Shiffman ML, Lee WM, Rustgi VK, Goodman ZD, Ling MH, CortS and Albrecht JK, "Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as Initial treatment for chronic hepatitis C", N. Engl. J. Med., Vol.339, pp.1485-1492.
【非特許文献２】Lin XL, Yang SY, Du J, Tian YX, Bu LN, Huo SF, Wang FP and Nan YD., "Detection of lung adenocarcinoma using magnetic beads based matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry serum protein profiling", Chin. Med. J., Vol.123, No.1, pp.34-39.
【非特許文献３】Kaneshiro N, Xiang Y, Nagai K, Kurokawa MS, Okamoto K, Arito M, MasukoK, Yudoh K, Yasuda T, SuematsuN, Kimura K and Kato T., "Comprehensive analysis of short peptides in sera from patients with IgA nephropathy", Rapid Commun. Mass Spectrom., Vol.23, pp.3720-3728.
【非特許文献４】Liang T, Wang N, Li W, Li A, Wang J, Cui J, Liu N, Li Y, Li L, Yang G, DuZ, Li D, He K and Wang G., "Identification of complement C3f-desArg and its derivative for acute leukemia diagnosis and minimal residual disease assessment", Proteomics, Vol.10, No.1, pp.90-98.
【非特許文献５】Xiang Y, Matsui T, Matsuo K, Shimada K, Tohma S, Nakamura H, Masuko K, Yudoh K, Nishioka K and Kato T., "Comprehensive investigation of disease-specific short peptides in sera from patients with systemic sclerosis: complement C3f-des-arginine, detected predominantly in systemic sclerosis sera, enhances proliferation of vascular endothelial cells", Arthritis Rheum., Vol.56, No.6, pp.2018-2030.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在までに、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果を予測する検査方法は確立されていない。したがって、その患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効であるかどうかが不明である状態で、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施せざるを得ない。上述の通り、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法では、ほぼ全例において発熱などの副作用が生じるため、無効例または再燃例となる患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施することは好ましくない。以上の点から、現在、Ｃ型肝炎の患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効であるかどうかを、治療前に予測する方法を確立することが強く望まれている。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、Ｃ型肝炎に対するＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測方法および予測キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、Ｃ型肝炎の患者の血清中のペプチドについて網羅的に解析を行ったところ、補体成分Ｃ３ｆの分解産物がＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーとなりうることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測方法に関する。
［１］Ｃ型肝炎の患者から採取された生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定するステップを含む、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法。
［２］前記Ｃ３ｆ分解産物の量が所定の値より多いとき、前記患者についてペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定するステップをさらに含む、［１］に記載の予測方法。
［３］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［１］または［２］に記載の予測方法。
［４］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［３］に記載の予測方法。
［５］前記生体試料は血清である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の予測方法。
［６］前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、質量分析法により測定される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の予測方法。
［７］前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、免疫測定法により測定される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の予測方法。
【００１１】
また、本発明は、以下のＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測キットに関する。
［８］Ｃ３ｆ分解産物を特異的に認識する抗体またはその断片を有する、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測キット。
［９］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［８］に記載の予測キット。
［１０］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［９］に記載の予測キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｃ型肝炎の患者に対して、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高いかどうかを治療前に評価することができる。したがって、本発明によれば、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高い患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を早期にかつ安心して実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、著効患者群の血清の平均ペプチドプロファイルである。図１Ｂは、無効患者群の血清の平均ペプチドプロファイルである。
【図２】図１Ａおよび図１ＢのペプチドプロファイルにおけるＡの部分の拡大図である。
【図３】ゲルイメージ化した各患者の血清ペプチドプロファイルである。
【図４】図４Ａは、著効患者の血清中のＣ３ｆ分解産物のプロファイルである。図４Ｂは、無効患者の血清中のＣ３ｆ分解産物のプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．本発明の予測方法
本発明の予測方法は、Ｃ型肝炎に対するＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測方法であって、Ｃ型肝炎の患者から採取された生体試料中の補体成分Ｃ３ｆの分解産物の量を測定するステップを含む。
【００１５】
補体成分Ｃ３ｆは、補体成分Ｃ３ｂの分解産物であり、血液中に存在している。Ｃ３ｆは、配列番号１のアミノ酸配列を有する１７残基のアミノ酸からなるペプチドである（ＮＣＢＩアクセッション番号：１４１３２０５Ａ）。本明細書では、１７残基のアミノ酸からなる補体成分Ｃ３ｆを「Ｃ３ｆ１−１７」と表記することがある。Ｃ３ｆは、平滑筋を収縮させたり血管透過性を上昇させたりすることが知られているが、Ｃ型肝炎との関連は報告されていない。
【００１６】
血液中には、Ｃ３ｆのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が離脱したＣ３ｆの分解産物も存在する。Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）の分解産物の例には、次に説明するＣ３ｆ１−１６やＣ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ４−１６、Ｃ３ｆ５−１６、Ｃ３ｆ６−１６、Ｃ３ｆ７−１６などが含まれる。
【００１７】
「Ｃ３ｆ１−１６」は、配列番号２のアミノ酸配列を有する１６残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ１−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００１８】
「Ｃ３ｆ２−１６」は、配列番号３のアミノ酸配列を有する１５残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ２−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端のセリン残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００１９】
「Ｃ３ｆ３−１６」は、配列番号４のアミノ酸配列を有する１４残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ３−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の２つのセリン残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２０】
「Ｃ３ｆ４−１６」は、配列番号５のアミノ酸配列を有する１３残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ４−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の３つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２１】
「Ｃ３ｆ５−１６」は、配列番号６のアミノ酸配列を有する１２残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ５−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の４つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２２】
「Ｃ３ｆ６−１６」は、配列番号７のアミノ酸配列を有する１１残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ６−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の５つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２３】
「Ｃ３ｆ７−１６」は、配列番号８のアミノ酸配列を有する１０残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ７−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の６つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２４】
本発明の予測方法は、Ｃ３ｆ分解産物を予測マーカーとして用いることを一つの特徴とする。上述のように、Ｃ３ｆ分解産物には様々なペプチドが含まれるが、感度および特異度を向上させる観点からは、Ｃ３ｆ１−１６（配列番号２）、Ｃ３ｆ２−１６（配列番号３）、Ｃ３ｆ３−１６（配列番号４）、Ｃ３ｆ５−１６（配列番号６）およびＣ３ｆ６−１６（配列番号７）からなる群から選択される１または２以上のペプチドを予測マーカーとして用いることが好ましい。また、感度および特異度をさらに向上させたい場合は、上記５種類のペプチドの中でも、Ｃ３ｆ１−１６（配列番号２）、Ｃ３ｆ２−１６（配列番号３）およびＣ３ｆ３−１６（配列番号４）からなる群から選択される１または２以上のペプチドを予測マーカーとして用いることが好ましい。これらのペプチドは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。２種以上のペプチドを組み合わせて使用することで、感度および特異度をより向上させることができる。
【００２５】
本発明者は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーとなりうるペプチドを網羅的に探索したところ、生体試料（特に血清）中のＣ３ｆ分解産物がＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーになりうることを見出した。本発明者の研究によれば、Ｃ３ｆ分解産物の濃度が高い患者は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高い。実施例に示されるように、Ｃ３ｆ分解産物を予測マーカーとして用いる本発明の予測方法は、適切なカットオフ値を設定することで高感度かつ高特異度の予測方法となりうる。
【００２６】
測定対象となる生体試料の種類は、特に限定されないが、血液や血漿、血清、尿、これらの希釈液などを用いることができる。検査を簡便に行う観点からは、生体試料として血清を用いることが好ましい。
【００２７】
生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定する方法は、特に限定されず、質量分析法や免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などの当業者に公知の測定法から適宜選択されうる。
【００２８】
質量分析方法の例としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）を用いた方法や、ＥＳＩ法（ElectrosprayIonization）を用いた質量分析法などが挙げられる。ＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計の例には、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）や、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）などが含まれる。たとえば、実施例に示すように、弱陽イオン交換体を結合した磁性ビーズを用いてＣ３ｆ分解産物を単離した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計を用いてＣ３ｆ分解産物を定量すればよい（ＣｌｉｎＰｒｏｔシステム；ブルカー・ダルトニクス株式会社）。
【００２９】
免疫測定法の例には、ＥＬＩＳＡ法、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法などが含まれる。たとえば、物理吸着や化学結合などにより抗体を結合させた固相担体を用いて生体試料中のＣ３ｆ分解産物を捕捉した後、固相担体に固定化した抗体とは抗原認識部位が異なる標識化抗体（酵素や蛍光物質などで標識した抗体）を用いて捕捉されたＣ３ｆ分解産物を定量すればよい。
【００３０】
免疫測定法によりＣ３ｆ分解産物の量を測定する場合、使用する抗体は、Ｃ３ｆの特定の分解産物（例えば、Ｃ３ｆ１−１６）に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されない。前述の通り、Ｃ３ｆはＣ３ｂの分解産物である。また、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）は、予測マーカーとして使用することはできない。したがって、使用する抗体は、Ｃ３ｂおよびＣ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のいずれにも結合しないものでなければならない。抗体の種類は、モノクローナル抗体であってもよいしポリクローナル抗体であってもよいが、通常はモノクローナル抗体である。また、抗体の断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。また、これらの抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００３１】
たとえば、生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定した結果、Ｃ３ｆ分解産物の量が所定のカットオフ値よりも多いときは、その患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高いと判定する。Ｃ３ｆ分解産物のカットオフ値は、必要とする感度や特異度などに応じて適宜設定すればよい。たとえば、あるＣ３ｆ分解産物のカットオフ値を、無効例の患者群における当該分解産物の測定値の最大値とすることで、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性を高い特異度で予測することができる（実施例参照）。
【００３２】
本発明の予測方法は、Ｃ３ｆ分解産物を予測マーカーとすることで、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高いかどうかを迅速かつ容易に予測することができる。本発明の予測方法は、医療従事者がＣ型肝炎の患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施するかどうかを判断する際の判断材料を提供することができる。
【００３３】
２．本発明の予測キット
本発明の予測キットは、生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を免疫測定法により測定するためのキットであり、本発明の予測方法に用いることができる。
【００３４】
本発明の予測キットは、Ｃ３ｆ分解産物に特異的に結合しうる抗体を有することを特徴とする。本発明の検査キットは、この抗体とＣ３ｆ分解産物との抗原抗体反応を検出して、生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定する。
【００３５】
前述の通り、抗体は、Ｃ３ｆの特定の分解産物（例えば、Ｃ３ｆ１−１６）に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されない。抗体の種類は、モノクローナル抗体であってもよいしポリクローナル抗体であってもよいが、通常はモノクローナル抗体である。抗体の断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。これらの抗体は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。また、これらの抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００３６】
生体試料中のタンパク質の量を測定するための検査キットは、タンパク質の種類に応じて様々なものが市販されている。本発明の予測キットも、Ｃ３ｆ分解産物に特異的に結合しうる抗体またはその断片を用いることを除き、当業者に公知の検査キットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００３７】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００３８】
倫理性を確保するための手続を終えた後、Ｃ型慢性肝炎の患者６２名（いずれも遺伝子型１ｂ、高ウイルス量）から血液を採取した。その後、各患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を２４〜７２週間実施した。ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を終了してから２４週間後に、各患者におけるＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果を評価した。その結果、著効患者は４９名（治療期間：４８〜７２週間）、無効患者は１３名（治療期間：２４〜７２週間）であった。
【００３９】
ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を行う前に各患者から採取した血液から血清（サンプル）を調製した。得られた血清１００μＬ（患者１人当たり。以下同じ）を１００ｋＤａ分子フィルターに通し、血清中のウイルスを除去した。次いで、弱陽イオン交換体を担持させた磁性ビーズ（ＭＢ−ＷＣＸ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いて、ウイルスを除去した血清２０μＬから弱陽イオン交換体に結合するペプチドを分離回収した。
【００４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いて、回収したペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）およびイオン強度を網羅的に測定した。解析プログラム（ＣｌｉｎＰｒｏＴｏｏｌｓ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いて、Ｃ型肝炎の患者６２名それぞれの血清ペプチドプロファイルを作成した。
【００４１】
図１Ａは、著効患者群（４９名）の血清の平均ペプチドプロファイルである。図１Ｂは、無効患者群（１３名）の血清の平均ペプチドプロファイルである。図１Ａに示されるように、著効患者群のペプチドプロファイルでは分子量約１.８ｋＤａのペプチドのピークが観察されたが（図中「Ａ」で示す）、図１Ｂに示されるように、無効患者群のペプチドプロファイルではこのピークはほとんど観察されなかった。図２は、図１Ａおよび図１ＢのペプチドプロファイルにおけるＡの部分の拡大図である。
【００４２】
図３は、ゲルイメージ化した各患者の血清ペプチドプロファイルである。上段は著効患者４９名の血清ペプチドプロファイルであり、下段は無効患者１３名の血清ペプチドプロファイルである。著効患者群と無効患者群との間で濃度に有意差（ｔ検定：ｐ＜０.０５）が見られたペプチドを検索したところ、９種類のペプチドが検出された（図中「▼」で示す）。これら９種類のペプチドは、いずれも著効患者群の血清中における濃度が無効患者群の血清中における濃度よりも大きかった。
【００４３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ型質量分析計（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いた質量分析法により、検出した９種類のペプチドのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を表１に示す。表１に示されるように、９種類のペプチドのうち５種類のペプチドは、Ｃ３ｆの分解産物（Ｃ３ｆ１−１６、Ｃ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ５−１６およびＣ３ｆ６−１６）であった。
【表１】
【００４４】
図４Ａは、著効患者（４９名）それぞれの血清中の補体成分Ｃ３ｆ分解産物のプロファイルである。図４Ｂは、無効患者（１３名）それぞれの血清中の補体成分Ｃ３ｆ分解産物のプロファイルである。図４Ａおよび図４Ｂを比較すると、Ｃ３ｆ１−１６、Ｃ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ５−１６およびＣ３ｆ６−１６は、無効患者の血清中にはほとんど含まれないが、一部の著効患者の血清中では相対的に高い濃度で含まれることがわかる。
【００４５】
図４Ａおよび図４Ｂにおける破線は、無効患者群における各分解産物の測定値の最大値を結ぶ線である。たとえば、図４Ａに示される著効患者群のプロファイルにおいて、この破線をカットオフ値として、Ｃ３ｆ１−１６、Ｃ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ５−１６およびＣ３ｆ６−１６のいずれかがカットオフ値よりも大きい場合、その患者にはペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定する。このようにすることで、感度４５％、特異度１００％で予測を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の予測方法による検査は、医療従事者がＣ型肝炎の患者に対して治療方針を決める際の判断材料を提供する検査として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法およびそれに用いられる予測キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（hepatitis C virus；以下「ＨＣＶ」と略記する）の感染により発症するウイルス性肝炎の一種である。ＨＣＶに感染すると、多くの場合は慢性肝炎状態となり、この状態を放置しておくと肝硬変、肝細胞癌へと進行することもある。現在、ＨＣＶの感染者は、日本に約２００万人存在し、世界に２億人存在すると推定されている。
【０００３】
現在、Ｃ型肝炎に対する治療方法として最も一般的なものが、ペグインターフェロン・リバビリン併用療法（以下「ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法」と略記する）である（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の有効例は約６割であり、残りの４割が無効例または再燃例である。
【０００４】
ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法では、ほぼ全例において発熱などの副作用が生じるため、無効例または再燃例となる患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施することは好ましくない。したがって、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施する前に、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果を予測できる検査方法の開発が望まれている。これまで、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーとしては、１）ウイルスの量やアミノ酸変異などのウイルス因子、２）ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶの投与量などの薬剤因子、３）患者の年齢や性別、肝線維化進展度、インシュリン抵抗性などの宿主因子などが報告されている。しかしながら、これらの因子による治療効果の予測方法は、感度および特異度が低く、確立されたものとはいえない。
【０００５】
一方、ヒトの血液中には、補体と総称されるタンパク質群が存在する。補体は、Ｃ１〜Ｃ９の９つの補体成分（タンパク質）を含み、成体防御に寄与する。９つの補体成分の中でも補体成分Ｃ３は、補体系の活性化を担う重要なタンパク質である。Ｃ３は、補体系を活性化する過程で分解され、様々な種類の分解産物を生成する。Ｃ３の分解産物の一つとして、１７残基のアミノ酸からなる補体成分Ｃ３ｆが挙げられる。このＣ３ｆも、さらに分解されて新たな分解産物を生成しうることが知られている。近年、血清中の特定のＣ３ｆ分解産物の増減が、特定の疾患のバイオマーカーとなりうることが報告されている（例えば、非特許文献２〜５参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】McHutchison JG, Gordon SC, Schiff ER, Shiffman ML, Lee WM, Rustgi VK, Goodman ZD, Ling MH, CortS and Albrecht JK, "Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as Initial treatment for chronic hepatitis C", N. Engl. J. Med., Vol.339, pp.1485-1492.
【非特許文献２】Lin XL, Yang SY, Du J, Tian YX, Bu LN, Huo SF, Wang FP and Nan YD., "Detection of lung adenocarcinoma using magnetic beads based matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry serum protein profiling", Chin. Med. J., Vol.123, No.1, pp.34-39.
【非特許文献３】Kaneshiro N, Xiang Y, Nagai K, Kurokawa MS, Okamoto K, Arito M, MasukoK, Yudoh K, Yasuda T, SuematsuN, Kimura K and Kato T., "Comprehensive analysis of short peptides in sera from patients with IgA nephropathy", Rapid Commun. Mass Spectrom., Vol.23, pp.3720-3728.
【非特許文献４】Liang T, Wang N, Li W, Li A, Wang J, Cui J, Liu N, Li Y, Li L, Yang G, DuZ, Li D, He K and Wang G., "Identification of complement C3f-desArg and its derivative for acute leukemia diagnosis and minimal residual disease assessment", Proteomics, Vol.10, No.1, pp.90-98.
【非特許文献５】Xiang Y, Matsui T, Matsuo K, Shimada K, Tohma S, Nakamura H, Masuko K, Yudoh K, Nishioka K and Kato T., "Comprehensive investigation of disease-specific short peptides in sera from patients with systemic sclerosis: complement C3f-des-arginine, detected predominantly in systemic sclerosis sera, enhances proliferation of vascular endothelial cells", Arthritis Rheum., Vol.56, No.6, pp.2018-2030.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在までに、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果を予測する検査方法は確立されていない。したがって、その患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効であるかどうかが不明である状態で、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施せざるを得ない。上述の通り、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法では、ほぼ全例において発熱などの副作用が生じるため、無効例または再燃例となる患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施することは好ましくない。以上の点から、現在、Ｃ型肝炎の患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効であるかどうかを、治療前に予測する方法を確立することが強く望まれている。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、Ｃ型肝炎に対するＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測方法および予測キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、Ｃ型肝炎の患者の血清中のペプチドについて網羅的に解析を行ったところ、補体成分Ｃ３ｆの分解産物がＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーとなりうることを見出し、さらに検討を加えて本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測方法に関する。
［１］Ｃ型肝炎の患者から採取された生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定するステップを含む、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法。
［２］前記Ｃ３ｆ分解産物の量が所定の値より多いとき、前記患者についてペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定するステップをさらに含む、［１］に記載の予測方法。
［３］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［１］または［２］に記載の予測方法。
［４］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［３］に記載の予測方法。
［５］前記生体試料は血清である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の予測方法。
［６］前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、質量分析法により測定される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の予測方法。
［７］前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、免疫測定法により測定される、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の予測方法。
【００１１】
また、本発明は、以下のＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測キットに関する。
［８］Ｃ３ｆ分解産物を特異的に認識する抗体またはその断片を有する、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測キット。
［９］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［８］に記載の予測キット。
［１０］前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、［９］に記載の予測キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｃ型肝炎の患者に対して、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高いかどうかを治療前に評価することができる。したがって、本発明によれば、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高い患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を早期にかつ安心して実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａは、著効患者群の血清の平均ペプチドプロファイルである。図１Ｂは、無効患者群の血清の平均ペプチドプロファイルである。
【図２】図１Ａおよび図１ＢのペプチドプロファイルにおけるＡの部分の拡大図である。
【図３】ゲルイメージ化した各患者の血清ペプチドプロファイルである。
【図４】図４Ａは、著効患者の血清中のＣ３ｆ分解産物のプロファイルである。図４Ｂは、無効患者の血清中のＣ３ｆ分解産物のプロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．本発明の予測方法
本発明の予測方法は、Ｃ型肝炎に対するＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測方法であって、Ｃ型肝炎の患者から採取された生体試料中の補体成分Ｃ３ｆの分解産物の量を測定するステップを含む。
【００１５】
補体成分Ｃ３ｆは、補体成分Ｃ３ｂの分解産物であり、血液中に存在している。Ｃ３ｆは、配列番号１のアミノ酸配列を有する１７残基のアミノ酸からなるペプチドである（ＮＣＢＩアクセッション番号：１４１３２０５Ａ）。本明細書では、１７残基のアミノ酸からなる補体成分Ｃ３ｆを「Ｃ３ｆ１−１７」と表記することがある。Ｃ３ｆは、平滑筋を収縮させたり血管透過性を上昇させたりすることが知られているが、Ｃ型肝炎との関連は報告されていない。
【００１６】
血液中には、Ｃ３ｆのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸が離脱したＣ３ｆの分解産物も存在する。Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）の分解産物の例には、次に説明するＣ３ｆ１−１６やＣ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ４−１６、Ｃ３ｆ５−１６、Ｃ３ｆ６−１６、Ｃ３ｆ７−１６などが含まれる。
【００１７】
「Ｃ３ｆ１−１６」は、配列番号２のアミノ酸配列を有する１６残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ１−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００１８】
「Ｃ３ｆ２−１６」は、配列番号３のアミノ酸配列を有する１５残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ２−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端のセリン残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００１９】
「Ｃ３ｆ３−１６」は、配列番号４のアミノ酸配列を有する１４残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ３−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の２つのセリン残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２０】
「Ｃ３ｆ４−１６」は、配列番号５のアミノ酸配列を有する１３残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ４−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の３つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２１】
「Ｃ３ｆ５−１６」は、配列番号６のアミノ酸配列を有する１２残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ５−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の４つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２２】
「Ｃ３ｆ６−１６」は、配列番号７のアミノ酸配列を有する１１残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ６−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の５つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２３】
「Ｃ３ｆ７−１６」は、配列番号８のアミノ酸配列を有する１０残基のアミノ酸からなるペプチドである。Ｃ３ｆ７−１６は、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のＮ末端の６つのアミノ酸残基およびＣ末端のアルギニン残基が離脱したものである。
【００２４】
本発明の予測方法は、Ｃ３ｆ分解産物を予測マーカーとして用いることを一つの特徴とする。上述のように、Ｃ３ｆ分解産物には様々なペプチドが含まれるが、感度および特異度を向上させる観点からは、Ｃ３ｆ１−１６（配列番号２）、Ｃ３ｆ２−１６（配列番号３）、Ｃ３ｆ３−１６（配列番号４）、Ｃ３ｆ５−１６（配列番号６）およびＣ３ｆ６−１６（配列番号７）からなる群から選択される１または２以上のペプチドを予測マーカーとして用いることが好ましい。また、感度および特異度をさらに向上させたい場合は、上記５種類のペプチドの中でも、Ｃ３ｆ１−１６（配列番号２）、Ｃ３ｆ２−１６（配列番号３）およびＣ３ｆ３−１６（配列番号４）からなる群から選択される１または２以上のペプチドを予測マーカーとして用いることが好ましい。これらのペプチドは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。２種以上のペプチドを組み合わせて使用することで、感度および特異度をより向上させることができる。
【００２５】
本発明者は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーとなりうるペプチドを網羅的に探索したところ、生体試料（特に血清）中のＣ３ｆ分解産物がＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果の予測マーカーになりうることを見出した。本発明者の研究によれば、Ｃ３ｆ分解産物の濃度が高い患者は、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高い。実施例に示されるように、Ｃ３ｆ分解産物を予測マーカーとして用いる本発明の予測方法は、適切なカットオフ値を設定することで高感度かつ高特異度の予測方法となりうる。
【００２６】
測定対象となる生体試料の種類は、特に限定されないが、血液や血漿、血清、尿、これらの希釈液などを用いることができる。検査を簡便に行う観点からは、生体試料として血清を用いることが好ましい。
【００２７】
生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定する方法は、特に限定されず、質量分析法や免疫測定法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）法などの当業者に公知の測定法から適宜選択されうる。
【００２８】
質量分析方法の例としては、レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）を用いた方法や、ＥＳＩ法（ElectrosprayIonization）を用いた質量分析法などが挙げられる。ＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計の例には、マトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）や、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計）などが含まれる。たとえば、実施例に示すように、弱陽イオン交換体を結合した磁性ビーズを用いてＣ３ｆ分解産物を単離した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計を用いてＣ３ｆ分解産物を定量すればよい（ＣｌｉｎＰｒｏｔシステム；ブルカー・ダルトニクス株式会社）。
【００２９】
免疫測定法の例には、ＥＬＩＳＡ法、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、イムノクロマト法などが含まれる。たとえば、物理吸着や化学結合などにより抗体を結合させた固相担体を用いて生体試料中のＣ３ｆ分解産物を捕捉した後、固相担体に固定化した抗体とは抗原認識部位が異なる標識化抗体（酵素や蛍光物質などで標識した抗体）を用いて捕捉されたＣ３ｆ分解産物を定量すればよい。
【００３０】
免疫測定法によりＣ３ｆ分解産物の量を測定する場合、使用する抗体は、Ｃ３ｆの特定の分解産物（例えば、Ｃ３ｆ１−１６）に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されない。前述の通り、Ｃ３ｆはＣ３ｂの分解産物である。また、Ｃ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）は、予測マーカーとして使用することはできない。したがって、使用する抗体は、Ｃ３ｂおよびＣ３ｆ（Ｃ３ｆ１−１７）のいずれにも結合しないものでなければならない。抗体の種類は、モノクローナル抗体であってもよいしポリクローナル抗体であってもよいが、通常はモノクローナル抗体である。また、抗体の断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。また、これらの抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００３１】
たとえば、生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定した結果、Ｃ３ｆ分解産物の量が所定のカットオフ値よりも多いときは、その患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高いと判定する。Ｃ３ｆ分解産物のカットオフ値は、必要とする感度や特異度などに応じて適宜設定すればよい。たとえば、あるＣ３ｆ分解産物のカットオフ値を、無効例の患者群における当該分解産物の測定値の最大値とすることで、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性を高い特異度で予測することができる（実施例参照）。
【００３２】
本発明の予測方法は、Ｃ３ｆ分解産物を予測マーカーとすることで、ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法が有効である可能性が高いかどうかを迅速かつ容易に予測することができる。本発明の予測方法は、医療従事者がＣ型肝炎の患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を実施するかどうかを判断する際の判断材料を提供することができる。
【００３３】
２．本発明の予測キット
本発明の予測キットは、生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を免疫測定法により測定するためのキットであり、本発明の予測方法に用いることができる。
【００３４】
本発明の予測キットは、Ｃ３ｆ分解産物に特異的に結合しうる抗体を有することを特徴とする。本発明の検査キットは、この抗体とＣ３ｆ分解産物との抗原抗体反応を検出して、生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定する。
【００３５】
前述の通り、抗体は、Ｃ３ｆの特定の分解産物（例えば、Ｃ３ｆ１−１６）に特異的に結合しうる抗体またはその断片であれば特に限定されない。抗体の種類は、モノクローナル抗体であってもよいしポリクローナル抗体であってもよいが、通常はモノクローナル抗体である。抗体の断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）などが含まれる。これらの抗体は、担体に固定化されていてもよいし、固定化されていなくてもよい。また、これらの抗体は、酵素、放射性同位体、蛍光色素、アビジン、ビオチンなどで標識されていてもよい。
【００３６】
生体試料中のタンパク質の量を測定するための検査キットは、タンパク質の種類に応じて様々なものが市販されている。本発明の予測キットも、Ｃ３ｆ分解産物に特異的に結合しうる抗体またはその断片を用いることを除き、当業者に公知の検査キットに用いられている各要素によって構成することができる。
【００３７】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００３８】
倫理性を確保するための手続を終えた後、Ｃ型慢性肝炎の患者６２名（いずれも遺伝子型１ｂ、高ウイルス量）から血液を採取した。その後、各患者に対してＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を２４〜７２週間実施した。ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を終了してから２４週間後に、各患者におけるＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法の治療効果を評価した。その結果、著効患者は４９名（治療期間：４８〜７２週間）、無効患者は１３名（治療期間：２４〜７２週間）であった。
【００３９】
ＰＥＧ−ＩＦＮ／ＲＢＶ療法を行う前に各患者から採取した血液から血清（サンプル）を調製した。得られた血清１００μＬ（患者１人当たり。以下同じ）を１００ｋＤａ分子フィルターに通し、血清中のウイルスを除去した。次いで、弱陽イオン交換体を担持させた磁性ビーズ（ＭＢ−ＷＣＸ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いて、ウイルスを除去した血清２０μＬから弱陽イオン交換体に結合するペプチドを分離回収した。
【００４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析計（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いて、回収したペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）およびイオン強度を網羅的に測定した。解析プログラム（ＣｌｉｎＰｒｏＴｏｏｌｓ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いて、Ｃ型肝炎の患者６２名それぞれの血清ペプチドプロファイルを作成した。
【００４１】
図１Ａは、著効患者群（４９名）の血清の平均ペプチドプロファイルである。図１Ｂは、無効患者群（１３名）の血清の平均ペプチドプロファイルである。図１Ａに示されるように、著効患者群のペプチドプロファイルでは分子量約１.８ｋＤａのペプチドのピークが観察されたが（図中「Ａ」で示す）、図１Ｂに示されるように、無効患者群のペプチドプロファイルではこのピークはほとんど観察されなかった。図２は、図１Ａおよび図１ＢのペプチドプロファイルにおけるＡの部分の拡大図である。
【００４２】
図３は、ゲルイメージ化した各患者の血清ペプチドプロファイルである。上段は著効患者４９名の血清ペプチドプロファイルであり、下段は無効患者１３名の血清ペプチドプロファイルである。著効患者群と無効患者群との間で濃度に有意差（ｔ検定：ｐ＜０.０５）が見られたペプチドを検索したところ、９種類のペプチドが検出された（図中「▼」で示す）。これら９種類のペプチドは、いずれも著効患者群の血清中における濃度が無効患者群の血清中における濃度よりも大きかった。
【００４３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ型質量分析計（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ；ブルカー・ダルトニクス株式会社）を用いた質量分析法により、検出した９種類のペプチドのアミノ酸配列を決定した。決定されたアミノ酸配列を表１に示す。表１に示されるように、９種類のペプチドのうち５種類のペプチドは、Ｃ３ｆの分解産物（Ｃ３ｆ１−１６、Ｃ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ５−１６およびＣ３ｆ６−１６）であった。
【表１】
【００４４】
図４Ａは、著効患者（４９名）それぞれの血清中の補体成分Ｃ３ｆ分解産物のプロファイルである。図４Ｂは、無効患者（１３名）それぞれの血清中の補体成分Ｃ３ｆ分解産物のプロファイルである。図４Ａおよび図４Ｂを比較すると、Ｃ３ｆ１−１６、Ｃ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ５−１６およびＣ３ｆ６−１６は、無効患者の血清中にはほとんど含まれないが、一部の著効患者の血清中では相対的に高い濃度で含まれることがわかる。
【００４５】
図４Ａおよび図４Ｂにおける破線は、無効患者群における各分解産物の測定値の最大値を結ぶ線である。たとえば、図４Ａに示される著効患者群のプロファイルにおいて、この破線をカットオフ値として、Ｃ３ｆ１−１６、Ｃ３ｆ２−１６、Ｃ３ｆ３−１６、Ｃ３ｆ５−１６およびＣ３ｆ６−１６のいずれかがカットオフ値よりも大きい場合、その患者にはペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定する。このようにすることで、感度４５％、特異度１００％で予測を行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明の予測方法による検査は、医療従事者がＣ型肝炎の患者に対して治療方針を決める際の判断材料を提供する検査として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎の患者から採取された生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定するステップを含む、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法。
【請求項２】
前記Ｃ３ｆ分解産物の量が所定の値より多いとき、前記患者についてペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項１に記載の予測方法。
【請求項４】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項３に記載の予測方法。
【請求項５】
前記生体試料は血清である、請求項１に記載の予測方法。
【請求項６】
前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、質量分析法により測定される、請求項１に記載の予測方法。
【請求項７】
前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、免疫測定法により測定される、請求項１に記載の予測方法。
【請求項８】
Ｃ３ｆ分解産物を特異的に認識する抗体またはその断片を有する、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測キット。
【請求項９】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項８に記載の予測キット。
【請求項１０】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項９に記載の予測キット。
【請求項１】
Ｃ型肝炎の患者から採取された生体試料中のＣ３ｆ分解産物の量を測定するステップを含む、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測方法。
【請求項２】
前記Ｃ３ｆ分解産物の量が所定の値より多いとき、前記患者についてペグインターフェロン・リバビリン併用療法が有効である可能性が高いと判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の予測方法。
【請求項３】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項１に記載の予測方法。
【請求項４】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項３に記載の予測方法。
【請求項５】
前記生体試料は血清である、請求項１に記載の予測方法。
【請求項６】
前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、質量分析法により測定される、請求項１に記載の予測方法。
【請求項７】
前記Ｃ３ｆ分解産物の量は、免疫測定法により測定される、請求項１に記載の予測方法。
【請求項８】
Ｃ３ｆ分解産物を特異的に認識する抗体またはその断片を有する、Ｃ型肝炎に対するペグインターフェロン・リバビリン併用療法の治療効果の予測キット。
【請求項９】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号６のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項８に記載の予測キット。
【請求項１０】
前記Ｃ３ｆ分解産物は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドおよび配列番号４のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１または２以上のペプチドである、請求項９に記載の予測キット。
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図２】
【図４】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−９３２３０（Ｐ２０１２−９３２３０Ａ）
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４０８７４（Ｐ２０１０−２４０８７４）
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（５９６１６５５８９）学校法人 聖マリアンナ医科大学 (53)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月２７日（２０１０．１０．２７）
【出願人】（５９６１６５５８９）学校法人 聖マリアンナ医科大学 (53)
【Ｆターム（参考）】
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