Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療
【課題】ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害する方法の提供。
【解決手段】ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させ、細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することにより、ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害するための、方法及び組成物。前記ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤が、マイクロモル以下の量でＭＴＰに結合し、かつ該ＭＴＰを阻害するＭＴＰ阻害剤（但し、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）を除く）、及びアポリポタンパク質Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される剤形。
【解決手段】ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させ、細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することにより、ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害するための、方法及び組成物。前記ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤が、マイクロモル以下の量でＭＴＰに結合し、かつ該ＭＴＰを阻害するＭＴＰ阻害剤（但し、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）を除く）、及びアポリポタンパク質Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｊｉｎ Ｙｅ（市民権：中華人民共和国；居住地：Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、Ｆａｎｇ Ｓｕｎ（市民権：中華人民共和国；居住地：Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＣＴ）、Ｈｕａ Ｈｕａｎｇ（市民権：中華人民共和国；居住地：Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）及びＭｉｃｈａｅｌ Ｇａｌｅ、Ｊｒ．（市民権：米国；居住地：Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）。
【０００２】
指定代理人：Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ交付番号５ Ｐ０１ ＨＬ２０９４８−３０（題名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）により支援されている。米国政府はこの出願において生ずるあらゆる特許において権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
多くのウイルスは、ある一定の特別の細胞型においてのみ大量に生じ得る。古典的な例はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（フラビウイルス科の１本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルス）（Ａｐｐｅｌら、２００６）であり、これは、肝細胞によってのみ大量に分泌され得る（Ｃｈｉｓａｒｉ、２００５）。この限定に関与する因子は殆ど知られていない。ＨＣＶの場合、１つの手がかりは、トリグリセリド及びコレステロールエステルを血漿中に排出するために（Ｇｉｂｂｏｎｓら、２０００）、少なくともＨＣＶの一部が超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）（Ａｎｄｒｅら、２００２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、２００６）、肝臓でのみ産生される球状粒子のファミリー（Ｇｉｂｂｏｎｓら、２００４）、との複合体となり血漿中で循環するという実験結果から得られる。ＨＣＶ及びＶＬＤＬは一緒に循環するが、ウイルスのアセンブリ又は分泌におけるＶＬＤＬに対する役割は明らかになっていない。
【０００４】
全てのプラス鎖ＲＮＡウイルスに関して、細胞質膜と関連してＨＣＶ ＲＮＡ複製が起こる。ＨＣＶの場合、ＨＣＶのサブゲノムレプリコンを有する培養ヒト肝臓癌Ｈｕｈ７細胞において、「膜性ウェブ（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｗｅｂｓ）」と呼ばれるこれらの構造が視覚化された（Ｇｏｓｅｒｔら、２００３；Ｍｏｒａｄｐｏｕｒら、２００４）。これらのレプリコンは、非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂに対するコード配列を含む、ＲＮＡ複製に対する必須のエレメントを含有する改変ＨＣＶ ＲＮＡ分子である（Ｌｏｈｍａｎｎら、１９９９）。Ｈｕｈ７細胞への遺伝子移入後、レプリコンＲＮＡは複製するが、これはウイルスのアセンブリ及び分泌に必要な構造タンパク質をコードしないので、感染性ウイルス粒子を産生しない（Ｌｏｈｍａｎｎら、１９９９）。ＨＣＶ複製複合体を有する膜性ウェブは単離されておらず、それらの組成は未知である。
【０００５】
ＶＬＤＬアセンブリは現在、２つの異なる段階で起こると考えられている（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ及びＳｅｌｌｅｒｓ、２００１）。第一段階において、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）は、新生アポリポタンパク質Ｂ、ＶＬＤＬを構造的に完全なものにする巨大な５４０Ｋｄａタンパク質、に脂質を輸送する（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ及びＢｏｒｅｎ、２００５）。十分な脂質結合なしで、ａｐｏＢはユビキチン化され、翻訳中に分解される（Ａｖｒａｍｏｇｌｕ及びＡｄｅｌｉ、２００４）。ＶＬＤＬアセンブリの第一段階で産生されるａｐｏＢ含有脂質粒子が含有するトリグリセリドは限られた量である（Ｇｕｓａｒｏｖａら、２００３）。第二段階において、ａｐｏＢ含有前駆体粒子は、内腔コンパートメントでトリグリセリド滴と融合し（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ及びＳｅｌｌｅｒｓ、２００１）、段階はおそらく、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）（ＶＬＤＬの別の主要なタンパク質成分）により促進される（Ｍｅｎｓｅｎｋａｍｐら、２００１）。直接的な融合現象に対して必須ではないが、細胞質から内腔コンパートメントへトリグリセリドを輸送するためにＭＴＰが必要とされる（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ及びＳｅｌｌｅｒｓ、２００１）。ヒト及びマウスにおいて、ＭＴＰにおける遺伝子異常によりＶＬＤＬ分泌が大きく減少する（Ｓｈａｒｐら、１９９３；Ｒａａｂｅら、１９９８）。ＶＬＤＬアセンブリの第一段階が小胞体（ＥＲ）で起こることが知られている一方で（Ｇｕｓａｒｏｖａら、２００３）、第二段階の正確な場所は意見の分かれるところである（Ｆｉｓｈｅｒ及びＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｐｅｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，９８３３−９８３６．
【非特許文献２】Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３６，９３０−９３２．
【非特許文献３】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ １４８３，３７−５７．
【非特許文献４】Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００２．
【非特許文献５】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２４１８−２４２８．
【非特許文献６】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｓｏｃ．ｔｒａｎｓ．３２，５９−６４．
【非特許文献７】Ｇｏｓｅｒｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，５４８７−５４９２．
【非特許文献８】Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，７４００−７４０９．
【非特許文献９】Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５，１１０−１１３．
【非特許文献１０】Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｒｓ，２００１．
【非特許文献１１】Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｓ．Ｏ．ａｎｄ Ｂｏｒｅｎ，Ｊ．（２００５）Ｊ．ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５８，３９５−４１０．
【非特許文献１２】Ａｖｒａｍｏｇｌｕ，Ｒ．Ｋ．ａｎｄ Ａｄｅｌｉ，Ｋ．（２００４）Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．５，２９３−３０１．
【非特許文献１３】Ｇｕｓａｒｏｖａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４８０５１−４８０５８．
【非特許文献１４】Ｍｅｎｓｅｎｋａｍｐ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５，８１６−８２２．
【非特許文献１５】Ｓｈａｒｐ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６５−６９．
【非特許文献１６】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｎ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１７３７７−１７３８０．
【発明の概要】
【０００７】
ある態様において、本発明は、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させることと；ｂ）細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することと、を含む、ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害する方法である。特定の実施形態において、この細胞を阻害剤のマイクロモル以下の量と接触させる。様々な実施形態において、この阻害剤は、ＭＴＰ阻害剤又は、アポリポタンパク質Ｂに対する、低分子干渉ＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、この接触段階は、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤に細胞を接触させることをさらに含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をＨＣＶ感染者に投与することと；ｂ）ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症の生じた低下を検出することと、を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させる方法である。特定の実施形態において、血清ウイルス血症の低下は、ＭＴＰ阻害剤などのＶＬＤＬアセンブリ阻害剤のマイクロモル以下の濃度により達成される。様々なその他の実施形態において、この阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択されるＭＴＰ阻害剤である。別の実施形態において、この阻害剤は、アポリポタンパク質Ｂに対する低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＩＳＩＳ ３０１０１２など、である。特定の実施形態において、この接触段階は、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤と細胞を接触させることをさらに含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、ａ）ＭＴＰ阻害剤剤形の複数と；ａ）リバビリン剤形の複数と、を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させるためのキットである。具体的な実施形態において、ＭＴＰ阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択される。
【００１０】
本発明の特定の実施形態の詳細な説明
発明者らは、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させることと；ｂ）細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することと、を含む、ＨＣＶ感染細胞からのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の放出を阻害する方法を記載する。
【００１１】
ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、好ましくは、ＭＴＰの活性を阻害する又はＡｐｏＢタンパク質の産生を限定することにより、ＶＬＤＬのアセンブリ及び分泌を阻止する。
【００１２】
ある実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、ＡｐｏＢに対する、低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一例として、ＩＳＩＳ ３０１０１２は、ヒトＡｐｏＢ−１００を標的とする臨床開発中のアンチセンスオリゴヌクレオチドである（Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００６）８：４６１−７）。
【００１３】
特定の実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、ＭＴＰに結合しＭＴＰ活性を阻害する分子であり、好ましくは、マイクロモル以下の濃度でＭＴＰ活性を阻害する合成（即ち非天然）分子である。合成ＭＴＰ阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０（例えば、Ｊａｍｉｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９９６）９３：１１９９１−５参照）、ＢＭＳ−２１２１２２（例えば、Ｒｏｂｌら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．（２００１）４４：８５１−６参照）、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３として開発中；例えば、Ｓｕｌｓｋｙら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．（２００４）１４：５０６７−７０参照）、ＢＭＳ−１９７６３６（例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４：２７７９３−８００参照）、ＪＴＴ−１３０（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌら、ＢＭＣ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓｏｒｄ（２００５）５：３０；及びＢｕｒｎｅｔｔ、ＩＤｒｕｇｓ（２００６）９：４９５−９参照）、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７としても知られる；例えば、Ｖｅｒｒｅｃｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（２００４）９３：１２１７−２８参照）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２としても知られる；例えば、Ｕｅｓｈｉｍａら、Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（２００５）２８：２４７−５２参照）、ＣＰ−３４６０８６（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２００３）４４：１８８７−９０１参照）、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０（例えば、米国特許第５，９１９，７９５号参照）など、当技術分野で周知である。
【００１４】
本発明は、細胞からのＨＣＶ放出の阻害について（これは、インビトロ又はＨＣＶ感染に対する動物モデルであるチンパンジーでのインシトゥであり得る。）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をスクリーニングするのに有用な方法を包含する。これらの実施形態において、細胞によりＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の取り込みを達成するのに適切な何らかの方法を用いて接触段階が達成される。例えば、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、インビトロで細胞にｓｉＲＮＡを遺伝子移入し得る。上述のＭＴＰ阻害剤などの低分子阻害剤を培養において細胞の培地に単純に添加し得る。ＭＴＰ阻害アッセイを用いて、本方法での使用のためのさらなるＭＴＰ阻害剤を同定することができ（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２００３）４４：１８８７−９０１参照）、場合によっては、チンパンジーでさらに確認することができる。特定の実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤のマイクロモル以下の量と細胞を接触させる。例えば、細胞は、１０００ｎＭ未満、好ましくは５００、２５０、１００又は１０ｎＭ未満の培地中濃度を達成するためのＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の量が添加される培養液中にあり得る。実施例２に記載のＨＣＶ放出アッセイなどの何らかの適切な方法を用いて、ＨＣＶ放出の得られる阻害を検出する。ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤がリバビリン及び／又はインターフェロンなどのその他の抗ウイルス剤とともに有する相加又は相乗効果を評価するために、本発明を使用することができる。従って、本発明の接触段階は、インターフェロン及び／又はリバビリンから選択される抗ウイルス剤と細胞を接触させることをさらに含み得る。
【００１５】
本発明は、ＨＣＶ感染者において血清ウイルス血症を低下させる方法を包含し、この方法は、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をＨＣＶ感染者に投与することと；ｂ）ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症の生じた低下を検出することと、を含む。接触段階の前に、患者は、好ましくは、ＨＣＶ感染を有するものとして診断されており、この診断は、何らかの医学的に許容可能な方法によるものであり得る。ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、高脂血症の治療に対して使用されている又は開発中の既知の薬物であり得る。
【００１６】
ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をヒトに投与するための適用可能なプロトコールは、当技術分野で公知であり、日常的に最適化される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ３０１０１２は、経口及び非経口投与経路によるバイオアベイラビリティーを示す（Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２００５ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔ）。低分子ＭＴＰ阻害剤は、経口剤形で日常的に投与される。患者へのＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の投与のための適切なプロトコールは、高脂血症の治療に対するＶＬＤＬアセンブリ阻害剤において行われている、大規模な臨床試験及び臨床前薬物動態試験から容易に導かれ得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤、特にＭＴＰ阻害剤、のマイクロモル以下の血清濃度は、血清ウイルス血症を低下させる。特定の実施形態において、患者において血清ウイルス血症を低下させるのに十分な時間、阻害剤の活性のあるマイクロモル以下濃度を達成するために、ＭＴＰ阻害剤１日あたり１ｍｇ／ｋｇ体重以下をヒトに投与する。例えば、ＭＴＰ阻害剤のマイクロモル以下の血清濃度を達成するために、１日あたり０．０３、０．１、０．３及び１．０ｍｇ／ｋｇ体重の経口剤形にＭＴＰ阻害剤を処方し、１日1回から４回送達させ得る。治療期間は、通常、患者による薬物の耐容性に依存して、約４週間から４ヶ月の範囲である。血清ウイルス血症の得られる低下は、当技術分野で公知の適切な方法を用いて定量的に検出され得る（例えば、Ｌｕｎｅｌら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９９）２９：５２８−３５参照）。特定の実施形態において、血清ウイルス血症の生じた低下は、治療前の力価と比較した血清ＨＣＶ ＲＮＡ力価の顕著な低下を明らかにすることにより検出される（例えば、ＮＡＳＢＡ（Ｒ）試験、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｂｏｘｔｅｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを用いて。）。特定の実施形態において、この方法の結果、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％以上血清ＨＣＶ ＲＮＡ力価が低下する。他の実施形態において、血清ウイルス血症の低下は、推論に基づき、例えば、患者のＨＣＶ症候の減少を観察することにより、又は間接的に、例えば、ＨＣＶ感染のその他のある指標の改善を示すことなどにより、検出される（例えば、治療前レベルと比較したアミノトランスフェラーゼレベルの正規化）。
【００１８】
本発明は、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤によるもの以外の機構により作用する１以上のさらなる抗ウイルス剤と組み合わせてＶＬＤＬアセンブリ阻害剤を患者に投与することを含む、ヒトにおいてＨＣＶ感染を治療するための併用療法を提供する。特定の実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、ＭＴＰの活性又はＡｐｏＢタンパク質の産生を標的とし、阻害するものであり、さらなる抗ウイルス剤はインターフェロン及び／又はリバビリンである。ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させるためのキットは、併用抗ウイルス剤を含み得る。例えば、ある実施形態において、本キットは、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤剤形の複数、好ましくは、経口投与されるカプセル又は錠剤、及びリバビリン剤形の複数を含む。あるいは、２以上の抗ウイルス剤を単一剤形中で処方し得る。本キットは、正しい毎日の投与を促すために、ブリスター包装中にパッケージ化される剤形を含み得る。具体的な実施形態において、本キットは、ＭＴＰ阻害剤剤形の複数を含み、ここで、ＭＴＰ阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択される。本キットは、経口投与可能なリバビリン及び／又はインターフェロン（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００２）３：６９３−７参照）剤形の複数をさらに含む。
【実施例１】
【００１９】
ａｐｏＢを標的とするｓｉＲＮＡで処理された細胞からの感染性ＨＣＶ粒子の分泌低下
発明者らは、Ｈｕｈ７−ＧＬ細胞、染色体に組み込まれた遺伝子型２ａＨＣＶ ｃＤＮＡを含有し、感染性ウイルスを構成的に産生するＨｕｈ７細胞の株（Ｃａｉら、２００５）に、ａｐｏＢ又は対照としてＧＦＰを標的とする二重ｓｉＲＮＡを遺伝子移入した。血清不含培地中での温置後、培養液を回収し、培地中のａｐｏＢ及びＨＣＶの量を分析した。ａｐｏＢ ｓｉＲＮＡでの細胞の遺伝子移入により、細胞内ＨＣＶ ＲＮＡに影響を与えずに、ａｐｏＢ ｍＲＮＡの量を約８０％減少させた。ａｐｏＢ ｓｉＲＮＡにより、培地中に分泌されるａｐｏＢの量が顕著に減少したが、α１−アンチトリプシンの分泌には影響がなかった。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡで遺伝子移入した対照細胞において、ＨＣＶコピー数及び力価は、４時間の温置時間の間、１０倍を超えて上昇した。ａｐｏＢ ｓｉＲＮＡを受容した細胞において、ウイルスコピー数によりアッセイした場合、この上昇は約５０％低下し、ウイルス力価によりアッセイした場合、７０％低下した。
【実施例２】
【００２０】
ＭＴＰ阻害剤 ＢＭＳ−２１０１０３８で処理された細胞からの感染性ＨＣＶ粒子の分泌低下
ＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ−２１０１３８の存在下又は非存在下でＨｕｈ７−ＧＬ細胞を温置した。血清不含培地中での温置後、培養液を回収し、培地中のＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶ力価及びａｐｏＢの量を測定した。ＭＴＰ阻害剤との細胞の温置により、ａｐｏＢの分泌は阻止されたが、α１−アンチトリプシンは阻止されなかった。ＭＴＰ阻害剤での細胞の処理により、培地中のＨＣＶ ＲＮＡの量及びウイルス力価が約８０％減少した。細胞内ＨＣＶ ＲＮＡはＭＴＰ阻害剤の非存在下又は存在下で同じままであるので、培地中のＨＣＶ量の減少はＨＣＶ ＲＮＡ合成の阻害によるものではない。阻害剤とともに温置しなかった細胞においてでさえも培地中で検出されるＨＣＶ ＲＮＡの量は細胞において見られる量の１％未満であったので、発明者らは、ＭＴＰ阻害剤で処理した細胞において細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの蓄積を観察しなかった。
【実施例３】
【００２１】
様々なＭＴＰ阻害剤がＨＣＶの細胞放出を減少させる。
実施例２に記載のようにＨｕｈ７−ＧＬ細胞を培養する。第１日に、次のＭＴＰ阻害剤：ＢＭＳ−２０１０３８（陽性対照）、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、インプリタピド、ミトラタピド及びＣＰ−３４６０８６の、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び５００ｎＭで細胞を処理する。１６時間後、第２日に、同量のＭＴＰ阻害剤の非存在下又は存在下で細胞の培地を血清不含培地に交換する。４時間温置した後、上記で調べたような培地中でのＨＣＶ ＲＮＡコピー数及び力価の低下により、試験した各阻害剤に対するウイルスの細胞放出の減少が明らかになる。
【実施例４】
【００２２】
ＭＴＰ阻害剤は血清ＨＣＶウイルス血症を低下させる。
インターフェロン単剤療法に無反応であったか不耐であった慢性ＨＣＶ感染患者でのＢＭＳ２０１０３８の効能及び安全性を評価するために、無作為二重盲検プラセボ対照試験（Ｒａｙｍｏｎｄら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（１９９８）１１月１５日；１２９（１０）：７９７−８００）を使用する。
【００２３】
患者を募集し、インターフェロン療法の少なくとも３ヶ月後に血清学的試験でＨＣＶ ＲＮＡに対して陽性である場合、登録資格がある。倦怠感、神経精神病学的障害又は血小板減少症などの重篤な副作用のためにインターフェロンに耐えることができない患者も含まれる。脂質低下薬を摂取している、妊娠している、現在薬物もしくはアルコール依存である、肝臓癌である、ＨＩＶに対して血清学的に陽性である、顆粒球の絶対数が１０００個／ｍｍ３未満であるか又は肝臓疾患の共存原因がある場合、その患者は除外する。
【００２４】
二重盲検方式で患者を無作為に割り当て、１日２回の０．１５ｍｇ／ｋｇ体重のＢＭＳ２０１０３８又は形態、色及び包装が活性薬物と同一であるプラセボの何れかの１２週間のコースを受けさせる。医師及び患者は、治療の割り当てを知らされない。規則順守について（これは錠剤数により評価する。）、及び有害反応の進展について、３週間ごとに患者を評価する。以前の臨床試験（例えば、Ｃｕｃｈｅｌら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ（２００７）３５６：１４８−５６参照）で明らかにされたように、ＢＭＳ−２０１０３８の耐容性が高いことを考えると、これらの用量及び治療期間では有害反応は予想されない。評価のための各来院において、完全血球算定を行い、電解質の血清レベル、血中尿素窒素、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルブミン及び総ビリルビンを測定する。定性的複数回逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法を用いることによって、登録前、評価のための各来院時及び最終投与から６週間後に、血清ＨＣＶ ＲＮＡの力価を評価する。５百万コピー／ｍＬまで力価を計算し；力価が５百万コピー／ｍＬより大きい場合、そのように単純に報告し、正確な値を与えない。ウイルス負荷の顕著な低下及びアミノトランスフェラーゼレベルの上昇の正規化により示されるように、血清ウイルス血症の低下によって、ＢＭＳ−２０１０３８の効能が示される。
【００２５】
上記で引用する参考文献は、そこで参照されるＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の構造及び合成のそれらの開示に対して、参照により、本明細書中に組み込まれる。
【００２６】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Ｊｉｎ Ｙｅ（市民権：中華人民共和国；居住地：Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）、Ｆａｎｇ Ｓｕｎ（市民権：中華人民共和国；居住地：Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＣＴ）、Ｈｕａ Ｈｕａｎｇ（市民権：中華人民共和国；居住地：Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）及びＭｉｃｈａｅｌ Ｇａｌｅ、Ｊｒ．（市民権：米国；居住地：Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）。
【０００２】
指定代理人：Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｙｓｔｅｍ
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ交付番号５ Ｐ０１ ＨＬ２０９４８−３０（題名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）により支援されている。米国政府はこの出願において生ずるあらゆる特許において権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
多くのウイルスは、ある一定の特別の細胞型においてのみ大量に生じ得る。古典的な例はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（フラビウイルス科の１本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルス）（Ａｐｐｅｌら、２００６）であり、これは、肝細胞によってのみ大量に分泌され得る（Ｃｈｉｓａｒｉ、２００５）。この限定に関与する因子は殆ど知られていない。ＨＣＶの場合、１つの手がかりは、トリグリセリド及びコレステロールエステルを血漿中に排出するために（Ｇｉｂｂｏｎｓら、２０００）、少なくともＨＣＶの一部が超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）（Ａｎｄｒｅら、２００２；Ｎｉｅｌｓｅｎら、２００６）、肝臓でのみ産生される球状粒子のファミリー（Ｇｉｂｂｏｎｓら、２００４）、との複合体となり血漿中で循環するという実験結果から得られる。ＨＣＶ及びＶＬＤＬは一緒に循環するが、ウイルスのアセンブリ又は分泌におけるＶＬＤＬに対する役割は明らかになっていない。
【０００４】
全てのプラス鎖ＲＮＡウイルスに関して、細胞質膜と関連してＨＣＶ ＲＮＡ複製が起こる。ＨＣＶの場合、ＨＣＶのサブゲノムレプリコンを有する培養ヒト肝臓癌Ｈｕｈ７細胞において、「膜性ウェブ（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｗｅｂｓ）」と呼ばれるこれらの構造が視覚化された（Ｇｏｓｅｒｔら、２００３；Ｍｏｒａｄｐｏｕｒら、２００４）。これらのレプリコンは、非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂに対するコード配列を含む、ＲＮＡ複製に対する必須のエレメントを含有する改変ＨＣＶ ＲＮＡ分子である（Ｌｏｈｍａｎｎら、１９９９）。Ｈｕｈ７細胞への遺伝子移入後、レプリコンＲＮＡは複製するが、これはウイルスのアセンブリ及び分泌に必要な構造タンパク質をコードしないので、感染性ウイルス粒子を産生しない（Ｌｏｈｍａｎｎら、１９９９）。ＨＣＶ複製複合体を有する膜性ウェブは単離されておらず、それらの組成は未知である。
【０００５】
ＶＬＤＬアセンブリは現在、２つの異なる段階で起こると考えられている（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ及びＳｅｌｌｅｒｓ、２００１）。第一段階において、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）は、新生アポリポタンパク質Ｂ、ＶＬＤＬを構造的に完全なものにする巨大な５４０Ｋｄａタンパク質、に脂質を輸送する（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ及びＢｏｒｅｎ、２００５）。十分な脂質結合なしで、ａｐｏＢはユビキチン化され、翻訳中に分解される（Ａｖｒａｍｏｇｌｕ及びＡｄｅｌｉ、２００４）。ＶＬＤＬアセンブリの第一段階で産生されるａｐｏＢ含有脂質粒子が含有するトリグリセリドは限られた量である（Ｇｕｓａｒｏｖａら、２００３）。第二段階において、ａｐｏＢ含有前駆体粒子は、内腔コンパートメントでトリグリセリド滴と融合し（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ及びＳｅｌｌｅｒｓ、２００１）、段階はおそらく、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）（ＶＬＤＬの別の主要なタンパク質成分）により促進される（Ｍｅｎｓｅｎｋａｍｐら、２００１）。直接的な融合現象に対して必須ではないが、細胞質から内腔コンパートメントへトリグリセリドを輸送するためにＭＴＰが必要とされる（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ及びＳｅｌｌｅｒｓ、２００１）。ヒト及びマウスにおいて、ＭＴＰにおける遺伝子異常によりＶＬＤＬ分泌が大きく減少する（Ｓｈａｒｐら、１９９３；Ｒａａｂｅら、１９９８）。ＶＬＤＬアセンブリの第一段階が小胞体（ＥＲ）で起こることが知られている一方で（Ｇｕｓａｒｏｖａら、２００３）、第二段階の正確な場所は意見の分かれるところである（Ｆｉｓｈｅｒ及びＧｉｎｓｂｅｒｇ、２００２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｐｅｌ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，９８３３−９８３６．
【非特許文献２】Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３６，９３０−９３２．
【非特許文献３】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄｓ １４８３，３７−５７．
【非特許文献４】Ａｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００２．
【非特許文献５】Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｓ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２４１８−２４２８．
【非特許文献６】Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｇ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｓｏｃ．ｔｒａｎｓ．３２，５９−６４．
【非特許文献７】Ｇｏｓｅｒｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，５４８７−５４９２．
【非特許文献８】Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８，７４００−７４０９．
【非特許文献９】Ｌｏｈｍａｎｎ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８５，１１０−１１３．
【非特許文献１０】Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｒｓ，２００１．
【非特許文献１１】Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｓ．Ｏ．ａｎｄ Ｂｏｒｅｎ，Ｊ．（２００５）Ｊ．ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５８，３９５−４１０．
【非特許文献１２】Ａｖｒａｍｏｇｌｕ，Ｒ．Ｋ．ａｎｄ Ａｄｅｌｉ，Ｋ．（２００４）Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．５，２９３−３０１．
【非特許文献１３】Ｇｕｓａｒｏｖａ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，４８０５１−４８０５８．
【非特許文献１４】Ｍｅｎｓｅｎｋａｍｐ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３５，８１６−８２２．
【非特許文献１５】Ｓｈａｒｐ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６５−６９．
【非特許文献１６】Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｈ．Ｎ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，１７３７７−１７３８０．
【発明の概要】
【０００７】
ある態様において、本発明は、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させることと；ｂ）細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することと、を含む、ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害する方法である。特定の実施形態において、この細胞を阻害剤のマイクロモル以下の量と接触させる。様々な実施形態において、この阻害剤は、ＭＴＰ阻害剤又は、アポリポタンパク質Ｂに対する、低分子干渉ＲＮＡもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、この接触段階は、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤に細胞を接触させることをさらに含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をＨＣＶ感染者に投与することと；ｂ）ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症の生じた低下を検出することと、を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させる方法である。特定の実施形態において、血清ウイルス血症の低下は、ＭＴＰ阻害剤などのＶＬＤＬアセンブリ阻害剤のマイクロモル以下の濃度により達成される。様々なその他の実施形態において、この阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択されるＭＴＰ阻害剤である。別の実施形態において、この阻害剤は、アポリポタンパク質Ｂに対する低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばＩＳＩＳ ３０１０１２など、である。特定の実施形態において、この接触段階は、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤と細胞を接触させることをさらに含む。
【０００９】
本発明の別の態様は、ａ）ＭＴＰ阻害剤剤形の複数と；ａ）リバビリン剤形の複数と、を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させるためのキットである。具体的な実施形態において、ＭＴＰ阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択される。
【００１０】
本発明の特定の実施形態の詳細な説明
発明者らは、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させることと；ｂ）細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することと、を含む、ＨＣＶ感染細胞からのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の放出を阻害する方法を記載する。
【００１１】
ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、好ましくは、ＭＴＰの活性を阻害する又はＡｐｏＢタンパク質の産生を限定することにより、ＶＬＤＬのアセンブリ及び分泌を阻止する。
【００１２】
ある実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、ＡｐｏＢに対する、低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一例として、ＩＳＩＳ ３０１０１２は、ヒトＡｐｏＢ−１００を標的とする臨床開発中のアンチセンスオリゴヌクレオチドである（Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００６）８：４６１−７）。
【００１３】
特定の実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、ＭＴＰに結合しＭＴＰ活性を阻害する分子であり、好ましくは、マイクロモル以下の濃度でＭＴＰ活性を阻害する合成（即ち非天然）分子である。合成ＭＴＰ阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０（例えば、Ｊａｍｉｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９９６）９３：１１９９１−５参照）、ＢＭＳ−２１２１２２（例えば、Ｒｏｂｌら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．（２００１）４４：８５１−６参照）、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３として開発中；例えば、Ｓｕｌｓｋｙら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．（２００４）１４：５０６７−７０参照）、ＢＭＳ−１９７６３６（例えば、Ｗａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４：２７７９３−８００参照）、ＪＴＴ−１３０（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌら、ＢＭＣ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓｏｒｄ（２００５）５：３０；及びＢｕｒｎｅｔｔ、ＩＤｒｕｇｓ（２００６）９：４９５−９参照）、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７としても知られる；例えば、Ｖｅｒｒｅｃｋら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（２００４）９３：１２１７−２８参照）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２としても知られる；例えば、Ｕｅｓｈｉｍａら、Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（２００５）２８：２４７−５２参照）、ＣＰ−３４６０８６（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２００３）４４：１８８７−９０１参照）、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０（例えば、米国特許第５，９１９，７９５号参照）など、当技術分野で周知である。
【００１４】
本発明は、細胞からのＨＣＶ放出の阻害について（これは、インビトロ又はＨＣＶ感染に対する動物モデルであるチンパンジーでのインシトゥであり得る。）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をスクリーニングするのに有用な方法を包含する。これらの実施形態において、細胞によりＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の取り込みを達成するのに適切な何らかの方法を用いて接触段階が達成される。例えば、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、インビトロで細胞にｓｉＲＮＡを遺伝子移入し得る。上述のＭＴＰ阻害剤などの低分子阻害剤を培養において細胞の培地に単純に添加し得る。ＭＴＰ阻害アッセイを用いて、本方法での使用のためのさらなるＭＴＰ阻害剤を同定することができ（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．（２００３）４４：１８８７−９０１参照）、場合によっては、チンパンジーでさらに確認することができる。特定の実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤のマイクロモル以下の量と細胞を接触させる。例えば、細胞は、１０００ｎＭ未満、好ましくは５００、２５０、１００又は１０ｎＭ未満の培地中濃度を達成するためのＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の量が添加される培養液中にあり得る。実施例２に記載のＨＣＶ放出アッセイなどの何らかの適切な方法を用いて、ＨＣＶ放出の得られる阻害を検出する。ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤がリバビリン及び／又はインターフェロンなどのその他の抗ウイルス剤とともに有する相加又は相乗効果を評価するために、本発明を使用することができる。従って、本発明の接触段階は、インターフェロン及び／又はリバビリンから選択される抗ウイルス剤と細胞を接触させることをさらに含み得る。
【００１５】
本発明は、ＨＣＶ感染者において血清ウイルス血症を低下させる方法を包含し、この方法は、ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をＨＣＶ感染者に投与することと；ｂ）ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症の生じた低下を検出することと、を含む。接触段階の前に、患者は、好ましくは、ＨＣＶ感染を有するものとして診断されており、この診断は、何らかの医学的に許容可能な方法によるものであり得る。ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、高脂血症の治療に対して使用されている又は開発中の既知の薬物であり得る。
【００１６】
ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をヒトに投与するための適用可能なプロトコールは、当技術分野で公知であり、日常的に最適化される。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ３０１０１２は、経口及び非経口投与経路によるバイオアベイラビリティーを示す（Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ２００５ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔ）。低分子ＭＴＰ阻害剤は、経口剤形で日常的に投与される。患者へのＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の投与のための適切なプロトコールは、高脂血症の治療に対するＶＬＤＬアセンブリ阻害剤において行われている、大規模な臨床試験及び臨床前薬物動態試験から容易に導かれ得る。
【００１７】
好ましい実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤、特にＭＴＰ阻害剤、のマイクロモル以下の血清濃度は、血清ウイルス血症を低下させる。特定の実施形態において、患者において血清ウイルス血症を低下させるのに十分な時間、阻害剤の活性のあるマイクロモル以下濃度を達成するために、ＭＴＰ阻害剤１日あたり１ｍｇ／ｋｇ体重以下をヒトに投与する。例えば、ＭＴＰ阻害剤のマイクロモル以下の血清濃度を達成するために、１日あたり０．０３、０．１、０．３及び１．０ｍｇ／ｋｇ体重の経口剤形にＭＴＰ阻害剤を処方し、１日1回から４回送達させ得る。治療期間は、通常、患者による薬物の耐容性に依存して、約４週間から４ヶ月の範囲である。血清ウイルス血症の得られる低下は、当技術分野で公知の適切な方法を用いて定量的に検出され得る（例えば、Ｌｕｎｅｌら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９９）２９：５２８−３５参照）。特定の実施形態において、血清ウイルス血症の生じた低下は、治療前の力価と比較した血清ＨＣＶ ＲＮＡ力価の顕著な低下を明らかにすることにより検出される（例えば、ＮＡＳＢＡ（Ｒ）試験、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ、Ｂｏｘｔｅｌ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを用いて。）。特定の実施形態において、この方法の結果、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％以上血清ＨＣＶ ＲＮＡ力価が低下する。他の実施形態において、血清ウイルス血症の低下は、推論に基づき、例えば、患者のＨＣＶ症候の減少を観察することにより、又は間接的に、例えば、ＨＣＶ感染のその他のある指標の改善を示すことなどにより、検出される（例えば、治療前レベルと比較したアミノトランスフェラーゼレベルの正規化）。
【００１８】
本発明は、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤によるもの以外の機構により作用する１以上のさらなる抗ウイルス剤と組み合わせてＶＬＤＬアセンブリ阻害剤を患者に投与することを含む、ヒトにおいてＨＣＶ感染を治療するための併用療法を提供する。特定の実施形態において、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤は、ＭＴＰの活性又はＡｐｏＢタンパク質の産生を標的とし、阻害するものであり、さらなる抗ウイルス剤はインターフェロン及び／又はリバビリンである。ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させるためのキットは、併用抗ウイルス剤を含み得る。例えば、ある実施形態において、本キットは、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤剤形の複数、好ましくは、経口投与されるカプセル又は錠剤、及びリバビリン剤形の複数を含む。あるいは、２以上の抗ウイルス剤を単一剤形中で処方し得る。本キットは、正しい毎日の投与を促すために、ブリスター包装中にパッケージ化される剤形を含み得る。具体的な実施形態において、本キットは、ＭＴＰ阻害剤剤形の複数を含み、ここで、ＭＴＰ阻害剤は、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択される。本キットは、経口投与可能なリバビリン及び／又はインターフェロン（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００２）３：６９３−７参照）剤形の複数をさらに含む。
【実施例１】
【００１９】
ａｐｏＢを標的とするｓｉＲＮＡで処理された細胞からの感染性ＨＣＶ粒子の分泌低下
発明者らは、Ｈｕｈ７−ＧＬ細胞、染色体に組み込まれた遺伝子型２ａＨＣＶ ｃＤＮＡを含有し、感染性ウイルスを構成的に産生するＨｕｈ７細胞の株（Ｃａｉら、２００５）に、ａｐｏＢ又は対照としてＧＦＰを標的とする二重ｓｉＲＮＡを遺伝子移入した。血清不含培地中での温置後、培養液を回収し、培地中のａｐｏＢ及びＨＣＶの量を分析した。ａｐｏＢ ｓｉＲＮＡでの細胞の遺伝子移入により、細胞内ＨＣＶ ＲＮＡに影響を与えずに、ａｐｏＢ ｍＲＮＡの量を約８０％減少させた。ａｐｏＢ ｓｉＲＮＡにより、培地中に分泌されるａｐｏＢの量が顕著に減少したが、α１−アンチトリプシンの分泌には影響がなかった。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡで遺伝子移入した対照細胞において、ＨＣＶコピー数及び力価は、４時間の温置時間の間、１０倍を超えて上昇した。ａｐｏＢ ｓｉＲＮＡを受容した細胞において、ウイルスコピー数によりアッセイした場合、この上昇は約５０％低下し、ウイルス力価によりアッセイした場合、７０％低下した。
【実施例２】
【００２０】
ＭＴＰ阻害剤 ＢＭＳ−２１０１０３８で処理された細胞からの感染性ＨＣＶ粒子の分泌低下
ＭＴＰ阻害剤ＢＭＳ−２１０１３８の存在下又は非存在下でＨｕｈ７−ＧＬ細胞を温置した。血清不含培地中での温置後、培養液を回収し、培地中のＨＣＶ ＲＮＡ、ＨＣＶ力価及びａｐｏＢの量を測定した。ＭＴＰ阻害剤との細胞の温置により、ａｐｏＢの分泌は阻止されたが、α１−アンチトリプシンは阻止されなかった。ＭＴＰ阻害剤での細胞の処理により、培地中のＨＣＶ ＲＮＡの量及びウイルス力価が約８０％減少した。細胞内ＨＣＶ ＲＮＡはＭＴＰ阻害剤の非存在下又は存在下で同じままであるので、培地中のＨＣＶ量の減少はＨＣＶ ＲＮＡ合成の阻害によるものではない。阻害剤とともに温置しなかった細胞においてでさえも培地中で検出されるＨＣＶ ＲＮＡの量は細胞において見られる量の１％未満であったので、発明者らは、ＭＴＰ阻害剤で処理した細胞において細胞内ＨＣＶ ＲＮＡの蓄積を観察しなかった。
【実施例３】
【００２１】
様々なＭＴＰ阻害剤がＨＣＶの細胞放出を減少させる。
実施例２に記載のようにＨｕｈ７−ＧＬ細胞を培養する。第１日に、次のＭＴＰ阻害剤：ＢＭＳ−２０１０３８（陽性対照）、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、インプリタピド、ミトラタピド及びＣＰ−３４６０８６の、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ及び５００ｎＭで細胞を処理する。１６時間後、第２日に、同量のＭＴＰ阻害剤の非存在下又は存在下で細胞の培地を血清不含培地に交換する。４時間温置した後、上記で調べたような培地中でのＨＣＶ ＲＮＡコピー数及び力価の低下により、試験した各阻害剤に対するウイルスの細胞放出の減少が明らかになる。
【実施例４】
【００２２】
ＭＴＰ阻害剤は血清ＨＣＶウイルス血症を低下させる。
インターフェロン単剤療法に無反応であったか不耐であった慢性ＨＣＶ感染患者でのＢＭＳ２０１０３８の効能及び安全性を評価するために、無作為二重盲検プラセボ対照試験（Ｒａｙｍｏｎｄら、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．（１９９８）１１月１５日；１２９（１０）：７９７−８００）を使用する。
【００２３】
患者を募集し、インターフェロン療法の少なくとも３ヶ月後に血清学的試験でＨＣＶ ＲＮＡに対して陽性である場合、登録資格がある。倦怠感、神経精神病学的障害又は血小板減少症などの重篤な副作用のためにインターフェロンに耐えることができない患者も含まれる。脂質低下薬を摂取している、妊娠している、現在薬物もしくはアルコール依存である、肝臓癌である、ＨＩＶに対して血清学的に陽性である、顆粒球の絶対数が１０００個／ｍｍ３未満であるか又は肝臓疾患の共存原因がある場合、その患者は除外する。
【００２４】
二重盲検方式で患者を無作為に割り当て、１日２回の０．１５ｍｇ／ｋｇ体重のＢＭＳ２０１０３８又は形態、色及び包装が活性薬物と同一であるプラセボの何れかの１２週間のコースを受けさせる。医師及び患者は、治療の割り当てを知らされない。規則順守について（これは錠剤数により評価する。）、及び有害反応の進展について、３週間ごとに患者を評価する。以前の臨床試験（例えば、Ｃｕｃｈｅｌら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ（２００７）３５６：１４８−５６参照）で明らかにされたように、ＢＭＳ−２０１０３８の耐容性が高いことを考えると、これらの用量及び治療期間では有害反応は予想されない。評価のための各来院において、完全血球算定を行い、電解質の血清レベル、血中尿素窒素、クレアチニン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルブミン及び総ビリルビンを測定する。定性的複数回逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法を用いることによって、登録前、評価のための各来院時及び最終投与から６週間後に、血清ＨＣＶ ＲＮＡの力価を評価する。５百万コピー／ｍＬまで力価を計算し；力価が５百万コピー／ｍＬより大きい場合、そのように単純に報告し、正確な値を与えない。ウイルス負荷の顕著な低下及びアミノトランスフェラーゼレベルの上昇の正規化により示されるように、血清ウイルス血症の低下によって、ＢＭＳ−２０１０３８の効能が示される。
【００２５】
上記で引用する参考文献は、そこで参照されるＶＬＤＬアセンブリ阻害剤の構造及び合成のそれらの開示に対して、参照により、本明細書中に組み込まれる。
【００２６】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させることと；及び
ｂ）細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することと、
を含む、ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害する方法。
【請求項２】
細胞が、阻害剤のマイクロモル以下の量と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
阻害剤が、マイクロモル以下の量のＭＴＰ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｂに対する、低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
接触段階が、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤に細胞を接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をＨＣＶ感染者に投与することと；及び
ｂ）ＨＣＶ感染者における血清ウイルス血症の生じた低下を検出することと、
を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させる方法。
【請求項７】
血清ウイルス血症の低下が、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤のマイクロモル以下の濃度により達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
阻害剤がＭＴＰ阻害剤であり、血清ウイルス血症の低下がＭＴＰ阻害剤のマイクロモル以下の濃度により達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｂに対する、低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤がＩＳＩＳ ３０１０１２である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤が、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択されるＭＴＰ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
投与段階が、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤を感染者に投与することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ＭＴＰ阻害剤剤形の複数と；及び
ａ）リバビリン剤形の複数と、
を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させるためのキット。
【請求項１５】
ＭＴＰ阻害剤が、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【請求項１】
ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤と細胞を接触させることと；及び
ｂ）細胞からのＨＣＶ放出の生じた阻害を検出することと、
を含む、ＨＣＶ感染細胞からのＨＣＶの放出を阻害する方法。
【請求項２】
細胞が、阻害剤のマイクロモル以下の量と接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
阻害剤が、マイクロモル以下の量のＭＴＰ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｂに対する、低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
接触段階が、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤に細胞を接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤をＨＣＶ感染者に投与することと；及び
ｂ）ＨＣＶ感染者における血清ウイルス血症の生じた低下を検出することと、
を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させる方法。
【請求項７】
血清ウイルス血症の低下が、ＶＬＤＬアセンブリ阻害剤のマイクロモル以下の濃度により達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
阻害剤がＭＴＰ阻害剤であり、血清ウイルス血症の低下がＭＴＰ阻害剤のマイクロモル以下の濃度により達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｂに対する、低分子干渉ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
阻害剤が、アポリポタンパク質Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
阻害剤がＩＳＩＳ ３０１０１２である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤が、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択されるＭＴＰ阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
投与段階が、インターフェロン及びリバビリンから選択される抗ウイルス剤を感染者に投与することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）ＭＴＰ阻害剤剤形の複数と；及び
ａ）リバビリン剤形の複数と、
を含む、ＨＣＶ感染者の血清ウイルス血症を低下させるためのキット。
【請求項１５】
ＭＴＰ阻害剤が、ＢＭＳ−２００１５０、ＢＭＳ−２１２１２２、ＢＭＳ−２０１０３８（ＡＥＲＧ−７３３）、ＢＭＳ−２０１０３０、ＢＭＳ−１９７６３６、ＪＴＴ−１３０、ミトラタピド（Ｒ−１０３７５７）、インプリタピド（ＢＡＹ−１３９９５２）、ＣＰ−３４６０８６、ＣＰ−４６７６８８及びＣＰ−３１９３４０からなる群から選択される、請求項１４に記載のキット。
【公開番号】特開２０１３−４７２３７（Ｐ２０１３−４７２３７Ａ）
【公開日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−２２０９６２（Ｐ２０１２−２２０９６２）
【出願日】平成２４年１０月３日（２０１２．１０．３）
【分割の表示】特願２００９−５４７３５４（Ｐ２００９−５４７３５４）の分割
【原出願日】平成２０年１月１５日（２００８．１．１５）
【出願人】（５０００３９４６３）ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−２２０９６２（Ｐ２０１２−２２０９６２）
【出願日】平成２４年１０月３日（２０１２．１０．３）
【分割の表示】特願２００９−５４７３５４（Ｐ２００９−５４７３５４）の分割
【原出願日】平成２０年１月１５日（２００８．１．１５）
【出願人】（５０００３９４６３）ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム (115)
【Ｆターム（参考）】
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