Ｃ型肝炎ウイルス株の評価方法およびその利用
【課題】Ｃ型肝炎ウイルス株の発癌性の評価方法およびその利用を提供する。
【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【解決手段】Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス株の評価方法およびその利用に関し、具体的には、Ｃ型肝炎ウイルスが高発癌性か否かを評価し、当該Ｃ型肝炎ウイルス株の感染による肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法等の利用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科に属するＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と称する場合がある。）は慢性肝疾患の主要な原因ウイルスであり、感染者の１５〜２０％に肝硬変をおこす。そして、肝硬変患者では年率１〜４％の割合で原発性肝細胞癌（肝癌）が発生する。我が国では、肝硬変患者が肝癌を発症する頻度は年率７％といわれ、ＨＣＶ感染者の約３０％あるいはそれ以上が確実に肝癌になると推測されている。
【０００３】
ＨＣＶのゲノム（遺伝子）は、１本鎖プラス鎖の約９６００塩基のＲＮＡからなり、一つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し、約３０００アミノ酸残基からなる前駆体タンパク質をコードしている。この前駆体タンパク質は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼとウイルス遺伝子にコードされる２種類のプロテアーゼ（ＨＣＶ亜鉛プロテアーゼおよびＨＣＶセリンプロテアーゼ）によりプロセシングされ、コア、エンベロープ１（Ｅ１）、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの１０種類のウイルスタンパク質を生じる。ＮＳ３を含め、ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂはウイルス粒子を構成しないが、ウイルスの増殖には必須の非構造タンパク質である。
【０００４】
ウイルスゲノムは変異に富んでおり、それに基づいてＨＣＶは７種類のゲノタイプと７０種類以上のサブタイプに分類されている。サブタイプ１ｂ型は日本を含むアジア地域で最も頻度の高いサブタイプで、アジア以外でも、欧米を含む世界中どこにでも多く検出される。一般的に、サブタイプ１ｂ型は他のサブタイプに比べてインターフェロン感受性が低く、また、肝癌をおこしやすいことが知られている。一方、ゲノタイプやサブタイプに関連する差異以外に、同じサブタイプ内でもウイルス株によって様々な性質の違いがあることも観察されている。例えば、サブタイプ１ｂ型のＨＣＶにおけるＮＳ５Ａのアミノ酸配列の違いによって、インターフェロン感受性や血中ウイルス量の異なることが報告されている。
【０００５】
ここで、非構造タンパク質であるＮＳ３は、そのアミノ末端領域にセリンプロテアーゼを、またカルボキシル末端にＮＴＰ分解酵素やヘリカーゼをコードしている。ＮＳ３のアミノ末端領域はＮＳ４Ａと結合し、これを介してＮＳ３が安定化され、そのセリンプロテアーゼ活性が亢進される。ＮＳ３は、このようなウイルス増殖に不可欠な酵素活性以外に、肝癌の発生に関わっていると考えられている。例えば、ＮＳ３のアミノ末端領域が培養細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を悪性形質転換（癌化）させることが報告されている（非特許文献１，２）。
【０００６】
本発明者も、ＮＳ３のアミノ末端領域がｐ５３癌抑制タンパク質と相互作用すること、およびその相互作用はＮＳ３アミノ末端領域の配列によって異なることを報告している（非特許文献３〜５）。また、ＮＳ３のアミノ末端領域の２次構造を解析して高発癌性ＨＣＶ株を同定する技術（特許文献１）、さらにＮＳ３アミノ末端領域においてｐ５３癌抑制タンパク質との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、新規医薬のスクリーニング方法を開発している（特許文献２）。
【０００７】
一方、ＨＣＶのコアタンパク質はウイルス粒子内部のカプシドを構成するのみならず、細胞死や細胞の癌化に重要な役割を果たしている。臨床的にも、コアタンパク質における特定のアミノ酸変異と肝癌の発症頻度が密接に関連する可能性が指摘されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２１０１８１号公報（２００３年７月２９日公開）
【特許文献２】特開２００６−０７５０３８号公報（２００６年３月２３日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sakamuro, D., T. Furukawa, and T. Takegami. 1995. Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 transforms NIH3T3 cells. J. Virol. 69: p3893-3896.
【非特許文献２】He, Q. Q., R. X. Cheng, Y. Sun, D. Y. Feng, Z. C. Chen, and H. Zeng. 2003. Hepatocyte transformation and tumor development induced by hepatitis C virus NS3 C-terminal deleted protein. World J. Gastroenterol. 9: p474-478.
【非特許文献３】Ishido, S., and H. Hotta. 1998. Complex formation of the nonstructural protein 3 of hepatitis C virus with the p53 tumor suppressor. FEBS Lett. 438: p258-262.
【非特許文献４】Ishido, S., T. Fujita, and H. Hotta. 2000. Possible involvement of the NS3 protein of hepatitis C virus in hepatocarcinogenesis: Its interaction with the p53 tumor suppressor, p. 37-55. In N. A. Habib, (ed.), Hepatocellular Carcinoma: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ.
【非特許文献５】Muramatsu, S., S. Ishido, T, Fujita, M. Itoh, and H. Hotta. 1997. Nuclear localization of the NS3 protein of hepatitis C virus and factors affecting the localization. J. Virol. 71: p4954-4961.
【非特許文献６】Kobayashi M, Akuta N, Suzuki F, Hosaka T, Sezaki H, Kobayashi M, Suzuki Y, Arase Y, Ikeda K, Watahiki S, Mineta R, Iwasaki S, Miyakawa Y, Kumada H. Influence of amino-acid polymorphism in the core protein on progression of liver disease in patients infected with hepatitis C virus genotype 1b. J Med Virol. 82(1):41-48, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、ＨＣＶの感染は肝癌の発症リスクを高くすることが知られているが、その発症リスクを予測する技術の開発は十分ではない。特にＨＣＶ株が高発癌性か否かを評価し、ＨＣＶ感染に起因する肝癌の発症リスクを予測するための技術開発が強く要望されている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＨＣＶ株の発癌性の評価方法およびその利用技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位に特定のアミノ酸残基を有するウイルス株が高発癌性であること、さらにコアタンパク質の第７０位のアミノ酸残基も指標とすることで、高発癌性のＨＣＶ株をより正確に同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１３】
１．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１４】
２．さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第７０位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とする２に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１５】
３．上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である１に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１６】
４．上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である２に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１７】
５．Ｃ型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、１〜４のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含む肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法。
【００１８】
６．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【００１９】
７．以下の（ｉ）〜（ｉｖ）いずれかに記載の試薬を含む６に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物；
（ｉｖ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【００２０】
８．さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含む６または７に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【００２１】
９．以下の（ｖ）または（ｖｉ）に記載の試薬を含む８に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｖ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｖｉ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ＨＣＶ株が高発癌性であるか否かを簡便かつ正確に評価することができる。それゆえ、ＨＣＶ感染患者における肝癌の発症リスクを判定することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】肝癌症例におけるＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株とＣｏｒｅ−Ｑ７０株の比率を表す図である。
【図２】非肝癌症例におけるＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株とＣｏｒｅ−Ｑ７０株の比率を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、本明細書に記載した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。また、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、「核酸分子」、「ＤＮＡ」または「ＲＮＡ」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
【００２５】
＜１．本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価方法＞
本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価方法は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするものであればよく、その他の構成は限定されるものではない。
【００２６】
本発明が対象とするＨＣＶのＮＳ３タンパク質は、上述したように、ＨＣＶの非構造タンパク質であり、これまでも発癌性に関与することが示唆されている。今回、本発明者は、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであるＨＣＶ株は、高発癌性であることを確認した（実施例参照）。
【００２７】
本発明でいう「ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域」とは、特に解析対象とするＮＳ３タンパク質におけるアミノ末端側の第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出できればよく、長さ等の具体的な領域については特に限定されないが、例えば、ＮＳ３タンパク質におけるアミノ末端側１〜１２０番目のアミノ酸配列領域を挙げることができる（配列番号１）。もちろん、本発明の趣旨に沿う範囲内で、上記配列の前後に１〜数十アミノ酸残基が付加あるいは欠損していても構わない。
【００２８】
配列表の配列番号１に「ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域」の一例を示すが、配列番号１に示すアミノ酸配列では、第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンである。なお、この１〜１２０番目のアミノ酸配列は、ＨＣＶ遺伝子がコードする全アミノ酸配列のうち１０２７〜１１４６番目までのアミノ酸配列に相当する。また配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする塩基配列を配列番号２に示す。ＨＣＶ遺伝子の全ゲノムの塩基配列およびアミノ酸配列は、上記特許文献１に記載されている。
【００２９】
また本発明では、上記のＮＳ３タンパク質を指標とした評価方法に加えて、さらにＨＣＶのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第７０位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることが好ましい。
【００３０】
従来、ＨＣＶのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基がアルギニンからグルタミンに変異している場合、高発癌性の可能性が高いことが報告されている（非特許文献６）。本発明者は、ＨＣＶのコアタンパク質における第７０位のグルタミン残基のみを指標としてＨＣＶの発癌性を評価する場合に比べ、上述したようにＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基の検出と組み合わせることによって、ＨＣＶ株の発癌性をより正確に評価できることを確認している（実施例参照）。
【００３１】
配列番号３にＨＣＶのコアタンパク質のアミノ酸配列を示すが、第７０位はグルタミンである。もちろん、本発明の趣旨に沿う範囲内で、上記配列の前後に数〜数十アミノ酸残基が付加あるいは欠損していても構わない。また、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するコアタンパク質をコードする塩基配列を配列番号４に示す。
【００３２】
ここで、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質は、ＨＣＶの種々のゲノタイプ（genotype）およびサブタイプにおいて高度に保存されているため、本発明が対象とするＨＣＶのゲノタイプおよびサブタイプについては特に限定されず、７種類のゲノタイプと７０種類以上のサブタイプのいずれをも対象とできる。例えば、ゲノタイプでいうと、１ａ型、１ｂ型、１ｃ型、２ａ型、２ｂ型、２ｃ型、３ａ型、３ｂ型、４型、５ａ型および６ｂ型を対象とすることができる。なかでも、サブタイプ１ｂ型を対象とすることが好ましい。サブタイプ１ｂ型は日本を含むアジア地域で最も頻度の高いサブタイプで、アジア以外でも、欧米を含む世界中どこにでも多く検出されるため、高発癌性か否かを検出するニーズは極めて高い。
【００３３】
ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域および／またはコアタンパク質のアミノ酸残基を検出する工程においては、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる方法を例示できる。すなわち、上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である。また、上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である。
【００３４】
例えば、上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドを用いる場合、(i) 上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を含む領域についてＰＣＲを行い、ＳＳＣＰ法で検出する方法、(ii) 上記領域でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に対する制限酵素の切断様式から検出する方法、(iii) 同ＰＣＲ産物を直接シーケンシングして、配列を決定する方法、(iv) 上記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、検出対象のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせるＡＳＯ（allele specific oligonucleotide）法、(v) 上記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して質量分析装置等で検出する方法など、公知の方法を用いることにより行うことができる。なお、ＨＣＶのゲノムはＲＮＡであるため、必要に応じて、逆転写反応によりＤＮＡとする工程を前処理工程として設けてもよい。上記の例示はＮＳ３タンパク質をコードする遺伝子について述べたが、コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドについても、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を含む領域に関して、同様に検出することができる。
【００３５】
より具体的には、上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）の場合、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列に相当する１６６〜１６８位がｔａｔ（アデニン、チミン、アデニン）またはｔａｃ（アデニン、チミン、シトシン）であるか否かを検出する方法（ただし、これらのオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、配列表中の塩基記号「ｔ（チミン）」は「ｕ（ウラシル）」に読み替えるものとする）、またＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列に相当する２５６〜２５８位がｃａａ（シトシン、アデニン、アデニン）またはｃａｇ（シトシン、アデニン、グアニン）であるか否かを検出する方法を挙げることができる。
【００３６】
また、コアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）において、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列に相当する２０８〜２１０位がｃａａ（シトシン、アデニン、アデニン）またはｃａｇ（シトシン、アデニン、グアニン）であるか否かを検出する方法を挙げることができる。
【００３７】
具体的には、本発明に係る評価方法は、例えば、ＨＣＶ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＲＮＡおよびその逆転写ＤＮＡ産物等）に含まれるＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子および／またはコアタンパク質をコードする遺伝子を対象として、配列番号２の１６６〜１６８位および２５６〜２５８位、あるいは配列番号４の２０８〜２１０位を含む領域の塩基配列を検出することで実施できる。
【００３８】
すなわち、本発明の一実施形態として、ＨＣＶ感染患者の血清あるいは肝細胞組織等からＨＣＶの遺伝子（ゲノムＲＮＡ）を含む試料を調製し、逆転写反応を行って上記ＨＣＶ遺伝子から鋳型となるＤＮＡを作製した後、後述のプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行い（すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行い）、遺伝子上のＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド、および／またはコアタンパク質をコードするポリヌクレオチドが増幅された増幅ＤＮＡ断片を取得し、当該増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法を挙げることができる。
【００３９】
ここで、上記ＲＴ−ＰＣＲ反応では、まず逆転写反応により、上記ＨＣＶゲノムを含む試料からｃＤＮＡを作製する。次に、このｃＤＮＡを鋳型にして２度のＰＣＲ反応を行う。より具体的には、一組のプライマーセットを用いて１回目のＰＣＲによる増幅反応を行い、その後さらに、他の一組のプライマーを用いて２回目のＰＣＲによる増幅反応を行う。これにより、ＨＣＶゲノム上のＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドが増幅された増幅ＤＮＡ断片を取得することができる。
【００４０】
上記１回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、例えば、後述する実施例で用いている配列番号５，６に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーは、日本遺伝子データバンクに登録（登録番号Ｄ９０２０８）されているＨＣＶ−１ｂのプロトタイプ（以下、これを「ＨＣＶ−Ｊ」という）の遺伝子配列においては、３２９５番目から３３１６番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、４０１９番目から４０４０番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。なお、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列の全長は、上記特許文献１に記載されている配列番号５，６を適宜参照できる。
【００４１】
また、上記２回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、配列番号７，８に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、３３９０番目から３４０７番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、３９８５番目から４００６番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。
【００４２】
また、コアタンパク質についても同様の手法を用いることができる。具体的には、１回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとして、例えば、後述する実施例で用いている配列番号９，１０に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーは、ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列においては、２５９番目から２７９番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、９６３番目から９８１番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。
【００４３】
また、２回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、配列番号１１，１２に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、２７６番目から２９５番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、９３０番目から９５２番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。
【００４４】
なお、詳細な条件等については、公知の方法（例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)）を適宜参考できる。
【００４５】
また、逆転写反応についても従来公知の手法を利用でき特に限定されないが、例えば、文献（Verma, I.M. (1974) In: The Enzymes, Boyer, P.D., ed., Academic Press, NY, 87. 、Kacian, D,L. (1977) Meth. Virol. 6, 143. 、Houts, G.E. et al. (1979) J. Virol. 29, 517. 、Roth, M.J., Tanese, N. and Goff, S.P. (1985) J. Biol, Chem. 260, 9326. 、Tanese, N. and Goff, S. P. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1777（1988） 、Gerard, G.F. and D'Alessio, J. (1993) In: Methods in Molecular Biology, Vol. 16: Enzymes of Molecular Biology, Burrell, M.M., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 73. 、Eun, H.-M. (1996) Enzymology Primer for Recombinant DNA Technology, Academic Press, San Diego, CA, 427.）等に基づいて行うことができる。
【００４６】
また、上述のように該当領域の塩基配列を直接検出（決定）する方法の他に、検出対象の領域（多型配列）が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、あるいは特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を、温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などを利用することもできる。
【００４７】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４８】
ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J.Biol.Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, p49-53 (1998)；遺伝子医学、4, p46-48 (2000)〕、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat.Biotechnol.,1.p.87-88 (1999)；遺伝子医学,4, 47-48 (2000)〕、パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3,p225-232 (1998) ；遺伝子医学,4, p50-51 (2000)〕、ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp）参照〕、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００４９】
以上、代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明のＨＣＶ株の評価方法には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される検出技術を用いることもできる。また、本発明の目的に応じて、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００５０】
さらに、本発明のＨＣＶ株の評価方法では、上述したポリヌクレオチドを用いることが好ましいが、塩基配列を検出する方法に限らず、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域におけるアミノ酸配列（配列番号１）の第５６位および第８６位のアミノ酸残基、またはコアタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）の第７０位のアミノ酸残基を直接検出する方法であってもよい。かかる方法としては、被験者（ＨＣＶ感染患者）から調製したＮＳ３タンパク質またはコアタンパク質についてアミノ酸配列を決定する方法のほか、当該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法等の各種の免疫学的手法を好適に利用することができる。
【００５１】
また、本発明者は、高発癌性のＨＣＶ株であるか否かを評価するために、「ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基」、さらに「コアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基」という３つの指標を見出したが、上述したように、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質は、上記３つのアミノ酸残基以外の領域は、ＨＣＶの種々のゲノタイプおよびサブタイプにおいて比較的よく保存されている。このため、本発明の方法を実施するにあたり、上記指標となる３つのアミノ酸残基以外の部分は、特に考慮する必要はないといえる。
【００５２】
このため、本発明に係る方法に利用できるＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、以下のものを例示できる。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の機能（例えば、セリンプロテアーゼ酵素活性）を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質；
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の機能（例えば、セリンプロテアーゼ酵素活性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）上記（ｄ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５３】
また、本発明に係る方法に利用できるコアタンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、以下のものを例示できる。
（ａ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、コアタンパク質としての機能を有するポリペプチド；
（ｃ’）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質；
（ｄ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、コアタンパク質としての機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ’）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ’）上記（ｄ’）〜（ｆ’）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５４】
本明細書において、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、３個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００５５】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５６】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
【００５７】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００５８】
また、本明細書において、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。具体的には、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同性の高いポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６０】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268 (1990); Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) ）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403 (1990) ）。
【００６１】
このように、本発明に係るＨＣＶの評価方法によれば、高発癌性のウイルス株か否かを簡便かつ正確に評価することができる。
【００６２】
＜２．本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法＞
本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法は、Ｃ型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、上述したＣ型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含むものであればよく、その他の具体的な構成は限定されない。
【００６３】
例えば、本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を行うことによって実施できる。
（ａ）被験者（ＨＣＶ感染患者）の生体試料からＨＣＶ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＲＮＡおよびその逆転写ＤＮＡ産物等）を抽出する工程、および；
（ｂ）上記ＨＣＶ株の評価方法を実施する工程。
【００６４】
ここで、本発明の検査に供することができる生体試料としては、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。ただし生殖細胞は除く）、組織（例えば、肝臓、腎臓、副腎、子宮、脳など。培養組織を含む）、血液ならびに血液成分（血清、血漿、血球など）、体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）、毛髪、バイオプシーなどで切除された組織の一部などの生体由来の固体・液体成分を挙げることができる。好ましくは血液または血液成分であり、特に好ましくは血清である。また、肝臓組織も好ましく利用できる。なお、生体から採取された試料を直接使用しても、また何かの処理を加えて調製した試料も本発明の生体試料の対象として使用することができる。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００６５】
被験者としては、好ましくはヒトである。ただし、これに限定されることなく、ヒト以外のＨＣＶに感染する哺乳動物、たとえばチンパンジーやサルなども対象となり得る。なお、被験者は、ＨＣＶの既感染者であることが好ましい。例えば、検査により抗ＨＣＶ抗体が検出されるか、ＨＣＶ感染者に特徴的な症状または所見を有するか、またはＨＣＶ感染の診断基準によりＨＣＶ感染が疑われる者を例示できる。
【００６６】
生体試料からＨＣＶ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＲＮＡ、逆転写のＤＮＡ産物等）の抽出は、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＲＮＡ抽出キット、ＤＮＡ抽出キット等を利用して行うことができる。さらに必要に応じて、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子またはコアタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを単離してもよい。当該ポリヌクレオチドの単離は、上記遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＲＮＡ（またはその逆転写ＤＮＡ産物）を鋳型としたＰＣＲ等に、公知の手法によって行うことができる。
【００６７】
具体的には、後述の実施例のように、血清あるいは外科的に切除した肝臓組織からＨＣＶゲノムを含む試料を調製することができる。検査材料となる試料は、血清や肝臓組織のような患者から得られた試料そのもの以外に、血清や肝臓組織からＣ型肝炎ウイルスをポリエチレングリコール法等によって濃縮し、これを試料として用いることもできる。このようなＣ型肝炎ウイルスが濃縮された試料を用いる場合、１度のＰＣＲ（いわゆるワンステップＰＣＲ）で所望の増幅ＤＮＡ断片が得られる可能性があり、２度のＰＣＲ（いわゆるnested ＰＣＲ）を行う場合に比べて増幅ステップをより簡便にできる可能性がある。
【００６８】
なお、試料の調製等は、公知の方法（例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)）を用いて行うことができる。
【００６９】
本発明の肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法によって、肝癌を発症する潜在的な危険度（リスク）が相対的に高いか否かを判定することができる。肝癌の発症リスクが高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、その治療若しくは改善、またはその発症を防ぐための的確な対策を講じることができる。したがって、本発明は、肝癌の早期治療若しくは改善、または発症を予防するための、さらにはその進展（進行）を阻止するための検査方法として極めて有用である。なお、被験者について肝癌の発症（罹患）の有無をも判定するためにも利用できる。
【００７０】
本発明に係る方法を利用した検査は、上記の判断基準に基づき、医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的に行うこともできる。このため、本発明の方法は、肝癌（将来的に肝癌を発症するリスク）の検出方法ということもできる。
【００７１】
＜３．本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価キット＞
本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価キットは、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むものであればよく、その他の構成は特に限定されない。さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むものであることが好ましい。
【００７２】
すなわち、本ＨＣＶ株の評価キットは、上述した本発明に係るＨＣＶ株の評価方法を実施するためのキットであると換言できる。このため、上記試薬としては、例えば、以下に説明するプローブまたはプライマーを挙げることができる。なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい。また試薬は、これらプローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液、ＰＣＲ用の酵素・各種材料など、本発明の検査に必要な他の試薬、器具などを適宜含むものであってもよい。
【００７３】
（３−１）プローブ
目的とするＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の第５６位と第８６位のアミノ酸残基の検出には、当該タンパク質をコードする塩基配列（配列番号２）の１６６〜１６８位の塩基配列または２５６〜２５８位の塩基を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該塩基配列または塩基を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドを用いることができる。また、コアタンパク質の第７０位のアミノ酸残基の検出には、当該タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４）の２０８〜２１０位の塩基配列の塩基を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該塩基配列または塩基を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドを用いることができる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記塩基配列を含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００７４】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出する塩基配列または塩基を含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましい。ただし、特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００７５】
上記オリゴまたはポリヌクレオチドとして、具体的には、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）において、１６６〜１６８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチド、または２５６〜２５８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７６】
また、同様に、ＨＣＶ株のコアタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号４）において、２０８〜２１０位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、配列番号２または４に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って調製することができる。
【００７７】
さらに好ましくは、後述するように、当該プローブは、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識されていてもよい。
【００７８】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明は、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものであってもよい。当該プローブは、好適にはＨＣＶ株の発癌性を評価するためのＲＮＡチップあるいはＤＮＡチップとして利用することができる。
【００７９】
また、固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッターを利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である（例えば、photolithographic技術（Affymetrix社）、インクジェット技術（Rosetta Inpharmatics社）によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等）。
【００８０】
（３−２）プライマー
本発明に係る評価キットに用いられるプライマー（オリゴヌクレオチド）は、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子（配列番号２）において、その塩基配列の１６６〜１６８位または２５６〜２５８位のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。また、コアタンパク質をコードする遺伝子（配列番号４）において、その塩基配列の２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００８１】
かかるプライマーとして、具体的には、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子（配列番号２）において、１６６〜１６８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチド、ならびに２５６〜２５８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００８２】
また、コアタンパク質をコードする遺伝子（配列番号４）において、２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、配列番号２または４に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って調製することができる。
【００８３】
また、本発明で使用するプライマーには、その末端に遺伝子異常の検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、オリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００８４】
なお、本発明において、特に好ましく利用できるプライマーとして、実施例で使用しているものを挙げることができる。一般的に、ＨＣＶ遺伝子は変異に富んでいることから、プライマーの設計は困難であるといわれている（換言すれば、標的遺伝子領域の塩基配列がウイルス株ごとに変異しており、プライマーのアニーリング効率が悪い）が、本実施例で使用したプライマーを用いると、目的とするＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の増幅効率が良い（後述の実施例では陽性率９０％以上）。また、本実施例で使用したプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片のサイズは、以後の解析に適した長さである。また、本実施例で使用したプライマーは、他のプライマーに比べて、プライマー内あるいはプライマー間でアニーリング（相補的結合）がおきにくく、標的遺伝子へのアニーリング効率がよい、といった利点がある。
【００８５】
（３−３）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子異常検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００８６】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、Applied Biosystems社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、Applied Biosystems社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる（Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照）。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、Amersham・Pharmacia社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００８７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではないことを念のため付言する。
【００８９】
〔材料と方法〕
（１）患者と血清：
ＨＣＶ感染肝癌患者および非癌患者の血清を用いた。肝癌の診断は臨床的および組織学的に行って確定した。血清中の抗ＨＣＶ抗体は市販の検査キット（Ortho HCV Ab ELISA Test III；Ortho Diagnostics）を用いて、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は検査キット（AUSAB（登録商標） EIA；Abbott Diagnostics）を用いて常法に従って測定した（Doi, H., C. Apichartpiyakul, K. Ohba, M. Mizokami, and H. Hotta. J.Clin. Microbiol. 34:569-574. 1996.）。Ｃ型肝炎ウイルス陽性かつＢ型肝炎ウイルス陰性の患者を解析対象とした。
【００９０】
（２）ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の増幅と塩基配列、アミノ酸配列の解析：
血清（１４０μｌ）から、市販のキット（RNeasyMini kit；Qiagen）を用いて、ＲＮＡ（ゲノム）を抽出した。得られたＲＮＡと市販のキット（Superscript One-Step RT-PCR with Platinum Taq；Gibco BRL）およびＮＳ３領域用に開発した外側プライマーセット（配列番号５，６）を用いて、逆転写反応およびファーストＰＣＲを行った。上記ＰＣＲ法の反応条件は、まず４５℃で３０分間の逆転写反応を行い、９４℃ ２分間で反応を停止した後、９４℃、５５℃、７２℃それぞれ１分間のＰＣＲ反応を４０サイクル行った。さらに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）と内側プライマーセット（配列番号７，８）を用いて、９４℃で１分間、５５℃で１．５分間、７２℃で３分間のＰＣＲ反応を３５サイクル行った（特許文献１）。
【００９１】
この方法により、ＨＣＶ感染者の９０%以上から当該ＮＳ３タンパク質のアミノ末端解析領域を増幅することができた。増幅断片は市販のキット（QIAquick PCR Purification kit；Qiagen）を用いて精製し、サブクローニングすることなく、そのまま市販のキット（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit）を用いて、ＡＢＩ３７７シークエンサー（PE Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。その塩基配列をもとにアミノ酸配列を求め、ＨＣＶサブタイプ１ｂのプロトタイプ（ＨＣＶ−Ｊ；登録番号Ｄ９０２０８）（Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., Ohkoshi, S., Sugimura, T. and Shimotohno, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87:9524-9528, 1990.）と比較した。
【００９２】
（３）コア領域の増幅と塩基配列、アミノ酸配列の解析：
上記と同様の方法で、血清からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡについて、ＨＣＶのコアタンパク質用に開発した外側プライマーセット（配列番号９，１０）を用いて、上記と同じ条件で逆転写反応およびファーストＰＣＲを行った。さらに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）と内側プライマーセット（配列番号１１，１２）を用いて、上記と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。
【００９３】
この方法により、ＨＣＶ感染者の９０％以上から当該コアタンパク質の領域を増幅することができた。増幅断片は、ＮＳ３タンパク質と同様に、市販のキット（QIAquick PCR Purification kit；Qiagen）を用いて精製し、サブクローニングすることなく、そのまま市販のキット（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit）を用いて、ＡＢＩ３７７シークエンサー（PE Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。その後、当該塩基配列をもとにアミノ酸配列を求め、ＨＣＶサブタイプ１ｂのプロトタイプ（ＨＣＶ−Ｊ；登録番号Ｄ９０２０８）と比較した。
【００９４】
（４）統計処理：
得られたデータはχ2テスト独立性の検定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｗｅｌｃｈのｔ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行い、Ｐ値が０．０５以下の場合を有意差ありと判定した。
【００９５】
〔結果と考察〕
（１）肝癌患者及び非癌患者から得られたＨＣＶＮＳ３アミノ末端領域のアミノ酸配列の比較：
肝癌患者（１２２症例）及び非癌患者（１０２症例）から得られた検体から増幅されたＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における配列を調べた。肝癌患者１２２症例のうち７２症例（５９%）について、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における５６位および８６位のアミノ酸残基がそれぞれチロシンおよびグルタミンであるウイルス株（ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６）であった（表１）。
【００９６】
【表１】
【００９７】
一方、非癌患者１０２症例のうち３２症例（３１％）がＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株の感染であり、肝癌症例に比べて、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株の比率が有意に低値であった（Ｐ＝０．００００４）。ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株は２２４症例中１０４症例（４６％）において検出され、そのうちの７２症例（６９％）が肝癌であった（表２）。
【００９８】
【表２】
【００９９】
（２）肝癌患者及び非癌患者から得られたＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列の比較：
肝癌患者（１２５症例）及び非癌患者（１０１症例）から得られた検体から増幅されたＨＣＶのコアタンパク質領域の配列を調べた。肝癌患者１２５症例のうち６０症例（４８％）がコアタンパク質の第７０位のアミノ酸がグルタミンであるウイルス株（Ｃｏｒｅ−Ｑ７０）であった（表３）。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
一方、非癌患者１０１症例のうち２４症例（２４％）がＣｏｒｅ−Ｑ７０株の感染であり、肝癌症例に比べて、Ｃｏｒｅ−Ｑ７０株の比率が有意に低値であった（Ｐ＝０．０００２）。逆に、非癌患者ではコアタンパク質の第７０位のアミノ酸がアルギニンであるウイルス株（Ｃｏｒｅ−Ｒ７０）が有意に多かった（７７症例（７６％））。Ｃｏｒｅ−Ｑ７０株は２２６症例中８４症例（３７％）において検出され、そのうちの６０症例（７１％）が肝癌であった（表４）。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
（３）肝癌患者及び非癌患者から得られたＨＣＶのＮＳ３アミノ末端領域及びコアタンパク質領域のアミノ酸配列による総合的比較：
肝癌患者（１２２症例）及び非癌患者（１００症例）から得られた検体から増幅されたＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質領域の配列を調べ、両者を組み合わせて肝癌との相関を検討した。肝癌患者１２２症例のうち９９症例（８１％）がＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株の感染であった（表５）。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
一方、非癌患者１００症例のうち４３症例（４３％）がＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株の感染であり、肝癌症例に比べて、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株の比率が有意に低値であった（Ｐ＜０．０００００００１）。ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株は２２２症例中１４２症例（６４％）において検出され、そのうちの９９症例（７０％）が肝癌であった（表６）。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
肝癌症例ではＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株は全体の８１％を占め、それ以外のウイルス株（その他）は１９％のみであった（図１）。一方、非癌症例ではＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株は肝癌症例に比べて少なく、それ以外の株（その他）が全体の５５％を占めた（図２）。また、同一患者で、数年〜１０年間の経過観察により肝癌発症前と発症後の血清が入手できた症例の解析から、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株およびＣｏｒｅ−Ｑ７０株は肝癌発症前から患者体内に存在していることが明らかになった。
【０１０８】
以上をまとめると、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株およびＣｏｒｅ−Ｑ７０株は、肝癌発症に密接に関連しており、高発癌性Ｃ型肝炎ウイルス株であることが強く示唆された。これらのウイルス株の検出は、Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の肝癌発症リスクを予測する診断法として有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によれば、以上のように、高発癌性Ｃ型肝炎ウイルス株の同定に基づき肝臓癌発症危険性をより正確に予測し得る新たな検査方法を提供することができる。それゆえ、臨床検査・診断などに利用することができ、肝臓癌の早期発見・早期治療にもつながるものである。また、癌疫学調査分野および癌治療のための薬剤の開発等への利用も期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス株の評価方法およびその利用に関し、具体的には、Ｃ型肝炎ウイルスが高発癌性か否かを評価し、当該Ｃ型肝炎ウイルス株の感染による肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法等の利用技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科に属するＣ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と称する場合がある。）は慢性肝疾患の主要な原因ウイルスであり、感染者の１５〜２０％に肝硬変をおこす。そして、肝硬変患者では年率１〜４％の割合で原発性肝細胞癌（肝癌）が発生する。我が国では、肝硬変患者が肝癌を発症する頻度は年率７％といわれ、ＨＣＶ感染者の約３０％あるいはそれ以上が確実に肝癌になると推測されている。
【０００３】
ＨＣＶのゲノム（遺伝子）は、１本鎖プラス鎖の約９６００塩基のＲＮＡからなり、一つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有し、約３０００アミノ酸残基からなる前駆体タンパク質をコードしている。この前駆体タンパク質は、宿主細胞のシグナルペプチダーゼとウイルス遺伝子にコードされる２種類のプロテアーゼ（ＨＣＶ亜鉛プロテアーゼおよびＨＣＶセリンプロテアーゼ）によりプロセシングされ、コア、エンベロープ１（Ｅ１）、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの１０種類のウイルスタンパク質を生じる。ＮＳ３を含め、ＮＳ２〜ＮＳ５Ｂはウイルス粒子を構成しないが、ウイルスの増殖には必須の非構造タンパク質である。
【０００４】
ウイルスゲノムは変異に富んでおり、それに基づいてＨＣＶは７種類のゲノタイプと７０種類以上のサブタイプに分類されている。サブタイプ１ｂ型は日本を含むアジア地域で最も頻度の高いサブタイプで、アジア以外でも、欧米を含む世界中どこにでも多く検出される。一般的に、サブタイプ１ｂ型は他のサブタイプに比べてインターフェロン感受性が低く、また、肝癌をおこしやすいことが知られている。一方、ゲノタイプやサブタイプに関連する差異以外に、同じサブタイプ内でもウイルス株によって様々な性質の違いがあることも観察されている。例えば、サブタイプ１ｂ型のＨＣＶにおけるＮＳ５Ａのアミノ酸配列の違いによって、インターフェロン感受性や血中ウイルス量の異なることが報告されている。
【０００５】
ここで、非構造タンパク質であるＮＳ３は、そのアミノ末端領域にセリンプロテアーゼを、またカルボキシル末端にＮＴＰ分解酵素やヘリカーゼをコードしている。ＮＳ３のアミノ末端領域はＮＳ４Ａと結合し、これを介してＮＳ３が安定化され、そのセリンプロテアーゼ活性が亢進される。ＮＳ３は、このようなウイルス増殖に不可欠な酵素活性以外に、肝癌の発生に関わっていると考えられている。例えば、ＮＳ３のアミノ末端領域が培養細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）を悪性形質転換（癌化）させることが報告されている（非特許文献１，２）。
【０００６】
本発明者も、ＮＳ３のアミノ末端領域がｐ５３癌抑制タンパク質と相互作用すること、およびその相互作用はＮＳ３アミノ末端領域の配列によって異なることを報告している（非特許文献３〜５）。また、ＮＳ３のアミノ末端領域の２次構造を解析して高発癌性ＨＣＶ株を同定する技術（特許文献１）、さらにＮＳ３アミノ末端領域においてｐ５３癌抑制タンパク質との結合に関与する重要なアミノ酸残基を同定することにより、新規医薬のスクリーニング方法を開発している（特許文献２）。
【０００７】
一方、ＨＣＶのコアタンパク質はウイルス粒子内部のカプシドを構成するのみならず、細胞死や細胞の癌化に重要な役割を果たしている。臨床的にも、コアタンパク質における特定のアミノ酸変異と肝癌の発症頻度が密接に関連する可能性が指摘されている（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−２１０１８１号公報（２００３年７月２９日公開）
【特許文献２】特開２００６−０７５０３８号公報（２００６年３月２３日公開）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sakamuro, D., T. Furukawa, and T. Takegami. 1995. Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 transforms NIH3T3 cells. J. Virol. 69: p3893-3896.
【非特許文献２】He, Q. Q., R. X. Cheng, Y. Sun, D. Y. Feng, Z. C. Chen, and H. Zeng. 2003. Hepatocyte transformation and tumor development induced by hepatitis C virus NS3 C-terminal deleted protein. World J. Gastroenterol. 9: p474-478.
【非特許文献３】Ishido, S., and H. Hotta. 1998. Complex formation of the nonstructural protein 3 of hepatitis C virus with the p53 tumor suppressor. FEBS Lett. 438: p258-262.
【非特許文献４】Ishido, S., T. Fujita, and H. Hotta. 2000. Possible involvement of the NS3 protein of hepatitis C virus in hepatocarcinogenesis: Its interaction with the p53 tumor suppressor, p. 37-55. In N. A. Habib, (ed.), Hepatocellular Carcinoma: Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ.
【非特許文献５】Muramatsu, S., S. Ishido, T, Fujita, M. Itoh, and H. Hotta. 1997. Nuclear localization of the NS3 protein of hepatitis C virus and factors affecting the localization. J. Virol. 71: p4954-4961.
【非特許文献６】Kobayashi M, Akuta N, Suzuki F, Hosaka T, Sezaki H, Kobayashi M, Suzuki Y, Arase Y, Ikeda K, Watahiki S, Mineta R, Iwasaki S, Miyakawa Y, Kumada H. Influence of amino-acid polymorphism in the core protein on progression of liver disease in patients infected with hepatitis C virus genotype 1b. J Med Virol. 82(1):41-48, 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、ＨＣＶの感染は肝癌の発症リスクを高くすることが知られているが、その発症リスクを予測する技術の開発は十分ではない。特にＨＣＶ株が高発癌性か否かを評価し、ＨＣＶ感染に起因する肝癌の発症リスクを予測するための技術開発が強く要望されている。
【００１１】
本発明は、上記の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＨＣＶ株の発癌性の評価方法およびその利用技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位に特定のアミノ酸残基を有するウイルス株が高発癌性であること、さらにコアタンパク質の第７０位のアミノ酸残基も指標とすることで、高発癌性のＨＣＶ株をより正確に同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１３】
１．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１４】
２．さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第７０位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とする２に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１５】
３．上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である１に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１６】
４．上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である２に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【００１７】
５．Ｃ型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、１〜４のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含む肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法。
【００１８】
６．Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【００１９】
７．以下の（ｉ）〜（ｉｖ）いずれかに記載の試薬を含む６に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物；
（ｉｖ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【００２０】
８．さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含む６または７に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【００２１】
９．以下の（ｖ）または（ｖｉ）に記載の試薬を含む８に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｖ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｖｉ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、ＨＣＶ株が高発癌性であるか否かを簡便かつ正確に評価することができる。それゆえ、ＨＣＶ感染患者における肝癌の発症リスクを判定することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】肝癌症例におけるＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株とＣｏｒｅ−Ｑ７０株の比率を表す図である。
【図２】非肝癌症例におけるＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株とＣｏｒｅ−Ｑ７０株の比率を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、本明細書に記載した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。また、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、「核酸分子」、「ＤＮＡ」または「ＲＮＡ」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
【００２５】
＜１．本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価方法＞
本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価方法は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とするものであればよく、その他の構成は限定されるものではない。
【００２６】
本発明が対象とするＨＣＶのＮＳ３タンパク質は、上述したように、ＨＣＶの非構造タンパク質であり、これまでも発癌性に関与することが示唆されている。今回、本発明者は、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであるＨＣＶ株は、高発癌性であることを確認した（実施例参照）。
【００２７】
本発明でいう「ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域」とは、特に解析対象とするＮＳ３タンパク質におけるアミノ末端側の第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出できればよく、長さ等の具体的な領域については特に限定されないが、例えば、ＮＳ３タンパク質におけるアミノ末端側１〜１２０番目のアミノ酸配列領域を挙げることができる（配列番号１）。もちろん、本発明の趣旨に沿う範囲内で、上記配列の前後に１〜数十アミノ酸残基が付加あるいは欠損していても構わない。
【００２８】
配列表の配列番号１に「ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域」の一例を示すが、配列番号１に示すアミノ酸配列では、第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンである。なお、この１〜１２０番目のアミノ酸配列は、ＨＣＶ遺伝子がコードする全アミノ酸配列のうち１０２７〜１１４６番目までのアミノ酸配列に相当する。また配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする塩基配列を配列番号２に示す。ＨＣＶ遺伝子の全ゲノムの塩基配列およびアミノ酸配列は、上記特許文献１に記載されている。
【００２９】
また本発明では、上記のＮＳ３タンパク質を指標とした評価方法に加えて、さらにＨＣＶのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、上記第７０位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることが好ましい。
【００３０】
従来、ＨＣＶのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基がアルギニンからグルタミンに変異している場合、高発癌性の可能性が高いことが報告されている（非特許文献６）。本発明者は、ＨＣＶのコアタンパク質における第７０位のグルタミン残基のみを指標としてＨＣＶの発癌性を評価する場合に比べ、上述したようにＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基の検出と組み合わせることによって、ＨＣＶ株の発癌性をより正確に評価できることを確認している（実施例参照）。
【００３１】
配列番号３にＨＣＶのコアタンパク質のアミノ酸配列を示すが、第７０位はグルタミンである。もちろん、本発明の趣旨に沿う範囲内で、上記配列の前後に数〜数十アミノ酸残基が付加あるいは欠損していても構わない。また、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するコアタンパク質をコードする塩基配列を配列番号４に示す。
【００３２】
ここで、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質は、ＨＣＶの種々のゲノタイプ（genotype）およびサブタイプにおいて高度に保存されているため、本発明が対象とするＨＣＶのゲノタイプおよびサブタイプについては特に限定されず、７種類のゲノタイプと７０種類以上のサブタイプのいずれをも対象とできる。例えば、ゲノタイプでいうと、１ａ型、１ｂ型、１ｃ型、２ａ型、２ｂ型、２ｃ型、３ａ型、３ｂ型、４型、５ａ型および６ｂ型を対象とすることができる。なかでも、サブタイプ１ｂ型を対象とすることが好ましい。サブタイプ１ｂ型は日本を含むアジア地域で最も頻度の高いサブタイプで、アジア以外でも、欧米を含む世界中どこにでも多く検出されるため、高発癌性か否かを検出するニーズは極めて高い。
【００３３】
ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域および／またはコアタンパク質のアミノ酸残基を検出する工程においては、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いる方法を例示できる。すなわち、上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である。また、上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程である。
【００３４】
例えば、上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドを用いる場合、(i) 上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を含む領域についてＰＣＲを行い、ＳＳＣＰ法で検出する方法、(ii) 上記領域でＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に対する制限酵素の切断様式から検出する方法、(iii) 同ＰＣＲ産物を直接シーケンシングして、配列を決定する方法、(iv) 上記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、検出対象のポリヌクレオチドとハイブリダイズさせるＡＳＯ（allele specific oligonucleotide）法、(v) 上記領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して質量分析装置等で検出する方法など、公知の方法を用いることにより行うことができる。なお、ＨＣＶのゲノムはＲＮＡであるため、必要に応じて、逆転写反応によりＤＮＡとする工程を前処理工程として設けてもよい。上記の例示はＮＳ３タンパク質をコードする遺伝子について述べたが、コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドについても、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を含む領域に関して、同様に検出することができる。
【００３５】
より具体的には、上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）の場合、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列に相当する１６６〜１６８位がｔａｔ（アデニン、チミン、アデニン）またはｔａｃ（アデニン、チミン、シトシン）であるか否かを検出する方法（ただし、これらのオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合は、配列表中の塩基記号「ｔ（チミン）」は「ｕ（ウラシル）」に読み替えるものとする）、またＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列に相当する２５６〜２５８位がｃａａ（シトシン、アデニン、アデニン）またはｃａｇ（シトシン、アデニン、グアニン）であるか否かを検出する方法を挙げることができる。
【００３６】
また、コアタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）において、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列に相当する２０８〜２１０位がｃａａ（シトシン、アデニン、アデニン）またはｃａｇ（シトシン、アデニン、グアニン）であるか否かを検出する方法を挙げることができる。
【００３７】
具体的には、本発明に係る評価方法は、例えば、ＨＣＶ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＲＮＡおよびその逆転写ＤＮＡ産物等）に含まれるＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子および／またはコアタンパク質をコードする遺伝子を対象として、配列番号２の１６６〜１６８位および２５６〜２５８位、あるいは配列番号４の２０８〜２１０位を含む領域の塩基配列を検出することで実施できる。
【００３８】
すなわち、本発明の一実施形態として、ＨＣＶ感染患者の血清あるいは肝細胞組織等からＨＣＶの遺伝子（ゲノムＲＮＡ）を含む試料を調製し、逆転写反応を行って上記ＨＣＶ遺伝子から鋳型となるＤＮＡを作製した後、後述のプライマーを用いてＰＣＲ法による増幅を行い（すなわち、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行い）、遺伝子上のＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチド、および／またはコアタンパク質をコードするポリヌクレオチドが増幅された増幅ＤＮＡ断片を取得し、当該増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する方法を挙げることができる。
【００３９】
ここで、上記ＲＴ−ＰＣＲ反応では、まず逆転写反応により、上記ＨＣＶゲノムを含む試料からｃＤＮＡを作製する。次に、このｃＤＮＡを鋳型にして２度のＰＣＲ反応を行う。より具体的には、一組のプライマーセットを用いて１回目のＰＣＲによる増幅反応を行い、その後さらに、他の一組のプライマーを用いて２回目のＰＣＲによる増幅反応を行う。これにより、ＨＣＶゲノム上のＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドが増幅された増幅ＤＮＡ断片を取得することができる。
【００４０】
上記１回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、例えば、後述する実施例で用いている配列番号５，６に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号５で示される塩基配列からなるプライマーは、日本遺伝子データバンクに登録（登録番号Ｄ９０２０８）されているＨＣＶ−１ｂのプロトタイプ（以下、これを「ＨＣＶ−Ｊ」という）の遺伝子配列においては、３２９５番目から３３１６番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、４０１９番目から４０４０番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。なお、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列の全長は、上記特許文献１に記載されている配列番号５，６を適宜参照できる。
【００４１】
また、上記２回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、配列番号７，８に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号７に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、３３９０番目から３４０７番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、３９８５番目から４００６番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。
【００４２】
また、コアタンパク質についても同様の手法を用いることができる。具体的には、１回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとして、例えば、後述する実施例で用いている配列番号９，１０に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号９で示される塩基配列からなるプライマーは、ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列においては、２５９番目から２７９番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、９６３番目から９８１番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。
【００４３】
また、２回目のＰＣＲに用いるプライマーセットとしては、配列番号１１，１２に記載のプライマーセットを挙げることができる。配列番号１１に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、２７６番目から２９５番目までの塩基配列に相当するセンスプライマーである。また、配列番号１２に示される塩基配列からなるプライマーは、上記ＨＣＶ−Ｊの遺伝子配列において、９３０番目から９５２番目までの塩基配列の相補配列に相当するアンチセンスプライマーである。
【００４４】
なお、詳細な条件等については、公知の方法（例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)）を適宜参考できる。
【００４５】
また、逆転写反応についても従来公知の手法を利用でき特に限定されないが、例えば、文献（Verma, I.M. (1974) In: The Enzymes, Boyer, P.D., ed., Academic Press, NY, 87. 、Kacian, D,L. (1977) Meth. Virol. 6, 143. 、Houts, G.E. et al. (1979) J. Virol. 29, 517. 、Roth, M.J., Tanese, N. and Goff, S.P. (1985) J. Biol, Chem. 260, 9326. 、Tanese, N. and Goff, S. P. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1777（1988） 、Gerard, G.F. and D'Alessio, J. (1993) In: Methods in Molecular Biology, Vol. 16: Enzymes of Molecular Biology, Burrell, M.M., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 73. 、Eun, H.-M. (1996) Enzymology Primer for Recombinant DNA Technology, Academic Press, San Diego, CA, 427.）等に基づいて行うことができる。
【００４６】
また、上述のように該当領域の塩基配列を直接検出（決定）する方法の他に、検出対象の領域（多型配列）が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、あるいは特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を、温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などを利用することもできる。
【００４７】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００４８】
ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J.Biol.Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, p49-53 (1998)；遺伝子医学、4, p46-48 (2000)〕、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat.Biotechnol.,1.p.87-88 (1999)；遺伝子医学,4, 47-48 (2000)〕、パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3,p225-232 (1998) ；遺伝子医学,4, p50-51 (2000)〕、ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp）参照〕、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００４９】
以上、代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明のＨＣＶ株の評価方法には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される検出技術を用いることもできる。また、本発明の目的に応じて、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００５０】
さらに、本発明のＨＣＶ株の評価方法では、上述したポリヌクレオチドを用いることが好ましいが、塩基配列を検出する方法に限らず、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域におけるアミノ酸配列（配列番号１）の第５６位および第８６位のアミノ酸残基、またはコアタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）の第７０位のアミノ酸残基を直接検出する方法であってもよい。かかる方法としては、被験者（ＨＣＶ感染患者）から調製したＮＳ３タンパク質またはコアタンパク質についてアミノ酸配列を決定する方法のほか、当該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いたウエスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法等の各種の免疫学的手法を好適に利用することができる。
【００５１】
また、本発明者は、高発癌性のＨＣＶ株であるか否かを評価するために、「ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基」、さらに「コアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基」という３つの指標を見出したが、上述したように、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質は、上記３つのアミノ酸残基以外の領域は、ＨＣＶの種々のゲノタイプおよびサブタイプにおいて比較的よく保存されている。このため、本発明の方法を実施するにあたり、上記指標となる３つのアミノ酸残基以外の部分は、特に考慮する必要はないといえる。
【００５２】
このため、本発明に係る方法に利用できるＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、以下のものを例示できる。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の機能（例えば、セリンプロテアーゼ酵素活性）を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質；
（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の機能（例えば、セリンプロテアーゼ酵素活性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ）上記（ｄ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５３】
また、本発明に係る方法に利用できるコアタンパク質および当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、以下のものを例示できる。
（ａ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、コアタンパク質としての機能を有するポリペプチド；
（ｃ’）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされるタンパク質；
（ｄ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、コアタンパク質としての機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ’）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｇ’）上記（ｄ’）〜（ｆ’）のポリヌクレオチドのうちいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００５４】
本明細書において、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、３個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００５５】
タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このタンパク質の構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５６】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
【００５７】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００５８】
また、本明細書において、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。具体的には、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同性の高いポリヌクレオチドを取得することができる。
【００６０】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268 (1990); Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) ）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al., J. Mol. Biol., 215: 403 (1990) ）。
【００６１】
このように、本発明に係るＨＣＶの評価方法によれば、高発癌性のウイルス株か否かを簡便かつ正確に評価することができる。
【００６２】
＜２．本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法＞
本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法は、Ｃ型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、上述したＣ型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含むものであればよく、その他の具体的な構成は限定されない。
【００６３】
例えば、本発明に係る肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を行うことによって実施できる。
（ａ）被験者（ＨＣＶ感染患者）の生体試料からＨＣＶ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＲＮＡおよびその逆転写ＤＮＡ産物等）を抽出する工程、および；
（ｂ）上記ＨＣＶ株の評価方法を実施する工程。
【００６４】
ここで、本発明の検査に供することができる生体試料としては、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。ただし生殖細胞は除く）、組織（例えば、肝臓、腎臓、副腎、子宮、脳など。培養組織を含む）、血液ならびに血液成分（血清、血漿、血球など）、体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）、毛髪、バイオプシーなどで切除された組織の一部などの生体由来の固体・液体成分を挙げることができる。好ましくは血液または血液成分であり、特に好ましくは血清である。また、肝臓組織も好ましく利用できる。なお、生体から採取された試料を直接使用しても、また何かの処理を加えて調製した試料も本発明の生体試料の対象として使用することができる。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００６５】
被験者としては、好ましくはヒトである。ただし、これに限定されることなく、ヒト以外のＨＣＶに感染する哺乳動物、たとえばチンパンジーやサルなども対象となり得る。なお、被験者は、ＨＣＶの既感染者であることが好ましい。例えば、検査により抗ＨＣＶ抗体が検出されるか、ＨＣＶ感染者に特徴的な症状または所見を有するか、またはＨＣＶ感染の診断基準によりＨＣＶ感染が疑われる者を例示できる。
【００６６】
生体試料からＨＣＶ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＲＮＡ、逆転写のＤＮＡ産物等）の抽出は、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＲＮＡ抽出キット、ＤＮＡ抽出キット等を利用して行うことができる。さらに必要に応じて、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子またはコアタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを単離してもよい。当該ポリヌクレオチドの単離は、上記遺伝子にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＲＮＡ（またはその逆転写ＤＮＡ産物）を鋳型としたＰＣＲ等に、公知の手法によって行うことができる。
【００６７】
具体的には、後述の実施例のように、血清あるいは外科的に切除した肝臓組織からＨＣＶゲノムを含む試料を調製することができる。検査材料となる試料は、血清や肝臓組織のような患者から得られた試料そのもの以外に、血清や肝臓組織からＣ型肝炎ウイルスをポリエチレングリコール法等によって濃縮し、これを試料として用いることもできる。このようなＣ型肝炎ウイルスが濃縮された試料を用いる場合、１度のＰＣＲ（いわゆるワンステップＰＣＲ）で所望の増幅ＤＮＡ断片が得られる可能性があり、２度のＰＣＲ（いわゆるnested ＰＣＲ）を行う場合に比べて増幅ステップをより簡便にできる可能性がある。
【００６８】
なお、試料の調製等は、公知の方法（例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)）を用いて行うことができる。
【００６９】
本発明の肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法によって、肝癌を発症する潜在的な危険度（リスク）が相対的に高いか否かを判定することができる。肝癌の発症リスクが高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、その治療若しくは改善、またはその発症を防ぐための的確な対策を講じることができる。したがって、本発明は、肝癌の早期治療若しくは改善、または発症を予防するための、さらにはその進展（進行）を阻止するための検査方法として極めて有用である。なお、被験者について肝癌の発症（罹患）の有無をも判定するためにも利用できる。
【００７０】
本発明に係る方法を利用した検査は、上記の判断基準に基づき、医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的に行うこともできる。このため、本発明の方法は、肝癌（将来的に肝癌を発症するリスク）の検出方法ということもできる。
【００７１】
＜３．本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価キット＞
本発明に係るＣ型肝炎ウイルス株の評価キットは、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むものであればよく、その他の構成は特に限定されない。さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むものであることが好ましい。
【００７２】
すなわち、本ＨＣＶ株の評価キットは、上述した本発明に係るＨＣＶ株の評価方法を実施するためのキットであると換言できる。このため、上記試薬としては、例えば、以下に説明するプローブまたはプライマーを挙げることができる。なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい。また試薬は、これらプローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液、ＰＣＲ用の酵素・各種材料など、本発明の検査に必要な他の試薬、器具などを適宜含むものであってもよい。
【００７３】
（３−１）プローブ
目的とするＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の第５６位と第８６位のアミノ酸残基の検出には、当該タンパク質をコードする塩基配列（配列番号２）の１６６〜１６８位の塩基配列または２５６〜２５８位の塩基を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該塩基配列または塩基を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドを用いることができる。また、コアタンパク質の第７０位のアミノ酸残基の検出には、当該タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４）の２０８〜２１０位の塩基配列の塩基を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該塩基配列または塩基を検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドを用いることができる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記塩基配列を含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００７４】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出する塩基配列または塩基を含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましい。ただし、特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００７５】
上記オリゴまたはポリヌクレオチドとして、具体的には、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号２）において、１６６〜１６８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチド、または２５６〜２５８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００７６】
また、同様に、ＨＣＶ株のコアタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号４）において、２０８〜２１０位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、配列番号２または４に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って調製することができる。
【００７７】
さらに好ましくは、後述するように、当該プローブは、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識されていてもよい。
【００７８】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明は、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものであってもよい。当該プローブは、好適にはＨＣＶ株の発癌性を評価するためのＲＮＡチップあるいはＤＮＡチップとして利用することができる。
【００７９】
また、固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッターを利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である（例えば、photolithographic技術（Affymetrix社）、インクジェット技術（Rosetta Inpharmatics社）によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等）。
【００８０】
（３−２）プライマー
本発明に係る評価キットに用いられるプライマー（オリゴヌクレオチド）は、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子（配列番号２）において、その塩基配列の１６６〜１６８位または２５６〜２５８位のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。また、コアタンパク質をコードする遺伝子（配列番号４）において、その塩基配列の２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【００８１】
かかるプライマーとして、具体的には、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードする遺伝子（配列番号２）において、１６６〜１６８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチド、ならびに２５６〜２５８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００８２】
また、コアタンパク質をコードする遺伝子（配列番号４）において、２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長、好ましくは１８〜３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、配列番号２または４に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って調製することができる。
【００８３】
また、本発明で使用するプライマーには、その末端に遺伝子異常の検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、オリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【００８４】
なお、本発明において、特に好ましく利用できるプライマーとして、実施例で使用しているものを挙げることができる。一般的に、ＨＣＶ遺伝子は変異に富んでいることから、プライマーの設計は困難であるといわれている（換言すれば、標的遺伝子領域の塩基配列がウイルス株ごとに変異しており、プライマーのアニーリング効率が悪い）が、本実施例で使用したプライマーを用いると、目的とするＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の増幅効率が良い（後述の実施例では陽性率９０％以上）。また、本実施例で使用したプライマーによって増幅されたＤＮＡ断片のサイズは、以後の解析に適した長さである。また、本実施例で使用したプライマーは、他のプライマーに比べて、プライマー内あるいはプライマー間でアニーリング（相補的結合）がおきにくく、標的遺伝子へのアニーリング効率がよい、といった利点がある。
【００８５】
（３−３）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子異常検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００８６】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、Applied Biosystems社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、Applied Biosystems社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる（Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照）。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、Amersham・Pharmacia社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【００８７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではないことを念のため付言する。
【００８９】
〔材料と方法〕
（１）患者と血清：
ＨＣＶ感染肝癌患者および非癌患者の血清を用いた。肝癌の診断は臨床的および組織学的に行って確定した。血清中の抗ＨＣＶ抗体は市販の検査キット（Ortho HCV Ab ELISA Test III；Ortho Diagnostics）を用いて、Ｂ型肝炎ウイルス抗原は検査キット（AUSAB（登録商標） EIA；Abbott Diagnostics）を用いて常法に従って測定した（Doi, H., C. Apichartpiyakul, K. Ohba, M. Mizokami, and H. Hotta. J.Clin. Microbiol. 34:569-574. 1996.）。Ｃ型肝炎ウイルス陽性かつＢ型肝炎ウイルス陰性の患者を解析対象とした。
【００９０】
（２）ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域の増幅と塩基配列、アミノ酸配列の解析：
血清（１４０μｌ）から、市販のキット（RNeasyMini kit；Qiagen）を用いて、ＲＮＡ（ゲノム）を抽出した。得られたＲＮＡと市販のキット（Superscript One-Step RT-PCR with Platinum Taq；Gibco BRL）およびＮＳ３領域用に開発した外側プライマーセット（配列番号５，６）を用いて、逆転写反応およびファーストＰＣＲを行った。上記ＰＣＲ法の反応条件は、まず４５℃で３０分間の逆転写反応を行い、９４℃ ２分間で反応を停止した後、９４℃、５５℃、７２℃それぞれ１分間のＰＣＲ反応を４０サイクル行った。さらに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）と内側プライマーセット（配列番号７，８）を用いて、９４℃で１分間、５５℃で１．５分間、７２℃で３分間のＰＣＲ反応を３５サイクル行った（特許文献１）。
【００９１】
この方法により、ＨＣＶ感染者の９０%以上から当該ＮＳ３タンパク質のアミノ末端解析領域を増幅することができた。増幅断片は市販のキット（QIAquick PCR Purification kit；Qiagen）を用いて精製し、サブクローニングすることなく、そのまま市販のキット（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit）を用いて、ＡＢＩ３７７シークエンサー（PE Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。その塩基配列をもとにアミノ酸配列を求め、ＨＣＶサブタイプ１ｂのプロトタイプ（ＨＣＶ−Ｊ；登録番号Ｄ９０２０８）（Kato, N., Hijikata, M., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., Ohkoshi, S., Sugimura, T. and Shimotohno, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87:9524-9528, 1990.）と比較した。
【００９２】
（３）コア領域の増幅と塩基配列、アミノ酸配列の解析：
上記と同様の方法で、血清からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡについて、ＨＣＶのコアタンパク質用に開発した外側プライマーセット（配列番号９，１０）を用いて、上記と同じ条件で逆転写反応およびファーストＰＣＲを行った。さらに、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Promega）と内側プライマーセット（配列番号１１，１２）を用いて、上記と同じ条件でＰＣＲ反応を行った。
【００９３】
この方法により、ＨＣＶ感染者の９０％以上から当該コアタンパク質の領域を増幅することができた。増幅断片は、ＮＳ３タンパク質と同様に、市販のキット（QIAquick PCR Purification kit；Qiagen）を用いて精製し、サブクローニングすることなく、そのまま市販のキット（dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit）を用いて、ＡＢＩ３７７シークエンサー（PE Applied Biosystems）により塩基配列を決定した。その後、当該塩基配列をもとにアミノ酸配列を求め、ＨＣＶサブタイプ１ｂのプロトタイプ（ＨＣＶ−Ｊ；登録番号Ｄ９０２０８）と比較した。
【００９４】
（４）統計処理：
得られたデータはχ2テスト独立性の検定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｗｅｌｃｈのｔ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により統計処理を行い、Ｐ値が０．０５以下の場合を有意差ありと判定した。
【００９５】
〔結果と考察〕
（１）肝癌患者及び非癌患者から得られたＨＣＶＮＳ３アミノ末端領域のアミノ酸配列の比較：
肝癌患者（１２２症例）及び非癌患者（１０２症例）から得られた検体から増幅されたＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における配列を調べた。肝癌患者１２２症例のうち７２症例（５９%）について、ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における５６位および８６位のアミノ酸残基がそれぞれチロシンおよびグルタミンであるウイルス株（ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６）であった（表１）。
【００９６】
【表１】
【００９７】
一方、非癌患者１０２症例のうち３２症例（３１％）がＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株の感染であり、肝癌症例に比べて、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株の比率が有意に低値であった（Ｐ＝０．００００４）。ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株は２２４症例中１０４症例（４６％）において検出され、そのうちの７２症例（６９％）が肝癌であった（表２）。
【００９８】
【表２】
【００９９】
（２）肝癌患者及び非癌患者から得られたＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸配列の比較：
肝癌患者（１２５症例）及び非癌患者（１０１症例）から得られた検体から増幅されたＨＣＶのコアタンパク質領域の配列を調べた。肝癌患者１２５症例のうち６０症例（４８％）がコアタンパク質の第７０位のアミノ酸がグルタミンであるウイルス株（Ｃｏｒｅ−Ｑ７０）であった（表３）。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
一方、非癌患者１０１症例のうち２４症例（２４％）がＣｏｒｅ−Ｑ７０株の感染であり、肝癌症例に比べて、Ｃｏｒｅ−Ｑ７０株の比率が有意に低値であった（Ｐ＝０．０００２）。逆に、非癌患者ではコアタンパク質の第７０位のアミノ酸がアルギニンであるウイルス株（Ｃｏｒｅ−Ｒ７０）が有意に多かった（７７症例（７６％））。Ｃｏｒｅ−Ｑ７０株は２２６症例中８４症例（３７％）において検出され、そのうちの６０症例（７１％）が肝癌であった（表４）。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
（３）肝癌患者及び非癌患者から得られたＨＣＶのＮＳ３アミノ末端領域及びコアタンパク質領域のアミノ酸配列による総合的比較：
肝癌患者（１２２症例）及び非癌患者（１００症例）から得られた検体から増幅されたＨＣＶのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域およびコアタンパク質領域の配列を調べ、両者を組み合わせて肝癌との相関を検討した。肝癌患者１２２症例のうち９９症例（８１％）がＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株の感染であった（表５）。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
一方、非癌患者１００症例のうち４３症例（４３％）がＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株の感染であり、肝癌症例に比べて、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株の比率が有意に低値であった（Ｐ＜０．０００００００１）。ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株は２２２症例中１４２症例（６４％）において検出され、そのうちの９９症例（７０％）が肝癌であった（表６）。
【０１０６】
【表６】
【０１０７】
肝癌症例ではＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株は全体の８１％を占め、それ以外のウイルス株（その他）は１９％のみであった（図１）。一方、非癌症例ではＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株またはＣｏｒｅ−Ｑ７０株は肝癌症例に比べて少なく、それ以外の株（その他）が全体の５５％を占めた（図２）。また、同一患者で、数年〜１０年間の経過観察により肝癌発症前と発症後の血清が入手できた症例の解析から、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株およびＣｏｒｅ−Ｑ７０株は肝癌発症前から患者体内に存在していることが明らかになった。
【０１０８】
以上をまとめると、ＮＳ３−Ｙ５６／Ｑ８６株およびＣｏｒｅ−Ｑ７０株は、肝癌発症に密接に関連しており、高発癌性Ｃ型肝炎ウイルス株であることが強く示唆された。これらのウイルス株の検出は、Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の肝癌発症リスクを予測する診断法として有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明によれば、以上のように、高発癌性Ｃ型肝炎ウイルス株の同定に基づき肝臓癌発症危険性をより正確に予測し得る新たな検査方法を提供することができる。それゆえ、臨床検査・診断などに利用することができ、肝臓癌の早期発見・早期治療にもつながるものである。また、癌疫学調査分野および癌治療のための薬剤の開発等への利用も期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、
上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項２】
さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、
上記第７０位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項３】
上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程であることを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項４】
上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程であることを特徴とする請求項２に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、請求項１〜４のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含むことを特徴とする肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【請求項７】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）いずれかに記載の試薬を含むことを特徴とする請求項６に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物；
（ｉｖ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【請求項８】
さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むことを特徴とする請求項６または７に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【請求項９】
以下の（ｖ）または（ｖｉ）に記載の試薬を含むことを特徴とする請求項８に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｖ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｖｉ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、
上記第５６位のアミノ酸残基がチロシンであり、かつ第８６位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項２】
さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出する工程を含み、
上記第７０位のアミノ酸残基がグルタミンであることを、高発癌性の指標とすることを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項３】
上記ＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域をコードするポリヌクレオチドにおいて、第５６位および第８６位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程であることを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項４】
上記コアタンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて、第７０位のアミノ酸残基をコードする塩基配列を検出する工程であることを特徴とする請求項２に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルス感染者から分離した生体サンプルを用いて、請求項１〜４のいずれかに記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価方法を行う工程を含むことを特徴とする肝癌の発症リスクを予測するためのデータ取得方法。
【請求項６】
Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ末端領域における第５６位および第８６位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【請求項７】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）いずれかに記載の試薬を含むことを特徴とする請求項６に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｉｉｉ）配列番号２に記載の塩基配列において、１６６〜１６８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物；
（ｉｖ）配列番号２に記載の塩基配列において、２５６〜２５８位に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【請求項８】
さらに、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質における第７０位のアミノ酸残基を検出するための試薬を含むことを特徴とする請求項６または７に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
【請求項９】
以下の（ｖ）または（ｖｉ）に記載の試薬を含むことを特徴とする請求項８に記載のＣ型肝炎ウイルス株の評価キット。
（ｖ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位に位置する塩基配列を含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその標識物；
（ｖｉ）配列番号４に示す塩基配列において、２０８〜２１０位のヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド（ただし、当該ヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３５塩基長のオリゴヌクレオチドまたはその標識物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−６０９１４（Ｐ２０１２−６０９１４Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０６８００（Ｐ２０１０−２０６８００）
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人科学技術振興機構、委託研究（地球規模課題対応国際科学技術協力事業、「抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）物質の同定及びＨＣＶならびにデングワクチンの開発」）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５１０２４９４１６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人科学技術振興機構、委託研究（地球規模課題対応国際科学技術協力事業、「抗Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）物質の同定及びＨＣＶならびにデングワクチンの開発」）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５１０２４９４１６）
【Ｆターム（参考）】
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