Ｃ型肝炎ウイルス核酸ワクチン
本発明の主題は、ＨＣＶ核酸ワクチンおよびワクチン成分として、または、ＨＣＶワクチンの製造に使用できる核酸構築物である。記載した構築物は、（１）第一のＨＣＶ菌株に基づくＮＳ３−４Ａ領域と第二の菌株に基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡまたはＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域とを含むキメラＨＣＶポリペプチドをコードする構築物、および、（２）ＨＣＶポリペプチドをコードするチンパンジーに基づくアデノベクターを含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願に引用した参考文献は特許請求の範囲に記載の発明に対する先行技術であると認められたものではない。
【０００２】
全世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。（Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０，１−１６，２０００）。ＨＣＶに接触して明白な急性疾患が発症するパーセンテージは低いが、多くの場合にウイルスが慢性感染として定着し、肝臓の炎症を生じさせ、ゆっくりと肝不全および肝硬変に進行する。（Ｉｗａｒｓｏｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４，２０１−２０４，１９９４）。さらに、疫学調査は、ＨＣＶが肝細胞癌の病理発生に重要な役割を演じることを示している。（Ｋｅｗ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４，２１１−２２０，１９９４，Ａｌｔｅｒ，Ｂｌｏｏｄ ８５，１６８１−１６９５，１９９５）。
【０００３】
ＨＣＶに対する定例の血液スクリーニングが実施されるようになった１９９２年以前には、たいていの感染は、汚染血液、血液製品または移植臓器への迂闊な接触が原因となっていた。ＨＣＶの血液スクリーニングが実施されている地域では、ＨＣＶは主として静脈内薬物使用によって感染する。頻度は少ないが、周産期接触、血液透析およびＨＣＶ感染者との性的接触なども伝播方法に含まれる。（Ａｌｔｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１（８），５５６−５６２，１９９９，Ａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３１ Ｓｕｐｐｌ．８８−９１，１９９９，Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．２０１，１−１６，２０００）。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする約９．５ｋｂの一本鎖ＲＮＡから成る。（Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，３６２−３６４，１９８９，Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，３５９−３６２，１９８９，Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５，１１０５−１１１３，１９９１）。ＨＣＶポリタンパク質はＣ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂという序列のウイルスタンパク質を含有する。
【０００５】
ＣＭＩ応答を生じさせるために１つ以上のＨＣＶ非構造抗原を提供するＨＣＶ核酸配列を使用することは、例えば、Ｃｈｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ ７７：１１３６−１１４４，１９９９；Ｐａｌｉａｒｄら，国際公開ＷＯ ０１／３０８１２；Ｃｏｉｔら，国際公開ＷＯ ０１／３８３６０；およびＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８によって言及されている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の主題は、ＨＣＶ核酸ワクチンおよびワクチン成分として、または、ＨＣＶワクチンの製造に使用できる核酸構築物である。記載した構築物は、（１）第一のＨＣＶ菌株に基づくＮＳ３−４Ａ領域と第二の菌株に基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡまたはＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域を含有するキメラＨＣＶポリペプチドをコードする核酸、および、（２）チンパンジーに基づくＨＣＶポリペプチドをコードするアデノベクターを含む。
【０００７】
従って、本発明の第一の目的は、ＨＣＶキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を記載する。該ポリペプチドは、第一のＨＣＶ菌株に由来のＨＣＶ ＮＳ３−４ａに実質的に相似のアミノ酸配列を含むＨＣＶ ＮＳ３−４ａ領域と、第二のＨＣＶ菌株に由来のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに実質的に相似のアミノ酸配列を含むＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域とを含む。この場合、２つの領域に存在するＮＳ３−４Ａ配列は異なる配列を有している。第一領域は第二領域のアミノ側またはカルボキシル側に配置されている。
【０００８】
アミノ酸配列に関する“実質的に相似の配列”という表現は、基準配列に対する少なくとも約７０％の一致を意味する。基準配列に対するパーセント一致（一致パーセントと表すこともある）を決定するためには、最大数の一致アミノ酸が得られるようにポリペプチド領域を対応する基準領域に位置合せし、対応領域の一致アミノ酸の数を測定する。この数を基準領域のアミノ酸の総数で除算し、次いで１００を乗算し、最も近い整数に丸める。例えば、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａ、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡおよびＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの領域が、異なるＨＣＶ菌株に存在する対応ＨＣＶ領域でもよい。
【０００９】
第一および第二の領域に異なるＮＳ３−４Ａ配列が存在することは、１つ以上のアミノ酸相違をもたらす。アミノ酸相違はおのおの独立に付加、置換または欠失である。
【００１０】
好ましい実施態様では、核酸が、コードされたＨＣＶポリペプチドをヒト細胞中で発現できる発現ベクターである。ヒト細胞中の発現は、ＨＣＶ感染の能動的治療およびＨＣＶ感染に対する予防的処置という治療的用途を有している。
【００１１】
発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適正な転写およびプロセシング用の調節要素と共に含有する。存在し得る調節要素は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に天然に連携している調節要素およびヌクレオチド配列に天然に連携していない外来調節要素を含む。外来プロモーターのような外来調節要素はヒト細胞のような特定宿主中の発現に使用できる。
【００１２】
好ましい発現ベクターは、１つ以上の欠失領域を有する組換えアデノウイルスゲノムである。組換えアデノウイルスゲノムは、１つ以上のアデノウイルス血清型に実質的に相似の種々の領域を含有し得る。欠失領域という表現は、指定した領域の全部または一部の欠失を表す。
【００１３】
本発明の別の目的は、
ａ）ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａを含むＨＣＶポリペプチドをコードしている発現カセットと、
ｂ）Ｅ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含む組換えアデノウイルスゲノムと、
を含み、該アデノウイルスゲノムが、（ｉ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、（ｉｉ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、（ｉｉｉ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている組換えアデノベクターを記載する。
【００１４】
発現カセットはＥ１またはＥ３欠失に配置される。発現カセットの全部または一部が欠失領域に対応する位置に存在するならば発現カセットはＥ１またはＥ３欠失に配置されたと考えられる。
【００１５】
ＨＣＶポリペプチドまたはアミノ酸配列という表現は、天然産生ＨＣＶ配列、天然産生配列または指定配列に実質的に相似の天然産生配列の誘導体、および、キメラＨＣＶポリペプチドを含む。キメラＨＣＶポリペプチドは、上述の本発明の第一の目的に記載のＨＣＶポリペプチドを含む。
【００１６】
本発明の別の目的は組換えアデノウイルス粒子を記載する。該粒子は、本文中に記載の組換えアデノウイルスゲノムによってコードされ、該ゲノムのコピーをパッケージしている。
【００１７】
本発明の別の目的は、（ａ）組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、（ｂ）該粒子を実質的に精製する段階とを含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法を記載する。粒子を実質的に精製するという表現は、粒子の製造に使用した細胞および細胞破片を完全にまたはほぼ完全に除去することを意味する。
【００１８】
本発明の別の目的は、治療有効量のＨＣＶポリペプチドをコードする核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を記載する。
【００１９】
本発明の別の目的は、治療有効量のＨＣＶポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法を記載する。
【００２０】
“治療する”という表現は、ＨＣＶ感染患者の治療または活動性ＨＣＶ感染の可能性もしくは重篤度を低下させるための患者の予防的処置を含む。“患者”という用語は、ＨＣＶ感染の可能性のある哺乳動物を表す。患者はＨＣＶ感染している場合もあり非感染の場合もある。患者の例はヒトおよびチンパンジーである。
【００２１】
ＨＣＶ感染患者の場合、有効量は、以下の効果、すなわち、ＨＣＶの複製能力を低下させる効果、ＨＣＶ荷重を減少させる効果、ウイルスクリアランスを増加させる効果、および、１つ以上のＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答を増加させる効果の１つ以上を発揮するために十分な量である：。
【００２２】
ＨＣＶ非感染患者の場合、有効量は、以下の効果、すなわち、ＨＣＶ感染に対するＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答の１つ以上の成分の発生能力を増加させる効果、ＨＣＶ感染に対する感受性を低下させる効果、および、慢性疾患に至る持続感染を定着させる感染ウイルスの能力を低下させる効果の１つ以上を達成するために十分な量である：。
【００２３】
“含む”のような無制限的用語は、追加の要素または段階を許容する。追加の要素または段階の可能性を強調するために、ときには、“１つ以上”のような成句を無制限的用語と共にまたは単独で使用する。
【００２４】
明白な記述がなければ、単数を表す不定冠詞は１に限定されない。例えば、“１つの細胞”は“複数の細胞”を排除しない。ときには、複数の存在が可能であることを強調するために、１つ以上という熟語を使用する。
【００２５】
本発明のその他の特徴および利点は、様々な実施例を含む本文中の以後の記載より明らかであろう。与えられた実施例は本発明の実施に役立つ様々な構成要素および方法を例示する。実施例は特許請求の範囲に記載の本発明を限定しない。この開示に基づいて当業者は本発明の実施に役立つ他の構成要素および方法を鑑定し使用できるであろう。
【００２６】
本発明は、種々のＨＣＶ菌株に基づくＨＣＶ非構造タンパク質を供給するＨＣＶキメラポリペプチドをコードする核酸、および、ＨＣＶポリペプチドを発現するチンパンジーアデノベクターの使用を含む。記載した核酸の使用は、ＨＣＶに対するＣＭＩ応答を生じさせる広範囲の抗原を提供するＨＣＶポリペプチドを細胞に導入するためのワクチン成分としての使用、および、このようなワクチン成分を製造する中間体としての使用を含む。
【００２７】
適応型細胞性免疫応答は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩの遍在的分布によって全身のＨＣＶ感染細胞のウイルス抗原を認識し、免疫記憶を誘導し、免疫記憶を維持する機能を果たし得る。これらの機能を果たすのは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）およびＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）である。
【００２８】
特異的Ｔ細胞受容体を介して活性化されると、ＨＣＶ特異的Ｔｈ細胞は多様な免疫調節機能を発揮するが、たいていの機能にはＴｈ１およびＴｈ２サイトカインが介在する。ＨＣＶ特異的Ｔｈ細胞は、Ｂ細胞の活性化および分化ならびにウイルス特異的細胞障害性Ｔ細胞の誘導および刺激を助ける。Ｔｈ細胞はまたＣＴＬと共に、数種類のウイルスの複製および遺伝子発現を阻害するＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌し得る。さらに、Ｔｈ細胞およびＣＴＬは主要なエフェクター細胞であり、ウイルス感染細胞のアポトーシスおよび溶解を誘導できる。
【００２９】
ＨＣＶ特異的ＣＴＬは、専門的抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）によってプロセシングされた抗原に応答して生じる。抗原はｐＡＰＣ内部で合成されるかまたはｐＡＰＣ導入される。抗原をコードする発現カセットを細胞に導入することによってｐＡＰＣ内部で抗原を合成することができる。
【００３０】
核酸ワクチンの好ましい投与経路は筋肉内経路である。筋肉内投与によって核酸が体細胞およびｐＡＰＣに導入され発現されると考えられる。体細胞で産生されたＨＣＶ抗原はｐＡＰＣに輸送され、ＭＨＣクラスＩ分子に関係して抗原提示される。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：６１７−６４８，１９９７）。
【００３１】
ｐＡＰＣはプロテアソーム複合体において長い抗原をより短いペプチド抗原にプロセシングする。該抗原は小胞体／ゴルジ複合体分泌経路に転送されてＭＨＣクラスＩタンパク質に会合する。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩに会合した抗原をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８細胞表面タンパク質を介して認識する。
【００３２】
チンパンジーアデノウイルスに基づくベクターはＨＣＶ抗原導入ビヒクルとしてヒトアデノベクターに代替して使用できる。チンパンジーアデノウイルスに基づくベクターは多重免疫戦略で使用するのが特に有効である。この場合、治療される患者の体内では初回に使用したアデノベクターへの免疫応答が生じている。同種のアデノウイルスに基づくベクターとの接触が繰返されると、アデノウイルスタンパク質に対する免疫応答が原因でワクチンの有効性が低下するであろう。初回接触がアデノウイルス感染の結果という場合もあるが、このような感染は恐らく、ＨＣＶ以外の疾患を治療するためにアデノベクターを使用したことによって生じたものであろう。
【００３３】
ここに与える指針に基づいて、患者体内で有益な効果を発揮する十分に強力な免疫応答を発生できる。これらの指針は、ＨＣＶ配列の選択、ベクター選択、ベクター産生、併用治療および投与に関する情報を含む。
【００３４】
Ｉ．キメラ配列
種々のＮＳ３−４Ａ配列をもつ領域を提供するＨＣＶキメラポリペプチドは、種々のＨＣＶ菌株を標的とする抗原を提供するワクチン成分として使用できる。ＨＣＶの主な特徴はそのゲノムの不均質性である。（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，７：４５−６６，２００３，Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ．Ｖｉｒｏｌ，８５：３１７３−３１８８，２００４）。さらに、ＲＮＡウイルスに共通の典型的な誤りがちのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび不十分なプルーフリーディング活性から生じた突然変異ならびに宿主から生じた突然変異は、ＨＣＶが偽種と呼ばれる複合ウイルス集団として宿主体内で循環する原因となる。（Ｂｌｉｇｈｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１９７２−１９７４，２０００）。
【００３５】
キメラ構築物の異なる領域に存在する異なるＮＳ３−４Ａ配列は、１つ以上のアミノ酸の違いとして表れる。アミノ酸の違いはおのおの独立に付加、置換または欠失である。種々の実施態様で、第一および第二の領域のＮＳ３−４Ａ配列は、少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％だけ違っている。または、少なくとも１、５、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸の変更が存在する。ＮＳ３−４Ａ領域はＮＳ３−４Ａ配列に加えて、アミノ末端メチオニンのような付加アミノ酸および／または導入された開裂部位を含み得る。
【００３６】
相違パーセントは配列一致を１００から減算することによって決定できる。例えば、８５％配列一致は１５％相違を与える。
【００３７】
キメラポリペプチドに存在する第一領域および第二ポリペプチド領域は、天然産生ＨＣＶ単離物の多くの例に基づいて容易に作製できる。ＨＣＶ単離物は１つ以上のサブタイプを含む以下の６つの主要遺伝子型に分類できる：ＨＣＶ−１／（１ａ，１ｂ，１ｃ）、ＨＣＶ−２／（２ａ，２ｂ，２ｃ）、ＨＣＶ−３／（３ａ，３ｂ，１０ａ）、ＨＣＶ−４／（４ａ）、ＨＣＶ−５／（５ａ）およびＨＣＶ−６／（６ａ，６ｂ，７ｂ，８ｂ，９ａ，１１ａ）。（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，６９３−７１２，２００１）。ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＮおよびＨＣＶ−Ｈのような特定のＨＣＶ配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託され種々の刊行物に記載されている。（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，１３４１−１３４７，１９９７）。
【００３８】
好ましくは、第一領域および第二領域の双方がＨＣＶプロテアーゼによってインビボでプロセシングされ、ＨＣＶキメラポリペプチドに存在する個々のタンパク質に対応する個々のタンパク質を提供する。個々のＨＣＶタンパク質は細胞によってさらにプロセシングされ得る。
【００３９】
第一領域に関する種々の実施態様では、該領域が、以下に存在するＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域に実質的に相似のアミノ酸配列であるかまたは該アミノ酸配列を内包する：配列１のアミノ酸１−６８６；ＨＣＶ １ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６２３２１）；ＨＣＶ ２ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ００９４４；ＨＣＶ ３ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ２８９１７）；ＨＣＶ ４ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１１６０４）；ＨＣＶ ５ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１３１８４）またはＨＣＶ ６ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ８４２６４）。
【００４０】
第二領域に関する種々の実施態様では、該領域が、以下に存在する対応領域に実質的に相似のＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡまたはＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊配列であるかまたは該配列を内包する：配列１のアミノ酸６８６−２６７５、アミノ酸６９１−２６７５またはアミノ酸６９２−２６７５；ＨＣＶ １ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６２３２１）；ＨＣＶ ２ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ００９４４；ＨＣＶ ３ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ２８９１７）；ＨＣＶ ４ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１１６０４）；ＨＣＶ ５ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１３１８４）またはＨＣＶ ６ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ８４２６４）。“ＮＳ５Ｂ＊”という表記は不活性ＮＳ５Ｂを表す。
【００４１】
好ましくは第二領域が、第一領域由来のプロテアーゼ活性に適合性のアミノ酸開裂部位を含む。開裂部位は既知の開裂配列に基づいて付加できる。
【００４２】
アミノ酸配列に関する“実質的に相似の配列”という表現は、基準配列に対する少なくとも約７０％の一致を意味する。基準配列に対するパーセント一致（一致パーセントと表すこともある）を決定するためには、最大数の一致アミノ酸が得られるようにポリペプチド領域を対応する基準領域に位置合せし、対応領域の一致アミノ酸の数を測定する。この数を基準領域のアミノ酸の総数で除算し、次いで１００を乗算し、最も近い整数に丸める。
【００４３】
種々の実施態様で、実質的に相似の配列は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の一致を有しているか；または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。変更はおのおの独立に挿入、置換または付加である。
【００４４】
天然産生ＨＣＶ配列に修飾を生じさせて実質的に相似の種々の配列を得ることもできる。天然産生アミノ酸の違いはアミノ酸側鎖（Ｒ基）の違いに起因する。Ｒ基は、物理的寸法、電荷および疎水性のようなアミノ酸の種々の特性を左右する。アミノ酸は以下のような種々のグループに分類できる：中性かつ疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン）；中性かつ極性（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）。
【００４５】
活性を維持するために種々のアミノ酸を置換する場合、一般には同様の特性を有しているアミノ酸で置換するのが好ましい。バリンでロイシンを、アルギニンでリシンを、アスパラギンでグルタミンを置換するような特定グループ内部の異なるアミノ酸の置換が、ポリペプチド三次構造の変化を生じない良好な候補である。
【００４６】
アミノ酸修飾はＴ細胞抗原領域を好ましく維持または追加する。広範囲のＴ細胞応答を誘発できるポリペプチドを産生するために天然産生ＨＣＶポリペプチドに様々な修飾を行うことが可能である。広いＴ細胞応答を誘発するポリペプチドの能力を左右する要因は、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞抗原の保存または導入、および、種々のＨＣＶ単離物中の種々のＴ細胞抗原領域の存在数である。
【００４７】
ＨＣＶ Ｔ細胞抗原は例えば実験作業によって同定できる。Ｔ細胞抗原を同定する１つの方法は、長いポリペプチドから一連の短いオーバーラップペプチドを作製し、次いで、感染患者に由来のＴ細胞集団を陽性クローンに基づいてスクリーニングする段階を含む。陽性クローンは特定のペプチドによって活性化／プライムされる。ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＦＮγ−細胞内染色およびバルクＣＴＬアッセイのような技術がペプチド活性の測定に使用できる。このようにして同定したペプチドは、それぞれの病原体のＴ細胞エピトープを表すと考えることができる。
【００４８】
自己をプロセシングしてＣＭＩ応答を生じるＨＣＶポリペプチドの能力は、ここに記載の技術または当業界で公知の技術を使用して判定できる。（参照：例えばＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。このような技術は、ＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答を測定するためのＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＦＮγ−細胞内染色およびバルクＣＴＬアッセイの使用を含む。
【００４９】
複製に必須のモチーフを標的組換えすることによって不活性ポリメラーゼを産生するためにＮＳ５Ｂに小さい修飾を行ってもよい。ＮＳ５Ｂ活性に必須のモチーフおよび不活性ＮＳ５Ｂを産生するために行うことができる修飾の例は、Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：８４１６−８４２６，１９９７、Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：２０４６−２０５１，２０００およびＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されている。
【００５０】
キメラＨＣＶポリペプチドを修飾するときに考慮すべき追加要因は、自己プロセシング能力の維持およびＴ細胞抗原の維持を含む。ポリペプチドの自己プロセシング能力は機能性プロテアーゼ活性によってほぼ判定できる。プロテアーゼ活性を維持する修飾は、ＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ３の補因子として役立つＮＳ４Ａ、および、ＨＣＶポリペプチド内部に存在するプロテアーゼ認識部位を考慮することによって得られる。
【００５１】
ＩＩ．キメラＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊
好ましいキメラＨＣＶポリペプチドは、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊である。下付き文字１および２は、種々のＨＣＶ菌株中の対応する領域に実質的に相似の配列をもつ領域を表し、“ＮＳ５Ｂ＊”は酵素的に不活性のＮＳ５Ｂを表す。ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１とＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２とは少なくとも１つのアミノ酸が違っている。種々の実施態様で、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１とＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２とは少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％違っている；または、少なくとも１、５、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸の変更が存在する。
【００５２】
好ましくは、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊ポリペプチドは、第一および第二領域のおのおのが１つ以上の個別ＨＣＶペプチドを産生するために十分なインビボのプロテアーゼ活性を提供する。好ましい実施態様で、ポリペプチドは、ＮＳ３１、ＮＳ４Ａ１、ＮＳ３２、ＮＳ４Ａ２、ＮＳ４Ｂ２、ＮＳ５Ａ２、ＮＳ５Ｂ２＊を個別ペプチドとして産生できる。
【００５３】
種々のＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１およびＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊領域は上述の項Ｉに記載のようにして供給される。種々の実施態様で、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１領域は、配列１のアミノ酸１−６８６もしくはアミノ酸２−６８６に実質的に相似の配列であるかまたは該配列を内包する。ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊領域は、配列１のアミノ酸６８７−２６７５、６９１−２６７５もしくは６９２−２６７５に実質的に相似の配列であるかまたは該配列を含む。または、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊が全体として配列１に実質的に相似である。種々の実施態様で、各領域は配列１の対応する領域に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％だけ実質的に相似であるか、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。
【００５４】
ＩＩＩ．遺伝子発現カセット
ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットは、ポリペプチド発現に必要な要素を含む。“ポリペプチド”という表現はキメラポリペプチドを含意する。
【００５５】
ＩＩＩ．Ａ．コードされたポリペプチド配列
本文中に記載のＨＣＶポリペプチドをコードした配列は種々のベクターに使用できる。特定例は、項ＩおよびＩＩに前述したようなキメラポリペプチド配列、および、配列１６に実質的に相似の配列のようなＨＣＶポリペプチド配列Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊を含む（参照：Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。配列１６に実質的に相似の配列は、例えば項Ｖに後述するようなチンパンジーベクターに結合して使用できる。
【００５６】
様々な実施態様で、配列１６に実質的に相似の配列は、配列１６に７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列一致を有しているか、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。
【００５７】
ＩＩＩ．Ｂ．コードされたポリペプチド配列
遺伝子発現カセット中に存在する調節要素は一般に、（ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写可能に連結されたプロモーターと、（ｂ）ヌクレオチド配列に機能的に連結された５’リボソーム結合部位と、（ｃ）ヌクレオチド配列の３’端に接合されたターミネーターと、（ｄ）ヌクレオチド配列に機能的に連結された３’ポリアデニル化シグナルとを含む。遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングに役立つ追加の調節要素が存在してもよい。
【００５８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、下流領域の転写を媒介する遺伝子要素である。好ましいプロモーターは、高い転写レベルを与える強プロモーターである。強プロモーターの例は、前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）およびイントロンＡをもつＣＭＶである。（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６，１９９１）。プロモーターの追加例は、ＥＦ１アルファプロモーター、ネズミＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターのような天然産生プロモーター、ならびに、合成の筋特異的プロモーター、キメラ筋特異的／ＣＭＶプロモーターのような人工プロモーターである。（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２４１−２４５，１９９９，Ｈａｇｓｔｒｏｍら，Ｂｌｏｏｄ ９５：２５３６−２５４２，２０００）。
【００５９】
リボソーム結合部位は開始コドンまたはその近傍に局在する。リボソーム結合部位の例は、ＣＣＡＣＣＡＵＧＧ、ＣＣＧＣＣＡＵＧＧおよびＡＣＣＡＵＧＧを含み、ここにＡＵＧは開始コドンである。（Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ ４４：２８３−２９２，１９８６）。リボソーム結合部位の別の例は、配列１８によって示される。
【００６０】
ポリアデニル化シグナルは、転写ＲＮＡを開裂しＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加する。高等真核生物のポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化付加部位から約１１−３０ヌクレオチドにＡＡＵＡＡＡ配列を含んでいる。ＡＡＵＡＡＡ配列は、ＲＮＡ開裂シグナルの伝達に関与する。（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）。ポリ（Ａ）テールはｍＲＮＡプロセシングに重要である。
【００６１】
遺伝子発現カセットの部分として使用できるポリアデニル化シグナルは、ミニマルラビットβ−グロブリンポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ）シグナルを含む（Ｘｕら，Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−１５６，２００１，Ｐｏｓｔら，米国特許Ｎｏ．５，１２２，４５８）。追加例は、合成ポリアデニル化シグナル（ＳＰＡ）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。ＳＰＡ配列は配列１９によって示されている。
【００６２】
“転写可能に連結された”という表現は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合することによってヌクレオチド配列の転写が生じるようにプロモーターが配置されていることを表す。転写可能に連結されたとしても、転写される配列がプロモーターに隣接する必要はない。
【００６３】
“機能的に連結された”という表現は、ヌクレオチド配列に間接的効果を与える能力を意味する。機能的に連結されたとしても、連結された配列が互いに隣接する必要はない。ヌクレオチド配列に機能的に連結された３’ポリアデニル化シグナルは、転写されたＲＮＡの開裂およびポリアデニル化を促進する。ヌクレオチド配列に機能的に連結された５’リボソーム結合部位はリボソーム結合を促進する。
【００６４】
遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングを増進または調節するために有用な調節要素の追加例は、エンハンサー、リーダー配列およびオペレーターである。エンハンサー領域は転写を増進する。エンハンサー領域の例は、ＣＭＶエンハンサーおよびＳＶ４０エンハンサーである。（Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−３０，１９９５，Ｘｕら，Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−１５６， ２００１）。エンハンサー領域はプロモーターに連携できる。
【００６５】
リーダー配列は、ポリペプチドをプロテアソームに案内するポリペプチド上のアミノ酸領域である。リーダー配列をコードする核酸は構造遺伝子の５’であり、構造遺伝子と共に転写される。リーダー配列の一例はｔＰＡである。
【００６６】
オペレーター配列は遺伝子発現を調節するために使用できる。例えば、Ｔｅｔオペレーター配列は遺伝子発現を抑制するために使用できる。
【００６７】
ＩＶ．コーディング核酸配列
コーディング核酸配列は特定のアミノ酸配列をコードするコドンを提供する。特定のアミノ酸配列および遺伝子コードの既知の縮重性に基づいて異なる多数のコーディング核酸配列を得ることができる。遺伝子コードが縮重性をもつ理由は、ほぼすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレットの様々な組合せすなわち“コドン”によってコードされているからである。
【００６８】
特定のコドンが特定のアミノ酸に翻訳されることは当業界で公知である（参照：例えばＬｅｗｉｎ ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。アミノ酸は以下のようなコドンによってコードされている：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００６９】
配列１３のヌクレオチド１２６９−７２２３はＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊配列の一例を示す。配列１３のヌクレオチド１２６９−７２２３に実質的に相似の配列はワクチン成分の部分として使用できる。（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。例えば、このような実質的に相似の配列は、ＣｈＡ３またはＣｈＡ６３に基づくアデノベクターの部分として使用できる。
【００７０】
ヌクレオチド配列に関する“実質的に相似の配列”という表現は、基準配列に対する少なくとも約７０％の一致を表す。基準配列に対するパーセント一致（一致パーセントと表すこともある）を決定するためには、ヌクレオチド領域を最大一致が得られるように対応する基準領域に位置合せし、対応領域の一致ヌクレオチド数を測定する。この数を基準配列中のヌクレオチドの総数で除算し、１００を乗算し、最も近い整数に丸める。
【００７１】
核酸配列は宿主体内での発現を増進するように最適化できる。考察すべき要因は、Ｃ：Ｇ含量、好適なコドン、および、阻害性二次構造の回避を含む。特定宿主体内で発現増進を生じる核酸配列が得られるようにこれらの要因を様々に組合せる。（参照：例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら，国際公開ＷＯ ９７／４７３５８）。
【００７２】
ＨＣＶコーディング核酸の最適化も、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８らに記載されている。ＷＯ ０３／０３１５８８は、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊をコードする種々の最適化配列の例を示している。
【００７３】
ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊のコドン最適化配列の一例は、配列２のヌクレオチド１８９１−９９１５によって示される。ヌクレオチド１８９１−１８９３は、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１領域のメチオニンコドンを与える。ヌクレオチド３９４９−３９６０は、ＨＣＶ ３ａに基づく最初の４つのアミノ酸のあとにメチオニンが存在するＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２領域を与える。
【００７４】
本発明の様々な実施態様で、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊コーディング領域は、配列２のヌクレオチド１８９１−９９１５または１８９４−９９１５に実質的に相似である。様々な実施態様でヌクレオチド配列は、配列２のヌクレオチド１８９１−９９１５または１８９４−９９１５に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の一致を有するか；または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【００７５】
Ｖ．核酸ベクター
ＨＣＶポリペプチドをコードする核酸は、治療用ベクターとしてまたは治療用ベクターの製造に使用できる。治療用ベクターの製造に使用できるベクターはシャトルベクター、アデノウイルスゲノムプラスミドなどである。
【００７６】
治療用ベクターは細胞にＨＣＶポリペプチドを導入し発現させるために使用される。適正なベクターは、許容できない副作用を生じることなく標的細胞に核酸を送達できる。細胞発現は、ＨＣＶポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを使用して達成される。
【００７７】
治療用途に使用できるベクターの例は、第一世代および第二世代のアデノベクター、ヘルパー依存性アデノベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターおよびプラスミドベクターなどである。（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３１−２０６，１９９７，Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，米国特許６，１５６，５８８，Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，国際公開ＷＯ ９５／３２７３３，Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。
【００７８】
Ｖ．Ａ．アデノベクター
アデノベクターは、標的細胞中で所望のタンパク質またはポリペプチドを発現させるために組換えアデノウイルスゲノムを使用する。野生型アデノウイルスは、両端に逆方向末端反復配列をもつ二重鎖の直鎖状ゲノムを有している。ウイルス複製中にゲノムがウイルスキャプシド内部にパッケージされてビリオンを形成する。ウイルスはウイルス付着によって標的細胞に侵入し、次いでインターナリゼーションを達成する。（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３１−２０６，１９９７）。
【００７９】
アデノウイルスゲノムは、アデノウイルスの複製およびプロセシングに必要な種々の要素を提供する。アデノウイルスゲノムの各末端は、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでおり、これらはウイルス複製に必要である。該ウイルスはまた、感染性ビリオンの産生に必要なある種の構造タンパク質をプロセシングするために必要なプロテアーゼ活性をコードしている。
【００８０】
アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞に形質導入後のウイルス遺伝子の発現順序に基づいて記述できる。ウイルス遺伝子は、転写がＤＮＡ複製開始の以前に生じるかまたは以後に生じるかに従って初期（Ｅ）遺伝子または後期（Ｌ）遺伝子と呼ばれる。転写の初期段階で、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子が発現されて宿主細胞のウイルス複製を準備する。ウイルスゲノムの必須初期領域１（Ｅ１）の欠失によってウイルスを複製欠陥にできる（Ｂｒｏｄｙら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７／６：９０−１０１，１９９４）。
【００８１】
後期段階で、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５の発現がスイッチオンされる。すべての後期遺伝子が単一プロモーターのコントロール下にあり、ペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、１００ｋＤａのスカフォールドタンパク質およびファイバータンパク質（Ｌ５）を含むタンパク質をコードしており、これらは、アデノウイルスＤＮＡをキャプシド封入した新しいウイルス粒子を形成する。最後に、野生型アデノウイルス複製プロセスが細胞溶解を惹起する。
【００８２】
アデノベクターは、ヒトまたは動物に見出されるような種々のアデノウイルス血清型に基づく。動物アデノウイルスの例は、ウシ、ブタ、チンパンジー、ネズミ、イヌおよびトリ（ＣＥＬＯ）を含む。ヒトアデノウイルスは、グループＢ、Ｃ、ＤまたはＥ血清型、例えば２型（“Ａｄ２”）、４型（“Ａｄ４”）、５型（“Ａｄ５”）、６型（“Ａｄ６”）、２４型（“Ａｄ２４”）、２６型（“Ａｄ２６”）、３４型（“Ａｄ３４”）および３５型（“Ａｄ３５”）を含む。アデノベクターは単一アデノウイルス由来または２種以上の異なるアデノウイルスに由来の領域を含有できる。
【００８３】
様々な実施態様で、アデノベクターは、Ａｄ５、Ａｄ６、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３またはそれらの組合せに基づく。Ａｄ５は、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５６：２８０−２８５，１９９２に記載されている。Ａｄ５およびＡｄ６に基づくベクターは、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されている。ＣｈＡｄ３の全長核酸配列を図６Ａ−６Ｈに示す。ＣｈＡｄ６３の全長核酸配列を図７Ａ−７Ｈに示す。
【００８４】
本発明の１つの実施態様では、アデノベクターが、表面に露出した１つ以上のチンパンジーＣｈＡｄ３またはＣｈＡｄ６３構造タンパク質を含有する。表面露出タンパク質は、ファイバー、ヘキソンおよびペントンを含む。このようなタンパク質を含むアデノベクターは、ヒトアデノウイルスタンパク質と違って、患者が予めヒトアデノウイルスに接触したときの免疫応答の影響を受け難い。
【００８５】
様々な実施態様で、組換えアデノベクターゲノムは、
ａ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｂ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｃ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている。様々な追加実施態様では、配列相似が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または、配列が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。
【００８６】
Ｖ．Ａ．１．第一世代アデノベクター
第一世代アデノベクターは、Ｅ１欠失、場合によりＥ３欠失、場合によりＥ４欠失、および、発現カセットを有する組換えアデノウイルスゲノムを含有している。欠失の範囲および組合せは、ウイルスを複製不能にし、所望産物をコードする遺伝子発現カセットを収容するために十分な大きさである。ウイルスはＥ１欠失によって複製不能になる。
【００８７】
Ｅ１欠失は、Ａｄ５の塩基対約３４２を起点とし塩基対約３５２３に達する領域、または、他のアデノウイルスの対応する領域の欠失である。好ましくは、欠失領域が、Ａｄ５の塩基対約４５０から塩基対約３５１１までの領域または他のアデノウイルスの対応する領域の除去を含む。塩基対約３４１を起点とするより大きいＥ１領域欠失は、ウイルスパッケージング促進要素を除去する。
【００８８】
Ｅ３欠失は、Ａｄ５の塩基対約２７８６５を起点とし塩基対約３０９９５に達する領域、または他のアデノベクターの対応する領域の欠失である。好ましくは、欠失領域が、Ａｄ５の塩基対約２８１３４から塩基対約３０８１７までの領域または他のアデノベクターの対応する領域の除去を含む。
【００８９】
Ｅ４欠失は、ＣｈＡｄ３の塩基対約３４６３４を起点とし塩基対約３７３４９に達する領域、または、他のアデノウイルスの対応する領域の欠失である。Ｅ４欠失は、先天性Ｅ４ｏｒｆ６を保持するかまたは別のアデノウイルス由来のＥ４ｏｒｆ６を挿入できる欠失でなければならない。Ｂｅｒｔら，国際公開ＷＯ２００４／０１８６２７は、このような異種Ｅ４ｏｒｆ６の使用を例示している。
【００９０】
Ｅ１、Ｅ３およびＥ４の欠失の組合せは、遺伝子発現カセットを含有している組換えゲノムの全体寸法が野生型アデノウイルスゲノムの約１０５％を超過しない程度の十分な大きさでなければならない。例えば、組換えアデノウイルスＡｄ５ゲノムの寸法が約１０５％を超過するとゲノムが不安定になる。（Ｂｅｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：５９１１−５９２１，１９９３）。
【００９１】
好ましくは、遺伝子発現カセットを含有している組換えアデノウイルスゲノムの寸法は、野生型アデノウイルスゲノムの寸法の約８５％から約１０５％までの範囲である。様々な実施態様で、発現カセットを含有している組換えアデノウイルスゲノムの寸法は、野生型ゲノムの寸法の約１００％から約１０５．２％、または約１００％である。
【００９２】
Ｅ１およびＥ３欠失を有しているＡｄ５またはＡｄ６ゲノムには約７，５００ｋｂを挿入できる。全く欠失が全く存在しないとき、Ａｄ５ゲノムは３５，９３５塩基対であり、Ａｄ６ゲノムは３５，７５９塩基対である。
【００９３】
ＣｈＡｄ３およびＣｈＡｄ６３ベクターは、Ａｄ５に比べて、ゲノムサイズがより大きく、また、より大きいＥ３領域が欠失可能領域として存在するので、核酸挿入容量が大きい。ＣｈＡｄ３ゲノムは、３７，７４１塩基対であり、ＣｈＡｄ６３ゲノムは３６，６４３塩基対である。
【００９４】
Ｅ１、Ｅ３が欠失しＥ４がＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置換されたＣｈＡｄ３およびＣｈＡｄ６３ベクターには約１０，８００ｂｐを挿入できる。Ｅ４がＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６によって置換されたとき、置換Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６が欠失領域よりも小さいので欠失および置換の双方である。これらのベクターには１０，８００ｂｐを挿入すると野生型ゲノムの寸法の１０５％という限度に達する。
【００９５】
第一世代のアデノベクターの複製は、Ｅ１遺伝子産物をトランスに供給することによって行うことができる。例えば、アデノウイルスＥ１領域で形質転換された細胞系を使用することによってＥ１遺伝子産物をトランスに供給できる。アデノウイルスＥ１領域で形質転換された細胞および細胞系の例は、ＨＥＫ２９３細胞、９１１細胞、ＰＥＲＣ．６ＴＭ細胞、および、トランスフェクトされた一次ヒトアミノサイト細胞である。（Ｇｒａｈａｍら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６：５９−１２，１９７７，Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７：２１０５−２１１６，２０００，Ｆａｌｌａｕｘら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１９０９−１９１７，１９９８，Ｂｏｕｔら，米国特許Ｎｏ．６，０３３，９０８）。
【００９６】
チンパンジーアデノウイルスの先天性Ｅ４領域がＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６によってシスに置換されると、Ａｄ５相補細胞系に伝播した様々な血清型のチンパンジーアデノウイルスベクターの増殖が促進されおよび／または収量が増加する。２９３およびＰＥＲ．Ｃ６細胞中のＡｄ５Ｅ１配列は、チンパンジーアデノウイルスのようなグループＣに所属するヒトアデノウイルス以外の血清型の複製を十分に相補しない。
【００９７】
発現カセットは組換えアデノウイルスゲノムの欠失Ｅ１領域または欠失Ｅ３領域に対応する領域に挿入されなければならない。発現カセットは、平行配向でもよくまたは逆平行配向でもよい。平行配向では、挿入された遺伝子の転写方向が欠失したＥ１またはＥ３遺伝子と同方向である。逆平行配向転写では、対向鎖が鋳型として機能し、転写方向が対向方向である。
【００９８】
本発明の１つの実施態様では、アデノベクターがＥ４欠失と、配列１３のヌクレオチド３４６０１−３５４８２によって示されるＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６配列に実質的に相似の配列の挿入とを含む。様々な実施態様で、配列一致は少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または、配列５のヌクレオチド３４６０１−３５４８２から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【００９９】
本発明の１つの実施態様では、アデノウイルス主鎖が、配列１３のヌクレオチド１−４６０および７４６８−３５８９０または配列１７のヌクレオチド１−４５４および７４５８−３４６５８に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のヌクレオチド配列一致を有するか、または、配列１３のヌクレオチド１−４６０および７４６８−３５８９０または配列１７のヌクレオチド１−４５４および７４５８−３４６５８から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【０１００】
発現カセットを含有するアデノベクターの別の実施態様では、配列１３または配列１７に対するヌクレオチド配列一致が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または、配列１３または配列１７から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【０１０１】
Ｖ．Ａ．２．第二世代アデノベクター
第二世代のアデノベクターは、第一世代のベクターよりも小さいアデノウイルスゲノムを含有し、相補細胞系および／またはアデノウイルスタンパク質を供給するヘルパーベクターと共に使用できる。一般的な第二世代のアデノベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２５７３−２６０４，２０００；Ｈｉｔｔら，１９９７，Ｈｕｍａｎ Ａｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４０ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｔａｌｕｃｃｉら．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：６４００−６４０９，２００５のような様々な参考文献に記載されている。第二世代のアデノベクターは、ヒトおよびチンパンジーアデノウイルスを含む様々な種類のアデノウイルスを基材にできる。
【０１０２】
Ｖ．Ｂ．ＤＮＡプラスミドベクター
ＤＮＡワクチンプラスミドベクターは、遺伝子発現カセットを複製促進要素および好ましくはベクー選択促進要素と共に含有する。好ましい要素は、非哺乳類細胞中の複製および選択可能マーカーを提供する。治療用ベクターは、ヒト細胞中の複製またはヒト核酸への組込みを提供する要素を含有してはならない。
【０１０３】
選択可能マーカーは、該マーカーを含有する核酸の選択を促進する。好ましい選択可能マーカーは、抗生物質抵抗性を与えるマーカーである。抗生物質選択遺伝子の例は、アンピシリン、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する抵抗性をコードする核酸を含む。
【０１０４】
適当なＤＮＡワクチンベクターは、細菌性複製起点と選択可能マーカーとを含有するプラスミドを出発材料として作製できる。より高い収率を与える細菌性複製起点の例は、ＣｏｌＥ１プラスミド由来の細菌性複製起点を含む。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：６１７−６４８，１９９７）。
【０１０５】
細菌性複製起点および選択可能マーカーの存在が大腸菌のような細菌株中のＤＮＡベクターの産生を可能にする。選択可能マーカーは、ＤＮＡベクターを含有しない細菌を除去するために使用される。
【０１０６】
配列２は、ＨＣＶポリペプチドをコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターの一例を示す。本発明の１つの実施態様で、プラスミドベクターは、配列２に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のヌクレオチド相似配列を有するか、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【０１０７】
ＶＩ．ベクター作製
ベクターは、制限酵素、核酸結合および相同的組換えの使用を含む組換え核酸技術を使用して作製できる。組換え核酸技術は当業界で公知である。（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、および、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【０１０８】
治療用ベクターを得るためまたは発現カセットもしくはその一部分を１つのベクターから他のベクターに移すためには中間ベクターを使用する。中間ベクターの例は、アデノウイルスゲノムプラスミドおよびシャトルベクターを含む。
【０１０９】
中間ベクター中の有用な要素は、複製起点、選択可能マーカー、相同的組換え領域および適正な制限部位を含む。適正な制限部位は、核酸配列のクローニングまたは遊離を促進するために使用できる。
【０１１０】
相同的組換え領域は、別の核酸分子中の標的領域に相同的な核酸配列領域を供給する。相同的領域は標的領域に挿入される核酸配列に隣接する。様々な実施態様で、相同的領域は、約１５０から６００ヌクレオチドの長さまたは約１００から５００ヌクレオチドの長さである。
【０１１１】
本発明の１つの実施態様は、ＨＣＶポリペプチドを発現する発現カセット、選択可能マーカー、細菌性複製起点、発現カセットを標的組換えによってＥ１領域に挿入または置換する第一のアデノウイルス相同性領域および第二のアデノウイルス相同性領域を含有するシャトルベクターを記載する。第一および第二の相同性領域は、発現カセットに隣接する。第一の相同性領域は、塩基対ほぼ４−４５０からの野生型アデノウイルスの領域の少なくとも右端（３’端）に実質的に相同の少なくとも約１００塩基対を含有する。第二の相同性領域は、塩基対ほぼ３５１１−５７９２からのＡｄ５の少なくとも左端（５’端）または別のアデノウイルスの対応する領域に実質的に相同の少なくとも約１００塩基対を含有する。
【０１１２】
“実質的に相同の”という表現は、標的領域と特異的組換えを行うために十分な相同度を表す。様々な実施態様で、実質的相同は、少なくとも８５％、少なくとも９５％または１００％の配列一致を表す。
【０１１３】
アデノベクターの１つの作製方法は、発現カセットを含有するプレアデノウイルスゲノムプラスミドの作製を経由する。該プレアデノウイルスプラスミドは、所望の相補細胞系中で複製されるために必要なすべてのアデノウイルス配列を含有する。次いでプレアデノウイルスプラスミドを制限酵素で消化してＩＴＲを遊離させ、相補細胞系にトランスフェクトしてウイルスを回収する。複製が生じ得るためにはＩＴＲがプラスミド配列から遊離されなければならない。アデノベクターの回収によって、発現カセットを含有するアデノベクターが得られる。（参照：例えばＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。
【０１１４】
ＶＩ．Ａ．アデノウイルスゲノムプラスミド
アデノウイルスゲノムプラスミドは、より長いプラスミド（コスミドでもよい）の内部にアデノベクター配列を含有している。より長いプラスミドは、プラスミドの製造および維持に使用される手順次第では真核細胞または原核細胞中の増殖および選択を促進する要素のような追加要素を含有している。アデノウイルスゲノムプラスミドは好ましくは、Ｅ１またはＥ３欠失領域に挿入された遺伝子発現カセットを有している。
【０１１５】
アデノウイルスゲノムプラスミド製造技術には、シャトルベクターおよび相同的組換えを使用する技術、アデノウイルスコスミドへの遺伝子発現カセットの挿入を含む技術などがある。（Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−３０，１９９５，Ｄａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１７０７−１７１４，２０００）。
【０１１６】
本発明の１つの実施態様は、アデノウイルスゲノムプラスミドを作製する相同的組換え段階と、アデノウイルス回収段階とを含むアデノベクターの製造方法を記載する。相同的組換え段階は、アデノウイルス相同領域に隣接されたＨＣＶポリペプチド発現カセットを含有するシャトルベクターの使用を含む。アデノウイルス相同領域は、Ｅ１またはＥ３欠失領域に発現カセットを標的組換えする。
【０１１７】
ＶＩ．Ｂ．アデノベクター回収
アデノベクターは当業界で公知の方法またはここに記載の方法を使用してを組換えアデノウイルスゲノムプラスミドから回収できる。当業界で公知のアデノウイルス回収技術の例は、Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−３０，１９９５およびＤａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１７０７−１７１４，２０００に示されている。
【０１１８】
アデノベクター回収方法の一例は、アデノウイルス複製の増進を含む。増進は例えば、Ｅ２タンパク質（ポリメラーゼ、プレターミナルタンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）ならびにＥ４ｏｒｆ６のようなアデノウイルス機能を別のプラスミドから供給することによって実行できる（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。
【０１１９】
ＶＩＩ．ＨＣＶ併用治療
ＨＣＶ核酸ワクチンは患者を治療するために単独で使用してもよく、他のＨＣＶ治療薬と併用してもよく、他の種類の疾患を対象とする薬剤と共に使用してもよい。追加治療薬は、ＨＣＶおよびＨＣＶ感染個体で有病率が高い疾患を治療する治療薬を含む。別種の疾患を対象とする薬剤は、ＨＩＶおよびＨＢＣに特異的なワクチンを含む。
【０１２０】
ＨＣＶを治療するための追加治療薬はワクチンおよび非ワクチン薬を含む。（Ｚｅｉｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ７０：１４５７−１４６９，２００１）。追加ＨＣＶワクチンの例は、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２またはｐ７領域に対する免疫応答を誘発するように設計されたワクチンを含む。ワクチン成分の例は、天然産生ポリペプチド、ＨＣＶミモトープポリペプチド、または、このようなポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０１２１】
一般的なミモトープ作製技術および種々のＨＣＶミモトープを記載している参考文献は、Ｆｅｌｉｃｉら，米国特許Ｎｏ．５，９９４，０８３およびＮｉｃｏｓｉａら，国際出願ＷＯ ９９／６０１３２である。ＨＣＶミモトープは天然産生ＨＣＶ抗原に融合できる。
【０１２２】
現在認可されている抗ＨＣＶ薬はリバビリンと併用されるインターフェロンαである。組換えインターフェロンおよびＰＥＧ付加インターフェロンのような様々な形態のインターフェロンαをＨＣＶ感染の治療に使用できる。（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５Ｓ：１−１６，２００３，Ｗａｌｋｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １４：１−２１，２００３）。
【０１２３】
異なる多様な抗ＨＣＶ薬が様々な臨床開発段階にある。開発中の種々の抗ＨＣＶ薬は、種々のＨＣＶ標的に特異的な薬剤を含む。種々のＨＣＶ標的の例は、ＨＣＶポリメラーゼおよびＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを含む。（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：１−１６，２００３，Ｗａｌｋｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １４：１−２１，２００３）。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．医薬投与
ＨＣＶワクチンはここに提供した指針を当業界で公知の技術と共に使用して配合し患者に投与できる。一般的な医薬投与の指針は、Ｍｏｄｅｒｎ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｋｕｒｓｔａｋ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄ．Ｃｏ．１９９４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０；およびＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に示されている。これらの文献はいずれも参照によって本発明に組込まれるものとする。
【０１２５】
ＨＣＶワクチンは、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経皮、皮膚圧入または鼻腔内のような種々の経路で投与できる。好ましい経路は筋肉内である。
【０１２６】
筋肉内投与は、１つ以上の電気パルスを伴うかまたは伴わない注射のような様々な技術を使用して行うことができる。電気介在移入は体液性および細胞性の双方の免疫応答を刺激することによって遺伝子免疫感作を補助する。
【０１２７】
ワクチン注射は、有針または無針の注射システムを使用する種々の技術を使用して行うことができる。無針注射システムの一例はジェット注射デバイスである。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，国際公開ＷＯ ９９／５２４６３）。
【０１２８】
電気介在移入すなわちジーン・エレクトロ・トランスファー（ＧＥＴ）は、核酸注入後に適正な電気パルスを送達することによって行うことができる。（参照：Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ，国際公開ＷＯ ９８／４３７０２およびＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）
ＶＩＩＩＡ．医薬担体
医薬的に許容される担体は、ワクチンの保存および対象へのワクチン投与を容易にする。医薬的に許容される担体の例をここに示す。医薬的に許容される追加の担体は当業界で公知である。
【０１２９】
医薬的に許容される担体は、バッファ、標準生理食塩水またはリン酸塩緩衝生理食塩水、ショ糖、塩およびポリソルベートのような様々な成分を含有し得る。医薬的に許容される担体の一例は、２．５−１０ｍＭのトリスバッファ、２５−１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５−１０％ショ糖、０．０１−２ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００１％−０．０１％のポリソルベート８０（植物由来）である。ｐＨは約７．０−９．０でよい。担体の１つの具体例は、５ｍＭのトリス、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％ショ糖、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のポリソルベート８０をｐＨ８．０で含有している。
【０１３０】
ＶＩＩＩ．Ｂ．投薬計画
適正投薬計画は、特定ワクチンの効力、ならびに、患者の年齢、体重、性別および医学的状態、投与経路、所望の効果、投与回数などの要因を考慮して決定できる。特定ワクチンの効力は、細胞で発現およびプロセシングされＭＨＣクラスＩおよびＩＩ複合体に関係して提示されるポリペプチドを産生する特定ワクチンの能力のような様々な要因に依存する。
【０１３１】
患者に投与されたＨＣＶポリペプチドをコードする核酸は、アデノベクターのようなウイルスベクターを含む様々なタイプのベクターおよびＤＮＡプラスミドワクチンの部分を構成し得る。ＤＮＡプラスミドの投与に関する様々な実施態様では、約０．１から１０ｍｇのプラスミドを患者に投与し、また、約１から５ｍｇのプラスミドを患者に投与する。ウイルスベクター好ましくはアデノウルイスベクターの投与に関する様々な実施態様では、約１０５から１０１１のウイルス粒子を患者に投与し、また１０７から１０１０のウイルス粒子を患者に投与する。
【０１３２】
ウイルスベクターワクチンおよびＤＮＡプラスミドワクチンは、単独で投与してもよく、または、プライム（初回抗原刺激）およびブースト（追加抗原刺激）を含む投与計画の部分であってもよい。プライムおよびブーストの混合接種法は、ＤＮＡワクチンでプライムしウイルスベクターワクチンでブーストする方法、または、ウイルスベクターワクチンでプライムし、ＤＮＡワクチンでブーストする方法を含む。
【０１３３】
例えば約２から４回またはそれ以上の多数プライムを使用し得る。プライムとブーストとの間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月から１年の範囲であるが、他の時間枠を使用してもよい。個体に抗アデノウイルス免疫応答が既に存在する場合にはＤＮＡワクチンでプライムする投与計画の使用が好ましい。
【０１３４】
本発明の１つの実施態様では、初回ワクチン接種でＤＮＡワクチンを筋肉組織に直接接種する。初回ワクチン接種後のブーストはアデノベクターまたはＤＮＡワクチンで行う。
【０１３５】
免疫応答をブーストするために、インターロイキン−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＰ１０およびＭｉｇ−１のような補助薬剤を併用投与できる。補助薬剤はタンパク質としてまたは核酸ベクターの使用を介して併用投与できる。
【０１３６】
ＶＩＩＩ．Ｃ．異種プライム−ブースト
異種プライム−ブーストは、プライムに１つの種類のウイルスベクターを使用し、ブーストに別の種類のウイルスベクターを使用する混合方式である。異種プライム−ブーストは、種々のアデノウイルス血清型に基づくベクターのような近縁ベクター、ならびに、異なる動物のアデノウイルスおよびポックスウイルスのようなより遠縁のウイルスを含み得る。マウスをマラリアから守るためにポックスウイルスとアデノベクターとを使用することは、Ｇｉｌｂｅｒｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１０３９−１０４５，２００２によって示されている。ＨＣＶポリペプチドを発現するチンパンジーアデノベクターは、異種プライム−ブーストに使用できるベクターを提供する。
【０１３７】
プライムとブーストとの間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月から１年の範囲であるが、他の時間枠を使用してもよい。最小時間枠は、免疫静止を考慮した十分な時間でなければならない。１つの実施態様では、この静止に少なくとも６ヶ月間を要する。プライムは１種類のベクターによる多回、例えば２から４回のプライムを含み得る。
【０１３８】
ポックスウイルスベクター中に存在する発現カセットは、当該ポックスウイルスまたは別のポックスウイルス構成員の先天的プロモーターまたはそれらに由来するプロモーターを含有しなければならない。ワクシニアウイルス、変性ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、変性ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ、カナリアポックスウイルス（例えばＡＬＶＡＣ）、トリポックスウイルス、ウシポックスウイルスおよびＮＹＶＡＣに基づくベクターのような様々な種類のポックスウイルスに基づくベクターを構築し使用する様々な戦略が当業界で公知である。（Ｍｏｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７５５：２５−３８，１９８２；Ｅａｒｌら，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；１９９１：１６．１６．１−１６．１６．７；Ｃｈｉｌｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４（２）：６２５−９，１９９０；Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：２１７−２３２，１９９２；米国特許Ｎｏｓ．，４，６０３，１１２，４，７２２，８４８，４，７６９，３３０，５，１１０，５８７，５，１７４，９９３，５，１８５，１４６，５，２６６，３１３，５，５０５，９４１，５，８６３，５４２，および５，９４２，２３５）。
【０１３９】
ＶＩＩＩ．Ｄ．アジュバント
ＨＣＶワクチンはアジュバントと共に配合できる。アジュバントは免疫原の免疫応答発生を補助する物質である。アジュバントは、生物学的または免疫学的半減期を延長する、免疫調節補助物質として作用する、または、免疫調節サイトカインの産生を誘導する、などの様々なメカニズムによって機能できる。種々のアジュバントを併用することもできる。
【０１４０】
ＨＣＶワクチンはアジュバントと共に配合できる。アジュバントの例は、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルヒドロゲル、リピドＡおよびそれらの誘導体または変異体、フロインド不完全アジュバント、中性リポソーム、ワクチンおよびサイトカインを内包するリポソーム、非イオン性ブロックコポリマー、ケモカイン、ならびに、免疫調節剤である。
【０１４１】
ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含有する非イオン性ブロックコポリマー、例えば、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーはアジュバントとして使用し得る（Ｎｅｗｍａｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ７５：８９−１４２，１９９８）。非イオン性ブロックコポリマーとアニオン性界面活性剤との併用によって核酸の免疫応答を増進できる。
【０１４２】
サイトカイン、ホルモン、脂質誘導体および低分子のような様々な種類の化合物を免疫調節剤として使用できる。免疫調節剤の例は、抗−ＣＴＬＡ−４、抗−ＣＤ１３７、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ２８、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ２５、抗ＰＤ１、抗−ＰＤ−Ｌｌ、抗−ＰＤ−Ｌ２、ＦＯＸＰ３−ブロッキング剤、Ｆｌｔ−３リガンド、イミキモッド、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サルグラモスチン、トール様受容体（ＴＬＲ）−７アゴニストおよびＴＬＲ−９アゴニストである。
【０１４３】
アジュバント配合物の具体例は、ＣＲＬ−１００５（ＣｙｔＲｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＤＮＡおよびベンジルアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）を含有する配合物である。ＣＲＬ−１００５配合物は、例えばＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されているように調製できる。
【０１４４】
ＶＩＩＩ．Ｅ．ワクチン保存
ワクチンは様々な種類のバッファを使用して保存できる。例えば、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されたバッファＡ１０５を使用できる。
【０１４５】
ＤＮＡの保存は微量金属イオンの除去またはキレート化によって強化できる。ＤＮＡワクチンの安定性を強化するためにコハク酸またはリンゴ酸のような試薬とキレート化剤とを使用できる。キレート化剤の例は、多くのリン酸塩リガンドおよびＥＤＴＡである。また、エタノールまたはグリセロールのような非還元性フリーラジカルスカベンジャーの含有はフリーラジカル発生によるＤＮＡプラスミドの損傷を防止するために役立つ。さらに、ＤＮＡワクチンの安定性を最適化するために、配合物中のバッファの種類、ｐＨ、塩濃度、露光、バイアルの製造に使用した滅菌法などをコントロールするとよい。
【０１４６】
ＩＸ．実施例
本発明の様々な特徴をさらに詳細に説明するために実施例を以下に示す。実施例はまた本発明の有用な実施方法も示している。これらの実施例は特許請求の範囲に記載した本発明を限定しない。
【実施例１】
【０１４７】
ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ３ゲノム配列の注釈
ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ３を、“ヒトアデノウイルスＣ”群（ＨＡｄＶ−Ｃ；分類ＩＤ：１２９９５１）のすべてのタンパク質配列で作成されたローカルデータベースにブラストした。特定の分類ＩＤをサーチすることによってタンパク質配列をＮＣＢＩサーバーからダウンロードした。ブラストサーチはｂｌａｓｔｘプログラムを使用して行った。列中に示す配列の数を１０００に設定し、Ｆｉｌｔｅｒをスイッチオフにした。次に、大規模配列相似解析用のＢＬＡＳＴ強調ツールであるＭＳＰｃｒｕｎｃｈによってブラスト結果を解析した。
【０１４８】
２つのゲノム配列について得られたＣＤＳ注釈のおのおのをＡＴＧおよび終結コドンの位置と必要ならばスプライシング部位の位置とを観察することによって手作業で確認した。このような産物の相同による予測の妥当性を検証するために、すべての産物を以前に作成されたアデノウイルスタンパク質データベースにｂｌａｓｔｐでサーチした。ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ３の無加工のゲノム配列をＭＳＰｃｒｕｎｃｈ結果および手作業の校正に従ってＶＮＴＩで注釈した。遺伝子産物のＣｈＡｄ３およびＣｈＡｄ６３を表１および２に示す。
【０１４９】
【表１】
【０１５０】
【表２】
【実施例２】
【０１５１】
ＣｈＡｄ３ベクター構築
ＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ４Ａｄ５ｏｒｆ６ベクターの構築は以下の段階を含む。
【０１５２】
Ｉ．サブグループＣシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ３ウイルスゲノムを完全に配列決定し（配列１４）、その情報を使用して、相同的組換えによって完全ゲノムを容易にクローニングできるシャトルベクターを構築した。要約すると、ここでｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰと呼ぶサブグループＣチンパンジーアデノウイルス３をクローニングするために使用したシャトルベクターを以下の手順で構築した。ｐＩＸコーディング領域を含有しているＣｈＡｄ３ ＤＮＡフラグメント（ｎｔ３５４２−４１０５）を配列２０および２１のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、Ｓｇｆ１−ＡｓｃＩで消化し、次いで、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳＣＶ３２−３にクローニングして、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３Ｄを作製した。ＣｈＡｄ３右端（ｎｔ３７３２０−７４４１）を配列２２および２３のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３Ｄに結合して、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＤを作製した。ＣｈＡｄ３ウイルスＤＮＡ左端（ｎｔ１−４６０）を配列２４および２５のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＳｇｆＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳｇｆＩで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＤにクローニングし、このようにしてｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＬＤを作製した。このウイルスＤＮＡカセットはまた、消化によってプラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡが遊離されるように双方のＩＴＲの末端に局在する制限酵素部位（ＰｍｅＩ）も含むように設計した。
【０１５３】
ＩＩ．ΔＥ１ ＣｈＡｄ３ベクターの構築
ＣｈＡｄ３ベクターはＢＪ５１８３大腸菌株中の相同的組換えによって構築した。ＢＪ５１８３細胞を、ＣｈＡｄ３精製ウイルスＤＮＡとＢｓｔＥＩＩおよびＢｓｔ１１０７１で消化したｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰシャトルベクターとによって同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子、直鎖化ｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰの末端に存在する右ＩＴＲ ＤＮＡ配列とウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同的組換えによってウイルスゲノムＤＮＡがプラスミドベクターに挿入され、同時に、Ｅ１領域が欠失してＥＧＦＰ発現カセットで置換された。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ポリＡ）に基づくＨＣＶ ＮＳ領域発現カセットを、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載された手順で構築し、ＨＣＭＶおよびＢｇｈ−ポリＡのＤＮＡ配列間の相同性を利用した相同的組換えによってＢＪ５１８３大腸菌株中のＣｈＡｄ３ΔＥ１ＥＧＦＰベクターに挿入した。
【０１５４】
ＩＩＩ．Ｅ３領域欠失
ＣｈＡｄ３ベクター主鎖に完全なＥ３領域の欠失を導入するために、Ｅ３遺伝子に隣接する２つのＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅して２つのＤＮＡフラグメントを作製した。４８６ｂｐのフラグメントはｎｔ２８１５９からｎｔ２８６４４（ｐＶＩＩＩ遺伝子の３’、Ｅ３領域の上流）の範囲であり、４７４ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ファイバー遺伝子の３’端（ｂｐ３２６３３からｂｐ３３１０６まで、Ｅ３領域の下流）を含んでいる。第一のＤＮＡフラグメントの３’端および第二のフラグメントの５’端にＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。２つのＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、インビトロ結合によって接合した。得られたＤＮＡフラグメント（９８８ｂｐ）を次に、ｐＶＩＩＩ順方向オリゴおよびファイバー逆方向オリゴを使用してさらに増幅した。
【０１５５】
互いに接合した３’および５’のＤＮＡフランキング領域を含有している９８８ｂｐのＥ３領域のＤＮＡフラグメントを、ＢＪ５１８３細胞の同時形質転換によって、ＨｐａＩ（野生型ＣｈＡｄ３の３２３８４ｂｐでＥ３領域切断）で直鎖化したｐＣｈＡｄ３ΔＥ１／ＥＧＦＰに組換えて、Ｅ３欠失を導入した。最終組換え産物はｐＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰプレアデノプラスミドであった。
【０１５６】
ＩＶ．Ｅ４領域の欠失およびＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の挿入
ＣｈＡｄ３Ｅ４領域をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置換するために、Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６を、ＣｈＡｄ３ゲノムの右端に由来の最後の３９３ｂｐ（ｂｐ３７３４９からｂｐ３７７４１まで）を含有するシャトルプラスミドに導入した。引き続いて、ファイバー３’端に由来しＥ４ポリＡを含有している１４４ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＣｈＡｄ３マップのｂｐ３４４９１からｂｐ３４６３４まで）をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の下流に導入して、プラスミドｐＡＲＳＣｈＡｄ３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２を作製した。
【０１５７】
最後にＢＪ５１８３大腸菌株の同時形質転換によって、境界にファイバー３’端／Ｅ４ポリＡおよびＣｈＡｄ３右端を含むｐＡＲＳＣｈＡｄ３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２に由来のＤＮＡフラグメントを、ＰａｃＩ制限酵素（ＰａｃＩ部位、野生型ＣｈＡｄ３のｎｔ３６９２４）で直鎖化したｐＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰに相同的組換えによって導入し、ｐＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４Ａｄ５ｏｒｆ６ＥＧＦＰを作製した。
【０１５８】
この戦略によって、ＣｈＡｄ３Ｅ４コーディング領域が完全に欠失し、ＣｈＡｄ３Ｅ４プロモーターのコントロール下に推定Ｅ４ＴＡＴＡシグナルの６２ｂｐ下流にクローニングされたＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子で置換された。
【実施例３】
【０１５９】
ＣｈＡｄ６３ベクター構築
ＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ４Ａｄ５ｏｒｆ６ベクターに類似のＣｈＡｄ６３ベクターは以下のように構築した。
【０１６０】
Ｉ．サブグループＥシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ６３ウイルスゲノムを完全に配列決定し、その情報を使用して、相同的組換えによって完全ゲノムを容易にクローニングできるシャトルベクターを構築した。要約すると、ここでｐＡＲＳＣｈＡｄ６３＿ＥＧＦＰと呼ぶサブグループＥチンパンジーアデノウイルス６３をクローニングするために使用したベクターを以下に記載の手順で構築した。
【０１６１】
ＣｈＡｄ６３右端（ｎｔ３６２１６−３６６４３）を配列２６および２７のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限したｐＡＲＳＣｈＡｄ３−ＲＬＤに結合して、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３Ｒを作製した。ｐＩＸコーディング領域を含有しているＣｈＡｄ６３ ＤＮＡフラグメント（ｎｔ３４２２−３８１４）を配列２８および２９のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化し、次いで、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３Ｒにクローニングして、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＤを作製した。ＣｈＡｄ６３ウイルスＤＮＡ左端（ｎｔ１−４５５）をプライマー３０および３１と共にＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＤにクローニングし、このようにしてｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤを作製した。ＨＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｂｇｈポリＡカセットを、配列３２および３３のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＶで消化し、次いで、ＥｃｏＲＶで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤにクローニングして、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰを作製した。このウイルスＤＮＡカセットはまた、消化によってプラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡが遊離されるように双方のＩＴＲの末端に局在する制限酵素部位（ＰｍｅＩ）も含むように設計した。
【０１６２】
ＩＩ．ΔＥ１ ＣｈＡｄ６３ベクターの構築
ＣｈＡｄ６３ベクターはＢＪ５１８３大腸菌株中の相同的組換えによって構築した。ＢＪ５１８３細胞を、ＣｈＡｄ６３精製ウイルスＤＮＡとＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰとによって同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子、直鎖化ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰの末端に存在する右ＩＴＲ ＤＮＡ配列とウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同的組換えによってウイルスゲノムＤＮＡがプラスミドベクターに挿入され、同時に、Ｅ１領域が欠失してＥＧＦＰ発現カセットで置換された。
【０１６３】
ＩＩＩ．Ｅ３領域欠失およびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔベクター構築
ＣｈＡｄ６３ベクター主鎖に完全なＥ３領域欠失を導入するために、Ｅ３遺伝子に隣接する２つのＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅して２つのＤＮＡフラグメントを作製した。５６７ｂｐのフラグメントはｎｔ２６６６５からｎｔ２７２０７まで（ｐＶＩＩＩ遺伝子の３’端，Ｅ３領域の上流）の範囲であり、５６３ｂｐのＤＮＡフラグメントはファイバー遺伝子の３’端（ｂｐ３１７８８からｂｐ３２３２６まで，Ｅ３領域の下流）を含んでいる。第一のＤＮＡフラグメントの３’端および第二フラグメントの５’にＰａｃＩ制限部位を導入した。２つのＰＣＲフラグメントをＰａｃＩで消化し、インビトロ結合によって接合した。得られたＤＮＡフラグメント（１１１２ｂｐ）を次に、ｐＶＩＩＩ順方向オリゴヌクレオチドおよびファイバー逆方向オリゴヌクレオチドを使用してさらに増幅した。
【０１６４】
互いに接合した３’および５’のＤＮＡフランキング領域を含有している１１１２ｂｐのＥ３領域のＤＮＡフラグメントを、ＢＪ５１８３細胞中の同時形質転換によって、ＨｐａＩ（野生型ＣｈＡｄ６３の３０１６８ｂｐでＥ３領域切断）で直鎖化したｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１／ＥＧＦＰと組換えて、Ｅ３欠失を導入した。最終組換え産物はｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰプレアデノプラスミドであった。
【０１６５】
ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＨＣＭＶ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ポリＡ）に基づくＨＣＶ ＮＳ領域発現カセットをＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載された手順で構築し、ＨＣＭＶおよびＢｇｈポリＡのＤＮＡ配列間の相同性を利用した相同的組換えによってＢＪ５１８３大腸菌株中のｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰベクターに挿入し、ＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔを作製した。
【０１６６】
ＩＶ．Ｅ４領域の欠失およびＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の挿入
ＣｈＡｄ６３Ｅ４領域をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置換するために、Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６を、ＣｈＡｄ６３ゲノムの右端に由来の４２８ｂｐ（ｂｐ３６２１６からｂｐ３６６４３まで）下流でｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰに導入した。引き続いて、ファイバー３’端に由来しＥ４ポリＡを含有している２００ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＣｈＡｄ６３マップのｂｐ３３６２４からｂｐ３３８２３まで）をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の下流に導入して、プラスミドｐＡＲＳＣｈＡｄ６３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２を作製した。最後に、ＢＪ５１８３大腸菌株の同時形質転換によって、境界にファイバー３’端／Ｅ４ポリＡおよびＣｈＡｄ６３左端を含むｐＡＲＳＣｈＡｄ６３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２に由来のＤＮＡフラグメントを、ＰｍｅＩ制限酵素（プラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡを遊離する）で消化したｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰに相同的組換えによって導入し、このようにしてｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４Ａｄ５ｏｒｆ６ＥＧＦＰを作製した。
【０１６７】
この戦略によって、ＣｈＡｄ６３Ｅ４コーディング領域が完全に欠失し、ＣｈＡｄ６３Ｅ４プロモーターのコントロール下に推定Ｅ４ＴＡＴＡシグナルの１３１ｂｐ下流にクローニングされたＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子で置換された。
【実施例４】
【０１６８】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）の発現
Ｃａｔａｌｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：６４００−６４０９，２００５に記載の手順に準拠した技術を使用してＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔのＨＣＶタンパク質発現を試験した。ＨｅＬａ細胞にＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔを感染させた。ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔはＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されている。細胞抽出物を抗ＮＳ５Ａモノクローナル抗体によるイムノブロットで分析した。図８に示すように、ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔは、ヒトＡｄ６に基づくベクター（ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔ）と同様にＨＣＶタンパク質を発現する。
【実施例５】
【０１６９】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）の安定性
Ｃａｔａｌｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：６４００−６４０９，２００５に記載の手順に準拠した技術を使用してＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔの遺伝的安定性を検証した。５つの独立クローン（継代１０）から抽出したウイルスＤＮＡの制限分析を行った。プレＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔプラスミドを陽性対照として含ませた。ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔはＰｅｒＣ．６細胞までの継代期間は遺伝的に安定であった。
【実施例６】
【０１７０】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔ（配列１７）はマウス体内でＣＭＩを誘導した。
【０１７１】
Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載の手順に準拠した技術を使用してＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔの細胞性免疫誘導能力をＣ５７／Ｂ６マウスで試験した。図９は、Ｃ５７／Ｂ６マウス体内でのＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）、ＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔ（配列１７）およびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔの細胞性免疫誘導能力の比較を示す。図９は、注入３週後に行ったＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ実験（Ｈ２Ｋｂ制限ペプチド使用、ＮＳ３プロテアーゼ中でマッピング）を示す（データはＮ＝５の平均として示す）。１０８および１０９の用量のＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔによってマウス体内でＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔと同等のＣＭＩが誘発される。
【実施例７】
【０１７２】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔはアカゲザル体内でＣＭＩを誘導した。
【０１７３】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔ（配列１７）のＣＭＩ誘導能力をヒト以外の霊長類で確認するために、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８およびＣｉｒｉｌｌｏら，国際公開ＷＯ ２００５／０７１０９３に記載の手順に準拠した技術を使用してアカゲザルを免疫感作した。異なる３つの非交差反応性ベクターの連続注射に基づく異種プライム／ブースト法で３匹１グループのサルを免疫感作してベクターを評価した。３匹の動物は、０および４週目に１匹あたり１０１０ｖｐの用量のＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔを２回注射してプライムし、次いで２２週目にＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔ、４２週目にＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔを注射した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した免疫応答の時間経過を図１１に報告するが、これは、所与のいずれかの時点で種々のＨＣＶ ＮＳペプチドプールに観察された応答の和を表している。この結果は、ＣｈＡｄ３ＮＳ注射によって全部の動物に効率的なプライム効果が得られたこと、および、ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔの双方の投与によってＣＭＩが強力にブーストされることを示す。
【実施例８】
【０１７４】
キメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡ（配列１）の構築
ＨＣＶ ３ａに基づくＮＳ３−４Ａ領域とＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域とを含み、ここでｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂと呼ぶキメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミド（図１２および１３）はＢＪ５１８３大腸菌株中の相同的組換えによって得られた。
【０１７５】
最適翻訳開始（コザック）配列と、成熟ＮＳ３配列の第一アミノ酸に融合したメチオニン開始コドンとをもつＨＣＶ ３ａ由来の完全コドン最適化ＮＳ３−４ａをコードするプラスミドを合成的に作製した。ＮＳ３−４ａコーディング配列には、ｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔｂ受容体プラスミドに挿入するためにイントロンＡ配列とＮＳ３（ＨＣＶ）コーディング配列の起点とに相同の２つの組換え領域が隣接している（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。親プラスミドからインサートを切除するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を新しいＮＳ３−４ａ配列の両端に導入した。
【０１７６】
このｐＶ１ＪｎｓＯＰＴｍｕｔプラスミドをＨｐａＩ非反復部位消化によって直鎖化した。直鎖化したｐＶ１ＪｎｓＯＰＴｍｕｔプラスミドおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化したＮＳ３−４ａ（３ａ）インサートでＢＪ５１８３菌株を同時形質転換して、ｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂを作製した。図１３に示す得られたｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−ｌｂの遺伝子構造を制限酵素およびＤＮＡ配列解析によって検証した。
【実施例９】
【０１７７】
キメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡはマウス体内でＤＭＩを誘導した。
【０１７８】
キメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡの種々のＨＣＶ遺伝子型に対する細胞性免疫誘導能力をマウスで試験した。キメラポリペプチド（配列１）は、ＨＣＶ ３ａに基づくＮＳ３−４Ａ領域およびＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域を含んでいた（ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂ）。
【０１７９】
異なる３つのマウス株（２つの同系交配：Ｂａｌｂ／ｃ，Ｃ５７Ｂ１／６および１つの異系交配：ＣＤ１）に、５０μｇのＤＮＡを筋肉内注射し次いで電気パルスを与えた。各動物に、キメラプラスミド（ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂ）、または、ＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域をコードするｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔプラスミド（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）を２回与えた。ＨＣＶ １ｂおよび３ａに由来のウイルスタンパク質に特異的なＣＭＩを、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載された技術を使用して測定した。図１４は、ＣＤ１マウス（異系交配株）の体内でＨＣＶ １ｂおよび３ａに由来のＮＳ３タンパク質に応答してＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を示す（１，０００，０００脾細胞あたりのスポット形成細胞として表す）。１ｂ ＮＳ３タンパク質に対する特異的応答は双方のプラスミドで同等であるが、３ａ ＮＳ３タンパク質に対してはキメラ構築物のほうが高い応答を誘導する（スチューデントＴ検定でｐ＝０．０４）。２つの同系交配株のマウス（Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂ１／６）の体内でＨＣＶ １ｂおよび３ａに由来のＮＳ３タンパク質に対して誘導されたＣＭＩは双方の構築物で同等であった。
【０１８０】
特許請求の範囲は他の実施態様も包含する。いくつかの実施態様を提示して説明したが、本発明の要旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことが可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】配列１のアミノ酸配列を示す。アミノ酸１−６８６は、ＨＣＶ ３ａに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域を与える。アミノ酸６８７−６９０は、ＨＣＶ ３ａ ＮＳ４Ｂ領域の最初の４つのアミノ酸を構成し、また、ＨＣＶ ３ａ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域の開裂接合を与える。アミノ酸６９１−２６７５は、ＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域を与える。ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域およびＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域はまた開始メチオニンの付加を含む。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは配列２の核酸配列を示す。ヌクレオチド３１８−１０１８２は以下の要素を含む発現カセットを構成する：ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ３１８−９０５Ｉｎｔ Ａ：ｎｔ１０４０−１８６５コザック配列：ｎｔ１８８５−１８９０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ（３ａに基づく、最適化）：ｎｔ１８９１−３９４８ＨＣＶ ＮＳ４Ｂの最初の４アミノ酸（３ａに基づく）：ｎｔ３９４９−３９６０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ（１ｂに基づく、Ｂｋ菌株、最適化）：ｎｔ３９６１−９９１５ＴＡＡＡターミネーター：ｎｔ９９１６−９９１９ＢＧＨ：ｎｔ９９５６−１０１７９。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは配列２の核酸配列を示す。ヌクレオチド３１８−１０１８２は以下の要素を含む発現カセットを構成する：ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ３１８−９０５Ｉｎｔ Ａ：ｎｔ１０４０−１８６５コザック配列：ｎｔ１８８５−１８９０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ（３ａに基づく、最適化）：ｎｔ１８９１−３９４８ＨＣＶ ＮＳ４Ｂの最初の４アミノ酸（３ａに基づく）：ｎｔ３９４９−３９６０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ（１ｂに基づく、Ｂｋ菌株、最適化）：ｎｔ３９６１−９９１５ＴＡＡＡターミネーター：ｎｔ９９１６−９９１９ＢＧＨ：ｎｔ９９５６−１０１７９。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは配列２の核酸配列を示す。ヌクレオチド３１８−１０１８２は以下の要素を含む発現カセットを構成する：ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ３１８−９０５Ｉｎｔ Ａ：ｎｔ１０４０−１８６５コザック配列：ｎｔ１８８５−１８９０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ（３ａに基づく、最適化）：ｎｔ１８９１−３９４８ＨＣＶ ＮＳ４Ｂの最初の４アミノ酸（３ａに基づく）：ｎｔ３９４９−３９６０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ（１ｂに基づく、Ｂｋ菌株、最適化）：ｎｔ３９６１−９９１５ＴＡＡＡターミネーター：ｎｔ９９１６−９９１９ＢＧＨ：ｎｔ９９５６−１０１７９。
【図３】ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ配列（配列１６）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｂ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｃ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｄ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｅ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｆ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｇ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｈ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｉ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｊ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｅ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｆ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｇ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｈ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｇ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｈ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｅ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｆ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｇ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｈ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図８】ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔに感染したＨｅＬａ細胞中のＨＣＶ ＮＳタンパク質の発現の比較を示す。
【図９】Ｃ５７／Ｂ６マウス体内で細胞性免疫を誘導するＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔの能力の比較を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｃ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｄ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｅ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｆ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｇ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｈ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１１】ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した免疫応答の時間経過を、いずれか所与の時点に種々のＨＣＶ ＮＳペプチドプールで観察した応答の和として表す。
【図１２】ｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ ３ａ−１ｂの種々の構成要素を示す。
【図１３】キメラＨＣＶポリペプチドをコードするｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ ３ａ−ｌｂ発現カセットの遺伝子構造を示す。様々な領域は以下の場所に存在する：−ヒトＣＭＶプロモーター：３１８−９０５；−イントロンＡ：１０４０−１８６５；−コザック配列：１８８５−１８９４；−ＨＣＶ ＭｅｔＮＳ３−ＮＳ４Ａ（遺伝子型３ａ）：１８９１−３９６０；−ＨＣＶ ＭｅｔＮＳ３−ＮＳ５ＢＯＰＴｍｕｔ（遺伝子型１ｂ）：３９６１−９９１５；−ＴＡＡＡターミネーター：９９１６−９９１９；−ＢＧＨポリＡ：９９６５−１０１８２。
【図１４】キメラプラスミド（ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ ３ａ−１ｂ）またはｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔで免疫感作した動物（ＣＤ１マウス）体内のＨＣＶ １ｂおよび３ａ由来のＮＳ３タンパク質に応答してＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を示す（脾細胞１，０００，０００個あたりのスポット形成細胞として表す）。
【背景技術】
【０００１】
本願に引用した参考文献は特許請求の範囲に記載の発明に対する先行技術であると認められたものではない。
【０００２】
全世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している。（Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０，１−１６，２０００）。ＨＣＶに接触して明白な急性疾患が発症するパーセンテージは低いが、多くの場合にウイルスが慢性感染として定着し、肝臓の炎症を生じさせ、ゆっくりと肝不全および肝硬変に進行する。（Ｉｗａｒｓｏｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４，２０１−２０４，１９９４）。さらに、疫学調査は、ＨＣＶが肝細胞癌の病理発生に重要な役割を演じることを示している。（Ｋｅｗ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１４，２１１−２２０，１９９４，Ａｌｔｅｒ，Ｂｌｏｏｄ ８５，１６８１−１６９５，１９９５）。
【０００３】
ＨＣＶに対する定例の血液スクリーニングが実施されるようになった１９９２年以前には、たいていの感染は、汚染血液、血液製品または移植臓器への迂闊な接触が原因となっていた。ＨＣＶの血液スクリーニングが実施されている地域では、ＨＣＶは主として静脈内薬物使用によって感染する。頻度は少ないが、周産期接触、血液透析およびＨＣＶ感染者との性的接触なども伝播方法に含まれる。（Ａｌｔｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１（８），５５６−５６２，１９９９，Ａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３１ Ｓｕｐｐｌ．８８−９１，１９９９，Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．２０１，１−１６，２０００）。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする約９．５ｋｂの一本鎖ＲＮＡから成る。（Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，３６２−３６４，１９８９，Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，３５９−３６２，１９８９，Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６５，１１０５−１１１３，１９９１）。ＨＣＶポリタンパク質はＣ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂという序列のウイルスタンパク質を含有する。
【０００５】
ＣＭＩ応答を生じさせるために１つ以上のＨＣＶ非構造抗原を提供するＨＣＶ核酸配列を使用することは、例えば、Ｃｈｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ ７７：１１３６−１１４４，１９９９；Ｐａｌｉａｒｄら，国際公開ＷＯ ０１／３０８１２；Ｃｏｉｔら，国際公開ＷＯ ０１／３８３６０；およびＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８によって言及されている。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の主題は、ＨＣＶ核酸ワクチンおよびワクチン成分として、または、ＨＣＶワクチンの製造に使用できる核酸構築物である。記載した構築物は、（１）第一のＨＣＶ菌株に基づくＮＳ３−４Ａ領域と第二の菌株に基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡまたはＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域を含有するキメラＨＣＶポリペプチドをコードする核酸、および、（２）チンパンジーに基づくＨＣＶポリペプチドをコードするアデノベクターを含む。
【０００７】
従って、本発明の第一の目的は、ＨＣＶキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を記載する。該ポリペプチドは、第一のＨＣＶ菌株に由来のＨＣＶ ＮＳ３−４ａに実質的に相似のアミノ酸配列を含むＨＣＶ ＮＳ３−４ａ領域と、第二のＨＣＶ菌株に由来のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに実質的に相似のアミノ酸配列を含むＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ領域とを含む。この場合、２つの領域に存在するＮＳ３−４Ａ配列は異なる配列を有している。第一領域は第二領域のアミノ側またはカルボキシル側に配置されている。
【０００８】
アミノ酸配列に関する“実質的に相似の配列”という表現は、基準配列に対する少なくとも約７０％の一致を意味する。基準配列に対するパーセント一致（一致パーセントと表すこともある）を決定するためには、最大数の一致アミノ酸が得られるようにポリペプチド領域を対応する基準領域に位置合せし、対応領域の一致アミノ酸の数を測定する。この数を基準領域のアミノ酸の総数で除算し、次いで１００を乗算し、最も近い整数に丸める。例えば、ＨＣＶ ＮＳ３−４Ａ、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡおよびＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの領域が、異なるＨＣＶ菌株に存在する対応ＨＣＶ領域でもよい。
【０００９】
第一および第二の領域に異なるＮＳ３−４Ａ配列が存在することは、１つ以上のアミノ酸相違をもたらす。アミノ酸相違はおのおの独立に付加、置換または欠失である。
【００１０】
好ましい実施態様では、核酸が、コードされたＨＣＶポリペプチドをヒト細胞中で発現できる発現ベクターである。ヒト細胞中の発現は、ＨＣＶ感染の能動的治療およびＨＣＶ感染に対する予防的処置という治療的用途を有している。
【００１１】
発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適正な転写およびプロセシング用の調節要素と共に含有する。存在し得る調節要素は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に天然に連携している調節要素およびヌクレオチド配列に天然に連携していない外来調節要素を含む。外来プロモーターのような外来調節要素はヒト細胞のような特定宿主中の発現に使用できる。
【００１２】
好ましい発現ベクターは、１つ以上の欠失領域を有する組換えアデノウイルスゲノムである。組換えアデノウイルスゲノムは、１つ以上のアデノウイルス血清型に実質的に相似の種々の領域を含有し得る。欠失領域という表現は、指定した領域の全部または一部の欠失を表す。
【００１３】
本発明の別の目的は、
ａ）ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａを含むＨＣＶポリペプチドをコードしている発現カセットと、
ｂ）Ｅ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含む組換えアデノウイルスゲノムと、
を含み、該アデノウイルスゲノムが、（ｉ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、（ｉｉ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、（ｉｉｉ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている組換えアデノベクターを記載する。
【００１４】
発現カセットはＥ１またはＥ３欠失に配置される。発現カセットの全部または一部が欠失領域に対応する位置に存在するならば発現カセットはＥ１またはＥ３欠失に配置されたと考えられる。
【００１５】
ＨＣＶポリペプチドまたはアミノ酸配列という表現は、天然産生ＨＣＶ配列、天然産生配列または指定配列に実質的に相似の天然産生配列の誘導体、および、キメラＨＣＶポリペプチドを含む。キメラＨＣＶポリペプチドは、上述の本発明の第一の目的に記載のＨＣＶポリペプチドを含む。
【００１６】
本発明の別の目的は組換えアデノウイルス粒子を記載する。該粒子は、本文中に記載の組換えアデノウイルスゲノムによってコードされ、該ゲノムのコピーをパッケージしている。
【００１７】
本発明の別の目的は、（ａ）組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、（ｂ）該粒子を実質的に精製する段階とを含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法を記載する。粒子を実質的に精製するという表現は、粒子の製造に使用した細胞および細胞破片を完全にまたはほぼ完全に除去することを意味する。
【００１８】
本発明の別の目的は、治療有効量のＨＣＶポリペプチドをコードする核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を記載する。
【００１９】
本発明の別の目的は、治療有効量のＨＣＶポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法を記載する。
【００２０】
“治療する”という表現は、ＨＣＶ感染患者の治療または活動性ＨＣＶ感染の可能性もしくは重篤度を低下させるための患者の予防的処置を含む。“患者”という用語は、ＨＣＶ感染の可能性のある哺乳動物を表す。患者はＨＣＶ感染している場合もあり非感染の場合もある。患者の例はヒトおよびチンパンジーである。
【００２１】
ＨＣＶ感染患者の場合、有効量は、以下の効果、すなわち、ＨＣＶの複製能力を低下させる効果、ＨＣＶ荷重を減少させる効果、ウイルスクリアランスを増加させる効果、および、１つ以上のＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答を増加させる効果の１つ以上を発揮するために十分な量である：。
【００２２】
ＨＣＶ非感染患者の場合、有効量は、以下の効果、すなわち、ＨＣＶ感染に対するＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答の１つ以上の成分の発生能力を増加させる効果、ＨＣＶ感染に対する感受性を低下させる効果、および、慢性疾患に至る持続感染を定着させる感染ウイルスの能力を低下させる効果の１つ以上を達成するために十分な量である：。
【００２３】
“含む”のような無制限的用語は、追加の要素または段階を許容する。追加の要素または段階の可能性を強調するために、ときには、“１つ以上”のような成句を無制限的用語と共にまたは単独で使用する。
【００２４】
明白な記述がなければ、単数を表す不定冠詞は１に限定されない。例えば、“１つの細胞”は“複数の細胞”を排除しない。ときには、複数の存在が可能であることを強調するために、１つ以上という熟語を使用する。
【００２５】
本発明のその他の特徴および利点は、様々な実施例を含む本文中の以後の記載より明らかであろう。与えられた実施例は本発明の実施に役立つ様々な構成要素および方法を例示する。実施例は特許請求の範囲に記載の本発明を限定しない。この開示に基づいて当業者は本発明の実施に役立つ他の構成要素および方法を鑑定し使用できるであろう。
【００２６】
本発明は、種々のＨＣＶ菌株に基づくＨＣＶ非構造タンパク質を供給するＨＣＶキメラポリペプチドをコードする核酸、および、ＨＣＶポリペプチドを発現するチンパンジーアデノベクターの使用を含む。記載した核酸の使用は、ＨＣＶに対するＣＭＩ応答を生じさせる広範囲の抗原を提供するＨＣＶポリペプチドを細胞に導入するためのワクチン成分としての使用、および、このようなワクチン成分を製造する中間体としての使用を含む。
【００２７】
適応型細胞性免疫応答は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩの遍在的分布によって全身のＨＣＶ感染細胞のウイルス抗原を認識し、免疫記憶を誘導し、免疫記憶を維持する機能を果たし得る。これらの機能を果たすのは、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）およびＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）である。
【００２８】
特異的Ｔ細胞受容体を介して活性化されると、ＨＣＶ特異的Ｔｈ細胞は多様な免疫調節機能を発揮するが、たいていの機能にはＴｈ１およびＴｈ２サイトカインが介在する。ＨＣＶ特異的Ｔｈ細胞は、Ｂ細胞の活性化および分化ならびにウイルス特異的細胞障害性Ｔ細胞の誘導および刺激を助ける。Ｔｈ細胞はまたＣＴＬと共に、数種類のウイルスの複製および遺伝子発現を阻害するＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌し得る。さらに、Ｔｈ細胞およびＣＴＬは主要なエフェクター細胞であり、ウイルス感染細胞のアポトーシスおよび溶解を誘導できる。
【００２９】
ＨＣＶ特異的ＣＴＬは、専門的抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）によってプロセシングされた抗原に応答して生じる。抗原はｐＡＰＣ内部で合成されるかまたはｐＡＰＣ導入される。抗原をコードする発現カセットを細胞に導入することによってｐＡＰＣ内部で抗原を合成することができる。
【００３０】
核酸ワクチンの好ましい投与経路は筋肉内経路である。筋肉内投与によって核酸が体細胞およびｐＡＰＣに導入され発現されると考えられる。体細胞で産生されたＨＣＶ抗原はｐＡＰＣに輸送され、ＭＨＣクラスＩ分子に関係して抗原提示される。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：６１７−６４８，１９９７）。
【００３１】
ｐＡＰＣはプロテアソーム複合体において長い抗原をより短いペプチド抗原にプロセシングする。該抗原は小胞体／ゴルジ複合体分泌経路に転送されてＭＨＣクラスＩタンパク質に会合する。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＭＨＣクラスＩに会合した抗原をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８細胞表面タンパク質を介して認識する。
【００３２】
チンパンジーアデノウイルスに基づくベクターはＨＣＶ抗原導入ビヒクルとしてヒトアデノベクターに代替して使用できる。チンパンジーアデノウイルスに基づくベクターは多重免疫戦略で使用するのが特に有効である。この場合、治療される患者の体内では初回に使用したアデノベクターへの免疫応答が生じている。同種のアデノウイルスに基づくベクターとの接触が繰返されると、アデノウイルスタンパク質に対する免疫応答が原因でワクチンの有効性が低下するであろう。初回接触がアデノウイルス感染の結果という場合もあるが、このような感染は恐らく、ＨＣＶ以外の疾患を治療するためにアデノベクターを使用したことによって生じたものであろう。
【００３３】
ここに与える指針に基づいて、患者体内で有益な効果を発揮する十分に強力な免疫応答を発生できる。これらの指針は、ＨＣＶ配列の選択、ベクター選択、ベクター産生、併用治療および投与に関する情報を含む。
【００３４】
Ｉ．キメラ配列
種々のＮＳ３−４Ａ配列をもつ領域を提供するＨＣＶキメラポリペプチドは、種々のＨＣＶ菌株を標的とする抗原を提供するワクチン成分として使用できる。ＨＣＶの主な特徴はそのゲノムの不均質性である。（Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，７：４５−６６，２００３，Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ．Ｖｉｒｏｌ，８５：３１７３−３１８８，２００４）。さらに、ＲＮＡウイルスに共通の典型的な誤りがちのＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび不十分なプルーフリーディング活性から生じた突然変異ならびに宿主から生じた突然変異は、ＨＣＶが偽種と呼ばれる複合ウイルス集団として宿主体内で循環する原因となる。（Ｂｌｉｇｈｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１９７２−１９７４，２０００）。
【００３５】
キメラ構築物の異なる領域に存在する異なるＮＳ３−４Ａ配列は、１つ以上のアミノ酸の違いとして表れる。アミノ酸の違いはおのおの独立に付加、置換または欠失である。種々の実施態様で、第一および第二の領域のＮＳ３−４Ａ配列は、少なくとも約５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％だけ違っている。または、少なくとも１、５、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸の変更が存在する。ＮＳ３−４Ａ領域はＮＳ３−４Ａ配列に加えて、アミノ末端メチオニンのような付加アミノ酸および／または導入された開裂部位を含み得る。
【００３６】
相違パーセントは配列一致を１００から減算することによって決定できる。例えば、８５％配列一致は１５％相違を与える。
【００３７】
キメラポリペプチドに存在する第一領域および第二ポリペプチド領域は、天然産生ＨＣＶ単離物の多くの例に基づいて容易に作製できる。ＨＣＶ単離物は１つ以上のサブタイプを含む以下の６つの主要遺伝子型に分類できる：ＨＣＶ−１／（１ａ，１ｂ，１ｃ）、ＨＣＶ−２／（２ａ，２ｂ，２ｃ）、ＨＣＶ−３／（３ａ，３ｂ，１０ａ）、ＨＣＶ−４／（４ａ）、ＨＣＶ−５／（５ａ）およびＨＣＶ−６／（６ａ，６ｂ，７ｂ，８ｂ，９ａ，１１ａ）。（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，６９３−７１２，２００１）。ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＮおよびＨＣＶ−Ｈのような特定のＨＣＶ配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託され種々の刊行物に記載されている。（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，１３４１−１３４７，１９９７）。
【００３８】
好ましくは、第一領域および第二領域の双方がＨＣＶプロテアーゼによってインビボでプロセシングされ、ＨＣＶキメラポリペプチドに存在する個々のタンパク質に対応する個々のタンパク質を提供する。個々のＨＣＶタンパク質は細胞によってさらにプロセシングされ得る。
【００３９】
第一領域に関する種々の実施態様では、該領域が、以下に存在するＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域に実質的に相似のアミノ酸配列であるかまたは該アミノ酸配列を内包する：配列１のアミノ酸１−６８６；ＨＣＶ １ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６２３２１）；ＨＣＶ ２ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ００９４４；ＨＣＶ ３ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ２８９１７）；ＨＣＶ ４ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１１６０４）；ＨＣＶ ５ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１３１８４）またはＨＣＶ ６ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ８４２６４）。
【００４０】
第二領域に関する種々の実施態様では、該領域が、以下に存在する対応領域に実質的に相似のＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５ＡまたはＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊配列であるかまたは該配列を内包する：配列１のアミノ酸６８６−２６７５、アミノ酸６９１−２６７５またはアミノ酸６９２−２６７５；ＨＣＶ １ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６２３２１）；ＨＣＶ ２ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ００９４４；ＨＣＶ ３ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ２８９１７）；ＨＣＶ ４ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１１６０４）；ＨＣＶ ５ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｙ１３１８４）またはＨＣＶ ６ａ（Ａｃｃ．Ｎｏ：Ｄ８４２６４）。“ＮＳ５Ｂ＊”という表記は不活性ＮＳ５Ｂを表す。
【００４１】
好ましくは第二領域が、第一領域由来のプロテアーゼ活性に適合性のアミノ酸開裂部位を含む。開裂部位は既知の開裂配列に基づいて付加できる。
【００４２】
アミノ酸配列に関する“実質的に相似の配列”という表現は、基準配列に対する少なくとも約７０％の一致を意味する。基準配列に対するパーセント一致（一致パーセントと表すこともある）を決定するためには、最大数の一致アミノ酸が得られるようにポリペプチド領域を対応する基準領域に位置合せし、対応領域の一致アミノ酸の数を測定する。この数を基準領域のアミノ酸の総数で除算し、次いで１００を乗算し、最も近い整数に丸める。
【００４３】
種々の実施態様で、実質的に相似の配列は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の一致を有しているか；または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。変更はおのおの独立に挿入、置換または付加である。
【００４４】
天然産生ＨＣＶ配列に修飾を生じさせて実質的に相似の種々の配列を得ることもできる。天然産生アミノ酸の違いはアミノ酸側鎖（Ｒ基）の違いに起因する。Ｒ基は、物理的寸法、電荷および疎水性のようなアミノ酸の種々の特性を左右する。アミノ酸は以下のような種々のグループに分類できる：中性かつ疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン）；中性かつ極性（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン、グルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）。
【００４５】
活性を維持するために種々のアミノ酸を置換する場合、一般には同様の特性を有しているアミノ酸で置換するのが好ましい。バリンでロイシンを、アルギニンでリシンを、アスパラギンでグルタミンを置換するような特定グループ内部の異なるアミノ酸の置換が、ポリペプチド三次構造の変化を生じない良好な候補である。
【００４６】
アミノ酸修飾はＴ細胞抗原領域を好ましく維持または追加する。広範囲のＴ細胞応答を誘発できるポリペプチドを産生するために天然産生ＨＣＶポリペプチドに様々な修飾を行うことが可能である。広いＴ細胞応答を誘発するポリペプチドの能力を左右する要因は、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞抗原の保存または導入、および、種々のＨＣＶ単離物中の種々のＴ細胞抗原領域の存在数である。
【００４７】
ＨＣＶ Ｔ細胞抗原は例えば実験作業によって同定できる。Ｔ細胞抗原を同定する１つの方法は、長いポリペプチドから一連の短いオーバーラップペプチドを作製し、次いで、感染患者に由来のＴ細胞集団を陽性クローンに基づいてスクリーニングする段階を含む。陽性クローンは特定のペプチドによって活性化／プライムされる。ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＦＮγ−細胞内染色およびバルクＣＴＬアッセイのような技術がペプチド活性の測定に使用できる。このようにして同定したペプチドは、それぞれの病原体のＴ細胞エピトープを表すと考えることができる。
【００４８】
自己をプロセシングしてＣＭＩ応答を生じるＨＣＶポリペプチドの能力は、ここに記載の技術または当業界で公知の技術を使用して判定できる。（参照：例えばＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。このような技術は、ＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答を測定するためのＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＦＮγ−細胞内染色およびバルクＣＴＬアッセイの使用を含む。
【００４９】
複製に必須のモチーフを標的組換えすることによって不活性ポリメラーゼを産生するためにＮＳ５Ｂに小さい修飾を行ってもよい。ＮＳ５Ｂ活性に必須のモチーフおよび不活性ＮＳ５Ｂを産生するために行うことができる修飾の例は、Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：８４１６−８４２６，１９９７、Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：２０４６−２０５１，２０００およびＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されている。
【００５０】
キメラＨＣＶポリペプチドを修飾するときに考慮すべき追加要因は、自己プロセシング能力の維持およびＴ細胞抗原の維持を含む。ポリペプチドの自己プロセシング能力は機能性プロテアーゼ活性によってほぼ判定できる。プロテアーゼ活性を維持する修飾は、ＮＳ３プロテアーゼ、ＮＳ３の補因子として役立つＮＳ４Ａ、および、ＨＣＶポリペプチド内部に存在するプロテアーゼ認識部位を考慮することによって得られる。
【００５１】
ＩＩ．キメラＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊
好ましいキメラＨＣＶポリペプチドは、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊である。下付き文字１および２は、種々のＨＣＶ菌株中の対応する領域に実質的に相似の配列をもつ領域を表し、“ＮＳ５Ｂ＊”は酵素的に不活性のＮＳ５Ｂを表す。ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１とＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２とは少なくとも１つのアミノ酸が違っている。種々の実施態様で、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１とＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２とは少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％違っている；または、少なくとも１、５、１０、１５、２０または２５個のアミノ酸の変更が存在する。
【００５２】
好ましくは、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊ポリペプチドは、第一および第二領域のおのおのが１つ以上の個別ＨＣＶペプチドを産生するために十分なインビボのプロテアーゼ活性を提供する。好ましい実施態様で、ポリペプチドは、ＮＳ３１、ＮＳ４Ａ１、ＮＳ３２、ＮＳ４Ａ２、ＮＳ４Ｂ２、ＮＳ５Ａ２、ＮＳ５Ｂ２＊を個別ペプチドとして産生できる。
【００５３】
種々のＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１およびＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊領域は上述の項Ｉに記載のようにして供給される。種々の実施態様で、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１領域は、配列１のアミノ酸１−６８６もしくはアミノ酸２−６８６に実質的に相似の配列であるかまたは該配列を内包する。ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊領域は、配列１のアミノ酸６８７−２６７５、６９１−２６７５もしくは６９２−２６７５に実質的に相似の配列であるかまたは該配列を含む。または、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊が全体として配列１に実質的に相似である。種々の実施態様で、各領域は配列１の対応する領域に、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％だけ実質的に相似であるか、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。
【００５４】
ＩＩＩ．遺伝子発現カセット
ポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットは、ポリペプチド発現に必要な要素を含む。“ポリペプチド”という表現はキメラポリペプチドを含意する。
【００５５】
ＩＩＩ．Ａ．コードされたポリペプチド配列
本文中に記載のＨＣＶポリペプチドをコードした配列は種々のベクターに使用できる。特定例は、項ＩおよびＩＩに前述したようなキメラポリペプチド配列、および、配列１６に実質的に相似の配列のようなＨＣＶポリペプチド配列Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊を含む（参照：Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。配列１６に実質的に相似の配列は、例えば項Ｖに後述するようなチンパンジーベクターに結合して使用できる。
【００５６】
様々な実施態様で、配列１６に実質的に相似の配列は、配列１６に７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列一致を有しているか、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。
【００５７】
ＩＩＩ．Ｂ．コードされたポリペプチド配列
遺伝子発現カセット中に存在する調節要素は一般に、（ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写可能に連結されたプロモーターと、（ｂ）ヌクレオチド配列に機能的に連結された５’リボソーム結合部位と、（ｃ）ヌクレオチド配列の３’端に接合されたターミネーターと、（ｄ）ヌクレオチド配列に機能的に連結された３’ポリアデニル化シグナルとを含む。遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングに役立つ追加の調節要素が存在してもよい。
【００５８】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され、下流領域の転写を媒介する遺伝子要素である。好ましいプロモーターは、高い転写レベルを与える強プロモーターである。強プロモーターの例は、前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）およびイントロンＡをもつＣＭＶである。（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３９７９−３９８６，１９９１）。プロモーターの追加例は、ＥＦ１アルファプロモーター、ネズミＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびβ−アクチンプロモーターのような天然産生プロモーター、ならびに、合成の筋特異的プロモーター、キメラ筋特異的／ＣＭＶプロモーターのような人工プロモーターである。（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７：２４１−２４５，１９９９，Ｈａｇｓｔｒｏｍら，Ｂｌｏｏｄ ９５：２５３６−２５４２，２０００）。
【００５９】
リボソーム結合部位は開始コドンまたはその近傍に局在する。リボソーム結合部位の例は、ＣＣＡＣＣＡＵＧＧ、ＣＣＧＣＣＡＵＧＧおよびＡＣＣＡＵＧＧを含み、ここにＡＵＧは開始コドンである。（Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ ４４：２８３−２９２，１９８６）。リボソーム結合部位の別の例は、配列１８によって示される。
【００６０】
ポリアデニル化シグナルは、転写ＲＮＡを開裂しＲＮＡにポリ（Ａ）テールを付加する。高等真核生物のポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化付加部位から約１１−３０ヌクレオチドにＡＡＵＡＡＡ配列を含んでいる。ＡＡＵＡＡＡ配列は、ＲＮＡ開裂シグナルの伝達に関与する。（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）。ポリ（Ａ）テールはｍＲＮＡプロセシングに重要である。
【００６１】
遺伝子発現カセットの部分として使用できるポリアデニル化シグナルは、ミニマルラビットβ−グロブリンポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ）シグナルを含む（Ｘｕら，Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−１５６，２００１，Ｐｏｓｔら，米国特許Ｎｏ．５，１２２，４５８）。追加例は、合成ポリアデニル化シグナル（ＳＰＡ）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。ＳＰＡ配列は配列１９によって示されている。
【００６２】
“転写可能に連結された”という表現は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼが結合することによってヌクレオチド配列の転写が生じるようにプロモーターが配置されていることを表す。転写可能に連結されたとしても、転写される配列がプロモーターに隣接する必要はない。
【００６３】
“機能的に連結された”という表現は、ヌクレオチド配列に間接的効果を与える能力を意味する。機能的に連結されたとしても、連結された配列が互いに隣接する必要はない。ヌクレオチド配列に機能的に連結された３’ポリアデニル化シグナルは、転写されたＲＮＡの開裂およびポリアデニル化を促進する。ヌクレオチド配列に機能的に連結された５’リボソーム結合部位はリボソーム結合を促進する。
【００６４】
遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングを増進または調節するために有用な調節要素の追加例は、エンハンサー、リーダー配列およびオペレーターである。エンハンサー領域は転写を増進する。エンハンサー領域の例は、ＣＭＶエンハンサーおよびＳＶ４０エンハンサーである。（Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−３０，１９９５，Ｘｕら，Ｇｅｎｅ ２７２：１４９−１５６， ２００１）。エンハンサー領域はプロモーターに連携できる。
【００６５】
リーダー配列は、ポリペプチドをプロテアソームに案内するポリペプチド上のアミノ酸領域である。リーダー配列をコードする核酸は構造遺伝子の５’であり、構造遺伝子と共に転写される。リーダー配列の一例はｔＰＡである。
【００６６】
オペレーター配列は遺伝子発現を調節するために使用できる。例えば、Ｔｅｔオペレーター配列は遺伝子発現を抑制するために使用できる。
【００６７】
ＩＶ．コーディング核酸配列
コーディング核酸配列は特定のアミノ酸配列をコードするコドンを提供する。特定のアミノ酸配列および遺伝子コードの既知の縮重性に基づいて異なる多数のコーディング核酸配列を得ることができる。遺伝子コードが縮重性をもつ理由は、ほぼすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレットの様々な組合せすなわち“コドン”によってコードされているからである。
【００６８】
特定のコドンが特定のアミノ酸に翻訳されることは当業界で公知である（参照：例えばＬｅｗｉｎ ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。アミノ酸は以下のようなコドンによってコードされている：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００６９】
配列１３のヌクレオチド１２６９−７２２３はＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊配列の一例を示す。配列１３のヌクレオチド１２６９−７２２３に実質的に相似の配列はワクチン成分の部分として使用できる。（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。例えば、このような実質的に相似の配列は、ＣｈＡ３またはＣｈＡ６３に基づくアデノベクターの部分として使用できる。
【００７０】
ヌクレオチド配列に関する“実質的に相似の配列”という表現は、基準配列に対する少なくとも約７０％の一致を表す。基準配列に対するパーセント一致（一致パーセントと表すこともある）を決定するためには、ヌクレオチド領域を最大一致が得られるように対応する基準領域に位置合せし、対応領域の一致ヌクレオチド数を測定する。この数を基準配列中のヌクレオチドの総数で除算し、１００を乗算し、最も近い整数に丸める。
【００７１】
核酸配列は宿主体内での発現を増進するように最適化できる。考察すべき要因は、Ｃ：Ｇ含量、好適なコドン、および、阻害性二次構造の回避を含む。特定宿主体内で発現増進を生じる核酸配列が得られるようにこれらの要因を様々に組合せる。（参照：例えばＤｏｎｎｅｌｌｙら，国際公開ＷＯ ９７／４７３５８）。
【００７２】
ＨＣＶコーディング核酸の最適化も、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８らに記載されている。ＷＯ ０３／０３１５８８は、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ＊をコードする種々の最適化配列の例を示している。
【００７３】
ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊のコドン最適化配列の一例は、配列２のヌクレオチド１８９１−９９１５によって示される。ヌクレオチド１８９１−１８９３は、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１領域のメチオニンコドンを与える。ヌクレオチド３９４９−３９６０は、ＨＣＶ ３ａに基づく最初の４つのアミノ酸のあとにメチオニンが存在するＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２領域を与える。
【００７４】
本発明の様々な実施態様で、ＮＳ３１−ＮＳ４Ａ１−ＮＳ３２−ＮＳ４Ａ２−ＮＳ４Ｂ２−ＮＳ５Ａ２−ＮＳ５Ｂ２＊コーディング領域は、配列２のヌクレオチド１８９１−９９１５または１８９４−９９１５に実質的に相似である。様々な実施態様でヌクレオチド配列は、配列２のヌクレオチド１８９１−９９１５または１８９４−９９１５に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の一致を有するか；または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【００７５】
Ｖ．核酸ベクター
ＨＣＶポリペプチドをコードする核酸は、治療用ベクターとしてまたは治療用ベクターの製造に使用できる。治療用ベクターの製造に使用できるベクターはシャトルベクター、アデノウイルスゲノムプラスミドなどである。
【００７６】
治療用ベクターは細胞にＨＣＶポリペプチドを導入し発現させるために使用される。適正なベクターは、許容できない副作用を生じることなく標的細胞に核酸を送達できる。細胞発現は、ＨＣＶポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを使用して達成される。
【００７７】
治療用途に使用できるベクターの例は、第一世代および第二世代のアデノベクター、ヘルパー依存性アデノベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクターおよびプラスミドベクターなどである。（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３１−２０６，１９９７，Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，米国特許６，１５６，５８８，Ｊｏｈｎｓｔｏｎら，国際公開ＷＯ ９５／３２７３３，Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。
【００７８】
Ｖ．Ａ．アデノベクター
アデノベクターは、標的細胞中で所望のタンパク質またはポリペプチドを発現させるために組換えアデノウイルスゲノムを使用する。野生型アデノウイルスは、両端に逆方向末端反復配列をもつ二重鎖の直鎖状ゲノムを有している。ウイルス複製中にゲノムがウイルスキャプシド内部にパッケージされてビリオンを形成する。ウイルスはウイルス付着によって標的細胞に侵入し、次いでインターナリゼーションを達成する。（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ４０：１３１−２０６，１９９７）。
【００７９】
アデノウイルスゲノムは、アデノウイルスの複製およびプロセシングに必要な種々の要素を提供する。アデノウイルスゲノムの各末端は、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含んでおり、これらはウイルス複製に必要である。該ウイルスはまた、感染性ビリオンの産生に必要なある種の構造タンパク質をプロセシングするために必要なプロテアーゼ活性をコードしている。
【００８０】
アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞に形質導入後のウイルス遺伝子の発現順序に基づいて記述できる。ウイルス遺伝子は、転写がＤＮＡ複製開始の以前に生じるかまたは以後に生じるかに従って初期（Ｅ）遺伝子または後期（Ｌ）遺伝子と呼ばれる。転写の初期段階で、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４遺伝子が発現されて宿主細胞のウイルス複製を準備する。ウイルスゲノムの必須初期領域１（Ｅ１）の欠失によってウイルスを複製欠陥にできる（Ｂｒｏｄｙら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７／６：９０−１０１，１９９４）。
【００８１】
後期段階で、ウイルス粒子の構造成分をコードする後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５の発現がスイッチオンされる。すべての後期遺伝子が単一プロモーターのコントロール下にあり、ペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、１００ｋＤａのスカフォールドタンパク質およびファイバータンパク質（Ｌ５）を含むタンパク質をコードしており、これらは、アデノウイルスＤＮＡをキャプシド封入した新しいウイルス粒子を形成する。最後に、野生型アデノウイルス複製プロセスが細胞溶解を惹起する。
【００８２】
アデノベクターは、ヒトまたは動物に見出されるような種々のアデノウイルス血清型に基づく。動物アデノウイルスの例は、ウシ、ブタ、チンパンジー、ネズミ、イヌおよびトリ（ＣＥＬＯ）を含む。ヒトアデノウイルスは、グループＢ、Ｃ、ＤまたはＥ血清型、例えば２型（“Ａｄ２”）、４型（“Ａｄ４”）、５型（“Ａｄ５”）、６型（“Ａｄ６”）、２４型（“Ａｄ２４”）、２６型（“Ａｄ２６”）、３４型（“Ａｄ３４”）および３５型（“Ａｄ３５”）を含む。アデノベクターは単一アデノウイルス由来または２種以上の異なるアデノウイルスに由来の領域を含有できる。
【００８３】
様々な実施態様で、アデノベクターは、Ａｄ５、Ａｄ６、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６３またはそれらの組合せに基づく。Ａｄ５は、Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５６：２８０−２８５，１９９２に記載されている。Ａｄ５およびＡｄ６に基づくベクターは、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されている。ＣｈＡｄ３の全長核酸配列を図６Ａ−６Ｈに示す。ＣｈＡｄ６３の全長核酸配列を図７Ａ−７Ｈに示す。
【００８４】
本発明の１つの実施態様では、アデノベクターが、表面に露出した１つ以上のチンパンジーＣｈＡｄ３またはＣｈＡｄ６３構造タンパク質を含有する。表面露出タンパク質は、ファイバー、ヘキソンおよびペントンを含む。このようなタンパク質を含むアデノベクターは、ヒトアデノウイルスタンパク質と違って、患者が予めヒトアデノウイルスに接触したときの免疫応答の影響を受け難い。
【００８５】
様々な実施態様で、組換えアデノベクターゲノムは、
ａ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｂ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｃ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている。様々な追加実施態様では、配列相似が、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または、配列が、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０個のアミノ酸の変更だけ違っている。
【００８６】
Ｖ．Ａ．１．第一世代アデノベクター
第一世代アデノベクターは、Ｅ１欠失、場合によりＥ３欠失、場合によりＥ４欠失、および、発現カセットを有する組換えアデノウイルスゲノムを含有している。欠失の範囲および組合せは、ウイルスを複製不能にし、所望産物をコードする遺伝子発現カセットを収容するために十分な大きさである。ウイルスはＥ１欠失によって複製不能になる。
【００８７】
Ｅ１欠失は、Ａｄ５の塩基対約３４２を起点とし塩基対約３５２３に達する領域、または、他のアデノウイルスの対応する領域の欠失である。好ましくは、欠失領域が、Ａｄ５の塩基対約４５０から塩基対約３５１１までの領域または他のアデノウイルスの対応する領域の除去を含む。塩基対約３４１を起点とするより大きいＥ１領域欠失は、ウイルスパッケージング促進要素を除去する。
【００８８】
Ｅ３欠失は、Ａｄ５の塩基対約２７８６５を起点とし塩基対約３０９９５に達する領域、または他のアデノベクターの対応する領域の欠失である。好ましくは、欠失領域が、Ａｄ５の塩基対約２８１３４から塩基対約３０８１７までの領域または他のアデノベクターの対応する領域の除去を含む。
【００８９】
Ｅ４欠失は、ＣｈＡｄ３の塩基対約３４６３４を起点とし塩基対約３７３４９に達する領域、または、他のアデノウイルスの対応する領域の欠失である。Ｅ４欠失は、先天性Ｅ４ｏｒｆ６を保持するかまたは別のアデノウイルス由来のＥ４ｏｒｆ６を挿入できる欠失でなければならない。Ｂｅｒｔら，国際公開ＷＯ２００４／０１８６２７は、このような異種Ｅ４ｏｒｆ６の使用を例示している。
【００９０】
Ｅ１、Ｅ３およびＥ４の欠失の組合せは、遺伝子発現カセットを含有している組換えゲノムの全体寸法が野生型アデノウイルスゲノムの約１０５％を超過しない程度の十分な大きさでなければならない。例えば、組換えアデノウイルスＡｄ５ゲノムの寸法が約１０５％を超過するとゲノムが不安定になる。（Ｂｅｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６７：５９１１−５９２１，１９９３）。
【００９１】
好ましくは、遺伝子発現カセットを含有している組換えアデノウイルスゲノムの寸法は、野生型アデノウイルスゲノムの寸法の約８５％から約１０５％までの範囲である。様々な実施態様で、発現カセットを含有している組換えアデノウイルスゲノムの寸法は、野生型ゲノムの寸法の約１００％から約１０５．２％、または約１００％である。
【００９２】
Ｅ１およびＥ３欠失を有しているＡｄ５またはＡｄ６ゲノムには約７，５００ｋｂを挿入できる。全く欠失が全く存在しないとき、Ａｄ５ゲノムは３５，９３５塩基対であり、Ａｄ６ゲノムは３５，７５９塩基対である。
【００９３】
ＣｈＡｄ３およびＣｈＡｄ６３ベクターは、Ａｄ５に比べて、ゲノムサイズがより大きく、また、より大きいＥ３領域が欠失可能領域として存在するので、核酸挿入容量が大きい。ＣｈＡｄ３ゲノムは、３７，７４１塩基対であり、ＣｈＡｄ６３ゲノムは３６，６４３塩基対である。
【００９４】
Ｅ１、Ｅ３が欠失しＥ４がＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置換されたＣｈＡｄ３およびＣｈＡｄ６３ベクターには約１０，８００ｂｐを挿入できる。Ｅ４がＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６によって置換されたとき、置換Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６が欠失領域よりも小さいので欠失および置換の双方である。これらのベクターには１０，８００ｂｐを挿入すると野生型ゲノムの寸法の１０５％という限度に達する。
【００９５】
第一世代のアデノベクターの複製は、Ｅ１遺伝子産物をトランスに供給することによって行うことができる。例えば、アデノウイルスＥ１領域で形質転換された細胞系を使用することによってＥ１遺伝子産物をトランスに供給できる。アデノウイルスＥ１領域で形質転換された細胞および細胞系の例は、ＨＥＫ２９３細胞、９１１細胞、ＰＥＲＣ．６ＴＭ細胞、および、トランスフェクトされた一次ヒトアミノサイト細胞である。（Ｇｒａｈａｍら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６：５９−１２，１９７７，Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７：２１０５−２１１６，２０００，Ｆａｌｌａｕｘら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：１９０９−１９１７，１９９８，Ｂｏｕｔら，米国特許Ｎｏ．６，０３３，９０８）。
【００９６】
チンパンジーアデノウイルスの先天性Ｅ４領域がＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６によってシスに置換されると、Ａｄ５相補細胞系に伝播した様々な血清型のチンパンジーアデノウイルスベクターの増殖が促進されおよび／または収量が増加する。２９３およびＰＥＲ．Ｃ６細胞中のＡｄ５Ｅ１配列は、チンパンジーアデノウイルスのようなグループＣに所属するヒトアデノウイルス以外の血清型の複製を十分に相補しない。
【００９７】
発現カセットは組換えアデノウイルスゲノムの欠失Ｅ１領域または欠失Ｅ３領域に対応する領域に挿入されなければならない。発現カセットは、平行配向でもよくまたは逆平行配向でもよい。平行配向では、挿入された遺伝子の転写方向が欠失したＥ１またはＥ３遺伝子と同方向である。逆平行配向転写では、対向鎖が鋳型として機能し、転写方向が対向方向である。
【００９８】
本発明の１つの実施態様では、アデノベクターがＥ４欠失と、配列１３のヌクレオチド３４６０１−３５４８２によって示されるＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６配列に実質的に相似の配列の挿入とを含む。様々な実施態様で、配列一致は少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または、配列５のヌクレオチド３４６０１−３５４８２から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【００９９】
本発明の１つの実施態様では、アデノウイルス主鎖が、配列１３のヌクレオチド１−４６０および７４６８−３５８９０または配列１７のヌクレオチド１−４５４および７４５８−３４６５８に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のヌクレオチド配列一致を有するか、または、配列１３のヌクレオチド１−４６０および７４６８−３５８９０または配列１７のヌクレオチド１−４５４および７４５８−３４６５８から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【０１００】
発現カセットを含有するアデノベクターの別の実施態様では、配列１３または配列１７に対するヌクレオチド配列一致が少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または、配列１３または配列１７から０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【０１０１】
Ｖ．Ａ．２．第二世代アデノベクター
第二世代のアデノベクターは、第一世代のベクターよりも小さいアデノウイルスゲノムを含有し、相補細胞系および／またはアデノウイルスタンパク質を供給するヘルパーベクターと共に使用できる。一般的な第二世代のアデノベクターは、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２５７３−２６０４，２０００；Ｈｉｔｔら，１９９７，Ｈｕｍａｎ Ａｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４０ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｔａｌｕｃｃｉら．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：６４００−６４０９，２００５のような様々な参考文献に記載されている。第二世代のアデノベクターは、ヒトおよびチンパンジーアデノウイルスを含む様々な種類のアデノウイルスを基材にできる。
【０１０２】
Ｖ．Ｂ．ＤＮＡプラスミドベクター
ＤＮＡワクチンプラスミドベクターは、遺伝子発現カセットを複製促進要素および好ましくはベクー選択促進要素と共に含有する。好ましい要素は、非哺乳類細胞中の複製および選択可能マーカーを提供する。治療用ベクターは、ヒト細胞中の複製またはヒト核酸への組込みを提供する要素を含有してはならない。
【０１０３】
選択可能マーカーは、該マーカーを含有する核酸の選択を促進する。好ましい選択可能マーカーは、抗生物質抵抗性を与えるマーカーである。抗生物質選択遺伝子の例は、アンピシリン、ネオマイシンおよびカナマイシンに対する抵抗性をコードする核酸を含む。
【０１０４】
適当なＤＮＡワクチンベクターは、細菌性複製起点と選択可能マーカーとを含有するプラスミドを出発材料として作製できる。より高い収率を与える細菌性複製起点の例は、ＣｏｌＥ１プラスミド由来の細菌性複製起点を含む。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７５：６１７−６４８，１９９７）。
【０１０５】
細菌性複製起点および選択可能マーカーの存在が大腸菌のような細菌株中のＤＮＡベクターの産生を可能にする。選択可能マーカーは、ＤＮＡベクターを含有しない細菌を除去するために使用される。
【０１０６】
配列２は、ＨＣＶポリペプチドをコードする発現カセットを含有するプラスミドベクターの一例を示す。本発明の１つの実施態様で、プラスミドベクターは、配列２に少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のヌクレオチド相似配列を有するか、または、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは１−５０ヌクレオチドだけ違っている。
【０１０７】
ＶＩ．ベクター作製
ベクターは、制限酵素、核酸結合および相同的組換えの使用を含む組換え核酸技術を使用して作製できる。組換え核酸技術は当業界で公知である。（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、および、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【０１０８】
治療用ベクターを得るためまたは発現カセットもしくはその一部分を１つのベクターから他のベクターに移すためには中間ベクターを使用する。中間ベクターの例は、アデノウイルスゲノムプラスミドおよびシャトルベクターを含む。
【０１０９】
中間ベクター中の有用な要素は、複製起点、選択可能マーカー、相同的組換え領域および適正な制限部位を含む。適正な制限部位は、核酸配列のクローニングまたは遊離を促進するために使用できる。
【０１１０】
相同的組換え領域は、別の核酸分子中の標的領域に相同的な核酸配列領域を供給する。相同的領域は標的領域に挿入される核酸配列に隣接する。様々な実施態様で、相同的領域は、約１５０から６００ヌクレオチドの長さまたは約１００から５００ヌクレオチドの長さである。
【０１１１】
本発明の１つの実施態様は、ＨＣＶポリペプチドを発現する発現カセット、選択可能マーカー、細菌性複製起点、発現カセットを標的組換えによってＥ１領域に挿入または置換する第一のアデノウイルス相同性領域および第二のアデノウイルス相同性領域を含有するシャトルベクターを記載する。第一および第二の相同性領域は、発現カセットに隣接する。第一の相同性領域は、塩基対ほぼ４−４５０からの野生型アデノウイルスの領域の少なくとも右端（３’端）に実質的に相同の少なくとも約１００塩基対を含有する。第二の相同性領域は、塩基対ほぼ３５１１−５７９２からのＡｄ５の少なくとも左端（５’端）または別のアデノウイルスの対応する領域に実質的に相同の少なくとも約１００塩基対を含有する。
【０１１２】
“実質的に相同の”という表現は、標的領域と特異的組換えを行うために十分な相同度を表す。様々な実施態様で、実質的相同は、少なくとも８５％、少なくとも９５％または１００％の配列一致を表す。
【０１１３】
アデノベクターの１つの作製方法は、発現カセットを含有するプレアデノウイルスゲノムプラスミドの作製を経由する。該プレアデノウイルスプラスミドは、所望の相補細胞系中で複製されるために必要なすべてのアデノウイルス配列を含有する。次いでプレアデノウイルスプラスミドを制限酵素で消化してＩＴＲを遊離させ、相補細胞系にトランスフェクトしてウイルスを回収する。複製が生じ得るためにはＩＴＲがプラスミド配列から遊離されなければならない。アデノベクターの回収によって、発現カセットを含有するアデノベクターが得られる。（参照：例えばＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。
【０１１４】
ＶＩ．Ａ．アデノウイルスゲノムプラスミド
アデノウイルスゲノムプラスミドは、より長いプラスミド（コスミドでもよい）の内部にアデノベクター配列を含有している。より長いプラスミドは、プラスミドの製造および維持に使用される手順次第では真核細胞または原核細胞中の増殖および選択を促進する要素のような追加要素を含有している。アデノウイルスゲノムプラスミドは好ましくは、Ｅ１またはＥ３欠失領域に挿入された遺伝子発現カセットを有している。
【０１１５】
アデノウイルスゲノムプラスミド製造技術には、シャトルベクターおよび相同的組換えを使用する技術、アデノウイルスコスミドへの遺伝子発現カセットの挿入を含む技術などがある。（Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−３０，１９９５，Ｄａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１７０７−１７１４，２０００）。
【０１１６】
本発明の１つの実施態様は、アデノウイルスゲノムプラスミドを作製する相同的組換え段階と、アデノウイルス回収段階とを含むアデノベクターの製造方法を記載する。相同的組換え段階は、アデノウイルス相同領域に隣接されたＨＣＶポリペプチド発現カセットを含有するシャトルベクターの使用を含む。アデノウイルス相同領域は、Ｅ１またはＥ３欠失領域に発現カセットを標的組換えする。
【０１１７】
ＶＩ．Ｂ．アデノベクター回収
アデノベクターは当業界で公知の方法またはここに記載の方法を使用してを組換えアデノウイルスゲノムプラスミドから回収できる。当業界で公知のアデノウイルス回収技術の例は、Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−３０，１９９５およびＤａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１７０７−１７１４，２０００に示されている。
【０１１８】
アデノベクター回収方法の一例は、アデノウイルス複製の増進を含む。増進は例えば、Ｅ２タンパク質（ポリメラーゼ、プレターミナルタンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質）ならびにＥ４ｏｒｆ６のようなアデノウイルス機能を別のプラスミドから供給することによって実行できる（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。
【０１１９】
ＶＩＩ．ＨＣＶ併用治療
ＨＣＶ核酸ワクチンは患者を治療するために単独で使用してもよく、他のＨＣＶ治療薬と併用してもよく、他の種類の疾患を対象とする薬剤と共に使用してもよい。追加治療薬は、ＨＣＶおよびＨＣＶ感染個体で有病率が高い疾患を治療する治療薬を含む。別種の疾患を対象とする薬剤は、ＨＩＶおよびＨＢＣに特異的なワクチンを含む。
【０１２０】
ＨＣＶを治療するための追加治療薬はワクチンおよび非ワクチン薬を含む。（Ｚｅｉｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ７０：１４５７−１４６９，２００１）。追加ＨＣＶワクチンの例は、ＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２またはｐ７領域に対する免疫応答を誘発するように設計されたワクチンを含む。ワクチン成分の例は、天然産生ポリペプチド、ＨＣＶミモトープポリペプチド、または、このようなポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０１２１】
一般的なミモトープ作製技術および種々のＨＣＶミモトープを記載している参考文献は、Ｆｅｌｉｃｉら，米国特許Ｎｏ．５，９９４，０８３およびＮｉｃｏｓｉａら，国際出願ＷＯ ９９／６０１３２である。ＨＣＶミモトープは天然産生ＨＣＶ抗原に融合できる。
【０１２２】
現在認可されている抗ＨＣＶ薬はリバビリンと併用されるインターフェロンαである。組換えインターフェロンおよびＰＥＧ付加インターフェロンのような様々な形態のインターフェロンαをＨＣＶ感染の治療に使用できる。（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５Ｓ：１−１６，２００３，Ｗａｌｋｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １４：１−２１，２００３）。
【０１２３】
異なる多様な抗ＨＣＶ薬が様々な臨床開発段階にある。開発中の種々の抗ＨＣＶ薬は、種々のＨＣＶ標的に特異的な薬剤を含む。種々のＨＣＶ標的の例は、ＨＣＶポリメラーゼおよびＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを含む。（Ｄｅ Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：１−１６，２００３，Ｗａｌｋｅｒら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ １４：１−２１，２００３）。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．医薬投与
ＨＣＶワクチンはここに提供した指針を当業界で公知の技術と共に使用して配合し患者に投与できる。一般的な医薬投与の指針は、Ｍｏｄｅｒｎ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ｋｕｒｓｔａｋ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄ．Ｃｏ．１９９４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０；およびＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に示されている。これらの文献はいずれも参照によって本発明に組込まれるものとする。
【０１２５】
ＨＣＶワクチンは、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経皮、皮膚圧入または鼻腔内のような種々の経路で投与できる。好ましい経路は筋肉内である。
【０１２６】
筋肉内投与は、１つ以上の電気パルスを伴うかまたは伴わない注射のような様々な技術を使用して行うことができる。電気介在移入は体液性および細胞性の双方の免疫応答を刺激することによって遺伝子免疫感作を補助する。
【０１２７】
ワクチン注射は、有針または無針の注射システムを使用する種々の技術を使用して行うことができる。無針注射システムの一例はジェット注射デバイスである。（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，国際公開ＷＯ ９９／５２４６３）。
【０１２８】
電気介在移入すなわちジーン・エレクトロ・トランスファー（ＧＥＴ）は、核酸注入後に適正な電気パルスを送達することによって行うことができる。（参照：Ｍａｔｈｉｅｓｅｎ，国際公開ＷＯ ９８／４３７０２およびＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）
ＶＩＩＩＡ．医薬担体
医薬的に許容される担体は、ワクチンの保存および対象へのワクチン投与を容易にする。医薬的に許容される担体の例をここに示す。医薬的に許容される追加の担体は当業界で公知である。
【０１２９】
医薬的に許容される担体は、バッファ、標準生理食塩水またはリン酸塩緩衝生理食塩水、ショ糖、塩およびポリソルベートのような様々な成分を含有し得る。医薬的に許容される担体の一例は、２．５−１０ｍＭのトリスバッファ、２５−１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５−１０％ショ糖、０．０１−２ｍＭのＭｇＣｌ２および０．００１％−０．０１％のポリソルベート８０（植物由来）である。ｐＨは約７．０−９．０でよい。担体の１つの具体例は、５ｍＭのトリス、７５ｍＭのＮａＣｌ、５％ショ糖、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のポリソルベート８０をｐＨ８．０で含有している。
【０１３０】
ＶＩＩＩ．Ｂ．投薬計画
適正投薬計画は、特定ワクチンの効力、ならびに、患者の年齢、体重、性別および医学的状態、投与経路、所望の効果、投与回数などの要因を考慮して決定できる。特定ワクチンの効力は、細胞で発現およびプロセシングされＭＨＣクラスＩおよびＩＩ複合体に関係して提示されるポリペプチドを産生する特定ワクチンの能力のような様々な要因に依存する。
【０１３１】
患者に投与されたＨＣＶポリペプチドをコードする核酸は、アデノベクターのようなウイルスベクターを含む様々なタイプのベクターおよびＤＮＡプラスミドワクチンの部分を構成し得る。ＤＮＡプラスミドの投与に関する様々な実施態様では、約０．１から１０ｍｇのプラスミドを患者に投与し、また、約１から５ｍｇのプラスミドを患者に投与する。ウイルスベクター好ましくはアデノウルイスベクターの投与に関する様々な実施態様では、約１０５から１０１１のウイルス粒子を患者に投与し、また１０７から１０１０のウイルス粒子を患者に投与する。
【０１３２】
ウイルスベクターワクチンおよびＤＮＡプラスミドワクチンは、単独で投与してもよく、または、プライム（初回抗原刺激）およびブースト（追加抗原刺激）を含む投与計画の部分であってもよい。プライムおよびブーストの混合接種法は、ＤＮＡワクチンでプライムしウイルスベクターワクチンでブーストする方法、または、ウイルスベクターワクチンでプライムし、ＤＮＡワクチンでブーストする方法を含む。
【０１３３】
例えば約２から４回またはそれ以上の多数プライムを使用し得る。プライムとブーストとの間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月から１年の範囲であるが、他の時間枠を使用してもよい。個体に抗アデノウイルス免疫応答が既に存在する場合にはＤＮＡワクチンでプライムする投与計画の使用が好ましい。
【０１３４】
本発明の１つの実施態様では、初回ワクチン接種でＤＮＡワクチンを筋肉組織に直接接種する。初回ワクチン接種後のブーストはアデノベクターまたはＤＮＡワクチンで行う。
【０１３５】
免疫応答をブーストするために、インターロイキン−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＰ１０およびＭｉｇ−１のような補助薬剤を併用投与できる。補助薬剤はタンパク質としてまたは核酸ベクターの使用を介して併用投与できる。
【０１３６】
ＶＩＩＩ．Ｃ．異種プライム−ブースト
異種プライム−ブーストは、プライムに１つの種類のウイルスベクターを使用し、ブーストに別の種類のウイルスベクターを使用する混合方式である。異種プライム−ブーストは、種々のアデノウイルス血清型に基づくベクターのような近縁ベクター、ならびに、異なる動物のアデノウイルスおよびポックスウイルスのようなより遠縁のウイルスを含み得る。マウスをマラリアから守るためにポックスウイルスとアデノベクターとを使用することは、Ｇｉｌｂｅｒｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１０３９−１０４５，２００２によって示されている。ＨＣＶポリペプチドを発現するチンパンジーアデノベクターは、異種プライム−ブーストに使用できるベクターを提供する。
【０１３７】
プライムとブーストとの間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月から１年の範囲であるが、他の時間枠を使用してもよい。最小時間枠は、免疫静止を考慮した十分な時間でなければならない。１つの実施態様では、この静止に少なくとも６ヶ月間を要する。プライムは１種類のベクターによる多回、例えば２から４回のプライムを含み得る。
【０１３８】
ポックスウイルスベクター中に存在する発現カセットは、当該ポックスウイルスまたは別のポックスウイルス構成員の先天的プロモーターまたはそれらに由来するプロモーターを含有しなければならない。ワクシニアウイルス、変性ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、変性ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ、カナリアポックスウイルス（例えばＡＬＶＡＣ）、トリポックスウイルス、ウシポックスウイルスおよびＮＹＶＡＣに基づくベクターのような様々な種類のポックスウイルスに基づくベクターを構築し使用する様々な戦略が当業界で公知である。（Ｍｏｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７５５：２５−３８，１９８２；Ｅａｒｌら，Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；１９９１：１６．１６．１−１６．１６．７；Ｃｈｉｌｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４（２）：６２５−９，１９９０；Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：２１７−２３２，１９９２；米国特許Ｎｏｓ．，４，６０３，１１２，４，７２２，８４８，４，７６９，３３０，５，１１０，５８７，５，１７４，９９３，５，１８５，１４６，５，２６６，３１３，５，５０５，９４１，５，８６３，５４２，および５，９４２，２３５）。
【０１３９】
ＶＩＩＩ．Ｄ．アジュバント
ＨＣＶワクチンはアジュバントと共に配合できる。アジュバントは免疫原の免疫応答発生を補助する物質である。アジュバントは、生物学的または免疫学的半減期を延長する、免疫調節補助物質として作用する、または、免疫調節サイトカインの産生を誘導する、などの様々なメカニズムによって機能できる。種々のアジュバントを併用することもできる。
【０１４０】
ＨＣＶワクチンはアジュバントと共に配合できる。アジュバントの例は、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルヒドロゲル、リピドＡおよびそれらの誘導体または変異体、フロインド不完全アジュバント、中性リポソーム、ワクチンおよびサイトカインを内包するリポソーム、非イオン性ブロックコポリマー、ケモカイン、ならびに、免疫調節剤である。
【０１４１】
ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）およびポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）を含有する非イオン性ブロックコポリマー、例えば、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーはアジュバントとして使用し得る（Ｎｅｗｍａｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ７５：８９−１４２，１９９８）。非イオン性ブロックコポリマーとアニオン性界面活性剤との併用によって核酸の免疫応答を増進できる。
【０１４２】
サイトカイン、ホルモン、脂質誘導体および低分子のような様々な種類の化合物を免疫調節剤として使用できる。免疫調節剤の例は、抗−ＣＴＬＡ−４、抗−ＣＤ１３７、抗−ＣＤ４０、抗−ＣＤ２８、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ２５、抗ＰＤ１、抗−ＰＤ−Ｌｌ、抗−ＰＤ−Ｌ２、ＦＯＸＰ３−ブロッキング剤、Ｆｌｔ−３リガンド、イミキモッド、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、サルグラモスチン、トール様受容体（ＴＬＲ）−７アゴニストおよびＴＬＲ−９アゴニストである。
【０１４３】
アジュバント配合物の具体例は、ＣＲＬ−１００５（ＣｙｔＲｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＤＮＡおよびベンジルアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）を含有する配合物である。ＣＲＬ−１００５配合物は、例えばＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されているように調製できる。
【０１４４】
ＶＩＩＩ．Ｅ．ワクチン保存
ワクチンは様々な種類のバッファを使用して保存できる。例えば、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されたバッファＡ１０５を使用できる。
【０１４５】
ＤＮＡの保存は微量金属イオンの除去またはキレート化によって強化できる。ＤＮＡワクチンの安定性を強化するためにコハク酸またはリンゴ酸のような試薬とキレート化剤とを使用できる。キレート化剤の例は、多くのリン酸塩リガンドおよびＥＤＴＡである。また、エタノールまたはグリセロールのような非還元性フリーラジカルスカベンジャーの含有はフリーラジカル発生によるＤＮＡプラスミドの損傷を防止するために役立つ。さらに、ＤＮＡワクチンの安定性を最適化するために、配合物中のバッファの種類、ｐＨ、塩濃度、露光、バイアルの製造に使用した滅菌法などをコントロールするとよい。
【０１４６】
ＩＸ．実施例
本発明の様々な特徴をさらに詳細に説明するために実施例を以下に示す。実施例はまた本発明の有用な実施方法も示している。これらの実施例は特許請求の範囲に記載した本発明を限定しない。
【実施例１】
【０１４７】
ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ３ゲノム配列の注釈
ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ３を、“ヒトアデノウイルスＣ”群（ＨＡｄＶ−Ｃ；分類ＩＤ：１２９９５１）のすべてのタンパク質配列で作成されたローカルデータベースにブラストした。特定の分類ＩＤをサーチすることによってタンパク質配列をＮＣＢＩサーバーからダウンロードした。ブラストサーチはｂｌａｓｔｘプログラムを使用して行った。列中に示す配列の数を１０００に設定し、Ｆｉｌｔｅｒをスイッチオフにした。次に、大規模配列相似解析用のＢＬＡＳＴ強調ツールであるＭＳＰｃｒｕｎｃｈによってブラスト結果を解析した。
【０１４８】
２つのゲノム配列について得られたＣＤＳ注釈のおのおのをＡＴＧおよび終結コドンの位置と必要ならばスプライシング部位の位置とを観察することによって手作業で確認した。このような産物の相同による予測の妥当性を検証するために、すべての産物を以前に作成されたアデノウイルスタンパク質データベースにｂｌａｓｔｐでサーチした。ＣｈＡｄ６３およびＣｈＡｄ３の無加工のゲノム配列をＭＳＰｃｒｕｎｃｈ結果および手作業の校正に従ってＶＮＴＩで注釈した。遺伝子産物のＣｈＡｄ３およびＣｈＡｄ６３を表１および２に示す。
【０１４９】
【表１】
【０１５０】
【表２】
【実施例２】
【０１５１】
ＣｈＡｄ３ベクター構築
ＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ４Ａｄ５ｏｒｆ６ベクターの構築は以下の段階を含む。
【０１５２】
Ｉ．サブグループＣシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ３ウイルスゲノムを完全に配列決定し（配列１４）、その情報を使用して、相同的組換えによって完全ゲノムを容易にクローニングできるシャトルベクターを構築した。要約すると、ここでｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰと呼ぶサブグループＣチンパンジーアデノウイルス３をクローニングするために使用したシャトルベクターを以下の手順で構築した。ｐＩＸコーディング領域を含有しているＣｈＡｄ３ ＤＮＡフラグメント（ｎｔ３５４２−４１０５）を配列２０および２１のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、Ｓｇｆ１−ＡｓｃＩで消化し、次いで、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳＣＶ３２−３にクローニングして、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３Ｄを作製した。ＣｈＡｄ３右端（ｎｔ３７３２０−７４４１）を配列２２および２３のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３Ｄに結合して、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＤを作製した。ＣｈＡｄ３ウイルスＤＮＡ左端（ｎｔ１−４６０）を配列２４および２５のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＳｇｆＩで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＳｇｆＩで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＤにクローニングし、このようにしてｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＬＤを作製した。このウイルスＤＮＡカセットはまた、消化によってプラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡが遊離されるように双方のＩＴＲの末端に局在する制限酵素部位（ＰｍｅＩ）も含むように設計した。
【０１５３】
ＩＩ．ΔＥ１ ＣｈＡｄ３ベクターの構築
ＣｈＡｄ３ベクターはＢＪ５１８３大腸菌株中の相同的組換えによって構築した。ＢＪ５１８３細胞を、ＣｈＡｄ３精製ウイルスＤＮＡとＢｓｔＥＩＩおよびＢｓｔ１１０７１で消化したｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰシャトルベクターとによって同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子、直鎖化ｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰの末端に存在する右ＩＴＲ ＤＮＡ配列とウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同的組換えによってウイルスゲノムＤＮＡがプラスミドベクターに挿入され、同時に、Ｅ１領域が欠失してＥＧＦＰ発現カセットで置換された。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ポリＡ）に基づくＨＣＶ ＮＳ領域発現カセットを、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載された手順で構築し、ＨＣＭＶおよびＢｇｈ−ポリＡのＤＮＡ配列間の相同性を利用した相同的組換えによってＢＪ５１８３大腸菌株中のＣｈＡｄ３ΔＥ１ＥＧＦＰベクターに挿入した。
【０１５４】
ＩＩＩ．Ｅ３領域欠失
ＣｈＡｄ３ベクター主鎖に完全なＥ３領域の欠失を導入するために、Ｅ３遺伝子に隣接する２つのＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅して２つのＤＮＡフラグメントを作製した。４８６ｂｐのフラグメントはｎｔ２８１５９からｎｔ２８６４４（ｐＶＩＩＩ遺伝子の３’、Ｅ３領域の上流）の範囲であり、４７４ｂｐのＤＮＡフラグメントは、ファイバー遺伝子の３’端（ｂｐ３２６３３からｂｐ３３１０６まで、Ｅ３領域の下流）を含んでいる。第一のＤＮＡフラグメントの３’端および第二のフラグメントの５’端にＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。２つのＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、インビトロ結合によって接合した。得られたＤＮＡフラグメント（９８８ｂｐ）を次に、ｐＶＩＩＩ順方向オリゴおよびファイバー逆方向オリゴを使用してさらに増幅した。
【０１５５】
互いに接合した３’および５’のＤＮＡフランキング領域を含有している９８８ｂｐのＥ３領域のＤＮＡフラグメントを、ＢＪ５１８３細胞の同時形質転換によって、ＨｐａＩ（野生型ＣｈＡｄ３の３２３８４ｂｐでＥ３領域切断）で直鎖化したｐＣｈＡｄ３ΔＥ１／ＥＧＦＰに組換えて、Ｅ３欠失を導入した。最終組換え産物はｐＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰプレアデノプラスミドであった。
【０１５６】
ＩＶ．Ｅ４領域の欠失およびＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の挿入
ＣｈＡｄ３Ｅ４領域をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置換するために、Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６を、ＣｈＡｄ３ゲノムの右端に由来の最後の３９３ｂｐ（ｂｐ３７３４９からｂｐ３７７４１まで）を含有するシャトルプラスミドに導入した。引き続いて、ファイバー３’端に由来しＥ４ポリＡを含有している１４４ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＣｈＡｄ３マップのｂｐ３４４９１からｂｐ３４６３４まで）をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の下流に導入して、プラスミドｐＡＲＳＣｈＡｄ３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２を作製した。
【０１５７】
最後にＢＪ５１８３大腸菌株の同時形質転換によって、境界にファイバー３’端／Ｅ４ポリＡおよびＣｈＡｄ３右端を含むｐＡＲＳＣｈＡｄ３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２に由来のＤＮＡフラグメントを、ＰａｃＩ制限酵素（ＰａｃＩ部位、野生型ＣｈＡｄ３のｎｔ３６９２４）で直鎖化したｐＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰに相同的組換えによって導入し、ｐＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４Ａｄ５ｏｒｆ６ＥＧＦＰを作製した。
【０１５８】
この戦略によって、ＣｈＡｄ３Ｅ４コーディング領域が完全に欠失し、ＣｈＡｄ３Ｅ４プロモーターのコントロール下に推定Ｅ４ＴＡＴＡシグナルの６２ｂｐ下流にクローニングされたＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子で置換された。
【実施例３】
【０１５９】
ＣｈＡｄ６３ベクター構築
ＣｈＡｄ３ΔＥ１，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ４Ａｄ５ｏｒｆ６ベクターに類似のＣｈＡｄ６３ベクターは以下のように構築した。
【０１６０】
Ｉ．サブグループＥシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ６３ウイルスゲノムを完全に配列決定し、その情報を使用して、相同的組換えによって完全ゲノムを容易にクローニングできるシャトルベクターを構築した。要約すると、ここでｐＡＲＳＣｈＡｄ６３＿ＥＧＦＰと呼ぶサブグループＥチンパンジーアデノウイルス６３をクローニングするために使用したベクターを以下に記載の手順で構築した。
【０１６１】
ＣｈＡｄ６３右端（ｎｔ３６２１６−３６６４３）を配列２６および２７のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで制限したｐＡＲＳＣｈＡｄ３−ＲＬＤに結合して、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３Ｒを作製した。ｐＩＸコーディング領域を含有しているＣｈＡｄ６３ ＤＮＡフラグメント（ｎｔ３４２２−３８１４）を配列２８および２９のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化し、次いで、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３Ｒにクローニングして、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＤを作製した。ＣｈＡｄ６３ウイルスＤＮＡ左端（ｎｔ１−４５５）をプライマー３０および３１と共にＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＤにクローニングし、このようにしてｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤを作製した。ＨＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ｂｇｈポリＡカセットを、配列３２および３３のプライマーと共にＰＣＲ増幅し、ＥｃｏＲＶで消化し、次いで、ＥｃｏＲＶで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤにクローニングして、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰを作製した。このウイルスＤＮＡカセットはまた、消化によってプラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡが遊離されるように双方のＩＴＲの末端に局在する制限酵素部位（ＰｍｅＩ）も含むように設計した。
【０１６２】
ＩＩ．ΔＥ１ ＣｈＡｄ６３ベクターの構築
ＣｈＡｄ６３ベクターはＢＪ５１８３大腸菌株中の相同的組換えによって構築した。ＢＪ５１８３細胞を、ＣｈＡｄ６３精製ウイルスＤＮＡとＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰとによって同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子、直鎖化ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰの末端に存在する右ＩＴＲ ＤＮＡ配列とウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同的組換えによってウイルスゲノムＤＮＡがプラスミドベクターに挿入され、同時に、Ｅ１領域が欠失してＥＧＦＰ発現カセットで置換された。
【０１６３】
ＩＩＩ．Ｅ３領域欠失およびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔベクター構築
ＣｈＡｄ６３ベクター主鎖に完全なＥ３領域欠失を導入するために、Ｅ３遺伝子に隣接する２つのＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅して２つのＤＮＡフラグメントを作製した。５６７ｂｐのフラグメントはｎｔ２６６６５からｎｔ２７２０７まで（ｐＶＩＩＩ遺伝子の３’端，Ｅ３領域の上流）の範囲であり、５６３ｂｐのＤＮＡフラグメントはファイバー遺伝子の３’端（ｂｐ３１７８８からｂｐ３２３２６まで，Ｅ３領域の下流）を含んでいる。第一のＤＮＡフラグメントの３’端および第二フラグメントの５’にＰａｃＩ制限部位を導入した。２つのＰＣＲフラグメントをＰａｃＩで消化し、インビトロ結合によって接合した。得られたＤＮＡフラグメント（１１１２ｂｐ）を次に、ｐＶＩＩＩ順方向オリゴヌクレオチドおよびファイバー逆方向オリゴヌクレオチドを使用してさらに増幅した。
【０１６４】
互いに接合した３’および５’のＤＮＡフランキング領域を含有している１１１２ｂｐのＥ３領域のＤＮＡフラグメントを、ＢＪ５１８３細胞中の同時形質転換によって、ＨｐａＩ（野生型ＣｈＡｄ６３の３０１６８ｂｐでＥ３領域切断）で直鎖化したｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１／ＥＧＦＰと組換えて、Ｅ３欠失を導入した。最終組換え産物はｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰプレアデノプラスミドであった。
【０１６５】
ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＨＣＭＶ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（Ｂｇｈ ポリＡ）に基づくＨＣＶ ＮＳ領域発現カセットをＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載された手順で構築し、ＨＣＭＶおよびＢｇｈポリＡのＤＮＡ配列間の相同性を利用した相同的組換えによってＢＪ５１８３大腸菌株中のｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰベクターに挿入し、ＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔを作製した。
【０１６６】
ＩＶ．Ｅ４領域の欠失およびＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の挿入
ＣｈＡｄ６３Ｅ４領域をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６で置換するために、Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６を、ＣｈＡｄ６３ゲノムの右端に由来の４２８ｂｐ（ｂｐ３６２１６からｂｐ３６６４３まで）下流でｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ６３ＲＬＤ−ＥＧＦＰに導入した。引き続いて、ファイバー３’端に由来しＥ４ポリＡを含有している２００ｂｐのＤＮＡフラグメント（ＣｈＡｄ６３マップのｂｐ３３６２４からｂｐ３３８２３まで）をＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６の下流に導入して、プラスミドｐＡＲＳＣｈＡｄ６３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２を作製した。最後に、ＢＪ５１８３大腸菌株の同時形質転換によって、境界にファイバー３’端／Ｅ４ポリＡおよびＣｈＡｄ６３左端を含むｐＡＲＳＣｈＡｄ６３Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６−２に由来のＤＮＡフラグメントを、ＰｍｅＩ制限酵素（プラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡを遊離する）で消化したｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，Ｅ３／ＥＧＦＰに相同的組換えによって導入し、このようにしてｐＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４Ａｄ５ｏｒｆ６ＥＧＦＰを作製した。
【０１６７】
この戦略によって、ＣｈＡｄ６３Ｅ４コーディング領域が完全に欠失し、ＣｈＡｄ６３Ｅ４プロモーターのコントロール下に推定Ｅ４ＴＡＴＡシグナルの１３１ｂｐ下流にクローニングされたＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子で置換された。
【実施例４】
【０１６８】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）の発現
Ｃａｔａｌｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：６４００−６４０９，２００５に記載の手順に準拠した技術を使用してＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔのＨＣＶタンパク質発現を試験した。ＨｅＬａ細胞にＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔを感染させた。ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔはＥｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載されている。細胞抽出物を抗ＮＳ５Ａモノクローナル抗体によるイムノブロットで分析した。図８に示すように、ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔは、ヒトＡｄ６に基づくベクター（ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔ）と同様にＨＣＶタンパク質を発現する。
【実施例５】
【０１６９】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）の安定性
Ｃａｔａｌｕｃｃｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７９：６４００−６４０９，２００５に記載の手順に準拠した技術を使用してＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔの遺伝的安定性を検証した。５つの独立クローン（継代１０）から抽出したウイルスＤＮＡの制限分析を行った。プレＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔプラスミドを陽性対照として含ませた。ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔはＰｅｒＣ．６細胞までの継代期間は遺伝的に安定であった。
【実施例６】
【０１７０】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔ（配列１７）はマウス体内でＣＭＩを誘導した。
【０１７１】
Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載の手順に準拠した技術を使用してＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔの細胞性免疫誘導能力をＣ５７／Ｂ６マウスで試験した。図９は、Ｃ５７／Ｂ６マウス体内でのＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）、ＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔ（配列１７）およびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔの細胞性免疫誘導能力の比較を示す。図９は、注入３週後に行ったＩＦＮγ ＥＬＩｓｐｏｔ実験（Ｈ２Ｋｂ制限ペプチド使用、ＮＳ３プロテアーゼ中でマッピング）を示す（データはＮ＝５の平均として示す）。１０８および１０９の用量のＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔによってマウス体内でＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔと同等のＣＭＩが誘発される。
【実施例７】
【０１７２】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔはアカゲザル体内でＣＭＩを誘導した。
【０１７３】
ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔ（配列１７）のＣＭＩ誘導能力をヒト以外の霊長類で確認するために、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８およびＣｉｒｉｌｌｏら，国際公開ＷＯ ２００５／０７１０９３に記載の手順に準拠した技術を使用してアカゲザルを免疫感作した。異なる３つの非交差反応性ベクターの連続注射に基づく異種プライム／ブースト法で３匹１グループのサルを免疫感作してベクターを評価した。３匹の動物は、０および４週目に１匹あたり１０１０ｖｐの用量のＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔを２回注射してプライムし、次いで２２週目にＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔ、４２週目にＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔを注射した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した免疫応答の時間経過を図１１に報告するが、これは、所与のいずれかの時点で種々のＨＣＶ ＮＳペプチドプールに観察された応答の和を表している。この結果は、ＣｈＡｄ３ＮＳ注射によって全部の動物に効率的なプライム効果が得られたこと、および、ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔおよびＣｈＡｄ６３ＮＳｍｕｔの双方の投与によってＣＭＩが強力にブーストされることを示す。
【実施例８】
【０１７４】
キメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡ（配列１）の構築
ＨＣＶ ３ａに基づくＮＳ３−４Ａ領域とＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域とを含み、ここでｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂと呼ぶキメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミド（図１２および１３）はＢＪ５１８３大腸菌株中の相同的組換えによって得られた。
【０１７５】
最適翻訳開始（コザック）配列と、成熟ＮＳ３配列の第一アミノ酸に融合したメチオニン開始コドンとをもつＨＣＶ ３ａ由来の完全コドン最適化ＮＳ３−４ａをコードするプラスミドを合成的に作製した。ＮＳ３−４ａコーディング配列には、ｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔｂ受容体プラスミドに挿入するためにイントロンＡ配列とＮＳ３（ＨＣＶ）コーディング配列の起点とに相同の２つの組換え領域が隣接している（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）。親プラスミドからインサートを切除するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を新しいＮＳ３−４ａ配列の両端に導入した。
【０１７６】
このｐＶ１ＪｎｓＯＰＴｍｕｔプラスミドをＨｐａＩ非反復部位消化によって直鎖化した。直鎖化したｐＶ１ＪｎｓＯＰＴｍｕｔプラスミドおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化したＮＳ３−４ａ（３ａ）インサートでＢＪ５１８３菌株を同時形質転換して、ｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂを作製した。図１３に示す得られたｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−ｌｂの遺伝子構造を制限酵素およびＤＮＡ配列解析によって検証した。
【実施例９】
【０１７７】
キメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡはマウス体内でＤＭＩを誘導した。
【０１７８】
キメラＨＣＶポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡの種々のＨＣＶ遺伝子型に対する細胞性免疫誘導能力をマウスで試験した。キメラポリペプチド（配列１）は、ＨＣＶ ３ａに基づくＮＳ３−４Ａ領域およびＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域を含んでいた（ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂ）。
【０１７９】
異なる３つのマウス株（２つの同系交配：Ｂａｌｂ／ｃ，Ｃ５７Ｂ１／６および１つの異系交配：ＣＤ１）に、５０μｇのＤＮＡを筋肉内注射し次いで電気パルスを与えた。各動物に、キメラプラスミド（ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ３ａ−１ｂ）、または、ＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域をコードするｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔプラスミド（Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８）を２回与えた。ＨＣＶ １ｂおよび３ａに由来のウイルスタンパク質に特異的なＣＭＩを、Ｅｍｉｎｉら，国際公開ＷＯ ０３／０３１５８８に記載された技術を使用して測定した。図１４は、ＣＤ１マウス（異系交配株）の体内でＨＣＶ １ｂおよび３ａに由来のＮＳ３タンパク質に応答してＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を示す（１，０００，０００脾細胞あたりのスポット形成細胞として表す）。１ｂ ＮＳ３タンパク質に対する特異的応答は双方のプラスミドで同等であるが、３ａ ＮＳ３タンパク質に対してはキメラ構築物のほうが高い応答を誘導する（スチューデントＴ検定でｐ＝０．０４）。２つの同系交配株のマウス（Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７Ｂ１／６）の体内でＨＣＶ １ｂおよび３ａに由来のＮＳ３タンパク質に対して誘導されたＣＭＩは双方の構築物で同等であった。
【０１８０】
特許請求の範囲は他の実施態様も包含する。いくつかの実施態様を提示して説明したが、本発明の要旨および範囲を逸脱することなく様々な変更を行うことが可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】配列１のアミノ酸配列を示す。アミノ酸１−６８６は、ＨＣＶ ３ａに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域を与える。アミノ酸６８７−６９０は、ＨＣＶ ３ａ ＮＳ４Ｂ領域の最初の４つのアミノ酸を構成し、また、ＨＣＶ ３ａ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域の開裂接合を与える。アミノ酸６９１−２６７５は、ＨＣＶ １ｂに基づくＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域を与える。ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域およびＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域はまた開始メチオニンの付加を含む。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｃは配列２の核酸配列を示す。ヌクレオチド３１８−１０１８２は以下の要素を含む発現カセットを構成する：ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ３１８−９０５Ｉｎｔ Ａ：ｎｔ１０４０−１８６５コザック配列：ｎｔ１８８５−１８９０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ（３ａに基づく、最適化）：ｎｔ１８９１−３９４８ＨＣＶ ＮＳ４Ｂの最初の４アミノ酸（３ａに基づく）：ｎｔ３９４９−３９６０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ（１ｂに基づく、Ｂｋ菌株、最適化）：ｎｔ３９６１−９９１５ＴＡＡＡターミネーター：ｎｔ９９１６−９９１９ＢＧＨ：ｎｔ９９５６−１０１７９。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｃは配列２の核酸配列を示す。ヌクレオチド３１８−１０１８２は以下の要素を含む発現カセットを構成する：ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ３１８−９０５Ｉｎｔ Ａ：ｎｔ１０４０−１８６５コザック配列：ｎｔ１８８５−１８９０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ（３ａに基づく、最適化）：ｎｔ１８９１−３９４８ＨＣＶ ＮＳ４Ｂの最初の４アミノ酸（３ａに基づく）：ｎｔ３９４９−３９６０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ（１ｂに基づく、Ｂｋ菌株、最適化）：ｎｔ３９６１−９９１５ＴＡＡＡターミネーター：ｎｔ９９１６−９９１９ＢＧＨ：ｎｔ９９５６−１０１７９。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｃは配列２の核酸配列を示す。ヌクレオチド３１８−１０１８２は以下の要素を含む発現カセットを構成する：ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ３１８−９０５Ｉｎｔ Ａ：ｎｔ１０４０−１８６５コザック配列：ｎｔ１８８５−１８９０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ（３ａに基づく、最適化）：ｎｔ１８９１−３９４８ＨＣＶ ＮＳ４Ｂの最初の４アミノ酸（３ａに基づく）：ｎｔ３９４９−３９６０ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ（１ｂに基づく、Ｂｋ菌株、最適化）：ｎｔ３９６１−９９１５ＴＡＡＡターミネーター：ｎｔ９９１６−９９１９ＢＧＨ：ｎｔ９９５６−１０１７９。
【図３】ｍｅｔ−ＮＳ３−５Ｂ配列（配列１６）を示す。
【図４Ａ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｂ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｃ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｄ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｅ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｆ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｇ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｈ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｉ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図４Ｊ】図４Ａ−４Ｊは、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ａ、配列３）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｂ、配列５）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｃ、配列７）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｄ、配列９）、ＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｅ、配列１１）のアミノ酸配列、ならびに、ＣｈＡｄ３ファイバー（図４Ｆ、配列４）、ＣｈＡｄ３ヘキソン（図４Ｇ、配列６）、ＣｈＡｄ３ペントン（図４Ｈ、配列８）、ＣｈＡｄ６３ファイバー（図４Ｉ、配列１０）およびＣｈＡｄ６３ヘキソン（図４Ｊ、配列１２）のコーディング核酸を表す。
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｅ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｆ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｇ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図５Ｈ】図５Ａ−５Ｈは、ＣｈＡｄ３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６ＮＳｍｕｔ−３５，８９０ｂｐ（ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ、配列１３）の核酸配列を表す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４６１からｎｔ３５４１まで（３０８０ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２８６４４からｎｔ３２６３３まで（３９８９ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３４６３４からｎｔ３７３４９まで（２７１５ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４６０ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４６７−１２５７コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２６３−１２６８ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６９−７２２３ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２２４−７２２６ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２３４−７４５２ＣｈＡｄ３主鎖：ｎｔ７４６８−３５８９０Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３４６０１−３５４８２。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｇ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図６Ｈ】図６Ａ−６Ｈは野生型ＣｈＡｄ３の核酸配列（配列１４）を示す。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｅ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｆ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｇ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図７Ｈ】図７Ａ−７Ｈは野生型ＣｈＡｄ６３の核酸配列（配列１５）を示す。
【図８】ＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔに感染したＨｅＬａ細胞中のＨＣＶ ＮＳタンパク質の発現の比較を示す。
【図９】Ｃ５７／Ｂ６マウス体内で細胞性免疫を誘導するＣｈＡｄ３ＮＳｍｕｔ（配列１３）およびＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔの能力の比較を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｃ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｄ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｅ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｆ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｇ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１０Ｈ】図１０Ａ−１０ＨはＣｈＡｄ６３ΔＥ１，３，４，Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６，ＮＳｍｕｔ（配列１７）の核酸配列を示す。野生型ゲノムの欠失の組合せは、ｎｔ４５５からｎｔ３４２１まで（２９６７ｂｐ）のＥｌ欠失、ｎｔ２７２０７からｎｔ３１７７８まで（４５８２ｂｐ）のＥ３欠失、ｎｔ３３８２５からｎｔ３６２１５まで（２３９０ｂｐ）のＥ４欠失である。様々な領域は以下の場所に存在する：ＣｈＡｄ６３左側ＩＴＲ＋パッケージングシグナル：ｎｔ１−４５４ＨＣＭＶプロモーター：ｎｔ４５８−１２４８コザックコンセンサス配列：ｎｔ１２５４−１２５９ＨＣＶ ＮＳ３−５Ｂ（ＢＫ菌株）：ｎｔ１２６０−７２１４ＴＡＡターミネーター：ｎｔ７２１５−７２１７ＢＧＨポリＡ：ｎｔ７２２７−７４４７ＣｈＡｄ６３主鎖：ｎｔ７４５８−３４６５８Ａｄ５Ｅ４ｏｒｆ６：ｎｔ３３３１６−３４１９７。
【図１１】ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した免疫応答の時間経過を、いずれか所与の時点に種々のＨＣＶ ＮＳペプチドプールで観察した応答の和として表す。
【図１２】ｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ ３ａ−１ｂの種々の構成要素を示す。
【図１３】キメラＨＣＶポリペプチドをコードするｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔ ３ａ−ｌｂ発現カセットの遺伝子構造を示す。様々な領域は以下の場所に存在する：−ヒトＣＭＶプロモーター：３１８−９０５；−イントロンＡ：１０４０−１８６５；−コザック配列：１８８５−１８９４；−ＨＣＶ ＭｅｔＮＳ３−ＮＳ４Ａ（遺伝子型３ａ）：１８９１−３９６０；−ＨＣＶ ＭｅｔＮＳ３−ＮＳ５ＢＯＰＴｍｕｔ（遺伝子型１ｂ）：３９６１−９９１５；−ＴＡＡＡターミネーター：９９１６−９９１９；−ＢＧＨポリＡ：９９６５−１０１８２。
【図１４】キメラプラスミド（ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ ３ａ−１ｂ）またはｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔで免疫感作した動物（ＣＤ１マウス）体内のＨＣＶ １ｂおよび３ａ由来のＮＳ３タンパク質に応答してＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞の数を示す（脾細胞１，０００，０００個あたりのスポット形成細胞として表す）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一ＨＣＶ領域と第二ＨＣＶ領域とを含み、
前記第一ＨＣＶ領域が、第一のＨＣＶ菌株由来のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａに実質的に相似のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列を含み、
前記第二ＨＣＶ領域が、第二のＨＣＶ菌株に由来のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに実質的に相似のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａアミノ酸配列を含み、
前記第一領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列が前記第二領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列とは違っており、
前記第一領域が前記第二領域のアミノまたはカルボキシル側に配置されたＨＣＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
前記第一領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列が前記第一ＨＣＶ菌株由来のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａに少なくとも８５％の配列一致を有しており、前記第二領域のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａアミノ酸が前記第二菌株由来のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに少なくとも８５％の配列一致を有しており、さらに、前記第一領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列と前記第二領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列が少なくとも５％だけ違っている請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記第二ＨＣＶ領域はさらに、前記第二領域がＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂを供給するようにＨＣＶ ＮＳ５Ｂを含んでおり、前記第二領域がさらに、インビボで自己をプロセシングして前記ＮＳ５Ｂを産生するために十分なプロテアーゼ活性を有しており、前記ＮＳ５Ｂタンパク質が酵素的に不活性である請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記第一領域が前記第二領域のアミノ側に存在し、前記第一領域が自己をプロセシングしてＨＣＶ ＮＳ３を産生するために十分なプロテアーゼ活性を有している請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記ＨＣＶポリペプチドが配列１に実質的に相似である請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記ＨＣＶポリペプチドが配列１から成る請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列２の塩基１８９１−９９１５に実質的に相似である請求項５に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸が前記ヌクレオチド配列をコードする発現カセットを含む請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が、選択可能マーカーと、複製起点と、前記発現カセットに隣接する第一のアデノウイルス相同領域および第二のアデノウイルス相同領域とをさらに含むシャトルベクターであり、前記第一相同領域が野生型アデノウイルス領域の少なくとも右端に実質的に相同の少なくとも約１００の塩基対を有しており、前記第二相同領域が野生型アデノウイルス領域の少なくとも左端に実質的に相同の少なくとも約１００の塩基対を有している請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸が、選択可能マーカーと、複製起点と、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含む組換えアデノベクターゲノムとを含むアデノウイルスゲノムプラスミドであり、前記発現カセットがＥ１またはＥ３欠失に配置されている請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
前記組換えアデノベクターゲノムが、
ａ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｂ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｃ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸が発現ベクターである請求項８に記載の核酸。
【請求項１３】
前記発現ベクターがプラスミドである請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記プラスミドがさらに原核性複製起点と選択可能マーカーとを含む請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記核酸が配列２の核酸に実質的に相似である請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸が配列２から成る請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記発現ベクターが組換えアデノベクターであり、前記アデノベクターが組換えアデノウイルスゲノムを含む請求項１２に記載の核酸。
【請求項１８】
前記組換えアデノウイルスゲノムがＥ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含み、前記発現カセットがＥ１またはＥ３欠失に配置されている請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記組換えアデノベクターゲノムが、
ａ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｂ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｃ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
前記アデノウイルスゲノムが配列１４または１５の対応領域に実質的に相似である請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
ａ）ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ５Ａを含むＨＣＶポリペプチドをコードしている発現カセットと、
ｂ）Ｅ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含むアデノウイルスゲノムと、
を含み、前記ゲノムが、
ｉ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｉｉ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｉｉｉ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしており、
前記発現カセットがＥ１またはＥ３欠失に配置されている組換えアデノベクター。
【請求項２２】
前記ＨＣＶポリペプチドがＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂを含み、インビボで自己をプロセシングしてＮＳ５Ｂタンパク質を産生するために十分な活性を有しており、前記ＮＳ５Ｂタンパク質が酵素的に不活性であり、前記アデノウイルスゲノムが、Ｅ４欠失と、配列１３のヌクレオチド３４６０１−３５４８２に実質的に相似のＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６配列の挿入とを含む請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが実質的に配列１３または１７である請求項２１に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが配列１３または１７の核酸配列から成る請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１７に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２６】
請求項１８に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２７】
請求項１９に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２８】
請求項２２に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２９】
請求項２３に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項３０】
請求項２４に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項３１】
ａ）請求項１７に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３２】
ａ）請求項１８に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３３】
ａ）請求項１９に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３４】
ａ）請求項２２に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３５】
ａ）請求項２３に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３６】
ａ）請求項２４に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３７】
治療有効量の請求項１２に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項３８】
治療有効量の請求項１４に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項３９】
治療有効量の請求項１５に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４０】
治療有効量の請求項１７に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４１】
治療有効量の請求項１８に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４２】
治療有効量の請求項１９に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４３】
治療有効量の請求項２１から２４のいずれか一項に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４４】
治療有効量の請求項１２に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４５】
治療有効量の請求項１４に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４６】
治療有効量の請求項１５に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４７】
治療有効量の請求項１７に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４８】
治療有効量の請求項１８に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４９】
治療有効量の請求項１９に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項５０】
治療有効量の請求項２１から２４のいずれか一項に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項１】
第一ＨＣＶ領域と第二ＨＣＶ領域とを含み、
前記第一ＨＣＶ領域が、第一のＨＣＶ菌株由来のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａに実質的に相似のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列を含み、
前記第二ＨＣＶ領域が、第二のＨＣＶ菌株に由来のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに実質的に相似のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａアミノ酸配列を含み、
前記第一領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列が前記第二領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列とは違っており、
前記第一領域が前記第二領域のアミノまたはカルボキシル側に配置されたＨＣＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２】
前記第一領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列が前記第一ＨＣＶ菌株由来のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａに少なくとも８５％の配列一致を有しており、前記第二領域のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａアミノ酸が前記第二菌株由来のＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａに少なくとも８５％の配列一致を有しており、さらに、前記第一領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列と前記第二領域のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａアミノ酸配列が少なくとも５％だけ違っている請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記第二ＨＣＶ領域はさらに、前記第二領域がＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂを供給するようにＨＣＶ ＮＳ５Ｂを含んでおり、前記第二領域がさらに、インビボで自己をプロセシングして前記ＮＳ５Ｂを産生するために十分なプロテアーゼ活性を有しており、前記ＮＳ５Ｂタンパク質が酵素的に不活性である請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記第一領域が前記第二領域のアミノ側に存在し、前記第一領域が自己をプロセシングしてＨＣＶ ＮＳ３を産生するために十分なプロテアーゼ活性を有している請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記ＨＣＶポリペプチドが配列１に実質的に相似である請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記ＨＣＶポリペプチドが配列１から成る請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列２の塩基１８９１−９９１５に実質的に相似である請求項５に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸が前記ヌクレオチド配列をコードする発現カセットを含む請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が、選択可能マーカーと、複製起点と、前記発現カセットに隣接する第一のアデノウイルス相同領域および第二のアデノウイルス相同領域とをさらに含むシャトルベクターであり、前記第一相同領域が野生型アデノウイルス領域の少なくとも右端に実質的に相同の少なくとも約１００の塩基対を有しており、前記第二相同領域が野生型アデノウイルス領域の少なくとも左端に実質的に相同の少なくとも約１００の塩基対を有している請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸が、選択可能マーカーと、複製起点と、Ｅ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含む組換えアデノベクターゲノムとを含むアデノウイルスゲノムプラスミドであり、前記発現カセットがＥ１またはＥ３欠失に配置されている請求項８に記載の核酸。
【請求項１１】
前記組換えアデノベクターゲノムが、
ａ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｂ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｃ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸が発現ベクターである請求項８に記載の核酸。
【請求項１３】
前記発現ベクターがプラスミドである請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
前記プラスミドがさらに原核性複製起点と選択可能マーカーとを含む請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記核酸が配列２の核酸に実質的に相似である請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸が配列２から成る請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記発現ベクターが組換えアデノベクターであり、前記アデノベクターが組換えアデノウイルスゲノムを含む請求項１２に記載の核酸。
【請求項１８】
前記組換えアデノウイルスゲノムがＥ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含み、前記発現カセットがＥ１またはＥ３欠失に配置されている請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記組換えアデノベクターゲノムが、
ａ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｂ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｃ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしている請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
前記アデノウイルスゲノムが配列１４または１５の対応領域に実質的に相似である請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
ａ）ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ５Ａを含むＨＣＶポリペプチドをコードしている発現カセットと、
ｂ）Ｅ１欠失、Ｅ３欠失および場合によりＥ４欠失を含むアデノウイルスゲノムと、
を含み、前記ゲノムが、
ｉ）配列３または９に実質的に相似のアミノ酸配列をもつファイバー領域、
ｉｉ）配列５または１１に実質的に相似のアミノ酸配列をもつヘキソン領域、および、
ｉｉｉ）配列７に実質的に相似のアミノ酸配列をもつペントン領域
の少なくとも１つをコードしており、
前記発現カセットがＥ１またはＥ３欠失に配置されている組換えアデノベクター。
【請求項２２】
前記ＨＣＶポリペプチドがＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂを含み、インビボで自己をプロセシングしてＮＳ５Ｂタンパク質を産生するために十分な活性を有しており、前記ＮＳ５Ｂタンパク質が酵素的に不活性であり、前記アデノウイルスゲノムが、Ｅ４欠失と、配列１３のヌクレオチド３４６０１−３５４８２に実質的に相似のＡｄ５Ｅ４ｏｒｆ６配列の挿入とを含む請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記ベクターが実質的に配列１３または１７である請求項２１に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ベクターが配列１３または１７の核酸配列から成る請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１７に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２６】
請求項１８に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２７】
請求項１９に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２８】
請求項２２に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項２９】
請求項２３に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項３０】
請求項２４に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含み、前記組換えアデノウイルスゲノムによってコードされている組換えアデノウイルス粒子。
【請求項３１】
ａ）請求項１７に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３２】
ａ）請求項１８に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３３】
ａ）請求項１９に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３４】
ａ）請求項２２に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３５】
ａ）請求項２３に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３６】
ａ）請求項２４に記載の組換えアデノウイルスゲノムを発現させるためにＥ１相補細胞を使用して粒子を製造する段階と、
ｂ）前記粒子を実質的に精製する段階と、
を含む組換えアデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項３７】
治療有効量の請求項１２に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項３８】
治療有効量の請求項１４に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項３９】
治療有効量の請求項１５に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４０】
治療有効量の請求項１７に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４１】
治療有効量の請求項１８に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４２】
治療有効量の請求項１９に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４３】
治療有効量の請求項２１から２４のいずれか一項に記載の核酸と医薬的に許容される担体とを含む医薬配合物。
【請求項４４】
治療有効量の請求項１２に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４５】
治療有効量の請求項１４に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４６】
治療有効量の請求項１５に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４７】
治療有効量の請求項１７に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４８】
治療有効量の請求項１８に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項４９】
治療有効量の請求項１９に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【請求項５０】
治療有効量の請求項２１から２４のいずれか一項に記載の核酸を患者に投与する段階を含む患者の治療方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図４Ｈ】
【図４Ｉ】
【図４Ｊ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図５Ｆ】
【図５Ｇ】
【図５Ｈ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図６Ｆ】
【図６Ｇ】
【図６Ｈ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図７Ｅ】
【図７Ｆ】
【図７Ｇ】
【図７Ｈ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１０Ｅ】
【図１０Ｆ】
【図１０Ｇ】
【図１０Ｈ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００８−５４３２９５（Ｐ２００８−５４３２９５Ａ）
【公表日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１６２２３（Ｐ２００８−５１６２２３）
【出願日】平成１８年６月１３日（２００６．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００５６９７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３３９１１
【国際公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１３日（２００６．６．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００５６９７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３３９１１
【国際公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【出願人】（５０１２０９４２７）イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー (90)
【Ｆターム（参考）】
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