Ｃ末端逐次分解反応に由来する塩形成回避法
【課題】微量タンパク質に対しても適用でき、かつ確度の高い内部配列取得技術における反応副産物の効率的除去方法の確立。
【解決手段】解析対象とするペプチド群ないしペプチドが乾燥状態で塗布されているサンプルプレートに対して、Ｃ末端逐次分解工程の終了後、含窒素芳香環化合物と水分子を作用させ、アルカン酸と「揮発性塩」を形成させ、得られた「揮発性塩」を、減圧もしくは不活性ガスの送気によりサンプルプレート上から除去する。引き続き、第３アミン化合物と水分子による、加水分解反応工程を実施する際、アルカン酸と第３アミン化合物の「不揮発性塩」形成を抑制する。その結果、質量分析時に置ける高感度、高再現性が確保される。
【解決手段】解析対象とするペプチド群ないしペプチドが乾燥状態で塗布されているサンプルプレートに対して、Ｃ末端逐次分解工程の終了後、含窒素芳香環化合物と水分子を作用させ、アルカン酸と「揮発性塩」を形成させ、得られた「揮発性塩」を、減圧もしくは不活性ガスの送気によりサンプルプレート上から除去する。引き続き、第３アミン化合物と水分子による、加水分解反応工程を実施する際、アルカン酸と第３アミン化合物の「不揮発性塩」形成を抑制する。その結果、質量分析時に置ける高感度、高再現性が確保される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ末端逐次分解反応ならびに質量分析法を利用して、タンパク質を構成するペプチド鎖のアミノ酸配列を解析する方法において、その解析精度を改善する方法に関する。より具体的には、タンパク質を構成するペプチド、あるいは、タンパク質に由来するペプチド群のアミノ酸配列を、Ｃ末端逐次分解反応ならびに質量分析法を利用して解析する際、前記Ｃ末端逐次分解反応に使用する試薬相互間での塩形成に起因する解析精度の低下を回避する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析法を利用して、ペプチド群ないしペプチドのアミノ酸配列を解析する手法として、次の二つの手法が知られている。一つは、タンデム質量分析によるＭＳ／ＭＳスペクトルを測定し、ペプチド自体に起因する親イオン種と、そのペプチド鎖の解裂により生成するペプチド断片群に相当する娘イオン種を同時に観測し、アミノ酸配列を解釈する方法である。二つ目は、ペプチド群ないしペプチドを化学的にアミノ酸単位で分解し、アミノ酸一つずつ短縮された一連の反応産物の質量分析を行い、この一連の反応産物の質量差に基づき、アミノ酸配列を解析する方法である。
【０００３】
前者のＭＳ／ＭＳ法では、ペプチド鎖の解裂は、アミド結合部分で起こり、結果的に、ペプチド鎖中に存在する複数のアミド結合のいずれかで解裂が生じた、一連のペプチド断片に起因する娘イオン種を同時に観測する。この解裂で生成する一連のペプチド断片起因する娘イオン種中には、解裂が生じたアミド結合の位置が一つずつ異なっている、特定の解裂シリーズをなす娘イオン種ピーク群が含まれている。この特定の解裂シリーズをなす娘イオン種ピーク群においては、ピーク間の質量差がアミノ酸残基質量に相当するので、演算によりアミノ酸配列を高い確度で推定することができる。しかしながら、ペプチド鎖の解裂を引き起こす衝撃エネルギー等の制御が難しく、また、アミノ酸配列により、解裂が生じ易い部位と、生じ難い部位が存在する場合もある。加えて、通常、ペプチド鎖に対する衝撃は、一回しか起こらないが、高密度の衝撃条件を選択する際には、生成したペプチド断片がさらに衝撃を受け、さらに、断片化する現象も見出される。結果的に、ペプチド鎖に対して、そのＮ末端からＣ末端まで、全てのアミド結合部分において解裂が生じ、一連の解裂シリーズをなす娘イオン種ピーク群が十分な精度（強度）で測定される頻度はあまり高くない。そのため、推定されるアミノ酸配列の確度も、必ずしも高くはない。
【０００４】
他の１つの方法は、化学反応を利用して、ペプチド鎖を末端からアミノ酸単位で分解し、アミノ酸一つずつ短縮された一連の反応産物を作製し、その質量分析を行い、この一連の反応産物の質量差に基づき、アミノ酸配列を解析する方法である。ペプチド鎖を末端からアミノ酸単位で分解する代表的な手法は、ペプチド鎖のＣ末端側から連続的にアミノ酸を切断するＣ末端アミノ酸逐次分解反応を利用する手法である。例えば、アルカン酸無水物（例えば、無水酢酸）蒸気に、微量のパーフルオロアルカン酸（例えば、トリフルオロ酢酸）蒸気を混入させ、ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する方法が提案されている（非特許文献１参照）。この手法によれば、測定される質量スペクトルの複雑性を除去するため、Ｃ末端逐次分解前にペプチド鎖に対して行うアシル化反応（前処理）と、Ｃ末端逐次分解後に反応産物に対して行う加水分解処理（後処理）を行うことが有効であることも併せて記載されている。
【０００５】
予め乾燥したペプチド鎖に、蒸気として供給されるアルカン酸無水物およびパーフルオロアルカン酸を作用させ、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解を行う手法では、下記の二段階の反応が進行する。まず、パーフルオロアルカン酸の存在下、アルカン酸無水物がペプチド鎖のＣ末端に作用することで、反応式（Ｉ）で表記される脱水反応：
【０００６】
【化１】
【０００７】
により、Ｃ末端アミノ酸から反応中間体として、５−オキサゾロン環構造が形成される。次いで、更に、アルカン酸無水物がこの５−オキサゾロン環に作用し、反応式（II）で表記される反応：
【０００８】
【化２】
【０００９】
が進行し、結果的に、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成される。その後、Ｃ末端に生成している酸無水物構造を利用して、５−オキサゾロン環構造が形成される。
【００１０】
上記のＣ末端アミノ酸の選択的な分解反応は逐次的に進み、所定の処理時間が経過した時点で、元のペプチド鎖に対して、１〜１０数アミノ酸残基がそのＣ末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物が得られる。この一連の反応産物を含む混合物に対して、質量分析法を適用して、各反応産物に由来するイオン種の質量を測定すると、Ｃ末端アミノ酸配列を反映した質量差を示す一連のピークが測定できる。具体的には、各反応産物は、元のペプチド鎖から逐次的なＣ末端アミノ酸分解反応で生成される結果、例えば、元のペプチド鎖から数アミノ酸残基が除去された反応産物までの、数種の一連の反応産物群に関して、質量分析法を利用することで、対応するイオン種の質量を一括して分析することができ、かかる数アミノ酸残基分のＣ末端アミノ酸配列を一括して決定できる。
【００１１】
また、アミノ酸配列の長いペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する際、ペプチド途中におけるペプチド結合の切断など好ましくない副次反応を抑制するために、アミノ酸配列の長いペプチドの乾燥試料に対して、予めＮ−アシル化処理を施し、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用し、穏和な条件でＣ末端アミノ酸の分解を行う。Ｃ末端アミノ酸逐次分解反応を終えた後、反応産物のＣ末端に残余している酸無水物構造、あるいは、オキサゾロン環構造を、第３アミンの存在下、気相から水分子を作用させることで加水分解処理を施し、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とする。さらに、この加水分解処理を施した反応産物に対して、トリプシン消化を行うことにより、質量分析の対象となるペプチド断片の分子量を小さくして、長いペプチド鎖のＣ末端アミノ酸配列をより簡便に解析する方法についても、本出願人により提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ４， １５−２１ （２００４）
【特許文献１】特開２００３−２７９５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のＣ末端逐次分解反応ならびに質量分析法を利用する方法は、ペプチド群ないしペプチドのＣ末端から１０アミノ酸残基程度のアミノ酸配列を高い精度で、かつ容易に決定できる汎用性に富む解析方法として有用である。しかしながら、前記加水分解処理の工程において、塩基触媒として利用する第３アミン試薬は、反応産物中に相当量残存するアルカン酸と塩を形成する。このアルカン酸と第３アミンで構成される塩が反応産物中に相当量残余していると、後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法による質量分析の際に不可欠となるマトリクスの結晶形成阻害、およびこれに起因するスペクトル不良を引き起こす要因となることが判明した。具体的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った際、分析対象試料中に、アルカン酸と第３アミンとで構成される塩が相当量に残余していると、目的とする反応産物に由来するピーク強度が極端に低下し、良好な測定結果が得られない場合がある。この現象は、特に、サンプルプレート上において、分析対象試料の調製を行う工程と、その後、そのまま、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行う工程とを一体化して、自動化・機械化を進める上で問題となる。
【００１３】
本発明は、前記の課題を解決するものである。本発明の目的は、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用して、ペプチド鎖のＣ末端逐次分解反応を行い、その後、第３アミンと水分子とを組み合わせた反応試薬を利用して、ペプチド鎖のＣ末端のオキサゾロン環構造を加水分解して、カルボキシル基に変換する後処理工程の操作を行う際、Ｃ末端逐次分解反応で使用するアルカン酸無水物に由来するアルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の形成を回避する手段を提供することにある。さらには、本発明の目的は、Ｃ末端逐次分解反応で使用するアルカン酸無水物に由来するアルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の形成を回避する手段を具えた、ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的分解して、前記ペプチドに由来する一連の反応産物を調製する手法を利用して、アルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の残余に起因する、質量分析用のマトリクス結晶形成障害、あるいは、測定される質量スペクトル上における、一連の反応産物由来のイオンピーク強度の低下などの問題を解消する方法を提供することにある。特には、解析対象のペプチドが、超微量サンプルである場合に、その質量解析に使用するサンプルプレート上において、前記Ｃ末端逐次分解反応と、その後処理工程を行う際、アルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の残余を回避でき、一連の反応操作の自動化・機械化に適合する質量分析用サンプルの調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
通常、Ｃ末端逐次分解反応工程では、サンプルプレート上において、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を、予めＮ−アシル化処理を施したペプチドの乾燥試料に作用させ、この工程を終了後、乾燥処理を施す。従って、本発明者は、前記乾燥処理を施した、サンプルプレート上の反応産物の乾燥試料中には、微小な液滴を形成可能な量のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸は残余していないことを確認した。しかしながら、このサンプルプレート上の反応産物の乾燥試料中には、相当量のアルカン酸無水物、微量のパーフルオロアルカン酸、アルカン酸無水物から生成したアルカン酸が吸着していることも確認した。従って、第３アミンと水分子とを組み合わせた反応試薬を利用して、加水分解処理を施す工程中では、残余しているアルカン酸無水物の加水分解も進行し、２分子のアルカン酸に変換される。また、系内には、第３アミンが存在しているため、生成した相当量のアルカン酸、あるいは、微量残余しているパーフルオロアルカン酸は、この第３アミンと速やかに付加塩を形成する。形成された付加塩の融点は高く、沸点も高く、また、熱的にも安定であるため、この加水分解処理工程の加熱温度では、揮発、解離を起こさず、固体状態となって、反応産物の試料中に混入した状態となる。従って、加水分解処理工程を終了し、再び、第３アミンと水分子を蒸散させ、加水分解処理済の反応産物の乾燥試料とする段階では、この反応産物の乾燥試料中に、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩が相当量混入した状態となることを確認した。
【００１５】
加えて、サンプルプレート上において、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩が相当量共存している状態で、ペプチドの乾燥試料に対して、マトリクス材料を含む溶液を滴下し、乾燥させて、マトリクスの結晶化を行うと、良好な結晶状態のマトリクスが形成されないことを確認した。また、その状態のサンプルを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行って、測定された質量スペクトル中において、目的とするペプチドに由来するイオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルとを比較すると、所謂、Ｓ／Ｎ比が低い測定結果となることも確認した。
【００１６】
一方、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩が共存していない状態では、サンプルプレート上において、ペプチドの乾燥試料に対して、マトリクス材料を含む溶液を滴下し、乾燥させて、マトリクスの結晶化を行うと、良好な結晶状態のマトリクスが形成される。また、良好な結晶状態のマトリクスが形成されているサンプルを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行うと、目的とするペプチドに由来するイオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルとの比、所謂、Ｓ／Ｎ比が十分に高い測定結果が得られる。
【００１７】
以上の知見から、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩の生成を回避することで、良好な結晶状態のマトリクスの形成が可能となり、良好な結晶状態のマトリクスが形成されているサンプルを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行うと、所謂、Ｓ／Ｎ比が十分に高い良好な測定結果が得られることを見出した。さらに、このアルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩の生成を回避する上では、Ｃ末端逐次分解反応工程を終了した後、サンプルプレート上、反応産物の乾燥試料中に吸着することで残余している、相当量のアルカン酸無水物、微量のパーフルオロアルカン酸、アルカン酸無水物から生成したアルカン酸を除去することが有効であることに着目した。
【００１８】
先ず、この吸着している、相当量のアルカン酸無水物を加水分解し、生成するアルカン酸を「揮発性塩」に変換すると、乾燥状態のペプチドに対する、吸着能が低下することを見出した。すなわち、アルカン酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が、塩の形成に使用される結果、乾燥状態のペプチドとの相互作用（例えば、水素結合）を低減でき、吸着能が低下することを見出した。また、微量残留しているパーフルオロアルカン酸に関しても、「揮発性塩」に変換すると、乾燥状態のペプチドに対する、吸着能が低下することを見出した。
【００１９】
さらに、本発明者は、Ｃ末端逐次分解反応工程を終了した後、サンプルプレート上、反応産物の乾燥試料中に吸着することで残余している、相当量のアルカン酸無水物の加水分解と、同時に、生成するアルカン酸を「揮発性塩」に選択的に変換する手段を探索した。その探索の結果、含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジンやその誘導体を利用すると、６０℃以下の加熱条件において、塩基触媒として機能する、該含窒素芳香環化合物の存在下、水分子をアルカン酸無水物に作用させると、加水分解が進行することを見出した。また、同時に、該含窒素芳香環化合物の存在下では、生成するアルカン酸は、速やかに、該含窒素芳香環化合物と塩を形成し、形成される塩は、６０℃以下の加熱条件において、「揮発」が進行する「揮発性塩」であることも確認した。
【００２０】
具体的には、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」は、気相中に存在する、含窒素芳香環化合物分子とアルカン酸分子と解離平衡状態となっている。そのため、気相中に存在するアルカン酸分子の分圧を低く抑えると、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」固体は、熱的に解離して、アルカン酸分子を気相中に放出する。一方、気相中に蒸気状の含窒素芳香環化合物と水分子を供給している、含窒素芳香環化合物の水溶液は、気相中に存在するアルカン酸分子を吸収し、その液相中（水溶液）において、アルカン酸アニオン種として、溶解し、蓄積していく。すなわち、含窒素芳香環化合物の水溶液が、系内に共存する状態とすることで、気相中に存在するアルカン酸分子の分圧は、実質的に「０」の状態に維持される。その結果、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」固体の熱的な解離が持続され、最終的には、相当量のアルカン酸無水物の加水分解、その後、含窒素芳香環化合物との「揮発性塩」を一旦形成したアルカン酸分子は、全て、気相中に放出される。すなわち、一旦、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」に変換したのち、この「揮発性塩」が前記の機構を介して、「揮発」される。
【００２１】
この蒸気状の含窒素芳香環化合物と水分子を利用し、アルカン酸無水物の加水分解と、生成するアルカン酸分子を「揮発性塩」に変換し、さらに「揮発」させ、除去する工程を設けると、その工程後、サンプルプレート上、反応産物の乾燥試料中には、アルカン酸が存在しない状態とできる。
【００２２】
本発明の方法は、上述する蒸気状の含窒素芳香環化合物と水分子を利用し、アルカン酸無水物の加水分解と、生成するアルカン酸分子を「揮発性塩」に変換し、さらに「揮発」させ、除去する「脱塩工程」を利用することで、その後、蒸気状の第３アミンと水分子を利用する「後処理工程」を実施する際、アルカン酸と第３アミンとで構成される不揮発性塩の生成を回避するものである。また、アルカン酸と第３アミンとで構成される不揮発性塩の生成を回避する結果、サンプルプレート上において、反応産物の乾燥試料にマトリクス材料を含む溶液を滴下し、乾燥させて、マトリクスの結晶化を行った際、良好な結晶性を示すものとできる。従って、かかるマトリクスの結晶化によって調製されるサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行うと、所謂、Ｓ／Ｎ比が十分に高い良好な測定結果が高い再現性で得られる。
【００２３】
本発明は、上述する一連の知見に基づき、完成されたものである。
【００２４】
すなわち、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、
解析対象とするペプチドを解析する方法であって、
質量分析測定用のサンプルプレート上において、解析対象とする前記ペプチドを、滴下乾燥した後、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的分解して、前記ペプチドに由来する一連の反応産物を調製する工程と、
該サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルを、質量分析機を利用して測定する工程と、
測定された質量スペクトルに基づき、前記一連の反応産物の質量を特定し、一連の反応産物間の質量差を用いて、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を特定する工程とを有し、
サンプルプレート上において、前記一連の反応産物を調製する工程は、少なくとも、
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解するＣ末端逐次分解化学反応工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程に先立ち実施される前処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程の後に実施される後処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程と後処理工程の間に、サンプルプレート上に残余している前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程で利用する反応試薬を除去する、反応試薬の除去工程とを具え、
前処理工程は、
乾燥雰囲気下、１０〜６０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において滴下乾燥されている、解析対象とする前記ペプチドに対して、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とアルカン酸を接触させて、前記ペプチドのＮ末端のアミノ基、ならびに該ペプチド鎖中に含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基にＮ−アシル化保護を施す工程であり；
Ｃ末端逐次分解反応工程は、
乾燥雰囲気下、１５〜８０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において、前処理工程によってＮ−アシル化保護されたペプチドの乾燥試料に対して、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を接触させて、該ペプチドのＣ末端において、
下記する一般式（III）：
【００２５】
【化３】
【００２６】
（式中、Ｒ１は、ペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖を表し、Ｒ２は、前記Ｃ末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す）で表記される５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴って、Ｃ末端アミノ酸の分解を逐次的に行う工程であり；
反応試薬の除去工程は、
サンプルプレート上において、前記Ｃ末端逐次分解反応工程で調製される、ペプチドに由来する一連の反応産物を含む乾燥試料に対して、
該サンプルプレート上に残余する前記アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸とを、減圧または不活性ガスの送気により蒸散させる処理を施し、
次いで、前記乾燥試料に対して、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子、あるいは、液滴状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を接触させて、塩基性含窒素芳香環化合物を触媒として利用し、該サンプルプレート上に残留する未反応の前記アルカン酸無水物を加水分解し、前記加水分解産物であるアルカン酸および前記パーフルオロアルカン酸と該塩基性含窒素芳香環化合物との揮発性の塩を形成させ、減圧または不活性ガスの送気により前記揮発性塩を揮発させ、前記乾燥試料中から除去する工程であり；
後処理工程は、
前記反応試薬の除去工程を施した後、サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物に対して、蒸気状の第３アミン化合物と水分子、あるいは、液滴状の第３アミン化合物と水分子を接触させて、該一連の反応産物のペプチド鎖のＣ末端部に形成されている該５−オキサゾロン環を加水分解処理する工程である
ことを特徴とする、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法である。
【００２７】
その際、
アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を反応試薬として使用する、Ｃ末端逐次分解反応工程；
アルカン酸無水物とアルカン酸を反応試薬として使用する、前処理工程；
含窒素芳香環化合物と水分子を反応試薬として使用する、反応試薬の除去工程；
第３アミン化合物と水分子を反応試薬として使用する、後処理工程の各工程において、
各工程で利用する反応試薬を、蒸気状の反応試薬を気相から供給し、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を低く設定し、前記サンプルプレート上のペプチドの乾燥試料に対して、蒸気状の反応試薬の吸着を起こさせる、反応試薬の吸着工程と、
各工程で利用する反応試薬を作用させる処理を終了させる時点で、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を高く設定し、前記サンプルプレート上の該工程の処理済ペプチド試料中に吸着させた前記反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を具えている
ことが好ましい。
【００２８】
また、前処理工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とアルカン酸の組み合わせは、無水酢酸と酢酸であることが好ましい。
【００２９】
Ｃ末端逐次分解反応工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の組み合わせにおいて、アルカン酸無水物は、無水酢酸であることが好ましい。さらに、前記パーフルオロアルカン酸が、０．３〜２．５の範囲内の酸解離定数（ｐＫａ）を有し、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸であることが好ましい。
【００３０】
一方、反応試薬の除去工程で使用される反応試薬中に含まれる、含窒素芳香環化合物は、ピリジンまたはコリジンであることが好ましい。
【００３１】
また、後処理工程で使用される反応試薬中に含まれる、第３アミン化合物は、ジメチルアミノエタノールであることが好ましい。
【００３２】
特に、本発明の方法においては、前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルの測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析法により行われることが一般的である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の方法では、質量分析測定用のサンプルプレート上において、個々のペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解し、一連の反応産物を調製する工程を実施するので、該サンプルプレート上において、多数の検体を並列的に処理することが可能である。この多数の検体の並列的処理を利用することで、全体として、ハイスループットな解析が行える利点を具えている。加えて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析を適用する際、利用されるマトリクスの結晶化を阻害し、その結果、測定される質量スペクトルの質、例えば、Ｓ／Ｎ比の低下を引き起こす要因である、Ｃ末端逐次分解反応工程後に残留している反応試薬と、後処理工程で利用する試薬の間で形成される不揮発性塩の生成に対して、上記の「反応試薬の除去工程」を設けることで、効果的な回避が可能となっている。すなわち、測定される質量スペクトルの質、例えば、Ｓ／Ｎ比の低下を高い再現性で回避できる利点は、微量のペプチド・サンプルの解析を行う際にも、良好なＳ／Ｎ比の質量スペクトルの測定結果に基づき、高い確度でＣ末端アミノ酸配列を解析することを可能とする。
【００３４】
さらに、本発明の方法によれば、「反応試薬の除去工程」で利用する「脱塩操作」は、極めて簡便な操作で構成されており、また、その再現性も高いため、サンプルプレート上において、個々のペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解し、一連の反応産物を調製する工程の自動化・機械化を実施する際で、全体の工程の再現性を維持する上でも好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に、本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法について、より詳しく説明する。
【００３６】
まず、本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、例えば、各種の酵素タンパク質、各種の受容体タンパク質、各種のペプチド性のリガンド分子、例えば、各種の成長因子等、種々のタンパク質を構成するペプチド鎖のアミノ酸配列を解析する際に利用される。なお、タンパク質を構成するペプチド鎖は、多くの場合、一本のペプチド鎖であるが、例えば、イムノグロブリンや、種々の受容体タンパク質のように、複数のペプチド鎖で構成されている場合もある。
【００３７】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、タンパク質を構成するペプチド鎖を、それぞれ分離し、また、分離されたペプチド鎖内に存在するＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を解離させ、一本鎖状にされたペプチド鎖に対して適用される。なお、一本鎖状とされたペプチド鎖が、ｒｅ−ｆｏｌｄｉｎｇして、三次元構造を再構築しないような状態とすることが一般的である。例えば、ｒｅ−ｆｏｌｄｉｎｇの過程で、鎖内でＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を形成する場合には、このＣｙｓ−Ｃｙｓ結合の形成を阻害するため、ペプチド鎖中に含まれるＣｙｓ残基の側鎖に存在するスルファニル基（−ＳＨ）に対して、予めアルキル化処理を施す。
【００３８】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法を、一本のペプチド鎖で構成されるタンパク質のアミノ酸配列の解析に適用する場合を例にとり、その実施形態の一例を説明する。図１に、前記の形態における、本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法の全体工程の流れを模式的に表したフローシートを示す。
【００３９】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法では、例えば、解析対象のペプチド鎖が、Ｎ個のアミノ酸で構成されている際、そのＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、（Ｎ−１）個のアミノ酸残基からなる反応産物Ｐ1、（Ｎ−２）個のアミノ酸残基からなる反応産物Ｐ2、…、（Ｎ−ｉ）個のアミノ酸残基からなる反応産物Ｐi、…のような、一連の反応産物Ｐi（ｉ＝１，２，…）を作製する。原理的には、解析対象のペプチド鎖が、Ｎ個のアミノ酸で構成されている場合、元のペプチド鎖Ｐ0と、合計（Ｎ−１）種類の反応産物Ｐi（ｉ＝１，２，…，Ｎ−１）を作製して、その分子量Ｍ（Ｐ0）、Ｍ（Ｐi）：（ｉ＝１，２，…，Ｎ−１）を質量分析により測定すると、逐次的に分解されたｉ番目のアミノ酸残基の式量：ΔＭi＝Ｍ（Ｐi-1）−Ｍ（Ｐi）：（ｉ＝１，２，…，Ｎ−１）と、Ｎ末端のアミノ酸の分子量：ΔＭNに相当するＭ（ＰN-1）を決定できる。但し、現実的には、解析対象のペプチド鎖を構成するアミノ酸数Ｎが、例えば、１００程度になると、これらの一連の反応産物の全て分析可能な量で作製するには、用いるペプチド量は大量に必要となる。
【００４０】
利用できるペプチド量が限れているので、Ｎ個のアミノ酸で構成されているペプチド鎖を予め断片化し、１番目のアミノ酸からＮ1番目のアミノ酸までのフラグメント：Ｆ1（１→Ｎ1）、（Ｎ1＋１）番目のアミノ酸からＮ2番目のアミノ酸までのフラグメント：Ｆ2（（Ｎ1＋１）→Ｎ2）、…のような複数個のフラグメントを調製し、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）のアミノ酸配列の解析を行う手法が利用される。
【００４１】
図１に示す全体工程の流れを模式的に示すフローシートは、前記のＮ個のアミノ酸で構成されているペプチド鎖を予め断片化し、複数個のフラグメントを調製し、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）のアミノ酸配列の解析を行う手法に適合するものである。
【００４２】
従来の方法では、サンプルプレート上において、ペプチド鎖のＣ末端逐次分解反応を実施し、得られる一連の反応産物を含む混合物について、質量分析を行う際、その工程は、第１工程：フラクション工程、第２工程：前処理工程、第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程、第４工程：後処理工程、第５工程：質量分析工程、第６工程：スペクトル解析工程の６工程で構成されている。先ず、第１工程：フラクション工程において、Ｎ個のアミノ酸で構成されているペプチド鎖を予め断片化し、複数個のフラグメントを調製し、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）を分取している。その後、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）について、第２工程：前処理工程、第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程、第４工程：後処理工程を施し、ペプチド鎖のＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解した一連の反応産物を調製している。この第２工程：前処理工程では、各フラグメントのペプチド鎖のＮ末端アミノ基、ならびに、その鎖中に存在するＬｙｓ残基の側鎖上に存在するアミノ基に対して、Ｎ−アシル化を施している。次の第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程では、上述する反応式（Ｉ）で表記される脱水反応、ならびに、反応式（II）で表記される反応を介して、ペプチド鎖のＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解して、一連の反応産物を作製する。そして、第３の工程を終えた後、第４工程：後処理工程では、第３工程で作製される一連の反応産物のＣ末端は、オキサゾロン環構造、あるいは、その前駆体である酸無水物構造となっており、第３アミンの存在下、水分子を作用させ、加水分解を行って、そのＣ末端にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する反応産物としている。
【００４３】
第５工程：質量分析工程では、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）について、前記第２工程〜第４工程を実施することで調製される、そのＣ末端にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する、一連の反応産物と、元のフラグメントを含む混合物を質量分析して、これらのペプチド鎖に由来するイオン種の分子量（ｍ／ｚ）を測定する。次いで、第６工程：スペクトル解析工程では、質量スペクトル上に見出される、一連の反応産物と、元のフラグメントに由来するイオン種の分子量（ｍ／ｚ）の測定結果に基づき、フラグメントＦiのＣ末端（Ｎi番目のアミノ酸）から逐次的に分解されたｊ番目のアミノ酸残基（Ｎi-j+1番目のアミノ酸残基）の式量：ΔＭ（Ｎi-j+1）を算定し、そのアミノ酸の種類を特定する。すなわち、各フラグメントＦiについて、そのＣ末端アミノ酸配列を特定する。
【００４４】
上記の第１工程、第２工程、第３工程、第４工程、第５工程および第６工程を具えた解析方法は、本願出願人により先に特許出願され、既に、特開２００６−１８９２７７号公報として公開されている。この特開２００６−１８９２７７号公報に開示される内容は、参照により本願明細書中に組み込まれるものとする。
【００４５】
一方、本発明の方法では、図１に示すように、第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程を終えた後、Ｃ末端逐次分解反応で使用される反応試薬を除去する工程（反応試薬の除去工程）を設け、第４工程：後処理工程に移行している。この反応試薬の除去工程において、Ｃ末端逐次分解反応で使用される反応試薬の除去がなされている結果、Ｃ末端逐次分解反応で使用される反応試薬と、後処理工程で使用される試薬とが反応し、不揮発性の塩を形成する現象の回避がなされている。この反応試薬の除去工程では、サンプルプレート上に残余しているＣ末端逐次分解反応で使用される反応試薬：アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸に対して、塩基性含窒素芳香環化合物の存在下、水分子を作用させる。その結果、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物、あるいはパーフルオロアルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物からなる「揮発性塩」を一旦生成させ、その後、「揮発性塩」を揮発させ、除去する「脱塩工程」としている。
【００４６】
従って、この反応試薬の除去工程（「脱塩工程」）を設ける結果、アルカン酸と第３アミン化合物、あるいは、パーフルオロアルカン酸と第３アミン化合物からなる「不揮発性の塩」の生成が回避される。それに伴って、第５工程の質量分析工程において測定される、一連の反応産物の質量スペクトルは、「不揮発性の塩」の残留、混入に起因するＳ／Ｎ比の低下等が見出されず、再現性、測定確度の高いものとなる。
【００４７】
本発明の方法は、図１に示すように、全体として、７つの工程で構成するプロセスとすることが好ましい。
【００４８】
第１工程：フラクション工程では、解析対象となるタンパク質を、予めプロテアーゼなどで特定のアミノ酸の位置で限定分解して、複数のペプチド断片を調製する。続いて、液体クロマトグラフィーにより、各ペプチド断片を含む、複数のフラクション（画分）を分取得する。得られた各ペプチド断片を含むフラクション（画分）は、その一部を用いて、質量分析測定用のサンプルプレート上に滴下・乾燥する。
【００４９】
第２工程：前処理工程では、サンプルプレート上にて、化学的手段によりＮ−アシル化、Ｏ−アシル化を行い、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応による副反応の抑制処理を施す。第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程では、化学的手段により、ペプチド断片のＣ末端のアミノ酸を逐次的に分解除去して、ペプチド鎖がＣ末端側から短縮された一連の反応産物を調製する。
【００５０】
次に、本発明の方法において、特徴的な工程、「脱塩工程」：反応試薬の除去工程を実施する。この「脱塩工程」では、「揮発性の塩」形成、その後、減圧もしくは不活性ガスの送気による反応系からの該「揮発性塩」の除去を行う。第４工程：後処理工程では、「脱塩工程」後、該サンプルプレート上の一連の反応産物に対して、化学的手段により加水分解反応を行い、Ｏ−アシル化保護の加水分解（脱保護）、Ｃ末端のオキサゾロン環の加水分解を実施する。
【００５１】
第５工程：質量分析工程では、サンプルプレート上に、マトリクスを塗布して、一連の反応産物とともに結晶を形成させ、該一連の反応産物の質量分析を実施する。この際、このＣ末端アミノ酸の逐次的分解がなされた一連の反応産物を含む試料と、液体クロマトグラフィーによって分取された未反応のペプチド断片との両方を、質量分析法により分子量を測定する。第６工程：スペクトル解析工程では、得られる質量スペクトルから、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を算出し、算出された一連の分子量減少量に基づき、逐次的に分解された一連のアミノ酸を特定する。すなわち、対象のペプチド断片のＣ末端アミノ酸配列情報を得る。さらに、未反応のペプチド断片の質量分析の際、内部標準ペプチドを混ぜて質量分析を行うことにより、精密測定することが好ましい。未反応のペプチド断片の分子量を基準として、一連の反応産物の質量スペクトルのうち、どのピークに基づき、Ｃ末端のアミノ酸配列の解析を進めるべきかの判定を行う。
【００５２】
以下、順に、以上の各工程について、その実施の形態を説明する。特に、本発明の方法において、特徴的な「脱塩工程」を設けることの技術的な意義、ならびに、「脱塩工程」において、「揮発性塩」を除去する際に利用されるメカニズムを詳細に説明する。
【００５３】
第１工程：フラクション工程
［ペプチド鎖の限定分解と、ペプチド断片の液体クロマトグラフィーによる分取］
本発明が対象とするペプチド鎖は、主に、酵素タンパク質、各種の受容体タンパク質、各種のペプチド性のリガンド分子などを構成するペプチド鎖であるが、特に、これらに限定されるものではない。また、少なくとも、α−アミノ酸残基が通常のペプチド結合で連結されている、一本鎖状のペプチド鎖となるものである限り、その起源に関しても、なんら制限はない。通常、ペプチド鎖を構成するアミノ酸は、天然に存在する２０種類のα−アミノ酸であるが、本発明が対象とするペプチド鎖は、上記の一般式（III）で示される５−オキサゾロン構造の形成が可能である限り、天然のα−アミノ酸の光学異性体や、その他の非天然型α−アミノ酸も含んでいてもよい。また、環状ペプチドである際、その環を開裂することで、一本鎖状のペプチド鎖とすることで、本発明の方法を適用することができる。
【００５４】
なお、対象とするペプチド鎖が、例えば、隣接するペプチド鎖のシステインとの間で、酸化型の−Ｓ−Ｓ−結合を形成する、あるいは、同一分子内で−Ｓ−Ｓ−結合を形成しているシステインを含む場合には、予め常用の還元処理を施し、かかる架橋を解消し、還元型のシステインを含むペプチド鎖に変換する。また、ペプチド鎖中に存在する還元型のシステインに対しては、その側鎖のスルファニル基（−ＳＨ）にカルボキシメチル化やピリジルエチル化などを施し、予めその保護を行う。
【００５５】
本発明の方法においては、ペプチド鎖を構成する第ｉ番目のアミノ酸残基の種類を、該第ｉ番目のアミノ酸残基の式量：ΔＭ（Ｎi）に基づき特定する。その際、例えば、ＡｓｐとＡｓｎ、ならびに、ＧｌｕとＧｌｎの分子量差は、１であるので、質量分析によって測定されるペプチド鎖に由来するイオン種の分子量：ｍ／ｚは、少なくとも、その分子量ｍ／ｚの測定精度は、１より高いことが必要である。その測定精度を達成する上では、質量分析を行う際、実際に測定されるペプチド鎖に由来するイオン種の分子量：ｍ／ｚは、少なくとも、ｍ／ｚ≦５０００の範囲、より好ましくは、ｍ／ｚ≦４０００の範囲とすることが望ましい。すなわち、実際に測定されるペプチド鎖の鎖長は、５０アミノ酸残基以下、より好ましくは、４０アミノ酸残基以下とすることが望ましい。
【００５６】
一方、解析対象となるタンパク質を構成するペプチド鎖の鎖長は、多くの場合、５０アミノ酸残基を超えているため、そのペプチド鎖を予め切断して、複数個のペプチド断片とした上で、個々のペプチド断片について、そのＣ末端アミノ酸配列の特定を行う。
【００５７】
先ず、解析対象とする一本鎖状のペプチド鎖を断片化して、個々の断片の鎖長が前記の範囲となる、複数のペプチド断片を調製する。このペプチド鎖の断片化処理では、例えば、特定のアミノ酸残基を認識して切断するプロテアーゼなどを利用して、ペプチド鎖を限定分解して、複数のペプチド断片を調製することが好ましい。ペプチド鎖の限定分解に利用されるプロテアーゼとしては、その切断部位が、アミノ酸残基特異的であれば、特に限定されない。なお、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基側で切断するプロテアーゼを利用すると、ペプチド鎖の断片化処理を行った際、調製される複数のペプチド断片は、Ｃ末端側の断片を除き、残るペプチド断片のＣ末端には、特定のアミノ酸残基が存在する。その場合、各ペプチド断片のＣ末端アミノ酸配列を特定した際、該ペプチド断片のＣ末端には、特定のアミノ酸残基が存在しないものは、唯一つＣ末端側の断片のみとなるはずである。換言すると、この特徴を利用すると、一本鎖状のペプチド鎖を断片化して調製される、複数のペプチド断片のなかから、Ｃ末端側の断片を特定することが可能である。前記の利点を考慮すると、一本鎖状のペプチド鎖を断片化する際、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基側で切断するプロテアーゼは、好適に利用できる。
【００５８】
例えば、ペプチド鎖中のＬｙｓやＡｒｇのカルボキシル基側で切断するトリプシンや、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐといった大きな疎水性の側鎖に特異的なキモトリプシン等の動物由来の消化酵素、さらには、種々の微生物由来のプロテアーゼを使用することができる。微生物由来のプロテアーゼとしては、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８株から調製されるプロテアーゼＶ８は、Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基側でペプチド結合を特異的に切断する。マイタケより抽出されるメタルプロテアーゼは、ＬｙｓおよびＡｒｇの一部を認識し、そのアミノ基側のペプチド結合を特異的に切断する。これらのその切断部位が、アミノ酸残基特異的であるプロテアーゼは、第１工程における、ペプチド鎖の断片化処理に利用することができる。
【００５９】
なお、理想的には、上記のプロテアーゼを利用する、ペプチド鎖の断片化処理を施すことで、元のペプチド鎖から、各ペプチド断片は、等量的に生成される。すなわち、理想的には、生成される各ペプチド断片のモル量は、元のペプチド鎖のモル量と等しくなっている。この各ペプチド断片を含む混合液中には、断片化処理に使用したプロテアーゼ、ならびに、該プロテアーゼ・タンパク質の自己消化によって生成されるペプチドが混入している。その際、該プロテアーゼ・タンパク質の自己消化によって生成されるペプチドは、予め判明しているので、次段のペプチド断片の分取操作を行う際、目的とする各ペプチド断片との区別は容易に行える。
【００６０】
続いて、ペプチド鎖の断片化処理により調製される、複数個のペプチド断片を分取する。ペプチド断片の分取は、通常、液体クロマトグラフィーにより、各ペプチド断片を分離し、個々のペプチド断片を含む画分を分取する。ペプチド断片の分取に利用される「液体クロマトグラフィー」は、液体を移動相とするクロマトグラフィーによる分離手法であり、一般に、固定相カラムを選択することによって、加圧下で操作が可能な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が利用される。一般に、ペプチド断片の分離機構は、分配、吸着、イオン交換、サイズ排除等の種々の機構に分類される。この第１工程において、好適に使用されるカラムは、逆相固定相で分配によって分離され、ペプチド断片試料はより極性の低い固定相に保持され、極性を持つ移動相によって、個々のペプチド断片のカラムに対する親和性の差違に基づき、分離して溶出可能なものである。例えば、ＯＤＳ（オクタデシルシリル基）を備えるケイ素化合物を分離用担体とする分離カラムを用いることができる。
【００６１】
近年、タンパク質を対象とする質量分析法、例えば、エレクトロスプレーイオン化やＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳなどの分析システムでは、試料中に含まれる、複数種のタンパク質を「液体クロマトグラフィー」で分離し、その分離されたタンパク質を引き続き、質量分析することが可能な装置構成を具えるものが多い。その用途に適合する質量分析装置に、多くの試料を適切な状態で供給するため、すなわち、ハイスループット分析に適したクロマトグラフィー及び分取システムが開発されている。特に、少量の試料液を対象として、流速が１０００μｌ／分以下のマイクロ液体クロマトグラフィー（マイクロＬＣ）や、流速が１０００ｎｌ／分以下のナノ液体クロマトグラフィー（ナノＬＣ）が既に実用化されており、本発明における第１工程における、ペプチド断片の分取に適用することができる。特に、ナノＬＣは、微量サンプルでかつ微少量の点状塗布（スポッティング）が可能であり、本発明の方法において、分取されたペプチド断片を含む溶液複数種を、同一のサンプルプレート上に並列的にスポットする形態を採用する際、個々のスポットに適切な試料量を提供する手段として利用できる。
【００６２】
第２工程：前処理工程
［サンプルプレート上における、各ペプチド断片に対するＮ−アシル化、Ｏ−アシル化保護］
上記第１工程で分取される各ペプチド断片を含む画分の溶液を、質量分析測定用のサンプルプレート上に滴下乾燥し、各ペプチド断片の乾燥試料とする。この「質量分析測定用のサンプルプレート」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法による質量分析を行うために、測定対象のペプチドを含む試料をスポッティングし、乾燥した後、マトリクス材料を含む液を滴下し、結晶化したマトリクス中にペプチドが混合したサンプルを調製するプレートである。本発明では、ペプチド断片の乾燥試料に対して、このサンプルプレート上において、前処理工程、Ｃ末端逐次分解反応工程、反応試薬の除去工程（脱塩工程）、後処理工程を実施するため、サンプルプレート表面は、これらの各工程で使用される試薬に対して耐性を有する素材で構成する。例えば、その表面に、白金や金メッキによる保護が施されたサンプルプレートを用いることが好ましい。
【００６３】
本発明においては、上記第１工程で分取される各ペプチド断片を、同じサンプルプレートの表面に、並列的にスポットした上で、同時にＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応を行い、各スポット点で生成される反応産物について、質量分析を行う形態を採用することが好ましい。すなわち、解析対象のペプチド鎖を断片化することで調製される、複数のペプチド断片に関して、そのＣ末端アミノ酸配列を、同じサンプルプレート上において、並列的に解析する形態を採用することが好ましい。
【００６４】
各ペプチド断片は、反応性の官能基として、ペプチド鎖のＮ末端にアミノ基（−ＮＨ2）に加えて、Ｌｙｓ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）−ＣＯ−）の側鎖のアミノ基、また、Ｓｅｒ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−ＣＯ−）、Ｔｈｒ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨ）−ＣＯ−）の側鎖のヒドロキシル基（−ＯＨ）、Ｔｙｒ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＯＨ）−ＣＯ−）のフェノール性ヒドロキシル基（−ＯＨ）を有する場合がある。第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程を行う際、これらの反応性官能基に対して、不要な副次反応が進行することを回避するため、予め、アミノ基に対しては、Ｎ−アシル化保護、ヒドロキシル基に対しては、Ｏ−アシル化保護を施す。
【００６５】
このＮ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施す前処理工程では、
サンプルプレート上にスプットされている、ペプチド断片の乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度において、
アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸とを作用させ、
該ペプチド断片のＮ末端のアミノ基、ならびにＬｙｓ残基側鎖のアミノ基に対して、Ｎ−アシル化を行う方法を採用することができる。その際、第２工程において、Ｎ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施す前処理工程で利用するアルカン酸無水物と、その後、第３工程で実施するＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応で利用するアルカン酸無水物とは、同じアルカン酸無水物を用いることが好ましい。具体的には、Ｎ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施す前処理反応では、アルカン酸無水物とアルカン酸とを蒸気として、ペプチド鎖の乾燥試料に供給して、アシル化反応を進めるため、適正な蒸気圧を得る上では、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解工程で利用するアルカン酸無水物と、同じアルカン酸無水物を好適に利用できる。加えて、このアルカン酸無水物は、乾燥雰囲気下、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度では、ペプチドの切断等の不要な副次反応を引き起こすには、その反応性は十分に低く、前処理工程においては、共存させるアルカン酸は、パーフルオロアルカン酸と比較して、その酸触媒作用は格段に劣るため、不要な副次反応を引き起こすことなく、Ｎ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施すことが可能となる。
【００６６】
なお、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基をＮ−アシル化保護する際には、ペプチド鎖中に存在するＬｙｓ残基側鎖のアミノ基に対しても、Ｎ−アシル化保護が同時に進行する。さらには、ペプチド鎖中に存在するＳｅｒ残基ならびにＴｈｒ残基側鎖のヒドロキシル基においても、Ｏ−アシル化反応が進み、その保護がなされる。その他、ペプチド鎖中に存在するＴｙｒ残基側鎖のフェノール性ヒドロキシル基も、その反応性は相違するものの、部分的にＯ−アシル化がなされる。
【００６７】
なお、この前処理工程で使用する、アルカン酸無水物とアルカン酸との組み合わせは、不要な副次反応、例えば、ペプチド鎖の途中での切断を生じる懸念はほとんどないものであるが、その反応温度は、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度、より好ましくは、かかる反応温度は、室温付近、あるいは、室温より僅かに高い範囲内に選択することが好ましい。すなわち、前処理工程の反応温度は、１５℃〜５０℃の範囲に選択することが好ましい。また、前記アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物中における、アルカン酸の添加比率は、アルカン酸無水物とアルカン酸との合計した体積に対して、２〜１０体積％の範囲、具体的には、５体積％に選択することが好ましい。
【００６８】
また、アルカン酸無水物と、アルカン酸との組み合わせは、アルカン酸無水物として、該アルカン酸に由来する酸無水物を用いることが好ましい。すなわち、アルカン酸無水物：（ＲＣＯ）2Ｏとアルカン酸：Ｒ’ＣＯＯＨとの間では、下記のような不均化反応が起こる。
【００６９】
（ＲＣＯ）2Ｏ＋Ｒ’ＣＯＯＨ → ＲＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ’＋ＲＣＯＯＨ
上記Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応で導入されるアシル基は、アルカン酸無水物に由来するアシル基である。その際、前記の不均化反応で生成する、非対称なＲＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ’が関与すると、アルカン酸に由来するアシル基が導入される。アルカン酸無水物として、該アルカン酸に由来する酸無水物を用いる際には、不均化反応で生成するアルカン酸無水物は、当然、元の対称なアルカン酸無水物と同じとなるので、導入されるアシル基は一種類となる。Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応で導入されるアシル基が二種類となると、質量分析を行った際、その導入されるアシル基の違いに起因して、二つのイオン種が観測される。本発明においては、一連の反応産物に由来するイオン種として、単一のピークであることが好ましいので、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応で導入されるアシル基が一種類となる反応条件を選択することが好ましい。すなわち、アルカン酸無水物と、アルカン酸との組み合わせは、アルカン酸無水物として、該アルカン酸に由来する酸無水物を用いることが好ましい。
【００７０】
さらに、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応に伴って、下記のように、アルカン酸無水物に由来するアルカン酸が生成する。
【００７１】
（ＲＣＯ）2Ｏ＋（−ＮＨ2） → ＲＣＯＯＨ＋（−ＮＨ−ＯＣＲ）
従って、ペプチド断片の近傍に存在するアルカン酸の総量（存在確率）が増加する。この酸触媒として機能するアルカン酸の局所的な濃度が極端に増加すると、不要な副次反応、例えば、アミノ基上に、二つのアシル基が導入される現象を引き起こす可能性がある。気相から、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸を供給する形態を選択すると、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応に伴って生成するアルカン酸は、気相中におけるアルカン酸分子の分圧と平衡するように、蒸散する。そのため、アルカン酸の局所的な濃度が極端に増加する現象は抑制される。
【００７２】
例えば、液滴状のアルカン酸無水物とアルカン酸を供給する形態を採用する際には、生成するアルカン酸が速やかに蒸散することが可能な状況を維持することが好ましい。例えば、系内に、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物を配置し、気相中のアルカン酸分子の分圧を制御することで、この液滴中に含まれるアルカン酸の濃度をその分圧と平衡させることが好ましい。
【００７３】
前処理工程において、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸を供給する形態を選択する際には、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、ペプチド断片の乾燥試料に蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。すなわち、この低い温度において、気相中に存在するアルカン酸無水物とアルカン酸と平衡させた後、ペプチド断片の乾燥試料の温度を目的とする反応温度まで上昇させる。この低い温度に保持する間に、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸は、ペプチド断片の乾燥試料に吸着されるが、その際、例えば、Ａｒｇ残基の側鎖上には、下記のような形態でアルカン酸が吸着される。
【００７４】
【化４】
【００７５】
また、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、Ｌｙｓ残基の側鎖上のアミノ基上では、下記のような形態でアルカン酸が吸着される。
【００７６】
【化５】
【００７７】
例えば、Ａｒｇ残基の側鎖のウリジル基と、他のペプチド鎖上のＡｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖上のカルボキシル基の間で、塩結合が形成する現象を回避することができる。
【００７８】
また、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖上のカルボキシル基と、アルカン酸無水物：（ＲＣＯ）2Ｏとの間で、不均化反応が生じて、非対象な酸無水物構造：−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲが形成され、稀に、他のペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、Ｌｙｓ残基の側鎖上のアミノ基と反応を起こす現象を回避することはできる。
【００７９】
この前処理工程の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる液状混合物の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【００８０】
一方、前処理工程を終了する時点では、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【００８１】
供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げると、気相中に存在するアルカン酸無水物とアルカン酸の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、アルカン酸無水物とアルカン酸は、気相中に存在するアルカン酸無水物とアルカン酸の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【００８２】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【００８３】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【００８４】
第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程
［サンプルプレート上における、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護済、各ペプチド断片のＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応］
サンプルプレート上で、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護を施したペプチド断片のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して、一連の反応産物を含む混合物を調製する。
【００８５】
その際に利用される、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解方法は、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護を施したペプチド断片の乾燥試料に対して、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用し、穏和な条件でＣ末端アミノ酸の分解を行う方法である。その反応方法は、例えば、本願出願人により先に特許出願され、既に登録されている、特許第３５３４１９１号公報に開示されている。この特許第３５３４１９１号公報に開示される内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【００８６】
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解除去する工程においては、
対象とするペプチド鎖の乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、１５℃〜８０℃の範囲に選択される温度において、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸とを作用させる。パーフルオロアルカン酸を触媒として、アルカン酸無水物が作用することで、下記の二段階の反応が進行する。
【００８７】
まず、パーフルオロアルカン酸の存在下、アルカン酸無水物がペプチド鎖のＣ末端に作用することで、反応式（Ｉ）で表記される脱水反応：
【００８８】
【化６】
【００８９】
により、Ｃ末端アミノ酸から反応中間体として、５−オキサゾロン環構造が形成される。次いで、更に、アルカン酸無水物がこの５−オキサゾロン環に作用し、反応式（II）で表記される反応：
【００９０】
【化７】
【００９１】
が進行し、結果的に、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成される。その後、Ｃ末端に生成している酸無水物構造を利用して、５−オキサゾロン環構造が形成される。
【００９２】
その際、パーフルオロアルカン酸をプロトン供与体として機能させることで、下記する反応式（Ｉａ）：
【００９３】
【化８】
【００９４】
で示されるケト−エノール互換異性化の過程でエノール型をとる比率を高めている。
【００９５】
一方、アルカン酸無水物は、Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を非対称型酸無水物構造へと変換し、活性化を行う。さらに、エノール型において、表出されているヒドロキシル基（−ＯＨ）と、Ｃ末端の非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）とが反応する結果、分子内エステル結合が形成され、５−オキサゾロン環が完成される。パーフルオロアルカン酸が示す高いプロトン供与能を利用することで、ケト−エノール互換異性化を促進する結果、かかる反応は、穏和な温度条件で進行でき、反応温度を１５℃〜６０℃の範囲に選択することが可能となっている。なお、かかる反応温度は、室温付近、あるいは、室温より僅かに高い範囲内に選択することが好ましく、より具体的には、１５℃〜５０℃の範囲に選択することがより好ましい。
【００９６】
一方、本発明にかかるＣ末端アミノ酸の選択的な分解方法において、利用されるパーフルオロアルカン酸は、そのプロトン供与能を利用するものであり、該パーフルオロアルカン酸の示すｐＫａは、０．３〜２．５の範囲であるパーフルオロアルカン酸を用いることが好ましい。
【００９７】
加えて、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を、乾燥ペプチド試料へ供給する形態を採用する場合、１５℃〜８０℃の範囲に選択する前記温度において、所望の蒸気圧を得られる揮発性に優れたパーフルオロアルカン酸であることが望ましい。その観点からも、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸は、より適するものであり、さらには、直鎖状の炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸が、より適するものであり、具体的には、トリフルオロ酢酸（ＣＦ3ＣＯＯＨ）、ペンタフルオロプロパン酸（ＣＦ3ＣＦ2ＣＯＯＨ）、ヘプタフルオロブタン酸（ＣＦ3ＣＦ2ＣＦ2ＣＯＯＨ）を利用することがより望ましい。
【００９８】
利用されるアルカン酸無水物は、反応温度まで昇温した際、適正な蒸気圧を生じる限り、種々のものが利用可能である。一方、反応温度を前記する好適な範囲、例えば、１５℃〜５０℃の範囲に選択する際に、十分な蒸気圧を与えるものが好ましく、従って、炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることが好ましい。なかでも、前記対称型酸無水物として、炭素数２〜４の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることがより好ましく、特には、炭素数２の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、すなわち、無水酢酸が好適に利用できる。かかるアルカン酸無水物は、Ｃ末端カルボキシル基の活性化、５−オキサゾロン環構造の開裂に利用されるため、その際、立体障害を生じることの少ないものが好ましく、その点でも、無水酢酸などがより好適である。
【００９９】
また、アルカン酸無水物は、反応の進行に従って、消費されるため、気相から蒸気状アルカン酸無水物として供給することで、消費されたアルカン酸無水物を補いつつ反応を行うことが望ましい。一方、分子内エステル結合が形成され、５−オキサゾロン環が生成される反応においては、アルカン酸無水物に由来するアルカン酸は副生される。その際、気相中には、元々、アルカン酸分子は存在していないため、副生されるアルカン酸は揮発して、気相へ移行する。系内に、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の供給源として、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加した液状混合物を置くと、気相中のアルカン酸は、この液状混合物中に溶解する。その結果、気相中に存在するアルカン酸分子の分圧は低く抑えられるため、副生されるアルカン酸の揮発は継続する。
【０１００】
蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の供給源には、利用するアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の種類によって、例えば、反応温度における、その飽和蒸気圧に応じて、目的とする気相中の分圧比（気相濃度比）を達成できる混合比率の液状混合物を適宜利用する。例えば、前記アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物中における、パーフルオロアルカン酸の含有比率は、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸との合計体積に対して、１〜２０体積％の範囲、より好ましくは、３〜１０体積％の範囲に選択することが望ましい。
【０１０１】
Ｃ末端逐次分解反応工程において、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を供給する形態を選択する際には、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる液状混合物の温度に対して、当初、Ｎ−アシル化保護済ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、Ｎ−アシル化保護済ペプチド断片の乾燥試料に蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。
【０１０２】
このＣ末端逐次分解反応工程の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【０１０３】
一方、Ｃ末端逐次分解反応工程を終了する時点では、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【０１０４】
供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げると、気相中に存在するアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸は、気相中に存在するアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【０１０５】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【０１０６】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【０１０７】
一方、液滴状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を供給する形態を採用する際には、反応の進行に伴って生成するアルカン酸が速やかに蒸散することが可能な状況を維持することが好ましい。例えば、系内に、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる液状混合物を配置し、気相中のアルカン酸分子をこの液状混合物中に溶解させる。また、気相中のアルカン酸無水物、パーフルオロアルカン酸の分圧を制御することで、この液滴中に含まれるアルカン酸無水物、パーフルオロアルカン酸の濃度をその分圧と平衡させることが好ましい。
【０１０８】
「脱塩工程」：反応試薬の除去工程
［サンプルプレート上における、アルカン酸無水物の加水分解と、生成するアルカン酸の「揮発性塩」への変換、「揮発性塩」の揮発除去］
前記のＣ末端逐次分解反応工程を行うことで、サンプルプレート上のスポット点には、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護を施したペプチド断片のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料が生成されている。この一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料には、未反応の反応試薬、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸、ならびに、副生物のアルカン酸は吸着して、残留している。
【０１０９】
一方、一連の反応産物は、そのペプチド鎖のＣ末端は、５−オキサゾロン環構造のものと、Ｃ末端の非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に留まっているものとが混在した状態となっている。さらには、逐次的に分解されたアミノ酸も、含まれている。なお、逐次的に分解されたアミノ酸のカルボキシル基に対しても、アルカン酸無水物による活性化がなされ、相当部分は、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されている。加えて、一連の反応産物のペプチド鎖中に存在する、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基に対しても、アルカン酸無水物による活性化がなされ、相当部分は、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されている。
【０１１０】
「脱塩工程」では、まず、サンプルプレート上において、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料に対して、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を接触させて、塩基性含窒素芳香環化合物を触媒として利用し、残留する未反応のアルカン酸無水物を加水分解する。加水分解により生成するアルカン酸は、傍に存在している塩基性含窒素芳香環化合物と、塩を形成する。このアルカン酸と、塩基性含窒素芳香環化合物との塩は、例えば、下記に示すような、該塩基性含窒素芳香環化合物の環上に存在する窒素原子に、アルカン酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が配向した形状である。
【０１１１】
【化９】
【０１１２】
一連の反応産物中、Ｃ末端の非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に留まるものも、同様に、加水分解を受ける。また、一連の反応産物のペプチド鎖中に存在する、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基のうち、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されているものも、同様に加水分解を受ける。さらに、逐次的に分解されたアミノ酸のカルボキシル基のうち、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されているものも、同様に加水分解を受ける。その際、生成するアルカン酸と、塩基性含窒素芳香環化合物とは塩を形成する。
【０１１３】
一方、加水分解で再生される、一連の反応産物のペプチド鎖のＣ末端のカルボキシル基、ペプチド鎖中に存在する、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基も、塩基性含窒素芳香環化合物との塩構造を形成する。また、逐次的に分解されたアミノ酸も、そのカルボキシル基は、塩基性含窒素芳香環化合物との塩構造を形成する。その塩構造は、例えば、下記に示すような構造となっている。
【０１１４】
【化１０】
【０１１５】
塩基性含窒素芳香環化合物は、弱い塩基であり、また、アルカン酸も弱い酸であるので、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される塩は、「揮発性塩」となっている。例えば、ピリジン・酢酸塩：Ｃ5Ｈ5Ｎ：ＨＯＯＣＣＨ3は、気相中のピリジン分子（Ｃ5Ｈ5Ｎ）と酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）と解離平衡にある。従って、気相中の酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）の分圧が低下すると、ピリジン・酢酸塩：Ｃ5Ｈ5Ｎ：ＨＯＯＣＣＨ3は、解離し、酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）を気相中に放出する。
【０１１６】
系内に、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子の供給源として、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液を存在させると、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」から気相へと放出されるアルカン酸分子は、この塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液に吸収される。従って、気相中のアルカン酸分子の分圧は低い状態に保たれるため、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」の解離は継続される。最終的には、サンプルプレート上において、一旦、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」が形成されるが、その後、この解離過程によって、アルカン酸のほぼ全ては、気相へと放出され、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液中に吸収される。
【０１１７】
また、Ｎ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される塩も、同様に、「揮発性塩」となっている。アルカン酸と比較すると、平衡蒸気圧は大幅に低いが、同様の機構を介して、微量なＮ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨ−Ｃ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）も、気相へと放出され、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液中に吸収される。一方、そもそも、この「脱塩工程」の温度では、気化することが不可能である、一連の反応産物は、そのカルボキシル基は、塩基性含窒素芳香環化合物との塩を形成した状態に留まっている。
【０１１８】
従って、この「脱塩工程」を終了した時点では、サンプルプレート上には、アルカン酸無水物、パーフルオロアルカン酸、アルカン酸は実質的に吸着していない状態となっている。
【０１１９】
「脱塩工程」の温度は、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を作用させることで、アルカン酸無水物の加水分解、ならびに、Ｎ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）のカルボキシル基のうち、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されているものの加水分解は速やかに進行するが、５−オキサゾロン環構造中の環内のエステル構造の加水分解は僅かしか進行しない条件を選択する。その温度は、高くとも、８０℃以下、例えば、５０℃〜７０℃の範囲に選択することが好ましい。
【０１２０】
利用される塩基性含窒素芳香環化合物としては、高い濃度の水溶液を調製可能なものが好ましく、また、室温において、液体であるものが好ましい。従って、単環の含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジン（沸点１１５〜１１６℃）、γ−コリジン（２，４，６−トリメチルピリジン：沸点：１７０．５℃、６５℃（３１ｍｍＨｇ））を利用することが好ましい。
【０１２１】
「脱塩工程」において、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を供給する形態を選択する際には、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度に対して、当初、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、乾燥試料に蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。
【０１２２】
この「脱塩工程」の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【０１２３】
一方、「脱塩工程」を終了する時点では、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【０１２４】
供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度を下げると、気相中に存在する塩基性含窒素芳香環化合物と水分子の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、塩基性含窒素芳香環化合物と水分子は、気相中に存在する塩基性含窒素芳香環化合物と水分子の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【０１２５】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【０１２６】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【０１２７】
加えて、一旦、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」を形成した後、サンプルプレート上には、加熱しつつ、減圧処理、あるいは、不活性ガスの送気操作を施すことで、熱的に解離し、気相へ放出されるアルカン酸分子を系外に排出することで、「揮発性塩」の「揮発」を促進することができる。この減圧処理、あるいは、不活性ガスの送気操作を施すと、「揮発性塩」を構成しているアルカン酸分子の除去、ならびに、塩基性含窒素芳香環化合物の除去が同時に行える。
【０１２８】
例えば、ピリジン・酢酸塩は、弱塩基と弱酸との塩の形態であるが、ピチジウムカチオン：Ｃ5Ｈ5ＮＨ+と、酢酸アニオン：ＣＨ3ＣＯＯ-とに電荷分離した状態ではなく、ピリジンの窒素原子に対して、酢酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が、水素結合型の分子間結合を形成している形態（複合体）に近い。例えば、ピリジン・塩酸塩：Ｃ5Ｈ5Ｎ・ＨＣｌは、この塩結合を維持して、蒸散することが可能であるが、ピリジン・酢酸塩の「揮発」は、前記の複合体を解消して、それぞれの分子が蒸散する形態であると推定される。気相中の酢酸分子の分圧が極めて低く、ピリジンの分圧が相対的に高い状況下では、ピリジン・酢酸塩が「解離」した際、酢酸分子が先ず蒸散し、その後、ピリジン分子が脱着する結果、見かけ上、ピリジン・酢酸塩の「揮発」がなされる。
【０１２９】
第４工程：後処理工程
［サンプルプレート上における、一連の反応産物のＣ末端の５−オキサゾロン環の加水分解］
上記の「脱塩工程」を施すことで、アルカン酸無水物、アルカン酸、パーフルオロアルカン酸が実質的に存在しない状態とした上で、一連の反応産物のＣ末端の５−オキサゾロン環の加水分解を行う。この５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解を行う際、ペプチド鎖中に存在するＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基の側鎖に存在するヒドロキシル基に施されているＯ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解もなされる。また、ペプチド鎖中に存在するＴｙｒ残基の側鎖に存在するフェノール性ヒドロキシル基に施されているＯ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解もなされる。
【０１３０】
５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解、ならびに、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換を行うため、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を作用させる。すなわち、塩基性含窒素芳香環化合物と比較し、塩基性が格段に高い、第３アミン化合物を利用することで、５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解を速やかに進め、さらに、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換をも達成できる。
【０１３１】
なお、塩基性含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジンを利用し、１００℃程度の高い温度で処理すると、５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解はある程度進行するが、その後、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換は、効率的には進行しない。一方、ペプチド鎖中に存在するＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基の側鎖に存在するヒドロキシル基に施されているＯ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解は、塩基性含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジンを利用し、１００℃程度の高い温度で処理すると、相当の程度進行する。
【０１３２】
本発明の方法では、「脱塩工程」において、一連の反応産物のモル量と比較して、相対的には、多量に残余しているアルカン酸無水物、ならびに、一連の反応産物のペプチド鎖上に形成されている非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）を予め加水分解し、生成するアルカン酸を、塩基性含窒素芳香環化合物との「揮発性塩」として、除去している。その後、後処理工程において、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を作用させ、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解、ならびに、５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解、および、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換を行う。その結果、一連の反応産物のペプチド鎖は、そのＣ末端は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）であり、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）も除去されたものとなっている。換言すると、一連の反応産物において、そのＣ末端は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）であり、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）も除去された主成分以外に、副次的な成分、例えば、そのＣ末端に５−オキサゾロン環構造を残しているもの、あるいは、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）が部分的に残っているものなどが存在する比率の低減がなされている。
【０１３３】
なお、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）を加水分解する際、アルカン酸が副生するが、その生成量は、一連の反応産物のモル量に比例するものとなっている。また、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解に伴う、副生成物のＮ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）も、その相当量が残っているが、Ｎ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）の量も、本質的に一連の反応産物のモル量に比例するものとなっている。
【０１３４】
後処理工程では、使用される第３アミン化合物と、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解により副生するアルカン酸とは、「不揮発性の塩」を形成する。また、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解に伴う、副生成物のＮ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）も、第３アミン化合物と、「不揮発性の塩」を形成する。しかし、これらの「不揮発性の塩」の総量は、一連の反応産物のモル量に比例したものとなっている。これら「内因性」の起源を有する「不揮発性の塩」は、その量は、一連の反応産物のモル量に比例するため、その絶対量は僅かである。
【０１３５】
それに対して、Ｃ末端逐次分解反応工程を終えた時点で、残余する反応試薬、アルカン酸無水物、アルカン酸、パーフルオロアルカン酸の量は、一連の反応産物のモル量に比較して、大過剰な量となっている。仮に、「脱塩工程」を実施せず、第３アミン化合物を使用する後処理工程を実施すると、これら「外因性」の起源を有する、アルカン酸、パーフルオロアルカン酸と第３アミン化合物で構成される「不揮発性の塩」の総量は、一連の反応産物のモル量に比較して、大過剰な量となってしまう。
【０１３６】
このような「外因性」の起源を有する「不揮発性の塩」が、一連の反応産物のモル量に比較して、大過剰な量混入していると、質量分析時に使用されるマトリクス材料、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてマトリクスを作製した際、マトリクスの結晶化を顕著に低下させる要因となる。また、目的とする一連の反応産物に由来するイオン種のピーク強度を顕著に低下させ、例えば、Ｓ／Ｎ比を顕著に低下させる要因となる。
【０１３７】
それに対して、「脱塩工程」を予め実施することで、前記の「外因性」の起源を有する「不揮発性の塩」の生成を回避することが可能となっている。すなわち、「内因性」の起源を有する「不揮発性の塩」は混在しているが、その量は、一連の反応産物のモル量に比例するため、その絶対量は僅かであるため、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてマトリクスを作製した際、マトリクスの結晶化を低下させる要因とはならない。加えて、目的とする一連の反応産物に由来するイオン種のピーク強度の顕著な低下もなく、例えば、Ｓ／Ｎ比は十分に高く状態となる。
【０１３８】
なお、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を作用させ、ペプチド鎖のＣ末端の５−オキサゾロン環構造を元のアミノ酸に変換し、また、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解を行う方法は、例えば、本願出願人により先に特許出願され、既に登録されている、特許第３５３４１９１号公報に開示されている。この特許第３５３４１９１号公報に開示される内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【０１３９】
この後処理工程で利用される、第３アミン化合物としては、その水溶液から、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を目的とする分圧で供給できることが必要である。例えば、２−（ジメチルアミノ）エタノール（沸点１３５℃）などを利用することが好ましい。
【０１４０】
後処理工程において、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を供給する形態を選択する際には、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度に対して、当初、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、乾燥試料に蒸気状の第３アミン化合物と水分子を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。
【０１４１】
この後処理工程の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【０１４２】
一方、後処理工程を終了する時点では、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【０１４３】
供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度を下げると、気相中に存在する第３アミン化合物と水分子の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、第３アミン化合物と水分子は、気相中に存在する第３アミン化合物と水分子の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【０１４４】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【０１４５】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【０１４６】
第５工程：質量分析工程
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法による、一連の反応産物の質量分析］
上記方法により調製される一連の反応産物を含む混合物を用いて、一連の反応産物の質量分析を行う。特に、本発明では、この一連の反応産物の分子量を同時に測定するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を適用して、一連の反応産物の質量分析を行うことが好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法では、ペプチド・サンプルを結晶マトリクス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸：２−シアノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロヘン酸）中に分散させたサンプルを利用して、レーザ脱着過程を介してイオン化を行い、分析を行う。この測定サンプルにレーザ光を照射すると、レーザ光はマトリクス材料により吸収され、その励起エネルギーを分析対象分子（ペプチド）へと供給して、その脱着を起こさせる。また、このレーザ脱着過程において、ペプチドは、光学的に励起された結晶マトリクスからプロトン（Ｈ+）を受けて、イオン化する。典型的には、（Ｍ＋Ｈ）+タイプのイオン種を生ずる。
【０１４７】
このソフト・レーザ脱着過程を介して、ペプチド由来のイオン種は、気相に移行した後、電場の中で加速されて、ディテクタへと導かれる。サンプルプレート上の結晶マトリクスから脱着した、イオン種が、ディテクタまで飛翔して検出されるまでの飛行時間を測定する。すなわち、イオン化に利用されるパルス状のレーザ光の照射から、ディテクタにおいてイオン種が検出されるまでの時間を、高い精度で測定する。このイオンの飛行時間は、運動量（ｍｖ）、質量対電荷比（ｍ／ｚ）の平方根に依存するので、測定された飛行時間から、そのイオン種の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を算出することができる。
なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を適用する質量分析では、結晶マトリクス中に分散されている分子種は、同時にイオン化されるため、一連の反応産物を一括して分析できる。その際、結晶マトリクス中に一連の反応産物以外に分子種が存在していると、相対的に一連の反応産物に由来するイオン種の生成量は低下する。例えば、アルカン酸と第３アミン化合物からなる不揮発性の塩が、多量に含まれていると、一連の反応産物に由来するイオン種の生成量は、大幅に低下する。アルカン酸と第３アミン化合物からなる不揮発性の塩が、多量に残存している際に引き起こされる、一連の反応産物に由来するイオン種のピークにおける、Ｓ／Ｎ比の大幅な低下には、この現象も関与していると推定される。
【０１４８】
第６工程：スペクトル解析工程
［一連の反応産物の質量分析結果に基づく、ペプチド断片のＣ末端アミノ酸配列の解析］
第５工程において、測定された各ペプチド断片から調製された、一連の反応産物に由来するイオン種、例えば、（Ｍ＋Ｈ）+タイプのイオン種の質量（ｍ／ｚ）を測定結果に基づき、各ペプチド断片：フラグメントＦiのＣ末端（Ｎi番目のアミノ酸）から逐次的に分解されたｊ番目のアミノ酸残基（Ｎi-j+1番目のアミノ酸残基）の式量：ΔＭ（Ｎi-j+1）を算定し、そのアミノ酸の種類を特定する。
【０１４９】
なお、ペプチド断片のＣ末端から逐次的分解された一連のアミノ酸を特定する際に用いられる解析方法は、本願出願人により先に特許出願され、既に、特開２００６−１８９２７７号公報として公開されている。この特開２００６−１８９２７７号公報に開示される内容は、参照により本願明細書中に組み込まれるものとする。
【０１５０】
以下に、具体例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。なお、下記の具体例は、本発明の最良の実施形態の一例を示唆するは、本発明の範囲は、かかる具体例により示唆される形態に限定されるものではない。
【０１５１】
（参考例１）
［サンプルプレート上に吸着している酢酸、無水酢酸に対する、蒸気状のピリジンと水分子を利用する「脱塩操作」による除去効果］
密閉容器中において、６０℃に加熱した５％酢酸無水酢酸溶液から蒸発する、蒸気状の酢酸と無水酢酸の雰囲気中に、質量分析用のサンプルプレートを４時間放置する。その間に、該サンプルプレートの表面には、蒸気状の酢酸と無水酢酸が吸着する。その後、この酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５２】
次いで、酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、同じく密閉容器中において、６０℃に加熱した１０％ジメチルアミノエタノール水溶液から蒸発する、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中に、２時間放置する。その間に、サンプルプレートの表面においては、吸着している酢酸と無水酢酸に対して、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子が気相から作用する。この蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子を作用させる処理を施した後、サンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５３】
なお、前記の蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子を作用させる処理を施す間に、無水酢酸に対して、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールの存在下に、水分子が作用すると、無水酢酸の加水分解が進行し、２分子の酢酸が生成される。従って、前記の加水分解によって、サンプルプレート表面に吸着していた無水酢酸は、系内で酢酸へと変換されると推定される。加えて、酢酸と、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールとは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：Ｎ（ＣＨ3）2−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨで表記できる付加塩を形成することが可能である。酢酸、ジメチルアミノエタノールは、室温では液体であるが、この付加塩化合物の融点は、少なくとも、６０℃以上であり、室温では、固体である。
【０１５４】
前記の二段階の処理を施したサンプルプレートの表面を観察したところ、処理前には清浄であった表面上に、図２Ａに示すような、白色の粉体状物質が付着している部位が散見される。この白色の粉体状物質は、前記の二段階の処理を施す間に、サンプルプレートの表面で生成した物質であり、酢酸とジメチルアミノエタノールの塩であると推定される。
【０１５５】
一方、５％酢酸無水酢酸溶液と１０％ジメチルアミノエタノール水溶液を、容積比率１：１で直接混合した混合液を調製する。シャーレ中にこの混合液を採り、別のサンプルプレートを混合液に浸し、その表面に前記混合液の極く薄い被膜を付着させる。この混合液の極く薄い被膜を付着させたサンプルプレートを、真空デシケータ中に入れ、真空ポンプで強制排気することで、前記混合液の極く薄い被膜中に含まれる水分を除去し、乾燥させる。この混合液中には、酢酸（沸点：１１８℃）、無水酢酸（沸点：１４０℃）、ジメチルアミノエタノール（沸点：１３５℃）ならびに水（沸点：１００℃）が含まれており、減圧状態に保持する間に、水分が除去され、濃縮される。その際、酢酸とジメチルアミノエタノールとで構成される塩化合物は、蒸散しないため、最終的に白色粉体として、析出し、乾燥状態でサンプルプレートの表面に残留する。前記真空デシケータ中おいて、乾燥処理を終えた後、サンプルプレートの表面を観察したところ、処理前には清浄であった表面上に、図２Ｂに示すような、白色の粉体状物質が付着している部位が散見される。酢酸（沸点：１１８℃）、無水酢酸（沸点：１４０℃）、ジメチルアミノエタノール（沸点：１３５℃）自体は、何れも、室温（２０℃）では液体であり、図２Ｂに示すような、このサンプルプレートの表面に付着している白色の粉体状物質（固体）は、酢酸とジメチルアミノエタノールとで構成される塩化合物であると推断される。
【０１５６】
さらに、別のサンプルプレートに対して、下記の三段階の処理を行い、その処理後の表面を観察した。
【０１５７】
先ず、密閉容器中において、６０℃に加熱した５％酢酸無水酢酸溶液から蒸発する、蒸気状の酢酸と無水酢酸の雰囲気中に、質量分析用のサンプルプレートを４時間放置する。その間に、該サンプルプレートの表面には、蒸気状の酢酸と無水酢酸が吸着する。その後、この酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５８】
次いで、酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、同じく密閉容器中において、６０℃に加熱した１０％ピリジン水溶液から蒸発する、蒸気状のピリジンと水分子の雰囲気中に、２時間放置する。その間に、サンプルプレートの表面においては、吸着している酢酸と無水酢酸に対して、蒸気状のピリジンと水分子が気相から作用する。この蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施した後、サンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５９】
なお、前記の蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施す間に、無水酢酸に対して、ピリジン塩基の存在下に水分子が作用すると、無水酢酸の加水分解が進行し、２分子の酢酸が生成される。従って、前記の加水分解によって、サンプルプレート表面に吸着していた無水酢酸は、系内で酢酸へと変換されると推定される。
【０１６０】
なお、ピリジン自体は弱塩基（ｐＫａ５．１９）であり、酢酸とは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる、「揮発性塩」を形成することが可能である。すなわち、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる「揮発性塩」は、熱的に安定ではなく、酢酸とピリジンに解離して、蒸散することが可能である。従って、一旦、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる「揮発性塩」が形成されるが、気相中に存在する酢酸分子の分圧が低い場合、この「揮発性塩」は解離し、蒸気状のピリジンと酢酸へと変換される。
【０１６１】
前記蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施したサンプルプレートを、同じく密閉容器中において、６０℃に加熱した１０％ジメチルアミノエタノール水溶液から蒸発する、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中に、４時間放置する。仮に、サンプルプレートの表面に、酢酸、あるいは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる「揮発性塩」が吸着しているならば、表面において、酢酸と、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールとは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：Ｎ（ＣＨ3）2−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨで表記できる付加塩が形成される。
【０１６２】
前記の三段階の処理を施したサンプルプレートの表面を観察したところ、図２Ｃに示すように、白色の粉体状物質が付着している痕跡は見出されなかった。すなわち、処理前の表面と同様に、清浄な表面を示していた。
【０１６３】
（参考例２）
［清浄なサンプルプレート表面において作製される、良好な結晶状態を示すマトリクス］
ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量分析の際、そのマトリクスとして多用される、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を、０．１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル水溶液中に溶解した溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、よく洗浄したサンプルプレート上に１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行った。前記の条件は、良好な結晶状態を得るための条件として、広く利用されている。図３Ａに、この典型的なＣＨＣＡの結晶化条件を用いて得られた、良好な結晶状態を示すマトリクスを観察した結果を示す。
【０１６４】
さらに、よく洗浄したサンプルプレート上に、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのアミノ酸配列からなるペプチド、ヒト・アンジオテンシン Ｉを含む標準ペプチド溶液（２ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ滴下し、乾燥した。その乾燥試料上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行って、該ペプチドが良好な結晶状態を示すマトリクス中に均一に混合されている試料を調製した。この試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを測定した結果を、図３Ｂに示す。この測定された質量スペクトル上には、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に主イオン種ピークが観測されている。また、測定された質量スペクトルにおいて、バックグランドのレベルは、十分に低く抑えられており、所謂、Ｓ／Ｎ比は十分に高い良好な測定結果となっている。
【０１６５】
（参考例３）
［サンプルプレート上に吸着している酢酸、無水酢酸に対する、蒸気状のピリジンと水分子を利用する「脱塩操作」による除去に伴う、良好な結晶状態を示すマトリクスの形成］
前記参考例１に記載する、二段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されるサンプルプレート上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾して、マトリクスを作製した。得られたマトリクスの結晶状態を観察した結果を、図４Ａに示す。図３Ａに示す良好な結晶状態を示すマトリクスと比較して、図４Ａに示すマトリクスは、粒が大きく、その結晶状態は理想的な状態とは異なっている。
【０１６６】
参考例１に記載する、二段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されるサンプルプレート上に、ヒト・アンジオテンシン Ｉを含む標準ペプチド溶液（２ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ滴下し、乾燥した。その乾燥試料上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行って、該ペプチドがマトリクス中に混合されている試料を調製した。この試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを測定した結果を、図４Ｂに示す。測定された質量スペクトルにおいて、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に存在する主イオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルを比較すると、所謂、Ｓ／Ｎ比は低い測定結果となっている。すなわち、バックグランドのレベルに対して、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に存在する主イオン種ピークの強度が相対的に弱くなっている。
【０１６７】
さらに、参考例１に記載する、三段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されていないサンプルプレート上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾して、マトリクスを作製した。得られたマトリクスの結晶状態を観察した結果を、図５Ａに示す。図３Ａに示す良好な結晶状態を示すマトリクスと比較して、図５Ａに示すマトリクスは、粒は同程度であり、その結晶状態は、図３Ａに示す良好な結晶状態と遜色のないものであった。
【０１６８】
参考例１に記載する、三段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されていないサンプルプレート上に、ヒト・アンジオテンシン Ｉを含む標準ペプチド溶液（２ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ滴下し、乾燥した。その乾燥試料上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行って、該ペプチドがマトリクス中に混合されている試料を調製した。この試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを測定した結果を、図５Ｂに示す。測定された質量スペクトルにおいて、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に存在する主イオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルを比較すると、所謂、Ｓ／Ｎ比は十分に高い測定結果となっている。図３Ｂに示す質量スペクトルと比較して、図５Ｂに示す質量スペクトルにおける、バックグランドのレベルは、同程度に抑えられている。
【０１６９】
すなわち、サンプルプレートの表面に酢酸と無水酢酸の吸着処理を施した後、蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施すことにより、表面に吸着していた無水酢酸は、加水分解され、酢酸となる。その際、加水分解で生成した酢酸、ならびに、当初から吸着していた酢酸とは、ピリジンと「揮発性塩」を構成し、この処理の間に、加熱によって、「揮発」する。その結果、サンプルプレートの表面には、酢酸、あるいは、酢酸とピリジンとからなる「揮発性塩」が実質的に残余していない状態とできる。従って、その後、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中に保持しても、サンプルプレートの表面で、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールと酢酸とからなる付加塩が生成し、残留することは無くなっている。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、解析対象のペプチドが、超微量サンプルである場合に、そのＣ末端アミノ酸配列の解析に用いる分析サンプルの調製を質量分析用のサンプルプレート上で行い、その後、質量スペクトルの測定を行う、サンプル調製と測定の自動化、機械化を行う際、好適な解析方法として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法を構成する全体工程を模式的に示す図である。Ｃ末端逐次分解反応工程と、その後に実施される後処理工程との間に、Ｃ末端逐次分解反応工程で利用される反応試薬をより効率的に除去するため、予め、脱着処理を施し、さらに、僅かに残余する反応試薬：アルカン酸無水物、該アルカン酸無水物由来のアルカン酸、パーフルオロアルカン酸を、塩基性含窒素芳香環化合物と揮発性塩に変換した後、該揮発性塩を揮発、除去する「脱塩処理」の工程を設けている。
【図２】５％酢酸無水酢酸溶液と１０％ジメチルアミノエタノール水溶液の１：１の混合液の被膜で覆われたサンプルプレートを乾燥する結果、その表面に析出・付着する白色の粉体状物質の観察結果（図２Ａ）；蒸気状の酢酸と無水酢酸の雰囲気中に保持し、その表面に酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施したサンプルプレートを、その後、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理した際、乾燥後、サンプルプレートの表面に付着残余する白色の粉体状物質の観察結果（図２Ｂ）；酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施した後、蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施すことにより、表面に吸着していた無水酢酸を加水分解し、酢酸とピリジンとで構成される「揮発性塩」とした上で、揮発させ、除去する工程を設けることで、さらに、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理した際、乾燥後、サンプルプレートの表面に、白色の粉体状物質の生成・付着を回避した表面の観察結果（図２Ｃ）を、対比して示す図である。
【図３−１】清浄なサンプルプレートの表面において作製された、良好な結晶状態を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量分析用のマトリクスの観察結果（図３Ａ）；清浄なサンプルプレートの表面において、ヒト・アンジオテンシン Ｉの乾燥試料と、良好な結晶状態を示すマトリクスを用いて調製したサンプルを用いて測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトル（図３Ｂ）を示す図である。
【図３−２】図３Ｂに示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを詳細に示す図である。
【図４−１】その表面に酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施し、その後、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理することで、乾燥後、表面に白色の粉体状物質の付着残余が生じているサンプルプレートの表面において、調製されたマトリクスの結晶状態の観察結果（図４Ａ）；前記表面に白色の粉体状物質の付着残余が生じているサンプルプレートの表面において、ヒト・アンジオテンシン Ｉの乾燥試料と、マトリクスを用いて調製したサンプルを用いて測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトル（図４Ｂ）を示す図である。
【図４−２】図４Ｂに示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを詳細に示す図である。
【図５−１】酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施した後、蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施すことにより、表面に吸着していた無水酢酸を加水分解し、酢酸とピリジンとで構成される「揮発性塩」とした上で、揮発させ、除去する工程を設けることで、さらに、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理した際、乾燥後、サンプルプレートの表面に、白色の粉体状物質の生成・付着を回避したサンプルプレートの表面において、調製されたマトリクスの結晶状態の観察結果（図５Ａ）；前記表面に白色の粉体状物質の付着残余が回避されているサンプルプレートの表面において、ヒト・アンジオテンシン Ｉの乾燥試料と、マトリクスを用いて調製したサンプルを用いて測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトル（図５Ｂ）を示す図である。
【図５−２】図５Ｂに示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを詳細に示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ末端逐次分解反応ならびに質量分析法を利用して、タンパク質を構成するペプチド鎖のアミノ酸配列を解析する方法において、その解析精度を改善する方法に関する。より具体的には、タンパク質を構成するペプチド、あるいは、タンパク質に由来するペプチド群のアミノ酸配列を、Ｃ末端逐次分解反応ならびに質量分析法を利用して解析する際、前記Ｃ末端逐次分解反応に使用する試薬相互間での塩形成に起因する解析精度の低下を回避する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析法を利用して、ペプチド群ないしペプチドのアミノ酸配列を解析する手法として、次の二つの手法が知られている。一つは、タンデム質量分析によるＭＳ／ＭＳスペクトルを測定し、ペプチド自体に起因する親イオン種と、そのペプチド鎖の解裂により生成するペプチド断片群に相当する娘イオン種を同時に観測し、アミノ酸配列を解釈する方法である。二つ目は、ペプチド群ないしペプチドを化学的にアミノ酸単位で分解し、アミノ酸一つずつ短縮された一連の反応産物の質量分析を行い、この一連の反応産物の質量差に基づき、アミノ酸配列を解析する方法である。
【０００３】
前者のＭＳ／ＭＳ法では、ペプチド鎖の解裂は、アミド結合部分で起こり、結果的に、ペプチド鎖中に存在する複数のアミド結合のいずれかで解裂が生じた、一連のペプチド断片に起因する娘イオン種を同時に観測する。この解裂で生成する一連のペプチド断片起因する娘イオン種中には、解裂が生じたアミド結合の位置が一つずつ異なっている、特定の解裂シリーズをなす娘イオン種ピーク群が含まれている。この特定の解裂シリーズをなす娘イオン種ピーク群においては、ピーク間の質量差がアミノ酸残基質量に相当するので、演算によりアミノ酸配列を高い確度で推定することができる。しかしながら、ペプチド鎖の解裂を引き起こす衝撃エネルギー等の制御が難しく、また、アミノ酸配列により、解裂が生じ易い部位と、生じ難い部位が存在する場合もある。加えて、通常、ペプチド鎖に対する衝撃は、一回しか起こらないが、高密度の衝撃条件を選択する際には、生成したペプチド断片がさらに衝撃を受け、さらに、断片化する現象も見出される。結果的に、ペプチド鎖に対して、そのＮ末端からＣ末端まで、全てのアミド結合部分において解裂が生じ、一連の解裂シリーズをなす娘イオン種ピーク群が十分な精度（強度）で測定される頻度はあまり高くない。そのため、推定されるアミノ酸配列の確度も、必ずしも高くはない。
【０００４】
他の１つの方法は、化学反応を利用して、ペプチド鎖を末端からアミノ酸単位で分解し、アミノ酸一つずつ短縮された一連の反応産物を作製し、その質量分析を行い、この一連の反応産物の質量差に基づき、アミノ酸配列を解析する方法である。ペプチド鎖を末端からアミノ酸単位で分解する代表的な手法は、ペプチド鎖のＣ末端側から連続的にアミノ酸を切断するＣ末端アミノ酸逐次分解反応を利用する手法である。例えば、アルカン酸無水物（例えば、無水酢酸）蒸気に、微量のパーフルオロアルカン酸（例えば、トリフルオロ酢酸）蒸気を混入させ、ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する方法が提案されている（非特許文献１参照）。この手法によれば、測定される質量スペクトルの複雑性を除去するため、Ｃ末端逐次分解前にペプチド鎖に対して行うアシル化反応（前処理）と、Ｃ末端逐次分解後に反応産物に対して行う加水分解処理（後処理）を行うことが有効であることも併せて記載されている。
【０００５】
予め乾燥したペプチド鎖に、蒸気として供給されるアルカン酸無水物およびパーフルオロアルカン酸を作用させ、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解を行う手法では、下記の二段階の反応が進行する。まず、パーフルオロアルカン酸の存在下、アルカン酸無水物がペプチド鎖のＣ末端に作用することで、反応式（Ｉ）で表記される脱水反応：
【０００６】
【化１】
【０００７】
により、Ｃ末端アミノ酸から反応中間体として、５−オキサゾロン環構造が形成される。次いで、更に、アルカン酸無水物がこの５−オキサゾロン環に作用し、反応式（II）で表記される反応：
【０００８】
【化２】
【０００９】
が進行し、結果的に、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成される。その後、Ｃ末端に生成している酸無水物構造を利用して、５−オキサゾロン環構造が形成される。
【００１０】
上記のＣ末端アミノ酸の選択的な分解反応は逐次的に進み、所定の処理時間が経過した時点で、元のペプチド鎖に対して、１〜１０数アミノ酸残基がそのＣ末端からそれぞれ除去された一連の反応産物を含む混合物が得られる。この一連の反応産物を含む混合物に対して、質量分析法を適用して、各反応産物に由来するイオン種の質量を測定すると、Ｃ末端アミノ酸配列を反映した質量差を示す一連のピークが測定できる。具体的には、各反応産物は、元のペプチド鎖から逐次的なＣ末端アミノ酸分解反応で生成される結果、例えば、元のペプチド鎖から数アミノ酸残基が除去された反応産物までの、数種の一連の反応産物群に関して、質量分析法を利用することで、対応するイオン種の質量を一括して分析することができ、かかる数アミノ酸残基分のＣ末端アミノ酸配列を一括して決定できる。
【００１１】
また、アミノ酸配列の長いペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的に分解する際、ペプチド途中におけるペプチド結合の切断など好ましくない副次反応を抑制するために、アミノ酸配列の長いペプチドの乾燥試料に対して、予めＮ−アシル化処理を施し、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用し、穏和な条件でＣ末端アミノ酸の分解を行う。Ｃ末端アミノ酸逐次分解反応を終えた後、反応産物のＣ末端に残余している酸無水物構造、あるいは、オキサゾロン環構造を、第３アミンの存在下、気相から水分子を作用させることで加水分解処理を施し、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とする。さらに、この加水分解処理を施した反応産物に対して、トリプシン消化を行うことにより、質量分析の対象となるペプチド断片の分子量を小さくして、長いペプチド鎖のＣ末端アミノ酸配列をより簡便に解析する方法についても、本出願人により提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ． ４， １５−２１ （２００４）
【特許文献１】特開２００３−２７９５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上記のＣ末端逐次分解反応ならびに質量分析法を利用する方法は、ペプチド群ないしペプチドのＣ末端から１０アミノ酸残基程度のアミノ酸配列を高い精度で、かつ容易に決定できる汎用性に富む解析方法として有用である。しかしながら、前記加水分解処理の工程において、塩基触媒として利用する第３アミン試薬は、反応産物中に相当量残存するアルカン酸と塩を形成する。このアルカン酸と第３アミンで構成される塩が反応産物中に相当量残余していると、後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法による質量分析の際に不可欠となるマトリクスの結晶形成阻害、およびこれに起因するスペクトル不良を引き起こす要因となることが判明した。具体的には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った際、分析対象試料中に、アルカン酸と第３アミンとで構成される塩が相当量に残余していると、目的とする反応産物に由来するピーク強度が極端に低下し、良好な測定結果が得られない場合がある。この現象は、特に、サンプルプレート上において、分析対象試料の調製を行う工程と、その後、そのまま、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行う工程とを一体化して、自動化・機械化を進める上で問題となる。
【００１３】
本発明は、前記の課題を解決するものである。本発明の目的は、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用して、ペプチド鎖のＣ末端逐次分解反応を行い、その後、第３アミンと水分子とを組み合わせた反応試薬を利用して、ペプチド鎖のＣ末端のオキサゾロン環構造を加水分解して、カルボキシル基に変換する後処理工程の操作を行う際、Ｃ末端逐次分解反応で使用するアルカン酸無水物に由来するアルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の形成を回避する手段を提供することにある。さらには、本発明の目的は、Ｃ末端逐次分解反応で使用するアルカン酸無水物に由来するアルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の形成を回避する手段を具えた、ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的分解して、前記ペプチドに由来する一連の反応産物を調製する手法を利用して、アルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の残余に起因する、質量分析用のマトリクス結晶形成障害、あるいは、測定される質量スペクトル上における、一連の反応産物由来のイオンピーク強度の低下などの問題を解消する方法を提供することにある。特には、解析対象のペプチドが、超微量サンプルである場合に、その質量解析に使用するサンプルプレート上において、前記Ｃ末端逐次分解反応と、その後処理工程を行う際、アルカン酸と、第３アミンとで構成される塩の残余を回避でき、一連の反応操作の自動化・機械化に適合する質量分析用サンプルの調製方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
通常、Ｃ末端逐次分解反応工程では、サンプルプレート上において、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を、予めＮ−アシル化処理を施したペプチドの乾燥試料に作用させ、この工程を終了後、乾燥処理を施す。従って、本発明者は、前記乾燥処理を施した、サンプルプレート上の反応産物の乾燥試料中には、微小な液滴を形成可能な量のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸は残余していないことを確認した。しかしながら、このサンプルプレート上の反応産物の乾燥試料中には、相当量のアルカン酸無水物、微量のパーフルオロアルカン酸、アルカン酸無水物から生成したアルカン酸が吸着していることも確認した。従って、第３アミンと水分子とを組み合わせた反応試薬を利用して、加水分解処理を施す工程中では、残余しているアルカン酸無水物の加水分解も進行し、２分子のアルカン酸に変換される。また、系内には、第３アミンが存在しているため、生成した相当量のアルカン酸、あるいは、微量残余しているパーフルオロアルカン酸は、この第３アミンと速やかに付加塩を形成する。形成された付加塩の融点は高く、沸点も高く、また、熱的にも安定であるため、この加水分解処理工程の加熱温度では、揮発、解離を起こさず、固体状態となって、反応産物の試料中に混入した状態となる。従って、加水分解処理工程を終了し、再び、第３アミンと水分子を蒸散させ、加水分解処理済の反応産物の乾燥試料とする段階では、この反応産物の乾燥試料中に、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩が相当量混入した状態となることを確認した。
【００１５】
加えて、サンプルプレート上において、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩が相当量共存している状態で、ペプチドの乾燥試料に対して、マトリクス材料を含む溶液を滴下し、乾燥させて、マトリクスの結晶化を行うと、良好な結晶状態のマトリクスが形成されないことを確認した。また、その状態のサンプルを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行って、測定された質量スペクトル中において、目的とするペプチドに由来するイオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルとを比較すると、所謂、Ｓ／Ｎ比が低い測定結果となることも確認した。
【００１６】
一方、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩が共存していない状態では、サンプルプレート上において、ペプチドの乾燥試料に対して、マトリクス材料を含む溶液を滴下し、乾燥させて、マトリクスの結晶化を行うと、良好な結晶状態のマトリクスが形成される。また、良好な結晶状態のマトリクスが形成されているサンプルを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行うと、目的とするペプチドに由来するイオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルとの比、所謂、Ｓ／Ｎ比が十分に高い測定結果が得られる。
【００１７】
以上の知見から、アルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩の生成を回避することで、良好な結晶状態のマトリクスの形成が可能となり、良好な結晶状態のマトリクスが形成されているサンプルを用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行うと、所謂、Ｓ／Ｎ比が十分に高い良好な測定結果が得られることを見出した。さらに、このアルカン酸と第３アミンとで構成される付加塩の生成を回避する上では、Ｃ末端逐次分解反応工程を終了した後、サンプルプレート上、反応産物の乾燥試料中に吸着することで残余している、相当量のアルカン酸無水物、微量のパーフルオロアルカン酸、アルカン酸無水物から生成したアルカン酸を除去することが有効であることに着目した。
【００１８】
先ず、この吸着している、相当量のアルカン酸無水物を加水分解し、生成するアルカン酸を「揮発性塩」に変換すると、乾燥状態のペプチドに対する、吸着能が低下することを見出した。すなわち、アルカン酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が、塩の形成に使用される結果、乾燥状態のペプチドとの相互作用（例えば、水素結合）を低減でき、吸着能が低下することを見出した。また、微量残留しているパーフルオロアルカン酸に関しても、「揮発性塩」に変換すると、乾燥状態のペプチドに対する、吸着能が低下することを見出した。
【００１９】
さらに、本発明者は、Ｃ末端逐次分解反応工程を終了した後、サンプルプレート上、反応産物の乾燥試料中に吸着することで残余している、相当量のアルカン酸無水物の加水分解と、同時に、生成するアルカン酸を「揮発性塩」に選択的に変換する手段を探索した。その探索の結果、含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジンやその誘導体を利用すると、６０℃以下の加熱条件において、塩基触媒として機能する、該含窒素芳香環化合物の存在下、水分子をアルカン酸無水物に作用させると、加水分解が進行することを見出した。また、同時に、該含窒素芳香環化合物の存在下では、生成するアルカン酸は、速やかに、該含窒素芳香環化合物と塩を形成し、形成される塩は、６０℃以下の加熱条件において、「揮発」が進行する「揮発性塩」であることも確認した。
【００２０】
具体的には、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」は、気相中に存在する、含窒素芳香環化合物分子とアルカン酸分子と解離平衡状態となっている。そのため、気相中に存在するアルカン酸分子の分圧を低く抑えると、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」固体は、熱的に解離して、アルカン酸分子を気相中に放出する。一方、気相中に蒸気状の含窒素芳香環化合物と水分子を供給している、含窒素芳香環化合物の水溶液は、気相中に存在するアルカン酸分子を吸収し、その液相中（水溶液）において、アルカン酸アニオン種として、溶解し、蓄積していく。すなわち、含窒素芳香環化合物の水溶液が、系内に共存する状態とすることで、気相中に存在するアルカン酸分子の分圧は、実質的に「０」の状態に維持される。その結果、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」固体の熱的な解離が持続され、最終的には、相当量のアルカン酸無水物の加水分解、その後、含窒素芳香環化合物との「揮発性塩」を一旦形成したアルカン酸分子は、全て、気相中に放出される。すなわち、一旦、含窒素芳香環化合物とアルカン酸とで構成される「揮発性塩」に変換したのち、この「揮発性塩」が前記の機構を介して、「揮発」される。
【００２１】
この蒸気状の含窒素芳香環化合物と水分子を利用し、アルカン酸無水物の加水分解と、生成するアルカン酸分子を「揮発性塩」に変換し、さらに「揮発」させ、除去する工程を設けると、その工程後、サンプルプレート上、反応産物の乾燥試料中には、アルカン酸が存在しない状態とできる。
【００２２】
本発明の方法は、上述する蒸気状の含窒素芳香環化合物と水分子を利用し、アルカン酸無水物の加水分解と、生成するアルカン酸分子を「揮発性塩」に変換し、さらに「揮発」させ、除去する「脱塩工程」を利用することで、その後、蒸気状の第３アミンと水分子を利用する「後処理工程」を実施する際、アルカン酸と第３アミンとで構成される不揮発性塩の生成を回避するものである。また、アルカン酸と第３アミンとで構成される不揮発性塩の生成を回避する結果、サンプルプレート上において、反応産物の乾燥試料にマトリクス材料を含む溶液を滴下し、乾燥させて、マトリクスの結晶化を行った際、良好な結晶性を示すものとできる。従って、かかるマトリクスの結晶化によって調製されるサンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行うと、所謂、Ｓ／Ｎ比が十分に高い良好な測定結果が高い再現性で得られる。
【００２３】
本発明は、上述する一連の知見に基づき、完成されたものである。
【００２４】
すなわち、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、
解析対象とするペプチドを解析する方法であって、
質量分析測定用のサンプルプレート上において、解析対象とする前記ペプチドを、滴下乾燥した後、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的分解して、前記ペプチドに由来する一連の反応産物を調製する工程と、
該サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルを、質量分析機を利用して測定する工程と、
測定された質量スペクトルに基づき、前記一連の反応産物の質量を特定し、一連の反応産物間の質量差を用いて、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を特定する工程とを有し、
サンプルプレート上において、前記一連の反応産物を調製する工程は、少なくとも、
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解するＣ末端逐次分解化学反応工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程に先立ち実施される前処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程の後に実施される後処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程と後処理工程の間に、サンプルプレート上に残余している前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程で利用する反応試薬を除去する、反応試薬の除去工程とを具え、
前処理工程は、
乾燥雰囲気下、１０〜６０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において滴下乾燥されている、解析対象とする前記ペプチドに対して、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とアルカン酸を接触させて、前記ペプチドのＮ末端のアミノ基、ならびに該ペプチド鎖中に含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基にＮ−アシル化保護を施す工程であり；
Ｃ末端逐次分解反応工程は、
乾燥雰囲気下、１５〜８０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において、前処理工程によってＮ−アシル化保護されたペプチドの乾燥試料に対して、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を接触させて、該ペプチドのＣ末端において、
下記する一般式（III）：
【００２５】
【化３】
【００２６】
（式中、Ｒ１は、ペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖を表し、Ｒ２は、前記Ｃ末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す）で表記される５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴って、Ｃ末端アミノ酸の分解を逐次的に行う工程であり；
反応試薬の除去工程は、
サンプルプレート上において、前記Ｃ末端逐次分解反応工程で調製される、ペプチドに由来する一連の反応産物を含む乾燥試料に対して、
該サンプルプレート上に残余する前記アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸とを、減圧または不活性ガスの送気により蒸散させる処理を施し、
次いで、前記乾燥試料に対して、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子、あるいは、液滴状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を接触させて、塩基性含窒素芳香環化合物を触媒として利用し、該サンプルプレート上に残留する未反応の前記アルカン酸無水物を加水分解し、前記加水分解産物であるアルカン酸および前記パーフルオロアルカン酸と該塩基性含窒素芳香環化合物との揮発性の塩を形成させ、減圧または不活性ガスの送気により前記揮発性塩を揮発させ、前記乾燥試料中から除去する工程であり；
後処理工程は、
前記反応試薬の除去工程を施した後、サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物に対して、蒸気状の第３アミン化合物と水分子、あるいは、液滴状の第３アミン化合物と水分子を接触させて、該一連の反応産物のペプチド鎖のＣ末端部に形成されている該５−オキサゾロン環を加水分解処理する工程である
ことを特徴とする、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法である。
【００２７】
その際、
アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を反応試薬として使用する、Ｃ末端逐次分解反応工程；
アルカン酸無水物とアルカン酸を反応試薬として使用する、前処理工程；
含窒素芳香環化合物と水分子を反応試薬として使用する、反応試薬の除去工程；
第３アミン化合物と水分子を反応試薬として使用する、後処理工程の各工程において、
各工程で利用する反応試薬を、蒸気状の反応試薬を気相から供給し、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を低く設定し、前記サンプルプレート上のペプチドの乾燥試料に対して、蒸気状の反応試薬の吸着を起こさせる、反応試薬の吸着工程と、
各工程で利用する反応試薬を作用させる処理を終了させる時点で、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を高く設定し、前記サンプルプレート上の該工程の処理済ペプチド試料中に吸着させた前記反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を具えている
ことが好ましい。
【００２８】
また、前処理工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とアルカン酸の組み合わせは、無水酢酸と酢酸であることが好ましい。
【００２９】
Ｃ末端逐次分解反応工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の組み合わせにおいて、アルカン酸無水物は、無水酢酸であることが好ましい。さらに、前記パーフルオロアルカン酸が、０．３〜２．５の範囲内の酸解離定数（ｐＫａ）を有し、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸であることが好ましい。
【００３０】
一方、反応試薬の除去工程で使用される反応試薬中に含まれる、含窒素芳香環化合物は、ピリジンまたはコリジンであることが好ましい。
【００３１】
また、後処理工程で使用される反応試薬中に含まれる、第３アミン化合物は、ジメチルアミノエタノールであることが好ましい。
【００３２】
特に、本発明の方法においては、前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルの測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析法により行われることが一般的である。
【発明の効果】
【００３３】
本発明の方法では、質量分析測定用のサンプルプレート上において、個々のペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解し、一連の反応産物を調製する工程を実施するので、該サンプルプレート上において、多数の検体を並列的に処理することが可能である。この多数の検体の並列的処理を利用することで、全体として、ハイスループットな解析が行える利点を具えている。加えて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析を適用する際、利用されるマトリクスの結晶化を阻害し、その結果、測定される質量スペクトルの質、例えば、Ｓ／Ｎ比の低下を引き起こす要因である、Ｃ末端逐次分解反応工程後に残留している反応試薬と、後処理工程で利用する試薬の間で形成される不揮発性塩の生成に対して、上記の「反応試薬の除去工程」を設けることで、効果的な回避が可能となっている。すなわち、測定される質量スペクトルの質、例えば、Ｓ／Ｎ比の低下を高い再現性で回避できる利点は、微量のペプチド・サンプルの解析を行う際にも、良好なＳ／Ｎ比の質量スペクトルの測定結果に基づき、高い確度でＣ末端アミノ酸配列を解析することを可能とする。
【００３４】
さらに、本発明の方法によれば、「反応試薬の除去工程」で利用する「脱塩操作」は、極めて簡便な操作で構成されており、また、その再現性も高いため、サンプルプレート上において、個々のペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解し、一連の反応産物を調製する工程の自動化・機械化を実施する際で、全体の工程の再現性を維持する上でも好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に、本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法について、より詳しく説明する。
【００３６】
まず、本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、例えば、各種の酵素タンパク質、各種の受容体タンパク質、各種のペプチド性のリガンド分子、例えば、各種の成長因子等、種々のタンパク質を構成するペプチド鎖のアミノ酸配列を解析する際に利用される。なお、タンパク質を構成するペプチド鎖は、多くの場合、一本のペプチド鎖であるが、例えば、イムノグロブリンや、種々の受容体タンパク質のように、複数のペプチド鎖で構成されている場合もある。
【００３７】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、タンパク質を構成するペプチド鎖を、それぞれ分離し、また、分離されたペプチド鎖内に存在するＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を解離させ、一本鎖状にされたペプチド鎖に対して適用される。なお、一本鎖状とされたペプチド鎖が、ｒｅ−ｆｏｌｄｉｎｇして、三次元構造を再構築しないような状態とすることが一般的である。例えば、ｒｅ−ｆｏｌｄｉｎｇの過程で、鎖内でＣｙｓ−Ｃｙｓ結合を形成する場合には、このＣｙｓ−Ｃｙｓ結合の形成を阻害するため、ペプチド鎖中に含まれるＣｙｓ残基の側鎖に存在するスルファニル基（−ＳＨ）に対して、予めアルキル化処理を施す。
【００３８】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法を、一本のペプチド鎖で構成されるタンパク質のアミノ酸配列の解析に適用する場合を例にとり、その実施形態の一例を説明する。図１に、前記の形態における、本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法の全体工程の流れを模式的に表したフローシートを示す。
【００３９】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法では、例えば、解析対象のペプチド鎖が、Ｎ個のアミノ酸で構成されている際、そのＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解し、（Ｎ−１）個のアミノ酸残基からなる反応産物Ｐ1、（Ｎ−２）個のアミノ酸残基からなる反応産物Ｐ2、…、（Ｎ−ｉ）個のアミノ酸残基からなる反応産物Ｐi、…のような、一連の反応産物Ｐi（ｉ＝１，２，…）を作製する。原理的には、解析対象のペプチド鎖が、Ｎ個のアミノ酸で構成されている場合、元のペプチド鎖Ｐ0と、合計（Ｎ−１）種類の反応産物Ｐi（ｉ＝１，２，…，Ｎ−１）を作製して、その分子量Ｍ（Ｐ0）、Ｍ（Ｐi）：（ｉ＝１，２，…，Ｎ−１）を質量分析により測定すると、逐次的に分解されたｉ番目のアミノ酸残基の式量：ΔＭi＝Ｍ（Ｐi-1）−Ｍ（Ｐi）：（ｉ＝１，２，…，Ｎ−１）と、Ｎ末端のアミノ酸の分子量：ΔＭNに相当するＭ（ＰN-1）を決定できる。但し、現実的には、解析対象のペプチド鎖を構成するアミノ酸数Ｎが、例えば、１００程度になると、これらの一連の反応産物の全て分析可能な量で作製するには、用いるペプチド量は大量に必要となる。
【００４０】
利用できるペプチド量が限れているので、Ｎ個のアミノ酸で構成されているペプチド鎖を予め断片化し、１番目のアミノ酸からＮ1番目のアミノ酸までのフラグメント：Ｆ1（１→Ｎ1）、（Ｎ1＋１）番目のアミノ酸からＮ2番目のアミノ酸までのフラグメント：Ｆ2（（Ｎ1＋１）→Ｎ2）、…のような複数個のフラグメントを調製し、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）のアミノ酸配列の解析を行う手法が利用される。
【００４１】
図１に示す全体工程の流れを模式的に示すフローシートは、前記のＮ個のアミノ酸で構成されているペプチド鎖を予め断片化し、複数個のフラグメントを調製し、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）のアミノ酸配列の解析を行う手法に適合するものである。
【００４２】
従来の方法では、サンプルプレート上において、ペプチド鎖のＣ末端逐次分解反応を実施し、得られる一連の反応産物を含む混合物について、質量分析を行う際、その工程は、第１工程：フラクション工程、第２工程：前処理工程、第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程、第４工程：後処理工程、第５工程：質量分析工程、第６工程：スペクトル解析工程の６工程で構成されている。先ず、第１工程：フラクション工程において、Ｎ個のアミノ酸で構成されているペプチド鎖を予め断片化し、複数個のフラグメントを調製し、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）を分取している。その後、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）について、第２工程：前処理工程、第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程、第４工程：後処理工程を施し、ペプチド鎖のＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解した一連の反応産物を調製している。この第２工程：前処理工程では、各フラグメントのペプチド鎖のＮ末端アミノ基、ならびに、その鎖中に存在するＬｙｓ残基の側鎖上に存在するアミノ基に対して、Ｎ−アシル化を施している。次の第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程では、上述する反応式（Ｉ）で表記される脱水反応、ならびに、反応式（II）で表記される反応を介して、ペプチド鎖のＣ末端からアミノ酸を逐次的に分解して、一連の反応産物を作製する。そして、第３の工程を終えた後、第４工程：後処理工程では、第３工程で作製される一連の反応産物のＣ末端は、オキサゾロン環構造、あるいは、その前駆体である酸無水物構造となっており、第３アミンの存在下、水分子を作用させ、加水分解を行って、そのＣ末端にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する反応産物としている。
【００４３】
第５工程：質量分析工程では、各フラグメントＦi（（Ｎi-1＋１）→Ｎi）について、前記第２工程〜第４工程を実施することで調製される、そのＣ末端にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する、一連の反応産物と、元のフラグメントを含む混合物を質量分析して、これらのペプチド鎖に由来するイオン種の分子量（ｍ／ｚ）を測定する。次いで、第６工程：スペクトル解析工程では、質量スペクトル上に見出される、一連の反応産物と、元のフラグメントに由来するイオン種の分子量（ｍ／ｚ）の測定結果に基づき、フラグメントＦiのＣ末端（Ｎi番目のアミノ酸）から逐次的に分解されたｊ番目のアミノ酸残基（Ｎi-j+1番目のアミノ酸残基）の式量：ΔＭ（Ｎi-j+1）を算定し、そのアミノ酸の種類を特定する。すなわち、各フラグメントＦiについて、そのＣ末端アミノ酸配列を特定する。
【００４４】
上記の第１工程、第２工程、第３工程、第４工程、第５工程および第６工程を具えた解析方法は、本願出願人により先に特許出願され、既に、特開２００６−１８９２７７号公報として公開されている。この特開２００６−１８９２７７号公報に開示される内容は、参照により本願明細書中に組み込まれるものとする。
【００４５】
一方、本発明の方法では、図１に示すように、第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程を終えた後、Ｃ末端逐次分解反応で使用される反応試薬を除去する工程（反応試薬の除去工程）を設け、第４工程：後処理工程に移行している。この反応試薬の除去工程において、Ｃ末端逐次分解反応で使用される反応試薬の除去がなされている結果、Ｃ末端逐次分解反応で使用される反応試薬と、後処理工程で使用される試薬とが反応し、不揮発性の塩を形成する現象の回避がなされている。この反応試薬の除去工程では、サンプルプレート上に残余しているＣ末端逐次分解反応で使用される反応試薬：アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸に対して、塩基性含窒素芳香環化合物の存在下、水分子を作用させる。その結果、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物、あるいはパーフルオロアルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物からなる「揮発性塩」を一旦生成させ、その後、「揮発性塩」を揮発させ、除去する「脱塩工程」としている。
【００４６】
従って、この反応試薬の除去工程（「脱塩工程」）を設ける結果、アルカン酸と第３アミン化合物、あるいは、パーフルオロアルカン酸と第３アミン化合物からなる「不揮発性の塩」の生成が回避される。それに伴って、第５工程の質量分析工程において測定される、一連の反応産物の質量スペクトルは、「不揮発性の塩」の残留、混入に起因するＳ／Ｎ比の低下等が見出されず、再現性、測定確度の高いものとなる。
【００４７】
本発明の方法は、図１に示すように、全体として、７つの工程で構成するプロセスとすることが好ましい。
【００４８】
第１工程：フラクション工程では、解析対象となるタンパク質を、予めプロテアーゼなどで特定のアミノ酸の位置で限定分解して、複数のペプチド断片を調製する。続いて、液体クロマトグラフィーにより、各ペプチド断片を含む、複数のフラクション（画分）を分取得する。得られた各ペプチド断片を含むフラクション（画分）は、その一部を用いて、質量分析測定用のサンプルプレート上に滴下・乾燥する。
【００４９】
第２工程：前処理工程では、サンプルプレート上にて、化学的手段によりＮ−アシル化、Ｏ−アシル化を行い、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解反応による副反応の抑制処理を施す。第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程では、化学的手段により、ペプチド断片のＣ末端のアミノ酸を逐次的に分解除去して、ペプチド鎖がＣ末端側から短縮された一連の反応産物を調製する。
【００５０】
次に、本発明の方法において、特徴的な工程、「脱塩工程」：反応試薬の除去工程を実施する。この「脱塩工程」では、「揮発性の塩」形成、その後、減圧もしくは不活性ガスの送気による反応系からの該「揮発性塩」の除去を行う。第４工程：後処理工程では、「脱塩工程」後、該サンプルプレート上の一連の反応産物に対して、化学的手段により加水分解反応を行い、Ｏ−アシル化保護の加水分解（脱保護）、Ｃ末端のオキサゾロン環の加水分解を実施する。
【００５１】
第５工程：質量分析工程では、サンプルプレート上に、マトリクスを塗布して、一連の反応産物とともに結晶を形成させ、該一連の反応産物の質量分析を実施する。この際、このＣ末端アミノ酸の逐次的分解がなされた一連の反応産物を含む試料と、液体クロマトグラフィーによって分取された未反応のペプチド断片との両方を、質量分析法により分子量を測定する。第６工程：スペクトル解析工程では、得られる質量スペクトルから、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解に伴う分子量減少を算出し、算出された一連の分子量減少量に基づき、逐次的に分解された一連のアミノ酸を特定する。すなわち、対象のペプチド断片のＣ末端アミノ酸配列情報を得る。さらに、未反応のペプチド断片の質量分析の際、内部標準ペプチドを混ぜて質量分析を行うことにより、精密測定することが好ましい。未反応のペプチド断片の分子量を基準として、一連の反応産物の質量スペクトルのうち、どのピークに基づき、Ｃ末端のアミノ酸配列の解析を進めるべきかの判定を行う。
【００５２】
以下、順に、以上の各工程について、その実施の形態を説明する。特に、本発明の方法において、特徴的な「脱塩工程」を設けることの技術的な意義、ならびに、「脱塩工程」において、「揮発性塩」を除去する際に利用されるメカニズムを詳細に説明する。
【００５３】
第１工程：フラクション工程
［ペプチド鎖の限定分解と、ペプチド断片の液体クロマトグラフィーによる分取］
本発明が対象とするペプチド鎖は、主に、酵素タンパク質、各種の受容体タンパク質、各種のペプチド性のリガンド分子などを構成するペプチド鎖であるが、特に、これらに限定されるものではない。また、少なくとも、α−アミノ酸残基が通常のペプチド結合で連結されている、一本鎖状のペプチド鎖となるものである限り、その起源に関しても、なんら制限はない。通常、ペプチド鎖を構成するアミノ酸は、天然に存在する２０種類のα−アミノ酸であるが、本発明が対象とするペプチド鎖は、上記の一般式（III）で示される５−オキサゾロン構造の形成が可能である限り、天然のα−アミノ酸の光学異性体や、その他の非天然型α−アミノ酸も含んでいてもよい。また、環状ペプチドである際、その環を開裂することで、一本鎖状のペプチド鎖とすることで、本発明の方法を適用することができる。
【００５４】
なお、対象とするペプチド鎖が、例えば、隣接するペプチド鎖のシステインとの間で、酸化型の−Ｓ−Ｓ−結合を形成する、あるいは、同一分子内で−Ｓ−Ｓ−結合を形成しているシステインを含む場合には、予め常用の還元処理を施し、かかる架橋を解消し、還元型のシステインを含むペプチド鎖に変換する。また、ペプチド鎖中に存在する還元型のシステインに対しては、その側鎖のスルファニル基（−ＳＨ）にカルボキシメチル化やピリジルエチル化などを施し、予めその保護を行う。
【００５５】
本発明の方法においては、ペプチド鎖を構成する第ｉ番目のアミノ酸残基の種類を、該第ｉ番目のアミノ酸残基の式量：ΔＭ（Ｎi）に基づき特定する。その際、例えば、ＡｓｐとＡｓｎ、ならびに、ＧｌｕとＧｌｎの分子量差は、１であるので、質量分析によって測定されるペプチド鎖に由来するイオン種の分子量：ｍ／ｚは、少なくとも、その分子量ｍ／ｚの測定精度は、１より高いことが必要である。その測定精度を達成する上では、質量分析を行う際、実際に測定されるペプチド鎖に由来するイオン種の分子量：ｍ／ｚは、少なくとも、ｍ／ｚ≦５０００の範囲、より好ましくは、ｍ／ｚ≦４０００の範囲とすることが望ましい。すなわち、実際に測定されるペプチド鎖の鎖長は、５０アミノ酸残基以下、より好ましくは、４０アミノ酸残基以下とすることが望ましい。
【００５６】
一方、解析対象となるタンパク質を構成するペプチド鎖の鎖長は、多くの場合、５０アミノ酸残基を超えているため、そのペプチド鎖を予め切断して、複数個のペプチド断片とした上で、個々のペプチド断片について、そのＣ末端アミノ酸配列の特定を行う。
【００５７】
先ず、解析対象とする一本鎖状のペプチド鎖を断片化して、個々の断片の鎖長が前記の範囲となる、複数のペプチド断片を調製する。このペプチド鎖の断片化処理では、例えば、特定のアミノ酸残基を認識して切断するプロテアーゼなどを利用して、ペプチド鎖を限定分解して、複数のペプチド断片を調製することが好ましい。ペプチド鎖の限定分解に利用されるプロテアーゼとしては、その切断部位が、アミノ酸残基特異的であれば、特に限定されない。なお、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基側で切断するプロテアーゼを利用すると、ペプチド鎖の断片化処理を行った際、調製される複数のペプチド断片は、Ｃ末端側の断片を除き、残るペプチド断片のＣ末端には、特定のアミノ酸残基が存在する。その場合、各ペプチド断片のＣ末端アミノ酸配列を特定した際、該ペプチド断片のＣ末端には、特定のアミノ酸残基が存在しないものは、唯一つＣ末端側の断片のみとなるはずである。換言すると、この特徴を利用すると、一本鎖状のペプチド鎖を断片化して調製される、複数のペプチド断片のなかから、Ｃ末端側の断片を特定することが可能である。前記の利点を考慮すると、一本鎖状のペプチド鎖を断片化する際、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基側で切断するプロテアーゼは、好適に利用できる。
【００５８】
例えば、ペプチド鎖中のＬｙｓやＡｒｇのカルボキシル基側で切断するトリプシンや、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐといった大きな疎水性の側鎖に特異的なキモトリプシン等の動物由来の消化酵素、さらには、種々の微生物由来のプロテアーゼを使用することができる。微生物由来のプロテアーゼとしては、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｖ８株から調製されるプロテアーゼＶ８は、Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基側でペプチド結合を特異的に切断する。マイタケより抽出されるメタルプロテアーゼは、ＬｙｓおよびＡｒｇの一部を認識し、そのアミノ基側のペプチド結合を特異的に切断する。これらのその切断部位が、アミノ酸残基特異的であるプロテアーゼは、第１工程における、ペプチド鎖の断片化処理に利用することができる。
【００５９】
なお、理想的には、上記のプロテアーゼを利用する、ペプチド鎖の断片化処理を施すことで、元のペプチド鎖から、各ペプチド断片は、等量的に生成される。すなわち、理想的には、生成される各ペプチド断片のモル量は、元のペプチド鎖のモル量と等しくなっている。この各ペプチド断片を含む混合液中には、断片化処理に使用したプロテアーゼ、ならびに、該プロテアーゼ・タンパク質の自己消化によって生成されるペプチドが混入している。その際、該プロテアーゼ・タンパク質の自己消化によって生成されるペプチドは、予め判明しているので、次段のペプチド断片の分取操作を行う際、目的とする各ペプチド断片との区別は容易に行える。
【００６０】
続いて、ペプチド鎖の断片化処理により調製される、複数個のペプチド断片を分取する。ペプチド断片の分取は、通常、液体クロマトグラフィーにより、各ペプチド断片を分離し、個々のペプチド断片を含む画分を分取する。ペプチド断片の分取に利用される「液体クロマトグラフィー」は、液体を移動相とするクロマトグラフィーによる分離手法であり、一般に、固定相カラムを選択することによって、加圧下で操作が可能な高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が利用される。一般に、ペプチド断片の分離機構は、分配、吸着、イオン交換、サイズ排除等の種々の機構に分類される。この第１工程において、好適に使用されるカラムは、逆相固定相で分配によって分離され、ペプチド断片試料はより極性の低い固定相に保持され、極性を持つ移動相によって、個々のペプチド断片のカラムに対する親和性の差違に基づき、分離して溶出可能なものである。例えば、ＯＤＳ（オクタデシルシリル基）を備えるケイ素化合物を分離用担体とする分離カラムを用いることができる。
【００６１】
近年、タンパク質を対象とする質量分析法、例えば、エレクトロスプレーイオン化やＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳなどの分析システムでは、試料中に含まれる、複数種のタンパク質を「液体クロマトグラフィー」で分離し、その分離されたタンパク質を引き続き、質量分析することが可能な装置構成を具えるものが多い。その用途に適合する質量分析装置に、多くの試料を適切な状態で供給するため、すなわち、ハイスループット分析に適したクロマトグラフィー及び分取システムが開発されている。特に、少量の試料液を対象として、流速が１０００μｌ／分以下のマイクロ液体クロマトグラフィー（マイクロＬＣ）や、流速が１０００ｎｌ／分以下のナノ液体クロマトグラフィー（ナノＬＣ）が既に実用化されており、本発明における第１工程における、ペプチド断片の分取に適用することができる。特に、ナノＬＣは、微量サンプルでかつ微少量の点状塗布（スポッティング）が可能であり、本発明の方法において、分取されたペプチド断片を含む溶液複数種を、同一のサンプルプレート上に並列的にスポットする形態を採用する際、個々のスポットに適切な試料量を提供する手段として利用できる。
【００６２】
第２工程：前処理工程
［サンプルプレート上における、各ペプチド断片に対するＮ−アシル化、Ｏ−アシル化保護］
上記第１工程で分取される各ペプチド断片を含む画分の溶液を、質量分析測定用のサンプルプレート上に滴下乾燥し、各ペプチド断片の乾燥試料とする。この「質量分析測定用のサンプルプレート」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法による質量分析を行うために、測定対象のペプチドを含む試料をスポッティングし、乾燥した後、マトリクス材料を含む液を滴下し、結晶化したマトリクス中にペプチドが混合したサンプルを調製するプレートである。本発明では、ペプチド断片の乾燥試料に対して、このサンプルプレート上において、前処理工程、Ｃ末端逐次分解反応工程、反応試薬の除去工程（脱塩工程）、後処理工程を実施するため、サンプルプレート表面は、これらの各工程で使用される試薬に対して耐性を有する素材で構成する。例えば、その表面に、白金や金メッキによる保護が施されたサンプルプレートを用いることが好ましい。
【００６３】
本発明においては、上記第１工程で分取される各ペプチド断片を、同じサンプルプレートの表面に、並列的にスポットした上で、同時にＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応を行い、各スポット点で生成される反応産物について、質量分析を行う形態を採用することが好ましい。すなわち、解析対象のペプチド鎖を断片化することで調製される、複数のペプチド断片に関して、そのＣ末端アミノ酸配列を、同じサンプルプレート上において、並列的に解析する形態を採用することが好ましい。
【００６４】
各ペプチド断片は、反応性の官能基として、ペプチド鎖のＮ末端にアミノ基（−ＮＨ2）に加えて、Ｌｙｓ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）−ＣＯ−）の側鎖のアミノ基、また、Ｓｅｒ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−ＣＯ−）、Ｔｈｒ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ3）ＯＨ）−ＣＯ−）の側鎖のヒドロキシル基（−ＯＨ）、Ｔｙｒ残基（−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＯＨ）−ＣＯ−）のフェノール性ヒドロキシル基（−ＯＨ）を有する場合がある。第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程を行う際、これらの反応性官能基に対して、不要な副次反応が進行することを回避するため、予め、アミノ基に対しては、Ｎ−アシル化保護、ヒドロキシル基に対しては、Ｏ−アシル化保護を施す。
【００６５】
このＮ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施す前処理工程では、
サンプルプレート上にスプットされている、ペプチド断片の乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度において、
アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸とを作用させ、
該ペプチド断片のＮ末端のアミノ基、ならびにＬｙｓ残基側鎖のアミノ基に対して、Ｎ−アシル化を行う方法を採用することができる。その際、第２工程において、Ｎ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施す前処理工程で利用するアルカン酸無水物と、その後、第３工程で実施するＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応で利用するアルカン酸無水物とは、同じアルカン酸無水物を用いることが好ましい。具体的には、Ｎ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施す前処理反応では、アルカン酸無水物とアルカン酸とを蒸気として、ペプチド鎖の乾燥試料に供給して、アシル化反応を進めるため、適正な蒸気圧を得る上では、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解工程で利用するアルカン酸無水物と、同じアルカン酸無水物を好適に利用できる。加えて、このアルカン酸無水物は、乾燥雰囲気下、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度では、ペプチドの切断等の不要な副次反応を引き起こすには、その反応性は十分に低く、前処理工程においては、共存させるアルカン酸は、パーフルオロアルカン酸と比較して、その酸触媒作用は格段に劣るため、不要な副次反応を引き起こすことなく、Ｎ−アシル化保護、Ｏ−アシル化保護を施すことが可能となる。
【００６６】
なお、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基をＮ−アシル化保護する際には、ペプチド鎖中に存在するＬｙｓ残基側鎖のアミノ基に対しても、Ｎ−アシル化保護が同時に進行する。さらには、ペプチド鎖中に存在するＳｅｒ残基ならびにＴｈｒ残基側鎖のヒドロキシル基においても、Ｏ−アシル化反応が進み、その保護がなされる。その他、ペプチド鎖中に存在するＴｙｒ残基側鎖のフェノール性ヒドロキシル基も、その反応性は相違するものの、部分的にＯ−アシル化がなされる。
【００６７】
なお、この前処理工程で使用する、アルカン酸無水物とアルカン酸との組み合わせは、不要な副次反応、例えば、ペプチド鎖の途中での切断を生じる懸念はほとんどないものであるが、その反応温度は、１０℃〜６０℃の範囲に選択される温度、より好ましくは、かかる反応温度は、室温付近、あるいは、室温より僅かに高い範囲内に選択することが好ましい。すなわち、前処理工程の反応温度は、１５℃〜５０℃の範囲に選択することが好ましい。また、前記アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物中における、アルカン酸の添加比率は、アルカン酸無水物とアルカン酸との合計した体積に対して、２〜１０体積％の範囲、具体的には、５体積％に選択することが好ましい。
【００６８】
また、アルカン酸無水物と、アルカン酸との組み合わせは、アルカン酸無水物として、該アルカン酸に由来する酸無水物を用いることが好ましい。すなわち、アルカン酸無水物：（ＲＣＯ）2Ｏとアルカン酸：Ｒ’ＣＯＯＨとの間では、下記のような不均化反応が起こる。
【００６９】
（ＲＣＯ）2Ｏ＋Ｒ’ＣＯＯＨ → ＲＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ’＋ＲＣＯＯＨ
上記Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応で導入されるアシル基は、アルカン酸無水物に由来するアシル基である。その際、前記の不均化反応で生成する、非対称なＲＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ’が関与すると、アルカン酸に由来するアシル基が導入される。アルカン酸無水物として、該アルカン酸に由来する酸無水物を用いる際には、不均化反応で生成するアルカン酸無水物は、当然、元の対称なアルカン酸無水物と同じとなるので、導入されるアシル基は一種類となる。Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応で導入されるアシル基が二種類となると、質量分析を行った際、その導入されるアシル基の違いに起因して、二つのイオン種が観測される。本発明においては、一連の反応産物に由来するイオン種として、単一のピークであることが好ましいので、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応で導入されるアシル基が一種類となる反応条件を選択することが好ましい。すなわち、アルカン酸無水物と、アルカン酸との組み合わせは、アルカン酸無水物として、該アルカン酸に由来する酸無水物を用いることが好ましい。
【００７０】
さらに、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応に伴って、下記のように、アルカン酸無水物に由来するアルカン酸が生成する。
【００７１】
（ＲＣＯ）2Ｏ＋（−ＮＨ2） → ＲＣＯＯＨ＋（−ＮＨ−ＯＣＲ）
従って、ペプチド断片の近傍に存在するアルカン酸の総量（存在確率）が増加する。この酸触媒として機能するアルカン酸の局所的な濃度が極端に増加すると、不要な副次反応、例えば、アミノ基上に、二つのアシル基が導入される現象を引き起こす可能性がある。気相から、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸を供給する形態を選択すると、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化反応に伴って生成するアルカン酸は、気相中におけるアルカン酸分子の分圧と平衡するように、蒸散する。そのため、アルカン酸の局所的な濃度が極端に増加する現象は抑制される。
【００７２】
例えば、液滴状のアルカン酸無水物とアルカン酸を供給する形態を採用する際には、生成するアルカン酸が速やかに蒸散することが可能な状況を維持することが好ましい。例えば、系内に、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物を配置し、気相中のアルカン酸分子の分圧を制御することで、この液滴中に含まれるアルカン酸の濃度をその分圧と平衡させることが好ましい。
【００７３】
前処理工程において、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸を供給する形態を選択する際には、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、ペプチド断片の乾燥試料に蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。すなわち、この低い温度において、気相中に存在するアルカン酸無水物とアルカン酸と平衡させた後、ペプチド断片の乾燥試料の温度を目的とする反応温度まで上昇させる。この低い温度に保持する間に、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸は、ペプチド断片の乾燥試料に吸着されるが、その際、例えば、Ａｒｇ残基の側鎖上には、下記のような形態でアルカン酸が吸着される。
【００７４】
【化４】
【００７５】
また、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、Ｌｙｓ残基の側鎖上のアミノ基上では、下記のような形態でアルカン酸が吸着される。
【００７６】
【化５】
【００７７】
例えば、Ａｒｇ残基の側鎖のウリジル基と、他のペプチド鎖上のＡｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖上のカルボキシル基の間で、塩結合が形成する現象を回避することができる。
【００７８】
また、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖上のカルボキシル基と、アルカン酸無水物：（ＲＣＯ）2Ｏとの間で、不均化反応が生じて、非対象な酸無水物構造：−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲが形成され、稀に、他のペプチド鎖のＮ末端のアミノ基、Ｌｙｓ残基の側鎖上のアミノ基と反応を起こす現象を回避することはできる。
【００７９】
この前処理工程の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる液状混合物の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【００８０】
一方、前処理工程を終了する時点では、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【００８１】
供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げると、気相中に存在するアルカン酸無水物とアルカン酸の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、アルカン酸無水物とアルカン酸は、気相中に存在するアルカン酸無水物とアルカン酸の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【００８２】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【００８３】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【００８４】
第３工程：Ｃ末端逐次分解反応工程
［サンプルプレート上における、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護済、各ペプチド断片のＣ末端アミノ酸の逐次的分解反応］
サンプルプレート上で、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護を施したペプチド断片のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して、一連の反応産物を含む混合物を調製する。
【００８５】
その際に利用される、Ｃ末端アミノ酸の逐次的分解方法は、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護を施したペプチド断片の乾燥試料に対して、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸少量とを組み合わせた反応試薬を利用し、穏和な条件でＣ末端アミノ酸の分解を行う方法である。その反応方法は、例えば、本願出願人により先に特許出願され、既に登録されている、特許第３５３４１９１号公報に開示されている。この特許第３５３４１９１号公報に開示される内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【００８６】
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解除去する工程においては、
対象とするペプチド鎖の乾燥試料に対して、乾燥雰囲気下、１５℃〜８０℃の範囲に選択される温度において、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物より供給される、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸とを作用させる。パーフルオロアルカン酸を触媒として、アルカン酸無水物が作用することで、下記の二段階の反応が進行する。
【００８７】
まず、パーフルオロアルカン酸の存在下、アルカン酸無水物がペプチド鎖のＣ末端に作用することで、反応式（Ｉ）で表記される脱水反応：
【００８８】
【化６】
【００８９】
により、Ｃ末端アミノ酸から反応中間体として、５−オキサゾロン環構造が形成される。次いで、更に、アルカン酸無水物がこの５−オキサゾロン環に作用し、反応式（II）で表記される反応：
【００９０】
【化７】
【００９１】
が進行し、結果的に、Ｃ末端アミノ酸の選択的な分解反応が達成される。その後、Ｃ末端に生成している酸無水物構造を利用して、５−オキサゾロン環構造が形成される。
【００９２】
その際、パーフルオロアルカン酸をプロトン供与体として機能させることで、下記する反応式（Ｉａ）：
【００９３】
【化８】
【００９４】
で示されるケト−エノール互換異性化の過程でエノール型をとる比率を高めている。
【００９５】
一方、アルカン酸無水物は、Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を非対称型酸無水物構造へと変換し、活性化を行う。さらに、エノール型において、表出されているヒドロキシル基（−ＯＨ）と、Ｃ末端の非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）とが反応する結果、分子内エステル結合が形成され、５−オキサゾロン環が完成される。パーフルオロアルカン酸が示す高いプロトン供与能を利用することで、ケト−エノール互換異性化を促進する結果、かかる反応は、穏和な温度条件で進行でき、反応温度を１５℃〜６０℃の範囲に選択することが可能となっている。なお、かかる反応温度は、室温付近、あるいは、室温より僅かに高い範囲内に選択することが好ましく、より具体的には、１５℃〜５０℃の範囲に選択することがより好ましい。
【００９６】
一方、本発明にかかるＣ末端アミノ酸の選択的な分解方法において、利用されるパーフルオロアルカン酸は、そのプロトン供与能を利用するものであり、該パーフルオロアルカン酸の示すｐＫａは、０．３〜２．５の範囲であるパーフルオロアルカン酸を用いることが好ましい。
【００９７】
加えて、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を、乾燥ペプチド試料へ供給する形態を採用する場合、１５℃〜８０℃の範囲に選択する前記温度において、所望の蒸気圧を得られる揮発性に優れたパーフルオロアルカン酸であることが望ましい。その観点からも、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸は、より適するものであり、さらには、直鎖状の炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸が、より適するものであり、具体的には、トリフルオロ酢酸（ＣＦ3ＣＯＯＨ）、ペンタフルオロプロパン酸（ＣＦ3ＣＦ2ＣＯＯＨ）、ヘプタフルオロブタン酸（ＣＦ3ＣＦ2ＣＦ2ＣＯＯＨ）を利用することがより望ましい。
【００９８】
利用されるアルカン酸無水物は、反応温度まで昇温した際、適正な蒸気圧を生じる限り、種々のものが利用可能である。一方、反応温度を前記する好適な範囲、例えば、１５℃〜５０℃の範囲に選択する際に、十分な蒸気圧を与えるものが好ましく、従って、炭素数２〜４のアルカン酸の対称型酸無水物を用いることが好ましい。なかでも、前記対称型酸無水物として、炭素数２〜４の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物を用いることがより好ましく、特には、炭素数２の直鎖アルカン酸の対称型酸無水物、すなわち、無水酢酸が好適に利用できる。かかるアルカン酸無水物は、Ｃ末端カルボキシル基の活性化、５−オキサゾロン環構造の開裂に利用されるため、その際、立体障害を生じることの少ないものが好ましく、その点でも、無水酢酸などがより好適である。
【００９９】
また、アルカン酸無水物は、反応の進行に従って、消費されるため、気相から蒸気状アルカン酸無水物として供給することで、消費されたアルカン酸無水物を補いつつ反応を行うことが望ましい。一方、分子内エステル結合が形成され、５−オキサゾロン環が生成される反応においては、アルカン酸無水物に由来するアルカン酸は副生される。その際、気相中には、元々、アルカン酸分子は存在していないため、副生されるアルカン酸は揮発して、気相へ移行する。系内に、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の供給源として、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加した液状混合物を置くと、気相中のアルカン酸は、この液状混合物中に溶解する。その結果、気相中に存在するアルカン酸分子の分圧は低く抑えられるため、副生されるアルカン酸の揮発は継続する。
【０１００】
蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の供給源には、利用するアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の種類によって、例えば、反応温度における、その飽和蒸気圧に応じて、目的とする気相中の分圧比（気相濃度比）を達成できる混合比率の液状混合物を適宜利用する。例えば、前記アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物中における、パーフルオロアルカン酸の含有比率は、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸との合計体積に対して、１〜２０体積％の範囲、より好ましくは、３〜１０体積％の範囲に選択することが望ましい。
【０１０１】
Ｃ末端逐次分解反応工程において、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を供給する形態を選択する際には、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる液状混合物の温度に対して、当初、Ｎ−アシル化保護済ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、Ｎ−アシル化保護済ペプチド断片の乾燥試料に蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。
【０１０２】
このＣ末端逐次分解反応工程の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【０１０３】
一方、Ｃ末端逐次分解反応工程を終了する時点では、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【０１０４】
供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度を下げると、気相中に存在するアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸は、気相中に存在するアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【０１０５】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【０１０６】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【０１０７】
一方、液滴状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を供給する形態を採用する際には、反応の進行に伴って生成するアルカン酸が速やかに蒸散することが可能な状況を維持することが好ましい。例えば、系内に、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる液状混合物を配置し、気相中のアルカン酸分子をこの液状混合物中に溶解させる。また、気相中のアルカン酸無水物、パーフルオロアルカン酸の分圧を制御することで、この液滴中に含まれるアルカン酸無水物、パーフルオロアルカン酸の濃度をその分圧と平衡させることが好ましい。
【０１０８】
「脱塩工程」：反応試薬の除去工程
［サンプルプレート上における、アルカン酸無水物の加水分解と、生成するアルカン酸の「揮発性塩」への変換、「揮発性塩」の揮発除去］
前記のＣ末端逐次分解反応工程を行うことで、サンプルプレート上のスポット点には、Ｎ−アシル化、Ｏ−アシル化保護を施したペプチド断片のＣ末端アミノ酸を逐次的に分解して、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料が生成されている。この一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料には、未反応の反応試薬、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸、ならびに、副生物のアルカン酸は吸着して、残留している。
【０１０９】
一方、一連の反応産物は、そのペプチド鎖のＣ末端は、５−オキサゾロン環構造のものと、Ｃ末端の非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に留まっているものとが混在した状態となっている。さらには、逐次的に分解されたアミノ酸も、含まれている。なお、逐次的に分解されたアミノ酸のカルボキシル基に対しても、アルカン酸無水物による活性化がなされ、相当部分は、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されている。加えて、一連の反応産物のペプチド鎖中に存在する、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基に対しても、アルカン酸無水物による活性化がなされ、相当部分は、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されている。
【０１１０】
「脱塩工程」では、まず、サンプルプレート上において、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料に対して、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を接触させて、塩基性含窒素芳香環化合物を触媒として利用し、残留する未反応のアルカン酸無水物を加水分解する。加水分解により生成するアルカン酸は、傍に存在している塩基性含窒素芳香環化合物と、塩を形成する。このアルカン酸と、塩基性含窒素芳香環化合物との塩は、例えば、下記に示すような、該塩基性含窒素芳香環化合物の環上に存在する窒素原子に、アルカン酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が配向した形状である。
【０１１１】
【化９】
【０１１２】
一連の反応産物中、Ｃ末端の非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に留まるものも、同様に、加水分解を受ける。また、一連の反応産物のペプチド鎖中に存在する、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基のうち、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されているものも、同様に加水分解を受ける。さらに、逐次的に分解されたアミノ酸のカルボキシル基のうち、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されているものも、同様に加水分解を受ける。その際、生成するアルカン酸と、塩基性含窒素芳香環化合物とは塩を形成する。
【０１１３】
一方、加水分解で再生される、一連の反応産物のペプチド鎖のＣ末端のカルボキシル基、ペプチド鎖中に存在する、Ａｓｐ残基、Ｇｌｕ残基の側鎖のカルボキシル基も、塩基性含窒素芳香環化合物との塩構造を形成する。また、逐次的に分解されたアミノ酸も、そのカルボキシル基は、塩基性含窒素芳香環化合物との塩構造を形成する。その塩構造は、例えば、下記に示すような構造となっている。
【０１１４】
【化１０】
【０１１５】
塩基性含窒素芳香環化合物は、弱い塩基であり、また、アルカン酸も弱い酸であるので、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される塩は、「揮発性塩」となっている。例えば、ピリジン・酢酸塩：Ｃ5Ｈ5Ｎ：ＨＯＯＣＣＨ3は、気相中のピリジン分子（Ｃ5Ｈ5Ｎ）と酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）と解離平衡にある。従って、気相中の酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）の分圧が低下すると、ピリジン・酢酸塩：Ｃ5Ｈ5Ｎ：ＨＯＯＣＣＨ3は、解離し、酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）を気相中に放出する。
【０１１６】
系内に、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子の供給源として、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液を存在させると、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」から気相へと放出されるアルカン酸分子は、この塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液に吸収される。従って、気相中のアルカン酸分子の分圧は低い状態に保たれるため、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」の解離は継続される。最終的には、サンプルプレート上において、一旦、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」が形成されるが、その後、この解離過程によって、アルカン酸のほぼ全ては、気相へと放出され、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液中に吸収される。
【０１１７】
また、Ｎ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される塩も、同様に、「揮発性塩」となっている。アルカン酸と比較すると、平衡蒸気圧は大幅に低いが、同様の機構を介して、微量なＮ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨ−Ｃ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）も、気相へと放出され、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液中に吸収される。一方、そもそも、この「脱塩工程」の温度では、気化することが不可能である、一連の反応産物は、そのカルボキシル基は、塩基性含窒素芳香環化合物との塩を形成した状態に留まっている。
【０１１８】
従って、この「脱塩工程」を終了した時点では、サンプルプレート上には、アルカン酸無水物、パーフルオロアルカン酸、アルカン酸は実質的に吸着していない状態となっている。
【０１１９】
「脱塩工程」の温度は、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を作用させることで、アルカン酸無水物の加水分解、ならびに、Ｎ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）のカルボキシル基のうち、非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）に変換されているものの加水分解は速やかに進行するが、５−オキサゾロン環構造中の環内のエステル構造の加水分解は僅かしか進行しない条件を選択する。その温度は、高くとも、８０℃以下、例えば、５０℃〜７０℃の範囲に選択することが好ましい。
【０１２０】
利用される塩基性含窒素芳香環化合物としては、高い濃度の水溶液を調製可能なものが好ましく、また、室温において、液体であるものが好ましい。従って、単環の含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジン（沸点１１５〜１１６℃）、γ−コリジン（２，４，６−トリメチルピリジン：沸点：１７０．５℃、６５℃（３１ｍｍＨｇ））を利用することが好ましい。
【０１２１】
「脱塩工程」において、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を供給する形態を選択する際には、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度に対して、当初、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、乾燥試料に蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。
【０１２２】
この「脱塩工程」の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【０１２３】
一方、「脱塩工程」を終了する時点では、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【０１２４】
供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度を下げると、気相中に存在する塩基性含窒素芳香環化合物と水分子の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、塩基性含窒素芳香環化合物と水分子は、気相中に存在する塩基性含窒素芳香環化合物と水分子の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【０１２５】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、塩基性含窒素芳香環化合物の水溶液の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【０１２６】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【０１２７】
加えて、一旦、アルカン酸と塩基性含窒素芳香環化合物とで構成される「揮発性塩」を形成した後、サンプルプレート上には、加熱しつつ、減圧処理、あるいは、不活性ガスの送気操作を施すことで、熱的に解離し、気相へ放出されるアルカン酸分子を系外に排出することで、「揮発性塩」の「揮発」を促進することができる。この減圧処理、あるいは、不活性ガスの送気操作を施すと、「揮発性塩」を構成しているアルカン酸分子の除去、ならびに、塩基性含窒素芳香環化合物の除去が同時に行える。
【０１２８】
例えば、ピリジン・酢酸塩は、弱塩基と弱酸との塩の形態であるが、ピチジウムカチオン：Ｃ5Ｈ5ＮＨ+と、酢酸アニオン：ＣＨ3ＣＯＯ-とに電荷分離した状態ではなく、ピリジンの窒素原子に対して、酢酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が、水素結合型の分子間結合を形成している形態（複合体）に近い。例えば、ピリジン・塩酸塩：Ｃ5Ｈ5Ｎ・ＨＣｌは、この塩結合を維持して、蒸散することが可能であるが、ピリジン・酢酸塩の「揮発」は、前記の複合体を解消して、それぞれの分子が蒸散する形態であると推定される。気相中の酢酸分子の分圧が極めて低く、ピリジンの分圧が相対的に高い状況下では、ピリジン・酢酸塩が「解離」した際、酢酸分子が先ず蒸散し、その後、ピリジン分子が脱着する結果、見かけ上、ピリジン・酢酸塩の「揮発」がなされる。
【０１２９】
第４工程：後処理工程
［サンプルプレート上における、一連の反応産物のＣ末端の５−オキサゾロン環の加水分解］
上記の「脱塩工程」を施すことで、アルカン酸無水物、アルカン酸、パーフルオロアルカン酸が実質的に存在しない状態とした上で、一連の反応産物のＣ末端の５−オキサゾロン環の加水分解を行う。この５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解を行う際、ペプチド鎖中に存在するＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基の側鎖に存在するヒドロキシル基に施されているＯ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解もなされる。また、ペプチド鎖中に存在するＴｙｒ残基の側鎖に存在するフェノール性ヒドロキシル基に施されているＯ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解もなされる。
【０１３０】
５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解、ならびに、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換を行うため、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を作用させる。すなわち、塩基性含窒素芳香環化合物と比較し、塩基性が格段に高い、第３アミン化合物を利用することで、５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解を速やかに進め、さらに、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換をも達成できる。
【０１３１】
なお、塩基性含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジンを利用し、１００℃程度の高い温度で処理すると、５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解はある程度進行するが、その後、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換は、効率的には進行しない。一方、ペプチド鎖中に存在するＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基の側鎖に存在するヒドロキシル基に施されているＯ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解は、塩基性含窒素芳香環化合物、例えば、ピリジンを利用し、１００℃程度の高い温度で処理すると、相当の程度進行する。
【０１３２】
本発明の方法では、「脱塩工程」において、一連の反応産物のモル量と比較して、相対的には、多量に残余しているアルカン酸無水物、ならびに、一連の反応産物のペプチド鎖上に形成されている非対称型酸無水物構造（−ＣＯ−Ｏ−ＯＣＲ）を予め加水分解し、生成するアルカン酸を、塩基性含窒素芳香環化合物との「揮発性塩」として、除去している。その後、後処理工程において、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を作用させ、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解、ならびに、５−オキサゾロン環の環内のエステル結合の加水分解、および、エノール構造（−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−）からケト構造（−ＣＯ−ＮＨ−）への変換を行う。その結果、一連の反応産物のペプチド鎖は、そのＣ末端は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）であり、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）も除去されたものとなっている。換言すると、一連の反応産物において、そのＣ末端は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）であり、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）も除去された主成分以外に、副次的な成分、例えば、そのＣ末端に５−オキサゾロン環構造を残しているもの、あるいは、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）が部分的に残っているものなどが存在する比率の低減がなされている。
【０１３３】
なお、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）を加水分解する際、アルカン酸が副生するが、その生成量は、一連の反応産物のモル量に比例するものとなっている。また、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解に伴う、副生成物のＮ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）も、その相当量が残っているが、Ｎ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）の量も、本質的に一連の反応産物のモル量に比例するものとなっている。
【０１３４】
後処理工程では、使用される第３アミン化合物と、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解により副生するアルカン酸とは、「不揮発性の塩」を形成する。また、Ｃ末端アミノ酸の逐次的な分解に伴う、副生成物のＮ−アルカノイルアミノ酸（ＲＣＯ−ＮＨＣ（Ｒ１）ＣＯＯＨ）も、第３アミン化合物と、「不揮発性の塩」を形成する。しかし、これらの「不揮発性の塩」の総量は、一連の反応産物のモル量に比例したものとなっている。これら「内因性」の起源を有する「不揮発性の塩」は、その量は、一連の反応産物のモル量に比例するため、その絶対量は僅かである。
【０１３５】
それに対して、Ｃ末端逐次分解反応工程を終えた時点で、残余する反応試薬、アルカン酸無水物、アルカン酸、パーフルオロアルカン酸の量は、一連の反応産物のモル量に比較して、大過剰な量となっている。仮に、「脱塩工程」を実施せず、第３アミン化合物を使用する後処理工程を実施すると、これら「外因性」の起源を有する、アルカン酸、パーフルオロアルカン酸と第３アミン化合物で構成される「不揮発性の塩」の総量は、一連の反応産物のモル量に比較して、大過剰な量となってしまう。
【０１３６】
このような「外因性」の起源を有する「不揮発性の塩」が、一連の反応産物のモル量に比較して、大過剰な量混入していると、質量分析時に使用されるマトリクス材料、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてマトリクスを作製した際、マトリクスの結晶化を顕著に低下させる要因となる。また、目的とする一連の反応産物に由来するイオン種のピーク強度を顕著に低下させ、例えば、Ｓ／Ｎ比を顕著に低下させる要因となる。
【０１３７】
それに対して、「脱塩工程」を予め実施することで、前記の「外因性」の起源を有する「不揮発性の塩」の生成を回避することが可能となっている。すなわち、「内因性」の起源を有する「不揮発性の塩」は混在しているが、その量は、一連の反応産物のモル量に比例するため、その絶対量は僅かであるため、例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を用いてマトリクスを作製した際、マトリクスの結晶化を低下させる要因とはならない。加えて、目的とする一連の反応産物に由来するイオン種のピーク強度の顕著な低下もなく、例えば、Ｓ／Ｎ比は十分に高く状態となる。
【０１３８】
なお、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を作用させ、ペプチド鎖のＣ末端の５−オキサゾロン環構造を元のアミノ酸に変換し、また、Ｏ−アシル化保護（エステル結合）の加水分解を行う方法は、例えば、本願出願人により先に特許出願され、既に登録されている、特許第３５３４１９１号公報に開示されている。この特許第３５３４１９１号公報に開示される内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【０１３９】
この後処理工程で利用される、第３アミン化合物としては、その水溶液から、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を目的とする分圧で供給できることが必要である。例えば、２−（ジメチルアミノ）エタノール（沸点１３５℃）などを利用することが好ましい。
【０１４０】
後処理工程において、蒸気状の第３アミン化合物と水分子を供給する形態を選択する際には、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度に対して、当初、一連の反応産物を含む混合物の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を低く設定して、乾燥試料に蒸気状の第３アミン化合物と水分子を吸着させる、反応試薬の吸着工程を設けることが好ましい。
【０１４１】
この後処理工程の開始時に設ける、吸着操作の際、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度に対して、当初、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で低く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃低く設定する。
【０１４２】
一方、後処理工程を終了する時点では、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度を下げ、一方、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高くなるように設定して、残余している反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を設けることが好ましい。
【０１４３】
供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度を下げると、気相中に存在する第３アミン化合物と水分子の分圧が低下する。ペプチド断片の乾燥試料に吸着する、第３アミン化合物と水分子は、気相中に存在する第３アミン化合物と水分子の分圧と平衡するように、脱離する。その際、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を相対的に高く設定することで、脱離が促進される。
【０１４４】
なお、この反応試薬の脱着工程では、供給源である、第３アミン化合物の水溶液の温度に対して、ペプチド断片の乾燥試料がスポットされているサンプルプレートの温度を、１〜１０℃の範囲で相対的に高く設定することが好ましい。例えば、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を５℃高く設定する。
【０１４５】
反応試薬の吸着工程、あるいは、反応試薬の脱着工程では、供給源の温度に対して、サンプルプレートの温度を独立に調節する必要がある。その際、サンプルプレートの温度調節は、例えば、公知のペルチェ素子等を用いた温度調節機構を利用することで容易に行うことができる。
【０１４６】
第５工程：質量分析工程
［ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法による、一連の反応産物の質量分析］
上記方法により調製される一連の反応産物を含む混合物を用いて、一連の反応産物の質量分析を行う。特に、本発明では、この一連の反応産物の分子量を同時に測定するため、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を適用して、一連の反応産物の質量分析を行うことが好ましい。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法では、ペプチド・サンプルを結晶マトリクス（例えば、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸：２−シアノ−３−（４−ヒドロキシフェニル）−２−プロヘン酸）中に分散させたサンプルを利用して、レーザ脱着過程を介してイオン化を行い、分析を行う。この測定サンプルにレーザ光を照射すると、レーザ光はマトリクス材料により吸収され、その励起エネルギーを分析対象分子（ペプチド）へと供給して、その脱着を起こさせる。また、このレーザ脱着過程において、ペプチドは、光学的に励起された結晶マトリクスからプロトン（Ｈ+）を受けて、イオン化する。典型的には、（Ｍ＋Ｈ）+タイプのイオン種を生ずる。
【０１４７】
このソフト・レーザ脱着過程を介して、ペプチド由来のイオン種は、気相に移行した後、電場の中で加速されて、ディテクタへと導かれる。サンプルプレート上の結晶マトリクスから脱着した、イオン種が、ディテクタまで飛翔して検出されるまでの飛行時間を測定する。すなわち、イオン化に利用されるパルス状のレーザ光の照射から、ディテクタにおいてイオン種が検出されるまでの時間を、高い精度で測定する。このイオンの飛行時間は、運動量（ｍｖ）、質量対電荷比（ｍ／ｚ）の平方根に依存するので、測定された飛行時間から、そのイオン種の質量対電荷比（ｍ／ｚ）を算出することができる。
なお、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を適用する質量分析では、結晶マトリクス中に分散されている分子種は、同時にイオン化されるため、一連の反応産物を一括して分析できる。その際、結晶マトリクス中に一連の反応産物以外に分子種が存在していると、相対的に一連の反応産物に由来するイオン種の生成量は低下する。例えば、アルカン酸と第３アミン化合物からなる不揮発性の塩が、多量に含まれていると、一連の反応産物に由来するイオン種の生成量は、大幅に低下する。アルカン酸と第３アミン化合物からなる不揮発性の塩が、多量に残存している際に引き起こされる、一連の反応産物に由来するイオン種のピークにおける、Ｓ／Ｎ比の大幅な低下には、この現象も関与していると推定される。
【０１４８】
第６工程：スペクトル解析工程
［一連の反応産物の質量分析結果に基づく、ペプチド断片のＣ末端アミノ酸配列の解析］
第５工程において、測定された各ペプチド断片から調製された、一連の反応産物に由来するイオン種、例えば、（Ｍ＋Ｈ）+タイプのイオン種の質量（ｍ／ｚ）を測定結果に基づき、各ペプチド断片：フラグメントＦiのＣ末端（Ｎi番目のアミノ酸）から逐次的に分解されたｊ番目のアミノ酸残基（Ｎi-j+1番目のアミノ酸残基）の式量：ΔＭ（Ｎi-j+1）を算定し、そのアミノ酸の種類を特定する。
【０１４９】
なお、ペプチド断片のＣ末端から逐次的分解された一連のアミノ酸を特定する際に用いられる解析方法は、本願出願人により先に特許出願され、既に、特開２００６−１８９２７７号公報として公開されている。この特開２００６−１８９２７７号公報に開示される内容は、参照により本願明細書中に組み込まれるものとする。
【０１５０】
以下に、具体例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。なお、下記の具体例は、本発明の最良の実施形態の一例を示唆するは、本発明の範囲は、かかる具体例により示唆される形態に限定されるものではない。
【０１５１】
（参考例１）
［サンプルプレート上に吸着している酢酸、無水酢酸に対する、蒸気状のピリジンと水分子を利用する「脱塩操作」による除去効果］
密閉容器中において、６０℃に加熱した５％酢酸無水酢酸溶液から蒸発する、蒸気状の酢酸と無水酢酸の雰囲気中に、質量分析用のサンプルプレートを４時間放置する。その間に、該サンプルプレートの表面には、蒸気状の酢酸と無水酢酸が吸着する。その後、この酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５２】
次いで、酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、同じく密閉容器中において、６０℃に加熱した１０％ジメチルアミノエタノール水溶液から蒸発する、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中に、２時間放置する。その間に、サンプルプレートの表面においては、吸着している酢酸と無水酢酸に対して、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子が気相から作用する。この蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子を作用させる処理を施した後、サンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５３】
なお、前記の蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子を作用させる処理を施す間に、無水酢酸に対して、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールの存在下に、水分子が作用すると、無水酢酸の加水分解が進行し、２分子の酢酸が生成される。従って、前記の加水分解によって、サンプルプレート表面に吸着していた無水酢酸は、系内で酢酸へと変換されると推定される。加えて、酢酸と、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールとは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：Ｎ（ＣＨ3）2−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨで表記できる付加塩を形成することが可能である。酢酸、ジメチルアミノエタノールは、室温では液体であるが、この付加塩化合物の融点は、少なくとも、６０℃以上であり、室温では、固体である。
【０１５４】
前記の二段階の処理を施したサンプルプレートの表面を観察したところ、処理前には清浄であった表面上に、図２Ａに示すような、白色の粉体状物質が付着している部位が散見される。この白色の粉体状物質は、前記の二段階の処理を施す間に、サンプルプレートの表面で生成した物質であり、酢酸とジメチルアミノエタノールの塩であると推定される。
【０１５５】
一方、５％酢酸無水酢酸溶液と１０％ジメチルアミノエタノール水溶液を、容積比率１：１で直接混合した混合液を調製する。シャーレ中にこの混合液を採り、別のサンプルプレートを混合液に浸し、その表面に前記混合液の極く薄い被膜を付着させる。この混合液の極く薄い被膜を付着させたサンプルプレートを、真空デシケータ中に入れ、真空ポンプで強制排気することで、前記混合液の極く薄い被膜中に含まれる水分を除去し、乾燥させる。この混合液中には、酢酸（沸点：１１８℃）、無水酢酸（沸点：１４０℃）、ジメチルアミノエタノール（沸点：１３５℃）ならびに水（沸点：１００℃）が含まれており、減圧状態に保持する間に、水分が除去され、濃縮される。その際、酢酸とジメチルアミノエタノールとで構成される塩化合物は、蒸散しないため、最終的に白色粉体として、析出し、乾燥状態でサンプルプレートの表面に残留する。前記真空デシケータ中おいて、乾燥処理を終えた後、サンプルプレートの表面を観察したところ、処理前には清浄であった表面上に、図２Ｂに示すような、白色の粉体状物質が付着している部位が散見される。酢酸（沸点：１１８℃）、無水酢酸（沸点：１４０℃）、ジメチルアミノエタノール（沸点：１３５℃）自体は、何れも、室温（２０℃）では液体であり、図２Ｂに示すような、このサンプルプレートの表面に付着している白色の粉体状物質（固体）は、酢酸とジメチルアミノエタノールとで構成される塩化合物であると推断される。
【０１５６】
さらに、別のサンプルプレートに対して、下記の三段階の処理を行い、その処理後の表面を観察した。
【０１５７】
先ず、密閉容器中において、６０℃に加熱した５％酢酸無水酢酸溶液から蒸発する、蒸気状の酢酸と無水酢酸の雰囲気中に、質量分析用のサンプルプレートを４時間放置する。その間に、該サンプルプレートの表面には、蒸気状の酢酸と無水酢酸が吸着する。その後、この酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５８】
次いで、酢酸と無水酢酸の吸着処理を施したサンプルプレートを、同じく密閉容器中において、６０℃に加熱した１０％ピリジン水溶液から蒸発する、蒸気状のピリジンと水分子の雰囲気中に、２時間放置する。その間に、サンプルプレートの表面においては、吸着している酢酸と無水酢酸に対して、蒸気状のピリジンと水分子が気相から作用する。この蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施した後、サンプルプレートを、前記密閉容器中に保持した状態で、室温（２０℃）まで放冷する。
【０１５９】
なお、前記の蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施す間に、無水酢酸に対して、ピリジン塩基の存在下に水分子が作用すると、無水酢酸の加水分解が進行し、２分子の酢酸が生成される。従って、前記の加水分解によって、サンプルプレート表面に吸着していた無水酢酸は、系内で酢酸へと変換されると推定される。
【０１６０】
なお、ピリジン自体は弱塩基（ｐＫａ５．１９）であり、酢酸とは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる、「揮発性塩」を形成することが可能である。すなわち、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる「揮発性塩」は、熱的に安定ではなく、酢酸とピリジンに解離して、蒸散することが可能である。従って、一旦、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる「揮発性塩」が形成されるが、気相中に存在する酢酸分子の分圧が低い場合、この「揮発性塩」は解離し、蒸気状のピリジンと酢酸へと変換される。
【０１６１】
前記蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施したサンプルプレートを、同じく密閉容器中において、６０℃に加熱した１０％ジメチルアミノエタノール水溶液から蒸発する、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中に、４時間放置する。仮に、サンプルプレートの表面に、酢酸、あるいは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：ＮＣ5Ｈ5で表記できる「揮発性塩」が吸着しているならば、表面において、酢酸と、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールとは、ＣＨ3ＣＯＯＨ：Ｎ（ＣＨ3）2−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨで表記できる付加塩が形成される。
【０１６２】
前記の三段階の処理を施したサンプルプレートの表面を観察したところ、図２Ｃに示すように、白色の粉体状物質が付着している痕跡は見出されなかった。すなわち、処理前の表面と同様に、清浄な表面を示していた。
【０１６３】
（参考例２）
［清浄なサンプルプレート表面において作製される、良好な結晶状態を示すマトリクス］
ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量分析の際、そのマトリクスとして多用される、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を、０．１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル水溶液中に溶解した溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）を、よく洗浄したサンプルプレート上に１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行った。前記の条件は、良好な結晶状態を得るための条件として、広く利用されている。図３Ａに、この典型的なＣＨＣＡの結晶化条件を用いて得られた、良好な結晶状態を示すマトリクスを観察した結果を示す。
【０１６４】
さらに、よく洗浄したサンプルプレート上に、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのアミノ酸配列からなるペプチド、ヒト・アンジオテンシン Ｉを含む標準ペプチド溶液（２ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ滴下し、乾燥した。その乾燥試料上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行って、該ペプチドが良好な結晶状態を示すマトリクス中に均一に混合されている試料を調製した。この試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを測定した結果を、図３Ｂに示す。この測定された質量スペクトル上には、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に主イオン種ピークが観測されている。また、測定された質量スペクトルにおいて、バックグランドのレベルは、十分に低く抑えられており、所謂、Ｓ／Ｎ比は十分に高い良好な測定結果となっている。
【０１６５】
（参考例３）
［サンプルプレート上に吸着している酢酸、無水酢酸に対する、蒸気状のピリジンと水分子を利用する「脱塩操作」による除去に伴う、良好な結晶状態を示すマトリクスの形成］
前記参考例１に記載する、二段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されるサンプルプレート上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾して、マトリクスを作製した。得られたマトリクスの結晶状態を観察した結果を、図４Ａに示す。図３Ａに示す良好な結晶状態を示すマトリクスと比較して、図４Ａに示すマトリクスは、粒が大きく、その結晶状態は理想的な状態とは異なっている。
【０１６６】
参考例１に記載する、二段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されるサンプルプレート上に、ヒト・アンジオテンシン Ｉを含む標準ペプチド溶液（２ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ滴下し、乾燥した。その乾燥試料上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行って、該ペプチドがマトリクス中に混合されている試料を調製した。この試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを測定した結果を、図４Ｂに示す。測定された質量スペクトルにおいて、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に存在する主イオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルを比較すると、所謂、Ｓ／Ｎ比は低い測定結果となっている。すなわち、バックグランドのレベルに対して、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に存在する主イオン種ピークの強度が相対的に弱くなっている。
【０１６７】
さらに、参考例１に記載する、三段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されていないサンプルプレート上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾して、マトリクスを作製した。得られたマトリクスの結晶状態を観察した結果を、図５Ａに示す。図３Ａに示す良好な結晶状態を示すマトリクスと比較して、図５Ａに示すマトリクスは、粒は同程度であり、その結晶状態は、図３Ａに示す良好な結晶状態と遜色のないものであった。
【０１６８】
参考例１に記載する、三段階の処理を施した結果、その表面に白色の粉体状物質の付着が見出されていないサンプルプレート上に、ヒト・アンジオテンシン Ｉを含む標準ペプチド溶液（２ｐｍｏｌ／μＬ）を１μＬ滴下し、乾燥した。その乾燥試料上に、上記のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液を１〜２μＬ滴下し、風乾させ結晶化を行って、該ペプチドがマトリクス中に混合されている試料を調製した。この試料について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを測定した結果を、図５Ｂに示す。測定された質量スペクトルにおいて、Ｍ／Ｚ＝１２９６．７の位置に存在する主イオン種ピークの強度と、バックグランドのレベルを比較すると、所謂、Ｓ／Ｎ比は十分に高い測定結果となっている。図３Ｂに示す質量スペクトルと比較して、図５Ｂに示す質量スペクトルにおける、バックグランドのレベルは、同程度に抑えられている。
【０１６９】
すなわち、サンプルプレートの表面に酢酸と無水酢酸の吸着処理を施した後、蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施すことにより、表面に吸着していた無水酢酸は、加水分解され、酢酸となる。その際、加水分解で生成した酢酸、ならびに、当初から吸着していた酢酸とは、ピリジンと「揮発性塩」を構成し、この処理の間に、加熱によって、「揮発」する。その結果、サンプルプレートの表面には、酢酸、あるいは、酢酸とピリジンとからなる「揮発性塩」が実質的に残余していない状態とできる。従って、その後、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中に保持しても、サンプルプレートの表面で、第３アミン型塩基である、ジメチルアミノエタノールと酢酸とからなる付加塩が生成し、残留することは無くなっている。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法は、解析対象のペプチドが、超微量サンプルである場合に、そのＣ末端アミノ酸配列の解析に用いる分析サンプルの調製を質量分析用のサンプルプレート上で行い、その後、質量スペクトルの測定を行う、サンプル調製と測定の自動化、機械化を行う際、好適な解析方法として利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】本発明にかかるペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法を構成する全体工程を模式的に示す図である。Ｃ末端逐次分解反応工程と、その後に実施される後処理工程との間に、Ｃ末端逐次分解反応工程で利用される反応試薬をより効率的に除去するため、予め、脱着処理を施し、さらに、僅かに残余する反応試薬：アルカン酸無水物、該アルカン酸無水物由来のアルカン酸、パーフルオロアルカン酸を、塩基性含窒素芳香環化合物と揮発性塩に変換した後、該揮発性塩を揮発、除去する「脱塩処理」の工程を設けている。
【図２】５％酢酸無水酢酸溶液と１０％ジメチルアミノエタノール水溶液の１：１の混合液の被膜で覆われたサンプルプレートを乾燥する結果、その表面に析出・付着する白色の粉体状物質の観察結果（図２Ａ）；蒸気状の酢酸と無水酢酸の雰囲気中に保持し、その表面に酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施したサンプルプレートを、その後、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理した際、乾燥後、サンプルプレートの表面に付着残余する白色の粉体状物質の観察結果（図２Ｂ）；酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施した後、蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施すことにより、表面に吸着していた無水酢酸を加水分解し、酢酸とピリジンとで構成される「揮発性塩」とした上で、揮発させ、除去する工程を設けることで、さらに、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理した際、乾燥後、サンプルプレートの表面に、白色の粉体状物質の生成・付着を回避した表面の観察結果（図２Ｃ）を、対比して示す図である。
【図３−１】清浄なサンプルプレートの表面において作製された、良好な結晶状態を示す、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量分析用のマトリクスの観察結果（図３Ａ）；清浄なサンプルプレートの表面において、ヒト・アンジオテンシン Ｉの乾燥試料と、良好な結晶状態を示すマトリクスを用いて調製したサンプルを用いて測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトル（図３Ｂ）を示す図である。
【図３−２】図３Ｂに示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを詳細に示す図である。
【図４−１】その表面に酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施し、その後、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理することで、乾燥後、表面に白色の粉体状物質の付着残余が生じているサンプルプレートの表面において、調製されたマトリクスの結晶状態の観察結果（図４Ａ）；前記表面に白色の粉体状物質の付着残余が生じているサンプルプレートの表面において、ヒト・アンジオテンシン Ｉの乾燥試料と、マトリクスを用いて調製したサンプルを用いて測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトル（図４Ｂ）を示す図である。
【図４−２】図４Ｂに示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを詳細に示す図である。
【図５−１】酢酸と無水酢酸を吸着する処理を施した後、蒸気状のピリジンと水分子を作用させる処理を施すことにより、表面に吸着していた無水酢酸を加水分解し、酢酸とピリジンとで構成される「揮発性塩」とした上で、揮発させ、除去する工程を設けることで、さらに、蒸気状のジメチルアミノエタノールと水分子の雰囲気中で処理した際、乾燥後、サンプルプレートの表面に、白色の粉体状物質の生成・付着を回避したサンプルプレートの表面において、調製されたマトリクスの結晶状態の観察結果（図５Ａ）；前記表面に白色の粉体状物質の付着残余が回避されているサンプルプレートの表面において、ヒト・アンジオテンシン Ｉの乾燥試料と、マトリクスを用いて調製したサンプルを用いて測定された、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトル（図５Ｂ）を示す図である。
【図５−２】図５Ｂに示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ法による質量スペクトルを詳細に示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象とするペプチドを解析する方法であって、
質量分析測定用のサンプルプレート上において、解析対象とする前記ペプチドを、滴下乾燥した後、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的分解して、前記ペプチドに由来する一連の反応産物を調製する工程と、
該サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルを、質量分析機を利用して測定する工程と、
測定された質量スペクトルに基づき、前記一連の反応産物の質量を特定し、一連の反応産物間の質量差を用いて、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を特定する工程とを有し、
サンプルプレート上において、前記一連の反応産物を調製する工程は、少なくとも、
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解するＣ末端逐次分解化学反応工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程に先立ち実施される前処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程の後に実施される後処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程と後処理工程の間に、サンプルプレート上に残余している前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程で利用する反応試薬を除去する、反応試薬の除去工程とを具え、
前処理工程は、
乾燥雰囲気下、１０〜６０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において滴下乾燥されている、解析対象とする前記ペプチドに対して、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とアルカン酸を接触させて、前記ペプチドのＮ末端のアミノ基、ならびに該ペプチド鎖中に含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基にＮ−アシル化保護を施す工程であり；
Ｃ末端逐次分解反応工程は、
乾燥雰囲気下、１５〜８０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において、前処理工程によってＮ−アシル化保護されたペプチドの乾燥試料に対して、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を接触させて、該ペプチドのＣ末端において、
下記する一般式（III）：
【化１】
（式中、Ｒ１は、ペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖を表し、Ｒ２は、前記Ｃ末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す）で表記される５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴って、Ｃ末端アミノ酸の分解を逐次的に行う工程であり；
反応試薬の除去工程は、
サンプルプレート上において、前記Ｃ末端逐次分解反応工程で調製される、ペプチドに由来する一連の反応産物を含む乾燥試料に対して、
該サンプルプレート上に残余する前記アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸とを、減圧または不活性ガスの送気により蒸散させる処理を施し、
次いで、前記乾燥試料に対して、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子、あるいは、液滴状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を接触させて、塩基性含窒素芳香環化合物を触媒として利用し、該サンプルプレート上に残留する未反応の前記アルカン酸無水物を加水分解し、前記加水分解産物であるアルカン酸および前記パーフルオロアルカン酸と該塩基性含窒素芳香環化合物との揮発性の塩を形成させ、減圧または不活性ガスの送気により前記揮発性塩を揮発させ、前記乾燥試料中から除去する工程であり；
後処理工程は、
前記反応試薬の除去工程を施した後、サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物に対して、蒸気状の第３アミン化合物と水分子、あるいは、液滴状の第３アミン化合物と水分子を接触させて、該一連の反応産物のペプチド鎖のＣ末端部に形成されている該５−オキサゾロン環を加水分解処理する工程である
ことを特徴とする、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法。
【請求項２】
アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を反応試薬として使用する、Ｃ末端逐次分解反応工程；
アルカン酸無水物とアルカン酸を反応試薬として使用する、前処理工程；
含窒素芳香環化合物と水分子を反応試薬として使用する、反応試薬の除去工程；
第３アミン化合物と水分子を反応試薬として使用する、後処理工程の各工程において、
各工程で利用する反応試薬を、蒸気状の反応試薬を気相から供給し、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を低く設定し、前記サンプルプレート上のペプチドの乾燥試料に対して、蒸気状の反応試薬の吸着を起こさせる、反応試薬の吸着工程と、
各工程で利用する反応試薬を作用させる処理を終了させる時点で、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を高く設定し、前記サンプルプレート上の該工程の処理済ペプチド試料中に吸着させた前記反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を具えている
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前処理工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とアルカン酸の組み合わせは、無水酢酸と酢酸である
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ末端逐次分解反応工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の組み合わせにおいて、アルカン酸無水物は、無水酢酸である
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記パーフルオロアルカン酸が、０．３〜２．５の範囲内の酸解離定数（ｐＫａ）を有し、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸である
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
反応試薬の除去工程で使用される反応試薬中に含まれる、含窒素芳香環化合物は、ピリジンまたはコリジンである
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
後処理工程で使用される反応試薬中に含まれる、第３アミン化合物は、ジメチルアミノエタノールである
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルの測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析法により行われる
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
解析対象とするペプチドを解析する方法であって、
質量分析測定用のサンプルプレート上において、解析対象とする前記ペプチドを、滴下乾燥した後、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸を逐次的分解して、前記ペプチドに由来する一連の反応産物を調製する工程と、
該サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルを、質量分析機を利用して測定する工程と、
測定された質量スペクトルに基づき、前記一連の反応産物の質量を特定し、一連の反応産物間の質量差を用いて、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸配列を特定する工程とを有し、
サンプルプレート上において、前記一連の反応産物を調製する工程は、少なくとも、
ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸を逐次的分解するＣ末端逐次分解化学反応工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程に先立ち実施される前処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程の後に実施される後処理工程と、
前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程と後処理工程の間に、サンプルプレート上に残余している前記Ｃ末端逐次分解化学反応工程で利用する反応試薬を除去する、反応試薬の除去工程とを具え、
前処理工程は、
乾燥雰囲気下、１０〜６０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において滴下乾燥されている、解析対象とする前記ペプチドに対して、アルカン酸無水物にアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とアルカン酸を接触させて、前記ペプチドのＮ末端のアミノ基、ならびに該ペプチド鎖中に含有されている可能性のあるリジン残基側鎖のアミノ基にＮ−アシル化保護を施す工程であり；
Ｃ末端逐次分解反応工程は、
乾燥雰囲気下、１５〜８０℃の範囲に選択される温度において、
サンプルプレート上において、前処理工程によってＮ−アシル化保護されたペプチドの乾燥試料に対して、アルカン酸無水物にパーフルオロアルカン酸を少量添加してなる混合物から発生する、蒸気状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸、あるいは、液滴状のアルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を接触させて、該ペプチドのＣ末端において、
下記する一般式（III）：
【化１】
（式中、Ｒ１は、ペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖を表し、Ｒ２は、前記Ｃ末端アミノ酸の直前に位置するアミノ酸残基の側鎖を表す）で表記される５−オキサゾロン構造を経て、該５−オキサゾロン環の開裂に伴って、Ｃ末端アミノ酸の分解を逐次的に行う工程であり；
反応試薬の除去工程は、
サンプルプレート上において、前記Ｃ末端逐次分解反応工程で調製される、ペプチドに由来する一連の反応産物を含む乾燥試料に対して、
該サンプルプレート上に残余する前記アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸とを、減圧または不活性ガスの送気により蒸散させる処理を施し、
次いで、前記乾燥試料に対して、蒸気状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子、あるいは、液滴状の塩基性含窒素芳香環化合物と水分子を接触させて、塩基性含窒素芳香環化合物を触媒として利用し、該サンプルプレート上に残留する未反応の前記アルカン酸無水物を加水分解し、前記加水分解産物であるアルカン酸および前記パーフルオロアルカン酸と該塩基性含窒素芳香環化合物との揮発性の塩を形成させ、減圧または不活性ガスの送気により前記揮発性塩を揮発させ、前記乾燥試料中から除去する工程であり；
後処理工程は、
前記反応試薬の除去工程を施した後、サンプルプレート上において、前記ペプチドに由来する一連の反応産物に対して、蒸気状の第３アミン化合物と水分子、あるいは、液滴状の第３アミン化合物と水分子を接触させて、該一連の反応産物のペプチド鎖のＣ末端部に形成されている該５−オキサゾロン環を加水分解処理する工程である
ことを特徴とする、ペプチドのＣ末端アミノ酸配列の解析方法。
【請求項２】
アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸を反応試薬として使用する、Ｃ末端逐次分解反応工程；
アルカン酸無水物とアルカン酸を反応試薬として使用する、前処理工程；
含窒素芳香環化合物と水分子を反応試薬として使用する、反応試薬の除去工程；
第３アミン化合物と水分子を反応試薬として使用する、後処理工程の各工程において、
各工程で利用する反応試薬を、蒸気状の反応試薬を気相から供給し、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を低く設定し、前記サンプルプレート上のペプチドの乾燥試料に対して、蒸気状の反応試薬の吸着を起こさせる、反応試薬の吸着工程と、
各工程で利用する反応試薬を作用させる処理を終了させる時点で、供給される該反応試薬の蒸気の温度よりも、該サンプルプレートの温度を高く設定し、前記サンプルプレート上の該工程の処理済ペプチド試料中に吸着させた前記反応試薬を脱離させる、反応試薬の脱着工程を具えている
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前処理工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とアルカン酸の組み合わせは、無水酢酸と酢酸である
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ末端逐次分解反応工程において使用される反応試薬である、アルカン酸無水物とパーフルオロアルカン酸の組み合わせにおいて、アルカン酸無水物は、無水酢酸である
ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記パーフルオロアルカン酸が、０．３〜２．５の範囲内の酸解離定数（ｐＫａ）を有し、炭素数２〜４のパーフルオロアルカン酸である
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
反応試薬の除去工程で使用される反応試薬中に含まれる、含窒素芳香環化合物は、ピリジンまたはコリジンである
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
後処理工程で使用される反応試薬中に含まれる、第３アミン化合物は、ジメチルアミノエタノールである
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドに由来する一連の反応産物の質量スペクトルの測定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析法により行われる
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【公開番号】特開２００８−２３２９１５（Ｐ２００８−２３２９１５Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−７４８７３（Ｐ２００７−７４８７３）
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（０００００４２３７）日本電気株式会社 (19,353)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２日（２００８．１０．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（０００００４２３７）日本電気株式会社 (19,353)
【Ｆターム（参考）】
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