【課題】性細胞表面上に発現される分子／受容体を認識する抗体を含む細胞結合性剤、および癌性細胞の表面上に発現される分子／受容体を特異的にターゲティングする細胞傷害性剤を含む、新規細胞傷害性コンジュゲートを提供する。
【解決手段】ＣＡ６グリコトープを認識し、これに結合する、モノクローナル抗体、およびそのエピトープ結合性断片。ネズミ抗ＣＡ６モノクローナル抗体ＤＳ６（ＤＳ６抗体）、及び前記ＤＳ６抗体のヒト化型または表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）型、ならびにそのエピトープ結合性断片。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
［０１］本発明は、ネズミ抗ＣＡ６グリコトープ・モノクローナル抗体、およびそのヒト化型またはその表面再構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）型に関する。本発明はまた、抗ＣＡ６グリコトープ・モノクローナル抗体のエピトープ結合性断片に、ならびに抗ＣＡ６グリコトープ・モノクローナル抗体のヒト化型または表面再構成型のエピトープ結合性断片にも関する。
【０００２】
［０２］本発明は、細胞結合性剤および細胞傷害性剤を含む細胞傷害性コンジュゲート、該コンジュゲートを含む療法組成物、細胞増殖の阻害および疾患の治療において該コンジュゲートを用いるための方法、ならびに該細胞傷害性コンジュゲートを含むキットにさらに関する。特に、細胞結合性剤は、ＣＡ６グリコトープを認識し、そしてこれに結合する、モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合性断片、あるいはそのヒト化型または表面再構成型である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
［０３］周囲の非癌性細胞および組織に害を及ぼすことなく、ターゲット癌細胞を特異的に破壊する、抗癌療法剤を開発する数多くの試みがなされてきている。こうした療法剤は、ヒト患者における癌の治療を非常に改善する潜在能力を有する。
【０００４】
［０４］１つの有望なアプローチは、モノクローナル抗体などの細胞結合性剤と、細胞傷害性薬剤を連結することであった（Ｓｅｌａら， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ中 １８９−２１６（Ｃ． Ｖｏｇｅｌ監修 １９８７）； Ｇｈｏｓｅら， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ中 １−２２（Ｅ． Ｇｏｌｄｂｅｒｇ監修 １９８３）； Ｄｉｅｎｅｒら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ中 １−２３（Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ監修 １９８８）； Ｐｉｅｔｅｒｓｚら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ中 ２５−５３（Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ監修 １９８８）； Ｂｕｍｏｌら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ中 ５５−７９（Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ監修 １９８８）。細胞結合性剤の選択次第で、こうした細胞の表面上に発現される分子の発現プロフィールに基づいて、癌性細胞の特定の種類のみを認識し、そしてこうした種類のみに結合するように、これらの細胞傷害性コンジュゲートを設計することも可能である。
【０００５】
［０５］多様なネズミ・モノクローナル抗体に連結された、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、およびクロラムブシルなどの細胞傷害性薬剤が、こうした細胞傷害性コンジュゲートで用いられてきている。いくつかの場合、血清アルブミン（Ｇａｒｎｅｔｔら， ４６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２４０７−２４１２（１９８６）； Ｏｈｋａｗａら ２３ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ８１−８６（１９８６）； Ｅｎｄｏら， ４７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０７６−１０８０（１９８０））、デキストラン（Ｈｕｒｗｉｔｚら， ２ Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５−３５（１９８０）； Ｍａｎａｂｉら， ３４ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２８９−２９１（１９８５）； Ｄｉｌｌｍａｎら， ４６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８８６−４８９１（１９８６）； Ｓｈｏｖａｌら， ８５ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ
ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２７６−８２８０（１９８８））、またはポリグルタミン酸（Ｔｓｕｋａｄａら， ７３ Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔ． ７２１−７２９（１９８４）； Ｋａｔｏら ２７ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １６０２−１６０７（１９８４）； Ｔｓｕｋａｄａら， ５２ Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １１１−１１６（１９８５））などの中間キャリアー分子を通じて、薬剤分子が抗体分子に連結された。
【０００６】
［０６］ある程度有望であることが示されている１つの特異的コンジュゲートの例として、結腸直腸腫瘍および膵臓腫瘍上に発現される抗原であるＣａｎＡｇに対して向けられるＣ２４２抗体、ならびにメイタンシン誘導体ＤＭ１のコンジュゲートがある（Ｌｉｕら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９３： ８６１８−８６２３（１９９６））。このコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価によって、細胞表面上に発現されるＣａｎＡｇに向かうその結合親和性が高く、見かけのＫ_ｄ値が３ｘ１０^−１１Ｍであり、そしてＣａｎＡｇ陽性細胞に対する細胞傷害能が高く、ＩＣ_５０が６ｘ１０^−１１Ｍであることが示された。この細胞傷害性は、過剰な非コンジュゲート化抗体によって遮断されたため、そして抗原陰性細胞が該コンジュゲートに対して１００倍以上感受性が低かったため、該細胞傷害性は抗原依存性である。それぞれのターゲット細胞に向かう親和性が高く、そしてかつ抗原選択的細胞傷害性が高い、抗体−ＤＭ１コンジュゲートの他の例には、ヒトＣＤ５６に対する抗体のヒト化型、ｈｕＮ９０１；ヒトＣＤ３３に対する抗体のヒト化型、ｈｕＭｙ９−６；ＣａｎＡｇ Ｍｕｃ１エピトープに対する抗体のヒト化型、ｈｕＣ２４２；ＰＳＭＡに対する脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、ｈｕＪ５９１；Ｈｅｒ２／ｎｅｕに対するヒト化抗体、トラスツズマブ；およびＣＤ４４ｖ６に対するヒト化抗体、ビバツズマブが含まれる。
【０００７】
［０７］癌患者を治療するのに用いる方法を、続けて改善する際に、特定の種類の癌性細胞を特異的に認識するさらなる細胞傷害性コンジュゲートの開発が重要であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
［０８］この目的に向けて、本発明は、癌性細胞表面上に発現される分子／受容体を認識し、そしてこれに結合する抗体の開発に、そして抗体などの細胞結合性剤、および癌性細胞の表面上に発現される分子／受容体を特異的にターゲティングする細胞傷害性剤を含む、新規細胞傷害性コンジュゲートの開発に関する。
【０００９】
［０９］より具体的には、本発明は、癌性細胞によって発現されるＭｕｃ１ムチン受容体上の新規ＣＡ６シアログリコトープの性質決定に、そしてＭｕｃ１ムチンの新規ＣＡ６シアログリコトープを認識し、そして細胞傷害性剤の背景で、ＣＡ６グリコトープを発現している細胞の増殖を阻害するために使用可能である抗体、好ましくはヒト化抗体の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
［１０］本発明には、Ｍｕｃ１ムチン受容体の新規ＣＡ６シアログリコトープを特異的に認識し、そして結合する、抗体またはそのエピトープ結合性断片が含まれる。別の態様において、本発明には、Ｍｕｃ１ムチン受容体の新規ＣＡ６シアログリコトープ（「ＣＡ６グリコトープ」）を認識する、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片が含まれる。
【００１１】
［１１］好ましい態様において、本発明には、ネズミ抗ＣＡ６モノクローナル抗体ＤＳ６（「ＤＳ６抗体」）、および当該抗体またはそのエピトープ結合性断片の、表面に曝露
される残基が、既知のヒト抗体表面により密接に似るように、軽鎖および重鎖両方において置換されている、ＤＳ６抗体の表面再構成型またはヒト化型が含まれる。本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片は、投与されるヒト被験体において、完全ネズミ型よりも、はるかにより免疫原性でない（または完全に非免疫原性である）点で、改善された特性を有する。したがって、本発明のヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合性断片は、ヒトに免疫原性でない一方、Ｍｕｃ１ムチン受容体上の新規シアログリコトープ、すなわちＣＡ６グリコトープを特異的に認識する。ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片を、メイタンシノイドなどの薬剤にコンジュゲート化させて、Ｍｕｃ１ ＣＡ６シアログリコトープに薬剤をターゲティングすることによって、抗原を発現している細胞に向かう特異的細胞傷害性を有するプロドラッグを形成してもよい。したがって、こうした抗体および小さい非常に毒性である薬剤（例えばメイタンシノイド、タキサン、およびＣＣ−１０６５類似体）を含む細胞傷害性コンジュゲートを、乳房腫瘍および卵巣腫瘍などの腫瘍治療のための療法剤として用いてもよい。
【００１２】
［１２］本発明のＤＳ６抗体のヒト化型は、軽鎖および重鎖可変領域両方のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖および重鎖可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、その表面アミノ酸の同定、ならびに組換え型におけるその発現のための手段の開示に関して、本明細書において完全に性質決定されている。
【００１３】
［１３］１つの態様において、配列番号１〜３によって示されるアミノ酸配列：
【００１４】
【化１】

【００１５】
を有するＣＤＲを含む重鎖を有し、そして配列番号４〜６によって示されるアミノ酸配列：
【００１６】
【化２】

【００１７】
を有するＣＤＲを含む軽鎖を有する、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片を提供する。
［１４］配列番号７または配列番号８によって示されるアミノ酸配列：
【００１８】
【化３】

【００１９】
と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合性断片もまた提供する。
［１５］同様に、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１によって示されるアミノ酸配列：
【００２０】
【化４】

【００２１】
と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、ヒト化ＤＳ６抗体およびエピトープ結合性断片を提供する。
［１６］別の態様において、配列番号８に対応するアミノ酸配列
【００２２】
【化５】

【００２３】
を有するヒト化または表面再構成軽鎖可変領域を有する、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合性断片を提供する。
［１７］同様に、それぞれ、配列番号１０または配列番号１１に対応するアミノ酸配列：
【００２４】
【化６】

【００２５】
を有するヒト化または表面再構成重鎖可変領域を有する、ヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合性断片を提供する。
［１８］本発明のヒト化ＤＳ６抗体およびそのエピトープ結合性断片にはまた、ヒト残基への変更が必要な、ＣＤＲの５オングストローム以内に見られるネズミ表面フレームワーク残基に相当する、表１の星印の残基によって定義される、１以上の位での軽鎖および／または重鎖アミノ酸残基中の置換をも含むことができる。例えば、ネズミ配列（配列番号７）中の最初のアミノ酸残基Ｑは、抗体をヒト化するため、Ｅ（配列番号８）によって置換されている。しかし、この残基はＣＤＲに近接しているため、抗体親和性を維持するために、ネズミ残基Ｑへの復帰突然変異が必要でありうる。
表１
【００２６】
【表１】

【００２７】
［１９］３つの最も相同なヒト可変領域表面残基と並列させて、ｍｕＤＳ６可変領域表面残基を示す表２に、これをさらに示す。表１のアミノ酸残基は、表２の下線のアミノ酸残基に対応する。
表２
【００２８】
【表２】

【００２９】
［２０］本発明は、（１）ＣＡ６グリコトープを認識し、そして該グリコトープに結合する細胞結合性剤、および（２）細胞傷害性剤を含む、細胞傷害性コンジュゲートをさらに提供する。本発明の細胞傷害性コンジュゲートが有効な殺傷剤を形成するように、細胞傷害性コンジュゲートにおいて、細胞結合性剤はＣＡ６グリコトープに対して高い親和性を有し、そして細胞傷害性剤はＣＡ６グリコトープを発現している細胞に対して高い度合いの細胞傷害性を有する。
【００３０】
［２１］好ましい態様において、細胞結合性剤は、抗ＣＡ６抗体またはそのエピトープ結合性断片、より好ましくはヒト化抗ＣＡ６抗体またはそのエピトープ結合性断片であり、ここで細胞傷害性剤が、直接、あるいは切断可能または切断不能リンカーを介して、抗体またはそのエピトープ結合性断片に共有結合している。より好ましい態様において、細胞結合性剤は、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片であり、そして細胞傷害性剤は、タキソール、メイタンシノイド、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。
【００３１】
［２２］本発明の好ましい態様において、細胞結合性剤はヒト化抗ＣＡ６抗体であり、そして細胞傷害性剤はメイタンシノイドまたはタキサンなどの細胞傷害性薬剤である。
［２３］より好ましくは、細胞結合性剤はヒト化抗ＣＡ６抗体ＤＳ６であり、そして細胞傷害性剤はＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシン化合物である。
【００３２】
［２４］本発明にはまた、ＣＡ６グリコトープを発現している細胞の増殖を阻害するための方法も含まれる。好ましい態様において、ＣＡ６グリコトープを発現している細胞の増殖を阻害するための方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで起こり、そして細胞の死を生じるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ適用もまた含まれる。
【００３３】
［２５］本発明はまた、細胞傷害性コンジュゲート、および薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤を含む療法組成物も提供する。
［２６］本発明には、療法組成物を用いて、癌を有する被験体を治療する方法がさらに含まれる。好ましい態様において、細胞傷害性コンジュゲートは、抗ＣＡ６抗体および細胞傷害性剤を含む。より好ましい態様において、細胞傷害性コンジュゲートは、ヒト化ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲート、ヒト化ＤＳ６抗体−ＤＭ４またはヒト化ＤＳ６抗体−タキサン・コンジュゲートを含み、そして該コンジュゲートは、薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤と一緒に投与される。
【００３４】
［２７］本発明にはまた、抗ＣＡ６抗体−細胞傷害性剤コンジュゲートおよび使用のための説明書を含むキットも含まれる。好ましい態様において、抗ＣＡ６抗体はヒト化ＤＳ６抗体であり、細胞傷害性剤はＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシン化合物、あるいは
タキサンであり、そして説明書は、癌を有する被験体の治療において、コンジュゲートを使用するためのものである。キットにはまた、コンジュゲートが凍結乾燥状態または濃縮型であるならば希釈剤などの、薬学的に許容しうる配合物の調製に必要な構成要素、および配合物の投与に必要な構成要素も含まれていてもよい。
【００３５】
［２８］本発明にはまた、ＣＡ６グリコトープに特異的に結合し、そして該グリコトープを認識する抗体の誘導体も含まれる。好ましい態様において、抗体誘導体は、ＣＡ６グリコトープに結合する抗体の表面を再構成するかまたは該抗体をヒト化することによって調製され、ここで該誘導体は宿主に対して減少した免疫原性を有する。
【００３６】
［２９］本発明は、研究または診断適用において使用するため、さらに標識されているヒト化抗体またはその断片をさらに提供する。好ましい態様において、標識は、放射標識、蛍光体、発色団、造影剤または金属イオンである。
【００３７】
［３０］前記の標識ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片を、癌を有すると推測される被験体に投与し、そして被験体体内の標識分布を測定するかまたは監視する、診断法もまた、提供する。
【００３８】
［３１］本発明はまた、本発明のヒト化抗体コンジュゲートを、単独で、あるいは他の細胞傷害性剤または療法剤と組み合わせて投与することによって、癌を有する被験体を治療するための方法もまた提供する。癌は、ＣＡ６が発現されている、例えば乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、骨肉腫、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌、滑膜癌、膵臓癌、肉腫または癌腫、あるいはＣＡ６グリコトープが主に発現されている、まだ決定されていない他の癌の１以上であってもよい。
【００３９】
［３２］別に言及しない限り、本明細書に引用するすべての参考文献および特許は、本明細書に援用される。
【００４０】
発明の詳細な説明
［６３］本発明は、他の特徴の中でも、抗ＣＡ６モノクローナル抗体、抗ＣＡ６ヒト化抗体、および抗ＣＡ６抗体の断片を提供する。本発明の抗体および抗体断片の各々は、細胞表面上のＣＡ６グリコトープを特異的に認識し、そして該グリコトープに結合するよう設計される。ＣＡ６は、多くのヒト腫瘍：漿液性卵巣癌の９５％、子宮内膜様卵巣癌の５０％、子宮頸部新生物の５０％、子宮内膜新生物の６９％、外陰新生物の８０％、乳癌の６０％、膵臓腫瘍の６７％、および尿路上皮腫瘍の４８％によって発現されることが知られるが、正常ヒト組織によっては滅多に発現されない。
【００４１】
［６４］Ｋｅａｒｓｅら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８８（６）：８６６−８７２（２０００）による報告は、ハイブリドーマ上清を用いてＣＡ６エピトープを性質決定した際、ＣＡ６エピトープが見られるタンパク質を、ＣＡ６エピトープを含有するＮ連結炭水化物を有する８０ｋＤａタンパク質と誤認した。その後、本発明者らは、精製ＤＳ６を用いて、２５０ｋＤａの非ジスルフィド連結糖タンパク質より大きい、Ｏ連結炭水化物上にＣＡ６エピトープが見られることを立証した。さらに、該糖タンパク質は、ムチン、Ｍｕｃ１と同定された。異なるＭｕｃ１アレルは、可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）ドメインにおいて、多様な数のタンデム反復を有するため、細胞はしばしば、異なるサイズの２つの別個のＭｕｃ１タンパク質を発現する（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４５５（２−３）：３０１−１３（１９９９）。ＶＮＴＲドメイン中の反復数が異なり、さらにグリコシル化も異なるため、Ｍｕｃ１の分子量は細胞株間で多様である。
【００４２】
［６５］過ヨウ素酸に対するＣＡ免疫反応性の感受性は、ＣＡ６が炭水化物エピトープ「グリコトープ」であることを示す。コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のノイラミニダーゼでの処理に対する、ＣＡ６免疫反応性のさらなる感受性は、ＣＡ６エピトープがシアル酸依存性グリコトープであり、したがって、「シアログリコトープ」であることを示す。
【００４３】
［６６］ＣＡ６の性質決定の詳細を実施例２に見出しうる（以下を参照されたい）。ＣＡ６に関するさらなる詳細は、ＷＯ ０２／１６４０１； Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇら， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４３（４）：１０５０−１０５４（１９９３）； Ｓｍｉｔｈら， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ９：６１−６５（１９９９）； Ｋｅａｒｓｅら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８８（６）：８６６−８７２（２０００）； Ｓｍｉｔｈら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｐａｔｈｏｌ． ２０（３）：２６０−６（２００１）；およびＳｍｉｔｈら， Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｍｏｒｐｈｏｌ． １０（２）：１５２−８（２００２）に見出されうる。
【００４４】
［６７］本発明にはまた、２つの主な構成要素を含む細胞傷害性コンジュゲートも含まれる。第一の構成要素は、ＣＡ６グリコトープを認識し、そして該グリコトープに結合する、細胞結合性剤である。細胞傷害性コンジュゲートが、意図する細胞のみを認識し、そして該細胞に結合するように、細胞結合性剤は、高い度合いの特異性で、Ｍｕｃ１上のＣＡ６シアログリコトープを認識すべきである。高い度合いの特異性は、コンジュゲートが、非特異的結合から生じる副作用をほとんど伴わずに、ターゲティングされた方式で作用することを可能にするであろう。
【００４５】
［６８］別の態様において、コンジュゲートの細胞傷害性薬剤部分が細胞に対して作用するのを可能にするのに十分な期間、そして／または細胞によってコンジュゲートが内部移行されるのを可能にするのに十分な期間、コンジュゲートがターゲット細胞と接触するように、本発明の細胞結合性剤はまた、ＣＡ６グリコエピトープを高い度合いの親和性でも認識するであろう。
【００４６】
［６９］好ましい態様において、細胞傷害性コンジュゲートは、細胞結合性剤として、抗ＣＡ６抗体、より好ましくはネズミＤＳ６抗ＣＡ６モノクローナル抗体を含む。より好ましい態様において、細胞傷害性コンジュゲートは、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む。ＤＳ６抗体は、高い度合いの特異性でＣＡ６を認識することが可能であり、そして細胞傷害性剤を、ターゲティング方式で、癌細胞などの異常な細胞または組織に向ける。
【００４７】
［７０］本発明の細胞傷害性コンジュゲートの第二の構成要素は、細胞傷害性剤である。好ましい態様において、細胞傷害性剤は、タキソール、ＤＭ１またはＤＭ４などのメイタンシノイド、ＣＣ−１０６５またはＣＣ−１０６５類似体である。好ましい態様において、本発明の細胞結合性剤は、直接、あるいは切断可能または切断不能リンカーを介して、細胞傷害性剤に共有結合している。
【００４８】
［７１］細胞結合性剤、細胞傷害性剤、およびリンカーを、以下により詳細に論じる。
細胞結合性剤
［７２］療法剤としての本発明の化合物の有効性は、適切な細胞結合性剤の注意深い選択次第である。細胞結合性剤は、現在知られるかまたは知られるようになる、いかなる種類のものであってもよく、そしてこうした剤には、ペプチドおよび非ペプチドが含まれる。細胞結合性剤は、特異的または非特異的方式のいずれかで、細胞に結合可能な、いかなる化合物であってもよい。一般的に、これらは、抗体（特にモノクローナル抗体）、リン
ホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン、栄養輸送分子（トランスフェリンなど）、あるいは他の任意の細胞結合性分子または物質であってもよい。
【００４９】
［７３］使用可能な細胞結合性剤のより具体的な例には：
（ａ）ポリクローナル抗体；
（ｂ）モノクローナル抗体；
（ｃ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｖなどの抗体断片（Ｐａｒｈａｍ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１：２８９５−２９０２（１９８３）； Ｓｐｒｉｎｇら Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１３：４７０−４７８（１９７４）； Ｎｉｓｏｎｏｆｆら， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９：２３０−２４４（１９６０））；
（ｄ）インターフェロン（例えばアルファ、ベータ、ガンマ）；
（ｅ）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６などのリンホカイン；
（ｆ）インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン形成細胞刺激ホルモン）、アンドロゲンおよびエストロゲンなどのステロイドホルモンなどのホルモン；
（ｇ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどの増殖因子およびコロニー刺激因子（Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ５：１５５−１５８（１９８４））；
（ｈ）トランスフェリン（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：９３２−９３７（１９８５））；ならびに
（ｉ）葉酸などのビタミン
が含まれる。
【００５０】
抗体
［７４］適切な細胞結合性剤の選択は、ターゲティングしようとする特定の細胞集団に応じた選択の問題であるが、一般的に、適切なものが入手可能であるか、または調製可能であるならば、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体が好ましい。
【００５１】
［７５］モノクローナル抗体技術によって、特異的モノクローナル抗体の形で、非常に特異的な細胞結合性剤の産生が可能になる。当該技術分野に特によく知られるのは、マウス、ラット、ハムスター、または任意の他の哺乳動物を、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ターゲット細胞、ターゲット細胞から単離された抗原、完全ウイルス、弱毒化完全ウイルス、およびウイルス・コートタンパク質などのウイルスタンパク質などの、関心対象の抗原で免疫することによって産生される、モノクローナル抗体を生成するための技術である。感作されたヒト細胞もまた使用可能である。モノクローナル抗体を生成する別の方法は、ｓｃＦｖ（一本鎖可変領域）、特にヒトｓｃＦｖの、ファージライブラリーの使用である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、米国特許第５，８８５，７９３号および第５，９６９，１０８号； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ ９２／０１０４７； Ｌｉｍｉｎｇら、ＷＯ ９９／０６５８７を参照されたい）。
【００５２】
［７６］典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって連結される２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖で構成される。可変領域は、抗体の中で配列が異なり、そして抗原に対する特定の抗体各々の結合および特異性において協調する、抗体重鎖および軽鎖の部分である。可変性は、通常、抗体可変領域全体に均一に分布しているのではない。典型的には、軽鎖および重鎖可変領域両方における、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる可変領域の３つのセグメント内に集中している。可変領域のより高く保存される部分は、フレームワーク領域と呼ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域は４つのフレームワーク領域を含み、これらは大部分、ベータ−シート立体配置を採用し、各フレームワーク領域は３つのＣＤＲによって連結され、ＣＤＲは、ベータ−シート構造を連結するルー
プを形成し、そしていくつかの場合、ベータ−シート構造の一部を形成する。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって非常に近接して保持され、そして他の鎖に由来するＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｅ． Ａ． Ｋａｂａｔら Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， １９９１， ＮＩＨ）。
【００５３】
［７７］定常領域は、重鎖の一部である。抗体の抗原への結合に直接関与してはいないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など、多様なエフェクター機能を示す。
［７８］本発明で使用するのに適したモノクローナル抗体には、ネズミＤＳ６モノクローナル抗体（米国特許第６，５９６，５０３号； ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−４４４９）が含まれる。
【００５４】
ヒト化または表面再構成ＤＳ抗体
［７９］好ましくは、本発明の細胞結合性剤として、ヒト化抗ＣＡ６抗体を用いる。こうしたヒト化抗体の好ましい態様は、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片である。
【００５５】
［８０］ヒト化の目的は、抗体の完全な抗原結合親和性および特異性を維持しつつ、ヒトに導入するために、ネズミ抗体などの異種抗体の免疫原性を減少させることである。
［８１］表面再構成およびＣＤＲ移植などのいくつかの技術を用いて、ヒト化抗体を産生してもよい。本明細書において、表面再構成技術は、分子モデリング、統計分析および突然変異誘発の組み合わせを用いて、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を改変し、ターゲット宿主の既知の抗体の表面に似せる。
【００５６】
［８２］抗体の表面再構成のための戦略および方法、ならびに異なる宿主内で抗体の免疫原性を減少させるための他の方法が、その全体が本明細書に援用される、米国特許第５，６３９，６４１号（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら）に開示される。簡潔には、好ましい方法において、（１）抗体重鎖および軽鎖可変領域のプールの位置アライメントを生成して、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露位置のセットを生じ、ここで、すべての可変領域のアライメント位置は、少なくとも約９８％同一である；（２）重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットを、げっ歯類抗体（またはその断片）に関して定義し；（３）げっ歯類表面曝露アミノ酸残基セットに、最も密接に同一である、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットを同定し；（４）げっ歯類抗体の相補性決定領域のいずれかの残基のいずれかの原子から５Å以内にあるアミノ酸残基を除いて、工程（２）で定義した、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットを、工程（３）で同定した、重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク表面曝露アミノ酸残基のセットで置換し；そして（５）結合特異性を有するヒト化げっ歯類抗体を産生する。
【００５７】
［８３］ＣＤＲ移植（ＥＰ ０ ２３９ ４００； ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、表面加工（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再構成（ＥＰ ０ ５９２ １０６； ＥＰ ０ ５１９ ５９６；
Ｐａｄｌａｎ Ｅ． Ａ．， １９９１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ． Ｍ．ら， １９９４， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４； Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．ら， １９９４， ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３）、および鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、多様な他の技術を用いて、抗体をヒト化してもよい。ファージディスプレイ法を含む、当該技術分野に知られる多様な方法によって、ヒト抗体を作製してもよい。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号、および第５，８１４，３１８号；ならびに国際
特許出願公報ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、およびＷＯ ９１／１０７４１（前記文献は、その全体が本明細書に援用される）もまた参照されたい。
【００５８】
［８４］好ましい態様において、本発明は、Ｍｕｃ１ムチン上の新規シアログリコトープ（ＣＡ６グリコトープ）を認識するヒト化抗体またはその断片を提供する。別の態様において、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片は、ＣＡ６グリコトープを発現している細胞の増殖を阻害するさらなる能力を有する。
【００５９】
［８５］より好ましい態様において、ＤＳ６抗体の表面再構成型またはヒト化型を提供し、ここで、抗体またはその断片の表面曝露残基は、既知のヒト抗体表面により密接に似るように、軽鎖および重鎖両方で置換される。本発明のヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片は、改善された特性を有する。例えば、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片は、Ｍｕｃ１ムチン上の新規シアログリコトープ（ＣＡ６グリコトープ）を特異的に認識する。より好ましくは、ヒト化ＤＳ６抗体またはそのエピトープ結合性断片は、ＣＤ６グリコトープを発現している細胞の増殖を阻害するさらなる能力を有する。ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片を、メイタンシノイドなどの薬剤にコンジュゲート化して、薬剤を新規Ｍｕｃ１シアログリコトープ、ＣＡ６にターゲティングすることによって、抗原発現細胞に向けて特異的細胞傷害性を有するプロドラッグを形成してもよい。こうした抗体、および小さく非常に毒性である薬剤（例えばメイタンシノイド、タキサン、およびＣＣ−１０６５類似体）を含む細胞傷害性コンジュゲートを、乳房腫瘍および卵巣腫瘍などの腫瘍の治療のための療法剤として用いてもよい。
【００６０】
［８６］ＤＳ６抗体のヒト化型はまた、軽鎖および重鎖可変領域両方のそれぞれのアミノ酸配列、軽鎖および重鎖可変領域の遺伝子のＤＮＡ配列、ＣＤＲの同定、その表面アミノ酸の同定、ならびに組換え型におけるその発現のための手段の開示に関しても、本明細書において完全に性質決定されている。
【００６１】
［８７］１つの態様において、配列番号１〜３によって示されるアミノ酸配列：
【００６２】
【化７】

【００６３】
を有するＣＤＲを含む重鎖を有する、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片を提供する。
［８８］ＡｂＭモデリングソフトウェアによって重鎖ＣＤＲを決定すると、重鎖ＣＤＲは配列番号２０〜２２：
【００６４】
【化８】

【００６５】
によって示される。
［８９］同じ態様において、ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片は、配列番号４〜６によって示されるアミノ酸配列：
【００６６】
【化９】

【００６７】
を有するＣＤＲを含む、軽鎖を有する。
［９０］配列番号７または８によって示されるアミノ酸配列：
【００６８】
【化１０】

【００６９】
と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片もまた提供する。
［９１］同様に、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１によって示されるアミノ酸配列：
【００７０】
【化１１】

【００７１】
と、少なくとも９０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有する、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片を提供する。
［９２］別の態様において、配列番号８に対応するアミノ酸配列
【００７２】
【化１２】

【００７３】
を有するヒト化または表面再構成軽鎖可変領域を有する、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片を提供する。
［９３］同様に、配列番号１０または配列番号１１に対応するアミノ酸配列：
【００７４】
【化１３】

【００７５】
を有するヒト化または表面再構成重鎖可変領域を有する、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片を提供する。
［９４］本発明のヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片にはまた、ｍｕＤＳ６の結合親和性および特異性を維持するため、ＣＤＲに近接するヒト表面アミノ酸残基が、表１のアステリスクで印を付けた残基によって定義される１以上の位（Ｋａｂａｔの番号付け）で、対応するｍｕＤＳ６表面残基によって置換されている、軽鎖および／または重鎖可変領域型も含まれてもよい。
表１
【００７６】
【表３】

【００７７】
［９５］ＤＳ６抗体軽鎖および重鎖、ならびにそのヒト化型の一次アミノ酸配列およびＤＮＡ配列を本明細書に開示する。しかし、本発明の範囲は、これらの配列を含む抗体および断片に限定されない。その代わり、Ｍｕｃ１受容体上のユニークな腫瘍特異的グリコ
トープとしてのＣＡ６に特異的に結合するすべての抗体および断片が、本発明に含まれる。好ましくは、ＣＡ６に特異的に結合する抗体および断片はまた、受容体の生物学的活性もアンタゴナイズする。より好ましくは、こうした抗体は、さらに、アゴニスト活性を実質的に回避する。したがって、本発明の抗体および抗体断片は、骨格、ＣＤＲ、および／または軽鎖および重鎖のアミノ酸配列が、ＤＳ６抗体またはそのヒト化誘導体と異なり、そしてなお、本発明の範囲内に属することも可能である。
【００７８】
［９６］モデリングによって、ＤＳ６抗体のＣＤＲが同定され、そしてその分子構造が予測されている。ここでも、ＣＤＲはエピトープ認識に重要であるが、本発明の抗体および断片には本質的でない。したがって、例えば本発明の抗体の親和性成熟によって産生される、改善された特性を有する抗体および断片を提供する。
【００７９】
［９７］ＤＳ６が由来しているようである、マウス軽鎖ＩｇＶκ ａｐ４生殖系列遺伝子および重鎖ＩｇＶｈ Ｊ５５８．４１生殖系列遺伝子を、ＤＳ６抗体の配列と整列させて、図１１に示す。この比較によって、ＣＤＲ中のいくつかを含めて、ＤＳ６抗体中のありうる体細胞突然変異が同定される。
【００８０】
［９８］ＤＳ６抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列、ならびにＤＳ６抗体のＣＤＲの配列は、先には知られておらず、そしてこれらを図９Ａおよび９Ｂに示す。こうした情報を用いて、ＤＳ６抗体のヒト化型を生じてもよい。
【００８１】
抗体断片
［９９］本発明の抗体には、上に論じる全長抗体ならびにエピトープ結合性断片の両方が含まれる。本明細書において、「抗体断片」には、全長抗体によって認識されるエピトープに結合する能力を保持する抗体のいかなる部分も含まれ、これらは一般的に「エピトープ結合性断片」と称される。抗体断片の例には、限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、ならびにＶ_ＬまたはＶ_Ｈ領域のいずれかを含む断片が含まれる。一本鎖抗体を含む、エピトープ結合性断片は、単独で、あるいは以下：ヒンジ領域、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３ドメインのすべてまたは一部と組み合わせて、可変領域（単数または複数）を含んでもよい。
【００８２】
［１００］こうした断片は、１つまたは両方のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）_２断片を含有してもよい。好ましくは、抗体断片は、完全抗体の６つのＣＤＲすべてを含有するが、こうした領域すべてより少ない、例えば、３つ、４つまたは５つのＣＤＲを含有する断片もまた、機能する。さらに、断片は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ、およびそのサブクラスの任意の１つのメンバーであっても、またはそれらを組み合わせてもよい。
【００８３】
［１０１］パパイン（Ｆａｂ断片）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片）などの酵素を用いたタンパク質分解切断によって、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片を産生してもよい。
【００８４】
［１０２］一本鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）断片は、抗体軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）の少なくとも１つの断片に連結された抗体重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）の少なくとも１つの断片を含有する、エピトープ結合性断片である。リンカーは、一本鎖抗体断片が由来する完全抗体のターゲット分子結合特異性を維持するために、連結された場合、（Ｖ_Ｌ）および（Ｖ_Ｈ）領域の適切な三次元フォールディングを確実にするように選択された、短い、柔軟なペプチドであってもよい。（Ｖ_Ｌ）または（Ｖ_Ｈ）配列のカルボキシル末端は、リンカーによって、相補（Ｖ_Ｌ）または（Ｖ_Ｈ）配列のアミノ酸末端に共有結合されてもよい。
【００８５】
［１０３］本発明の一本鎖抗体断片は、本明細書に記載する完全抗体の可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを有するが、こうした抗体の定常ドメインのいくつかまたはすべてを欠く、アミノ酸配列を含有する。これらの定常ドメインは、抗原結合には必要でないが、完全抗体の構造の主要な部分を構成する。したがって、一本鎖抗体断片は、定常ドメインの一部またはすべてを含有する抗体の使用と関連する問題のいくつかを克服しうる。例えば、一本鎖抗体断片は、生物学的分子および重鎖定常領域の間の望ましくない相互作用、または他の望ましくない生物学的活性がない傾向がある。さらに、一本鎖抗体断片は、完全抗体よりかなり小さく、そしてしたがって、完全抗体よりも高い毛細管透過性を有し、一本鎖抗体断片が、より効率的にターゲット抗原結合部位に局在し、そして結合することを可能にしうる。また、原核細胞において、比較的大規模に抗体断片を産生し、したがってその産生を容易にすることも可能である。さらに、一本鎖抗体断片が比較的小さいサイズであることから、これらは完全抗体よりも、レシピエントにおいて、免疫応答を誘発する可能性がより低くなる。
【００８６】
［１０４］分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリーまたは当業者に周知の類似の技術によって、一本鎖抗体断片を生成してもよい。真核細胞、または細菌を含む原核細胞において、これらのタンパク質を産生してもよい。また、当該技術分野に知られる多様なファージディスプレイ法を用いて、本発明のエピトープ結合性断片を生成してもよい。ファージディスプレイ法において、抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を所持するファージ粒子の表面上に、機能する抗体ドメインがディスプレイされる。特に、こうしたファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばヒトまたはネズミ）から発現されるエピトープ結合性ドメインをディスプレイしてもよい。抗原を用いて、例えば固体表面またはビーズに結合したかまたは捕捉された標識抗原を用いて、関心対象の抗原に結合するエピトープ結合性ドメインを発現するファージを選択するかまたは同定してもよい。これらの方法で用いるファージは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合された、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを含むファージから発現される、ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、典型的には繊維状ファージである。
【００８７】
［１０５］本発明のエピトープ結合性断片を作製するために使用可能なファージディスプレイ法の例には、各々、その全体が本明細書に援用される、Ｂｒｉｎｋｍａｎら， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０； Ａｍｅｓら， １９９５， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６； Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら， １９９４， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．
２４：９５２−９５８； Ｐｅｒｓｉｃら， １９９７， Ｇｅｎｅ １８７：９−１８； Ｂｕｒｔｏｎら， １９９４， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
５７：１９１−２８０； ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号； ＰＣＴ公報ＷＯ ９０／０２８０９； ＷＯ ９１／１０７３７； ＷＯ ９２／０１０４７； ＷＯ ９２／１８６１９； ＷＯ ９３／１１２３６； ＷＯ ９５／１５９８２； ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されるものが含まれる。
【００８８】
［１０６］ファージ選択後、断片をコードするファージ領域を単離し、そしてこれを用いて、例えば以下に詳細に記載するような組換えＤＮＡ技術を用い、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む、選択した宿主における発現を通じて、エピト
ープ結合性断片を生成してもよい。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／２２３２４； Ｍｕｌｌｉｎａｘら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９； Ｓａｗａｉら， １９９５， ＡＪＲＩ ３４：２６−３４；ならびにＢｅｔｔｅｒら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３に開示されるものなど、当該技術分野に知られる方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２断片を組換え的に産生する技術もまた使用してもよく；前記参考文献は、その全体が本明細書に援用される。一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用可能な技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号； Ｈｕｓｔｏｎら， １９９１， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８； Ｓｈｕら， １９９３， ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９； Ｓｋｅｒｒａら， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０に記載されるものが含まれる。
【００８９】
機能的同等物
［１０７］本発明の範囲内にやはり含まれるのは、抗ＣＡ６抗体およびヒト化抗ＣＡ６抗体の機能的同等物である。用語「機能的同等物」には、例えば、相同配列を持つ抗体、キメラ抗体、人工的抗体および修飾抗体が含まれ、各機能同等物は、ＣＡ６に結合する能力によって定義される。当業者は、「抗体断片」と称される分子群および「機能的同等物」と称される群には重複があることを理解するであろう。機能的同等物を産生する方法は、例えば、本明細書にそれぞれの全体が援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ ９３／２１３１９、欧州特許出願第２３９，４００号； ＰＣＴ出願ＷＯ ８９／０９６２２；欧州特許出願３３８，７４５；および欧州特許出願ＥＰ ３３２，４２４に開示される。
【００９０】
［１０８］相同配列を持つ抗体は、本発明の抗ＣＡ６抗体およびヒト化抗ＣＡ６抗体のアミノ酸配列と配列相同性を有するアミノ酸配列を持つ抗体である。好ましくは、相同性は、本発明の抗ＣＡ６抗体およびヒト化抗ＣＡ６抗体の可変領域のアミノ酸配列との相同性である。「配列相同性」は、本明細書において、アミノ酸配列に適用された際、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５， ２４４４−２４４８（１９８８）にしたがったＦＡＳＴＡ検索法によって決定した際、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％の配列相同性、そしてより好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を持つ配列と定義される。
【００９１】
［１０９］本明細書において、キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来するものである。例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域と対形成した、ネズミ・モノクローナル抗体由来の可変領域を有する抗体がある。キメラ抗体を産生するための方法が当該技術分野に知られる。例えば、その全体が本明細書に援用される、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２； Ｏｉら， １９８６， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４； Ｇｉｌｌｉｅｓら， １９８９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６，３９７号を参照されたい。
【００９２】
［１１０］キメラ抗体のヒト化型は、ヒト・フレームワークドメイン内で、例えばマウス抗体の相補性決定領域を代用することによって、作製される。例えばＰＣＴ公報第ＷＯ９２／２２６５３号を参照されたい。ヒト化キメラ抗体は、好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的にまたはもっぱら由来する、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の定常領域および可変領域、ならびにヒト以外の哺乳動物に実質的にまたはもっぱら由来するＣＤＲを有する。
【００９３】
［１１１］人工的な抗体には、各々、抗原結合能を有する、ｓｃＦｖ断片、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびｍｒｕが含まれる（Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ．および
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３−２９９； Ｈｕｄｓｏｎ， Ｐ．Ｊ．， １９９９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１：５４８−５５７による概説を参照されたい）。一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）において、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインは、柔軟なペプチドによって連結される。典型的には、このリンカーペプチドは、長さ約１５アミノ酸残基である。リンカーがはるかに小さいならば、例えば５アミノ酸であるならば、二価ｓｃＦｖ二量体であるディアボディが形成される。リンカーが３アミノ酸残基未満に減少する場合、トリアボディおよびテトラボディと呼ばれる三量体および四量体構造が形成される。抗体の最少の結合単位は、別個に使用可能であるのに十分な特異的認識および結合を有するＣＤＲ、典型的には重鎖のＣＤＲ２である。こうした断片は、分子認識単位またはｍｒｕと呼ばれる。いくつかのこうしたｍｒｕは、短いリンカーペプチドと一緒に連結されて、したがって単一のｍｒｕより高いアビディティーを持つ人工的な結合タンパク質を形成してもよい。
【００９４】
［１１２］本出願の機能的同等物にはまた、修飾抗体、例えば抗体への任意の種類の分子の共有結合によって修飾された抗体も含まれる。例えば、修飾抗体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結等によって修飾されている抗体が含まれる。こうした共有結合は、抗体が抗イディオタイプ応答を生じるのを妨げない。限定されるわけではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含む、既知の技術によって、これらの修飾を行ってもよい。さらに、修飾抗体は、１以上の非古典的アミノ酸を含有してもよい。
【００９５】
［１１３］異なるフレームワーク内の異なる鎖上の異なるＣＤＲを交換することによって、機能的同等物を生じてもよい。したがって、例えば、ＩｇＧ１〜４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１〜２、ＩｇＤ、ＩｇＥ抗体タイプおよびアイソタイプを産生可能な、異なる重鎖の置換によって、所定のＣＤＲセットに関して、抗体の異なるクラスにすることも可能である。同様に、完全に合成であるフレームワーク内に、所定のＣＤＲセットを包埋することによって、本発明の範囲内の人工的抗体を産生してもよい。
【００９６】
［１１４］当該技術分野に知られる非常に多様な方法を用いて、ＣＤＲの特定のセットに隣接する可変および／または定常領域配列内の突然変異、欠失および／または挿入によって、機能的同等物を容易に産生可能である。
【００９７】
［１１５］本発明の抗体断片および機能的同等物は、ＤＳ６抗体に比較した際、ＣＡ６に検出可能な度合いで結合する分子を含む。検出可能な度合いの結合には、ＣＡ６に対するネズミＤＳ６抗体の結合能の少なくとも１０〜１００％、好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の範囲のすべての値が含まれる。
【００９８】
改善された抗体
［１１６］ＣＤＲは、エピトープ認識および抗体結合に、最も重要である。しかし、抗体がその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）エピトープを認識し、そして結合する能力に干渉することなく、ＣＤＲを含む残基に変化を作製してもよい。例えば、エピトープ認識に影響を及ぼさず、さらにエピトープに対する抗体の結合親和性を増加させる変化を作製してもよい。
【００９９】
［１１７］したがって、本発明の範囲内にやはり含まれるのは、好ましくは増加した親和性で、やはりＣＡ６を特異的に認識し、そしてこれに結合する、ネズミ抗体およびヒト化抗体の両方の改善型である。
【０１００】
［１１８］いくつかの研究によって、一次抗体配列の知識に基づいて、結合および発現レベルなどの特性に対して、抗体の配列の多様な位で、１以上のアミノ酸変化を導入する影響が調べられてきている（Ｙａｎｇ， Ｗ． Ｐ．ら， １９９５， Ｊ． Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．， ２５４， ３９２−４０３； Ｒａｄｅｒ， Ｃ．ら， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５， ８９１０−８９１５； Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ． Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９）。
【０１０１】
［１１９］これらの研究において、オリゴヌクレオチドが仲介する部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、変異性（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ＤＮＡシャフリング、または大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株などの方法を用いて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはフレームワーク領域において、重鎖および軽鎖遺伝子の配列を変化させることによって、一次抗体の同等物が生成されてきている（Ｖａｕｇｈａｎ， Ｔ． Ｊ．ら， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １６， ５３５−５３９； Ａｄｅｙ， Ｎ． Ｂ．ら， １９９６， 第１６章， ｐｐ． ２７７−２９１， “Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”中， Ｋａｙ， Ｂ． Ｋ．ら監修， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。一次抗体配列を変化させるこれらの方法は、二次抗体の改善された親和性を生じている（Ｇｒａｍ， Ｈ．ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９， ３５７６−３５８０； Ｂｏｄｅｒ， Ｅ． Ｔ．ら， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， １０７０１−１０７０５； Ｄａｖｉｅｓ， Ｊ．およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ， Ｌ．， １９９６， Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ， ２， １６９−１７９； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．ら， １９９６， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２５６， ７７−８８； Ｓｈｏｒｔ， Ｍ． Ｋ．ら， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７， １６３６５−１６３７０； Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｋ．ら， ２００１， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ２７６２２−２７６２８）。
【０１０２】
［１２０］抗体の１以上のアミノ酸残基を変化させる類似の指令戦略によって、本発明で記載する抗体配列を用いて、ＣＡ６に対する改善された親和性を含む、改善された機能を持つ抗ＣＡ６抗体を開発してもよい。
【０１０３】
［１２１］改善された抗体にはまた、動物免疫、ハイブリドーマ形成、および特定の性質を持つ抗体に関する選択の標準的技術によって調製される、改善された性質を有する抗体が含まれる。
【０１０４】
細胞傷害性剤
［１２２］本発明の細胞傷害性コンジュゲートで用いる細胞傷害性剤は、細胞の死を生じるか、細胞の死を誘導するか、または何らかの方式で細胞生存度を減少させる、いかなる化合物であってもよい。好ましい細胞傷害性剤には、例えば、以下に定義される、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体が含まれる。これらの細胞傷害性剤を、本明細書に開示するような抗体、抗体断片、機能的同等物、改善された抗体およびその類似体にコンジュゲート化する。
【０１０５】
［１２３］ｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって、細胞傷害性コンジュゲートを調製してもよい。抗体に薬剤またはプロドラッグを連結するため、連結基を用いる。適切な連結基が当該技術分野に周知であり、そしてこうした連結基には、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光解離基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基が含まれる。好ましい連結基はジスルフィド基およびチオエーテル基である。例えば、ジスルフ
ィド交換反応を用いて、あるいは抗体および薬剤またはプロドラッグ間にチオエーテル結合を形成することによって、コンジュゲートを構築してもよい。
【０１０６】
メイタンシノイド
［１２４］細胞傷害性コンジュゲートを形成するため、本発明で使用可能な細胞傷害性剤の中に、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体がある。適切なメイタンシノイドの例には、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が含まれる。メイタンシノイドは、微小管形成を阻害し、そして哺乳動物細胞に対して非常に毒性である薬剤である。
【０１０７】
［１２５］適切なメイタンシノール類似体の例には、修飾芳香族環を有するものおよび他の位で修飾を有するものが含まれる。こうした適切なメイタンシノイドが、米国特許第４，４２４，２１９号；第４，２５６，７４６号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６２，６６３号；第４，３６４，８６６号；第４，４５０，２５４号；第４，３２２，３４８号；第４，３７１，５３３号；第６，３３３，４１０号；第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；および第５，８４６，５４５号に開示される。
【０１０８】
［１２６］修飾芳香族環を有するメイタンシノールの適切な類似体の特定の例には：
［１２７］（１）Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元によって調製）；
［１２８］（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および第４，３０７，０１６号）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いた脱メチル化、あるいはＬＡＨを用いた脱クロロ化によって調製）；および
［１２９］（３）Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いたアシル化によって調製）
が含まれる。
【０１０９】
［１３０］他の位の修飾を有するメイタンシノールの適切な類似体の特定の例には：
［１３１］（１）Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（Ｈ_２ＳまたはＰ_２Ｓ_５とメイタンシノールの反応によって調製）；
［１３２］（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ_２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）；
［１３３］（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ_２ＯＨまたはＣＨ_２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製）；
［１３４］（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製）；
［１３５］（５）Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および第４，３１５，９２９号）（トレウィア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離）；
［１３６］（６）Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および第４，３２２，３４８号）（ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化によって調製）；および
［１３７］（７）４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって調製）
が含まれる。
【０１１０】
［１３８］好ましい態様において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、細胞傷害性剤として、以前、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと称された、チオール含有メイタンシノイド（ＤＭ１）を利用する。ＤＭ１は、以下の構造式（Ｉ）：
【０１１１】
【化１４】

【０１１２】
によって示される。
［１３９］別の好ましい態様において、本発明の細胞傷害性コンジュゲートは、細胞傷害性剤として、チオール含有メイタンシノイド、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシンを利用する。ＤＭ４は、以下の構造式（ＩＩ）：
【０１１３】
【化１５】

【０１１４】
によって示される。
［１４０］本発明のさらなる態様において、イオウ原子を所持する炭素原子上に、モノまたはジアルキル置換を所持する、チオールおよびジスルフィド含有メイタンシノイドを含む、他のメイタンシンを用いてもよい。これらには、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシ、またはＣ−２０デスメチルに、立体障害を受けた（ｈｉｎｄｅｒｅｄ）スルフヒドリル基を所持するアシル基を含むアシル化アミノ酸側鎖を有するメイタンシノイドが含まれ、ここで、チオール官能性を所持するアシル基の炭素原子は、１つまたは２つの置換基を有し、前記置換基は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、置換基の１つはＨであってもよく、そ
してアシル基は、カルボニル官能性およびイオウ原子間に少なくとも３つの炭素原子の長さの直鎖を有する。
【０１１５】
［１４１］こうしたさらなるメイタンシンには、式（ＩＩＩ）によって示される化合物：
【０１１６】
【化１６】

【０１１７】
式中：
Ｙ’は
（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）_ｐＣ＝Ｃ_ｑＡ_ｒ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ＝Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ
を示し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立に、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ_２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、Ｄは、３〜１０炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１１、およびＲ_１２は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、各々独立に、０または１〜５の整数であり、但し、どの時点においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔの少なくとも２つはゼロではなく；そして
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、あるいは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである
が含まれる。
【０１１８】
［１４２］式（ＩＩＩ）の好ましい態様には：
Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、そしてＺがＨである
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、そしてＺがＨである
Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、そしてＺが−ＳＣＨ_３である
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、そしてＺが−ＳＣＨ_３である
式（ＩＩＩ）の化合物が含まれる。
【０１１９】
［１４３］こうしたさらなるメイタンシンにはまた、式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）、または（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）：
【０１２０】
【化１７】

【０１２１】
式中：
Ｙは、（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを示し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立に、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ_２はＨであってもよく；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎはゼロであってもよく；
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０炭素原子を有する環状アルキルもしくはアルケニル、あるいは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに側鎖を所持するメイタンシノイドを示す
によって示される化合物も含まれる。
【０１２２】
［１４４］式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の好ましい態様には：
Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり、ｎがゼロであり、そしてＺがＨである
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、ｎがゼロであり、そしてＺがＨである
Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり、ｎがゼロであり、そしてＺが−ＳＣＨ_３である
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、ｎがゼロであり、そしてＺが−ＳＣＨ_３である
式（ＩＶ−Ｌ）、（ＩＶ−Ｄ）および（ＩＶ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる。
【０１２３】
［１４５］好ましくは、細胞傷害性剤は、式（ＩＶ−Ｌ）によって示される。
［１４６］こうしたさらなるメイタンシンにはまた、式（Ｖ）：
【０１２４】
【化１８】

【０１２５】
式中：
Ｙは、（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺを示し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立に、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ_２はＨであってもよく；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎはゼロであってもよく；そして
Ｚは、Ｈ、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、あるいは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである
によって示される化合物も含まれる。
【０１２６】
［１４７］式（Ｖ）の好ましい態様には：
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がメチルであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８が各々Ｈであり；ｌおよびｍが各々１であり；ｎがゼロであり；そしてＺがＨである
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが１であり；ｎがゼロであり；そしてＺがＨである
Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり；ｎがゼロであり；そしてＺが−ＳＣＨ_３である
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、ｎがゼロであり、そしてＺが−ＳＣＨ_３である
式（Ｖ）の化合物が含まれる。
【０１２７】
［１４８］こうしたさらなるメイタンシンにはさらに、式（ＶＩ−Ｌ）、（ＶＩ−Ｄ）、または（ＶＩ−Ｄ，Ｌ）：
【０１２８】
【化１９】

【０１２９】
式中：
Ｙ_２は、（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２を示し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立に、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ_２はＨであってもよく；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖、環状アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎはゼロであってもよく；
Ｚ_２は、ＳＲまたはＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、あるいは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；そして
Ｍａｙはメイタンシノイドである
によって示される化合物が含まれる。
【０１３０】
［１４９］こうしたさらなるメイタンシンにはまた、式（ＶＩＩ）によって示される化合物：
【０１３１】
【化２０】

【０１３２】
式中：
Ｙ_２’は
（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）ｐ（Ｃ＝Ｃ）_ｑＡ_ｒ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ＝Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２ＳＺ_２
を示し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立に、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ_２はＨであってもよく；
Ａ、Ｂ、およびＤは、各々独立に、３〜１０炭素原子を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル、単純または置換アリール、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１１、およびＲ_１２は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、各々独立に、０または１〜５の整数であり、但し、どの時点においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔの少なくとも２つはゼロではなく；そして
Ｚ_２は、ＳＲまたは−ＣＯＲであり、式中、Ｒは、１〜１０炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、あるいは単純もしくは置換アリールまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルである
も含まれる。
【０１３３】
［１５０］式（ＶＩＩ）の好ましい態様には：
Ｒ１がＨであり、そしてＲ２がメチルである
式（ＶＩＩ）の化合物が含まれる。
【０１３４】
［１５１］上述のメイタンシノイドを、抗ＣＡ６抗体ＤＳ６、あるいはその相同体または断片にコンジュゲート化してもよく、ここで、抗体は、メイタンシノイドのＣ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルに見られるアシ
ル化アミノ酸側鎖のアシル基上に存在するチオールまたはジスルフィド官能性を用いて、メイタンシノイドに連結され、そしてアシル化アミノ酸側鎖のアシル基が、１つまたは２つの置換基を有する炭素原子に位置する、チオールまたはジスルフィド官能性を有し、前記置換基は、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、置換基の１つはＨであってもよく、そしてアシル基は、カルボニル官能性およびイオウ原子間に少なくとも３つの炭素原子の長さの直鎖を有する。
【０１３５】
［１５２］本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＶＩＩＩ）：
【０１３６】
【化２１】

【０１３７】
式中：
Ｙ_１’は
（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_９＝ＣＲ_１０）ｐ（Ｃ＝Ｃ）_ｑＡ_ｒ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍＤ_ｕ（ＣＲ_１１＝ＣＲ_１２）_ｒ（Ｃ＝Ｃ）_ｓＢ_ｔ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２Ｓ−
を示し、
式中：
Ａ、Ｂ、およびＤは、各々独立に、３〜１０炭素原子を有するシクロアルキルもしくはシクロアルケニル、単純もしくは置換アリール、または複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、Ｒ_８、Ｒ_９、Ｒ_１１、およびＲ_１２は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；そして
ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔは、各々独立に、０または１〜５の整数であり、但し、どの時点においても、ｌ、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、およびｔの少なくとも２つはゼロではない
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、抗抗ＣＡ６抗体ＤＳ６、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【０１３８】
［１５３］好ましくは、Ｒ_１はＨであり、そしてＲ_２はメチルであるか、またはＲ_１およびＲ_２はメチルである。
［１５４］本発明のさらにより好ましいコンジュゲートは、式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）、または（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）：
【０１３９】
【化２２】

【０１４０】
式中：
Ｙ_１は、（ＣＲ_７ＣＲ_８）_ｌ（ＣＲ_５ＣＲ_６）_ｍ（ＣＲ_３ＣＲ_４）_ｎＣＲ_１Ｒ_２Ｓ−を示し、
式中：
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立に、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニル、複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり、そしてさらに、Ｒ_２はＨであってもよく；
Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８は、各々独立に、Ｈ、ＣＨ_３、Ｃ_２Ｈ_５、１〜１０の炭素原子を有する直鎖アルキルもしくはアルケニル、３〜１０の炭素原子を有する分枝鎖もしくは環状アルキルもしくはアルケニル、フェニル、置換フェニルまたは複素環芳香族またはヘテロシクロアルキルラジカルであり；
ｌ、ｍおよびｎは、各々独立に、１〜５の整数であり、そしてさらに、ｎはゼロであってもよく；そして
Ｍａｙは、Ｃ−３、Ｃ−１４ヒドロキシメチル、Ｃ−１５ヒドロキシまたはＣ−２０デスメチルで側鎖を所持するメイタンシノールを示す
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、抗ＣＡ６抗体ＤＳ６、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【０１４１】
［１５５］式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の好ましい態様には：
Ｒ_１がＨであり、そしてＲ_２がメチルであるか、またはＲ_１およびＲ_２がメチルである、
Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８が各々Ｈであり；ｌおよびｍが各々１であり；ｎが０である、
Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり；Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、およびＲ_８が各々Ｈであり；ｌおよびｍが１であり；ｎが０である
式（ＩＸ−Ｌ）、（ＩＸ−Ｄ）および（ＩＸ−Ｄ，Ｌ）の化合物が含まれる。
【０１４２】
［１５６］好ましくは、細胞傷害性剤は、式（ＩＸ−Ｌ）によって示される。
［１５７］本発明のさらに好ましいコンジュゲートは、式（Ｘ）：
【０１４３】
【化２３】

【０１４４】
式中、置換基は、上記式（ＩＸ）に関して定義されるとおりである
のメイタンシノイドにコンジュゲート化された、抗ＣＡ６抗体ＤＳ６、あるいはその相同体または断片を含むものである。
【０１４５】
［１５８］特に好ましいのは、Ｒ_１がＨであり、Ｒ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８が各々Ｈであり、ｌおよびｍが各々１であり、そしてｎが０である、上記化合物のいずれかである。
【０１４６】
［１５９］さらに特に好ましいのは、Ｒ_１およびＲ_２がメチルであり、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７およびＲ_８が、各々、Ｈであり、ｌおよびｍが１であり、そしてｎが０である、上記化合物のいずれかである。
【０１４７】
［１６０］さらに、Ｌ−アミノアシル立体異性体が好ましい。
［１６１］係属中の米国特許出願第１０／８４９，１３６号、２００４年５月２０日出願に解説される各メイタンシノイドもまた、本発明の細胞傷害性コンジュゲートに使用可能である。米国特許出願第１０／８４９，１３６号の全開示が、本明細書に援用される。
【０１４８】
ジスルフィド含有連結基
［１６２］ＤＳ６抗体などの細胞結合性剤にメイタンシノイドを連結するため、メイタンシノイドは連結基を含む。連結部分は、完全活性メイタンシノイドの放出を可能にする化学結合を特定の部位に含有する。適切な化学結合は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、ジスルフィド結合、酸不安定性結合、光解離結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合が含まれる。好ましいのはジスルフィド結合である。
【０１４９】
［１６３］連結部分はまた、反応性化学基も含む。好ましい態様において、反応性化学基を、ジスルフィド結合連結部分を介して、メイタンシノイドに共有結合させてもよい。
［１６４］特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。
【０１５０】
［１６５］反応性化学基を含有する連結部分を含む、特に好ましいメイタンシノイドは、連結部分がジスルフィド結合を含有し、そして化学反応基がＮ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含む、メイタンシノールおよびその類似体のＣ−３エステルである。
【０１５１】
［１６６］メイタンシノイド上の多くの位が、連結部分を化学的に連結する位として働きうる。例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位がすべて、有用であると期待される。しかし、Ｃ−３位が好ましく、そしてメイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。
【０１５２】
［１６７］連結部分を有するメイタンシノールのエステルの合成を、ジスルフィド結合含有連結部分の観点で記載する一方、当業者は、他の化学結合（上述のようなもの）を持つ連結部分もまた、本発明で使用可能であり、他のメイタンシノイドも使用可能であることを理解するであろう。他の化学結合の特定の例には、酸不安定性結合、光解離結合、ペプチダーゼ不安定性結合およびエステラーゼ不安定性結合が含まれる。本明細書に援用される、米国特許第５，２０８，０２０号の開示は、こうした結合を所持するメイタンシノイドの産生を解説する。
【０１５３】
［１６８］反応性基を所持するジスルフィド部分を有するメイタンシノイドおよびメイタンシノイド誘導体の合成が、各々、本明細書に援用される、米国特許第６，４４１，１６３号および第６，３３３，４１０号、ならびに米国出願第１０／１６１，６５１号に記載される。
【０１５４】
［１６９］ＤＭ１などの反応性基含有メイタンシノイドを、ＤＳ６抗体などの抗体と反応させて、細胞傷害性コンジュゲートを産生する。ＨＰＬＣによって、またはゲルろ過によって、これらのコンジュゲートを精製してもよい。
【０１５５】
［１７０］こうした抗体メイタンシノイド・コンジュゲートを産生するためのいくつかの優れたスキームが、各々、その全体が本明細書に援用される、米国特許第６，３３３，４１０号、ならびに米国出願第０９／８６７，５９８号、第１０／１６１，６５１号および第１０／０２４，２９０号に提供される。
【０１５６】
［１７１］一般的に、水性緩衝液中の抗体溶液を、反応性基を所持するジスルフィド部分を有する、モル過剰のメイタンシノイドとインキュベーションしてもよい。過剰なアミン（エタノールアミン、タウリンなど）の添加によって、反応混合物の反応を停止してもよい。次いで、ゲルろ過によって、メイタンシノイド−抗体コンジュゲートを精製してもよい。
【０１５７】
［１７２］２５２ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度の比を、分光光度的に測定することによって、抗体分子あたりに結合するメイタンシノイド分子の数を決定することができる。平均１〜１０のメイタンシノイド分子／抗体分子が好ましい。
【０１５８】
［１７３］メイタンシノイド薬剤と抗体のコンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、多様な望ましくない細胞株の増殖を抑制する能力に関して、評価することができる。例えば、ヒト類表皮癌細胞株Ａ−４３１、ヒト小細胞肺癌細胞株ＳＷ２、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫＢＲ３およびバーキットリンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａなどの細胞株は、これらの化合物の細胞傷害性の評価のため、容易に使用可能である。評価しようとする細胞を化合物に２４時間曝露して、そして既知の方法による直接アッセイにおいて、細胞の生存率を測定することができる。次いで、アッセイ結果からＩＣ_５０値を計算することができる。
【０１５９】
ＰＥＧ含有連結基
［１７４］メイタンシノイドをまた、米国出願第１０／０２４，２９０号に示されるように、ＰＥＧ連結基を用いて、細胞結合性剤に連結してもよい。これらのＰＥＧ連結基は
、水中および非水性溶媒中の両方で、可溶性であり、そしてこれを用いて、１以上の細胞傷害性剤を、細胞結合性剤に連結してもよい。典型的なＰＥＧ連結基には、一端の官能性スルフヒドリル基またはジスルフィド基、およびもう一端の活性エステルを通じて、リンカーの反対の端で、細胞傷害性剤および細胞結合性剤に結合する、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーが含まれる。
【０１６０】
［１７５］ＰＥＧ連結基を用いた、細胞傷害性コンジュゲートの合成の一般的な例として、特定の詳細に関して、米国出願第１０／０２４，２９０号に再び言及する。合成は、反応性ＰＥＧ部分を所持する１以上の細胞傷害性剤と細胞結合性剤の反応で始まり、この反応が、細胞結合性剤のアミノ酸残基による、各反応性ＰＥＧ部分の末端活性エステルの置換を生じ、ＰＥＧ連結基を通じて細胞結合性剤に共有結合した１以上の細胞傷害性剤を含む、細胞傷害性コンジュゲートを生じる。
【０１６１】
タキサン
［１７６］本発明記載の細胞傷害性コンジュゲートで用いる細胞傷害性剤はまた、タキサンまたはその誘導体であってもよい。
【０１６２】
［１７７］タキサンは、細胞傷害性天然産物であるパクリタキセル（タキソール）、および半合成誘導体であるドセタキセル（タキソテール）を含む化合物ファミリーであり、これらの２つの化合物は、癌の治療に広く用いられている。タキサンは、チューブリンの脱分極を阻害し、細胞死を生じる、紡錘体毒物である。ドセタキセルおよびパクリタキセルは、癌治療に有用な剤であるが、正常細胞に対して非特異的に毒性であるため、その抗腫瘍活性は限定される。さらに、パクリタキセルおよびドセタキセルのような化合物は、それ自体、細胞結合性剤のコンジュゲートにおいて使用するには、十分に強力ではない。
【０１６３】
［１７８］細胞傷害性コンジュゲートの調製に使用するのに好ましいタキサンは、式（ＸＩ）のタキサン：
【０１６４】
【化２４】

【０１６５】
である。
［１７９］抗体などの細胞結合性剤にタキサンをコンジュゲート化するための方法とともに、本発明の細胞傷害性コンジュゲートにおいて使用可能なタキサンを合成するための方法が、米国特許第５，４１６，０６４号、第５，４７５，０９２号、第６，３４０，７０１号、第６，３７２，７３８号および第６，４３６，９３１号、ならびに米国出願第１０／０２４，２９０号、第１０／１４４，０４２号、第１０／２０７，８１４号、第１０／２１０，１１２号および第１０／３６９，５６３号に詳細に記載される。
【０１６６】
ＣＣ−１０６５類似体
［１８０］本発明記載の細胞傷害性コンジュゲートで使用する細胞傷害性剤はまた、ＣＣ−１０６５またはその誘導体であってもよい。
【０１６７】
［１８１］ＣＣ−１０６５は、ストレプトミセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓ）の培養ブロスから単離される、強力な抗腫瘍抗生物質である。ＣＣ−１０６５は、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンクリスチンなどの、一般的に用いられる抗癌薬剤よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、約１０００倍強力である（Ｂ．Ｋ． Ｂｈｕｙａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４２， ３５３２−３５３７（１９８２））。ＣＣ−１０６５およびその類似体は、米国特許第６，３７２，７３８号、第６，３４０，７０１号、第５，８４６，５４５号および第５，５８５，４９９号に開示される。
【０１６８】
［１８２］ＣＣ−１０６５の細胞傷害能は、そのアルキル化活性、およびそのＤＮＡ結合またはＤＮＡ挿入活性と相関付けられてきている。これらの２つの活性は、分子の別個の部分に属する。したがって、アルキル化活性は、シクロプロパピロロインドール（ＣＰＩ）・サブユニットに含有され、そしてＤＮＡ結合活性は、２つのピロロインドール・サブユニット中に属する。
【０１６９】
［１８３］ＣＣ−１０６５は、細胞傷害性剤として特定の魅力的な特徴を有するが、療法的使用においては限界を有する。マウスにＣＣ−１０６５を投与すると、遅延型肝毒性が引き起こされ、１２．５μｇ／ｋｇの単回静脈内用量後、第５０日での死亡を導く｛Ｖ． Ｌ． Ｒｅｙｎｏｌｄｓら， Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ＸＸＩＸ， ３１９−３３４（１９８６）｝。このことから、遅延型毒性を引き起こさない類似体を開発する努力に拍車がかかり、そしてＣＣ−１０６５をモデルとするより単純な類似体の合成が記載されてきている｛Ｍ．Ａ． Ｗａｒｐｅｈｏｓｋｉら， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３１， ５９０−６０３（１９８８）｝。
【０１７０】
［１８４］別の一連の類似体において、ＣＰＩ部分がシクロプロパベンズインドール（ＣＢＩ）部分によって置換された｛Ｄ．Ｌ． Ｂｏｇｅｒら， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ５５， ５８２３−５８３３， （１９９０）， Ｄ．Ｌ． Ｂｏｇｅｒら， ＢｉｏＯｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １， １１５−１２０（１９９１）｝。これらの化合物は、マウスにおいて、遅延型毒性を引き起こすことなく、親薬剤の高いｉｎ ｖｉｔｒｏ強度を維持する。ＣＣ−１０６５同様、これらの化合物は、共有結合性の方式でＤＮＡの副溝に結合して、細胞死を生じる、アルキル化剤である。しかし、最も有望な類似体、アドゼレシンおよびカルゼレシンの臨床的評価は、期待はずれの結果を導いた｛Ｂ．Ｆ． Ｆｏｓｔｅｒら， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ， １３， ３２１−３２６（１９９６）； Ｉ． Ｗｏｌｆｆら， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２，１７１７−１７２３（１９９６）｝。これらの薬剤は、全身毒性が高いため、劣った療法効果を示す。
【０１７１】
［１８５］腫瘍部位へのターゲティング送達を通じて、ｉｎ ｖｉｖｏ分布を変化させ、ターゲティングされない組織に対するより低い毒性、そしてしたがって、より低い全身毒性を生じることによって、ＣＣ−１０６５類似体の療法的有効性を非常に改善することも可能である。この目的を達成するため、腫瘍細胞を特異的にターゲティングする、細胞結合性剤とＣＣ−１０６５の類似体および誘導体のコンジュゲートが記載されてきている｛米国特許第５，４７５，０９２号；第５，５８５，４９９号；第５，８４６，５４５号｝。これらのコンジュゲートは、典型的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高いターゲット特異的細胞傷害性を示し、そしてマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片モデルにおいて、ひときわ優れた抗腫瘍活性を示す｛Ｒ．Ｖ．Ｊ． Ｃｈａｒｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５， ４０７９−４０８４（１９９５）｝。
【０１７２】
［１８６］抗体などの細胞結合性剤に類似体をコンジュゲート化するための方法とともに、本発明の細胞傷害性コンジュゲートで使用可能なＣＣ−１０６５類似体を合成するための方法が、米国特許第５，４７５，０９２号、第５，８４６，５４５号、第５，５８５，４９９号、第６，５３４，６６０号および第６，５８６，６１８号に、そして米国出願第１０／１１６，０５３号および第１０／２６５，４５２号に、詳細に記載される。
【０１７３】
他の薬剤
［１８７］メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、カリケアマイシン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）およびチューブリシン類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体などの薬剤もまた、本発明のコンジュゲートの調製に適している。また、血清アルブミンなどの仲介キャリアー分子を通じて、抗体分子に薬剤分子を連結させてもよい。米国第０９／７４０９９１号に記載されるように、ドキソルビシンおよびダウノルビシン化合物もまた、有用な細胞傷害性剤でありうる。
【０１７４】
療法組成物
［１８８］本発明はまた：
（ａ）１以上の細胞傷害性コンジュゲートの有効量、および
（ｂ）薬学的に許容しうるキャリアー
を含む療法組成物も提供する。
【０１７５】
［１８９］同様に、本発明は、選択した細胞集団の増殖を阻害するための方法であって、ターゲット細胞、またはターゲット細胞を含有する組織を、有効量の細胞傷害性コンジュゲート、または細胞傷害性コンジュゲートを含む療法剤と、単独で、あるいは他の細胞傷害性剤または療法剤と組み合わせて、接触させることを含む、前記方法を提供する。
【０１７６】
［１９０］本発明はまた、本発明の療法組成物を用いて、癌を有する被験体を治療するための方法も含む。
［１９１］先に記載される方法によって、細胞傷害性コンジュゲートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ強度および特異性に関して評価することができる（例えば、Ｒ．Ｖ．Ｊ． Ｃｈａｒｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５：４０７９−４０８４（１９９５）を参照されたい）。やはり先に記載される方法によって、マウスにおけるヒト腫瘍異種移植モデルにおいて、抗腫瘍活性を評価することができる（例えば、Ｌｉｕら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：８６１８−８６２３（１９９６）を参照されたい）。
【０１７７】
［１９２］適切な薬学的に許容しうるキャリアーが周知であり、そして臨床状況が保証するように、一般の当業者によって決定可能である。本明細書において、キャリアーには希釈剤および賦形剤が含まれる。
【０１７８】
［１９３］適切なキャリアー、希釈剤および／または賦形剤の例には：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するかまたは含有しない、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ〜７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが含まれ；そしてまた、こうしたキャリアーは、トリプタミンなどの酸化防止剤、およびＴｗｅｅｎ２０などの安定化剤を含有してもよい。
【０１７９】
［１９４］選択した細胞集団の増殖を阻害するための方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ
ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。本明細書において、増殖の
阻害は、短期間であれ、または長期間であれ、細胞の増殖の遅延、細胞生存度の減少、細胞死を引き起こすこと、細胞溶解、および細胞死の誘導を意味する。
【０１８０】
［１９５］ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用の例には、疾患細胞または悪性細胞を殺すための、同じ患者への移植前の自己骨髄の治療；適格性Ｔ細胞を殺し、そして移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための、移植前の骨髄の治療；ターゲット抗原を発現していない望ましい変異体以外のすべての細胞を殺すか；または望ましくない抗原を発現する変異体を殺すための、細胞培養の治療が含まれる。
【０１８１】
［１９６］非臨床的ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用の条件は、一般の当業者によって容易に決定される。
［１９７］臨床的ｅｘ ｖｉｖｏ使用の例は、癌治療において、または自己免疫疾患治療において、自己移植前に、骨髄から腫瘍細胞またはリンパ球を取り除くこと、あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するため、移植前に、自己または同種骨髄または組織からＴ細胞または他のリンパ球を取り除くことである。治療を以下のように行ってもよい。骨髄を患者または他の個体から採取し、そして次いで、本発明の細胞傷害性剤を添加した、血清を含有する培地中でインキュベーションする。濃度は、約１０μＭ〜１ｐＭの範囲であり、約３７℃で約３０分間〜約４８時間、インキュベーションする。濃度およびインキュベーション時間、すなわち用量の正確な条件は、一般の当業者によって容易に決定される。インキュベーション後、血清を含有する培地で、骨髄細胞を洗浄し、そして既知の方法にしたがって、ｉ．ｖ．注入によって、患者に戻す。患者が骨髄採取時および処置細胞の再注入の間に切除化学療法または全身照射過程などの他の治療を受ける状況下では、標準的医学装置を用いて、液体窒素中で処置骨髄細胞を凍結保存してもよい。
【０１８２】
［１９８］臨床的ｉｎ ｖｉｖｏ使用のため、本発明の細胞傷害性コンジュゲートを溶液として供給して、無菌性および内毒素レベルに関して試験する。細胞傷害性コンジュゲート投与の適切なプロトコルの例は、以下のとおりである。コンジュゲートを毎週、４週間、ｉ．ｖ．ボーラスとして投与する。ボーラス用量は、生理食塩水５０〜１００ｍｌ中で投与され、これに５〜１０ｍｌのヒト血清アルブミンを添加してもよい。投薬量は、ｉ．ｖ．投与あたり１０μｇ〜１００ｍｇである（１日あたり、１００ｎｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲）。より好ましくは、投薬量は、５０μｇ〜３０ｍｇの範囲であろう。最も好ましくは、投薬量は、１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲であろう。治療４週後、患者に、毎週、治療を投与し続けてもよい。臨床状況が保証するように、投与経路、賦形剤、希釈剤、投薬量、時間等に関して、特定の臨床プロトコルを、一般の当業者が決定してもよい。
【０１８３】
［１９９］選択した細胞集団を殺すｉｎ ｖｉｖｏ法またはｅｘ ｖｉｖｏ法にしたがって治療可能な医学的条件の例には、ＣＡ６が発現されている、例えば肺、乳房、結腸、前立腺、腎臓、膵臓、卵巣、子宮頸部およびリンパ器官の癌、骨肉腫、滑膜癌、肉腫または癌腫、ならびにＣＡ６グリコトープが主に発現されている、まだ決定されていない他の癌を含む、いかなる種類の悪性腫瘍も含まれ；全身性狼瘡（systemic lupus）、関節リウマチ、および多発性硬化症などの自己免疫疾患；腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、および骨髄移植拒絶などの移植片拒絶；移植片対宿主病；ｍＶ感染、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ等のウイルス感染；ならびにランブルべん毛虫症、アメーバ症、住血吸虫症などの寄生虫感染、および一般の当業者によって決定されるような他のものが含まれる。
【０１８４】
キット
［２００］本発明にはまた、例えば記載する細胞傷害性コンジュゲート、および特定の細胞種を殺すための細胞傷害性コンジュゲートの使用のための説明書を含むキットも含まれる。使用説明書には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで細胞
傷害性コンジュゲートを使用するための指示が含まれてもよい。
【０１８５】
［２０１］典型的には、キットは、細胞傷害性コンジュゲートを含有する区画を有するであろう。細胞傷害性コンジュゲートは、凍結乾燥型、液体型、またはキットに含まれるよう受け入れ可能な他の型であってもよい。キットはまた、キット中の使用説明書に記載される方法を実施するのに必要なさらなる要素、例えば凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者に投与する前に、細胞傷害性コンジュゲートと組み合わせるためのさらなる剤、および患者にコンジュゲートを投与するのに役立つツールも含有してもよい。
【０１８６】
さらなる態様
［２０２］本発明は、研究または診断適用で使用するためにさらに標識されている、モノクローナル抗体、ヒト化抗体およびそのエピトープ結合性断片をさらに提供する。好ましい態様において、標識は、放射標識、蛍光体、発色団、造影剤または金属イオンである。
【０１８７】
［２０３］前記の標識ヒト化抗体またはそのエピトープ結合性断片を、癌を有すると推測される被験体に投与し、そして被験体体内の標識分布を測定するかまたは監視する、診断法もまた、提供する。
【実施例】
【０１８８】
実施例
［２０４］本発明の広い範囲は、以下の実施例を参照すると最適に理解され、これらは本発明を特定の態様に限定することを意図しない。
【０１８９】
実施例１：フローサイトメトリー結合アッセイによる、抗原陽性および陰性細胞株の同定
［２０５］フローサイトメトリー分析を用いて、ＤＳ６エピトープ、ＣＡ６を細胞表面に局在させた。ＯＶＣＡＲ５（Ｋｅａｒｓｅら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ８８（６）：８６６−８７２（２０００））、ＯＶＣＡＲ８およびＩＧＲＯＶ１細胞（Ｍ． Ｓｅｉｄｅｎ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）を除いて、ヒト細胞株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た。本明細書において、以後、培地と称する、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ、メイン州ロックランド）および１０％ｖ／ｖウシ胎児血清（Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、コロラド州フォートコリンズ）を補ったＲＰＭＩ１６４０中で、すべての細胞を増殖させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中で維持した。
【０１９０】
［２０６］９６ウェルプレート中、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ヤギ血清、ＲＰＭＩ）中で調製した連続希釈濃度のＤＳ６抗体と、細胞（１〜２ｘ１０^−５細胞／ウェル）を氷上で３〜４時間インキュベーションした。卓上遠心分離装置中、１５００ｒｐｍ、４℃で５分間、細胞を回転させて落とした。培地を取り除いた後、ウェルに１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を再度満たした。次いで、洗浄工程を反復した。ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＦＡＣＳ緩衝液に対して１：１００に希釈し、そして氷上で１時間、細胞とインキュベーションした。プレートをホイルで覆い、シグナルの光退色を防いだ。２回の洗浄後、細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメーター上で分析した。
【０１９１】
［２０７］腫瘍免疫組織化学から予測されるように、ＣＡ６エピトープは、主に、卵巣、乳房、子宮頸部、および膵臓起源の細胞株で見られる（表３）。しかし、他の腫瘍種のいくつかの細胞株が、限定されたＣＡ６発現を示した。ＤＳ６抗体は、１３５．６ｐＭの見かけのＫ_Ｄで結合する（ＰＣ−３細胞において、表３）。抗原陽性細胞株における結合
曲線（図１）の最大平均蛍光（表３）は、相対的抗原密度を示唆する。
表３
【０１９２】
【表４】

【０１９３】
^＊平均最大相対的平均蛍光
【０１９４】
実施例２：ＤＳ６エピトープの性質決定
［２０８］タンパク質分解（プロナーゼおよびプロテイナーゼＫ）および／または糖分解（ノイラミニダーゼおよび過ヨウ素酸）処理で消化した、ＣＡ６陽性細胞溶解物（Ｃａｏｖ−３）のドットブロットを免疫ブロッティングすることによって、ＤＳ６抗原、ＣＡ６の特性を分析した。陽性対照には、多様なエピトープ種を認識する他の抗体を、抗原陽性細胞株の溶解物に対して試験した（Ｃａｏｖ−３およびＣＭ１；Ｃｏｌｏ２０５およびＣ２４２；ＳＫＭＥＬ２８およびＲ２４）。ＣＭ１は、Ｍｕｃ−１の可変数タンデム反復ドメイン（ＶＮＴＲ）のタンパク質エピトープを認識する抗体であり、そしてしたがって、タンパク質エピトープに関する対照を提供する。Ｃ２４２は、Ｍｕｃ−１上の新規結腸直腸癌特異的シアル酸依存性グリコトープ（ＣａｎＡｇ）に結合し、これはタンパク質上のグリコトープに関する対照を提供する。Ｒ２４は、黒色腫に特異的なＧＤ３ガングリオシドに結合し、そしてしたがって、非タンパク質骨格上のグリコトープに関する対照を提供する。
【０１９５】
［２０９］Ｃａｏｖ−３、Ｃｏｌｏ２０５、およびＳＫＭＥＬ２８細胞を１５ｃｍ組織培養プレート中にプレーティングした。培地（３０ｍｌ／プレート）を溶解前日に新しくした。修飾ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、およびアプロチニン）、およびＰＢＳを氷上であらかじめ冷却した。培地をプレートから吸引した後、１０ｍｌの冷却ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。続くすべての工程を、氷上および／または４℃の低
温室で行った。ＰＢＳの最後の洗浄液を吸引した後、溶解緩衝液（最終濃度１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μＭペプスタチンＡ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、および２μｇ／ｍｌアプロチニンまで、プロテアーゼ阻害剤を新鮮に添加した、ＲＩＰＡ緩衝液）１〜２ｍｌ中で細胞を溶解した。細胞リフターを用いて、プレートから溶解物をこそげ落とし、そして１８Ｇ針で懸濁物を上下に（５〜１０回）ピペッティングすることによって、すりつぶした（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）。溶解物を１０分間回転させ、そして次いで、最大出力で１０分間微量遠心分離装置中で遠心分離した（１３Ｋ ｒｐｍ）。ペレットを廃棄し、そして次いで、ブラッドフォード・タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて上清をアッセイした。
【０１９６】
［２１０］乾いた０．２μｍニトロセルロース膜上に、溶解物（２μｌ）を直接ピペッティングした。スポットをおよそ３０分間風乾させた。膜を、各々、単一のスポットを含有するピースに分けた。プロナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ酵素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ_２）、プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ酵素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ_２）、ノイラミニダーゼ（２０ｍＵ／ｍｌ酵素、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）または過ヨウ素酸（２０ｍＭ、０．５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５）の存在下で、スポットを３７℃で１時間インキュベーションした。Ｒｏｃｈｅ（酵素）およびＶＷＲ（過ヨウ素酸）から試薬を購入した。Ｔ−ＴＢＳ洗浄緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｘＴＢＳ）中で膜を洗浄し（５分間）、ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ、Ｔ−ＴＢＳ）中で、室温で２時間ブロッキングし、そしてブロッキング緩衝液中、２μｇ／ｍｌの一次抗体（すなわちＤＳ６、ＣＭ１、Ｃ２４２、Ｒ２４）で一晩インキュベーションした。Ｔ−ＴＢＳ中で５分間、膜を３回洗浄し、そして次いで、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗マウス（またはヒト）ＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；ブロッキング緩衝液中、１：２０００希釈）と、室温で１時間インキュベーションした。免疫ブロットを３回洗浄し、そしてＥＣＬ系（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて現像した。
【０１９７】
［２１１］消化した対照溶解物の免疫ブロット（図２）は、タンパク質分解処理によってＣＭ１シグナルが破壊される一方、糖分解消化のシグナルは、タンパク質エピトープを認識する抗体に関して予測されるように、影響を受けなかったことを示した。Ｃ２４２シグナルは、タンパク質上に見られるグリコトープを認識する抗体に関して予測されるように、タンパク質分解処理または糖分解処理のいずれによっても破壊された。タンパク質分解処理によって影響を受けなかったＲ２４シグナルは、ガングリオシドを認識する抗体に関して予測されるように、ノイラミニダーゼ処理または過ヨウ素酸処理で消滅した。消化したＣａｏｖ−３溶解物のＤＳ６免疫ブロットは、タンパク質分解化合物および糖分解化合物のいずれかでの処理に際して、シグナル喪失を示した。したがって、Ｃ２４２同様、ＤＳ６は、タンパク性コア上の炭水化物エピトープに結合する。さらに、ＤＳ６免疫ブロット中のシグナルは、ノイラミニダーゼ処理に感受性であった。したがって、ＣａｎＡｇ同様、ＣＡ６は、シアル酸依存性グリコトープである。
【０１９８】
［２１２］ＣＡ６が炭水化物性であることを確認するため、Ｃａｏｖ−３溶解物をＰＶＤＦ膜上にスポッティングし、そして化学的脱グリコシル化剤、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）で、窒素下、周囲温度で５分間、処理した。ブロットをＴ−ＴＢＳで洗浄し、そしてＣＭ１またはＤＳ６のいずれかで免疫ブロッティングした（図３）。ＤＳ６シグナルは、酸処理で破壊され、ＣＡ６がグリコトープであるさらなる証拠が提供された。ＴＦＳＭＡ処理に際してＣＭ１シグナルが増進することから、酸処理がフィルター上のタンパク質に影響を及ぼさないことが示され、そして糖分解処理によって、ＣＭ１が認識するタンパク質エピトープが暴露されることが示唆される。
【０１９９】
［２１３］ＣＡ６が属する炭水化物の構造をさらに解明するため、ドットブロットをＮ
−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、および／またはシアリダーゼ（図４）で消化した。Ｃａｏｖ−３細胞溶解物（１００μｇ、３０μｌ）を、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含有する変性緩衝液（Ｇｌｙｋｏ）２．５μｌと１００℃で５分間インキュベーションした。次いで、変性溶解物を１μｌのＮ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、および／またはシアリダーゼＡ（Ｇｌｙｋｏ）を用いて、３７℃で１時間消化した。次いで、消化した溶解物をニトロセルロース上にスポッティングし（２μｌ）、そして上述のように免疫ブロッティングした。
【０２００】
［２１４］Ｎ−グリカナーゼは、ＤＳ６免疫ブロットシグナルに対して明らかな影響がなかった。しかし、シアリダーゼで消化した試料はまったくシグナルを生じなかった。Ｏ−グリカナーゼは、シアリダーゼでの前処理なしには、シアル化されたＯ連結炭水化物を消化不能であるため、Ｏ−グリカナーゼ単独でプロセシングした試料のＤＳ６シグナルは、影響を受けないであろう。対照的に、Ｎ−グリカナーゼは、活性のため、いかなるグリコシド酵素での前処理も必要としない。Ｎ−グリカナーゼ処理がＤＳ６シグナルに影響を及ぼさないという事実は、ＣＡ６エピトープが、シアル化Ｏ連結炭水化物鎖上に存在する可能性が最も高いことを示唆する。
【０２０１】
実施例３：ＣＡ６エピトープが見出される抗原の解明
［２１５］ＣＡ６シアログリコトープが見出される抗原を同定するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって、ＤＳ６免疫沈降物を分析した。細胞溶解物上清（１ｍｌ／試料；３〜５ｍｇタンパク質）をプロテインＧビーズ（３０μｌ）であらかじめきれいにし、回転させながら４℃で１〜２時間、１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液で平衡化させた。続くすべての工程を、氷上および／または４℃の低温室で行った。あらかじめきれいにしたビーズを、微量遠心分離装置中、簡単に（２〜３秒）回転させて落とした。あらかじめきれいにした上清を、新しい試験管に移し、そして回転させながら、２μｇのＤＳ６と一晩インキュベーションした。新鮮な、平衡化プロテインＧビーズ（３０μｌ）を溶解物に添加し、そして回転させながら、１時間インキュベーションした。ビーズ−溶解物懸濁物を、微量遠心分離装置中、簡単に回転させて落とし、そして場合によって、免疫沈降後の溶解物の試料を採取した。１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液で、ビーズを５〜１０回洗浄した。
【０２０２】
［２１６］次いで、免疫沈降したＤＳ６試料を、３０μｌのノイラミニダーゼ（２０ｍＵノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）または３０μｌの過ヨウ素酸（２０ｍＭ過ヨウ素酸（ＶＷＲ）、０．５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５）で、３７℃で１時間消化した。次いで、これらを、２ｘ試料装填緩衝液（β−メルカプトエタノールを含有する）３０μｌ中に再懸濁した。ビーズを５分間煮沸し、そして装填緩衝液上清を、４〜１２％または４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン・ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に装填した。Ｌａｅｍｍｌｉ電気泳動緩衝液中、１２５Ｖで１．５時間、ゲルを泳動した。Ｍｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔトランスファー装置（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、０．２μｍニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に、ゲル試料を２０ｍＡで一晩トランスファーした。実施例２に上述するように、ＤＳ６で膜を免疫ブロッティングした。
【０２０３】
［２１７］あるいは、免疫沈降したビーズをまず変性させ、そして次いで、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはシアリダーゼＡ（Ｇｌｙｋｏ）で酵素的に消化した。２７μｌのインキュベーション緩衝液および２μｌの変性溶液（Ｇｌｙｋｏ）中にビーズを再懸濁し、そして１００℃で５分間インキュベーションした。室温に冷却した後、界面活性剤溶液（２μｌ）を添加し、そして試料を１μｌのＮ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカナーゼ、および／またはシアリダーゼＡと、３７℃で４時間インキュベーションした。５ｘ試料装填緩衝液（７μｌ）を添加した後、試料を５分間煮沸した。試料をＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供し、そして上述のように、免疫ブロッティングした。
【０２０４】
［２１８］ＤＳ６は、抗原陽性細胞溶解物中に見られうる、＞２５０ｋＤａのタンパク質バンドを免疫沈降する（図５Ａ、ＢおよびＣ）。ある細胞株（すなわちＴ−４７Ｄ）では、ダブレットが観察される。＞２５０ｋＤａバンドは、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸で処理したＣａｏｖ−３免疫沈降物では消失し（図５ＡおよびＢ）、ＣＡ６エピトープが、＞２５０ｋＤａバンド上に属することが示唆される。＞２５０ｋＤａバンドはまた、免疫沈降物のＮ−グリカナーゼ処理には感受性ではないことも示され、このことは、ＣＡ６がＯ連結炭水化物上に属することと一致する（図５Ｆ）。２５０ｋＤａバンドがＣＡ６抗原であることをさらに支持するのは、ＤＳ６が、ＤＳ６抗原陰性細胞から、こうしたバンドを免疫沈降させないという事実である（図５ＤおよびＥ）。
【０２０５】
［２１９］いくつかの系列の証拠が、ＣＡ６抗原がＭｕｃ１であることを示唆した。分子量が高く、そしてＯ連結炭水化物特異的糖分解酵素に感受性であるため、ＣＡ６抗原がムチンである可能性が高いようである。ムチン過剰発現は、腫瘍、特に乳房および卵巣の腫瘍でよく特徴付けられており、これは、ＤＳ６の主な腫瘍反応性と一致する。さらに、ＣＡ６は、ＣａｎＡｇ（Ｍｕｃ１上のシアログリコトープ）同様、過塩素酸沈殿に感受性ではなく、ＣＡ６抗原が、非常にＯ−グリコシル化されていることが示唆される。いくつかのＤＳ６発現細胞株において、ＤＳ６が、＞２５０ｋＤａのダブレットを免疫沈降させた観察から、ＣＡ６がＭｕｃ１であることが示唆された。ヒトにおけるＭｕｃ１の特質は、タンデム反復数が異なる２つの別個のＭｕｃ１アレルの存在であり、これは異なる分子量の２つのＭｕｃ１タンパク質の発現を生じる。
【０２０６】
［２２０］ＣＡ６がＭｕｃ１上に見られるかどうかを試験するため、Ｃａｏｖ−３溶解物からのＤＳ６免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＤＳ６、またはＭｕｃ１ＶＮＴＲ抗体、ＣＭ１のいずれかで免疫ブロッティングした。図６Ａに見られうるように、ＣＭ１は、ＤＳ６によって免疫沈降される＞２５０ｋＤａバンドと強く反応する。図６Ｂでは、ＨｅＬａ細胞溶解物からのＤＳ６およびＣＭ１免疫沈降物は、ＤＳ６またはＣＭ１のいずれかで免疫ブロッティングした際、同じ＞２５０ｋＤａダブレットを示す。これらの結果によって、ＣＡ６エピトープは実際、Ｍｕｃ−１タンパク質上に位置することが示される。ＨｅＬａ（およびＴ−４７Ｄ）細胞に見られるＤＳ６ダブレットは、Ｍｕｃ−１発現が、異なる数のタンデム反復を有する別個のアレルによって指示されるという事実によって説明可能である。
【０２０７】
［２２１］ＣＭ１およびＤＳ６は、同じＭｕｃ−１タンパク質に結合するが、これらは別個のエピトープである。トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）によるＣａｏｖ−３溶解物ドットブロットの化学的脱グリコシル化によって、ＤＳ６シグナルが消滅した（図３）。しかし、この同じ処理は、ＣＭ１シグナルを増進させた。脱グリコシル化が、ＣＭ１抗体の隠れたエピトープを暴露した可能性もある。さらに、ＤＳ６およびＣＭ１のフローサイトメトリー結合結果の比較（表４）によって、ＣＡ６エピトープが、Ｍｕｃ１を発現するすべての細胞上には存在しないことが示される。高レベルのＭｕｃ１ ＣａｎＡｇシアログリコトープを発現することが知られる細胞株であるＣｏｌｏ２０５上に、ＣＡ６エピトープが発現されないことに注目すると興味深い（表３）。
表４
【０２０８】
【表５】

【０２０９】
^＊ＭＭＦ＝最大平均相対的蛍光
【０２１０】
実施例４：脱落（ｓｈｅｄ）ＣＡ６エピトープの定量的分析
［２２２］ＣＡ６エピトープは、多くの癌患者において、血流内に脱落することが知られる分子であるＭｕｃ１上に属するため、こうしたレベルがＤＳ６抗体療法を禁ずるほどであるかどうかを決定するために、定量的アプローチを行った。抗原に循環抗体が結合すると、血液からの免疫複合体の迅速なクリアランスにつながると考えられる。投与した抗体用量のかなりの部分が循環から迅速に除去されるならば、腫瘍に到達する量は、減少する可能性が高く、抗体療法剤の抗腫瘍活性の減少を生じる。抗体を非常に強力な細胞傷害性化合物にコンジュゲート化すると、コンジュゲートの迅速なクリアランスが、非特異的な毒性を潜在的に増加させうる。したがって、ＤＳ６−ＤＭ１などの抗体−小薬剤コンジュゲートの場合、高レベルの脱落抗原は、抗腫瘍効果を減少させ、そしてかつ用量を制限する毒性を増加させると予期されうる。
【０２１１】
［２２３］抗体療法剤の最近の臨床試験は、薬物動態に対する脱落抗原濃度の影響に関する情報を生じた。例えば、ｈｅｒ２／ｎｅｕを発現する転移性乳癌治療に使用する抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン）を用いた臨床試験において、トラスツズマブ・クリアランスの薬物動態は、脱落Ｈｅｒ２／ｎｅｕレベルが５００ｎｇ／ｍｌ未満である場合、改変されないことが示された（Ｐｅｇｒａｍら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．
１６（８）：２６５９−７１（１９９８））。脱落Ｈｅｒ２／ｎｅｕの分子量を１１０，０００ダルトンと仮定すると、４．５ｎＭ未満の脱落Ｈｅｒ２／ｎｅｕのモル濃度は、薬物動態にほとんど影響を及ぼさないようである。
【０２１２】
［２２４］別の例において、カンツズマブ・マータンシン（ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（ｈｕＣ２４２−ＤＭｌ）を用いた臨床試験によって、処置前脱落ＣａｎＡｇ（Ｃ２４２エピトープ）レベルおよび抗体クリアランスの薬物動態に相関がないことが示された（Ｔｏｌｃｈｅｒら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２１（２）：２１１−２２（２００３））。ＣａｎＡｇエピトープは、ＤＳ６によって認識されるＣＡ６エピトープ同様、Ｍｕｃ１上のユニークな腫瘍特異的Ｏ連結シアログリコトープである。しかし、ＣａｎＡｇエピトープは不均一性であるため、モルで定量化するのが困難である。一般集団において、Ｍｕｃ１アレルは、可変数タンデム反復（ＶＮＴＲ）ドメイン中のタンデム反復数に応じて、長さが多様である。Ｏ連結グリコシル化のためのいくつかの部位が、各タンデム反復中に存在する。ＣａｎＡｇ発現の複雑さに加えて、生得的なグリコシルトランスフェラーゼ活性には、細胞間変動がある。したがって、単一の患者においてであってさえ、Ｍｕｃ１分子あたり、広い範囲のＣａｎＡｇエピトープがありうる。さらに、Ｍｕｃ１分子あたりのＣａｎＡｇエピトープの比は、患者集団に渡って異なるであろう。このため、ＣａｎＡｇエピトープを含む脱落Ｍｕｃ１が、Ｃ２４２に捕捉され、
そしてビオチン化Ｃ２４２／ストレプトアビジンＨＲＰ系によって検出される、サンドイッチＥＬＩＳＡによって、血清試料中の脱落ＣａｎＡｇを測定する。Ｍｕｃ１のモル濃度によるのではなく、血清１ｍｌあたりのエピトープ数に比例する標準化単位で、脱落ＣａｎＡｇを定量化する。同様に、脱落ＣＡ６エピトープの定量化に関して、類似の状況が生じる。対照的に、トラスツズマブに関しては、脱落ｈｅｒ２／ｎｅｕ分子あたりにただ１つのエピトープしかなく、脱落抗原の定量化は非常に単純化される。
【０２１３】
［２２５］トラスツズマブおよびカンツズマブ・マータンシンを用いた臨床試験で見られるものに、ＣＡ６脱落エピトープレベルを関連させるため、Ｍｕｃ１上のシアログリコトープなどの複雑な脱落エピトープのモル濃度を得るための方法を開発した。まず、ＤＳ６に関する単純サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを確立した。代表的なアッセイを図７Ａに示す。ＤＳ６を用いて、ＣＡ６エピトープを有するＭｕｃ１を捕捉した。各Ｍｕｃ１分子は複数のＣＡ６エピトープを有するため、ビオチン化ＤＳ６を、トレーサー抗体としてもまた用いた。基質としてＡＢＴＳを用い、ストレプトアビジン−ＨＲＰによって、捕捉されたＣＡ６に結合したビオチン化ＤＳ６を検出した。卵巣癌患者血清から、または乳癌患者において脱落Ｍｕｃ１を監視するために用いられる商業的に入手可能なＭｕｃ１試験キット（ＣＡ１５−３）に由来する標準から、ＣＡ６エピトープを捕捉した。ＤＳ６単位／ｍｌを、恣意的に、ＣＡ１５−３標準単位／ｍｌに等しく設定した。
【０２１４】
［２２６］図７Ｂにおいて、ＣＡ１５−３標準を用いる、ＤＳ６サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。生じる曲線は、ＣＡ１５−３アッセイにおいて、ＣＡ１５−３標準で得られるものと非常に類似である。ＤＳ６単位／ｍｌを、ＣＡ６のモル濃度に変換するため、シグナルをＤＳ６のピコグラムに変換する、ビオチン化ＤＳ６に関する標準曲線が必要である。ＣＡ６エピトープおよびビオチン化ＤＳ６抗体間は１対１の化学量論であり、そしてビオチン化ＤＳ６の分子量は１６０，０００ダルトンであると仮定して、添加した試料体積あたりに捕捉されるＣＡ６のモル数を計算してもよい。
【０２１５】
［２２７］図８ＡおよびＢにおいて、ビオチン化ＤＳ６に関する標準曲線を生じる、２つの代替手段を示す。図８Ａにおいて、ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を用いて、ビオチン化ＤＳ６を捕捉し、これを次に、図７に示すサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで用いるものと同一の方式で検出する。図８Ｂに示す方法において、ビオチン化ＤＳ６を、ＥＬＩＳＡプレート上に直接プレーティングし、そして図８Ａにおけるように検出する。図８Ｃにおいて見られるように、各方法によって生成されるビオチン化ＤＳ６標準曲線は、十分一致している。
【０２１６】
［２２８］表５において、多様な脱落抗原に関する卵巣癌患者血清試料の分析を示す。一般的に、ＣＡ１２５ ＥＬＩＳＡを用いて、脱落ＣＡ１２５単位／ｍｌを測定することによって、卵巣癌患者の治療を監視する。血清試料を用いて、ＣＡ１２５状態を提供する。一般的に、ＣＡ１５−３ ＥＬＩＳＡを用いて、ＤＳ６によって認識されるものと異なるエピトープを認識する捕捉および検出抗体を用い、脱落Ｍｕｃ１の単位／ｍｌを測定することによって、乳癌患者の治療を監視する。表５において、卵巣癌患者血清試料において、ＣＡ１５−３を測定する。
表５
【０２１７】
【表６】

【０２１８】
^１商業的ＥＬＩＳＡキットによって測定
^２商業的ＣＡ１５−３標準によって測定（１ ＣＡ１５−３ Ｕ＝１ ＤＳ６ Ｕ）
^３ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチン−ＤＳ６標準曲線
^４ビオチン−ＤＳ６標準曲線
【０２１９】
［２２９］表５に報告するＣＡ１５−３値に関しては、ＣａｎＡｇ Ｄａｇｎｏｓｔｉｃｓの商業的に入手可能なＣＡ１５−３酵素免疫アッセイキットを用いた。ＤＳ６単位／ｍｌに関しては、ＤＳ６サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、ＣＡ１５−３標準（ＣａｎＡｇ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＣＡ１５−３酵素免疫アッセイキット由来）を用いて標準曲線を生成した。ＤＳ６単位／ｍｌを、恣意的に、ＣＡ１５−３単位／ｍｌに等しく設定した。最後の２つの列では、図８Ｃに示すビオチン化ＤＳ６標準曲線を用いて、ピコモル（ｐＭ）脱落ＣＡ６を計算した。
【０２２０】
［２３０］ＣａｎＡｇレベルの定量的分析に関して、ＣａｎＡｇ血清レベルは、処置前にカンツズマブ・マータンシン臨床試験に参加した患者に関して報告されたものであった（Ｔｏｌｃｈｅｒら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２１（２）：２１１−２２（２００３））。ＤＳ６に関して記載されるものと類似のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＣａｎＡｇ標準を用い、ＣａｎＡｇ標準曲線を作成した。Ｃ２４２を用いて、ＣａｎＡｇ標準を捕捉した。ビオチン化Ｃ２４２トレーサーを用いて、その後、基質としてＡＢＴＳを用い、ストレプトアビジン−ＨＲＰで発色させて、捕捉されたＣａｎＡｇの検出を達成した。ビオチン化ＤＳ６に関して行ったように、ビオチン化Ｃ２４２標準曲線を構築して、単位／ｍｌを循環ＣａｎＡｇエピトープのモル濃度に変換することを可能にした。表６において、カンツズマブ・マータンシン臨床試験患者由来のＣａｎＡｇレベルを、循環ＣａｎＡｇの対応する計算モル濃度と一緒に報告する。
表６
【０２２１】
【表７】

【０２２２】
^１サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した、循環ＣａｎＡｇの処置前レベル
^２ヤギ抗マウスＩｇＧおよびビオチン−Ｃ２４２標準曲線
^３ビオチン−Ｃ２４２標準曲線
【０２２３】
［２３１］卵巣癌患者における脱落ＣＡ６のｐＭレベルと、ＣａｎＡｇ陽性癌患者における脱落ＣａｎＡｇに関して計算したものの比較によって、一般的に、脱落ＣＡ６レベルは、脱落ＣａｎＡｇレベルと類似であることが示される。さらに、１６の卵巣癌患者血清試料のうち２つのみが、４．５ｎＭより高いＣＡ６レベルを潜在的に有し（シグナルが標準曲線の範囲から外れている、血清試料５および９）、このレベルは、これより高い場合、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性乳癌患者での臨床試験において、改変されたハーセプチン薬物動態が観察されたレベルであった。４．５ｎＭを超えるＣａｎＡｇレベルは、３７の臨床試験患者のうち３人でのみ見られた。この臨床試験において、脱落ＣａｎＡｇレベルおよびカンツズマブ・マータンシンのより迅速なクリアランスには相関はなかった。しかし、最高のＣａｎＡｇレベル（３１２４０Ｕ／ｍｌ）の患者は、注入後８時間のみ試料採取された。これらの結果によって、Ｍｕｃ１の特定のエピトープ、例えばＣＡ６およびＣａｎＡｇは、癌患者において脱落するものの、抗体療法治療を禁じるレベルまでは脱落しないことが示される。
【０２２４】
実施例６：ネズミＤＳ６抗体可変領域のクローニング
［２３２］ＤＳ６などのネズミ・モノクローナル抗体は、ヒト免疫系によって異質（ｆｏｒｅｉｇｎ）と認識されるため、臨床設定において、有用性が限定されている。患者は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）を迅速に発展させ、ネズミ抗体の迅速なクリアランスを生じる。このため、ネズミＤＳ６（ｍｕＤＳ６）の可変領域の表面を再構成して、ヒト化ＤＳ６（ｈｕＤＳ６）抗体を生じた。
【０２２５】
［２３３］ＲＴ−ＰＣＲによって、ネズミＤＳ６抗体可変領域をクローニングした。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニプレップキットを用いて、ＤＳ６ハイブリドーマ細胞の集密Ｔ１７５フラスコから総ＲＮＡを精製した。ＵＶ分光光度測定によってＲＮＡ濃度を測定し、そしてＧｉｂｃｏ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩキットおよびランダム六量体プライマーを用いて、４〜５μｇ総ＲＮＡでＲＴ反応を行った。
【０２２６】
［２３４］Ｗａｎｇ Ｚら， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｊａｎ １３；２３３（ｌ−２）：１６７−７７（２０００）に記載されるものに基き、縮重プライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ反応混合物を縮重ＰＣＲ反応に直接用いた。３’軽鎖プライマー、ＨｉｎｄＫＬ、
（ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ）（配列番号２５）
および３’重鎖プライマー、ＢａｍＩｇＧ１、
（ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ）（配列番号２６）
を用い、そして５’端に関しては、ＰＣＲプライマーは、軽鎖に関して、Ｓａｃ１ＭＫ
（ＧＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ）（配列番号２７）
そして重鎖に関して、ＥｃｏＲ１ＭＨ１
（ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ）（配列番号２８）およびＥｃｏＲ１ＭＨ２（ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ）（配列番号２９）の等量混合物であった（混合塩基：Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ｎ＝Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）。
【０２２７】
［２３５］１０％ＤＭＳＯを補った以外、ＰＣＲ反応は標準的であった（５０μｌ反応混合物は、最終濃度１ｘ反応緩衝液（ＲＯＣＨＥ）、各２ｍＭのｄＮＴＰ、各１ｍＭのプライマー、２μｌ ＲＴ反応、５μｌ ＤＭＳＯ、および０．５μｌ Ｔａｑ（ＲＯＣＨＥ）を含有した）。Ｗａｎｇ Ｚら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｊａｎ １３；２３３（１−２）：１６７−７７（２０００））から適応させたプログラム：１）９４℃、３分間；２）９４℃、１５秒間；３）４５℃、１分間；４）７２℃、２分間；５）工程２に戻って２９周期；６）７２℃、１０分間の最終伸長工程で終了を用いて、ＭＪ
ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラー上で、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲプライマーによって生成されたＰＣＲ産物を、制限酵素を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローニングした。Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ配列決定サービスによって、重鎖および軽鎖クローンを配列決定した。
【０２２８】
［２３６］５’端ｃＤＮＡ配列を確認するため、さらなるＰＣＲおよびクローニングを行った。縮重ＰＣＲクローンから決定したＤＳ６軽鎖および重鎖ｃＤＮＡ配列をＮＣＢＩのＢｌａｓｔ検索ウェブサイト内に打ち込み、そして提示されたシグナル配列を持つネズミ抗体配列を記録した。関連ＤＮＡ配列の間で保存されたストレッチを用いて、これらのシグナルペプチドからＰＣＲプライマーを設計した。ＥｃｏＲＩ制限部位をリーダー配列
プライマーに付加し（表７）、そしてこれらを、上述のようなＲＴ−ＰＣＲ反応に用いた。
【０２２９】
【表８】

【０２３０】
［２３７］いくつかの個々の軽鎖および重鎖クローンを配列決定して同定し、そしてポリメラーゼが生成する可能性がある配列エラーを回避した。軽鎖および重鎖ＲＴ−ＰＣＲクローンの両方に関して、単一の配列のみが得られた。これらの配列は、シグナル配列内まで拡大してネズミＤＳ６軽鎖および重鎖配列を増幅可能なプライマーを設計するのに十分であった。これらの追加ＰＣＲ反応由来の続くクローンによって、元来の縮重プライマーによって改変されている可変領域の５’端配列が確認された。多様なｃＤＮＡクローンからの累積結果によって、図９に示す最終ネズミＤＳ６軽鎖および重鎖配列が提供された。ＫａｂａｔおよびＡｂＭ定義を用いて、３つの軽鎖および重鎖ＣＤＲが同定された（図９および１０）。ＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔデータベースの検索によって、ｍｕＤＳ６抗体軽鎖可変領域が、ネズミＩｇＶκ ａｐ４生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高く、一方、重鎖可変領域が、ネズミＩｇＶｈ Ｊ５５８．４１生殖系列遺伝子に由来する可能性が最も高いことが示される（図１１）。
【０２３１】
実施例７：ＤＳ６抗体の可変領域表面残基の決定
［２３８］Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９４）およびＲｏｇｕｓｋａら（１９９６）によって記載される抗体表面再構成技術は、ネズミ抗体可変配列の表面残基を予測することから始まる。表面残基は、その総表面積の少なくとも３０％が水分子に対してアクセス可能であるアミノ酸と定義される。ｍｕＤＳ６に関する表面残基を発見するために解明された構造がないため、本発明者らは、１２７の抗体構造ファイルセット中、最も相同な配列を持つ１０の抗体を整列させた（図１２）。これらの整列配列に関して、各Ｋａｂａｔ位の溶媒アクセス可能性を平均した（図１３ＡおよびＢ）。
【０２３２】
［２３９］いずれかの側に隣接する２つの同一残基を含有する抗体サブセットを比較することによって、２５％〜３５％の間の平均アクセス可能性を持つ表面位を、第二周期の分析に供した（図１３ＡおよびＢ）。第二周期の分析後、ｍｕＤＳ６重鎖に関して、２１の予測される表面残基は、２３に増加し、３０％より高い表面アクセス可能性を持つと予測される残基のリストに、Ｔｙｒ３およびＬｙｓ２３が加わった。本発明者らの表面再構成抗体の大部分では、重鎖ＣＤＲ１のＫａｂａｔ定義を用いたが、ＤＳ６に関しては、計算中、不注意にＡｂＭ定義を用いたため、重鎖残基Ｔ２８は、Ｋａｂａｔ定義でフレームワーク表面残基と定義されうるようには、定義されなかった。Ａｌａ８０の予測される表面アクセス可能性が、第二周期分析において、３０．５％から２７．８％に減少したため、軽鎖表面位の数は、１６から１５に減少した。総合すると、ｍｕＤＳ６重鎖および軽鎖可変配列は、３８の予測される表面アクセス可能フレームワーク残基を有する。
【０２３３】
実施例８：ヒト抗体選択
［２４０］ネズミＤＳ６可変領域の表面位を、Ｋａｂａｔデータベース中のヒト抗体配列中の対応する位に比較した（Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｇ， Ｗｕ ＴＴ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｊａｎ １；２９（１）：２０５−６（２００１））。抗体データベース管理ソフトウェアＳＲ（Ｓｅａｒｌｅ、１９９８）を用いて、天然重鎖および軽鎖ヒト抗体対から表面残基を抽出し、そして整列させた。ＣＤＲの５Å以内にある位に特に考慮を払い、最も同一の表面残基を持つヒト抗体可変領域表面を選択して、ネズミＤＳ６抗体可変領域表面残基を置換した。
【０２３４】
実施例９：キメラおよびヒト化抗体の発現ベクター
［２４１］軽鎖および重鎖対形成配列を、単一哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。ヒト可変配列のＰＣＲプライマーは、制限部位を生成し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩクローニングベクターにヒトシグナル配列を付加することを可能にした。次いで、軽鎖または重鎖に関して、それぞれ、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩまたはＨｉｄＩＩＩおよびＡｐａＩを持つ哺乳動物発現プラスミド内に、可変配列をクローニングしてもよい（図１４）。軽鎖可変配列を、インフレームでヒトＩｇカッパ定常領域上にクローニングし、そして重鎖可変配列を、ヒトＩｇガンマ１定常領域配列内にクローニングした。最終発現プラスミドにおいて、ヒトＣＭＶプロモーターが、軽鎖および重鎖両方のｃＤＮＡ配列の発現を駆動する。
【０２３５】
実施例１０：ＤＳ６活性に負に影響を及ぼしうる残基の同定
［２４２］今日まで、ヒト化の大部分では、潜在的に問題がある残基として、ＣＤＲに近接する残基を同定するため、対象抗体の分子モデルが構築されてきた。作業を開始する表面再構成された抗体の数が増加しつつあるため、歴史的な経験は、問題を予測するのに、モデルを構築するのと少なくとも同程度に有効であり、ＤＳ６に関しては、分子モデルを構築しなかった。その代わり、ネズミＤＳ６表面残基を、先に表面再構成された抗体と比較し、そして抗体の結合能に影響を及ぼすリスクが低い残基から高い残基を同定した。
【０２３６】
［２４３］入手可能な解明された抗体構造および先のヒト化に由来する分子モデルの両方において、類似の残基セットが、ＣＤＲの５Å以内にあると繰り返し同定された。このデータを用いて、表１は、ＣＤＲに近接する可能性があり、そしておそらく５Å以内である、ネズミＤＳ６残基を提供する。これらの位の多くが、先のヒト化でもまた変更されているが、これまでに結合活性の喪失を生じたのは、重鎖７４位のみであった。ネズミ抗体の結合活性を保存するため、ｈｕＣ２４２およびｈｕＢ４の両方において、この位でネズミ残基を保持した。一方、この同じ位が、ヒト化６．２Ｇ５Ｃ６において、対応するヒト残基に変更されたが、活性の喪失は伴わなかった（６．２Ｇ５Ｃ６は、しばしば、単に抗Ｃ６と称される抗ＩＧＦ１−Ｒ抗体である）。表１中のいかなる残基もヒト化抗体において問題を提示しうるが、重鎖残基Ｐ７３が、この位での先の経験から、特に懸念される。
【０２３７】
実施例１１：最も相同なヒト表面の選択
［２４４］ＳＲソフトウェアを用いて、Ｋａｂａｔ抗体配列データベースから、ｍｕＤＳ６の表面を再構成するための候補ヒト抗体表面を引き出した。このソフトウェアは、抗体データベースに対して、特定の残基位のみを検索するインターフェースを提供する。天然の対を保持するため、軽鎖および重鎖両方の表面残基を一緒に比較した。配列同一性のランク順に、Ｋａｂａｔデータベース由来の最も相同なヒト表面を整列させた。ＳＲ Ｋａｂａｔデータベースソフトウェアによって並列した際の上位３つの表面を表２に示す。次いで、表面を比較して、表１に同定する残基に対して最も少ない変化しか必要としないのはどのヒト表面かを同定した。抗Ｒｈ（Ｄ）抗体、２８Ｅ４（Ｂｏｕｃｈｅｒら、１９９７）は、最少数の表面残基変化しか必要とせず（総数１１）、そしてこれらの残基のう
ち３つのみが、潜在的な問題の残基のリストに含まれた。２８Ｅ４抗体は、最も相同なヒト表面を提供するため、これが、ｍｕＤＳ６の表面を再構成する最適な候補である。
【０２３８】
実施例１２：ヒト化ＤＳ６抗体のためのＤＮＡ配列の構築
［２４５］ＰＣＲ突然変異誘発を用いて、ＤＳ６のための１１の表面残基変化を作製した。ネズミＤＳ６可変領域ｃＤＮＡクローンに対して、ＰＣＲ突然変異誘発を行って、表面を再構成したヒトＤＳ６遺伝子を構築した。以下の表８に示すように、ヒト化プライマーセットを設計して、表面再構成ＤＳ６に必要なアミノ酸変化を作製した。
表８
【０２３９】
【表９】

【０２４０】
［２４６］１０％ＤＭＳＯを補った以外、ＰＣＲ反応は標準的であった（５０μｌ反応混合物は、最終濃度１ｘ反応緩衝液（ＲＯＣＨＥ）、各２ｍＭのｄＮＴＰ、各１ｍＭのプライマー、１００ｎｇのテンプレート、５μｌ ＤＭＳＯ、および０．５μｌ Ｔａｑ（ＲＯＣＨＥ）を含有した）。以下のプログラム：１）９４℃、１分間；２）９４℃、１５秒間；３）５５℃、１分間；４）７２℃、１分間；５）工程２に戻って２９周期；６）７２℃、４分間の最終伸長工程で終了を用いて、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーモサイクラー上で、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を、対応する制限酵素で消化して、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニングベクター内にクローニングした。クローンを配列決定して、アミノ酸変化を確認した。
【０２４１】
［２４７］重鎖残基Ｐ７３を変化させると、過去に問題が引き起こされたため、重鎖の２つの型、ヒト２８Ｅ４ Ｔ７３を持つもの、およびネズミＰ７３を保持するものを構築した。ヒト化ＤＳ６のどちらの型でも、他の１０の表面残基をネズミからヒト２８Ｅ４残基に変化させた（表２）。通常の命名法に忠実にしたがい、１１のヒト表面残基すべてを有するため、最もヒトであるのは、１．０型である。さらなる型が必要とされる場合のために、ネズミＰ７３を保持する重鎖型を１．２と名付け、したがって、１．１型は、最大数のネズミ残基を含有する型のために取っておく。図１５ＡおよびＢにおいて、２つのヒト化型のアミノ酸配列を、ネズミＤＳ６アミノ酸配列と整列させて示す。一過性および安定トランスフェクションのため、ヒト化ＤＳ６抗体遺伝子の両方を、抗体発現プラスミド（図１４）内にクローニングした。ヒト化型１．０１および１．２１軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、同じであり、そしてこれらを図１６に示す。ヒト化型１．０１および１．２１の重鎖ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を図１７ＡおよびＢに示す。
【０２４２】
実施例１３：ＣＨＯ細胞におけるｈｕＤＳ６の発現および精製、ならびに親和性測定
［２４８］ヒト化ＤＳ６型が、ｍｕＤＳ６の結合親和性を保持するかどうかを決定するため、抗体を発現し、そして精製することが必要であった。ヒト定常領域およびネズミ可変領域を有するＤＳ６のキメラ型（ｃｈＤＳ６）で、あるいはｈｕＤＳ６ｖ１．０１またはｈｕＤＳ６ｖ１．２１で、ＣＨＯ細胞を安定トランスフェクションした。
【０２４３】
［２４９］ＣＨＯＤＧ４４細胞（４．３２ｘ１０^６細胞／プレート）を、非選択培地（４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ｖ／ｖ ＦＢＳを補った、アルファＭＥＭ＋ヌクレオチド（Ｇｉｂｃｏ））中、１５ｃｍプレートに植え付け、そして３７℃、５％ＣＯ_２加湿インキュベーター中に入れた。翌日、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎに関してＱｉａｇｅｎが推奨するプロトコルの修飾型を用いて、ｃｈＤＳ６発現プラスミドで細胞をトランスフェクションした。非選択培地を細胞から吸引した。７ｍｌのあらかじめ温めた（３７℃）ＰＢＳでプレートを洗浄し、そして２０ｍｌの非選択培地を再補充した。プラスミドＤＮＡ（１１μｇ）を８００μｌのハイブリドーマＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ）内に希釈した。次いで、７０μｌのＰｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をＤＮＡ／ＳＦＭ混合物に添加した。次いで、Ｐｏｌｙｆｅｃｔ混合物を数秒間穏やかにボルテックスし、そして周囲温度で１０分間インキュベーションした。非選択培地（２．７ｍｌ）を混合物に添加した。この最終混合物を、プレーティングした細胞と２４時間インキュベーションした。
【０２４４】
［２５０］トランスフェクション混合物／培地をプレートから取り除き、そして次いで、細胞をトリプシン処理し、そして計数した。次いで、多様な密度（１８００、６００、２００、および６７細胞／ウェル）で、９６ウェルプレート（２５０μｌ／ウェル）中、細胞を選択培地（４ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ｖ／ｖ ＦＢＳ、１．２５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補った、アルファＭＥＭ−ヌクレオチド（Ｇｉｂｃｏ））中でプレーティングした。必要であれば培地を補って、細胞を２〜３週間インキュベーションした。定量的ＥＬＩＳＡを用いて、抗体産生レベルに関してウェルをスクリーニングした。Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ ９６ウェルプレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ；１００μｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６中、１μｇ／ウェル）でコーティングし、そして振盪しながら、周囲温度で１．５時間インキュベーションした。すべての続く工程を、周囲温度で行った。ウェルをＴ−ＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＴＢＳ）で２回洗浄し、そして２００μｌのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ、Ｔ−ＴＢＳ）で１時間ブロッキングした。ウェルをＴ−ＴＢＳで２回洗浄した。別個のプレート中で、抗体標準、ＥＭ１６４（１００ｎｇ／ｍｌ）および培養上清を、ブロッキング緩衝液中で連続希釈した（１：２または１：３）。これらの希釈物（１００μｌ）を、ＥＬＩＳＡプレートに移し、そして１時間インキュベーションした。ウェルをＴ−ＴＢＳで３回洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中で１：３０００希釈した１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＡＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と４５分間インキュベーションした。Ｔ−ＴＢＳで５回洗浄した後、１００μｌのＰＮＰＰ発色試薬（１０ｍｇ／ｍｌ ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルリン酸、二ナトリウム塩；Ｐｉｅｒｃｅ）、０．１ＭジエタノールアミンｐＨ１０．３緩衝液）を用いて、ウェルを２５分間、発色させた。ＥＬＩＳＡプレート読取装置中、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。標準曲線の直線部分での（培養上清の）吸光度読取り値を用いて、抗体レベルを決定した。
【０２４５】
［２５１］次いで、ＥＬＩＳＡによって同定された最大産生クローンをサブクローニングし、拡大し、そして凍結細胞ストックを調製した。
［２５２］ｈｕＤＳ６ｖ１．０１およびｈｕＤＳ６ｖ１．２１の発現に関しては、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞（Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｃｈａｓｉｎ博士、ニューヨーク州コロンビア大学）を、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含むアルファＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２５７１、ニューヨーク州グランドアイランド）中で培養した。培
地に１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７１．０３、ユタ州ローガン）、１％ゲンタマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈカタログ番号３０−００５−ＣＲ、バージニア州ハーンドーン）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｌ−ｇｌｕｔ）（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号１７−６０５Ｅ、メリーランド州ウォーカーズビル）を補った。この配合物をＣＨＯ完全培地と名付けた。
【０２４６】
［２５３］ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞（５ｘ１０^６）を、５０μｇのｈｕＤＳ６プラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション前に、トリプシン（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５０９０−０４６、ニューヨーク州グランドアイランド）でフラスコから細胞を取り除き、そしてリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを欠く、非補充アルファＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２５６１、ニューヨーク州グランドアイランド）で２回洗浄した。これを洗浄培地と名付けた。０．４ｃｍギャップの電極キュベット（ＢｉｏＲａｄカタログ番号１６５２０８８、ペンシルバニア州ハーキュルス）中、細胞をプラスミドＤＮＡと混合した。これらを氷上に２分間置き、そして次いで、ＢｉｏＲａｄエレクトロポレーション装置中、１，０００μＦおよび２６０ボルトでパルス処理した。エレクトロポレーション後、氷上で２分間、細胞をインキュベーションした。次いで、ＣＨＯ完全培地中、細胞を５つの２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒカタログ番号３５２４）中にプレーティングし、そして５％ＣＯ_２の３７℃インキュベーター中で維持した。４８時間後、ウェルから培地を取り除いた。洗浄培地でウェルを１回リンスし、そして１％ゲンタマイシン、２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔ、１０％透析ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏカタログ番号２６４００−０４４、ニューヨーク州グランドアイランド）、および１．２５ｍｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１８１１、ニューヨーク州グランドアイランド）を補った、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含まないアルファＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１２５６１、ニューヨーク州グランドアイランド）を供給した。この完全配合物を、選択培地と名付けた。選択培地中でおよそ２週間、クローンをインキュベーションし、この時点で、定量的ＥＬＩＳＡによって、抗体産生に関してスクリーニングした。次いで、最高産生クローンをサブクローニングし、拡大し、そして凍結細胞ストックを調製した。
【０２４７】
［２５４］精製に十分な量の抗体を産生するため、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補った選択培地３０ｍｌを含む１５ｃｍプレート（〜１ｘ１０^６細胞／プレート）上に、細胞を拡大し、そして１週間インキュベーションした。２５０ｍｌの円錐管内に培養上清を収集し、卓上遠心分離装置中で回転して落とし（２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）、そして次いで、０．２μｍフィルター装置を通じて滅菌ろ過した。
【０２４８】
［２５５］ＤＳ６を精製するため、ＮａＯＨのペレットをろ過培養上清に添加して、最終ｐＨ８．０にした。ＨｉＴｒａｐ ｒプロテインＡカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、２０〜５０カラム体積の結合緩衝液で平衡化した。蠕動ポンプを用いて、上清をカラム上に装填した。次いで、カラムを５０カラム体積の結合緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（１００ｍＭ酢酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３）を用いて、結合した抗体を、カラムから、フラクションコレクター中にセッティングした試験管内に溶出させた。中和緩衝液（２Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ１０．０）を用いて、溶出した抗体を中和し、そしてＰＢＳ中で一晩透析した。０．２μｍシリンジフィルターを通じて、透析抗体をろ過した。２８０ｎｍでの吸光度を測定して、最終タンパク質濃度を決定した。
【０２４９】
［２５６］精製ｈｕＩｇＧの親和性を、フローサイトメトリーによって、ｍｕＤＳ６と比較した。最初の実験セットでは、ＣＡ６発現細胞株、ＫＢへの直接結合を測定した。図１８に示すように、ｍｕＤＳ６、ｃｈＤＳ６、ｈｕＤＳ５ｖ１．０１およびｈｕＤＳ６ｖ１．２１は、非常に類似の親和性を示し、見かけのＫｄが、それぞれ、０．８２ｎＭ、０．６９ｎＭ、０．８２および０．８５ｎＭであり、表面再構成がＣＤＲを妨害しなかった
ことが示唆された。ｈｕＤＳ６型が、ｍｕＤＳ６の親和性を保持することを確認するため、競合的結合実験を行った。この形式の利点は、ネズミおよびヒト抗体の両方に関して、同じ検出系；すなわち、ビオチン−ｍｕＤＳ６／ストレプトアビジン−ＤＴＡＦを使用することである。ｍｕＤＳ６、ｃｈＤＳ６、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１およびｈｕＤＳ６ｖ１．２１がビオチン−ＤＳ６と競合する能力を比較する、競合結合アッセイの結果を図１９に示す。見かけのＥＣ_５０は、ｍｕＤＳ６、ｃｈＤＳ６、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１、およびｈｕＤＳ６ｖ１．２１に関して、それぞれ、１．９ｎＭ、１．７ｎＭ、３．０および１．９ｎＭである。これらの結果は、ヒト化ＤＳ６を産生するためのｍｕＤＳ６の表面再構成が、結合親和性の減少をほとんど引き起こさないことを示す。
【０２５０】
実施例１４：ｍｕＤＳ６−ＤＭ１細胞傷害性コンジュゲートの調製
［２５７］８倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）を用いて、ｍｕＤＳ６抗体（８ｍｇ／ｍｌ）を修飾して、ジチオピリジル基を導入した。９５％ｖ／ｖ緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＫＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）および５％ｖ／ｖ ＤＭＡ中で、室温で２時間、反応を行った。ＮＡＰまたはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（緩衝液Ａ中で平衡化）を通じて、わずかに膨らんだ（ｔｕｒｇｉｄ）反応混合物をゲルろ過した。２８０ｎｍで抗体の吸光度を、そして２８０および３４３ｎｍで、ＤＴＴで放出される２−メルカプトピリジン（Ｓｐｙ）を測定することによって、修飾の度合いを決定した。次いで、ＳＰｙよりも１．７倍モル過剰のＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（Ｌ−ＤＭ１）を用いて、修飾ｍｕＤＳ６を２．５ｍｇ Ａｂ／ｍｌでコンジュゲート化した。ＤＭＡ（３％ｖ／ｖ）を含む緩衝液Ａ（９７％ｖ／ｖ）中で反応を行った。反応を室温で一晩、〜２０時間、インキュベーションした。不透明な反応混合物を遠心分離し（１１６２ｘｇ、１０分間）、そして次いで、緩衝液Ｂ（１ｘＰＢＳ ｐＨ６．５）中で平衡化したＮＡＰ−２５またはＳ３００（Ｔａｎｄｅｍ ３、３ｘ２６／１０脱塩カラム、Ｇ２５媒体）カラムを通じて上清をゲルろ過した。ペレットを廃棄した。０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを用いて、コンジュゲートを滅菌ろ過し、そしてＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒを用いて、緩衝液Ｂ中で透析した。ろ過物質の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍ両方の吸光度を測定することによって、ｍｕＤＳ６の分子あたりに連結されたＤＭ１分子の数を決定した。ＤＭ１／Ａｂ比は、４．３６であることが見出され、そしてコンジュゲート化ＭＵＤＳ６の工程収率は５５％であった。コンジュゲート化抗体濃度は１．３２ｍｇ／ｍｌであった。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、精製コンジュゲートを生化学的に性質決定して、そして９２％単量体であることを見出した。精製コンジュゲート中のＤＭ１の分析によって、９９％が抗体に共有結合していることが示された。図２０において、ｍｕＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲートおよび非修飾ｍｕＤＳ６のＣａｏｖ−３細胞へのフローサイトメトリー結合によって、ｍｕＤＳ６のコンジュゲート化が親和性のわずかな喪失しか生じないことが示される。
【０２５１】
実施例１５：ｍｕＤＳ６−ＤＭ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
［２５８］裸の抗体として、ｍｕＤＳ６は、細胞培養において、増殖または成長阻害活性を示さなかった（図２１）。しかし、ヤギ抗マウスＩｇＧ重鎖および軽鎖に対するＤＭ１コンジュゲートの存在下で、ｍｕＤＳ６を細胞とインキュベーションすると、ｍｕＤＳ６は、このコンジュゲートを細胞にターゲティングし、そして送達するのに非常に有効であり、間接的な細胞傷害性を生じた（図２１）。裸のｍｕＤＳ６の生得的な活性をさらに試験するため、ｍｕＤＳ６を用いた、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイを行った。２００μｌのＲＨＢＰ培地（ＲＰＭＩ−１６４０、０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２〜７．４）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中、５％ヒトまたはウサギ血清および多様な希釈のｍｕＤＳ６の存在下で、ＨＰＡＣおよびＺＲ−７５−１細胞（２５０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を３７℃で２時間インキュベーションした。次いで、Ａｌａ
ｍａｒ Ｂｌｕｅ（最終濃度１０％）試薬（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を上清に添加した。蛍光を測定する前に、５〜２４時間、細胞をインキュベーションした。ネズミＤＳ６は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイにおいて、影響を持たなかった（図２２）。これによって、ｍｕＤＳ６の療法的適用が、毒性エフェクター分子のコンジュゲート化を必要とするであろうことが示唆される。
【０２５２】
［２５９］多様なＤＳ６陽性細胞株において、２つの異なるアッセイ形式を用いて、メイタンシノイド・コンジュゲート化ｍｕＤＳ６抗体の細胞傷害性を調べた。培地中で希釈した２ｍｌのコンジュゲート中、６ウェルプレート上に細胞（１０００〜２５００細胞／ウェル）をプレーティングする、コロニー形成アッセイを行った。一般的に、３ｘ１０^−１１Ｍ〜３ｘ１０^−９Ｍの間のいくつかの濃度で、細胞を連続してコンジュゲートに曝露し、そして３７℃、６％ＣＯ_２加湿チャンバー中で、５〜９日間、インキュベーションした。ＰＢＳでウェルを洗浄し、そして１％ｗ／ｖクリスタルバイオレット／１０％ｖ／ｖホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で、コロニーを染色した。次いで、再蒸留水を用いて、未結合染色剤を徹底的にウェルから洗い落とし、そしてプレートを乾燥させた。Ｌｅｉｃａ
ＳｔｅｒｅｏＺｏｏｍ４解剖顕微鏡を用いて、コロニーを計数した。
【０２５３】
［２６０］コロニーの数／プレーティングした細胞数として、プレーティング効率（ＰＥ）を計算した。処理細胞のＰＥ／非処理細胞のＰＥとして、生存率を計算した。細胞の生存率対コンジュゲートのモル濃度をグラフで示すことによって、ＩＣ_５０濃度を決定した。コロニー形成アッセイにおいて（図２３）、ｍｕＤＳ６−ＤＭ１は、Ｃａｏｖ−３細胞を殺すのに有効であり、概算されるＩＣ_５０は８００ｐＭであった。抗原陰性細胞、Ａ３７５は、試験したｍｕＤＳ６−ＤＭ１の最高の濃度である、３ｘ１０^−９Ｍの濃度のコンジュゲートによって、わずかにしか影響を受けず、コンジュゲートの細胞殺傷活性が、抗原発現細胞に特異的に向けられることを立証した。しかし、メイタンシンに対する見かけの感受性にもかかわらず、多くの他のＤＳ６陽性細胞株は、免疫コンジュゲートに対して、特に感受性ではなかった。すべての子宮頸部細胞株（ＨｅＬａ、ＫＢ、およびＷＩＳＨ）は、コンジュゲートに対して感受性であり、一方、卵巣および乳房細胞株の選ばれた数のみが、何らかの細胞傷害性効果を示した。膵臓細胞株は、いずれも、影響を受けないようであった。
【０２５４】
［２６１］ＭＴＴアッセイにおいて、１０００〜５０００細胞／ウェルの密度で、細胞を９６ウェルプレートに植え付けた。２００μｌの培地中、裸のｍｕＤＳ６またはｍｕＤＳ６−ＤＭ１免疫コンジュゲートのいずれかの連続希釈とともに、細胞をプレーティングした。試料を３つ組で実験した。次いで、細胞および抗体／コンジュゲート混合物を２〜７日間インキュベーションし、この時点で、ＭＴＴ（［３（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］）アッセイによって、細胞生存度を評価した。ＭＴＴ（５０μｇ／ウェル）を培養上清に添加して、そして３７℃で３〜４時間インキュベーションさせた。培地を取り除き、そしてＭＴＴホルマザンをＤＭＳＯ（１７５μｌ／ウェル）中に可溶化した。５４０〜５４５ｎｍの吸光度を測定した。ＭＴＴ細胞生死判別アッセイにおいて（図２４Ｃ）、免疫コンジュゲートは、Ｃａｏｖ−３細胞を有効に殺すことが可能であり、概算されるＩＣ_５０は１．６１ｎＭであった。まったく影響を及ぼさなかった裸の抗体に比較して、最高濃度のコンジュゲートを含むウェルは、生存細胞をまったく含有しなかった（図２１および２４）。
【０２５５】
［２６２］他の細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果は、わずかに異なった（図２４Ａ、Ｂ、およびＤ〜Ｉ）。多くの場合、ある程度の細胞傷害性が見られるが、コンジュゲートは、全細胞集団を完全に殺すことは不可能であった（ＷＩＳＨ細胞を除く）。ＢＴ−２０、ＯＶＣＡＲ５、およびＨＰＡＣ細胞が特に抵抗性であった：最高コンジュゲート濃度（３２ｎＭ）のウェルで、５０％を超える細胞がなお生存可能であった。
【０２５６】
実施例１６：ｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲート抗腫瘍活性
［２６３］ｍｕＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ活性を立証するため、ＳＣＩＤマウスにおいて、ヒト腫瘍異種移植片を確立した。ヒト子宮頸癌細胞株ＫＢの皮下モデルを開発した。ＫＢ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、収集し、そして各マウスの右肩下に、１００μｌの血清不含培地中、５ｘ１０^６細胞を注射し、そして平均腫瘍体積１４４±１２５ｍｍ^３になるまで６日間増殖させ、この時点で薬剤処置を開始した。マウスに、ＰＢＳ、１５０μｇ／ｋｇ ＤＭ１のコンジュゲート、または２２５μｇ／ｋｇ
ＤＭ１のコンジュゲート（群あたり２匹のマウス）のいずれかを静脈内に毎日５日間投与した。処置中、毒性応答を毎日監視した。研究の間中、腫瘍体積（図２５Ａ）および対応する体重（図２５Ｂ）を監視した。
【０２５７】
［２６４］ＰＢＳ対照で処置したＫＢ腫瘍は、約４日間の倍増時間で、迅速に増殖した。対照的に、コンジュゲートで処置したマウスの両群は、２２５μｇ／ｋｇおよび１５０μｇ／ｋｇ用量群で、それぞれ、処置開始の１４日後および１８日後に、完全腫瘍退行を示す。１５０μｇ／ｋｇ用量では、腫瘍遅延はおよそ７０日であった。２２５μｇ／ｋｇでの処置は、第１２０日に研究を終了した際、腫瘍再発の証拠がまったくなかったように、治癒を生じた。図２５Ｂに見られるように、１５０μｇ／ｋｇ群のマウスは、体重喪失をまったく示さず、用量がよく許容されることを示した。より高い用量では、マウスは、体重の一時的な３％の減少しか経験しない。５日間の処置経過中、マウスは毒性の可視徴候を示さなかった。総合すると、この研究は、ｍｕＤＳ６−ＤＭ１処置が、非毒性用量で、ＫＢ異種移植片腫瘍のマウスを治癒させうることを立証する。
【０２５８】
［２６５］一団の皮下異種移植片モデルに対して、ｍｕＤＳ６−ＤＭ１活性をさらに試験した（図２６を参照されたい）。異種移植片を作製するのに用いた腫瘍細胞株は、さまざまなｉｎ ｖｉｔｒｏメイタンシン感度およびＣＡ６エピトープ密度を示した（以下の表９）。ＯＶＣＡＲ５細胞およびＴＯＶ−２１Ｇは、卵巣腫瘍細胞株であり；ＨＰＡＣは膵臓腫瘍細胞株であり；ＨｅＬａは子宮頸部腫瘍細胞株である。ＯＶＣＡＲ５およびＴＯＶ−２１Ｇ細胞は、低い表面ＣＡ６発現を有し；ＨｅＬａ細胞は、中間レベルの表面ＣＡ６発現を有し；ＨＰＡＣ細胞は、高いＣＡ６表面発現密度を有する。ＴＯＶ−２１ＧおよびＨＰＡＣ細胞はメイタンシン感受性であり；ＯＶＣＡＲ５およびＨｅＬａ細胞はメイタンシン感受性が２〜７倍低かった。
表９
【０２５９】
【表１０】

【０２６０】
^＊平均最大相対的平均蛍光
【０２６１】
［２６６］４つの細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、収集し、そして１００μｌの血清不含培地中の１ｘ１０^７細胞を、各マウスの右肩下（モデルあたり６匹のマウス）に注射し、そしてＯＶＣＡＲ５の試験群および対照群では、それぞれ５７．６±６．７および９０．２±１３．４ｍｍ^３、ＨＰＡＣの試験群および対照群では、それぞれ１４７．１±２９．６および１７６．２±１８．９ｍｍ^３、ＨｅＬａの試験群および対照群では、それぞれ１９４．３±３７．２および２０１．７±７１．７ｍｍ^３、そしてＴＯＶ−２１Ｇの試験群および対照群では、それぞれ９６．６±２２．８および１５５．６±１３．４ｍｍ^３の平均腫瘍体積になるまで、６日間増殖させ、この時点で薬剤処置を開始した。各モデルに関して、３匹の対照マウスをＰＢＳの２回の毎週用量で処置し、そして３匹の試験マウスを静脈内でのコンジュゲート（６００μｇ／ｋｇ ＤＭ１）の２回の毎週用量で処置した。処置中、毒性応答を毎日監視し、そして研究の間中、腫瘍体積および体重を監視した。多様なモデルのコンジュゲート有効性を、図２６Ａ、Ｃ、Ｅ、およびＧにグラフで示し、そして対応する体重を図２６Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＨにプロットする。ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、およびＨＰＡＣ細胞株は、各モデルに関するＰＢＳ対照で見られうるように、攻撃的な腫瘍を形成する。ＨｅＬａモデルは、指数関数的な増殖を開始するまでに、約３週間の遅延期間を有した。すべてのモデルにおいて、ＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲート処置は、すべてのマウスにおいて、完全腫瘍退行を生じた。ＴＯＶ−２１Ｇ、ＨＰＡＣ、およびＨｅＬａモデルに関して、マウスは、第６１日に、腫瘍不含のままである。ＯＶＣＡＲ５モデルにおいて、腫瘍接種後、約４５日で、腫瘍が再発した。したがって、このモデルにおいて、ｍｕＤＳ６−ＤＭ１処置は、およそ３４日間の腫瘍増殖遅延を生じる。ＯＶＣＡＲ５細胞がよりメイタンシン感受性でなく、そして低いＣＡ６エピトープ発現を有するため、増殖遅延は有意である。ＣＡ６エピトープ密度がより高いか、またはモデルがより高いメイタンシン感受性を有するモデルにおいては、腫瘍退行はより強固である。２回の用量しか投与されないことに注目することが重要である。体重喪失が観察されないため、本研究で用いる投薬スケジュールは、マウスにとっては明らかに毒性でない。治癒は、さらなるまたはより高いコンジュゲート用量で達成可能である可能性がある。
【０２６２】
［２６７］ヒト卵巣癌は、大部分、腹膜の疾患である。ＯＶＣＡＲ５細胞は、ＳＣＩＤマウスにおいて、腹腔内（ＩＰ）モデルとして攻撃的に増殖して、ヒト疾患と類似の方式で、腫瘍節を形成し、そして腹水を産生する。ＩＰモデルにおいて活性を立証するため、
ｍｕＤＳ６−ＤＭ１を用いて、ＯＶＣＡＲ５ ＩＰ腫瘍を所持するマウスを処置した（図２７）。ＯＶＣＡＲ５細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、採取し、そして１００μｌの血清不含培地中、１ｘ１０^７細胞を腹腔内注射した。腫瘍を６日間増殖させ、この時点で処置を開始した。６００μｇ／ｋｇ ＤＭ１の用量で、ＰＢＳまたはＤＳ６−ＤＭ１コンジュゲートのいずれかで、マウスを２週間、毎週処置し、そして腹腔疾患から生じる体重喪失に関して監視した。第２８日までに、マウスのＰＢＳ群は、２０％より多く体重を失い、そして安楽死させられた。２０％を超える体重を喪失した後、第４５日に、処置群を屠殺した。この研究によって、ＯＶＣＡＲ５細胞がメイタンシンにより感受性でなく、そして細胞あたりより少ないＣＡ６エピトープを有するという事実にもかかわらず、ｍｕＤＳ６−ＤＭ１は、攻撃的ＯＶＣＡＲ５ ＩＰモデルにおいて、腫瘍増殖を遅延させることが可能であることが立証される。用いた投薬スケジュールは、毒性の可視徴候を誘発しなかったため、さらなる用量およびより高い用量を用いて、さらなる腫瘍増殖遅延または治癒を達成することも可能である可能性が高い。
【０２６３】
実施例１７：ＤＳ６−ＳＰＰ−ＭＭ１−２０２タキソイド細胞傷害性コンジュゲートの合成および性質決定
［２６８］Ｎ−スルホスクシンイミジル４−ニトロ−２−ピリジル−ペンタノエート（ＳＳＮＰＰ）リンカーを用いて、ｍｕＤＳ６を修飾した。９０％緩衝液Ａ、１０％ＤＭＡ中の５０ｍｇのｍｕＤＳ６ Ａｂに、ＤＭＡ中の１０当量のＳＳＮＰＰを添加した。Ａｂの最終濃度は、８ｍｇ／ｍｌであった。反応を室温で４時間攪拌し、次いでＧ２５クロマトグラフィーによって精製した。２８０ｎｍ（抗体）および３２５（リンカー）の吸光度を用いて、抗体修飾の度合いを分光光度的に測定し、そして３．８２リンカー／抗体を有することが見出された。抗体の回収は、４３．３ｍｇであり、８７％収率を生じた。ｍｕＤＳ６−ニトロＳＰＰを、タキソイドＭＭ１−２０２（１８１２Ｐ．１６）とコンジュゲート化した。９０％緩衝液Ａ、１０％ＤＭ１中、４２ｍｇスケールで、コンジュゲート化を行った。約２０時間の期間に渡って、０．４３当量／リンカー（各アリコット）の４アリコットでタキソイドを添加した。この時点までに、反応は、著しく曇った。Ｇ２５精製後、約６４％の収率で回収された、生じたコンジュゲートは、約４．３タキソイド／Ａｂを有し、そして約１当量の未反応リンカーが残った。未反応リンカーの反応を停止するため、１当量のシステイン／未反応リンカーを、一晩攪拌しながら、コンジュゲートに添加した。システインを添加した際、明確な黄色がかった色合いが顕著であり、これはチオピリジンの放出を示す。次いで、反応溶液を緩衝液Ｂ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で透析し、その後、緩衝液Ｂのみでさらに数日に渡って透析した。最終コンジュゲートは、２．８６薬剤／抗体を有した。抗体回収は１４．７ｍｇであり、全体で３５％の収率を生じた。ＳＥＣによってコンジュゲートをさらに生化学的に性質決定し、そして８９％単量体、１０．５％二量体および０．５％のより高い分子量の凝集体を有することが見出された。
【０２６４】
［２６９］ＨｅＬａ細胞に対する、ｍｕＤＳ６−ＳＰＰ−ＭＭ１−２０２タキソイド対ｍｕＤＳ６抗体の結合を比較するフローサイトメトリー分析の結果を、図２８に示す。結果によって、ｍｕＤＳ６がタキサンにコンジュゲート化された際、結合活性を保持することが示される。
【０２６５】
実施例１８：ヒト化ＤＳ６コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ活性
［２７０］ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートを構築した。このコンジュゲートは、コンジュゲートのリンカー／メイタンシン薬剤部分の構造がジスルフィド結合周囲で異なることを除いて、実施例１４に記載するｍｕＤＳ６−ＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートと類似であり；ｍｕＤＳ６−ＳＰＰ−ＤＭ１コンジュゲートは、リンカーの抗体側でジスルフィド炭素上に１つのメチル基立体障害を有し、一方、ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、リンカーのメイタンシン側でジスルフィド炭素上に２つのメチル基立体障害を有する。
【０２６６】
［２７１］８倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）を用いて、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１抗体（８ｍｇ／ｍｌ）を修飾して、ジチオピリジル基を導入した。９５％ｖ／ｖ緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＫＰｉ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）および５％ｖ／ｖエタノール中で、室温で１．５時間、反応を行った。１５ｍｌのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム（緩衝液Ａ中で平衡化）を通じて、反応混合物をゲルろ過した。２８０ｎｍで抗体の吸光度を、そして２８０および３４３ｎｍで、ＤＴＴで放出される２−メルカプトピリジン（Ｓｐｙ）を測定することによって、修飾の度合いを決定した。次いで、ＳＰｙよりも１．７倍モル過剰のＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（Ｌ−ＤＭ４）を用いて、修飾ＤＳ６を１．８ｍｇ Ａｂ／ｍｌでコンジュゲート化した。ＤＭＡ（３％ｖ／ｖ）を含む緩衝液Ａ（９７％ｖ／ｖ）中で反応を行った。反応を室温で一晩、〜２０時間、インキュベーションした。ｍｕＤＳ６のコンジュゲート化と対照的に、反応混合物は透明であり、そして直ちに、クエン酸緩衝液（２０ｍＭクエン酸、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中で平衡化されたＮＡＰ １５ｍｌ Ｇ２５カラムを通じたゲルろ過を経た。０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルターを用いて、コンジュゲートを滅菌ろ過した。ろ過物質の２５２ｎｍおよび２８０ｎｍ両方の吸光度を測定することによって、ＤＳ６の分子あたりに連結したＤＭ４分子の数を決定した。ＤＭ４／Ａｂ比は、３．２であることが見出され、そしてコンジュゲート化ＤＳ６の工程収率は６９％であった。コンジュゲート化抗体濃度は１．５１ｍｇ／ｍｌであった。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、精製コンジュゲートを生化学的に性質決定して、そして９２．５％単量体であることを見出した。精製コンジュゲート中のＤＭ４の分析によって、＞９９％が抗体に共有結合していることが示された。
【０２６７】
［２７２］図２９Ａにおいて、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＤＭ４コンジュゲートおよび非修飾ＤＳ６のＫＢ細胞へのフローサイトメトリー結合によって、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１のコンジュゲート化が親和性の喪失を本質的に生じないことを示す。ＣａＯｖ−３細胞ではなく、ＫＢ細胞を用いたことを除いて、図２０に関して記載したのと本質的に同様に、結合を行った。本質的に図２４Ｇに記載するように、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を試験した。ｈｕＤＳ６ｖ１．０１はＷＩＳＨ細胞を４．４ｘ１０^−１０ＭのＩＣ_５０で殺し、一方、非コンジュゲート化ｈｕＤＳ６ｖ１．０１は細胞傷害性活性をまったく示さなかった。
【０２６８】
［２７３］ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＤＭ４のｉｎ ｖｉｖｏ活性を、ＨＰＡＣ膵臓モデルに対して試験した。ＨＰＡＣ細胞を第０日に接種し、そして免疫コンジュゲート処置を第１３日に投与した。腫瘍体積が１０００ｃｍ^３を越えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートを２００μｇ／ｋｇまたは６００μｇ／ｋｇ ＤＭ４のいずれかの用量で投与し、これはそれぞれ、１５ｍｇ／ｋｇおよび４５ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に対応した。研究の経過中、マウスの腫瘍体積（図３０Ａ）および体重（図３０Ｂ）を監視した。ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＤＭ４は、２００μｇ／ｋｇ ＤＭ４で強力な抗腫瘍活性を示し、すべてのマウスは、完全な腫瘍退行を達成した。ＨＰＡＣ異種移植片上では発現されない抗原を認識する対照Ｂ４−ＤＭ４コンジュゲートは、２００μｇ／ｋｇで、本質的に活性を持たなかった。マウスの体重喪失が欠如している（図３０Ｂ）ことから、２００μｇ／ｋｇコンジュゲートでの処置は、最大許容用量未満であることが示される。この結果によって、ＤＳ６のヒト化型は、メイタンシノイド薬剤のターゲティング送達を仲介し、強力な抗腫瘍活性を生じることが可能であることが立証される。
【図面の簡単な説明】
【０２６９】
【図１】［３３］図１は、ＤＳ６抗体が、選択した癌細胞株の表面に結合する能力を決定するために行った研究の結果を示す。ＤＳ６一次抗体およびＦＩＴＣコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体とインキュベーションした細胞株の蛍光を、フローサイトメトリーによって測定した。ＤＳ６抗体はＣａｏｖ−３（図１Ａ）およびＴ−４７Ｄ（図１Ｂ）細胞に結合し、見かけのＫｄは、それぞれ、１．８４８ｎＭおよび２．５８６ｎＭであった。抗原陰性細胞株、ＳＫ−ＯＶ−３（図１Ｃ）およびＣｏｌｏ２０５（図１Ｄ）は、抗原特異的結合をまったく示さなかった。
【図２】［３４］図２は、エピトープ発現のドットブロット分析の結果を示す。Ｃａｏｖ−３（図２Ａおよび図２Ｂ）、ＳＫＭＥＬ２８（図２Ｃ）、およびＣｏｌｏ２０５（図２Ｄ）細胞溶解物を、ニトロセルロース膜上に個々にスポッティングし、そして次いで、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ノイラミニダーゼまたは過ヨウ素酸と、個々にインキュベーションした。次いで、膜をＤＳ６抗体（図２Ａ）、ＣＭ１抗体（図２Ｂ）、Ｒ２４抗体（図２Ｃ）、またはＣ２４２抗体（図２Ｄ）で免疫ブロッティングした。
【図３】［３５］図３は、ＤＳ６抗原発現のドットブロット分析の結果を示す。Ｃａｏｖ−３細胞溶解物を、ＰＶＤＦ膜上に個々にスポッティングし、そして次いで、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）の存在下でインキュベーションした。次いで、膜を、ＣＭ１抗体（１および２）またはＤＳ６（３および４）で免疫ブロッティングした。
【図４】［３６］図４は、ＤＳ６抗原のグリコトープ分析の結果を示す。Ｎ−グリカナーゼ（「Ｎ−ｇｌｙ」）、Ｏ−グリカナーゼ（「Ｏ−ｇｌｙ」）、および／またはシアリダーゼ（「Ｓ」）であらかじめ処理したＣａｏｖ−３溶解物を、ニトロセルロース上にスポッティングし、そして次いで、ＤＳ−６抗体またはＣＭ１抗体（Ｍｕｃ−１ ＶＮＴＲ）で免疫ブロッティングした。
【図５−１】［３７］図５は、ＤＳ６抗原のウェスタンブロット分析の結果を示す。細胞溶解物を、ＤＳ６抗体で免疫沈降（「ＩＰ」）し、そして免疫ブロッティングした。抗原は、抗原陽性Ｃａｏｖ−３（図５Ａおよび図５Ｂ）およびＴ４７Ｄ（図５Ｃ）細胞で観察される＞２５０ｋＤａタンパク質バンドに対応する。抗原陰性ＳＫ−ＯＶ−３（図５Ｄ）およびＣｏｌｏ２０５（図５Ｅ）細胞株は、このバンドを示さない。免疫沈降後、Ｃａｏｖ−３細胞溶解物のプロテインＧビーズを、（図５Ａ）ノイラミニダーゼ（「Ｎ」）または（図５Ｂ）過ヨウ素酸（「ＰＡ」）とインキュベーションした。抗体（「α」）、ＩＰ前（「Ｌｙｓ」）およびＩＰ後フロースルー（「ＦＴ」）溶解物対照を同じゲル上で泳動した。Ｃａｏｖ−３免疫沈降物を、Ｎ−グリカナーゼ（「Ｎ−ｇｌｙ」）、Ｏ−グリカナーゼ（「Ｏ−ｇｌｙ」）、および／またはシアリダーゼ（「Ｓ」）ともまたインキュベーションし（図５Ｆを参照されたい）、この場合、ブロットを代わりに、ビオチン化ＤＳ６およびストレプトアビジン−ＨＲＰで探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【図５−２】［３７］図５は、ＤＳ６抗原のウェスタンブロット分析の結果を示す。細胞溶解物を、ＤＳ６抗体で免疫沈降（「ＩＰ」）し、そして免疫ブロッティングした。抗原は、抗原陽性Ｃａｏｖ−３（図５Ａおよび図５Ｂ）およびＴ４７Ｄ（図５Ｃ）細胞で観察される＞２５０ｋＤａタンパク質バンドに対応する。抗原陰性ＳＫ−ＯＶ−３（図５Ｄ）およびＣｏｌｏ２０５（図５Ｅ）細胞株は、このバンドを示さない。免疫沈降後、Ｃａｏｖ−３細胞溶解物のプロテインＧビーズを、（図５Ａ）ノイラミニダーゼ（「Ｎ」）または（図５Ｂ）過ヨウ素酸（「ＰＡ」）とインキュベーションした。抗体（「α」）、ＩＰ前（「Ｌｙｓ」）およびＩＰ後フロースルー（「ＦＴ」）溶解物対照を同じゲル上で泳動した。Ｃａｏｖ−３免疫沈降物を、Ｎ−グリカナーゼ（「Ｎ−ｇｌｙ」）、Ｏ−グリカナーゼ（「Ｏ−ｇｌｙ」）、および／またはシアリダーゼ（「Ｓ」）ともまたインキュベーションし（図５Ｆを参照されたい）、この場合、ブロットを代わりに、ビオチン化ＤＳ６およびストレプトアビジン−ＨＲＰで探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【図６】［３８］図６は、Ｃａｏｖ−３（図６Ａ）およびＨｅＬａ（図６Ｂ）細胞溶解物に対する、ＤＳ６抗体およびＣＭ１抗体の免疫沈降および／または免疫ブロットの結果を示す。ＣＭ１およびＤＳ６ウェスタンブロットシグナルの重複は、ＤＳ６抗原がＭｕｃ１タンパク質上にあることを示す。ＨｅＬａ溶解物において、Ｍｕｃ１ダブレットは、タンデム反復数が異なる別個のアレルによって指示されるＭｕｃ１発現から生じる。
【図７】［３９］図７は、ＤＳ６抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ設計（図７Ａ）および標準曲線（図７Ｂ）を示す。商業的に入手可能なＣＡ１５−３標準の既知の濃度を用いて、標準曲線を生じた（１ ＣＡ１５−３単位＝１ ＤＳ６単位）。
【図８】［４０］図８は、定量的ＥＬＩＳＡ標準曲線を示す。プレーティングされたヤギ抗マウスＩｇＧによって捕捉される（図８Ａ）か、またはＥＬＩＳＡプレート上に直接結合する（図８Ｂ）か、いずれかの、既知の濃度のビオチン−ＤＳ６を用いて、検出抗体（ストレプトアビジン−ＨＲＰ／ビオチン−ＤＳ６）シグナルの標準曲線（図８Ｃ）を決定した。
【図９】［４１］図９は、ネズミＤＳ６抗体の軽鎖（図９Ａ）および重鎖（図９Ｂ）可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。各配列中の３つのＣＤＲを下線で示す（Ｋａｂａｔ定義）。
【図１０】［４２］図１０は、Ｋａｂａｔ定義によって決定されるネズミＤＳ６抗体の軽鎖（図１０Ａ）および重鎖（図１０Ｂ）ＣＤＲを示す。ＡｂＭモデリングソフトウェアは、重鎖ＣＤＲのわずかに異なる定義を生じる（図１０Ｃ）。
【図１１】［４３］図１１は、ＩｇＶκａｐ４（配列番号２３）およびＩｇＶｈ Ｊ５８８．４１（配列番号２４）遺伝子の生殖系列配列と並列させた、ネズミＤＳ６抗体の軽鎖（「ｍｕＤＳ６ＬＣ」）（配列番号７の残基１〜９５）および重鎖（「ｍｕＤＳ６ＨＣ」）（配列番号９の残基１〜９８）アミノ酸配列を示す。灰色は配列相違を示す。
【図１２】［４４］図１２は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベースにおいて、解明された構造ファイルを有する、ネズミＤＳ６（ｍｕＤＳ６）軽鎖（「ｍｕＤＳ６ＬＣ」）および重鎖（「ｍｕＤＳ６ＨＣ」）配列に最も相同な１０の軽鎖および重鎖抗体配列を示す。最も相同であるものから最も相同でないものの順に、配列を並列させる。
【図１３−１】［４５］図１３は、ネズミＤＳ６抗体軽鎖可変領域のどのフレームワーク残基が表面にアクセス可能であるかを予測する、表面アクセス可能性データおよび計算を示す。２５〜３５％の平均表面アクセス可能性を持つ位に印を付け（^＊？？^＊）、そしてこれを第二周期の分析に供した。ＤＳ６抗体軽鎖可変領域（図１３Ａ）および重鎖可変領域（図１３Ｂ）。〓
【図１３−２】［４５］図１３は、ネズミＤＳ６抗体軽鎖可変領域のどのフレームワーク残基が表面にアクセス可能であるかを予測する、表面アクセス可能性データおよび計算を示す。２５〜３５％の平均表面アクセス可能性を持つ位に印を付け（^＊？？^＊）、そしてこれを第二周期の分析に供した。ＤＳ６抗体軽鎖可変領域（図１３Ａ）および重鎖可変領域（図１３Ｂ）。
【図１４】［４６］図１４は、ｐｒＤＳ６ ｖ１−０哺乳動物発現プラスミドマップを示す。このプラスミドを用いて、組換えキメラおよびヒト化ＤＳ６抗体を構築し、そして発現させた。
【図１５】［４７］図１５は、ネズミ（「ｍｕＤＳ６」）およびヒト化（「ｈｕＤＳ６」）（１．０１および１．２１）ＤＳ６抗体軽鎖（図１５Ａ）および重鎖（図１５Ｂ）可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１６】［４８］図１６は、ヒト化ＤＳ６抗体（「ｈｕＤＳ６」）（１．０１および１．２１）の軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図１７】［４９］図１７は、ヒト化ＤＳ６抗体（「ｈｕＤＳ６」）１．０１（図１７Ａ）および１．２１（図１７Ｂ）の重鎖可変領域のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。
【図１８】［５０］図１８は、ＫＢ細胞に対して行ったアッセイからの、ネズミＤＳ６（ｍｕＤＳ６）、キメラＤＳ６（ｃｈＤＳ６）、およびヒトＤＳ６ １．０１型（ｈｕＤＳ６ ｖ１．０１）およびｈｕＤＳ６ １．２１型（ｈｕＤＳ６ ｖ１．２１）のフローサイトメトリー結合曲線を示す。ネズミ、キメラ、およびヒトｖ１．０１およびｖ１．２１ ＤＳ６抗体のアビディティー（ｍｕＤＳ６＝０．８２ｎＭ、ｃｈＤＳ６＝０．６９ｎＭ、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１＝０．８２ｎＭおよびｈｕＤＳ６ｖ１．２１＝０．８５ｎＭ）は同程度であり、表面再構成がアビディティーを減少させなかったことを示す。
【図１９】［５１］図１９は、ｍｕＤＳ６、ｃｈＤＳ６、ｈｕＤＳ６ ｖ１．０１およびｈｕＤＳ６ ｖ１．２１抗体とビオチン化ｍｕＤＳ６の競合結合アッセイの結果を示す。多様な濃度の裸のｍｕＤＳ６、ｃｈＤＳ６、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１およびｈｕＤＳ６ｖ１．２１を、２ｎＭのビオチン−ｍｕＤＳ６およびストレプトアビジン−ＤＴＡＦ二次抗体と合わせた。すべての抗体のＩＣ５０（ｍｕＤＳ６＝１．９ｎＭ、ｃｈＤＳ６＝１．７ｎＭ、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１＝３．０ｎＭ、およびｈｕＤＳ６ｖ１．２１＝１．９ｎＭ）は類似であり、これは、ヒト化がアビディティーを減少させなかったことを示す。
【図２０】［５２］図２０は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートに対する非コンジュゲート化ＤＳ６抗体の結合親和性決定の結果を示す。この結果は、ＤＭ１コンジュゲート化が、抗体の結合親和性に不都合に影響を及ぼさないことを示した。ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートの見かけのＫｄ（３．９０２ｎＭ）（「ＤＳ６−ＤＭ１」）は、裸の抗体（２．０２０ｎＭ）（「ＤＳ６」）よりわずかに高かった。
【図２１】［５３］図２１は、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤＭ１コンジュゲート（２°Ａｂ−ＤＭ１）の存在下または非存在下で、ＤＳ６抗体を用いた、間接的細胞生死判別アッセイの結果を示す。抗原陽性Ｃａｏｖ−３細胞は、二次コンジュゲートの存在下（「ＤＳ６＋２°Ａｂ−ＤＭ１」）でのみ、ＤＳ６抗体依存性方式で殺された（ＩＣ_５０＝４２４．９ｐＭ）。
【図２２】［５４］図２２は、ｍｕＤＳ６抗体の補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイの結果を示す。結果は、ＨＰＡＣ（図２２Ａ）およびＺＲ−７５−１（図２２Ｂ）細胞に対して、ＣＤＣが仲介するＤＳ６抗体の効果がないことを示す。
【図２３−１】［５５］図２３は、未結合（ｆｒｅｅ）のメイタンシンに対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６抗原陽性卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）、および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞株を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートに対する連続曝露の細胞傷害性に関して試験した（左のパネル）。未結合メイタンシンへの７２時間の曝露によって、メイタンシン感受性に関して、これらの細胞株を同様に試験した（右のパネル）。試験した卵巣癌細胞株は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞株は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞株は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞株は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２３−２】［５５］図２３は、未結合（ｆｒｅｅ）のメイタンシンに対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６抗原陽性卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）、および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞株を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートに対する連続曝露の細胞傷害性に関して試験した（左のパネル）。未結合メイタンシンへの７２時間の曝露によって、メイタンシン感受性に関して、これらの細胞株を同様に試験した（右のパネル）。試験した卵巣癌細胞株は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞株は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞株は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞株は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２３−３】［５５］図２３は、未結合（ｆｒｅｅ）のメイタンシンに対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６抗原陽性卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）、および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞株を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートに対する連続曝露の細胞傷害性に関して試験した（左のパネル）。未結合メイタンシンへの７２時間の曝露によって、メイタンシン感受性に関して、これらの細胞株を同様に試験した（右のパネル）。試験した卵巣癌細胞株は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞株は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞株は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞株は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２３−４】［５５］図２３は、未結合（ｆｒｅｅ）のメイタンシンに対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイの結果を示す。コロニー形成アッセイにおいて、ＤＳ６抗原陽性卵巣癌（図２３Ａ）、乳癌（図２３Ｂ）、子宮頸癌（図２３Ｃ）、および膵臓癌（図２３Ｄ）細胞株を、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートに対する連続曝露の細胞傷害性に関して試験した（左のパネル）。未結合メイタンシンへの７２時間の曝露によって、メイタンシン感受性に関して、これらの細胞株を同様に試験した（右のパネル）。試験した卵巣癌細胞株は、ＯＶＣＡＲ５、ＴＯＶ−２１Ｇ、Ｃａｏｖ−４およびＣａｏｖ−３であった。試験した乳癌細胞株は、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ−２０およびＢＴ−４８３であった。試験した子宮頸癌細胞株は、ＫＢ、ＨｅＬａおよびＷＩＳＨであった。試験した膵臓癌細胞株は、ＨＰＡＣ、Ｈｓ７６６ＴおよびＨＰＡＦ−ＩＩであった。
【図２４】［５６］図２４は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイの結果を示す。ＭＴＴ細胞生死判別アッセイにおいて、ヒト卵巣癌（図２４Ａ、図２４Ｂおよび図２４Ｃ）、乳癌（図２４Ｄおよび図２４Ｅ）、子宮頸癌（図２４Ｆおよび図２４Ｇ）、および膵臓癌（図２４Ｈおよび図２４Ｉ）細胞は、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲート依存性方式で、殺された。裸のＤＳ６は、これらの細胞の増殖に不都合に影響を及ぼさず、これは、細胞傷害性には、ＤＭ１コンジュゲート化が必要であることを示した。
【図２５】［５７］図２５Ａは、確立された皮下ＫＢ腫瘍異種移植片に対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性研究の結果を示す。腫瘍細胞を、第０日に接種し、そして最初の処置を第６日に与えた。免疫コンジュゲート処置を、総数５用量で毎日続けた。腫瘍体積が１５００ｍｍ^３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートを１５０または２２５μｇ／ｋｇ ＤＭ１の用量で投与し、これはそれぞれ、５．７および８．５ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に対応した。研究経過中、マウスの体重（図２５Ｂ）を監視した。
【図２６−１】［５８］図２６は、確立された皮下腫瘍異種移植片に対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍有効性研究の結果を示す。第０日に、ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を接種し、そして免疫コンジュゲート処置を、第６日および第１３日に与えた。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートを６００μｇ／ｋｇ ＤＭ１の用量で投与し、これは、２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に対応した。研究経過中、マウスの腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）および体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）を監視した。
【図２６−２】［５８］図２６は、確立された皮下腫瘍異種移植片に対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍有効性研究の結果を示す。第０日に、ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を接種し、そして免疫コンジュゲート処置を、第６日および第１３日に与えた。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートを６００μｇ／ｋｇ ＤＭ１の用量で投与し、これは、２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に対応した。研究経過中、マウスの腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）および体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）を監視した。
【図２６−３】［５８］図２６は、確立された皮下腫瘍異種移植片に対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍有効性研究の結果を示す。第０日に、ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を接種し、そして免疫コンジュゲート処置を、第６日および第１３日に与えた。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートを６００μｇ／ｋｇ ＤＭ１の用量で投与し、これは、２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に対応した。研究経過中、マウスの腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）および体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）を監視した。
【図２６−４】［５８］図２６は、確立された皮下腫瘍異種移植片に対する、ＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍有効性研究の結果を示す。第０日に、ＯＶＣＡＲ５（図２６Ａおよび図２６Ｂ）、ＴＯＶ−２１Ｇ（図２６Ｃおよび図２６Ｄ）、ＨＰＡＣ（図２６Ｅおよび図２６Ｆ）、およびＨｅＬａ（図２６Ｇおよび図２６Ｈ）細胞を接種し、そして免疫コンジュゲート処置を、第６日および第１３日に与えた。腫瘍体積が１０００ｍｍ^３を超えた時点で、ＰＢＳ対照動物を安楽死させた。コンジュゲートを６００μｇ／ｋｇ ＤＭ１の用量で投与し、これは、２７．７ｍｇ／ｋｇの抗体濃度に対応した。研究経過中、マウスの腫瘍体積（図２６Ａ、図２６Ｃ、図２６Ｅ、および図２６Ｇ）および体重（図２６Ｂ、図２６Ｄ、図２６Ｆ、および図２６Ｈ）を監視した。
【図２７】［５９］図２７は、腹腔内ＯＶＣＡＲ５腫瘍に対する、ｍｕＤＳ６抗体−ＤＭ１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究の結果を示す。第０日に、腫瘍細胞を腹腔内注射し、そして第６日および第１３日に、免疫コンジュゲート処置を与えた。体重喪失が２０％を超えた時点で、動物を安楽死させた。
【図２８】［６０］図２８は、ＨｅＬａ細胞に対する、裸のおよびタキサン−コンジュゲート化ＤＳ６抗体の結合親和性の研究由来のフローサイトメトリー結合曲線を示す。タキサン（ＭＭ１−２０２）−コンジュゲート化は、抗体の結合親和性に不都合に影響を及ぼさない。ＤＳ６−ＭＭ１−２０２コンジュゲートの見かけのＫｄ（１．２４ｎＭ）は、裸のＤＳ６抗体（６２０ｐＭ）よりもわずかに大きかった。
【図２９】［６１］図２９は、ヒト化ＤＳ６ １．０１型抗体コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合および強度を示す。ＤＭ４とｈｕＤＳ６ｖ１．０１のコンジュゲート化は、ＫＢ細胞に対するｈｕＤＳ６ｖ１．０１のアビディティーにほとんど影響を及ぼさない（図２９Ａ）。ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＤＭ４は、ＤＳ６を発現しているＷＩＳＨ細胞に向かって、強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示し、ＩＣ_５０は０．４４ｎＭであった（図２９Ｂ）。
【図３０】［６２］図３０は、ＨＰＡＣ膵臓癌モデルにおける、ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＤＭ４コンジュゲートを用いたｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究の結果を示す。ｈｕＤＳ６ｖ１．０１−ＤＭ４は、強力な抗腫瘍活性を示し、一方、ＨＰＡＣモデル中にターゲットが発現されていないＢ４−ＤＭ４対照コンジュゲートは、本質的にまったく活性を持たなかった（図３０Ａ）。２００μｇ／ｋｇの投与用量は、体重喪失の欠如によって示されるように、動物に対して毒性ではなかった（図３０Ｂ）。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの重鎖可変領域またはその断片および少なくとも１つの軽鎖可変領域またはその断片を含む、抗体またはそのエピトープ結合性断片であって、前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列：
【化１】

に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する、前記抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項２】
前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列に対し、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１の抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項３】
前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域またはその断片が、配列番号７または配列番号８によって示されるアミノ酸配列：
【化２】

に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１の抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域またはその断片が、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列に対
し、少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１の抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域またはその断片が、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項７】
前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖可変領域またはその断片が、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する、請求項１の抗体またはそのエピトープ結合性断片。
【請求項８】
請求項１記載の抗体またはそのエピトープ結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４記載の抗体またはそのエピトープ結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項７記載の抗体またはそのエピトープ結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１記載の抗体またはそのエピトープ結合性断片の重鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項８のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１０のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１３の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
抗体またはそのエピトープ結合性断片を調製する方法であって、請求項１５の宿主細胞を、前記抗体またはそのエピトープ結合性断片の発現を促進する条件下で培養し、そして該細胞培養から前記ポリペプチドを回収する
ここで、前記抗体またはそのエピトープ結合性断片が、少なくとも１つの重鎖可変領域またはその断片および少なくとも１つの軽鎖可変領域またはその断片を含み、前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列：
【化３】

に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する
工程を含む、前記方法。
【請求項１９】
抗体またはそのエピトープ結合性断片を調製する方法であって、請求項１６の宿主細胞を、前記抗体またはそのエピトープ結合性断片の発現を促進する条件下で培養し、そして該細胞培養から前記ポリペプチドを回収する
ここで、前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１からなる群より選択されるアミノ酸配列：
【化４】

に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして
前記軽鎖可変領域またはその断片が、配列番号７または配列番号８によって示されるアミノ酸配列：
【化５】

に対し、少なくとも９０％の配列同一性を有する
工程を含む、前記方法。
【請求項２０】
抗体またはそのエピトープ結合性断片を調製する方法であって、請求項１７の宿主細胞を、前記抗体またはそのエピトープ結合性断片の発現を促進する条件下で培養し、そして該細胞培養から前記ポリペプチドを回収する
ここで、前記重鎖可変領域またはその断片が、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列を有し、そして前記軽鎖可変領域またはその断片が、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する
工程を含む、前記方法。

【図１】

【図２】

【図４】

【図５−１】

【図５−２】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３−１】

【図１３−２】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３−１】

【図２３−２】

【図２３−３】

【図２３−４】

【図２４】

【図２５】

【図２６−１】

【図２６−２】

【図２６−３】

【図２６−４】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３】

【公開番号】特開２０１２−１６１３２１（Ｐ２０１２−１６１３２１Ａ）
【公開日】平成２４年８月３０日（２０１２．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−８０６８６（Ｐ２０１２−８０６８６）
【出願日】平成２４年３月３０日（２０１２．３．３０）
【分割の表示】特願２００８−５２７８８２（Ｐ２００８−５２７８８２）の分割
【原出願日】平成１７年８月２２日（２００５．８．２２）
【出願人】（５０４０３９１５５）イミュノジェン・インコーポレーテッド (36)
【Ｆターム（参考）】