ＣＤ２０認識モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、ＣＤ２０の検出方法および診断方法
【課題】Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができるＣＤ２０認識モノクローナル抗体を提供する。
【解決手段】ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体である。このＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いることにより、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができる。
【解決手段】ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体である。このＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いることにより、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ２０分子を認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いるＣＤ２０の検出方法および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常Ｂ細胞あるいはＢ細胞性リンパ腫細胞の細胞表面に発現するＣＤ２０分子は、近年抗体療法の標的分子として利用されている。最近になって、ＣＤ２０分子のＣ末端細胞質内領域に遺伝子変異を獲得したリンパ腫細胞は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体医薬の一つであるリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を併用した化学療法に対して耐性を示すことが示されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、現在まで、ＣＤ２０分子に対する病理組織化学染色はほぼ寡占的にＬ２６と命名されたモノクローナル抗体が用いられてきた。この抗体はＣＤ２０分子の細胞質内領域を認識することが報告されていた（非特許文献２参照）が、そのエピトープの詳細に関する報告は現在までされていない。
【０００４】
また、現在までにＣＤ２０分子を認識する各種のモノクローナル抗体が市販されているが、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子を認識することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Clin Cancer Res., 2009 Apr 1; 15(7): pp. 2523-30
【非特許文献２】Am J Pathol., 1990 Jun; 136(6): pp. 1215-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができるＣＤ２０認識モノクローナル抗体、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いるＣＤ２０の検出方法および診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体である。
【０００８】
また、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体において、前記Ｎ末端細胞質内領域におけるアミノ酸配列２３番目から３６番目のアミノ酸残基を含むエピトープを認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０００９】
また、本発明は、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１０】
また、本発明は、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用してＣＤ２０を検出するＣＤ２０の検出方法である。
【００１１】
また、前記ＣＤ２０の検出方法において、前記検出する方法が、免疫組織化学染色法であることが好ましい。
【００１２】
また、前記ＣＤ２０の検出方法において、前記検出する方法が、ウエスタンブロッティング法であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫およびＢ細胞性白血病の診断を行う診断方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識することが可能なＣＤ２０認識モノクローナル抗体により、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｂ細胞におけるＣＤ２０分子の構造を示す概略模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体およびＬ２６によるＣＤ２０分子の認識部位の一例を示す概略模式図である。
【図３】本発明の実施例におけるＬ２６抗体のエピトープ探索における染色結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例における２１種類のハイブリドーマのウエスタンブロッティング法による評価結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例における病理標本の組織免疫染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
＜ＣＤ２０認識モノクローナル抗体＞
図１に、Ｂ細胞におけるＣＤ２０分子の構造を示す概略模式図を示す。図１に示すように、ＣＤ２０分子５０は、細胞膜５２に対してＮ末端側から、細胞質内７２に位置するＮ末端細胞質内領域（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）５４、細胞膜５２内に位置する細胞膜内領域（ＴＭ）５６、細胞膜外７４に位置する細胞膜外領域（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）５８、細胞膜内領域６０、細胞質内領域６２、細胞膜内領域６４、細胞膜外領域６６、細胞膜内領域６８、Ｃ末端細胞質内領域７０の順に構成されている。ＣＤ２０分子５０において、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体医薬の一つであるリツキシマブは、通常、細胞膜外領域６６におけるリツキシマブ認識領域７６を認識する。
【００１８】
本発明者らが、ＣＤ２０分子へのＬ２６抗体の抗体結合位置を実験的に特定したところ、図２に示すように、ＣＤ２０分子のＣ末端細胞質内領域７０におけるアミノ酸配列２６４番目から２８１番目の領域７８内の領域を認識していることが明らかになり（実施例の欄参照）、理論上、Ｃ末端細胞質内領域７０に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子の大部分を認識できないことが判明した。そこで本発明者らは、このようなＣ末端細胞質内領域７０に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができる、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域を認識するモノクローナル抗体を確立した。
【００１９】
本発明の実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域を認識して結合しうる抗体分子である。本発明の実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域５４を認識して結合しうるものであればよく、特に制限はない。ＣＤ２０認識モノクローナル抗体が認識する認識部位は、Ｎ末端細胞質内領域５４のうち、Ｎ末端になるべく近い方がよく、かつ抗体が生成しやすい部位であることが望ましい。
【００２０】
ここで、「Ｎ末端細胞質内領域」とは、ＣＤ２０分子のアミノ酸配列１番目から６４番目までの領域（ＭＴＴＰＲＮＳＶＮＧＴＦＰＡＥＰＭＫＧＰＩＡＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳＬＶＧＰＴＱＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩ）のことをいう。「Ｃ末端細胞質内領域」とは、ＣＤ２０分子のアミノ酸配列２１０番目から２９７番目までの領域（ＧＩＶＥＮＥＷＫＲＴＣＳＲＰＫＳＮＩＶＬＬＳＡＥＥＫＫＥＱＴＩＥＩＫＥＥＶＶＧＬＴＥＴＳＳＱＰＫＮＥＥＤＩＥＩＩＰＩＱＥＥＥＥＥＥＴＥＴＮＦＰＥＰＰＱＤＱＥＳＳＰＩＥＮＤＳＳＰ）のことをいう。
【００２１】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、この「Ｎ末端細胞質内領域」において、抗体が生成しやすい等の点で、アミノ酸配列２３番目から３６番目のアミノ酸残基（ＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳ）（図２の領域８０に相当）、４３番目から５２番目のアミノ酸残基（配列：ＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬ）を含むエピトープを認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体であることが好ましく、その中でも２３番目から３６番目のアミノ酸残基（ＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳ）を含むエピトープを認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体であることが特に好ましい。
【００２２】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ヒト型抗体またはヒト抗体であってもよい。
【００２３】
＜ＣＤ２０認識モノクローナル抗体、ハイブリドーマの作製方法＞
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、当該分野で周知の各種の方法で製造することができる。例えば、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域における所望の領域のアミノ酸配列のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を配置した合成ペプチドを作製し、末端システイン残基にＫＬＨ等のキャリアタンパク質を結合（コンジュゲーション）したものを、必要に応じてフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント等のアジュバントと混合し、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物の皮下等に投与する。投与は、同じ抗原を用いて所定の間隔で複数回行ってもよい。最終感作を行った後、所定の間隔をおいてから、抗体を産生した哺乳動物より、脾臓細胞等の抗体産生細胞を採取し、常法に従いマウス骨髄腫細胞等との細胞融合を実施してハイブリドーマを作製する。なお、抗体の産生は、投与した哺乳動物より血清を採取し、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法等により確認することができる。ハイブリドーマはクローニングを実施し、培養上清を用い、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法を実施して、候補細胞を選択してハイブリドーマを確立することができる。
【００２４】
抗原の哺乳動物１匹当たりの投与量は、例えば、アジュバントを用いないときは０．５ｍｇ〜１ｍｇであり、アジュバントを用いるときは０．０５ｍｇ〜０．１ｍｇである。
【００２５】
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、合成サーファクタント、リポソーム等が挙げられる。
【００２６】
免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、例えば、数日から数週間間隔、好ましくは２週間〜３週間間隔で、１〜５回、好ましくは２〜４回免疫を行う。そして、例えば、最終の免疫日から１〜７日後、好ましくは１〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞、骨髄細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
【００２７】
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、例えば、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。ミエローマ細胞としては、例えば、マウス骨髄腫細胞等が挙げられる。
【００２８】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば、ＨＡＴ培地等の培地中で、１〜１０×１０７個／ｍＬの抗体産生細胞と１〜５×１０７個／ｍＬミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比は、例えば、２：１〜１０：１である。細胞融合促進剤として、重量平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてもよい。
【００２９】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。細胞懸濁液を例えば限界希釈等の方法により培養を行う。培養により生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。そして、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法により行えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酸素結合免疫吸着測定法、フローサイトメトリー法、イムノブロット法等によってスクリーニングすればよい。陽性の融合細胞のクローニングを、限界希釈法等により行い、モノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００３０】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法、腹水形成法等を用いればよい。細胞培養法においては、例えば、ハイブリドーマをＲＰＭＩ基本培地等の培地中で、３０℃〜３８℃、好ましくは３７℃の培養条件で３日〜６０日間培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。
【００３１】
腹水形成法の場合は、例えば、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを１〜２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集して、モノクローナル抗体を取得することができる。
【００３２】
モノクローナル抗体は必要に応じて精製を行ってもよい。精製法としては、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィ等の方法が挙げられ、これらの方法を適宜選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製すればよい。
【００３３】
＜ＣＤ２０の検出方法＞
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、ＣＤ２０を検出することができる、すなわち、測定対象試料がＣＤ２０（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含むかどうかを評価することができる。測定対象試料としては、細胞、組織、血液、リンパ液および骨髄液等である。検出方法としては、免疫組織化学染色法、ウエスタンブロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）法等が挙げられる。
【００３４】
免疫組織化学染色法は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋切片等に対して本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いて抗原抗体反応を行い、発色操作により可視化を行う方法である。本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いることにより、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子に特異的な、良好な染色像を得ることができる。
【００３５】
ウエスタンブロッティング法は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動によって試料を分離して、膜に転写し、本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いて抗原抗体反応を行い、発色操作により可視化を行う方法である。本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いることにより、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を良好に検出することができる。
【００３６】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いるＣＤ２０の検出方法は、びまん性大細胞型リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫等のＢ細胞性リンパ腫である非ホジキン悪性リンパ腫等の固形悪性腫瘍（リンフォーマ）や、血液浮遊系の悪性腫瘍の一つであるＢ細胞性白血病（ロイケミア）の臨床検査、診断等に用いることができる。
【００３７】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ヒト型抗体またはヒト抗体とすることにより、Ｂ細胞性リンパ腫等の治療用の抗体とすることができ、現行の治療用の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体医薬の一つであるリツキシマブより治療効果の高い、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫等の治療用免疫治療薬が得られる可能性がある。
【００３８】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、Ｌ２６抗体等のモノクローナル抗体等との併用により、リツキシマブ治療等に対する不可逆的な耐性を示す症例を早期に検出することを可能にし、リツキシマブによる治療等の継続の是非、あるいは将来的に導入が見込まれるより低い発現量の抗原に対して効果が期待される新規抗体医薬への治療方針転換を判断するための重要な知見を提供することが期待される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
＜Ｌ２６抗体のエピトープ探索＞
ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ細胞から、ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＴＲＩｚｏｌ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。本ＲＮＡを鋳型に、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、ヒトＣＤ２０遺伝子のタンパク質コード領域の全長を挟むように設計されたオリゴＤＮＡプライマーを用いて、ヒトＣＤ２０遺伝子のタンパク質コード領域の全長（２９７アミノ酸をコード）を含む配列をＰＣＲ法により増幅した。逆転写反応、ＰＣＲ反応はＴａｋａｒａ社、 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用した。これにより得られたＤＮＡをレトロウイルスベクター（Ｔａｋａｒａ社 ｐＤＯＮ−ＡＩベクター）に制限酵素を用いてクローニングした。ＤＮＡ配列解析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ ３１３０）を用いて、導入した遺伝子配列を確認後、このヒトＣＤ２０遺伝子のタンパク質コード領域の全長を導入したベクターを鋳型に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社 Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを使用し、ＣＤ２０アミノ酸配列２８１番目のグルタミン酸、２６３番目のグルタミン酸、２４５番目のグルタミン酸、２２８番目のバリン、２１０番目のグリシン残基の直後にそれぞれ終止コドンができるように遺伝子変異を挿入し、Ｃ末端欠失変異ベクター５種類を作製した。
【００４１】
野生型ヒトＣＤ２０全長、および５種類のＣＤ２０欠失変異株をコードする遺伝子を導入したベクター、および外来遺伝子を導入しないｍｏｃｋベクターの７種類のレトウイルスベクターを使用し、パッケージング細胞株Ｇ３Ｔｈｉ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてレトロウイルスを産生させた。これらの７種類のレトロウイルスを用いて、ＣＤ２０タンパク質を発現しないヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ１２ＰＥ細胞に感染させ、Ｃ末端細胞質内領域の長さの異なる６種類のＣＤ２０を発現する細胞株とｍｏｃｋベクターを導入した陰性対照細胞株を作製した。
【００４２】
これら７種類の細胞株および陽性対照細胞株として、ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞を、７５ｍＭの塩化カリウム水溶液で膨潤後、コラーゲンＩでコートされたカバーグラス（ＩＷＡＫＩ社）にマウントした。細胞標本は３．７％ホルムアミド／０．５％グルタルアルデヒド溶液で固定、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で浸透化処理を施した後、Ｌ２６抗体（ＤＡＫＯ社）溶液を添加し、抗原抗体反応を実施した。標本を０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２次染色を実施した。標本は０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で洗浄後、５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ溶液で核染色を実施した。これらの標本について、共焦点顕微鏡（オリンパス社）を用いて観察を行った。結果を図３に示す。Ｌ２６抗体による特異的な染色シグナルが、野生型ＣＤ２０分子、２８１番目のグルタミン酸残基の直後に終止コドンを挿入したＣＤ２０分子を発現する細胞、および陽性対照細胞にのみ認められたことから、Ｌ２６抗体のＣＤ２０分子上の結合位置が、アミノ酸配列２６４番目〜２８１番目の間にあることが強く示唆された。
【００４３】
＜ＣＤ２０認識モノクローナル抗体の作製＞
ＣＤ２０（配列番号１）のＮ末端細胞質内領域（アミノ酸２３〜３６番目）のアミノ酸配列のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を配置したＣＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳ（配列番号２）と相同な合成ペプチドを作製し、末端システイン残基にＫＬＨを結合したものを、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバントと混合し、３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に投与した。具体的には、０．５ｍｇ／ｍＬに調製したＫＬＭ結合合成ペプチドを等量のフロイント完全アジュバントと混合してエマルジョンを形成させたものを、０．０５ｍＬずつマウスの背部皮下に投与した。マウスは同じ抗原で２週間間隔にて、さらに４回感作（最終感作は静注）を行った。最終感作から４日後、各マウスより血清を採取し、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法にて、抗体の産生を確認した。抗体を産生したマウスより、脾臓細胞を採取し、常法に従い、マウス骨髄腫細胞との細胞融合を実施し、ハイブリドーマを作製した。具体的には、上記の脾臓細胞１×１０９個と、マウスミエローマＰ３Ｕ１細胞２×１０８個とを混合した後、１，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけた。上清を吸引除去し、沈殿画分として細胞を取得し、これに２５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベーリンガー社製）１ｍＬを加えた後、さらにＲＰＭＩ培地１０ｍＬをゆっくり加えて、総量を１０ｍＬとした。これに、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地１０ｍＬを加えて、少し静置させた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分（細胞画分）に２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を加えて細胞濃度が１０６個／ｍＬになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の９６穴培養プレートに２００μＬ／ウエルずつ分注した。５％ＣＯ２・３７℃インキュベーター中で２４時間培養後、ＨＡＴ溶液（インビトロジェン社製）を添加した後、さらに２週間培養した。ハイブリドーマはクローニングを実施し、培養上清を用いて、再度、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法を実施して候補細胞を選択して２１種類のハイブリドーマを確立した。サブクラスとしてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体が含まれた。
【００４４】
＜ハイブリドーマクローンの評価＞
２１種類のハイブリドーマをＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン）にて培養し、その培養上清を用いて、ウエスタンブロッティング法により、抗体の評価を実施した。
【００４５】
評価に用いた抗原試料は、ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ ＤＴＴ、２％ ＳＤＳ、０．１％ ブロモフェノールブルー、１０％ グリセロールを含むサンプル緩衝液に懸濁したものを用い、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの各ウエルにタンパク質量として２５μｇになるように抗原試料を添加し、電気泳動にて分離し、ＰＶＤＦ製の膜（ＢｉｏＲａｄ社製、ＩｍｍｕｎｍａｉｎａｓｕＢｌｏｔ ＰＶＤＦ）に電気的に転写した。転写終了後、ブロッキング剤（ナカライテスク社製、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ）に室温（２２〜２７℃）で３０分間浸漬後、各レーンを切断し、それぞれ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液で２０倍に希釈した培養上清に浸漬し、室温で２時間浸漬を行った。培養上清を廃棄後、十分量の０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝液で３回洗浄後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識−抗マウスヤギＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）に室温で１時間浸漬した。抗体溶液を廃棄後、十分量の０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄したのち、ＧＥヘルスケア社、ＥＣＬ プラス Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムを用いて処理を行い、化学発光用フィルム（ＧＥヘルスケア社、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ）にて、シグナルを検出した。評価結果を図４に示す。
【００４６】
＜病理標本の組織免疫染色＞
一次抗体として、Ｌ２６抗体（ＤＡＫＯ社 コード番号 N１５０２）、およびハイブリドーマ、クローン４−６H：２Ｃ（ＣＤ２０Ｎ）の培養上清より、固相化ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて精製した免疫グロブリン（サブクラスＩｇＧ３）を用いた。
【００４７】
［標本作製］
通常のＬ２６抗体を用いた方法によりＣＤ２０陽性と評価されたリツキシマブによる治療前の病理組織およびＣＤ２０陰性と評価された再発後の胸水フィブリンクロットを、採取後ただちに、組織切片の５〜１０倍量の１０％の中性ホルマリン固定液に浸した。この際、２４時間を超えないようにした。固定後、水洗いし、７０％エタノールに浸した。それを順次高濃度となる系列のエタノールに浸して脱水し、さらにキシレンに浸して脱アルコールした後、パラフィン包埋した。パラフィン包埋標本はミクロトームで３〜５μｍに薄切し、スライドガラスに貼り付け、恒温槽内で十分に乾燥させた。
【００４８】
［脱パラフィン／親水化］
スライドを以下の溶液に順次浸し、脱パラフィンおよび親水化処理を行った。
キシレン５分（２回）、１００％エタノール ３分（２回）、９５％エタノール ３分（２回）、８０％エタノール ３分（２回）、７０％エタノール ３分、５０％エタノール ３分、精製水 ３分（２回）、トリス塩酸緩衝液 ３分
【００４９】
［抗原賦活処理］
脱パラフィン／親水化処理を行ったスライドは、Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ９（Dａｋｏ社）に浸漬し、９７℃で４０分間加熱し、抗原賦活処理を行った。
【００５０】
［標識処理］
抗体標識は、Ｄａｋｏ社製自動免疫組織化学装置Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ｐｌｕｓを使用し、Ｄａｋｏ社のプロトコール通りに実施した。ただし、ＣＤ２０Ｎは、抗体希釈用緩衝液（Dａｋｏ社）にて５０倍希釈したものを用いた。
【００５１】
［脱水／封入］
検体組織スライドを以下の順に各液に浸漬し、脱水／透徹処理を行った。
精製水１分、５０％エタノール ３分、７０％エタノール ３分、８０％エタノール ３分、９５％エタノール ３分、１００％エタノール ３分（３回）、キシレン ３分（３回）、その後、封入剤で封入し、カバーガラスをかけた。顕微鏡による観察結果を図５に示す。図５において、上段は、通常のＬ２６抗体を用いた方法によりＣＤ２０陽性と評価されたリツキシマブによる治療前の病理組織の観察結果、下段は、ＣＤ２０陰性と評価された再発後の胸水細胞クロットの観察結果を示す。
【００５２】
このように、Ｃ末端領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識する、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域を認識するモノクローナル抗体を確立した。本抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いた免疫組織化学染色においても、ＣＤ２０分子特異的な良好な染色像を提供した。さらに、Ｌ２６抗体を用いた免疫組織化学染色の結果、ＣＤ２０陰性と評価された標本の再検査により、陽性を示す標本を検出した。この症例のＣＤ２０遺伝子配列解析の結果、Ｃ末端領域に遺伝子変異が検出された。
【００５３】
後方視的な解析の結果、当該遺伝子変異が検出された以降、本症例はリツキシマブ併用化学療法に対して、治療反応が得られていないことが判明した。また本実施例により確立したＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いた解析の結果、本症例におけるＣＤ２０分子は細胞膜近傍に発現が認められたが、正常なＣＤ２０分子と比較すると、リツキシマブの結合が著しく減弱していた（ただし、完全に失われている訳ではなかった）。
【符号の説明】
【００５４】
５０ ＣＤ２０分子、５２ 細胞膜、５４ Ｎ末端細胞質内領域、５６，６０，６４，６８ 細胞膜内領域、５８，６６ 細胞膜外領域、６２ 細胞質内領域、７０ Ｃ末端細胞質内領域、７２ 細胞質内、７４ 細胞膜外、７６ リツキシマブ認識領域、７８，８０ 領域。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ２０分子を認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いるＣＤ２０の検出方法および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
正常Ｂ細胞あるいはＢ細胞性リンパ腫細胞の細胞表面に発現するＣＤ２０分子は、近年抗体療法の標的分子として利用されている。最近になって、ＣＤ２０分子のＣ末端細胞質内領域に遺伝子変異を獲得したリンパ腫細胞は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体医薬の一つであるリツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）を併用した化学療法に対して耐性を示すことが示されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一方、現在まで、ＣＤ２０分子に対する病理組織化学染色はほぼ寡占的にＬ２６と命名されたモノクローナル抗体が用いられてきた。この抗体はＣＤ２０分子の細胞質内領域を認識することが報告されていた（非特許文献２参照）が、そのエピトープの詳細に関する報告は現在までされていない。
【０００４】
また、現在までにＣＤ２０分子を認識する各種のモノクローナル抗体が市販されているが、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子を認識することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Clin Cancer Res., 2009 Apr 1; 15(7): pp. 2523-30
【非特許文献２】Am J Pathol., 1990 Jun; 136(6): pp. 1215-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができるＣＤ２０認識モノクローナル抗体、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、そのＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いるＣＤ２０の検出方法および診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体である。
【０００８】
また、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体において、前記Ｎ末端細胞質内領域におけるアミノ酸配列２３番目から３６番目のアミノ酸残基を含むエピトープを認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０００９】
また、本発明は、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１０】
また、本発明は、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用してＣＤ２０を検出するＣＤ２０の検出方法である。
【００１１】
また、前記ＣＤ２０の検出方法において、前記検出する方法が、免疫組織化学染色法であることが好ましい。
【００１２】
また、前記ＣＤ２０の検出方法において、前記検出する方法が、ウエスタンブロッティング法であることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、前記ＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫およびＢ細胞性白血病の診断を行う診断方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明では、ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識することが可能なＣＤ２０認識モノクローナル抗体により、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｂ細胞におけるＣＤ２０分子の構造を示す概略模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体およびＬ２６によるＣＤ２０分子の認識部位の一例を示す概略模式図である。
【図３】本発明の実施例におけるＬ２６抗体のエピトープ探索における染色結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例における２１種類のハイブリドーマのウエスタンブロッティング法による評価結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例における病理標本の組織免疫染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
＜ＣＤ２０認識モノクローナル抗体＞
図１に、Ｂ細胞におけるＣＤ２０分子の構造を示す概略模式図を示す。図１に示すように、ＣＤ２０分子５０は、細胞膜５２に対してＮ末端側から、細胞質内７２に位置するＮ末端細胞質内領域（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）５４、細胞膜５２内に位置する細胞膜内領域（ＴＭ）５６、細胞膜外７４に位置する細胞膜外領域（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）５８、細胞膜内領域６０、細胞質内領域６２、細胞膜内領域６４、細胞膜外領域６６、細胞膜内領域６８、Ｃ末端細胞質内領域７０の順に構成されている。ＣＤ２０分子５０において、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体医薬の一つであるリツキシマブは、通常、細胞膜外領域６６におけるリツキシマブ認識領域７６を認識する。
【００１８】
本発明者らが、ＣＤ２０分子へのＬ２６抗体の抗体結合位置を実験的に特定したところ、図２に示すように、ＣＤ２０分子のＣ末端細胞質内領域７０におけるアミノ酸配列２６４番目から２８１番目の領域７８内の領域を認識していることが明らかになり（実施例の欄参照）、理論上、Ｃ末端細胞質内領域７０に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子の大部分を認識できないことが判明した。そこで本発明者らは、このようなＣ末端細胞質内領域７０に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識することができる、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域を認識するモノクローナル抗体を確立した。
【００１９】
本発明の実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域を認識して結合しうる抗体分子である。本発明の実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域５４を認識して結合しうるものであればよく、特に制限はない。ＣＤ２０認識モノクローナル抗体が認識する認識部位は、Ｎ末端細胞質内領域５４のうち、Ｎ末端になるべく近い方がよく、かつ抗体が生成しやすい部位であることが望ましい。
【００２０】
ここで、「Ｎ末端細胞質内領域」とは、ＣＤ２０分子のアミノ酸配列１番目から６４番目までの領域（ＭＴＴＰＲＮＳＶＮＧＴＦＰＡＥＰＭＫＧＰＩＡＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳＬＶＧＰＴＱＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩ）のことをいう。「Ｃ末端細胞質内領域」とは、ＣＤ２０分子のアミノ酸配列２１０番目から２９７番目までの領域（ＧＩＶＥＮＥＷＫＲＴＣＳＲＰＫＳＮＩＶＬＬＳＡＥＥＫＫＥＱＴＩＥＩＫＥＥＶＶＧＬＴＥＴＳＳＱＰＫＮＥＥＤＩＥＩＩＰＩＱＥＥＥＥＥＥＴＥＴＮＦＰＥＰＰＱＤＱＥＳＳＰＩＥＮＤＳＳＰ）のことをいう。
【００２１】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、この「Ｎ末端細胞質内領域」において、抗体が生成しやすい等の点で、アミノ酸配列２３番目から３６番目のアミノ酸残基（ＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳ）（図２の領域８０に相当）、４３番目から５２番目のアミノ酸残基（配列：ＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬ）を含むエピトープを認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体であることが好ましく、その中でも２３番目から３６番目のアミノ酸残基（ＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳ）を含むエピトープを認識するＣＤ２０認識モノクローナル抗体であることが特に好ましい。
【００２２】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ヒト型抗体またはヒト抗体であってもよい。
【００２３】
＜ＣＤ２０認識モノクローナル抗体、ハイブリドーマの作製方法＞
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、当該分野で周知の各種の方法で製造することができる。例えば、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域における所望の領域のアミノ酸配列のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を配置した合成ペプチドを作製し、末端システイン残基にＫＬＨ等のキャリアタンパク質を結合（コンジュゲーション）したものを、必要に応じてフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント等のアジュバントと混合し、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物の皮下等に投与する。投与は、同じ抗原を用いて所定の間隔で複数回行ってもよい。最終感作を行った後、所定の間隔をおいてから、抗体を産生した哺乳動物より、脾臓細胞等の抗体産生細胞を採取し、常法に従いマウス骨髄腫細胞等との細胞融合を実施してハイブリドーマを作製する。なお、抗体の産生は、投与した哺乳動物より血清を採取し、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法等により確認することができる。ハイブリドーマはクローニングを実施し、培養上清を用い、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法を実施して、候補細胞を選択してハイブリドーマを確立することができる。
【００２４】
抗原の哺乳動物１匹当たりの投与量は、例えば、アジュバントを用いないときは０．５ｍｇ〜１ｍｇであり、アジュバントを用いるときは０．０５ｍｇ〜０．１ｍｇである。
【００２５】
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、合成サーファクタント、リポソーム等が挙げられる。
【００２６】
免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、例えば、数日から数週間間隔、好ましくは２週間〜３週間間隔で、１〜５回、好ましくは２〜４回免疫を行う。そして、例えば、最終の免疫日から１〜７日後、好ましくは１〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞、骨髄細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
【００２７】
細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、例えば、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。ミエローマ細胞としては、例えば、マウス骨髄腫細胞等が挙げられる。
【００２８】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、例えば、ＨＡＴ培地等の培地中で、１〜１０×１０７個／ｍＬの抗体産生細胞と１〜５×１０７個／ｍＬミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤の存在下で融合反応を行う。抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比は、例えば、２：１〜１０：１である。細胞融合促進剤として、重量平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてもよい。
【００２９】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。細胞懸濁液を例えば限界希釈等の方法により培養を行う。培養により生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。そして、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法により行えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酸素結合免疫吸着測定法、フローサイトメトリー法、イムノブロット法等によってスクリーニングすればよい。陽性の融合細胞のクローニングを、限界希釈法等により行い、モノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００３０】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法、腹水形成法等を用いればよい。細胞培養法においては、例えば、ハイブリドーマをＲＰＭＩ基本培地等の培地中で、３０℃〜３８℃、好ましくは３７℃の培養条件で３日〜６０日間培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。
【００３１】
腹水形成法の場合は、例えば、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを１〜２×１０７個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜２週間後に腹水を採集して、モノクローナル抗体を取得することができる。
【００３２】
モノクローナル抗体は必要に応じて精製を行ってもよい。精製法としては、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィ等の方法が挙げられ、これらの方法を適宜選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製すればよい。
【００３３】
＜ＣＤ２０の検出方法＞
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、ＣＤ２０を検出することができる、すなわち、測定対象試料がＣＤ２０（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含むかどうかを評価することができる。測定対象試料としては、細胞、組織、血液、リンパ液および骨髄液等である。検出方法としては、免疫組織化学染色法、ウエスタンブロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ法）、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）法、ＲＩＡ（ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）法等が挙げられる。
【００３４】
免疫組織化学染色法は、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋切片等に対して本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いて抗原抗体反応を行い、発色操作により可視化を行う方法である。本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いることにより、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子に特異的な、良好な染色像を得ることができる。
【００３５】
ウエスタンブロッティング法は、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気泳動によって試料を分離して、膜に転写し、本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いて抗原抗体反応を行い、発色操作により可視化を行う方法である。本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いることにより、Ｃ末端細胞質内領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を良好に検出することができる。
【００３６】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いるＣＤ２０の検出方法は、びまん性大細胞型リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫等のＢ細胞性リンパ腫である非ホジキン悪性リンパ腫等の固形悪性腫瘍（リンフォーマ）や、血液浮遊系の悪性腫瘍の一つであるＢ細胞性白血病（ロイケミア）の臨床検査、診断等に用いることができる。
【００３７】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、ヒト型抗体またはヒト抗体とすることにより、Ｂ細胞性リンパ腫等の治療用の抗体とすることができ、現行の治療用の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体医薬の一つであるリツキシマブより治療効果の高い、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫等の治療用免疫治療薬が得られる可能性がある。
【００３８】
本実施形態に係るＣＤ２０認識モノクローナル抗体は、Ｌ２６抗体等のモノクローナル抗体等との併用により、リツキシマブ治療等に対する不可逆的な耐性を示す症例を早期に検出することを可能にし、リツキシマブによる治療等の継続の是非、あるいは将来的に導入が見込まれるより低い発現量の抗原に対して効果が期待される新規抗体医薬への治療方針転換を判断するための重要な知見を提供することが期待される。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４０】
＜Ｌ２６抗体のエピトープ探索＞
ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ細胞から、ＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＴＲＩｚｏｌ）を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。本ＲＮＡを鋳型に、逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、ヒトＣＤ２０遺伝子のタンパク質コード領域の全長を挟むように設計されたオリゴＤＮＡプライマーを用いて、ヒトＣＤ２０遺伝子のタンパク質コード領域の全長（２９７アミノ酸をコード）を含む配列をＰＣＲ法により増幅した。逆転写反応、ＰＣＲ反応はＴａｋａｒａ社、 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲキットを使用した。これにより得られたＤＮＡをレトロウイルスベクター（Ｔａｋａｒａ社 ｐＤＯＮ−ＡＩベクター）に制限酵素を用いてクローニングした。ＤＮＡ配列解析装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｒ ３１３０）を用いて、導入した遺伝子配列を確認後、このヒトＣＤ２０遺伝子のタンパク質コード領域の全長を導入したベクターを鋳型に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社 Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔを使用し、ＣＤ２０アミノ酸配列２８１番目のグルタミン酸、２６３番目のグルタミン酸、２４５番目のグルタミン酸、２２８番目のバリン、２１０番目のグリシン残基の直後にそれぞれ終止コドンができるように遺伝子変異を挿入し、Ｃ末端欠失変異ベクター５種類を作製した。
【００４１】
野生型ヒトＣＤ２０全長、および５種類のＣＤ２０欠失変異株をコードする遺伝子を導入したベクター、および外来遺伝子を導入しないｍｏｃｋベクターの７種類のレトウイルスベクターを使用し、パッケージング細胞株Ｇ３Ｔｈｉ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてレトロウイルスを産生させた。これらの７種類のレトロウイルスを用いて、ＣＤ２０タンパク質を発現しないヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ１２ＰＥ細胞に感染させ、Ｃ末端細胞質内領域の長さの異なる６種類のＣＤ２０を発現する細胞株とｍｏｃｋベクターを導入した陰性対照細胞株を作製した。
【００４２】
これら７種類の細胞株および陽性対照細胞株として、ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞を、７５ｍＭの塩化カリウム水溶液で膨潤後、コラーゲンＩでコートされたカバーグラス（ＩＷＡＫＩ社）にマウントした。細胞標本は３．７％ホルムアミド／０．５％グルタルアルデヒド溶液で固定、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で浸透化処理を施した後、Ｌ２６抗体（ＤＡＫＯ社）溶液を添加し、抗原抗体反応を実施した。標本を０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２次染色を実施した。標本は０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液で洗浄後、５μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ溶液で核染色を実施した。これらの標本について、共焦点顕微鏡（オリンパス社）を用いて観察を行った。結果を図３に示す。Ｌ２６抗体による特異的な染色シグナルが、野生型ＣＤ２０分子、２８１番目のグルタミン酸残基の直後に終止コドンを挿入したＣＤ２０分子を発現する細胞、および陽性対照細胞にのみ認められたことから、Ｌ２６抗体のＣＤ２０分子上の結合位置が、アミノ酸配列２６４番目〜２８１番目の間にあることが強く示唆された。
【００４３】
＜ＣＤ２０認識モノクローナル抗体の作製＞
ＣＤ２０（配列番号１）のＮ末端細胞質内領域（アミノ酸２３〜３６番目）のアミノ酸配列のＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を配置したＣＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳ（配列番号２）と相同な合成ペプチドを作製し、末端システイン残基にＫＬＨを結合したものを、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバントと混合し、３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスの皮下に投与した。具体的には、０．５ｍｇ／ｍＬに調製したＫＬＭ結合合成ペプチドを等量のフロイント完全アジュバントと混合してエマルジョンを形成させたものを、０．０５ｍＬずつマウスの背部皮下に投与した。マウスは同じ抗原で２週間間隔にて、さらに４回感作（最終感作は静注）を行った。最終感作から４日後、各マウスより血清を採取し、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法にて、抗体の産生を確認した。抗体を産生したマウスより、脾臓細胞を採取し、常法に従い、マウス骨髄腫細胞との細胞融合を実施し、ハイブリドーマを作製した。具体的には、上記の脾臓細胞１×１０９個と、マウスミエローマＰ３Ｕ１細胞２×１０８個とを混合した後、１，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけた。上清を吸引除去し、沈殿画分として細胞を取得し、これに２５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ベーリンガー社製）１ｍＬを加えた後、さらにＲＰＭＩ培地１０ｍＬをゆっくり加えて、総量を１０ｍＬとした。これに、２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地１０ｍＬを加えて、少し静置させた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分（細胞画分）に２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を加えて細胞濃度が１０６個／ｍＬになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の９６穴培養プレートに２００μＬ／ウエルずつ分注した。５％ＣＯ２・３７℃インキュベーター中で２４時間培養後、ＨＡＴ溶液（インビトロジェン社製）を添加した後、さらに２週間培養した。ハイブリドーマはクローニングを実施し、培養上清を用いて、再度、免疫に用いた合成ペプチドを用いて酸素結合免疫吸着測定法を実施して候補細胞を選択して２１種類のハイブリドーマを確立した。サブクラスとしてはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の抗体が含まれた。
【００４４】
＜ハイブリドーマクローンの評価＞
２１種類のハイブリドーマをＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン）にて培養し、その培養上清を用いて、ウエスタンブロッティング法により、抗体の評価を実施した。
【００４５】
評価に用いた抗原試料は、ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ細胞を遠心分離により回収し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ ＤＴＴ、２％ ＳＤＳ、０．１％ ブロモフェノールブルー、１０％ グリセロールを含むサンプル緩衝液に懸濁したものを用い、１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの各ウエルにタンパク質量として２５μｇになるように抗原試料を添加し、電気泳動にて分離し、ＰＶＤＦ製の膜（ＢｉｏＲａｄ社製、ＩｍｍｕｎｍａｉｎａｓｕＢｌｏｔ ＰＶＤＦ）に電気的に転写した。転写終了後、ブロッキング剤（ナカライテスク社製、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｏｎｅ）に室温（２２〜２７℃）で３０分間浸漬後、各レーンを切断し、それぞれ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液で２０倍に希釈した培養上清に浸漬し、室温で２時間浸漬を行った。培養上清を廃棄後、十分量の０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝液で３回洗浄後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝液で１００００倍に希釈したＨＲＰ標識−抗マウスヤギＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）に室温で１時間浸漬した。抗体溶液を廃棄後、十分量の０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄したのち、ＧＥヘルスケア社、ＥＣＬ プラス Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムを用いて処理を行い、化学発光用フィルム（ＧＥヘルスケア社、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ）にて、シグナルを検出した。評価結果を図４に示す。
【００４６】
＜病理標本の組織免疫染色＞
一次抗体として、Ｌ２６抗体（ＤＡＫＯ社 コード番号 N１５０２）、およびハイブリドーマ、クローン４−６H：２Ｃ（ＣＤ２０Ｎ）の培養上清より、固相化ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて精製した免疫グロブリン（サブクラスＩｇＧ３）を用いた。
【００４７】
［標本作製］
通常のＬ２６抗体を用いた方法によりＣＤ２０陽性と評価されたリツキシマブによる治療前の病理組織およびＣＤ２０陰性と評価された再発後の胸水フィブリンクロットを、採取後ただちに、組織切片の５〜１０倍量の１０％の中性ホルマリン固定液に浸した。この際、２４時間を超えないようにした。固定後、水洗いし、７０％エタノールに浸した。それを順次高濃度となる系列のエタノールに浸して脱水し、さらにキシレンに浸して脱アルコールした後、パラフィン包埋した。パラフィン包埋標本はミクロトームで３〜５μｍに薄切し、スライドガラスに貼り付け、恒温槽内で十分に乾燥させた。
【００４８】
［脱パラフィン／親水化］
スライドを以下の溶液に順次浸し、脱パラフィンおよび親水化処理を行った。
キシレン５分（２回）、１００％エタノール ３分（２回）、９５％エタノール ３分（２回）、８０％エタノール ３分（２回）、７０％エタノール ３分、５０％エタノール ３分、精製水 ３分（２回）、トリス塩酸緩衝液 ３分
【００４９】
［抗原賦活処理］
脱パラフィン／親水化処理を行ったスライドは、Ｔａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｐＨ９（Dａｋｏ社）に浸漬し、９７℃で４０分間加熱し、抗原賦活処理を行った。
【００５０】
［標識処理］
抗体標識は、Ｄａｋｏ社製自動免疫組織化学装置Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ｐｌｕｓを使用し、Ｄａｋｏ社のプロトコール通りに実施した。ただし、ＣＤ２０Ｎは、抗体希釈用緩衝液（Dａｋｏ社）にて５０倍希釈したものを用いた。
【００５１】
［脱水／封入］
検体組織スライドを以下の順に各液に浸漬し、脱水／透徹処理を行った。
精製水１分、５０％エタノール ３分、７０％エタノール ３分、８０％エタノール ３分、９５％エタノール ３分、１００％エタノール ３分（３回）、キシレン ３分（３回）、その後、封入剤で封入し、カバーガラスをかけた。顕微鏡による観察結果を図５に示す。図５において、上段は、通常のＬ２６抗体を用いた方法によりＣＤ２０陽性と評価されたリツキシマブによる治療前の病理組織の観察結果、下段は、ＣＤ２０陰性と評価された再発後の胸水細胞クロットの観察結果を示す。
【００５２】
このように、Ｃ末端領域に遺伝子変異を有するＣＤ２０分子も含めて、より広範なＣＤ２０分子を認識する、ＣＤ２０分子のＮ末端細胞質内領域を認識するモノクローナル抗体を確立した。本抗体は、ホルマリン固定パラフィン包埋切片を用いた免疫組織化学染色においても、ＣＤ２０分子特異的な良好な染色像を提供した。さらに、Ｌ２６抗体を用いた免疫組織化学染色の結果、ＣＤ２０陰性と評価された標本の再検査により、陽性を示す標本を検出した。この症例のＣＤ２０遺伝子配列解析の結果、Ｃ末端領域に遺伝子変異が検出された。
【００５３】
後方視的な解析の結果、当該遺伝子変異が検出された以降、本症例はリツキシマブ併用化学療法に対して、治療反応が得られていないことが判明した。また本実施例により確立したＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いた解析の結果、本症例におけるＣＤ２０分子は細胞膜近傍に発現が認められたが、正常なＣＤ２０分子と比較すると、リツキシマブの結合が著しく減弱していた（ただし、完全に失われている訳ではなかった）。
【符号の説明】
【００５４】
５０ ＣＤ２０分子、５２ 細胞膜、５４ Ｎ末端細胞質内領域、５６，６０，６４，６８ 細胞膜内領域、５８，６６ 細胞膜外領域、６２ 細胞質内領域、７０ Ｃ末端細胞質内領域、７２ 細胞質内、７４ 細胞膜外、７６ リツキシマブ認識領域、７８，８０ 領域。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識することを特徴とするＣＤ２０認識モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体であって、
前記Ｎ末端細胞質内領域におけるアミノ酸配列２３番目から３６番目のアミノ酸残基を含むエピトープを認識することを特徴とするＣＤ２０認識モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用してＣＤ２０を検出することを特徴とするＣＤ２０の検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＣＤ２０の検出方法であって、
前記検出する方法が、免疫組織化学染色法であることを特徴とするＣＤ２０の検出方法。
【請求項６】
請求項４に記載のＣＤ２０の検出方法であって、
前記検出する方法が、ウエスタンブロッティング法であることを特徴とするＣＤ２０の検出方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫およびＢ細胞性白血病の診断を行うことを特徴とする診断方法。
【請求項１】
ＣＤ２０のＮ末端細胞質内領域を認識することを特徴とするＣＤ２０認識モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体であって、
前記Ｎ末端細胞質内領域におけるアミノ酸配列２３番目から３６番目のアミノ酸残基を含むエピトープを認識することを特徴とするＣＤ２０認識モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用してＣＤ２０を検出することを特徴とするＣＤ２０の検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載のＣＤ２０の検出方法であって、
前記検出する方法が、免疫組織化学染色法であることを特徴とするＣＤ２０の検出方法。
【請求項６】
請求項４に記載のＣＤ２０の検出方法であって、
前記検出する方法が、ウエスタンブロッティング法であることを特徴とするＣＤ２０の検出方法。
【請求項７】
請求項１または２に記載のＣＤ２０認識モノクローナル抗体を用いる抗原抗体反応を利用して、ＣＤ２０陽性のＢ細胞性リンパ腫およびＢ細胞性白血病の診断を行うことを特徴とする診断方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１２１８１９（Ｐ２０１２−１２１８１９Ａ）
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７１６９９（Ｐ２０１０−２７１６９９）
【出願日】平成２２年１２月６日（２０１０．１２．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）発明を掲載したホームページのＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１０／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ２９８１６．ｈｔｍｌ （２）発明の掲載日 平成２２年１１月 ８日 （３）発表者名 三嶋 雄二、照井 康仁、三嶋 裕子、畠 清彦 （４）発表の内容 「５２ｎｄ ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ」講演予稿集 「Ａｎｔｉ−Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ ＣＤ２０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｌ２６ Ｄｕａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ａｎ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍｕｔａｎｔ Ｇｅｎｅｓ（抗Ｎ末端ＣＤ２０モノクローナル抗体及びＬ２６の併用による不可逆的な耐性変異遺伝子の染色による検出）」
【出願人】（０００１７３５８８）公益財団法人がん研究会 (34)
【出願人】（３９００２９７９１）日立アロカメディカル株式会社 (899)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年６月２８日（２０１２．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月６日（２０１０．１２．６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り （１）発明を掲載したホームページのＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１０／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ２９８１６．ｈｔｍｌ （２）発明の掲載日 平成２２年１１月 ８日 （３）発表者名 三嶋 雄二、照井 康仁、三嶋 裕子、畠 清彦 （４）発表の内容 「５２ｎｄ ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ」講演予稿集 「Ａｎｔｉ−Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ ＣＤ２０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｌ２６ Ｄｕａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ａｎ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｍｕｔａｎｔ Ｇｅｎｅｓ（抗Ｎ末端ＣＤ２０モノクローナル抗体及びＬ２６の併用による不可逆的な耐性変異遺伝子の染色による検出）」
【出願人】（０００１７３５８８）公益財団法人がん研究会 (34)
【出願人】（３９００２９７９１）日立アロカメディカル株式会社 (899)
【Ｆターム（参考）】
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