ＣＤ４０抗体製剤および方法
【課題】ＣＤ４０アゴニスト抗体を患者に投与することを含む、患者における腫瘍の治療方法および非経口投与に適した安定な液体医薬製剤の提供。
【解決手段】ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそれらのフラグメントを、少なくとも２サイクルの断続的な投与計画に従って投与する。該サイクルはそれぞれ、（ａ）投与期間（この間に、前記患者に前記ＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量が投与される）、および、それに続く（ｂ）休止期間、を含む。一実施態様において、上記投与は、少なくとも３時間にわたり抗体の血漿濃度０.０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌを生産し、上記休止期間は、少なくとも１週間である。該製剤は、抗ＣＤ４０抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む。
【解決手段】ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそれらのフラグメントを、少なくとも２サイクルの断続的な投与計画に従って投与する。該サイクルはそれぞれ、（ａ）投与期間（この間に、前記患者に前記ＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量が投与される）、および、それに続く（ｂ）休止期間、を含む。一実施態様において、上記投与は、少なくとも３時間にわたり抗体の血漿濃度０.０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌを生産し、上記休止期間は、少なくとも１週間である。該製剤は、抗ＣＤ４０抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの構成要素である。これは、抗原提示細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、単球）、造血細胞前駆体、内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞で発現され、同様に、ほとんどのヒト腫瘍でも発現される。（ＧｒｅｗａｌおよびＦｌａｖｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６：１１１〜３５；ＴｏｅｓおよびＳｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１０（６）：４４３〜８）。ＣＤ４０アゴニスト剤を用いた研究によれば、ＣＤ４０受容体の刺激は、抗腫瘍活性に関連する作用のカスケードを惹起することを報告している。例えば、抗原提示細胞におけるＣＤ４０受容体の刺激は、それらの成熟、抗原提示機能、副刺激の可能性、および、それらの免疫調節サイトカインの放出を増強することが示されている（Ｌｅｅ等，ＰＮＡＳ
ＵＳＡ，１９９９，９６（４）：１４２１〜６；Ｃｅｌｌａ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９６；１８４（２）：７４７〜５２）。また、ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０＋腫瘍のアポトーシスを促進し、それらの樹状細胞によってプロセシングされる能力を増強することも報告されている（ｖｏｎ
Ｌｅｏｐｒｅｃｈｔｉｎｇ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９９，５９：１２８７〜９４；Ｓｏｔｏｍａｙｏ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９９，５（７）：７８０〜８７；Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，２０００，２９（１５）：５５０３〜１５；Ｚｉｅｂｏｌｄ等，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｉａｅ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ，２０００，４８（４）：２２５〜３３；Ｈｏｆｆｍａｎｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，２４（２）：１６２〜７１）。これらの免疫刺激の重要性と直接的な抗腫瘍作用は、動物モデルで説明されており、それによれば、ＣＤ４０アゴニスト抗体は、腫瘍成長を阻害し、腫瘍の耐性をリバースさせることが示されている（Ｄｉｅｈｌ等，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．，１９９９，５（７）：７７４〜９；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，２０００，６０（１２）：３２２２５〜３１）。ＣＤ４０抗体は、以下の特許公報で言及されている：Ｕ．Ｓ．５,７８６,４５６；Ｕ．Ｓ．５,６７４,４９２；ＷＯ０２／０８８１８６；ＵＳ２００３０５９４２７；ＵＳ２００２０１４２３５８；ＷＯ０１／５６６０３；Ｕ．Ｓ．５,８０１,２２７；ＥＰ８０６９６３；ＷＯ８８／０６８９１；および、ＷＯ９４／０４５７０。しかしながら、ＣＤ４０抗体に関する高度に有効な投与方法および製剤は説明されていない。また、このような治療に使用するのに適した安定な製剤も有用と思われる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそれらのフラグメントを前記患者に投与することを含む、ガン治療が必要な患者におけるガンの治療方法に関する、前記抗体は、少なくとも２サイクルの断続的な投与計画に従って投与され、該サイクルはそれぞれ、（ａ）投与期間（この間に、前記患者に前記ＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量が投与される）、および、それに続く（ｂ）休止期間、を含む。一実施態様において、上記投与は、少なくとも３時間にわたり抗体の血漿濃度０.０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌを生産し、上記休止期間は、少なくとも１週間である。その他の実施態様において、上記投与期間は、少なくとも１日、１〜５日間、または、１〜３日間である。その他の実施態様において、上記休止期間は、１〜８、１〜６週間、２〜５週間、または、３〜４週間である。
【０００３】
特定の実施態様において、ＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量は、３〜１２０時間にわたり、前記抗体の血漿濃度約０.０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、約０.０３μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、約０.０３μｇ／ｍｌ〜０.３μｇ／ｍｌ、または、約０.１μｇ／ｍｌ〜０.３μｇ／ｍｌを生産する。いくつかの実施態様において、このような特定の血漿濃度が、少なくとも１日、２４〜３０時間、２４〜３６時間、２４〜４８時間、２４〜７２時間、２４〜９６時間、または、２４〜１２０時間維持される。いくつかの実施態様において、上記血漿濃度は、３〜９６時間、または、１２〜７２時間維持される。
【０００４】
特定の実施態様において、投与期間中に投与されるＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量は、約０.０３〜３.０ｍｇ／ｋｇ／日、０.１〜３.０ｍｇ／ｋｇ／日、０.１〜１.０ｍｇ／ｋｇ／日、または、約０.１〜０.３ｍｇ／ｋｇ／日である。一実施態様において、上記用量は、１〜５日間、または、１〜３日間、連続的に、または、１日おきのいずれかで投与される。
【０００５】
また、腫瘍の治療に関して上述したように、ＣＤ４０アゴニスト抗体の断続的な投与計画も患者の免疫反応を増強することにおいて有用であるため、本発明はこのような使用も提供する。特定の実施態様において、患者の免疫反応を増強することにより、患者の全血中のＢ細胞におけるＣＤ２３またはＭＨＣ−ＩＩ発現の増加（これは、例えば投与期間の終了時に測定してもよい）が起こる。
【０００６】
いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、原発性および／または複合免疫不全に罹った患者、例えば、高ＩｇＭ症候群を伴うＣＤ４０依存性免疫不全、分類不能型免疫不全、ブルトン型無γグロブリン血症、ＩｇＧサブクラス欠損症、および、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ（共通ガンマ鎖の突然変異）に罹った患者に投与される。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、免疫抑制された（例えば化学療法により）患者、または、免疫を衰弱させる疾患（例えば、ＨＩＶのようなあらゆる後天性免疫不全疾患）を有する患者を治療するために投与される。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、高齢の患者の免疫性を増強するために投与される。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫感染を有する患者を治療するために投与される。いくつかの実施態様において、ヒトのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、年齢、病気または全身的に悪い健康状態のために感染を起こしやすい患者に、感染を予防する、または感染数または重症度を低減させるために、予防的に投与してもよい。
【０００７】
本発明はまた、ＣＤ４０アゴニスト抗体、および、ＤＮＡ複製阻害剤、好ましくはプラチン（ｐｌａｔｉｎ）誘導体、特にシスプラチンを投与することを含む、患者における腫瘍の治療方法を提供する。特定の実施態様において、シスプラチンは、静脈内投与される。いくつかの実施態様において、シスプラチンは、患者の体表面領域の約２５〜３００ｍｇ／ｍ2、約５０〜１５０ｍｇ／ｍ2、または、約７５〜１００ｍｇ／ｍ2の量で投与される。一実施態様において、シスプラチンは、一回用量（例えば、一回の静脈内注入）で投与される。その他の実施態様において、これは、２〜５日間にわたり投与される。特定の実施態様において、シスプラチンと併用して投与されるＣＤ４０抗体の量は、約０.１〜３.０ｍｇ／ｋｇ、または、約０.１〜１.０ｍｇ／ｋｇ、または、約０.１〜０.３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０００８】
その他の形態において、シスプラチンの投与は、ＣＤ４０抗体の断続的な投与計画と併用され、ここにおいて、シスプラチンは、１回またはそれ以上の投与期間または休止期間の間に投与される。
【０００９】
その他の形態において、本発明は、腫瘍の治療が必要な患者に、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそれらのフラグメントを１ｍｇ／ｋｇ／日未満の用量で投与することによって、腫瘍の治療が必要な患者における腫瘍の治療方法に関し、ここにおいて、上記抗体の投与によって生じた患者のＣmax血清濃度は、５０μｇ／ｍｌ未満である。一実施態様において、上記用量は、０.１〜０.３ｍｇ／ｋｇであり、患者における上記抗体のＣmax血清濃度は、０.５〜１０μｇ／ｍｌである。
【００１０】
その他の形態において、本発明は、ｐＨ５.０〜６.０の抗ＣＤ４０抗体と、製薬上許容できるキャリアーとを含む、非経口投与に適した安定な液体医薬製剤に関し、本製剤は、少なくとも３ヶ月の期間安定である。本製剤のＣＤ４０抗体の濃度は、好ましくは、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌである。一実施態様において、本製剤は、抗ＣＤ４０抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む。好ましくは、本製剤は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、および、０.２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０を含む。抗ＣＤ４０抗体は、好ましくは、抗体２１．４．１、または、３．１．１からなる群より選択される抗体のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、免疫細胞の存在下のＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（−）腫瘍Ｋ５６２の成長の阻害を示す。動物は、腫瘍の攻撃時間に、２１．４．１またはＫＬＨの１回の注射（ＩＰ）を受けた。腫瘍の大きさは、それぞれ個々の動物について、２１日目にｍｍ2で報告されている（１０動物／グループ）。この研究は、少なくとも５回の別々の研究を代表するものである。
【００１２】
図２は、ＣＤ４０アゴニスト抗体によるヒト乳房腫瘍細胞系ＢＴ４７４の成長の阻害を示す。この値は、６匹の動物／グループを用いて、注射後５３日目に行われた個々の腫瘍測定を示す。この研究は、２回の別々の実験を代表するものである。各治療グループの平均は、水平線で示される。
【００１３】
図３は、単独または免疫細胞の存在下での、ＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（＋）腫瘍成長の阻害を示す。動物は、腫瘍の攻撃時間に、２１．４．１の１回の注射を受けた。腫瘍を、（ａ）単独で、または、（ｂ）ヒト末梢血液Ｔ細胞およびＤＣと共に注射した。このデータポイントは、それぞれ個々の動物における腫瘍の大きさ（ｍｍ2）を示す。各治療グループの平均（Ｎ＝１０）は、水平線で示される。この研究は、少なくとも３回の別々の実験を代表するものである。
【００１４】
図４は、ＣＤ４０アゴニスト抗体の、Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）により誘発された死亡率を遅らせる作用を示す。このデータポイントは、生存した動物の平均数を意味する（Ｎ＝１０／グループ）。
【００１５】
図５は、ＣＤ４０アゴニスト抗体とシスプラチンとの併用療法によって生じる腫瘍の縮小を示す。
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
用語「アゴニストＣＤ４０抗体」または「アゴニスト抗ＣＤ４０抗体」は、本明細書で用いられる場合、ヒトＣＤ４０分子に特異的に結合する抗体であって、さらに、ＣＤ４０を発現する細胞、組織または生物に添加された場合、１種またはそれ以上のＣＤ４０活性を少なくとも約２０％増加させるものを意味する。いくつかの実施態様において、このような抗体は、ＣＤ４０活性を、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または、８５％活性化する。いくつかの実施態様において、このような活性化は、ＣＤ４０Ｌの存在下で生じる。いくつかの実施態様において、活性化している抗体の活性は、全血の表面分子のアップレギュレーション分析を用いて測定される。その他の実施態様において、活性化している抗体の活性は、ＩＬ−１２放出を測定するための樹状細胞分析を用いて測定される。その他の実施態様において、活性化している抗体の活性は、インビボでの腫瘍モデルを用いて測定される。
【００１７】
用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、無傷の抗体、または、無傷の抗体と特異的な結合で競合するそれらの結合フラグメントを意味する。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または、無傷の抗体の酵素的または化学的な切断によって生産される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、および、単鎖抗体が挙げられる。本明細書において無傷の（例えば、全体、全長など）抗体という場合、重鎖で末端のリシンが欠失（組換え発現の際に一般的に発生する）した抗体を含むものと理解される。
【００１８】
好ましくは、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いられる場合、可変および定常ドメイン配列がヒト配列から誘導されている抗体を意味する。ヒトＣＤ４０抗体は、２００１年１１月９日付けで出願された米国仮出願番号６０／３４８,９８０、および、２００２年１１月８日付けで出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３６１０７（現在、ＷＯ０３／０４０１７０として公開）で詳細に説明されており、これらの全開示は、参照により本発明に含める。ヒト抗体は、ヒト患者における非ヒト抗体の使用に付随する免疫原性およびアレルギー性応答を最小化できると予想されるため、本発明の治療方法に実質的な利点を提供する。
【００１９】
本発明に有用な典型的なヒト抗ＣＤ４０抗体としては、３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａと称される抗体、同様に、典型的な抗体のいずれかのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のアミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。
【００２０】
また、上記典型的な抗体のいずれかと同一または類似のエピトープを認識する抗体またはそれらの一部も、本発明に有用であり得る。すなわち、当業者には本明細書で示される開示に基づき理解できると思われるが、本発明の抗体と競合する抗体（例えば、３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａなど）は、本明細書の他所で開示されているように、有用であり得る。本明細書で例示された抗体と競合する対象の抗体は、抗体を特徴付けるための当業界周知の方法を用いて容易に同定することができる。より特定には、抗体の結合の特徴を評価するための分析、同様に、それらの結合の特徴と、その他の抗体の結合の特徴とを比較するための分析は当業界周知である。このような方法
としては、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡに基づく分析、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）結合研究の使用、同様に、Ｗａｌｋｅｒ等のＵＳ特許出願公報番号２００３／０１５７７３０Ａ１で詳述されている方法が挙げられる。
【００２１】
用語「競合する」は、本明細書において抗体に関して用いられる場合、第一の抗体と第二の抗体とが結合において競合しており、ここにおいて、第一の抗体とその同源のエピトープとの結合は、第二の抗体の非存在下における第一の抗体の結合と比較して、第二の抗体の存在下で検出可能に減少することを意味する。しかしながら、第二の抗体のそのエピトープへの結合もまた、第一の抗体の存在下で検出可能に減少するような別の場合は、必ずしも当てはまらない。すなわち、第一の抗体は、第二の抗体が第一の抗体のそれらそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第二の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が、その他の抗体とその同源のエピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、その阻害が同程度なのか、より大きい程度なのか、または、より小さい程度なのかにかかわらず、その抗体は、それらそれぞれのエピトープの結合に関して互いに「交差競合する」と称される。例えば、交差競合する抗体は、本発明の抗体（例えば、３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａ）が結合するエピトープまたはそのエピトープの一部に、結合することができる。競合する抗体と、交差競合する抗体はいずれも、本発明に包含される。このような競合または交差競合が発生するメカニズム（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、または、共通エピトープまたはそれらの一部への結合、など）に関係なく、当業者には当然であるが、本明細書で示される教示に基づき、このような競合および／または交差競合する抗体が包含され、本明細書で開示された方法に有用であることができる。
【００２２】
加えて、上記典型的な抗体は、抗体が抗原に結合する能力を損なうことなく、１個またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、付加または欠失によってさらに修飾され、そのアゴニスト機能を作用させてもよい。実際に、「３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ」と称される抗体は、重鎖可変領域に３つのアミノ酸置換を含み、すなわち、アミノ酸残基番号７８におけるアラニンからスレオニンへの置換、アミノ酸残基番号８８におけるバリンからアラニンへの置換、および、アミノ酸残基番号９７におけるバリンからアラニンへの置換（配列番号９）であり、これらは全て、抗体３．１．１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）に対応している。加えて、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体は、抗体３．１．１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）と比較して、軽鎖可変領域（配列番号１０）において、アミノ酸残基番号４におけるロイシンからメチオニンへのアミノ酸置換、および、アミノ酸残基番号８３におけるロイシンからバリンへの置換をさらに含む。３．１．１、および、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体の重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号４）の定常領域のアミノ酸配列は、同一である。また、抗体３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖは、「３．１．１Ｈ３Ｌ２」とも称され、これは、この抗体は、抗体３．１．１に比べて重鎖に３つのアミノ酸置換を含み、軽鎖に２つのアミノ酸置換を含む、ということを反映している。
【００２３】
従って、いくつかの実施態様において、上記典型的な抗体は、例えばＣＤＲまたはフレームワーク領域において、１〜１０個、１〜５個、または、１〜３個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失によって修飾されていてもよい。これらの典型的な抗体、および、それらを生産する方法は、２００１年１１月９日付けで出願された米国仮出願番号６０／３４８,９８０、および、２００２年１１月８日付けで出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３６１０７（ＷＯ０３／０４０１７０）で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は、これらのアミノ酸置換、またはその他のあらゆるアミノ酸置換に限定されない。むしろ、当業者であれば、本明細書で示された教示をもとに多種多様のアミノ酸置換が本発明に包含され得ることが理解されるだろう。
【００２４】
ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ３．１．１、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、および、２１．４．１を、２００１年８月６日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ；１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，マナサス，バージニア州２０１１０−２２０９）に寄託した。ハイブリドーマ２１．２．１、２２．１．１、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２９．１、および、２４．２．１を、２００２年７月１６日にＡＴＣＣに寄託した。これらのハイブリドーマには、以下の寄託番号が付与された：
【００２５】
【表１】
【００２６】
これらの抗体の配列は既知であり、ＷＯ０３／０４０１７０に記載されている。便宜上、これらの抗体のうち２種の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、以下に示す：
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
従って、２１．４．１抗体のアミノ酸配列は、配列番号５〜８に記載のアミノ酸配列を含み、３．１．１抗体のアミノ酸配列は、配列番号１〜４に記載のアミノ酸配列を含み、および、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体のアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号２、配列番号１０、および、配列番号４に記載の配列を含む。３．１．１と、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖとの間で異なるアミノ酸は、下線で示した。
【００３０】
当然ながら、本明細書で示される開示に基づき、本発明の３．１．１抗体は、本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖可変領域のあらゆる組み合わせを包含する。すなわち、抗体は、可変領域のあらゆる組み合わせを含んでいてもよく、このような組合せとしては、これらに限定されないが、３．１．１Ｈ（配列番号１）／３．１．１Ｌ（配列番号３）、３．１．１Ｈ（配列番号１）／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ（配列番号１０）、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ（配列番号９）／３．１．１Ｌ（配列番号３）が挙げられ、より好ましくは、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ（配列番号９）／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ（配列番号１０）である。しかしながら、本発明は、これらの、またはその他のあらゆる特定の組み合わせに少しも限定されることはない。
【００３１】
特定の実施態様において、腫瘍の治療とは、ガン細胞の増殖を阻害する、腫瘍の質量または体積の増加を阻害または予防する、および、／または、腫瘍の質量または体積の減少を起こすことである。いくつかの実施態様において、腫瘍の治療は、患者の寿命を延長させる。特定の実施態様において、腫瘍成長は、治療されていない場合と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害される。いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＣＤ４０陽性である。いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＣＤ４０陰性である。腫瘍は、充実性腫瘍でもよいし、または、リンパ腫のような非充実性腫瘍でもよい。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体が、癌性の腫瘍を有する患者に投与される。
【００３２】
抗ＣＤ４０抗体または抗体の一部で治療できる患者としては、これらに限定されないが、脳ガン、肺ガン、骨ガン、膵臓ガン、皮膚ガン、頭部および頚部のガン、皮膚または眼内黒色腫、子宮ガン、卵巣ガン、直腸ガン、肛門領域の癌、胃ガン（ｓｔｏｍａｃｈ
ｃａｎｃｅｒ，ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸ガン、結腸ガン、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚の癌腫、膣の癌腫、または、陰門の癌腫）、食道ガン、小腸ガン、内分泌系のガン（例えば、甲状腺ガン、副甲状腺ガンまたは副腎ガン）、軟部組織肉腫、白血病、骨髄腫、多発性骨髄腫、尿道ガン、陰茎ガン、前立腺ガン、慢性もしくは急性白血病、小児の充実性腫瘍、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、腎臓または尿道ガン（例えば、腎細胞ガン、腎盂ガン）、または、中枢神経系の新生物（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹グリオーマもしくは下垂体腺腫）、神経膠腫、または、線維肉腫を有すると診断された患者が挙げられる。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、用語「患者」は、交叉反応するＣＤ４０を発現するヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、霊長類、カニクイザルまたはアカゲザル）を意味する。好ましくは治療される患者はヒトである。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、用語「断続的な投与計画」は、ＣＤ４０アゴニスト抗体を投与すること、それに続く休止期間を含む投与計画を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「休止期間」は、患者にＣＤ４０アゴニスト抗体が投与されない期間を意味する。例えば、抗体が毎日投与されている場合、毎日の投与が、例えば数日間または数週間中止されれば、それは休止期間といえる。用量が様々なスケジュールで投与される場合、しばらくの間投与が中止されるような休止期間も考えられる。あるいは、抗体の濃度が治療レベルより低く維持されるような休止期間もあり得る。
【００３６】
一実施態様において、上記抗体は、第二の休止期間の後に投与されない、すなわち、本発明の方法が２サイクルを含む場合、第二の休止サイクルの後、薬物は、投与しなくてもよい。
【００３７】
好ましくは、休止期間の間、上記抗体の血漿濃度は、治療レベルより低く維持される。
【００３８】
上記抗体の投与期間および／または用量は、サイクル間で同一でも異なっていてもよい。
【００３９】
総治療時間（すなわち、治療のためのサイクルの数）は、患者それぞれに応じて、確実な医療的判断と治療される患者に特有の要因に基づき様々であると予想される。一般的に、このような治療は、十分な応答が得られるまで施される。本発明の特定の実施態様において、治療期間は、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜７、２〜５サイクル、または、２〜３サイクルを含む。
【００４０】
上記抗体は、あらゆる望ましい手段によって投与することができ、このような手段としては、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、腫瘍内、および、経皮投与が挙げられる。一実施態様において、ＣＤ４０抗体は、静脈内投与される。あるいは、ＣＤ４０抗体は、微細針装置を用いて投与される；このような
装置は周知であり、例えば、ＷＯ０３／０８４５９８で説明されている装置が挙げられる。
【００４１】
ＤＮＡ複製阻害剤（例えばシスプラチン）と組み合わせて投与される場合、上記抗体は、このような阻害剤の投与の前に、その最中に、または、その後に投与されてもよい。
【００４２】
一形態において、本発明は、ｐＨが約５.０〜６.０、好ましくはｐＨが約５.５の、静脈注射のための水溶液に関する。このような溶液は、酢酸ナトリウム（三水和物）、酢酸（氷酢酸）、ポリソルベート８０、塩化ナトリウムおよび水と共に製剤化されてもよい。好ましくは、上記抗体溶液を冷蔵温度２℃〜８℃で保存し、凍結させないことである。
【００４３】
本発明によれば、腫瘍の治療が必要な患者において腫瘍を治療する方法も提供され、本方法は、前記患者に、治療上有効な量のＣＤ４０アゴニスト抗体と、治療上有効な量のＤＮＡ複製阻害剤（例えばプラチン誘導体）との組み合わせを投与することを含む。特定の実施態様において、組み合わせの抗腫瘍作用がそれぞれの化合物の単独投与から予測される作用より大きくなるように、ＣＤ４０アゴニスト抗体と、プラチン誘導体化合物（特にシスプラチン）とを、相乗的に組み合わせて作用させる。
【００４４】
プラチン誘導体は、ＤＮＡ複製を妨害することによって抗腫瘍活性を示すことが周知の化合物群である。特定の実施態様において、プラチン誘導体は、シスプラチン（シスジアミンジクロロプラチナム、メルクインデックス（Ｍｅｒｃｋ
Ｉｎｄｅｘ）を参照）、カルボプラチン、および、オキサリプラチンからなる群より選択される。
【００４５】
以下の実施例を参照することによって、本発明をさらによく理解できると思われる。しかしながら、これら実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。全ての文献の参照は、参照により開示に含まれる。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ガン患者からのリンパ節細胞に対する抗体の作用
自己腫瘍細胞で刺激されたガン患者から得られたリンパ節細胞に対するヒト抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の作用を試験した。
腎細胞ガン、非小細胞肺癌、膀胱の移行細胞癌、結腸ガン、前立腺ガン、および、頭部および頚部のガンを有する患者から、リンパ節細胞と腫瘍を採取した。そのリンパ節細胞を、２１．４．１（１μｇ／ｍＬ；６.７ｎＭ）の存在または非存在下で、放射線照射したコラゲナーゼ処理腫瘍（上記の同じ患者より採取）と共に培養下に置いた。９６時間後に、増殖を3Ｈ−チミジンを用いて評価した。ＩＮＦγ生産細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴ、その後の再刺激で評価した。
腫瘍抗原で刺激されたリンパ節細胞の培養において、上記抗体は、ＩＦＮγ＋陽性Ｔ細胞の数を高めた。さらに、これらのリンパ節細胞の腫瘍抗原に応答した増殖は３〜４倍に高められた。
腫瘍抗原で刺激されると、上記抗体は、ガン患者から得られたリンパ節細胞の増殖とサイトカイン生産能を高めた。
【００４７】
実施例２：抗体のＦｃ受容体への結合
抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の、ヒトおよびカニクイザルの白血球におけるＦｃ受容体への結合を試験した。
フローサイトメトリー研究によれば、ヒト白血球で、ＦｃＲタイプのＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、および、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、同様に、極めて低いレベルのＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）が発現されたことが示された。２１．４．１の、ヒトまたはカニクイザルの末梢血液の白血球におけるＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を、125Ｉ−２１．４．１と、ヒトＩｇＧ１コントロールｍＡｂを用いることによって決定した。正常なドナーからのヒト白血球またはカニクイザルの白血球を、血漿ゲルを用いて全血から単離し、徹底的に洗浄し、受容体に結合した血清免疫グロブリンを解離させた。スクロースの緩衝材を通過させた遠心分離を用いて、細胞に結合した抗体と、遊離の抗体とを分離した。研究は、受容体の内在化を予防するために、アジ化ナトリウムの存在下で４℃で行われた。
２１．４．１を、ＦｃＲへの特異的結合に関して、競合物質として、抗体と競合する過量の非標識ヒトＩｇＧ２アイソタイプを用いることによって試験した。ヒト白血球におけるＦｃＲへの125Ｉ−２１．４．１の特異的結合（ｎ＝５ドナー）は、−１.０±８.５％であり、カニクイザルの白血球におけるＦｃＲへの特異的結合（ｎ＝４）は、１５±１３％であった。125Ｉ−２１．４．１の白血球のＣＤ４０受容体、同様にＦｃＲへのあらゆる特異的な結合をブロックし得る非標識２１．４．１を５００倍過量で添加することによって、ヒトおよびカニクイザルの白血球における125Ｉ−２１．４．１のＣＤ４０受容体への特異的な結合は、それぞれ４９％および６７％であることが示された（ＣＤ４０への特異的結合の％は、全ての特異的な結合の％からＦｃＲへの結合の％を引くことによって計算された）。コントロールとして、125Ｉ−ＩｇＧ１は、ヒトおよびカニクイザルの白血球への特異的結合を矛盾なく実証している。ヒトおよびカニクイザルの白血球におけるＩｇＧ１コントロール抗体のＦｃＲへの特異的な結合は、全ての結合した放射活性のそれぞれ５６％および５１％を占めた。
これらの研究により、上記抗体は、ヒトおよびカニクイザルの白血球においてＦｃ受容体へ特異的結合が最小であることが示される。
【００４８】
実施例３：全血のサイトカイン放出分析
ヒトにおける抗体が介在するサイトカイン放出の誘導と相関するインビトロでの全血分析を用いて、抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）を、それらの刺激されていないヒト全血からのサイトカインの放出を誘導する能力に関して試験した。２１．４．１を、１、１０および１００μｇ／ｍＬで、ポジティブコントロールとして、Ｆｃ介在経路を介してサイトカイン放出を誘導するマウスの抗ヒトＣＤ３ＩｇＧ１、および、第二のポジティブコントロールとしてマクロファージを刺激することによってサイトカインを誘導するＬＰＳと共に用いて試験した。用いられたドナーには、マウス抗体とＬＰＳの両方に応答した個体（４ドナー）、同様に、ＬＰＳのみに応答した個体（３ドナー）が含まれる。ヘパリン化された全血を、２１．４．１と５時間培養し、血漿を回収し、ＥＬＩＳＡによって（市販のキットを使用）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）に関して解析した。また、培養物を、４８時間インキュベートし、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−β）に関しても解析した。
１または１０μｇ／ｍＬの２１．４．１と培養されたヒト血液の血漿においてサイトカインは検出されなかった。１００μｇ／ｍＬの上記抗体で処理された１つのドナーのみが、低いが測定可能なレベルの２種のサイトカイン（３４ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、および、９０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６）を示した。その後、このドナーを再試験したところ、検出可能なＴＮＦ−αまたはＩＬ−６の誘導は示されなかった。いずれのサンプルにおいてもＩＮＦγまたはＩＬ−１βの上昇はみられなかった。
これらの研究によれば、２１．４．１は、ヒト全血において炎症性サイトカインを誘導しないことが示される。
【００４９】
実施例４：抗体の薬力学および薬物動態学
ＣＤ４０抗体（２１．４．１）を、様々な用量（１ｍｇ／ｋｇ
ｎ＝４、３ｍｇ／ｋｇ ｎ＝４、５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝２、および、１０ｍｇ／ｋｇ
ｎ＝２）でカニクイザルに静脈内投与した。これらのサルから、投与前後の様々なタイムポイントでヘパリン化された血液を採取した。この血液をアリコートにし、染色した。ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いてデータを得て、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェアで解析した。結果を、中央値の蛍光強度の投与前の値と比較した増加の倍数として計算した。
Ｂ細胞の活性化状態と抗原提示能を反映するＭＨＣクラスＩＩ発現が、投与してから２４時間までに、試験された全ての用量に関して、２.５〜３倍増加したが、明確な用量応答関係は観察されなかった。ＣＤ２３発現、その他のＢ細胞活性化のマーカーについて、動物２匹を３ｍｇ／ｋｇで、動物１匹を１０ｍｇ／ｋｇで評価した。ＣＤ２３発現が、投与後２４時間で、≧２０倍に増加したが、用量の作用は観察されなかった。両方の表面マーカーのアップレギュレーションは持続したが（≧２倍の増加）、２１．４．１レベルは１μｇ／ｍｌを超えたままだった。また、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）とＣＤ８６の副刺激分子のレベルも、中程度のアップレギュレーションを示したが、一方で、ＣＤ８０発現はそれほど変化しなかった。
インビボのカニクイザルのＢ細胞において、２１．４．１は、表面マーカーをアップレギュレートした。ＣＤ２０＋細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ、および、ＣＤ２３発現は、処理によって増加し、１ｍｇ／ｋｇ（４日間で、〜２０μｇ／ｍＬのＣmax、および、≧０.１μｇ／ｍＬの接触に相当する）が、カニクイザルのＢ細胞において飽和した薬力学反応を生産するようである。この反応の持続時間は、より高い用量ではより長かった。
カニクイザルにおける、１、３、５または１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）投与の後の抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の薬物動態学的特性を試験した。２１．４．１は、低い全身クリアランス（０.０１３３〜０.０６３５ｍＬ／分／ｋｇ）、および、定常状態における少ない分配量（０.０４５９〜０.０７５７Ｌ／ｋｇ）であり、見かけの平均除去半減期が０.７５〜２.０日間（表１）になったことが特徴的であった。２１．４．１の薬物動態学は、試験された用量範囲にわたり用量依存性のようであった。クリアランス値は、概して、用量を１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに高めると減少し、見かけの平均除去半減期は、１ｍｇ／ｋｇで０.７５日間から、１０ｍｇ／ｋｇで２.０日間に増加した。定常状態における分配量は、様々な用量で類似していた（０.０５７５Ｌ／ｋｇの平均）。
【００５０】
観察された用量依存性クリアランスは、部分的には、２１．４．１の、正常な組織で広く発現されるＣＤ４０受容体への結合、それに続く内在化、および、抗体−受容体複合体の除去に起因している可能性がある。また、霊長類の抗ヒト抗体（ＰＡＨＡ）応答の開発も、数種のサルにおいて、クリアランスの促進に寄与する可能性がある。試験血清中に２１．４．１が存在するとＰＡＨＡ分析を妨害するため、それぞれの２１．４．１の血清濃度が定量の下限（ＬＬＯＱ，０.０３μｇ／ｍＬ）に達した後だけ、ＰＡＨＡを評価した。３、５および１０ｍｇ／ｋｇの用量のグループの全てのサルで、抗体投与後１４〜２８日目に抗２１．４．１抗体を検出した。
【００５１】
【表４】
【００５２】
実施例５：抗体の抗腫瘍活性
腫瘍細胞単独（１×１０7）、または、ヒトＤＣ（１×１０5）、および、同じドナーからのＴ細胞（５×１０5）を皮下注射されたＳＣＩＤ−ベージュマウスにおいて、ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の腫瘍成長の阻害活性を決定した。腫瘍細胞のＤＣおよびＴ細胞に対する比率は、１００：１：５であった。特に他の指定がない限り、結果は、コントロール動物における腫瘍成長が３００〜４００ｍｍ2の大きさに達し、実験を継続することがもはや人道的ではない時点であることが予め決定されている１つの固定タイムポイント（反応速度論実験より）における腫瘍の大きさ（ｍｍ2）に関して示される。全ての場合において、＞３０日間のＴ1/2を有する２１．４．１の注射を１回だけ、ＳＣＩＤ−ベージュマウスに投与した。
【００５３】
実施例５（ａ）：ＣＤ４０（−）ヒト腫瘍に対する抗体の作用
ＣＤ４０（−）腫瘍（例えば、赤白血病および結腸ガン）の成長に対するＣＤ４０抗体（２１．４．１）の作用を試験した。特に、ＣＤ４０（−）の低い免疫原性の（クラスＩおよびＩＩ陰性）腫瘍に対する２１．４．１の有効性を評価するのに、Ｋ５６２腫瘍を選択した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ＣＤ４０（−）赤白血病の腫瘍、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２４３）を、単独で、または、ヒト末梢血液Ｔ細胞およびＤＣの存在下で皮下注射した。腫瘍注射の時、または、５日間後のいずれかに、１回の２１．４．１のＩＰ注射を様々な用量レベルを用いて動物に与えた。
腫瘍の攻撃後の２１日目で示されるように（図１）、１回の２１．４．１のＩＰ注射により、免疫細胞が存在すると、Ｋ５６２腫瘍成長の用量依存性の阻害が生じた。腫瘍成長の５０％阻害を引き起こす２１．４．１の量は、０.００５ｍｇ／ｋｇ（Ｃmax血清濃度０.０５μｇ／ｍＬに相当する）であった。ＣＤ４０（−）結腸ガン、Ｌｏｖｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２９）でも同様の結果が観察された。腫瘍の攻撃から０日目または＋５日目に２１．４．１を投与したところ、結果は同一であった。これらのＣＤ４０（−）腫瘍の成長は、免疫細胞の非存在下だと、２１．４．１によって阻害されなかった。
２１．４．１は、免疫細胞が存在する場合、ＣＤ４０（−）腫瘍の成長を阻害するが、これは、免疫が介在する抗腫瘍活性の増強を示唆している。これは、結腸ガンと赤白血病の腫瘍に対して実証された。また、この抗腫瘍活性も、結腸ガンには抗体３．１．１、および、赤白血病の腫瘍には３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体（ＩＣ５０＜０.０１ｍｇ／ｋｇ）を用いて実証された。従って、本明細書で開示されたデータは、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体は、インビボで、３．１．１抗体活性を有することを実証する。これらのインビボでの腫瘍の結果は、２種の抗体を比較して得られた類似のインビトロでのデータを考慮すると、抗体３．１．１、および、抗体３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖは、インビボでも類似の様式で性能を示すだろうということを、さらに裏付けている。従って、３．１．１を用いて得られた結果は、この分析、および、その他の分析において、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖにも当てはまる。
【００５４】
実施例５（ｂ）：抗体のヒト乳房および前立腺腫瘍成長に対する作用
抗Ｄ４０抗体（２１．４．１）の乳房および前立腺腫瘍の成長阻害に対する作用を試験した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスの皮下を、ヒト乳房腫瘍、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ
ＨＴＢ−２０）をヒト末梢血液Ｔ細胞およびＤＣと共に用いて攻撃した。腫瘍を注射した時に、動物は、２１．４．１の単回投与（ＩＰ）を受けた。
図２で示されるように、２１．４．１の１回の注射は、免疫細胞の存在下でＢＴ４７４細胞の成長を阻害した。腫瘍成長を５０％減少を起こすのに必要な２１．４．１の量は、０.００５ｍｇ／ｋｇ（Ｃmax血清濃度０.０５μｇ／ｍＬに相当する）であった。ヒト前立腺ガン細胞系、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）に対しても、同様の結果が観察された。これもまた、抗体３．１．１を用いて実証され、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖについても予想可能である。
２１．４．１は、ヒト乳房、および、前立腺腫瘍の成長を阻害する。
【００５５】
実施例５（ｃ）：ＣＤ４０（＋）腫瘍に対する抗体の抗腫瘍作用
抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）のＣＤ４０（＋）腫瘍に対する抗腫瘍活性への作用、および、免疫細胞の存在および非存在下における有効性の変化を研究した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ＣＤ４０（＋）Ｒａｊｉ
Ｂ細胞リンパ腫（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）（ＳＣ）を皮下注射し、それに続いて、腫瘍の注射の時に２１．４．１の単回投与を与えた（ＩＰ）。また、数匹の動物には、ヒトＴ細胞およびＤＣも注射した。２１日目に腫瘍成長を評価した。
図３で示されるように、免疫細胞の非存在下で腫瘍成長の５０％阻害を引き起こす２１．４．１の量は、０.０２ｍｇ／ｋｇ（Ｃmax血清濃度０.２μｇ／ｍＬに相当する）であった。腫瘍細胞が免疫細胞と共に注射された場合、腫瘍成長の５０％阻害を起こすのに必要な２１．４．１の量は、２０分の１の０.００１ｍｇ／ｋｇに減少した（Ｃmax血清濃度＝０.０１μｇ／ｍＬ）。
これらの結果は、２１．４．１は、ＣＤ４０（＋）腫瘍に対して直接的な抗腫瘍活性を有することを説明している。また、この観察は、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ（ＩＣ５０＜０.０１ｍｇ／ｋｇ）にも当てはまる。この抗体２１．４．１に関する抗腫瘍活性は、免疫細胞が存在する場合に高められ、これもまた、抗体３．１．１でも実証され、抗体３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖについても予想される。
【００５６】
実施例５（ｄ）：Ｂ細胞リンパ腫に対する抗体の抗腫瘍作用
ＣＤ４０（＋）の全身性腫瘍モデルにおいて、Ｂ細胞リンパ腫を用いて、本発明に係る抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の死亡を遅らせる能力を評価した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２１３）を静脈内注射した。腫瘍の注射の時に、２１．４．１を１回の注射（ＩＰ）で投与した。死亡を５８日間モニターした。
図４で示されるように、２１．４．１の１回の注射によって、全身投与された腫瘍細胞系により誘導された死亡が阻害された。
Ｂ細胞リンパ腫を用いたＣＤ４０（＋）全身性腫瘍モデルにおいて、２１．４．１は死亡を遅らせる。これもまた、３．１．１を用いて実証され、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖについても類似の結果が予想される。
【００５７】
実施例６：抗体のシスプラチン併用の治療効果
ヒト乳房腫瘍の成長を阻害することにおける、抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の、単独、および、シスプラチンの存在下における治療効果を試験した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、乳房腫瘍、ＢＴ４７４を皮下注射した。腫瘍が２００ｍｍ2のサイズに達したら、上記抗体（１ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ）および／またはシスプラチン（２.５ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ）を１回の注射で投与した。攻撃の後の８４日目に、腫瘍成長を測定した。
図４で示されるように、２１．４．１またはシスプラチンの１回の注射は、腫瘍成長を阻害した。しかしながら、両方の処理を併用すると、８匹の動物のうち７匹において腫瘍の縮小が達成された。
２１．４．１は、腫瘍が定着した際に単独で投与された場合、腫瘍成長を阻害し、シスプラチンと組み合わせて投与された場合、腫瘍の縮小を引き起こす。これもまた、抗体３．１．１を用いて実証され、同様に、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖでも起こり得る。
【００５８】
実施例７：抗体の複数回用途の薬物動態学
複数回投与の研究において、カニクイザル（２／性別／用量）に、０．３、１．０および１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１、３、５、７および９日目（総投与回数５回）に２１．４．１を静脈内投与した。投与前の１日目と９日目に、および、投与後と投与前の０.５、６および２４時間目に、および、投与後５日目の０.５時間に血液を回収し、血清薬物濃度を測定した。２１．４．１への全身性の接触は、平均Ｃmax、および、平均ＡＵＣ(0-24)での評価の通り、１日目と９日目の両方において、用量が０.３から１０ｍｇ／ｋｇに増加するにつれて増加した（表２）。類似の接触（平均Ｃmax、および、平均ＡＵＣ）を、１日目と９日目に、０.３ｍｇ／ｋｇ、および、１ｍｇ／ｋｇの用量グループで観察した。１０ｍｇ／ｋｇの用量グループにおいて、平均Ｃmax、および、平均ＡＵＣ(0-24)値は、１日目から９日目でそれぞれ２.６倍および２.８倍に増加した。接触における性別に関連する差は観察されなかった。
【００５９】
【表５】
【００６０】
実施例８：抗体製剤
３０ｋＤａの分子量でカットオフするカセットを含む限外ろ過ユニットを用いて、ＣＤ４０抗体を約１１.０ｍｇ／ｍＬ±０.８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次に、この濃縮物を、ダイアフィルターでろ過して、２０ｍＭ酢酸ナトリウム／１４０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）にした。２％ポリソルベート８０溶液を、ダイアフィルターで濃縮した生成物に添加し、０.０２％ポリソルベート８０の最終濃度を達成した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】免疫細胞の存在下のＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（−）腫瘍Ｋ５６２の成長の阻害を示す。
【図２】ＣＤ４０アゴニスト抗体によるヒト乳房腫瘍細胞系ＢＴ４７４の成長の阻害を示す。
【図３】単独または免疫細胞の存在下での、ＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（＋）腫瘍成長の阻害を示す。
【図４】ＣＤ４０アゴニスト抗体の、Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）により誘発された死亡率を遅らせる作用を示す。
【図５】ＣＤ４０アゴニスト抗体とシスプラチンとの併用療法によって生じる腫瘍の縮小を示す。
【背景技術】
【０００１】
ＣＤ４０は、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーの構成要素である。これは、抗原提示細胞（Ｂ細胞、樹状細胞、単球）、造血細胞前駆体、内皮細胞、平滑筋細胞、上皮細胞で発現され、同様に、ほとんどのヒト腫瘍でも発現される。（ＧｒｅｗａｌおよびＦｌａｖｅｌｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１６：１１１〜３５；ＴｏｅｓおよびＳｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ
ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１０（６）：４４３〜８）。ＣＤ４０アゴニスト剤を用いた研究によれば、ＣＤ４０受容体の刺激は、抗腫瘍活性に関連する作用のカスケードを惹起することを報告している。例えば、抗原提示細胞におけるＣＤ４０受容体の刺激は、それらの成熟、抗原提示機能、副刺激の可能性、および、それらの免疫調節サイトカインの放出を増強することが示されている（Ｌｅｅ等，ＰＮＡＳ
ＵＳＡ，１９９９，９６（４）：１４２１〜６；Ｃｅｌｌａ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９６；１８４（２）：７４７〜５２）。また、ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０＋腫瘍のアポトーシスを促進し、それらの樹状細胞によってプロセシングされる能力を増強することも報告されている（ｖｏｎ
Ｌｅｏｐｒｅｃｈｔｉｎｇ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９９，５９：１２８７〜９４；Ｓｏｔｏｍａｙｏ等，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９９，５（７）：７８０〜８７；Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，２０００，２９（１５）：５５０３〜１５；Ｚｉｅｂｏｌｄ等，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｉａｅ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ，２０００，４８（４）：２２５〜３３；Ｈｏｆｆｍａｎｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，２４（２）：１６２〜７１）。これらの免疫刺激の重要性と直接的な抗腫瘍作用は、動物モデルで説明されており、それによれば、ＣＤ４０アゴニスト抗体は、腫瘍成長を阻害し、腫瘍の耐性をリバースさせることが示されている（Ｄｉｅｈｌ等，Ｎａｔｕｒｅ
Ｍｅｄ．，１９９９，５（７）：７７４〜９；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ等，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．，２０００，６０（１２）：３２２２５〜３１）。ＣＤ４０抗体は、以下の特許公報で言及されている：Ｕ．Ｓ．５,７８６,４５６；Ｕ．Ｓ．５,６７４,４９２；ＷＯ０２／０８８１８６；ＵＳ２００３０５９４２７；ＵＳ２００２０１４２３５８；ＷＯ０１／５６６０３；Ｕ．Ｓ．５,８０１,２２７；ＥＰ８０６９６３；ＷＯ８８／０６８９１；および、ＷＯ９４／０４５７０。しかしながら、ＣＤ４０抗体に関する高度に有効な投与方法および製剤は説明されていない。また、このような治療に使用するのに適した安定な製剤も有用と思われる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明は、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそれらのフラグメントを前記患者に投与することを含む、ガン治療が必要な患者におけるガンの治療方法に関する、前記抗体は、少なくとも２サイクルの断続的な投与計画に従って投与され、該サイクルはそれぞれ、（ａ）投与期間（この間に、前記患者に前記ＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量が投与される）、および、それに続く（ｂ）休止期間、を含む。一実施態様において、上記投与は、少なくとも３時間にわたり抗体の血漿濃度０.０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌを生産し、上記休止期間は、少なくとも１週間である。その他の実施態様において、上記投与期間は、少なくとも１日、１〜５日間、または、１〜３日間である。その他の実施態様において、上記休止期間は、１〜８、１〜６週間、２〜５週間、または、３〜４週間である。
【０００３】
特定の実施態様において、ＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量は、３〜１２０時間にわたり、前記抗体の血漿濃度約０.０３μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、約０.０３μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、約０.０３μｇ／ｍｌ〜０.３μｇ／ｍｌ、または、約０.１μｇ／ｍｌ〜０.３μｇ／ｍｌを生産する。いくつかの実施態様において、このような特定の血漿濃度が、少なくとも１日、２４〜３０時間、２４〜３６時間、２４〜４８時間、２４〜７２時間、２４〜９６時間、または、２４〜１２０時間維持される。いくつかの実施態様において、上記血漿濃度は、３〜９６時間、または、１２〜７２時間維持される。
【０００４】
特定の実施態様において、投与期間中に投与されるＣＤ４０アゴニスト抗体の治療上有効な量は、約０.０３〜３.０ｍｇ／ｋｇ／日、０.１〜３.０ｍｇ／ｋｇ／日、０.１〜１.０ｍｇ／ｋｇ／日、または、約０.１〜０.３ｍｇ／ｋｇ／日である。一実施態様において、上記用量は、１〜５日間、または、１〜３日間、連続的に、または、１日おきのいずれかで投与される。
【０００５】
また、腫瘍の治療に関して上述したように、ＣＤ４０アゴニスト抗体の断続的な投与計画も患者の免疫反応を増強することにおいて有用であるため、本発明はこのような使用も提供する。特定の実施態様において、患者の免疫反応を増強することにより、患者の全血中のＢ細胞におけるＣＤ２３またはＭＨＣ−ＩＩ発現の増加（これは、例えば投与期間の終了時に測定してもよい）が起こる。
【０００６】
いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、原発性および／または複合免疫不全に罹った患者、例えば、高ＩｇＭ症候群を伴うＣＤ４０依存性免疫不全、分類不能型免疫不全、ブルトン型無γグロブリン血症、ＩｇＧサブクラス欠損症、および、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ（共通ガンマ鎖の突然変異）に罹った患者に投与される。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、免疫抑制された（例えば化学療法により）患者、または、免疫を衰弱させる疾患（例えば、ＨＩＶのようなあらゆる後天性免疫不全疾患）を有する患者を治療するために投与される。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、高齢の患者の免疫性を増強するために投与される。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫感染を有する患者を治療するために投与される。いくつかの実施態様において、ヒトのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、年齢、病気または全身的に悪い健康状態のために感染を起こしやすい患者に、感染を予防する、または感染数または重症度を低減させるために、予防的に投与してもよい。
【０００７】
本発明はまた、ＣＤ４０アゴニスト抗体、および、ＤＮＡ複製阻害剤、好ましくはプラチン（ｐｌａｔｉｎ）誘導体、特にシスプラチンを投与することを含む、患者における腫瘍の治療方法を提供する。特定の実施態様において、シスプラチンは、静脈内投与される。いくつかの実施態様において、シスプラチンは、患者の体表面領域の約２５〜３００ｍｇ／ｍ2、約５０〜１５０ｍｇ／ｍ2、または、約７５〜１００ｍｇ／ｍ2の量で投与される。一実施態様において、シスプラチンは、一回用量（例えば、一回の静脈内注入）で投与される。その他の実施態様において、これは、２〜５日間にわたり投与される。特定の実施態様において、シスプラチンと併用して投与されるＣＤ４０抗体の量は、約０.１〜３.０ｍｇ／ｋｇ、または、約０.１〜１.０ｍｇ／ｋｇ、または、約０.１〜０.３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０００８】
その他の形態において、シスプラチンの投与は、ＣＤ４０抗体の断続的な投与計画と併用され、ここにおいて、シスプラチンは、１回またはそれ以上の投与期間または休止期間の間に投与される。
【０００９】
その他の形態において、本発明は、腫瘍の治療が必要な患者に、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはそれらのフラグメントを１ｍｇ／ｋｇ／日未満の用量で投与することによって、腫瘍の治療が必要な患者における腫瘍の治療方法に関し、ここにおいて、上記抗体の投与によって生じた患者のＣmax血清濃度は、５０μｇ／ｍｌ未満である。一実施態様において、上記用量は、０.１〜０.３ｍｇ／ｋｇであり、患者における上記抗体のＣmax血清濃度は、０.５〜１０μｇ／ｍｌである。
【００１０】
その他の形態において、本発明は、ｐＨ５.０〜６.０の抗ＣＤ４０抗体と、製薬上許容できるキャリアーとを含む、非経口投与に適した安定な液体医薬製剤に関し、本製剤は、少なくとも３ヶ月の期間安定である。本製剤のＣＤ４０抗体の濃度は、好ましくは、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌである。一実施態様において、本製剤は、抗ＣＤ４０抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む。好ましくは、本製剤は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、および、０.２ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０を含む。抗ＣＤ４０抗体は、好ましくは、抗体２１．４．１、または、３．１．１からなる群より選択される抗体のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、免疫細胞の存在下のＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（−）腫瘍Ｋ５６２の成長の阻害を示す。動物は、腫瘍の攻撃時間に、２１．４．１またはＫＬＨの１回の注射（ＩＰ）を受けた。腫瘍の大きさは、それぞれ個々の動物について、２１日目にｍｍ2で報告されている（１０動物／グループ）。この研究は、少なくとも５回の別々の研究を代表するものである。
【００１２】
図２は、ＣＤ４０アゴニスト抗体によるヒト乳房腫瘍細胞系ＢＴ４７４の成長の阻害を示す。この値は、６匹の動物／グループを用いて、注射後５３日目に行われた個々の腫瘍測定を示す。この研究は、２回の別々の実験を代表するものである。各治療グループの平均は、水平線で示される。
【００１３】
図３は、単独または免疫細胞の存在下での、ＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（＋）腫瘍成長の阻害を示す。動物は、腫瘍の攻撃時間に、２１．４．１の１回の注射を受けた。腫瘍を、（ａ）単独で、または、（ｂ）ヒト末梢血液Ｔ細胞およびＤＣと共に注射した。このデータポイントは、それぞれ個々の動物における腫瘍の大きさ（ｍｍ2）を示す。各治療グループの平均（Ｎ＝１０）は、水平線で示される。この研究は、少なくとも３回の別々の実験を代表するものである。
【００１４】
図４は、ＣＤ４０アゴニスト抗体の、Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）により誘発された死亡率を遅らせる作用を示す。このデータポイントは、生存した動物の平均数を意味する（Ｎ＝１０／グループ）。
【００１５】
図５は、ＣＤ４０アゴニスト抗体とシスプラチンとの併用療法によって生じる腫瘍の縮小を示す。
【００１６】
好ましい実施態様の詳細な説明
用語「アゴニストＣＤ４０抗体」または「アゴニスト抗ＣＤ４０抗体」は、本明細書で用いられる場合、ヒトＣＤ４０分子に特異的に結合する抗体であって、さらに、ＣＤ４０を発現する細胞、組織または生物に添加された場合、１種またはそれ以上のＣＤ４０活性を少なくとも約２０％増加させるものを意味する。いくつかの実施態様において、このような抗体は、ＣＤ４０活性を、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または、８５％活性化する。いくつかの実施態様において、このような活性化は、ＣＤ４０Ｌの存在下で生じる。いくつかの実施態様において、活性化している抗体の活性は、全血の表面分子のアップレギュレーション分析を用いて測定される。その他の実施態様において、活性化している抗体の活性は、ＩＬ−１２放出を測定するための樹状細胞分析を用いて測定される。その他の実施態様において、活性化している抗体の活性は、インビボでの腫瘍モデルを用いて測定される。
【００１７】
用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、無傷の抗体、または、無傷の抗体と特異的な結合で競合するそれらの結合フラグメントを意味する。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または、無傷の抗体の酵素的または化学的な切断によって生産される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、および、単鎖抗体が挙げられる。本明細書において無傷の（例えば、全体、全長など）抗体という場合、重鎖で末端のリシンが欠失（組換え発現の際に一般的に発生する）した抗体を含むものと理解される。
【００１８】
好ましくは、アゴニストＣＤ４０抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書で用いられる場合、可変および定常ドメイン配列がヒト配列から誘導されている抗体を意味する。ヒトＣＤ４０抗体は、２００１年１１月９日付けで出願された米国仮出願番号６０／３４８,９８０、および、２００２年１１月８日付けで出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３６１０７（現在、ＷＯ０３／０４０１７０として公開）で詳細に説明されており、これらの全開示は、参照により本発明に含める。ヒト抗体は、ヒト患者における非ヒト抗体の使用に付随する免疫原性およびアレルギー性応答を最小化できると予想されるため、本発明の治療方法に実質的な利点を提供する。
【００１９】
本発明に有用な典型的なヒト抗ＣＤ４０抗体としては、３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａと称される抗体、同様に、典型的な抗体のいずれかのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体のアミノ酸配列を有する抗体が挙げられる。
【００２０】
また、上記典型的な抗体のいずれかと同一または類似のエピトープを認識する抗体またはそれらの一部も、本発明に有用であり得る。すなわち、当業者には本明細書で示される開示に基づき理解できると思われるが、本発明の抗体と競合する抗体（例えば、３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａなど）は、本明細書の他所で開示されているように、有用であり得る。本明細書で例示された抗体と競合する対象の抗体は、抗体を特徴付けるための当業界周知の方法を用いて容易に同定することができる。より特定には、抗体の結合の特徴を評価するための分析、同様に、それらの結合の特徴と、その他の抗体の結合の特徴とを比較するための分析は当業界周知である。このような方法
としては、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡに基づく分析、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）結合研究の使用、同様に、Ｗａｌｋｅｒ等のＵＳ特許出願公報番号２００３／０１５７７３０Ａ１で詳述されている方法が挙げられる。
【００２１】
用語「競合する」は、本明細書において抗体に関して用いられる場合、第一の抗体と第二の抗体とが結合において競合しており、ここにおいて、第一の抗体とその同源のエピトープとの結合は、第二の抗体の非存在下における第一の抗体の結合と比較して、第二の抗体の存在下で検出可能に減少することを意味する。しかしながら、第二の抗体のそのエピトープへの結合もまた、第一の抗体の存在下で検出可能に減少するような別の場合は、必ずしも当てはまらない。すなわち、第一の抗体は、第二の抗体が第一の抗体のそれらそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第二の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が、その他の抗体とその同源のエピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、その阻害が同程度なのか、より大きい程度なのか、または、より小さい程度なのかにかかわらず、その抗体は、それらそれぞれのエピトープの結合に関して互いに「交差競合する」と称される。例えば、交差競合する抗体は、本発明の抗体（例えば、３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａ）が結合するエピトープまたはそのエピトープの一部に、結合することができる。競合する抗体と、交差競合する抗体はいずれも、本発明に包含される。このような競合または交差競合が発生するメカニズム（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、または、共通エピトープまたはそれらの一部への結合、など）に関係なく、当業者には当然であるが、本明細書で示される教示に基づき、このような競合および／または交差競合する抗体が包含され、本明細書で開示された方法に有用であることができる。
【００２２】
加えて、上記典型的な抗体は、抗体が抗原に結合する能力を損なうことなく、１個またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、付加または欠失によってさらに修飾され、そのアゴニスト機能を作用させてもよい。実際に、「３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ」と称される抗体は、重鎖可変領域に３つのアミノ酸置換を含み、すなわち、アミノ酸残基番号７８におけるアラニンからスレオニンへの置換、アミノ酸残基番号８８におけるバリンからアラニンへの置換、および、アミノ酸残基番号９７におけるバリンからアラニンへの置換（配列番号９）であり、これらは全て、抗体３．１．１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）に対応している。加えて、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体は、抗体３．１．１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）と比較して、軽鎖可変領域（配列番号１０）において、アミノ酸残基番号４におけるロイシンからメチオニンへのアミノ酸置換、および、アミノ酸残基番号８３におけるロイシンからバリンへの置換をさらに含む。３．１．１、および、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体の重鎖（配列番号２）および軽鎖（配列番号４）の定常領域のアミノ酸配列は、同一である。また、抗体３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖは、「３．１．１Ｈ３Ｌ２」とも称され、これは、この抗体は、抗体３．１．１に比べて重鎖に３つのアミノ酸置換を含み、軽鎖に２つのアミノ酸置換を含む、ということを反映している。
【００２３】
従って、いくつかの実施態様において、上記典型的な抗体は、例えばＣＤＲまたはフレームワーク領域において、１〜１０個、１〜５個、または、１〜３個のアミノ酸残基の置換、付加または欠失によって修飾されていてもよい。これらの典型的な抗体、および、それらを生産する方法は、２００１年１１月９日付けで出願された米国仮出願番号６０／３４８,９８０、および、２００２年１１月８日付けで出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３６１０７（ＷＯ０３／０４０１７０）で詳細に説明されている。しかしながら、本発明は、これらのアミノ酸置換、またはその他のあらゆるアミノ酸置換に限定されない。むしろ、当業者であれば、本明細書で示された教示をもとに多種多様のアミノ酸置換が本発明に包含され得ることが理解されるだろう。
【００２４】
ブダペスト条約に従って、ハイブリドーマ３．１．１、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、および、２１．４．１を、２００１年８月６日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ；１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，マナサス，バージニア州２０１１０−２２０９）に寄託した。ハイブリドーマ２１．２．１、２２．１．１、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２９．１、および、２４．２．１を、２００２年７月１６日にＡＴＣＣに寄託した。これらのハイブリドーマには、以下の寄託番号が付与された：
【００２５】
【表１】
【００２６】
これらの抗体の配列は既知であり、ＷＯ０３／０４０１７０に記載されている。便宜上、これらの抗体のうち２種の重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、以下に示す：
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
従って、２１．４．１抗体のアミノ酸配列は、配列番号５〜８に記載のアミノ酸配列を含み、３．１．１抗体のアミノ酸配列は、配列番号１〜４に記載のアミノ酸配列を含み、および、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体のアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号２、配列番号１０、および、配列番号４に記載の配列を含む。３．１．１と、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖとの間で異なるアミノ酸は、下線で示した。
【００３０】
当然ながら、本明細書で示される開示に基づき、本発明の３．１．１抗体は、本明細書に記載の重鎖および／または軽鎖可変領域のあらゆる組み合わせを包含する。すなわち、抗体は、可変領域のあらゆる組み合わせを含んでいてもよく、このような組合せとしては、これらに限定されないが、３．１．１Ｈ（配列番号１）／３．１．１Ｌ（配列番号３）、３．１．１Ｈ（配列番号１）／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ（配列番号１０）、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ（配列番号９）／３．１．１Ｌ（配列番号３）が挙げられ、より好ましくは、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ（配列番号９）／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ（配列番号１０）である。しかしながら、本発明は、これらの、またはその他のあらゆる特定の組み合わせに少しも限定されることはない。
【００３１】
特定の実施態様において、腫瘍の治療とは、ガン細胞の増殖を阻害する、腫瘍の質量または体積の増加を阻害または予防する、および、／または、腫瘍の質量または体積の減少を起こすことである。いくつかの実施態様において、腫瘍の治療は、患者の寿命を延長させる。特定の実施態様において、腫瘍成長は、治療されていない場合と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％阻害される。いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＣＤ４０陽性である。いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＣＤ４０陰性である。腫瘍は、充実性腫瘍でもよいし、または、リンパ腫のような非充実性腫瘍でもよい。いくつかの実施態様において、抗ＣＤ４０抗体が、癌性の腫瘍を有する患者に投与される。
【００３２】
抗ＣＤ４０抗体または抗体の一部で治療できる患者としては、これらに限定されないが、脳ガン、肺ガン、骨ガン、膵臓ガン、皮膚ガン、頭部および頚部のガン、皮膚または眼内黒色腫、子宮ガン、卵巣ガン、直腸ガン、肛門領域の癌、胃ガン（ｓｔｏｍａｃｈ
ｃａｎｃｅｒ，ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸ガン、結腸ガン、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚の癌腫、膣の癌腫、または、陰門の癌腫）、食道ガン、小腸ガン、内分泌系のガン（例えば、甲状腺ガン、副甲状腺ガンまたは副腎ガン）、軟部組織肉腫、白血病、骨髄腫、多発性骨髄腫、尿道ガン、陰茎ガン、前立腺ガン、慢性もしくは急性白血病、小児の充実性腫瘍、ホジキン病、リンパ球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膀胱ガン、肝臓ガン、腎臓ガン、腎臓または尿道ガン（例えば、腎細胞ガン、腎盂ガン）、または、中枢神経系の新生物（例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹グリオーマもしくは下垂体腺腫）、神経膠腫、または、線維肉腫を有すると診断された患者が挙げられる。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、用語「患者」は、交叉反応するＣＤ４０を発現するヒトまたはヒト以外の哺乳動物（例えば、霊長類、カニクイザルまたはアカゲザル）を意味する。好ましくは治療される患者はヒトである。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、用語「断続的な投与計画」は、ＣＤ４０アゴニスト抗体を投与すること、それに続く休止期間を含む投与計画を意味する。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「休止期間」は、患者にＣＤ４０アゴニスト抗体が投与されない期間を意味する。例えば、抗体が毎日投与されている場合、毎日の投与が、例えば数日間または数週間中止されれば、それは休止期間といえる。用量が様々なスケジュールで投与される場合、しばらくの間投与が中止されるような休止期間も考えられる。あるいは、抗体の濃度が治療レベルより低く維持されるような休止期間もあり得る。
【００３６】
一実施態様において、上記抗体は、第二の休止期間の後に投与されない、すなわち、本発明の方法が２サイクルを含む場合、第二の休止サイクルの後、薬物は、投与しなくてもよい。
【００３７】
好ましくは、休止期間の間、上記抗体の血漿濃度は、治療レベルより低く維持される。
【００３８】
上記抗体の投与期間および／または用量は、サイクル間で同一でも異なっていてもよい。
【００３９】
総治療時間（すなわち、治療のためのサイクルの数）は、患者それぞれに応じて、確実な医療的判断と治療される患者に特有の要因に基づき様々であると予想される。一般的に、このような治療は、十分な応答が得られるまで施される。本発明の特定の実施態様において、治療期間は、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜７、２〜５サイクル、または、２〜３サイクルを含む。
【００４０】
上記抗体は、あらゆる望ましい手段によって投与することができ、このような手段としては、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、腫瘍内、および、経皮投与が挙げられる。一実施態様において、ＣＤ４０抗体は、静脈内投与される。あるいは、ＣＤ４０抗体は、微細針装置を用いて投与される；このような
装置は周知であり、例えば、ＷＯ０３／０８４５９８で説明されている装置が挙げられる。
【００４１】
ＤＮＡ複製阻害剤（例えばシスプラチン）と組み合わせて投与される場合、上記抗体は、このような阻害剤の投与の前に、その最中に、または、その後に投与されてもよい。
【００４２】
一形態において、本発明は、ｐＨが約５.０〜６.０、好ましくはｐＨが約５.５の、静脈注射のための水溶液に関する。このような溶液は、酢酸ナトリウム（三水和物）、酢酸（氷酢酸）、ポリソルベート８０、塩化ナトリウムおよび水と共に製剤化されてもよい。好ましくは、上記抗体溶液を冷蔵温度２℃〜８℃で保存し、凍結させないことである。
【００４３】
本発明によれば、腫瘍の治療が必要な患者において腫瘍を治療する方法も提供され、本方法は、前記患者に、治療上有効な量のＣＤ４０アゴニスト抗体と、治療上有効な量のＤＮＡ複製阻害剤（例えばプラチン誘導体）との組み合わせを投与することを含む。特定の実施態様において、組み合わせの抗腫瘍作用がそれぞれの化合物の単独投与から予測される作用より大きくなるように、ＣＤ４０アゴニスト抗体と、プラチン誘導体化合物（特にシスプラチン）とを、相乗的に組み合わせて作用させる。
【００４４】
プラチン誘導体は、ＤＮＡ複製を妨害することによって抗腫瘍活性を示すことが周知の化合物群である。特定の実施態様において、プラチン誘導体は、シスプラチン（シスジアミンジクロロプラチナム、メルクインデックス（Ｍｅｒｃｋ
Ｉｎｄｅｘ）を参照）、カルボプラチン、および、オキサリプラチンからなる群より選択される。
【００４５】
以下の実施例を参照することによって、本発明をさらによく理解できると思われる。しかしながら、これら実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。全ての文献の参照は、参照により開示に含まれる。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ガン患者からのリンパ節細胞に対する抗体の作用
自己腫瘍細胞で刺激されたガン患者から得られたリンパ節細胞に対するヒト抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の作用を試験した。
腎細胞ガン、非小細胞肺癌、膀胱の移行細胞癌、結腸ガン、前立腺ガン、および、頭部および頚部のガンを有する患者から、リンパ節細胞と腫瘍を採取した。そのリンパ節細胞を、２１．４．１（１μｇ／ｍＬ；６.７ｎＭ）の存在または非存在下で、放射線照射したコラゲナーゼ処理腫瘍（上記の同じ患者より採取）と共に培養下に置いた。９６時間後に、増殖を3Ｈ−チミジンを用いて評価した。ＩＮＦγ生産細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴ、その後の再刺激で評価した。
腫瘍抗原で刺激されたリンパ節細胞の培養において、上記抗体は、ＩＦＮγ＋陽性Ｔ細胞の数を高めた。さらに、これらのリンパ節細胞の腫瘍抗原に応答した増殖は３〜４倍に高められた。
腫瘍抗原で刺激されると、上記抗体は、ガン患者から得られたリンパ節細胞の増殖とサイトカイン生産能を高めた。
【００４７】
実施例２：抗体のＦｃ受容体への結合
抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の、ヒトおよびカニクイザルの白血球におけるＦｃ受容体への結合を試験した。
フローサイトメトリー研究によれば、ヒト白血球で、ＦｃＲタイプのＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、および、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、同様に、極めて低いレベルのＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）が発現されたことが示された。２１．４．１の、ヒトまたはカニクイザルの末梢血液の白血球におけるＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合を、125Ｉ−２１．４．１と、ヒトＩｇＧ１コントロールｍＡｂを用いることによって決定した。正常なドナーからのヒト白血球またはカニクイザルの白血球を、血漿ゲルを用いて全血から単離し、徹底的に洗浄し、受容体に結合した血清免疫グロブリンを解離させた。スクロースの緩衝材を通過させた遠心分離を用いて、細胞に結合した抗体と、遊離の抗体とを分離した。研究は、受容体の内在化を予防するために、アジ化ナトリウムの存在下で４℃で行われた。
２１．４．１を、ＦｃＲへの特異的結合に関して、競合物質として、抗体と競合する過量の非標識ヒトＩｇＧ２アイソタイプを用いることによって試験した。ヒト白血球におけるＦｃＲへの125Ｉ−２１．４．１の特異的結合（ｎ＝５ドナー）は、−１.０±８.５％であり、カニクイザルの白血球におけるＦｃＲへの特異的結合（ｎ＝４）は、１５±１３％であった。125Ｉ−２１．４．１の白血球のＣＤ４０受容体、同様にＦｃＲへのあらゆる特異的な結合をブロックし得る非標識２１．４．１を５００倍過量で添加することによって、ヒトおよびカニクイザルの白血球における125Ｉ−２１．４．１のＣＤ４０受容体への特異的な結合は、それぞれ４９％および６７％であることが示された（ＣＤ４０への特異的結合の％は、全ての特異的な結合の％からＦｃＲへの結合の％を引くことによって計算された）。コントロールとして、125Ｉ−ＩｇＧ１は、ヒトおよびカニクイザルの白血球への特異的結合を矛盾なく実証している。ヒトおよびカニクイザルの白血球におけるＩｇＧ１コントロール抗体のＦｃＲへの特異的な結合は、全ての結合した放射活性のそれぞれ５６％および５１％を占めた。
これらの研究により、上記抗体は、ヒトおよびカニクイザルの白血球においてＦｃ受容体へ特異的結合が最小であることが示される。
【００４８】
実施例３：全血のサイトカイン放出分析
ヒトにおける抗体が介在するサイトカイン放出の誘導と相関するインビトロでの全血分析を用いて、抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）を、それらの刺激されていないヒト全血からのサイトカインの放出を誘導する能力に関して試験した。２１．４．１を、１、１０および１００μｇ／ｍＬで、ポジティブコントロールとして、Ｆｃ介在経路を介してサイトカイン放出を誘導するマウスの抗ヒトＣＤ３ＩｇＧ１、および、第二のポジティブコントロールとしてマクロファージを刺激することによってサイトカインを誘導するＬＰＳと共に用いて試験した。用いられたドナーには、マウス抗体とＬＰＳの両方に応答した個体（４ドナー）、同様に、ＬＰＳのみに応答した個体（３ドナー）が含まれる。ヘパリン化された全血を、２１．４．１と５時間培養し、血漿を回収し、ＥＬＩＳＡによって（市販のキットを使用）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）に関して解析した。また、培養物を、４８時間インキュベートし、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−β）に関しても解析した。
１または１０μｇ／ｍＬの２１．４．１と培養されたヒト血液の血漿においてサイトカインは検出されなかった。１００μｇ／ｍＬの上記抗体で処理された１つのドナーのみが、低いが測定可能なレベルの２種のサイトカイン（３４ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、および、９０ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６）を示した。その後、このドナーを再試験したところ、検出可能なＴＮＦ−αまたはＩＬ−６の誘導は示されなかった。いずれのサンプルにおいてもＩＮＦγまたはＩＬ−１βの上昇はみられなかった。
これらの研究によれば、２１．４．１は、ヒト全血において炎症性サイトカインを誘導しないことが示される。
【００４９】
実施例４：抗体の薬力学および薬物動態学
ＣＤ４０抗体（２１．４．１）を、様々な用量（１ｍｇ／ｋｇ
ｎ＝４、３ｍｇ／ｋｇ ｎ＝４、５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝２、および、１０ｍｇ／ｋｇ
ｎ＝２）でカニクイザルに静脈内投与した。これらのサルから、投与前後の様々なタイムポイントでヘパリン化された血液を採取した。この血液をアリコートにし、染色した。ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いてデータを得て、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウェアで解析した。結果を、中央値の蛍光強度の投与前の値と比較した増加の倍数として計算した。
Ｂ細胞の活性化状態と抗原提示能を反映するＭＨＣクラスＩＩ発現が、投与してから２４時間までに、試験された全ての用量に関して、２.５〜３倍増加したが、明確な用量応答関係は観察されなかった。ＣＤ２３発現、その他のＢ細胞活性化のマーカーについて、動物２匹を３ｍｇ／ｋｇで、動物１匹を１０ｍｇ／ｋｇで評価した。ＣＤ２３発現が、投与後２４時間で、≧２０倍に増加したが、用量の作用は観察されなかった。両方の表面マーカーのアップレギュレーションは持続したが（≧２倍の増加）、２１．４．１レベルは１μｇ／ｍｌを超えたままだった。また、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）とＣＤ８６の副刺激分子のレベルも、中程度のアップレギュレーションを示したが、一方で、ＣＤ８０発現はそれほど変化しなかった。
インビボのカニクイザルのＢ細胞において、２１．４．１は、表面マーカーをアップレギュレートした。ＣＤ２０＋細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ、および、ＣＤ２３発現は、処理によって増加し、１ｍｇ／ｋｇ（４日間で、〜２０μｇ／ｍＬのＣmax、および、≧０.１μｇ／ｍＬの接触に相当する）が、カニクイザルのＢ細胞において飽和した薬力学反応を生産するようである。この反応の持続時間は、より高い用量ではより長かった。
カニクイザルにおける、１、３、５または１０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内（ＩＶ）投与の後の抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の薬物動態学的特性を試験した。２１．４．１は、低い全身クリアランス（０.０１３３〜０.０６３５ｍＬ／分／ｋｇ）、および、定常状態における少ない分配量（０.０４５９〜０.０７５７Ｌ／ｋｇ）であり、見かけの平均除去半減期が０.７５〜２.０日間（表１）になったことが特徴的であった。２１．４．１の薬物動態学は、試験された用量範囲にわたり用量依存性のようであった。クリアランス値は、概して、用量を１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに高めると減少し、見かけの平均除去半減期は、１ｍｇ／ｋｇで０.７５日間から、１０ｍｇ／ｋｇで２.０日間に増加した。定常状態における分配量は、様々な用量で類似していた（０.０５７５Ｌ／ｋｇの平均）。
【００５０】
観察された用量依存性クリアランスは、部分的には、２１．４．１の、正常な組織で広く発現されるＣＤ４０受容体への結合、それに続く内在化、および、抗体−受容体複合体の除去に起因している可能性がある。また、霊長類の抗ヒト抗体（ＰＡＨＡ）応答の開発も、数種のサルにおいて、クリアランスの促進に寄与する可能性がある。試験血清中に２１．４．１が存在するとＰＡＨＡ分析を妨害するため、それぞれの２１．４．１の血清濃度が定量の下限（ＬＬＯＱ，０.０３μｇ／ｍＬ）に達した後だけ、ＰＡＨＡを評価した。３、５および１０ｍｇ／ｋｇの用量のグループの全てのサルで、抗体投与後１４〜２８日目に抗２１．４．１抗体を検出した。
【００５１】
【表４】
【００５２】
実施例５：抗体の抗腫瘍活性
腫瘍細胞単独（１×１０7）、または、ヒトＤＣ（１×１０5）、および、同じドナーからのＴ細胞（５×１０5）を皮下注射されたＳＣＩＤ−ベージュマウスにおいて、ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の腫瘍成長の阻害活性を決定した。腫瘍細胞のＤＣおよびＴ細胞に対する比率は、１００：１：５であった。特に他の指定がない限り、結果は、コントロール動物における腫瘍成長が３００〜４００ｍｍ2の大きさに達し、実験を継続することがもはや人道的ではない時点であることが予め決定されている１つの固定タイムポイント（反応速度論実験より）における腫瘍の大きさ（ｍｍ2）に関して示される。全ての場合において、＞３０日間のＴ1/2を有する２１．４．１の注射を１回だけ、ＳＣＩＤ−ベージュマウスに投与した。
【００５３】
実施例５（ａ）：ＣＤ４０（−）ヒト腫瘍に対する抗体の作用
ＣＤ４０（−）腫瘍（例えば、赤白血病および結腸ガン）の成長に対するＣＤ４０抗体（２１．４．１）の作用を試験した。特に、ＣＤ４０（−）の低い免疫原性の（クラスＩおよびＩＩ陰性）腫瘍に対する２１．４．１の有効性を評価するのに、Ｋ５６２腫瘍を選択した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ＣＤ４０（−）赤白血病の腫瘍、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２４３）を、単独で、または、ヒト末梢血液Ｔ細胞およびＤＣの存在下で皮下注射した。腫瘍注射の時、または、５日間後のいずれかに、１回の２１．４．１のＩＰ注射を様々な用量レベルを用いて動物に与えた。
腫瘍の攻撃後の２１日目で示されるように（図１）、１回の２１．４．１のＩＰ注射により、免疫細胞が存在すると、Ｋ５６２腫瘍成長の用量依存性の阻害が生じた。腫瘍成長の５０％阻害を引き起こす２１．４．１の量は、０.００５ｍｇ／ｋｇ（Ｃmax血清濃度０.０５μｇ／ｍＬに相当する）であった。ＣＤ４０（−）結腸ガン、Ｌｏｖｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２９）でも同様の結果が観察された。腫瘍の攻撃から０日目または＋５日目に２１．４．１を投与したところ、結果は同一であった。これらのＣＤ４０（−）腫瘍の成長は、免疫細胞の非存在下だと、２１．４．１によって阻害されなかった。
２１．４．１は、免疫細胞が存在する場合、ＣＤ４０（−）腫瘍の成長を阻害するが、これは、免疫が介在する抗腫瘍活性の増強を示唆している。これは、結腸ガンと赤白血病の腫瘍に対して実証された。また、この抗腫瘍活性も、結腸ガンには抗体３．１．１、および、赤白血病の腫瘍には３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体（ＩＣ５０＜０.０１ｍｇ／ｋｇ）を用いて実証された。従って、本明細書で開示されたデータは、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ抗体は、インビボで、３．１．１抗体活性を有することを実証する。これらのインビボでの腫瘍の結果は、２種の抗体を比較して得られた類似のインビトロでのデータを考慮すると、抗体３．１．１、および、抗体３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖは、インビボでも類似の様式で性能を示すだろうということを、さらに裏付けている。従って、３．１．１を用いて得られた結果は、この分析、および、その他の分析において、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖにも当てはまる。
【００５４】
実施例５（ｂ）：抗体のヒト乳房および前立腺腫瘍成長に対する作用
抗Ｄ４０抗体（２１．４．１）の乳房および前立腺腫瘍の成長阻害に対する作用を試験した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスの皮下を、ヒト乳房腫瘍、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ
ＨＴＢ−２０）をヒト末梢血液Ｔ細胞およびＤＣと共に用いて攻撃した。腫瘍を注射した時に、動物は、２１．４．１の単回投与（ＩＰ）を受けた。
図２で示されるように、２１．４．１の１回の注射は、免疫細胞の存在下でＢＴ４７４細胞の成長を阻害した。腫瘍成長を５０％減少を起こすのに必要な２１．４．１の量は、０.００５ｍｇ／ｋｇ（Ｃmax血清濃度０.０５μｇ／ｍＬに相当する）であった。ヒト前立腺ガン細胞系、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）に対しても、同様の結果が観察された。これもまた、抗体３．１．１を用いて実証され、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖについても予想可能である。
２１．４．１は、ヒト乳房、および、前立腺腫瘍の成長を阻害する。
【００５５】
実施例５（ｃ）：ＣＤ４０（＋）腫瘍に対する抗体の抗腫瘍作用
抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）のＣＤ４０（＋）腫瘍に対する抗腫瘍活性への作用、および、免疫細胞の存在および非存在下における有効性の変化を研究した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、ＣＤ４０（＋）Ｒａｊｉ
Ｂ細胞リンパ腫（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）（ＳＣ）を皮下注射し、それに続いて、腫瘍の注射の時に２１．４．１の単回投与を与えた（ＩＰ）。また、数匹の動物には、ヒトＴ細胞およびＤＣも注射した。２１日目に腫瘍成長を評価した。
図３で示されるように、免疫細胞の非存在下で腫瘍成長の５０％阻害を引き起こす２１．４．１の量は、０.０２ｍｇ／ｋｇ（Ｃmax血清濃度０.２μｇ／ｍＬに相当する）であった。腫瘍細胞が免疫細胞と共に注射された場合、腫瘍成長の５０％阻害を起こすのに必要な２１．４．１の量は、２０分の１の０.００１ｍｇ／ｋｇに減少した（Ｃmax血清濃度＝０.０１μｇ／ｍＬ）。
これらの結果は、２１．４．１は、ＣＤ４０（＋）腫瘍に対して直接的な抗腫瘍活性を有することを説明している。また、この観察は、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ（ＩＣ５０＜０.０１ｍｇ／ｋｇ）にも当てはまる。この抗体２１．４．１に関する抗腫瘍活性は、免疫細胞が存在する場合に高められ、これもまた、抗体３．１．１でも実証され、抗体３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖについても予想される。
【００５６】
実施例５（ｄ）：Ｂ細胞リンパ腫に対する抗体の抗腫瘍作用
ＣＤ４０（＋）の全身性腫瘍モデルにおいて、Ｂ細胞リンパ腫を用いて、本発明に係る抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の死亡を遅らせる能力を評価した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ−２１３）を静脈内注射した。腫瘍の注射の時に、２１．４．１を１回の注射（ＩＰ）で投与した。死亡を５８日間モニターした。
図４で示されるように、２１．４．１の１回の注射によって、全身投与された腫瘍細胞系により誘導された死亡が阻害された。
Ｂ細胞リンパ腫を用いたＣＤ４０（＋）全身性腫瘍モデルにおいて、２１．４．１は死亡を遅らせる。これもまた、３．１．１を用いて実証され、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖについても類似の結果が予想される。
【００５７】
実施例６：抗体のシスプラチン併用の治療効果
ヒト乳房腫瘍の成長を阻害することにおける、抗ＣＤ４０抗体（２１．４．１）の、単独、および、シスプラチンの存在下における治療効果を試験した。
ＳＣＩＤ−ベージュマウスに、乳房腫瘍、ＢＴ４７４を皮下注射した。腫瘍が２００ｍｍ2のサイズに達したら、上記抗体（１ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ）および／またはシスプラチン（２.５ｍｇ／ｋｇ，ＩＰ）を１回の注射で投与した。攻撃の後の８４日目に、腫瘍成長を測定した。
図４で示されるように、２１．４．１またはシスプラチンの１回の注射は、腫瘍成長を阻害した。しかしながら、両方の処理を併用すると、８匹の動物のうち７匹において腫瘍の縮小が達成された。
２１．４．１は、腫瘍が定着した際に単独で投与された場合、腫瘍成長を阻害し、シスプラチンと組み合わせて投与された場合、腫瘍の縮小を引き起こす。これもまた、抗体３．１．１を用いて実証され、同様に、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖでも起こり得る。
【００５８】
実施例７：抗体の複数回用途の薬物動態学
複数回投与の研究において、カニクイザル（２／性別／用量）に、０．３、１．０および１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１、３、５、７および９日目（総投与回数５回）に２１．４．１を静脈内投与した。投与前の１日目と９日目に、および、投与後と投与前の０.５、６および２４時間目に、および、投与後５日目の０.５時間に血液を回収し、血清薬物濃度を測定した。２１．４．１への全身性の接触は、平均Ｃmax、および、平均ＡＵＣ(0-24)での評価の通り、１日目と９日目の両方において、用量が０.３から１０ｍｇ／ｋｇに増加するにつれて増加した（表２）。類似の接触（平均Ｃmax、および、平均ＡＵＣ）を、１日目と９日目に、０.３ｍｇ／ｋｇ、および、１ｍｇ／ｋｇの用量グループで観察した。１０ｍｇ／ｋｇの用量グループにおいて、平均Ｃmax、および、平均ＡＵＣ(0-24)値は、１日目から９日目でそれぞれ２.６倍および２.８倍に増加した。接触における性別に関連する差は観察されなかった。
【００５９】
【表５】
【００６０】
実施例８：抗体製剤
３０ｋＤａの分子量でカットオフするカセットを含む限外ろ過ユニットを用いて、ＣＤ４０抗体を約１１.０ｍｇ／ｍＬ±０.８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次に、この濃縮物を、ダイアフィルターでろ過して、２０ｍＭ酢酸ナトリウム／１４０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）にした。２％ポリソルベート８０溶液を、ダイアフィルターで濃縮した生成物に添加し、０.０２％ポリソルベート８０の最終濃度を達成した。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】免疫細胞の存在下のＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（−）腫瘍Ｋ５６２の成長の阻害を示す。
【図２】ＣＤ４０アゴニスト抗体によるヒト乳房腫瘍細胞系ＢＴ４７４の成長の阻害を示す。
【図３】単独または免疫細胞の存在下での、ＣＤ４０アゴニスト抗体によるＣＤ４０（＋）腫瘍成長の阻害を示す。
【図４】ＣＤ４０アゴニスト抗体の、Ｂ細胞リンパ腫（Ｄａｕｄｉ）により誘発された死亡率を遅らせる作用を示す。
【図５】ＣＤ４０アゴニスト抗体とシスプラチンとの併用療法によって生じる腫瘍の縮小を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも３ヶ月の期間安定な、ＣＤ４０アゴニスト抗体と、製薬上許容できるキャリアーとをｐＨ５.０〜６.０で含む非経口投与に適した安定な液体医薬製剤。
【請求項２】
ＣＤ４０抗体の濃度が少なくとも約５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
抗ＣＤ４０抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記抗ＣＤ４０抗体は、２１．４．１、３．１．１、および、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖからなる群より選択される抗体のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
ｐＨ５．０〜６．０のＣＤ４０アゴニスト抗体および製薬上許容できるキャリアーを含む非経口投与に適した液体医薬製剤であって、ここで該抗体は３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａからなる群より選択され、そして該製薬上許容できるキャリアーは酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびポリソルベート８０から選択される、製剤。
【請求項６】
該抗体の濃度は少なくとも約５ｍｇ／ｍｌである、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
抗体が、２１．４．１、３．１．１、および３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖからなる群より選択される、請求項７に記載の製剤。
【請求項１】
少なくとも３ヶ月の期間安定な、ＣＤ４０アゴニスト抗体と、製薬上許容できるキャリアーとをｐＨ５.０〜６.０で含む非経口投与に適した安定な液体医薬製剤。
【請求項２】
ＣＤ４０抗体の濃度が少なくとも約５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
抗ＣＤ４０抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
前記抗ＣＤ４０抗体は、２１．４．１、３．１．１、および、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖからなる群より選択される抗体のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
ｐＨ５．０〜６．０のＣＤ４０アゴニスト抗体および製薬上許容できるキャリアーを含む非経口投与に適した液体医薬製剤であって、ここで該抗体は３．１．１、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ、３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、７．１．２、１０．８．３、１５．１．１、２１．４．１、２１．２．１、２２．１．１、２２．１．１Ｈ−Ｃ１０９Ａ、２３．５．１、２３．２５．１、２３．２８．１、２３．２８．１Ｈ−Ｄ１６Ｅ、２３．２９．１、２４．２．１、３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖ、および、２３．２８．１Ｌ−Ｃ９２Ａからなる群より選択され、そして該製薬上許容できるキャリアーは酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよびポリソルベート８０から選択される、製剤。
【請求項６】
該抗体の濃度は少なくとも約５ｍｇ／ｍｌである、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記抗体、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および、ポリソルベート８０を含む、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
抗体が、２１．４．１、３．１．１、および３．１．１Ｈ−Ａ７８Ｔ−Ｖ８８Ａ−Ｖ９７Ａ／３．１．１Ｌ−Ｌ４Ｍ−Ｌ８３Ｖからなる群より選択される、請求項７に記載の製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−１８４４４６（Ｐ２０１１−１８４４４６Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１００８６８（Ｐ２０１１−１００８６８）
【出願日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【分割の表示】特願２００６−５４６３５７（Ｐ２００６−５４６３５７）の分割
【原出願日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【分割の表示】特願２００６−５４６３５７（Ｐ２００６−５４６３５７）の分割
【原出願日】平成１６年１２月９日（２００４．１２．９）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]