ＣＤＣＡ１−ＫＮＴＣ２複合体を標的とするスクリーニングおよびＮＳＣＬＣの治療方法
本発明は、CDCA1およびKNTC2の同時活性化ならびにそれらの同族相互作用が、肺癌進行において重要な役割を果たし、かつその複合体を阻害する方法が、非小細胞肺癌を治療に用いることができるという観察結果に基づいている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌治療の分野に関する。特に本発明は、CDCA1およびKNTC2の同時活性化ならびにそれらの同族相互作用が、肺癌進行において重要な役割を果たし、かつその複合体を阻害する方法が、非小細胞肺癌を治療するのに使用することができるという観察結果に基づいた、癌の治療に関する。
【０００２】
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、2005年7月29日に出願された米国特許仮出願第60/703,704号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は世界で最も一般的な癌の1つであり、かつ非小細胞肺癌(NSCLC)はさらに最も一般的な形態であり、それらの症例のほぼ80％を占める(Greenlee RT., et al., CA Cancer J Clin. 2001；51：15-36)。肺癌の発症および進行に関連した多くの遺伝子的な変化が報告されている。しかしながら、これまでのところ、正確な分子メカニズムは依然として不明である(Sozzi G., Eur J Cancer. 2001；37 Suppl 7：S63-73)。最近10年間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンを含む新しく開発された細胞毒性薬が登場し、NSCLCの進行した患者に対する複数の治療選択が与えられた。しかしながら、これらの治療計画は、シスプラチンに基づいた療法と比較して、中程度の延命効果しか提供しない(Schiller JH, et al., N Engl J Med. 2002；346：92-8；Kelly K, et al., J Clin Oncol. 2001；19：3210-8)。したがって、新しい治療法が切に望まれている。
【０００４】
cDNAマイクロアレイを用いた何千個もの遺伝子の発現レベルの体系的な解析は、発癌の経路に関与する未知の分子を同定するのに効果的なアプローチであり、かつ新規な治療および診断の開発のための候補標的分子を明らかにすることができる。本発明者らは、NSCLCを診断、治療、および/または予防するための標的分子候補を単離するために、レーザーマイクロダイセクションによって精製した腫瘍細胞集団を用いて、23,040個の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイ上でNSCLC細胞のゲノム全域の発現プロファイルを解析した(Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003；22：2192-205；Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003；63：7038-41；Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003；1：485-99；Zembutsu H, et al., Int J Oncol. 2003；23：29-39；Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004；13：3029-43)。それぞれの遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な重要性を確認するために、本発明者らはまた、肺癌の臨床材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析も実施した(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004；10(24)：8363-70)。この体系的なアプローチにより、cell division associated 1(CDCA1)およびkinetocore associated 2(KNTC2)が高頻度で、原発性NSCLCにおいて同時に過剰発現されることが明らかになった(WO2004/031413も参照されたい)。
【０００５】
細胞周期の調節の変化は、ヒト癌の特徴である。CDCA1およびKNTC2は、紡錘体チェックポイントシグナル伝達に関与するいくつかのタンパク質のメンバーである。具体的には、キネトコアの外層内の結合部位は、染色体移動のための微小管依存的な力を生じさせ、かつキネトコアでの紡錘体チェックポイントタンパク質の集合を調節する。Ndc80(Hec1)、Nuf2、Spc24、およびSpc25から構成されるNdc80複合体は、中期染色体の整列および後期染色体の分離に不可欠である。Ndc80複合体は、出芽酵母において最初に単離され、かつそのホモログが、ぜん虫、カエル、ニワトリ、およびヒトにおいて同定された(Ciferri, C. et al. J Biol Chem. 280, 29088-95(2005)；McCleland, M.L et al. Genes Dev. 17, 101-114(2003)；Desai, A. et al. Genes Dev. 17, 2421-2435(2003)；DeLuca, J.G. et al. Curr Biol. 13, 2103-2109(2003))。キネトコア外層内のCDCA1-KNTC2複合体の結合部位は、染色体移動のための微小管依存的な力を生じさせ、かつキネトコアでの紡錘体チェックポイントタンパク質の集合を調節する。この複合体のメンバーを欠くか、または変異したメンバーを有する酵母細胞は、キネトコア構造の全体的な損失を伴わずに、キネトコア-微小管結合の喪失を示すことが公知であった(Wigge, P.A. et al. J Cell Biol. 152, 349-60(2001))。酵母Nuf2もまた、セントロメアが紡錘極体への結合を失う場合、減数分裂前期の間にセントロメアから消失し、染色体の分離において調節性の役割を果たす(Nabetani, A. et al. Chromosoma. 110, 322-334(2001))。ヒトCDCA1は、CDC2、サイクリン、トポイソメラーゼII、およびothers21を含む、公知の細胞周期遺伝子と共発現される遺伝子のメンバーとして同定され、かつ有糸分裂HeLa細胞のセントロメアに結合することが報告された。このことから、CDCA1が、酵母Nuf2の機能的なホモログであることが見込まれる(Wigge, P.A. et al. J Cell Biol. 152, 349-360(2001))。
【０００６】
これに対して、ヒトKNTC2は、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを用いて、網膜芽細胞腫タンパク質(RB1)のC末端と相互作用するタンパク質として同定され、かつ紡錘体チェックポイントシグナル伝達に関与するいくつかのタンパク質のうちの1つであることが示唆された(Durfee,T. et al. Genes Dev. 7, 555-569(1993)；Chen, Y. et al. Mol.Cell.Biol. 17, 6049-6056(1997))。
【０００７】
KNTC2を含むこの監視メカニズムは、MPS1キナーゼおよびMAD1/MAD2複合体をキネトコアに動員し、かつ整列されていない染色体の検出および染色体の適切な両極への結合が実現されるまで前中期停止を引き起こすことによって、細胞分裂の間の染色体の正確な分離を確実にする(Martin-Lluesma, S. et al. Science 297, 2267-2270(2002))。
【０００８】
これらの進歩にもかかわらず、これまで、ヒト癌の進行におけるCDCA1-KNTC2複合体の同時活性化の重要性ならびに治療標的および予後判定標的としての可能性を記載した報告はなかった。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
非小細胞肺癌(NSCLC)のゲノム全域の遺伝子発現プロファイルの解析により、本発明者らは、cell division associated 1(CDCA1)の過剰発現を検出した。本発明者らはさらに、CDCA1タンパク質が、肺癌において同様に特異的に過剰発現されるタンパク質であるkinetocore associated 2(KNTC2)と物理的に相互作用することを見出した。ノーザンブロット解析により、これら2種の遺伝子が、検査した23種の正常成人組織のうち、精巣でのみ発現されることが明らかになった。肺癌組織マイクロアレイの免疫組織化学的解析により、肺癌患者におけるCDCA1およびKNTC2の同時活性化が、予後不良に関連することが実証された。インビトロで、CDCA1もしくはKNTC2のいずれかの発現をsiRNAで抑制するか、またはドミナントネガティブなCDCA1断片、もしくは膜導入11ポリアルギニン配列およびCDCA1由来の19アミノ酸のペプチド(コドン398〜416)から構成された33アミノ酸の合成ポリペプチドを用いてそれらの結合を阻害すると、NSCLC細胞の増殖が効果的に抑制された。本明細書におけるデータが、CDCA1およびKNTC2が癌-精巣抗原(CTA)のカテゴリーに入ること、ならびにそれらの同時上方制御が肺癌細胞の増殖/生存の頻繁かつ重要な特徴であることを実証するため、CDCA1もしくはKNTC2の活性の選択的抑制、および/またはCDCA1-KNTC2複合体の形成の阻害は、多くの肺癌を治療するための簡便な治療法であると考えられる。
【００１０】
したがって、本発明は、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な方法は、以下の段階を含む：
(1)試験化合物の存在下で、KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物をCDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
(2)段階(1)のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
(3)それらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【００１１】
CDCA1ポリペプチドの機能的等価物は、KNTC2結合ドメインに対応するアミノ酸配列、例えばSEQ ID NO：35のアミノ酸配列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)を有してもよい。同様に、KNTC2ポリペプチドの機能的等価物は、CDCA1結合ドメインに対応するアミノ酸配列を有してもよい。
【００１２】
本発明はまた、前述した本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物を投与することにより、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法も提供する。
【００１３】
本発明はさらに、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキットも提供する。キットは好ましくは、以下の構成要素を含む：
a：KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物、および
b：CDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物。
【００１４】
本発明はまた、KNTC2遺伝子の発現を低減させるsiRNAを含むsiRNA組成物を対象に投与する段階を含み、そのsiRNAがセンス鎖中にSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有する、対象においてNSCLCを治療または予防する方法を提供する。siRNAは、好ましくは以下の一般式を有する：
5'-[A]-[B]-[A']-3'
式中、[A]はSEQ ID NO：9に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから構成されるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。
【００１５】
本発明の方法はまた、ドミナントネガティブな効果を有するCDCA1変異体、またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象においてNSCLCを治療または予防することも提供する。CDCA1変異体は、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を有してよく、かつそのnuf2ドメインを含まない。好ましい態様において、CDCA1変異体は、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する。CDCA1変異体は、以下の一般式を有し得る：
[R]-[D]、
式中、[R]は膜導入物質であり、かつ[D]はSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。膜導入物質は以下からなる群より選択することができる；
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；
Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49。
【００１６】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を提供し、ここでセンス鎖はKNTC2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列であり、該センス鎖および該アンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子はKNTC2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合、該遺伝子の発現を阻害する。この二本鎖分子は、SEQ ID NO：31のヌクレオチド配列由来の少なくとも約10個の連続的なヌクレオチドから構成されるKNTC2標的配列を含んでもよい。好ましい態様において、KNTC2標的配列は、SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列由来の約19〜約25個の連続的なヌクレオチドを含むか、またはSEQ ID NO：9から完全に構成されていてもよい。
【００１７】
二本鎖分子は、一本鎖リボヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成された単一のリボヌクレオチド転写物でよい。二本鎖分子は典型的に、約100ヌクレオチド長未満、約75ヌクレオチド長未満、約50ヌクレオチド長未満、または約25ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである。二本鎖分子は、約19ヌクレオチド長と約25ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであり得る。
【００１８】
本発明はまた、前述した本発明の二本鎖分子をコードするベクターも提供する。ベクターは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二次構造を有する転写物をコードし得る。この転写物は、センス鎖およびアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含んでよい。
【００１９】
本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせから構成されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、ここでセンス鎖核酸はSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有し、アンチセンス鎖核酸はセンス鎖に相補的な配列を有する。
【００２０】
ポリヌクレオチドは一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有してもよく、式中[A]はSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なヌクレオチド配列である。
【００２１】
本発明は、KNTC2遺伝子に対する薬学的有効量のsiRNAを含む、NSCLCを治療または予防するための組成物を提供する。siRNAは、標的配列としてSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含んでもよい。
【００２２】
本発明はさらに、活性成分として前述した本発明のスクリーニング方法によって選択された薬学的有効量の化合物および薬学的に許容される担体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、薬学的有効量の本発明のCDCA1変異体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物も提供する。
【００２４】
本発明は、以下の段階を含む、NSCLCの予後を評価する方法を提供する：
(a)NSCLCの予後を評価しようとする対象から採取した試料におけるCDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルを検出する段階、ならびに
(b)CDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルの上昇が検出される場合、予後不良が示唆される段階。
【００２５】
上記の方法は、CDCA1およびKNTC2の両方の発現レベルを検出する段階を含んでもよい。発現レベルは、以下の方法のうちいずれか1つによって検出してもよい：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出する段階、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を検出する段階、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出する段階。
【００２６】
本発明はまた、以下からなる群より選択される任意の1つの構成要素を含む、NSCLCの予後を評価するためのキットも提供する：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【００２７】
定義
本明細書において使用される語「a」、「an」、および「the」は、別に具体的に指示しない限り「少なくとも1つ」を意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は同義的に使用される。さらに、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、別に具体的に指示しない限り同義的に使用される。
【００２８】
「有効な」という用語は、対象におけるNSCLCのサイズ、罹患率、または転移能の低減をもたらす治療を意味する。ある治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、その治療が、NSCLCの発生を遅延もしくは予防するか、またはNSCLCの臨床症状を緩和することを意味する。NSCLCの評価は、標準的な臨床的プロトコールを用いて実施することができる。さらに、治療の有効性は、NSCLCを診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定してもよい。例えば、NSCLCは、組織病理学的に、または慢性の咳、嗄声、喀血、体重減少、食欲低下、息切れ、喘鳴、気管支炎もしくは肺炎の発作の繰り返し、および胸痛など症候性異常を確認することによって、しばしば診断される。
【００２９】
詳細な説明
NSCLCを治療または予防するための化合物のスクリーニング
前述したように、本発明者らは、CDCA1がNSCLC細胞においてKNTC2と相互作用することを明らかにした。したがって本発明は、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、以下の段階を含む：
(1)試験化合物の存在下で、KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物をCDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
(2)段階(1)のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
(3)それらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【００３０】
本発明の文脈において、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドの機能的等価物は、それぞれ、CDCA1ポリペプチド(SEQ ID NO：34)またはKNTC2ポリペプチド(SEQ ID NO：32)に等価な生物活性を有するポリペプチドである。
【００３１】
所与のタンパク質に機能的に等価なポリペプチドを調製するための方法は当業者に周知であり、タンパク質中に変異を導入する公知の方法も含まれる。例えば当業者は、CDCA1またはKNTC2に機能的に等価なポリペプチドを、部位特異的変異誘発によってこれらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列中に適切な変異を導入することによって調製することができる(Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152：271-5(1995)；ZollerおよびSmith, Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12：9441-9456(1984)；KramerおよびFritz, Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82：488-92(1985)；Kunkel TA, et al., Methods Enzymol. 1991；204：125-39)。アミノ酸変異は、天然にも発生し得る。本発明のポリペプチドには、結果として生じる変異ポリペプチドがそれぞれCDCA1またはKNTC2に機能的に等価であるという条件で、1つまたは複数のアミノ酸が変異している、CDCA1またはKNTC2のアミノ酸配列を有するものが含まれる。このような変異体において変異したアミノ酸の数は、一般に20個またはそれ未満のアミノ酸、より典型的には10個またはそれ未満のアミノ酸、好ましくは5〜6個またはそれ未満のアミノ酸、およびより好ましくは1〜3個のアミノ酸である。
【００３２】
変異または改変されたタンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが公知である(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；ZollerおよびSmith, Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。
【００３３】
変異させるアミノ酸残基は、好ましくはアミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる(保存的アミノ酸置換として公知のプロセス)。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、ならびに以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖：脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P)；ヒドロキシル基を含む側鎖(S、T、Y)；硫黄原子を含む側鎖(C、M)；カルボン酸およびアミドを含む側鎖(D、N、E、Q)；塩基を含む側鎖(R、K、H)；および芳香族を含む側鎖(H、F、Y、W)である。括弧内の文字はアミノ酸の一文字表記を示すことに留意されたい。
【００３４】
CDCA1またはKNTC2のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸残基を付加したポリペプチドの例は、CDCA1またはKNTC2をそれぞれ含む融合タンパク質である。したがって、融合タンパク質、すなわちCDCA1またはKNTC2および他のペプチドまたはタンパク質の融合物が、本発明に含まれる。当業者に周知の技術によって、例えばCDCA1またはKNTC2をコードするDNAを、フレームが合致するように、他のペプチドもしくはタンパク質をコードするDNAと連結し、その融合DNAを発現ベクター中に挿入し、かつ宿主中でそれを発現させることによって、融合タンパク質を作製することができる。本発明のタンパク質に融合されるペプチドまたはタンパク質に関して制限はない。
【００３５】
機能的に等価なポリペプチドを単離するための当技術分野において公知の代替方法は、例えばハイブリダイゼーション技術を用いた方法である(Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))。当業者は、CDCA1またはKNTC2(すなわち、それぞれSEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：32)と高い相同性を有するDNAを容易に単離することができ、単離したDNAから、CDCA1またはKNTC2に機能的に等価なポリペプチドを単離することができる。本発明のタンパク質には、CDCA1もしくはKNTC2をコードするDNA配列の全体または一部とハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつCDCA1またはKNTC2に機能的に等価であるものが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物のホモログ(例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシの遺伝子よってコードされたポリペプチド)が含まれる。動物由来のCDCA1またはKNTC2をコードするDNAとの相同性が高いcDNAを単離する際、肺癌組織を使用することが特に好ましい。
【００３６】
好ましくは、機能的に等価なポリペプチドは、本明細書において開示される天然のCDCA1またはKNTC2の配列との相同性(配列同一性とも呼ばれる)が少なくとも約80％、より好ましくは相同性が少なくとも約85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％であるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの相同性は、「WilburおよびLipman、Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。他の態様において、機能的に等価なポリペプチドは、(下記に定義する)ストリンジェントな条件下で、そのような機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００３７】
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を使用し、CDCA1またはKNTC2の配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いて、CDCA1またはKNTC2に機能的に等価なポリペプチドをコードするDNAを単離することができる。
【００３８】
本発明の文脈において有用なCDCA1またはKNTC2の機能的等価物は、それを作製するために使用する細胞もしくは宿主または使用する精製方法によって、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変形を有してもよい。それでもなお、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドいずれかの機能等価物である限り、それは本発明の範囲内である。
【００３９】
いくつかの好ましい態様において、CDCA1ポリペプチドの機能的等価物は、KNTC2結合ドメインに対応するアミノ酸配列、例えばSEQ ID NO：35のアミノ酸配列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)を含み得る。同様に、KNTC2ポリペプチドの機能的等価物は、CDCA1結合ドメインに対応するアミノ酸配列を含み得る。
【００４０】
上述したように、CDCA1とKNTC2との結合を阻害すると、細胞増殖が抑制される。したがって、この結合を阻害する化合物は、NSCLCを治療または予防するための薬剤として役立つ可能性がある。本発明のスクリーニング方法に使用するCDCA1ポリペプチドおよびKNTC2ポリペプチドは、組み換えポリペプチドもしくは天然由来のタンパク質でよく、または完全長タンパク質の結合能力を保持する限り、その部分ペプチドでもよい。結合能力を保持するこのような部分ペプチドは、本明細書において「機能的等価物」と呼ばれる。スクリーニング方法において使用するCDCA1ポリペプチドおよびKNTC2ポリペプチドは、例えば精製したポリペプチド、可溶性タンパク質、担体に結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【００４１】
CDCA1とKNTC2との結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。例えば、スクリーニングは、細胞系のようなインビトロのアッセイ系として実施することができる。より具体的には、最初にCDCA1またはKNTC2のいずれかを支持体に結合させ、他のタンパク質を試験化合物と共にそこへ添加する。次に、この混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合した他のタンパク質を検出および/または測定する。
【００４２】
タンパク質を結合するのに使用され得る支持体の例には、例えばアガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；好ましくは、上記の材料から調製される市販のビーズおよびプレート(例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど)を使用してもよい。ビーズを使用する場合、これらをカラム中に充填してもよい。または、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより、磁気を介してビーズに結合したタンパク質を容易に単離することが可能になる。
【００４３】
支持体へのタンパク質の結合は、例えば化学的結合および物理的吸着などの常法に従って実施してよい。または、タンパク質は、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合され得る。さらに、支持体へのタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンを用いて実施することもできる。
【００４４】
タンパク質間の結合は、好ましくは緩衝液中で実施され、緩衝液の例には、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液が含まれるがこれらに限定されない。しかしながら、選択される緩衝液は、タンパク質間の結合を阻害してはならない。
【００４５】
本発明の文脈において、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、結合したタンパク質を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーを使用する場合、タンパク質間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いてCDCA1とKNTC2との結合を評価することが可能である。
【００４６】
または、CDCA1またはKNTC2のいずれかを標識してもよく、結合したタンパク質の標識を使用して、結合したタンパク質を検出または測定してもよい。具体的には、これらのタンパク質のうち1種を前標識した後、標識されたタンパク質を、試験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次いで、洗浄後に、結合したタンパク質を標識に従って検出または測定する。
【００４７】
限定されないが、放射性同位体(例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ)、蛍光性物質(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン)、およびビオチン/アビジンを含む標識物質が、本発明の方法においてタンパク質の標識のために使用され得る。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は液体シンチレーションによって実施することができる。または、酵素で標識されたタンパク質は、酵素の基質を添加して、色の生成のような基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、検出または測定することができる。さらに、蛍光物質を標識として使用する場合は、蛍光光度計を用いて結合したタンパク質を検出または測定してもよい。
【００４８】
さらに、CDCA1およびKNTC2の結合は、CDCA1またはKNTC2に対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定されたCDCA1ポリペプチドを試験化合物およびKNTC2と接触させた後、この混合物をインキュベートおよび洗浄し、かつKNTC2に対する抗体を用いて検出および測定を実施することができる。または、KNTC2を支持体上に固定してよく、CDCA1に対する抗体をその抗体として使用してもよい。
【００４９】
本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合、好ましくは抗体を、前述の標識物質の1つで標識し、標識物質に基づいて検出または測定する。または、CDCA1もしくはKNTC2に対する抗体を、標識物質で標識した二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合する抗体は、プロテインGカラムまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定してもよい。
【００５０】
または、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい(「MATCHMAKER Two-Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one-Hybrid system」(Clontech)；「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(Stratagene)；参考文献：「DaltonおよびTreisman, Cell 68：597-612(1992)」、「FieldsおよびSternglanz, Trends Genet 10：286-92(1994)」)。
【００５１】
ツーハイブリッドシステムでは、例えばCDCA1ポリペプチドは、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合され、酵母細胞において発現される。CDCA1ポリペプチドに結合するKNTC2ポリペプチドを、VP16またはGAL4の転写活性化領域に融合し、同様に試験化合物の存在下で酵母細胞において発現される。または、KNTC2ポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域に融合し、かつCDCA1ポリペプチドをVP16またはGAL4の転写活性化領域に融合してもよい。試験化合物がCDCA1とKNTC2との結合を阻害しない場合、これら2種の結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子として、HIS3遺伝子に加え、適切な例には、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養上清液、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、および天然化合物が、本発明のスクリーニング方法の文脈において使用することができる。本発明の試験化合物はまた、限定されないが、(1)生物ライブラリ、(2)空間的にアドレス可能なパラレルな固相ライブラリまたは液相ライブラリ、(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、(4)「1ビーズ1化合物」ライブラリ法、および(5)アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物ライブラリ法は、ペプチドライブラリに限定されるが、他の4種のアプローチは、ペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または化合物の小分子ライブラリに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 12：145-67(1997))。分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において見出すことができる(DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90：6909(1993)；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91：11422-6(1994)；Zuckermann et al., J.Med.Chem. 37：2678-85(1994)；Cho et al., Science 261：1303-5(1993)；Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33：2059(1994)；Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33：2061(1994)；Gallop et al., J.Med.Chem. 37：1233-51(1994))。化合物のライブラリは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 13：412-21(1992)を参照されたい)、またはビーズ上(Lam, Nature 354：82-4(1991))、チップ上(Fodor, Nature 364：555-6(1993))、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698号、第5,403,484号、および第5,223,409号)、プラスミド上(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1865-9(1992))、もしくはファージ上(ScottおよびSmith, Science 249：386-90(1990)；Devlin, Science 249：404-6(1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87：6378-82(1990)；Felici, J.Mol.Biol. 222：301-10(1991)；米国特許出願第20020103360号)に提示され得る。本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験化合物は、単一の化合物または化合物の組み合わせでよい。化合物の組み合わせを本発明のスクリーニング方法において使用する場合、これらの化合物を逐次的にまたは同時に接触させてもよい。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法によって単離される化合物は、例えばNSCLCのような細胞増殖性疾患に起因する疾患を治療または予防するための、CDCA1およびKNTC2の活性を阻害する薬物の候補である。本発明の本スクリーニング方法によって得られた化合物の構造の一部分が、付加、欠失、および/または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。過剰発現された遺伝子、すなわちCDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子の発現の抑制に有効な化合物は、臨床的な利益を有するとみなされ、動物モデルもしくは試験対象において癌細胞増殖を低減させるか、または防止する能力についてさらに試験され得る。
【００５４】
本発明はまた、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合してそれらの相互作用を阻害するタンパク質のスクリーニングも含み得る。このために、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。このようなスクリーニングは、例えば当技術分野において周知の方法を用いる免疫沈降アッセイ法により実施することができる。本発明のタンパク質は、標準的な方法を用いて組み換えにより作製することができる。例えば、関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、およびpCD8など外来遺伝子用の発現ベクター中にその遺伝子を挿入することによって、動物細胞において発現させてもよい。発現に使用するプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターでよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby、Williamson(編), Genetic Engineering, vol. 3.Academic Press, London, 83-141,(1982))、EF-αプロモーター(Kim et al., Gene 91, 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108：193(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 8：466-72(1988))、CMV最初期プロモーター(SeedおよびAruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987)))、SV40後期プロモーター(GheysenおよびFiers, J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9：946-58(1989))、HSV TKプロモーターなどが含まれる。外来遺伝子を発現させるための、動物細胞中への遺伝子の導入は、任意の従来の方法、例えばエレクトロポレーション法(Chu et al., Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、リン酸カルシウム法(ChenおよびOkayama, Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；SussmanおよびMilman, Mol Cell Biol 4：1641-3(1984))、リポフェクチン法(Derijard B, Cell 76：1025-37(1994)；Lamb et al., Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al., Science 259：230-4(1993))などに従って実施することができる。ポリペプチドはまた、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を含む融合タンパク質としても発現させることができる。市販されているエピトープ-抗体系もまた、使用することができる(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。例えば、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニング部位を用いることにより発現できるベクターが市販されている。
【００５５】
融合によって元のポリペプチドの特性を変更しないように、数個〜数十個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することによって調製した融合タンパク質もまた、本明細書において提供される。ポリヒスチジン(His-タグ)、インフルエンザ凝集体HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7-タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSV-タグ)、E-タグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)などのエピトープ、ならびにそれらを認識するモノクローナル抗体が、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ-抗体系として使用され得る(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。
【００５６】
免疫沈降法では、適切な洗浄剤を用いて調製した細胞溶解物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチド、そのポリペプチドに対する結合親和力を有するポリペプチド、および抗体から構成される。免疫沈降法はまた、上記のエピトープに対する抗体に加え、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を用いて実施することもでき、これらの抗体は、従来の方法に従って調製することができ、かつモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態でよく、例えばウサギなどの動物をそのポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに組み換え抗体(例えばヒト化抗体)が含まれる。
【００５７】
具体的には、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体は、当技術分野において周知の技術を用いて調製することができる。例えば、抗体を得るために抗原として使用するCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドは、任意の動物種に由来してよいが、好ましくはヒト、マウス、ウサギ、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。抗原として使用するポリペプチドは、組み換えによって作製するか、または天然源から単離することができる。本発明の文脈において、免疫抗原として使用するポリペプチドは、完全なタンパク質またはCDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチドの部分ペプチドでよい。
【００５８】
任意の哺乳動物を抗原で免疫してよい。しかしながら好ましくは、細胞融合に使用する親細胞との適合性が考慮される。一般に、げっ歯目(Rodentia)、ウサギ目(Lagomorpha)、または霊長目(Primate)の動物を使用する。げっ歯目の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えば野ウサギ、ナキウサギ、およびウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目(Catarrhini)のサル(旧世界ザル)が含まれる。
【００５９】
動物を抗原で免疫するための方法は、当技術分野において周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的に、抗原は、適切な量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、生理食塩水などに希釈および懸濁してもよい。所望の場合、抗原懸濁液を、適切な量のフロイント完全アジュバントのような標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにし、次いで哺乳動物に投与してよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を4日〜21日毎に数回投与する。適切な担体もまた、免疫化のために使用され得る。前述の免疫化の後、標準的な方法により、血清を所望の抗体の量の増加に関して検査する。
【００６０】
CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して検査した免疫化哺乳動物から血液を採取することによって、および任意の従来の方法によりその血液から血清を分離することによって、調製してもよい。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含む血清、ならびに血清から単離されたポリクローナル抗体を含む画分が含まれる。免疫グロブリンGまたは免疫グロブリンMは、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドのみを認識する画分から、例えばそのポリペプチドが結合したアフィニティカラムを用い、さらにプロテインAカラムまたはプロテインGカラムを用いてこの画分を精製して、調製することができる。
【００６１】
モノクローナル抗体を調製するために、前述したように抗原で免疫し、かつ血清中の所望の抗体のレベルの上昇を確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、かつそれらを細胞融合に供する。細胞融合のために使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、例えば哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、薬物によって融合された細胞の選択のための獲得された性質を有する骨髄腫細胞が含まれる。
【００６２】
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えばMilsteinらの方法(GalfreおよびMilstein, Methods Enzymol 73：3-46(1981))に従って融合することができる。
【００６３】
細胞融合により得られる、結果として生じるハイブリドーマは、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地)のような標準的な選択培地中でそれらを培養することによって選択することができる。典型的に、HAT培地中で数日間〜数週間、所望のハイブリドーマを除く他の細胞(非融合細胞)すべてを死滅させるのに充分な期間、細胞培養を継続する。次いで、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローン化する。
【００６４】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染させたものなどのヒトリンパ球を、CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチド、このようなポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物でインビトロで免疫してもよい。次いで、免疫されたリンパ球を、U266のような無制限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合できる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る(特開昭(JP-A)63-17688号)。
【００６５】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔中に移植し、腹水を取り出してよい。得られたモノクローナル抗体は、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、プロテインAカラムもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明の標的タンパク質(CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチド)のいずれかが結合したアフィニティカラムによって、精製することができる。この抗体は、本発明のスクリーニング方法においてだけでなく、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドの精製および検出のためにも使用することができる。それらはさらに、関心対象のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補にもなり得る。さらに、アンタゴニストの候補となるこのような抗体は、後述のNSCLCを含むCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに関係した疾患の抗体治療に適用することができる。
【００６６】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組み換えによって調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTDによって英国で出版されたBorrebaeckおよびLarrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990)を参照されたい)。例えば、ある抗体をコードするDNAを、その抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローン化し、適切なベクター中に挿入し、かつ宿主細胞中に導入して、組み換え抗体を調製してよい。このような組み換え抗体は、本発明のスクリーニングの文脈においても使用することができる。
【００６７】
さらに、スクリーニングなどにおいて使用する抗体は、CDCA1およびKNTC2の一方または両方に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結される単鎖Fv(scFv)でよい(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。より具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい(例えば、Co et al., J Immunol 152：2968-76(1994)；BetterおよびHorwitz, Methods Enzymol 178：476-96(1989)；PluckthunおよびSkerra, Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121：663-9(1986)；BirdおよびWalker, Trends Biotechnol 9：132-7(1991)を参照されたい)。
【００６８】
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)のような様々な分子と結合させることによって、修飾してもよい。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は、当技術分野において常識である。
【００６９】
または抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とのキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR)および定常領域から構成されるヒト化抗体として、得ることもできる。このような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。
【００７０】
ヒト化は、げっ歯動物のCDRまたはCDR配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる(例えば、Verhoeyen et al., Science 239：1534-6(1988)を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されるキメラ抗体である。ヒトのフレームワークおよび定常領域に加えて、ヒト可変領域から構成される完全なヒト抗体もまた使用することができる。このような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組み換えライブラリの使用を含む(例えば、HoogenboomおよびWinter, J.Mol.Biol. 227：381-8(1992))。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することができる。このアプローチは、例えば米国特許第6,150,584号、第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号において記載される。
【００７１】
前述のように得られた抗体を、均一になるまで精製してよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用する分離方法および精製方法に従って実施することができる。例えば抗体は、適切に選択し組み合わせた、アフィニティクロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などによって、分離および単離してもよい(Antibodies：A Laboratory Manual. Ed HarlowおよびDavid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用する例示的なプロテインAカラムには、例えばHyper D、POROS、およびセファロース F.F(Pharmacia)が含まれる。
【００７２】
アフィニティクロマトグラフィーを除き、例示的なクロマトグラフィーには、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。クロマトグラフィーの方法は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
【００７３】
抗体がマウスIgG抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースを用いて沈殿させることができる。CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドが、GSTのようなエピトープとの融合タンパク質として調製される場合、グルタチオン-セファロース4Bのような、これらのエピトープに特異的に結合する物質を用いて、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同じ様式で、免疫複合体を形成することができる。
【００７４】
免疫沈降法は、例えば文献(HarlowおよびLane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))中の方法にならって、または従って、実施することができる。
【００７５】
SDS-PAGEは、免疫沈降させたタンパク質の解析に通常使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度のゲルを用いてそのタンパク質の分子量によって解析することができる。CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合するタンパク質は、クーマシー染色または銀染色など従来の染色方法で検出することが困難であるため、このタンパク質に対する検出感度は、放射性同位体である35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培地中で細胞を培養し、細胞中のタンパク質を標識し、これらのタンパク質を検出することによって改善することができる。標的タンパク質は、SDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、そのタンパク質の分子量が明らかにされた場合は、その配列を決定することができる。
【００７６】
CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合する化合物もまた、アフィニティクロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることができる。例えば、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドは、アフィニティカラムの担体上に固定してもよく、試験化合物をそのカラムに添加する。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞溶解物などでよい。試験化合物を添加した後、カラムを洗浄し、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。
【００７７】
試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、その配列に基づいてオリゴDNAを合成し、かつそのオリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、そのタンパク質をコードするDNAを得る。
【００７８】
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、本発明において結合した化合物を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーを使用する場合、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドと試験化合物との相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いてCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
【００７９】
固定されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドを、合成化学化合物、または天然物質バンクもしくはランダムペプチドファージディスプレイライブラリに曝露させた場合に結合する分子をスクリーニングする方法、ならびにCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質に結合するタンパク質だけでなく化学化合物(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)も単離する、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを用いたスクリーニング方法(Wrighton et al., Science 273：458-64(1996)；Verdine, Nature 384：11-3(1996))は、当業者に周知である。
【００８０】
個体の遺伝子構成の差異が、様々な薬物を代謝する相対的な能力の差をもたらす可能性がある。対象中で代謝されて抗NSCLC物質として作用する化合物は、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化させることができる。したがって、本明細書において開示される、差次的に発現されるCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞(または試験細胞集団)において候補化合物を試験することによって、対象に特異的に適した推定上のNSCLCの治療用または予防用阻害剤を選択することが可能になる。
【００８１】
個々の対象にとって適切な抗NSCLC物質を同定するために、対象由来の試験細胞または試験細胞集団を治療物質に曝露し、かつCDCA1遺伝子もしくはKNTC2遺伝子の1つまたは複数の発現を決定する。
【００８２】
試験細胞がCDCA1遺伝子もしくはKNTC2遺伝子を発現するNSCLC細胞であるか、または試験細胞集団が該NSCLC細胞を含む。好ましくは、試験細胞または試験細胞集団は肺細胞を含む。例えば、試験細胞または試験細胞集団は、候補物質の存在下でインキュベートしてよく、かつ試験細胞または試験細胞集団の遺伝子発現パターンを測定し、1種または複数種の参照プロファイル、例えばNSCLCの参照発現プロファイルまたは非NSCLCの参照発現プロファイルと比較してもよい。
【００８３】
NSCLCを含む参照細胞集団と比較して試験細胞または試験細胞集団におけるCDCA1またはKNTC2の発現が減少する場合、その物質が治療的に有効であることが示唆される。
【００８４】
NSCLCを治療または予防するための方法
本発明はさらに、対象においてNSCLCを治療、緩和、または予防するための方法を提供する。治療的化合物を、NSCLCに罹患するか、またはNSCLCを発症するリスクがある(もしくは発症しやすい)対象に予防的または治療的に投与してもよい。標準的な臨床的方法を用いて、またはCDCA1もしくはKNTC2の遺伝子もしくはポリペプチドの異常な発現レベルもしくは活性を検出することによって、このような対象を特定する。疾患もしくは障害が予防されるか、またはその進行が遅延されるように、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に予防的投与を実施する。
【００８５】
本発明の方法は、NSCLC細胞が由来する同じ組織型の正常細胞と比較して、NSCLC細胞において発現が異常に増大する遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物の発現もしくは機能、または両方を低減させることを含む。発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害してもよい。例えば、対象中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の量を減少させる有効量の化合物で、対象を処置してもよい。化合物の投与は全身的または局所的でよい。このような治療的化合物には、NSCLC細胞中に内因的に存在するこのような遺伝子の発現レベルを低下させる化合物(すなわち、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現を下方制御する化合物)が含まれる。このような治療的化合物の投与は、対象のNSCLC細胞中の異常に過剰発現された遺伝子の影響に対抗し、対象の臨床状態が改善すると予想される。このような化合物は、前述した本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
【００８６】
または、CDCA1もしくはKNTC2の発現は、過剰発現された遺伝子の発現を阻害するか、またはそれに拮抗する核酸を対象に投与することによって阻害することができる。過剰発現された遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはリボザイムを、過剰発現された遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。
【００８７】
上記のように、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかに対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、その遺伝子の発現レベルを低下させることができる。NSCLCにおいて上方制御されるCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、NSCLCの治療または予防において有用である。具体的には、これらの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの遺伝子によってコードされた対応するポリペプチドのいずれか、もしくはそれに対応するmRNAに結合し、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/またはCDCA1ヌクレオチドもしくはKNTC2ヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を阻害し、最終的にそれらのタンパク質の機能を阻害することによって、作用し得る。本明細書において使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列に完全に相補的であるヌクレオチドおよび1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するものの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかの少なくとも15個の連続的ヌクレオチドから最長で完全長配列までの範囲に渡って、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性(配列同一性とも呼ばれる)を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、相同性を決定することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物もまた、本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用され得る。このような修飾産物の例には、メチルホスホナート型またはエチルホスホナート型などの低級アルキルホスホナート修飾、ホスホロチオアート修飾、およびホスホロアミダート修飾が含まれる。
【００８８】
本発明のsiRNA分子はまた、本明細書において開示される遺伝子由来のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする能力によって定義することができる。本発明の文脈において、「ハイブリダイズする」および「特異的にハイブリダイズする」という用語は同義的に使用され、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下でハイブリダイズする2つの核酸分子の能力を意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、ある核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中でその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況においては異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHにおける個々の配列の熱融点(Tm)より約5℃〜10℃低くなるように選択される。Tmは(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するため、Tmでは50％のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベーションし、0.2×SSCおよび0.1％SDS中、50℃で洗浄。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子よってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して、そのタンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害すことによって作用し、それによってタンパク質機能の阻害がもたらされる。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、その誘導体に対して不活性である適切な基材と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
【００９０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子よってコードされる少なくとも1種のタンパク質の発現を阻害し、したがってそれぞれのタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。
【００９１】
過剰発現された遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物を阻害するポリヌクレオチドには、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子によってコードされる過剰発現タンパク質をコードするヌクレオチド配列のセンス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせから構成される低分子干渉RNA(siRNA)も含まれる。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を意味する。DNAがRNAの転写元の鋳型であるものを含む、siRNAを細胞中に導入する標準技術は、本発明の治療または予防において使用することができる。siRNAは、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方、例えばヘアピンを有するように構築される。
【００９２】
この方法は、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現が上方制御される細胞の遺伝子発現を抑制するのに使用される。標的細胞中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の転写物にsiRNAが結合すると、細胞によるCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも約10ヌクレオチドであり、天然の転写物と同じくらい長くてよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、約75、約50、または約25ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、約19〜約25ヌクレオチド未満である。本発明において使用される好ましいsiRNAは、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]はCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は約3個〜約23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。本明細書において、「CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の標的配列」という語句は、NSCLC細胞株中に導入された場合、細胞生存を抑制するのに効果的である配列を意味する。
【００９３】
好ましいsiRNAは、センス鎖中にSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有し、KNTC2遺伝子の発現を低減させるsiRNAである。siRNAは、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]はSEQ ID NO：9に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから構成されるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。
【００９４】
さらにsiRNAのヌクレオチド配列は、Ambion社のウェブサイト(http：//www.ambion.com/techlib/ misc/siRNA_finder.html)から入手可能なsiRNA設計コンピュータプログラムを用いて設計してもよい。siRNAのためのヌクレオチド配列は、以下のプロトコールに基づくコンピュータプログラムによって選択してもよい。
【００９５】
siRNA標的部位の選択：
1．転写物のAUG開始コドンから開始して、下流へとスキャンしてAAジヌクレオチド配列を探す。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschl, et al. Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)では、5'および3'の非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン近傍の領域(75塩基以内)が調節タンパク質結合部位においてより豊富である可能性があり、したがってエンドヌクレアーゼとこれらの領域に対して設計されたsiRNAとの複合体は、UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体の結合を妨害し得ることから、これらの領域に対するsiRNAを設計することを推奨していない。
2.潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、かつ他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、BLAST(Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997；25：3389-402.；J Mol Biol. 1990；215：403-10)を用いて実施することができ、これはNCBIサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。Ambionのウェブサイトでは、評価のためにいくつかの好ましい標的配列を遺伝子の全長に沿って選択することができる。
【００９６】
本発明のsiRNAポリヌクレオチドを発現するベクターのトランスフェクションを用いて、NSCLC細胞の増殖を阻害することができる。したがって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、CDCA1またはKNTC2に対するsiRNAとして機能する二本鎖分子、ならびにその二本鎖分子をコードするベクターを提供することが、本発明の別の局面である。
【００９７】
本発明の二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖はCDCA1標的配列またはKNTC2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列であり、該センス鎖および該アンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子は、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する。
【００９８】
本発明の二本鎖分子は、その本来の環境(すなわち、それが天然分子である場合、天然の環境)に由来するポリヌクレオチドでよく、その天然の状態から物理的もしくは化学的に改変されてもよく、または化学的に合成されてもよい。本発明によれば、このような二本鎖分子には、DNA、RNA、およびそれらの誘導体から構成されるものが含まれる。DNAは、A、T、C、およびGなどの塩基から適切に構成され、かつTはRNA中ではUに置き換えられる。
【００９９】
本発明のベクターは好ましくは、本発明の二本鎖分子をコードする領域に隣接し、適切な細胞においてその分子の発現を指示する調節配列を含む。例えば本発明の二本鎖分子は、例えば核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位またはヒトH1 RNAプロモーターを含むベクター中にそれらのコード配列をクローニングすることにより、細胞内で転写される。
【０１００】
または、その発現(DNA分子の転写)を可能にする様式で、目的の配列がベクターの調節配列に機能的に連結されるように、例えば発現ベクター中に標的配列をクローニングすることによって、本発明のベクターを作製することができる(Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology 20：500-5(2002))。例えば、標的配列に対するアンチセンス配列を有するRNA分子の転写は、第1のプロモーター(例えば、クローン化DNAの3'末端に連結されたプロモーター配列)によって駆動され得、かつ標的配列に対するセンス配列を有するものは、第2のプロモーター(例えば、クローン化DNAの5'末端に連結されたプロモーター配列)によって駆動され得る。発現されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は、インビボで互いにハイブリダイズして、標的配列を含む遺伝子をサイレンシングするsiRNA構築物を生じる。さらに、2つの構築物(ベクター)を使用して、siRNA構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ作製してもよい。
【０１０１】
細胞中にベクターを導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。FuGENE6(Roche diagnostice)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(Wako pure Chemical)が、トランスフェクション促進剤として有用である。
【０１０２】
過剰発現された遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物を阻害する核酸には、そのような遺伝子に対するリボザイムも含まれる。本発明の文脈において、リボザイムは、過剰発現されるCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の発現を阻害し、それによってそのようなタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。したがって、このようなリボザイムから構成される組成物は、NSCLCを治療または予防するのに有用である。
【０１０３】
一般に、リボザイムは、大型リボザイムおよび小型リボザイムに分類される。大型リボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断する酵素として公知である。大型リボザイムとの反応後、反応した部位は、5'-リン酸基および3'-ヒドロキシル基からなる。大型リボザイムはさらに、(1)グアノシンによる5'-スプライス部位でのエステル転移反応を触媒するグループIイントロンRNA、(2)ラリアット構造を経た2段階反応による自己スプライシングを触媒するグループIIイントロンRNA、および(3)加水分解により、5'部位でtRNA前駆体を切断するリボヌクレアーゼPのRNA構成要素に分類される。これに対して、小型リボザイムは、大型リボザイムと比較してサイズが小さく(約40bp)、RNAを切断して5'-ヒドロキシル基および2'-3'環状リン酸を生じさせる。ハンマーヘッド型リボザイム(Koizumi et al., FEBS Lett. 228：225(1988))およびヘアピン型リボザイム(Buzayan, Nature 323：349(1986)；KikuchiおよびSasaki, Nucleic Acids Res. 19：6751(1991))は、小型リボザイムに含まれる。リボザイムを設計および構築するための方法は当技術分野において公知であり(Koizumi et al., FEBS Lett. 228：225(1988)；Koizumi et al., Nucleic Acids Res. 17：7059-71(1989)；KikuchiおよびSasaki, Nucleic Acids Res. 19：6751-5(1991)を参照されたい)、過剰発現されるNSCタンパク質の発現を阻害するリボザイムは、リボザイムを作製するための従来の方法に従って、CDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質をコードするヌクレオチド配列の配列情報に基づいて構築することができる。
【０１０４】
または、過剰発現される遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物の機能は、この遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。このような化合物の例は、過剰発現される1種または複数種の遺伝子産物に結合する抗体である。
【０１０５】
本発明は、抗体、特に上方制御された遺伝子CDCA1もしくはKNTC2のいずれかよってコードされるタンパク質に対する抗体、またはそのような抗体の断片の使用に関する。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用する抗原(すなわち、上方制御された遺伝子産物)を含む分子またはそれに密接に関連した抗原と特異的に相互作用(結合)する、特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。過剰発現されたCDCA1またはKNTC2ヌクレオチドに結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態でよく、ウサギなどの動物をポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組み換えによって作製されるヒト化抗体が含まれる。さらに、NSCLCを治療または予防する本発明の方法において使用する抗体は、マーカー遺伝子(CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子)によってコードされる1種または複数種のタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でもよい。NSCLCを治療または予防する本発明の方法の文脈において使用する抗体および抗体断片は、修飾されてよく、化学的に修飾された抗体およびキメラ抗体が含まれる。このような抗体および抗体断片は、前記の上述した方法に従って得ることができる。
【０１０６】
得られた抗体がヒトの身体に投与される場合(抗体治療)、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を、CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチドなどの抗原、そのポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物で免疫してもよい。次いで、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、そこからポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる(WO92-03918、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735、およびWO96-34096を参照されたい)。
【０１０７】
または、免疫されたリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するのに使用してもよい。本発明は、過剰発現されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を用いてNSCLCを治療または予防するための方法を提供する。この方法に従い、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する。過剰発現されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体は、CDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の活性を低下させるのに充分な投薬量で投与される。または、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する抗体を薬物送達のためのツールとして使用することもできる。したがって、例えば細胞毒性薬と結合した、過剰発現されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を、腫瘍細胞を損傷するのに充分な投薬量で投与してもよい。
【０１０８】
さらに、本明細書において開示するタンパク質のドミナントネガティブ変異体を使用して、NSCLCを治療または予防することもできる。例えば本発明は、ドミナントネガティブな効果を有するCDCA1変異体、またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法を提供する。CDCA1変異体は、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を含んでよく、そのnuf2ドメインは含まない。CDCA1変異体は、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有し得る。
【０１０９】
いくつかの好ましい態様において、CDCA1変異体は膜導入物質に連結している。いくつかのペプチド配列が、生細胞中に移行する能力について特徴付けられており、本発明のこの目的のために使用され得る。このような膜導入物質(典型的にはペプチド)は、内部移行後、生細胞中の細胞質コンパートメントおよび/または核コンパートメントに到達する能力によって定義される。導入物質が由来し得るタンパク質の例には、HIV Tatトランス活性化因子1、2、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)転写因子アンテナペディア3が含まれる。さらに、導入活性を有する非天然ペプチドも使用される。これらのペプチドは典型的に、移行に関して試験される膜相互作用特性が公知である小型ペプチドである。K-線維芽細胞増殖因子(FGF)、ハチ毒素マストパラン(トランスポータン)13、およびBuforin I14(両生類の抗菌ペプチド)の分泌シグナル配列内の疎水性領域が、導入物質として有用であることが示される。本発明において有用な両生類物質の総説については、Joliot et al. Nature Cell Biology 6：189-196(2004)を参照されたい。
【０１１０】
CDCA1変異体は、一般式
[R]-[D]
を有してもよく、式中[R]は膜導入物質であり、[D]はSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一般式において、[R]は[D]と直接結合してよく、またはリンカーを介して間接的に[D]と結合してよい。複数の官能基を有するペプチドまたは化合物がリンカーとして使用され得る。具体的には、アミノ酸配列-GGG-がリンカーとして使用され得る。または、膜導入物質およびSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、微小粒子の表面に結合することができる。本発明において、[R]は[D]の任意の領域と結合してよい。例えば[R]は、[D]のN末端もしくはC末端、または[D]を構成するアミノ酸残基の側鎖と結合してよい。さらに、複数の分子の[R]が、1分子の[D]と結合してもよい。いくつかの態様において、複数の分子の[R]が[D]の異なる部位と結合してよい。別の態様において、[D]は相互に連結されたいくつかの[R]で修飾されてよい。
【０１１１】
膜導入物質は、以下に挙げる群より選択することができる；
[ポリアルギニン]；Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-6007(2003)
[Tat/RKKRRQRRR](SEQ ID NO：37)Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93(1988)
Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88(1988)
[ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK](SEQ ID NO：38)
Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50(1994)
[Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](SEQ ID NO：39)
Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50(2000)
[トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](SEQ ID NO：40)
Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77(1998)
[MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA](SEQ ID NO：41)
Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39(1998)
[K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP](SEQ ID NO：42)
Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258(1995)
[Ku70/VPMLK](SEQ ID NO：43)
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003)
[Ku70/PMLKE](SEQ ID NO：50)
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003)
[プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](SEQ ID NO：44)
Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90(2002)
[pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK](SEQ ID NO：45)
Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44(2001)
[Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](SEQ ID NO：46)
Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-76(2001)
[SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR](SEQ ID NO：47)
Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86(2000)
[Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY](SEQ ID NO：48)
Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65(2002)
[HN-1/TSPLNIHNGQKL](SEQ ID NO：49)
Hong, F. D. & Clayman, G. L. Cancer Res. 60, 6551-6(2000)。
【０１１２】
本発明において、ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は限定されていない。いくつかの好ましい態様において、5個〜20個の連続的なアルギニン残基が例示され得る。好ましい態様において、ポリアルギニンのアルギニン残基の数は11個である(SEQ ID NO：36)。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「CDCA1のドミナントネガティブな断片」という語句は、KNTC2と複合体を形成することができるCDCA1の変異型を意味する。したがって、ドミナントネガティブな断片は、完全長CDCA1ポリペプチドに機能的に等価ではないものである。好ましいドミナントネガティブな断片は、KNTC2結合領域を含み、そのnuf2ドメインは含まないものである。
【０１１４】
NSCLCを治療または予防するための薬学的組成物
本発明は、CDCA1遺伝子もしくはKNTC2遺伝子の発現または活性を改変する化合物をスクリーニングする本発明の方法によって選択された化合物を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物を提供する。このような活性成分は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、その遺伝子に対するsiRNAもしくはリボザイム、または発現ベクターのような、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、もしくはリボザイムの誘導体でもよい。
【０１１５】
本発明のスクリーニング方法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患(例えば非小細胞肺癌)を治療するために、ヒト、およびマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、またはチンパンジーなど他の哺乳動物用の薬剤として投与する場合、単離された化合物は直接投与するか、または従来の薬学的調製方法を用いて剤形へ製剤化することもできる。本発明の組成物のこのような薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与(頬側および舌下を含む)、膣内投与もしくは非経口投与(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)、または吸入もしくは吹入による投与に適したものが含まれる。製剤は任意で、個別の投薬単位で包装されてもよい。
【０１１６】
経口投与に適した薬学的製剤には、限定されないが、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれ、それぞれ、所定の量の活性成分を含む。例示的な製剤には、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤もさらに含まれる。活性成分は任意で、ボーラス舐剤、またはペースト剤として投与される。経口投与に適した錠剤およびカプセル剤は、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、および/または湿潤剤など従来の賦形剤を含んでよい。錠剤は、任意で1種または複数種の製剤用成分と共に、圧縮または成形することによって製造してもよい。粉末または顆粒など易流動性の形態の活性成分を、任意で結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械中で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって、成形錠剤を製造してもよい。当技術分野において周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶剤を用いて溶解するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油を含んでよい)、または保存剤など従来の添加剤を含んでよい。錠剤を任意で、インビボでの活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤のパッケージは、各月に服用されるべき1つの錠剤を含んでよい。これらの製剤中の薬剤の配合および用量により、指定された範囲内の適切な投薬量が取得できるようになる。
【０１１７】
非経口投与用の例示的な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象とするレシピエントの血液とその製剤を等張性にする溶質を任意で含む、水性および非水性の無菌注射液剤、ならびに限定されないが懸濁化剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を、単位投与用容器または複数回投与用容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用する直前に、無菌の液体担体、例えば生理食塩水、注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０１１８】
直腸投与用の例示的な製剤には、ココアバターまたはポリエチレングリコールなど標準的な担体を伴う坐剤が含まれる。口に、例えば口腔内または舌下に局所投与するための製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの風味付きの基剤中に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、スクロース、またはアラビアゴムなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻腔内投与する場合、液体スプレーもしくは分散性の散剤、または滴剤の形態で使用され得る。滴剤はまた、1種もしくは複数種の分散剤、可溶化剤、もしくは懸濁化剤もまた含む水性または非水性の基剤と共に製剤化することができる。
【０１１９】
吸入による投与の場合、組成物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から都合よく送達してもよい。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など適切な噴射剤を含み得る。加圧したエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。
【０１２０】
または、吸入もしくは吹入による投与の場合、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分とラクトースまたはデンプンなど適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックに入れて提供されてもよく、散剤は、吸入器または注入器の補助によりこれらから投与され得る。
【０１２１】
他の適切な製剤には、治療物質を放出する、埋め込み可能な器具および接着性のパッチが含まれる。
【０１２２】
所望の場合には、前述の製剤は、活性成分の持続放出を提供するように適合され得る。薬学的組成物はまた、限定されないが、抗菌剤、免疫抑制剤、および保存剤を含む他の活性成分も含んでよい。
【０１２３】
具体的に前述した成分に加えて、本発明の製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的な他の物質を含み得ること、例えば経口投与に適したものは矯味剤を含み得ることが、理解されるべきである。
【０１２４】
好ましい単位投薬製剤は、後述するような有効な用量の活性成分またはその適切な分割量を含むものである。
【０１２５】
前述した各状態に対して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、1日当たり約0.1 mg/kg〜約250 mg/kgの用量で経口的に、または注射によって投与され得る。ヒト成人に対する用量範囲は、一般に約5 mg/日〜約17.5 g/日、好ましくは約5 mg/日〜約10 g/日、および最も好ましくは約100 mg/日〜約3 g/日である。錠剤、または個別の単位で提供される形態の他の単位剤形は、便宜的に、そのような投薬量で、またはその倍数量として効果的である量を含んでよく、例えば各単位は、約5 mg〜約500 mg、通常約100 mg〜約500 mgを含む。
【０１２６】
使用する用量は、対象の年齢および性別、治療される厳密な疾患およびその重症度を含む、いくつかの要因に依存すると考えられる。同様に、投与経路も、状態およびその重症度に応じて異なってよい。
【０１２７】
上記のように、本発明はさらに、過剰発現される遺伝子の発現を阻害する活性成分を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物も提供する。活性成分は、その誘導体に対して不活性である適切な基剤材料と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
【０１２８】
同様に必要に応じて、活性成分は、賦形剤、等張化剤、可溶化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することによって、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することができる。これらは、核酸を含む薬剤を調製するための従来の方法に従って調製することができる。
【０１２９】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、siRNA誘導体、またはリボザイム誘導体は、患部に直接適用することによって、または疾患部位に到達するように血管中に注射することによって、患者に与えられる。封入剤もまた、耐久性および膜透過性を高めるために、組成物中で使用することができる。封入剤の例には、リポソーム、ポリ-L-リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、およびそれらの誘導体が含まれる。
【０１３０】
このような組成物の投薬量を、患者の状態によって適切に調整し、所望の量で使用することができる。例えば、0.1 mg/kg〜100 mg/kg、好ましくは0.1 mg/kg〜50 mg/kgの用量範囲を投与することができる。
【０１３１】
本発明の別の態様は、CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチドに対する抗体、またはそのポリペプチドに結合する抗体の断片から構成される、NSCLCを治療または予防するための組成物である。
【０１３２】
投薬量は症状によって変動し得るが、NSCLCを治療または予防するための抗体またはその断片の例示的な用量は、通常の成人(体重60 kg)に経口投与する場合、1日当たり約0.1 mg〜約100 mg、好ましくは1日当たり約1.0 mg〜約50 mg、およびより好ましくは1日当たり約1.0 mg〜約20 mgである。
【０１３３】
通常の成人(体重60 kg)への注射の形態で非経口的に投与する場合、患者の状態、疾患の症状、および投与方法によっていくらかの違いはあるが、1日当たり約0.01 mg〜約30 mg、好ましくは1日当たり約0.1 mg〜約20 mg、およびより好ましくは1日当たり約0.1 mg〜約10 mgの用量を静脈内注射することが好都合である。同様に、他の動物の場合も、体重60 kgに変換した量を投与することが可能である。
【０１３４】
本明細書において同定される差次的に発現されるCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子はまた、NSCLCの治療の経過を予測またはモニターすることを可能にし得る。この方法では、試験生物試料は、NSCLCの治療を受けている対象から提供される。所望の場合は、複数の試験生物試料が、様々な時点、例えば治療前、治療中、または治療後に対象から採取される。次いで、試料中の1つまたは複数のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現レベルを決定し、かつ治療を受けていないNSCLCの公知の状態を有する参照試料と比較する。本発明のいくつかの好ましい態様において、CDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子の両方の発現レベルが検出してもよい。
【０１３５】
参照試料がNSCLC細胞を含まない場合、試験生物試料および参照試料中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現レベルが類似するならば、治療の有効性が示唆される。しかしながら、試験中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現レベルが参照試料と比較して異なるならば、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示唆される。本発明の文脈において、予後の好ましい患者から得たNSCLC細胞を、参照試料として使用してもよい。例えば一般に、患者が手術後5年より長く生存できた場合、患者の予後は良好であった。より具体的には、長期生存者(すなわち予後良好)群および短期生存者(すなわち予後不良)群は、腫瘍特異的5年生存率の平均がそれぞれ69％超および45％未満であった患者を含む。したがって、このような短期生存者に由来し、かつ強い染色を示す試料は、予後不良の陽性対照として使用することができる。または、患者由来の試料の代わりに、患者由来の試料と同様の強い染色を示す試料または肺癌細胞株も、陽性対照として使用することができる。さらに、いくつかの態様において、CDCA1およびKNTC2を発現していない正常な肺細胞、肺癌細胞、または他の細胞を、予後不良の陰性対照として使用することができる。
【０１３６】
本発明はまた、以下からなる群より選択される1つまたは複数の構成要素を含む、NSCLCの予後を予測するためのキットも含む：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【０１３７】
いくつかの好ましい態様において、(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出するための試薬は、CDCA1核酸またはKNTC2核酸に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、CDCA1核酸もしくはKNTC2核酸に特異的に結合するか、またはそれを特定する核酸でよい。具体的には、SEQ ID NO：34(CDCA1)およびSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：33 およびSEQ ID NO：31のヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、SEQ ID NO：33およびSEQ ID NO：31のヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の好ましいプライマーまたはプローブとして使用され得る。または、本発明において、(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出するための試薬は、CDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質に結合する抗体でよい。さらに、(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬も、本発明のキットのために使用され得る。これらの検出試薬は、キットの形態で一緒に包装してもよい。これらの試薬、例えば(固体マトリックスに結合するか、もしくはマトリックスにそれらを結合させるための試薬と共に別々に包装される)核酸もしくは抗体、対照試薬(陽性および/もしくは陰性)、ならびに/または検出可能な標識は、好ましくは、別々の容器に包装される。アッセイ法を実施するための取扱い説明書(例えば、文書、テープ、VCR、CD-ROMなど)もキットに含まれてよい。キットのアッセイ形式は、ノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAでよく、いずれも当技術分野において公知である。
【０１３８】
例えば検出試薬を、多孔質ストリップのような固体マトリックス上に固定して、少なくとも1つのNSCLC検出部位を形成させてもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸を含む複数の部位を含んでよい。テストストリップは、陰性対照および/または陽性対照用の部位も含んでよい。または対照部位を、テストストリップとは別のストリップ上に配置してもよい。任意で異なる検出部位が、異なる量の固定された核酸を含んでもよく、すなわち第1の検出部位により多くの量を含み、次の部位により少ない量を含んでもよい。試験試料を添加した際、検出可能なシグナルを提示する部位の数が、試料の予後の定量的な指標を提供する。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で構成されてよく、典型的には、テストストリップの幅にわたる棒または点の形状である。
【０１３９】
以下の実施例は、本発明を例示し、かつ当業者がそれらを作製および使用するのを補助するために提供される。これらの実施例は、本発明の範囲を他の方法で限定することを決して意図しない。他に規定しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を後述する。本明細書において引用される任意の特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み入れられる。
【０１４０】
実施例
以下の実施例は、特許請求される本発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【０１４１】
材料および方法
(a)肺癌細胞株および組織試料：
以下のプロトコールにおいて使用したヒト肺癌細胞株は、以下のとおりであった：肺腺癌(ADC)A427、A549、LC319、PC3、PC9、PC14、NCI-H23、NCI-H522、およびNCI-H1373；細気管支肺胞上皮細胞癌(BAC)NCI-H1666およびNCI-H1781；肺腺扁平上皮癌(ASC)NCI-H226およびNCI-H647；肺扁平上皮癌(SCC)RERF-LC-AI、SK-MES-1、EBC-1、LC176、LU61、NCI-H520、NCI-H1703、およびNCI-H2170；肺大細胞癌(LCC)LX1；ならびに小細胞肺癌(SCLC)DMS114、DMS273、SBC-3、およびSBC-5。細胞はすべて、10％ウシ胎児血清(FCS)を添加した適切な培地中で単層で増殖させ、かつ5％CO2を含む加湿大気雰囲気中、37℃で維持した。ヒト小気道上皮細胞(SAEC)を、Cambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)から購入した、最適化された培地(SAGM)中で増殖させた。22個はADCに、14個はSCCに、1個はASCに分類された原発性NSCLC試料は、以前に記載されたように(Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003；22(14)：2192-205)、インフォームドコンセントを書面で得た患者37名から得られた。さらに、8個のADCおよび8個のSCCを含む、独立した16個の原発性NSCLCを、外科手術を受けている患者から、隣接した正常肺組織試料と共に得た。合計256個のNSCLC試料および隣接した正常肺組織試料もまた、組織マイクロアレイ上での免疫染色およびさらなる統計学的解析のために、外科手術を受けた患者から採取した。本研究およびすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会(Ethical Committee)によって承認された。
【０１４２】
(b)半定量的RT-PCR：
製造業者のプロトコールに従ってTrizol試薬(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)を用いて、培養細胞および臨床組織から全RNAを抽出した。抽出したRNAおよび正常ヒト組織のポリ(A)RNAをDNase I(Nippon Gene、東京、日本)で処理し、かつオリゴ(dT)プライマーおよびSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて逆転写した。半定量的RT-PCR実験は、以下の合成されたCDCA1特異的プライマー、KNTC2特異的プライマーを用いて、または内部対照としてのACTB特異的プライマーを用いて実施した：
CDCA1、5'-GAGAAACTGAAGTCCCAGGAAAT-3'(SEQ ID NO：1)および5'-CTGATACTTCCATTCGCTTCAAC-3'(SEQ ID NO：2)；
KNTC2、5'-AAAAGAACCGAATCGTCTAGAGTC-3'(SEQ ID NO：29)および5'-CCGAGAGATCTTCTGACATGC-3'(SEQ ID NO：30)；
ACTB、5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3'(SEQ ID NO：3)および5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'(SEQ ID NO：4)。
PCR反応は、増幅の対数期の範囲内で産物の強度を確保するように、サイクル数を最適化した。
【０１４３】
(c)ノーザンブロット解析：
ヒト多組織ブロット(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を、CDCA1またはKNTC2の32P標識したPCR産物とハイブリダイズさせた。CDCA1およびKNTC2のcDNAプローブは、前述のプライマーを用いてRT-PCRによって調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を実施した。増感BASスクリーン(BIO-RAD, Hercules, CA)を用いて、室温で30時間、ブロットをオートラジオグラフ撮影した。
【０１４４】
(d)抗体：
抗CDCA1抗体を得るために、本発明者らは、pET28ベクター(Novagen, Madison, WI)を用いて、NH2末端にHisタグ付加エピトープを含むCDCA1の部分断片(コドン15〜338)を発現するプラスミドを調製した。組み換えペプチドを大腸菌(Escherichia coli)のBL21コドンプラス株(Stratagene, LaJolla, CA)において発現させ、かつ供給業者のプロトコールに従ってTALON樹脂(BD Bioscience)を用いて精製した。SDS-PAGEゲルで抽出したタンパク質をウサギに接種し；免疫血清を、標準的な方法論に従ってアフィニティカラムで精製した。アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗CDCA1抗体を、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、および免疫染色のために使用した。ヤギポリクローナル抗KNTC2抗体は、abcam Inc.(Cambridge, MA)から購入した。ウェスタンブロットにおいて、本発明者らは、CDCA1およびKNTC2を内因的に発現するか、もしくは発現しないNSCLC細胞株、またはCDCA1もしくはKNTC2発現ベクターをトランスフェクトした細胞由来の溶解物を用いて、この抗体がCDCA1またはKNTC2に特異的であることを確認した。
【０１４５】
(e)ウェスタンブロット法：
細胞を溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、0.5％ NP-40、0.5％デオキシコール酸Na、0.1％SDS、およびプロテアーゼインヒビター(Protease Inhibitor Cocktail Set III；Calbiochem Darmstadt, Germany))中に溶解した。本発明者らは、以前に記載されるように(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004；10(24)：8363-70)、ECLウェスタンブロット解析システム(GE Healthcare/Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ)を使用した。
【０１４６】
(f)CDCA1関連タンパク質の同定：
肺癌細胞株LC319由来の細胞抽出物を、プロテイナーゼインヒビターの存在下、最終容量2 mlの免疫沈降用緩衝液(0.5％ NP-40、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl)中で、プロテインAおよびプロテインGアガロースビーズ50μlと共に4℃で1時間インキュベーションすることによって前清浄した。1,000rpm、4℃で5分間遠心分離した後、上清を、抗CDCA1ポリクローナル抗体、抗KNTC2ポリクローナル抗体、または正常なウサギIgGと共に4℃で2時間インキュベートした。プロテインAおよびプロテインGアガロースビーズ50μlと共に4℃で1時間インキュベーションした後、これらのビーズを5,000rpmで2分間の遠心分離によって各試料から回収し、免疫沈降用緩衝液1 mlで6回洗浄し、洗浄したビーズをLaemmli試料用緩衝液50μl中に再懸濁し、5分間煮沸した後、5％〜10％SDS PAGEゲル(BIO RAD)上でタンパク質を分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。抗CDCA1ポリクローナル抗体と共にインキュベートした抽出物中で特異的に発見されたタンパク質バンドを切り出して、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS；AXIMA-CFR plus, SHIMADZU BIOTECH、京都、日本)によって解析するために使用した。CDCA1とKNTC2の相互作用を確認するために、本発明者らは、免疫沈降実験を実施した。pCAGGSn3Fc-CDCA1を得るために、本発明者らは、pCAGGSn3Fc-CDCA1プラスミドベクターの適切な部位中に完全なコード配列をクローニングした。各cDNAクローンのヌクレオチド配列は、製造業者の取扱い説明書に従い、T3プライマー、T7プライマー、または合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ABI Prism 3700 DNAシークエンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によって決定した。pCAGGSn3Fc-CDCA1をトランスフェクトしたLC319細胞由来の抽出物を、KNTC2ポリクローナル抗体(Abcom, Inc.)および正常なウサギIgGでそれぞれ免疫沈降させた。抗FLAG M2モノクローナル抗体(Sigma-Aldrich Co.)を用いて、免疫ブロットを実施した。
【０１４７】
(g)CDCA1中のKNTC2結合領域の同定：
CDCA1の11種の欠失構築物(CDCA1 200-464、CDCA1 149-464、CDCA1 1-348、CDCA1 1-148、CDCA1 149-306、CDCA1 306-464、CDCA1 319-464、CDCA1 277-416、CDCA1 277-367、CDCA1 319-416、およびCDCA1 319-367)を、C末端をFLAGでタグ付加したpCAGGSベクターの適切な部位にクローニングした。CDCA1の11種の欠失構築物を発現するプラスミドをトランスフェクトした肺癌細胞株LC319由来の細胞抽出物を、プロテイナーゼインヒビターの存在下、最終容量2 mlの免疫沈降用緩衝液(0.5％ NP-40、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl)中で、プロテインGアガロースビーズ100μlと共に4℃で1時間インキュベーションすることによって前清浄した。1,000rpm、4℃で5分間遠心分離した後、上清を抗FLAG M2アガロースと共に4℃で2時間インキュベートした。これらのビーズを5,000rpmで2分間の遠心分離によって各試料から回収し、免疫沈降用緩衝液1 mlで6回洗浄した後、洗浄したビーズをLaemmli試料用緩衝液50μl中に再懸濁し、5分間煮沸した後、10％SDS PAGEゲル上でタンパク質を分離した。KNTC2ポリクローナル抗体(Abcom, Inc.)および抗FLAGM2モノクローナル抗体(Sigma-Aldrich Co.)をそれぞれ用いて、免疫ブロットを実施した。
【０１４８】
(h)免疫細胞化学：
培養細胞をPBS(-)で2回洗浄し、室温で60分間、4％ホルムアルデヒド溶液中で固定し、かつ0.1％ Triton X-100を含むPBS(-)で1.5分間処理することによって透過性にした。一次抗体反応の前に、細胞をPBS(-)中3％BSAで60分間覆って、非特異的結合をブロックした。次いで細胞を、ヒトCDCA1タンパク質またはヒトKNTC2タンパク質に対する抗体と共にインキュベートした。免疫複合体を、Alexa488(Molecular Probes, Eugene, OR)に結合させたヤギ抗ウサギ二次抗体およびAlexa594(Molecular Probes)に結合させたロバ抗ヤギ二次抗体で染色し、レーザー共焦点顕微鏡(TCS SP2 AOBS：Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)で観察した。
【０１４９】
(i)免疫組織化学および組織マイクロアレイ解析：
以前に公開されたように、ホルマリン固定したNSCLCを用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004；10(24)：8363-70)。試料採取するための組織領域は、スライド上の対応するHE染色切片との視覚的な整合に基づいて選択した。ドナーの腫瘍塊から採取した3つ、4つ、または5つの組織コア(直径0.6 mm；高さ3〜4 mm)を、組織マイクロアレイヤー(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)を用いてレシピエントパラフィンブロック中に配置した。正常組織のコアを各例からパンチした。結果として生じるマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学的解析のために使用した。CDCA1およびKNTC2に対する陽性を、臨床的なフォローアップデータの事前知識を持たない独立した研究者3名によって半定量的に評価した。各研究者は、染色強度を、無し(0として記録)、弱い(1+)、または強い陽性(2+)として記録した。肺癌は、検査者すべてがそれらをそのように定義した場合にのみ、強い陽性(2+)と記録された。臨床材料中のCDCA1/KNTC2タンパク質の存在を調査するために、本発明者らは、ENVISION+ Kit/HRP(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)を用いて組織切片を染色した。内在性のペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロッキングした後、アフィニティ精製した抗CDCA1抗体または抗KNTC2抗体を添加し、各切片を二次抗体としてのHRP標識抗ウサギIgGまたはHRP標識抗ヤギIgGと共にインキュベートした。基質-色素原を添加し、かつヘマトキシリンで試料を対比染色した。
【０１５０】
(j)統計学的解析：
本発明者らは、年齢、性別、および病理学的なTNM病期などの臨床病理学的変動要素と、組織マイクロアレイ解析によって決定されたCDCA1および/またはKNTC2タンパク質の発現レベルとを相関させようと試みた。腫瘍特異的生存曲線を、手術日からNSCLCに関連した死亡時まで、または最後のフォローアップ観察時まで算出した。カプラン・マイヤー曲線を、関連する各変動要素およびCDCA1/KNTC2発現に関して算出し；患者サブグループ間の生存期間の差異をログ・ランク検定によって解析した。コックス比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を実施して、臨床病理学的変動要素と癌に関連する死亡率との関連を決定した。最初に、本発明者らは、死亡と、年齢、性別、pT-分類、およびpN-分類を含む考え得る予後因子との関連を、一度に一因子を考慮して解析した。次に、多変量コックス解析を、p値0.05未満のエントリーレベルを満たした任意およびすべての変動要素と共に、CDCA1/KNTC2発現を常にモデルに強制する後ろ向き(段階的)の方法に適用した。モデルが因子を加え続けた場合、独立した因子はP＜0.05のエクジットレベルを超えなかった。
【０１５１】
(k)RNA干渉アッセイ法：
本発明者らは以前、哺乳動物細胞中でsiRNAを合成するように設計した、ベクターに基づくRMA干渉(RNAi)系、psiH1BX3.0を確立した(Shimokawa T, et al., Cancer Res. 2003；63(19)：6116-20)。CDCA1に対するsiRNA発現ベクター(si-CDCA1)およびKNTC2に対するsiRNA発現ベクター(si-KNTC2)を、表1の2本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BXベクターのBbsI部位中にクローニングすることによって調製した。Lipofectamine 2000(Invitrogen)30μlを用いて、NSCLC細胞株のA549およびLC319にsiRNA発現ベクター10μgをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネテシン(G418)の存在下で7日間培養し、コロニーの数をギムザ染色によって計数し、かつ処理後7日目にMTTアッセイ法によって細胞生存率を評価した；簡潔には、細胞計数キット8溶液(DOJINDO、熊本、日本)を1/10体積の濃度で各ディッシュに添加し、かつ37℃でさらに4時間、プレートをインキュベートした。次いで、490nmおよび参照として630nmでの吸光度をMicroplate Reader 550(BIO-RAD)で測定した。CDCA1またはKNTC2のmRNA発現の抑制を確認するために、半定量的RT-PCR実験を、以下の合成したCDCA1特異的プライマーおよびKNTC2特異的プライマーを用い、標準プロトコールに従って実施した。RNAiのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下のとおりであった：(EGFP：強化緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea victoria)GFPの変異体)、5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(SEQ ID NO：5)；対照2(スクランブル：5Sおよび16SのrRNAをコードするユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)葉緑体遺伝子)、5'-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3'(SEQ ID NO：6)；対照3(ルシフェラーゼ：キタアメリカホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子), 5'-CGTACGCGGAATACTTCGA-3'(SEQ ID NO：7)；siRNA-CDCA1-#2, 5'-AAGATGCTGCTGAAAGGGAGA-3'(SEQ ID NO：8)；siRNA-KNTC2-#1, 5'-GCTGGATGATCTTTACCAA-3'(SEQ ID NO：9)。
【０１５２】
（表１）siRNA発現ベクター中に挿入された特異的2本鎖オリゴヌクレオチドの配列および各siRNAの標的配列
【０１５３】
(l)合成されたドミナントネガティブなペプチド：
CDCA1のKNTC2結合ドメイン由来のドミナントネガティブな20個または19個のアミノ酸配列のN末端を、膜導入11ポリアルギニン配列(11R)に共有結合させた。4種のドミナントネガティブなペプチドを合成した：11R-CDCA1 368-387, RRRRRRRRRRR-GGG-QYKRTVIEDCNKVQEKRGAV(SEQ ID NO：10)；11R-CDCA1 378-397, RRRRRRRRRRR-GGG-NKVQEKRGAVYERVTTINQE(SEQ ID NO：11), 11R-CDCA1 388-407, RRRRRRRRRRR-GGG-YERVTTINQEIQKIKLGIQQ(SEQ ID NO：12)；11R-CDCA1 398-416 RRRRRRRRRRR-GGG-IQKIKLGIQQLKDAAEREK(SEQ ID NO：13)。ペプチドは分取逆相HPLCによって精製され、95％を超える純度であった。
【０１５４】
(m)肺癌細胞増殖に対する11R-ペプチドの作用：
LC319およびA546、ならびに正常ヒト肺線維芽細胞由来のMRC5細胞を、濃度5μM、10μM、および20μMの11R-ペプチドと共に7日間インキュベートした。各ペプチドの適切な濃度で1日おきに培地を交換し、処理後7日目にMTTアッセイ法によって細胞生存率を評価した；簡潔には、細胞計数キット8溶液(DOJINDO、熊本、日本)を1/10体積の濃度で各ディッシュに添加し、かつ37℃でさらに4時間プレートをインキュベートした。次いで、490nmおよび参照として630nmでの吸光度をMicroplate Reader 550(BIO-RAD)で測定した。以前に記載されたように(Suzuki, C. et al. Cancer Res. 65, 11314-11325(2005))、フローサイトメトリー解析を実施した。
【０１５５】
(n)マウスモデル：
動物実験は、実験動物の管理と使用に関する施設および国の指針に従って実施し、かつ施設内動物使用委員会によって承認された。A549細胞1×106個を6週齢のオスのBALB/cヌードマウス(nu/nu)の右肩に皮下移植した。注射後2週間目に、腫瘍(平均体積30 mm3)を有するマウスを無作為に3群に分け、腫瘍内に11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブル(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)を7週間投与した。カリパスを用いて腫瘍体積を1日1回測定し、そのデータを式(体積=0.52×[幅]2×[長さ])に適用してスフェロイドの体積を算出した。
【０１５６】
結果
(a)CDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子の同時活性化：
23,040遺伝子に相当するcDNAマイクロアレイを用いて、大部分のNSCLCにおいて高度にトランス活性化されたエレメントをスクリーニングし、CDCA1(アクセッション番号hCT1957725(Celera)SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34)を優良な候補として同定した。この遺伝子は、検査したNSCLC症例の大多数において、3倍またはそれより高い発現レベルを示した。続いてそのトランス活性化を、さらに16のNSCLC症例のうち10例(ADC8個のうち4個、SCC8個のうち6個)における半定量的RT-PCR実験によって確認した(図1A)。CDCA1の上方制御は、検査した23個のNSCLC細胞株およびSCLC細胞株のすべてにおいて観察されたが、転写物は正常気管支上皮由来のSAEC細胞においてはほとんど検出可能ではなかった(図1B)。CDCA1タンパク質の内在性発現を、12個の肺癌細胞株において、抗CDCA1抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した(データ示さず)。CDCA1 cDNAをプローブとして用いたノーザンブロット解析により、精巣においてのみ独占的かつ大量に観察される2.4 kbの転写物を同定し、これはCDCA1が典型的な癌精巣抗原であることを示唆した(図1C)。
【０１５７】
(b)CDCA1と相互作用するタンパク質としてのKNTC2の同定：
肺癌細胞中のCDCA1の機能を解明するため、本発明者らはまず、CDCA1と相互作用すると考えられるタンパク質を探した。LC319細胞の溶解物を抽出し、抗CDCA1抗体を用いて免疫沈降させた。タンパク質複合体を、SDS-PAGEゲル上でSilverQuest(Invitrogen)で染色した。抗CDCA1で免疫沈降されたが正常なウサギIgGでは免疫沈降されなかった細胞溶解物中で認められた75 kDaのバンドを切り出し、そのペプチド配列をMALDI-TOF質量分析法によって決定した。この方法により、KNTC2(GenBankアクセッション番号NM_006101, SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32)が、CDCA1と相互作用するタンパク質の候補として同定された。外来CDCA1と内在性KNTC2の同族相互作用が、免疫沈降実験によって確認された(図2A)。
【０１５８】
肺癌細胞における内在性のCDCA1およびKNTC2の細胞内局在を決定するために、ウサギポリクローナル抗CDCA1抗体およびヤギポリクローナル抗KNTC2抗体を用いて、免疫細胞化学的解析を実施した；G1/S期では主に中心体および核、ならびにG2/Mでは中心体およびセントロメアでの両方のタンパク質の共局在化が検出された(図2B)。
【０１５９】
原発性NSCLC組織および肺癌細胞株を続いて再検査し、NSCLC臨床試料16個中9個(ADC8個中3個、SCC8個中6個)におけるKNTC2発現の増大を半定量的RT-PCR実験によって確認し、同様に肺癌細胞株23個すべてにおいても確認した(図1A、図1B)。ACTB遺伝子に比べて高い、CDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子のmRNA発現パターンは、臨床試料において有意に相関していた(X2検定によりP＜0.001)。これら2種の遺伝子は、検査した肺癌細胞株のほぼすべてにおいても同時活性化されていた(X2検定によりP＜0.001)。KNTC2cDNAをプローブとして用いたノーザンブロットにより、精巣において独占的かつ大量に2.5 kbの転写物が同定され、これによりKNTC2が癌精巣抗原の部類に属することが示唆された(図1C)。肺癌および正常組織におけるKNTC2の発現分布パターンは、CDCA1のものに非常に類似していた。
【０１６０】
(c)CDCA1中のKNTC2結合領域の同定：
KNTC2との相互作用に必要とされるCDCA1の特異的ドメインを決定するために、COOH(C)末端FLAG配列を有するCDCA1の6種の欠失構築物(CDCA1 200-464、CDCA1 149-464、CDCA1 1-348、CDCA1 1-148、CDCA1 149-306、およびCDCA1 306-464)のうち1種をLC319細胞中にトランスフェクトした。モノクローナル抗Flagを用いた免疫沈降法により、C末端のアミノ酸158個を欠いた、CDCA1 1-148構築物およびCDCA1 149-306構築物が、内在性KNTC2と相互作用できないことが示唆された(図2C)。CDCA1の最小限のKNTC2結合ドメインをさらに決定するために、C末端FLAG配列を有するCDCA1のさらに5種の欠失構築物(CDCA1 319-464、CDCA1 277-416、CDCA1 277-367、CDCA1 319-416、およびCDCA1 319-367)のうち1種をLC319細胞中にトランスフェクトした。モノクローナル抗Flag抗体を用いた免疫沈降法により、CDCA1 368-416のアミノ酸49個を欠いたCDCA1 277-367構築物およびCDCA1 319-367構築物が、内在性KNTC2と相互作用できないことが示唆された(図2D)。
【０１６１】
(d)CDCA1およびKNTC2の過剰発現と予後不良との関連：
256個のNSCLCから調製した組織マイクロアレイを使用して、アフィニティ精製した抗CDCA1およびKNTC2ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的解析を実施し、それぞれ225例(88％)および225例(88％)において陽性染色を確認した。これらのうち、CDCA1染色は、ADC腫瘍138例中117例(85％)において陽性であり、80例中72例はSCCであり(90％)、21例中19例はLCCであり(90％)、BAC10例のすべて(100％)およびASC7例のすべて(100％)で陽性であった。一方、KNTC2染色は、ADC腫瘍138例中113例(82％)において陽性であり、80例中75例はSCCであり(94％)、21例中20例はLCCであり(95％)、BAC10例のすべて(100％)およびASC7例のすべて(100％)で陽性であった。これらの腫瘍はすべて外科的に切除されたNSCLCであり、それらに隣接したいかなる正常肺組織においても染色は観察されなかった(図3A)。CDCA1タンパク質の発現パターンは、これらの腫瘍におけるKNTC2タンパク質発現と有意に一致し(X2検定によりP＜0.001)、これによりRT-PCRおよびウェスタンブロット法による結果が裏付けられた。CDCA1/KNTC2発現のパターンを無し/弱い(0〜1+として記録)または強い(2+として記録)に分類した。CDCA1およびKNTC2の両方に関して強い陽性を示す腫瘍を伴う症例は、予後不良となる可能性があった(ログ・ランク検定によりP=0.146、図3B)。CDCA1/KNTC2免疫染色試験における長期生存者および短期生存者の定義は、以下のとおりである：
長期生存者：5年生存率の平均が少なくとも69％であった患者群に属する患者、および
短期生存者：5年生存率の平均が45％を超えなかった患者群に属する患者。
【０１６２】
さらに、282個のパラフィン包埋NSCLCから調製した組織マイクロアレイを使用して、アフィニティ精製した抗CDCA1および抗KNTC2ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的解析を実施した。CDCA1/KNTC2発現のパターンを無し/弱い(0〜1+として記録)または強い(2+として記録)に分類した。検査したNSCLC282例のうち、95例(33.7％)は強いCDCA1染色(スコア2+)を示し、113例(40.1％)は弱く染色され(スコア1+)、かつ74例(26.2％)では染色は観察されなかった(スコア0)。KNTC2については、強い染色(スコア2+)が112例(39.7％)において観察され、弱い染色(スコア1+)が122例(43.3％)において観察され、かつ48例(17％)では染色は観察されなかった(スコア0)。これらの腫瘍はすべて外科的に切除されたNSCLC症例であり、それらに隣接したいかなる正常肺組織においても染色は観察されなかった(図1c)。腫瘍282個のうち189個は、CDCA1およびKNTC2の両方に関して陽性(1+〜2+として記録)であり、29個は両方のタンパク質に関して陰性であった。282例のうち19例はCDCA1に関してのみ陽性であり、45例はKNTC2に関してのみ陽性であった。CDCA1タンパク質の発現パターンが、これらの腫瘍におけるKNTC2タンパク質発現と有意に一致した(X2検定によりP＜0.0001)ことにより、RT-PCRおよびウェスタンブロット法による結果がさらに裏付けられ、CDCA1およびKNTC2に対する共通の転写調節因子がある可能性が示唆された。NSCLCにおけるCDCA1の強い発現は、pT因子の状態(X2=5.473、P=0.019)および腫瘍特異的5年生存率(ログ・ランク検定によりP=0.0233)と有意に関連していた(図3C)。NSCLCにおけるKNTC2の強い発現は、pT因子(X2=11.664、P=0.0006)および5年生存率(ログ・ランク検定によりP=0.0384)と有意に関連していた(図3D)。腫瘍がCDCA1もKNTC2も発現しなかったNSCLC患者は、最良の延命効果を受けたが、両方のマーカーに関して強い陽性の値を示した患者は、最も短期間の腫瘍特異的生存を被った(ログ・ランク検定によりP=0.0250、図3E)。単変量解析を用いて、本発明者らは、節の状態(N0対N1、N2：P＜0.0001；スコアテスト)、腫瘍サイズ(T1対T2、T3、T4：P＜0.001；スコアテスト)、および高いCDCA1/KNTC2発現(それぞれP=0.0233、P=0.0384；スコアテスト)が、NSCLC患者の予後不良に関して重要な相関関係にある特徴であることを見出した。
【０１６３】
(e)CDCA1およびKNTC2に対する特異的siRNAによるNSCLC細胞増殖の阻害：
CDCA1およびKNTC2が肺癌細胞の増殖または生存に不可欠であるかどうかを評価するために、EGFP、ルシフェラーゼ、およびスクランブルに対するsiRNAを対照として用いて、CDCA1に対するsiRNA(si-CDCA1)またはKNTC2に対するsiRNA(si-KNTC2)を発現するようにプラスミドを構築した。A549細胞またはLC319細胞中にプラスミド(si-CDCA1-#2またはsi-KNTC2#1)のいずれかをトランスフェクトした場合、対照と比較して内在性のCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の発現は有意に抑制され、かつMTTアッセイ法(対応のないt検定によりそれぞれP=0.0008およびP=0.0005)およびコロニー形成アッセイ法によって測定した細胞生存率およびコロニー数は有意に減少した(A549の代表的なデータを図4Aおよび図4Bに示した)。
【０１６４】
(f)CDCA1のドミナントネガティブなペプチドによるNSCLC細胞増殖の阻害：
肺癌細胞の増殖または生存に対する、CDCA1-KNTC2相互作用の機能的重要性を調査するために、CDCA1のN末端部分を欠くが、他の欠失変異体と比較して内在性KNTC2に対して最大の親和性を示したCDCA1の欠失断片(CDCA1 200-464；図2Cを参照されたい)を、CDCA1とKNTC2の直接的な相互作用を抑制するドミナントネガティブな機能に関して検査した。抗CDCA1/KNTC2抗体で免疫沈降させた内在性CDCA1のバンドは、IgG重鎖のバンドと重なったため、内在性のCDCA1とKNTC2との相互作用を検出することは困難であった。したがって、CDCA1 200-464構築物による、CDCA1とKNTC2の直接的な相互作用の抑制を確認するために、プラスミドの2通りの組み合わせ；CDCA1 1-464(完全長)およびCDCA1 200-464またはCDCA1 1-464(完全長)およびCDCA1 149-306(対照)(内在性KNTC2と相互作用することができない)(図5A、左から2番目の上のパネル)を、LC319細胞中に同時トランスフェクトした。CDCA1 1-464(完全長)またはCDCA1 200-464のみと内在性KNTC2との相互作用が、抗KNTC2ポリクローナル抗体を用いた免疫沈降法によって検出された(図5A；左上のパネル；黒および白の矢印)。CDCA1 200-464の過剰発現により、外来CDCA1(CDCA1 1-464；完全長)と内在性KNTC2との複合体形成が減少することがさらに確認された(図5A；左上のパネル；黒の矢印)。LC319細胞におけるCDCA1 200-464および内在性KNTC2の共局在化もまた、免疫細胞化学によって確認された(図5A；右のパネル)。次に、CDCA1 200-464をコードするプラスミドをLC319細胞中にトランスフェクトして、この構築物のドミナントネガティブな効果を検出した。予想通り、CDCA1 200-464のドミナントネガティブな断片のトランスフェクションは、MTTアッセイ法によって測定した細胞生存率を有意に減少させた(対応のないt検定によるP=0.0026、CDCA1 200-464対CDCA1 149-306；図5B)。
【０１６５】
図2Dに示したように、CDCA1 368-416のアミノ酸49個のペプチドが、内在性KNTC2と相互作用する最も重要な領域であると予想された。CDCA1-KNTC2複合体形成をインビボで阻害することができる生物活性細胞透過性化合物を開発するために、膜導入11ポリアルギニン配列(11R)にN末端で共有結合したCDCA1 368-416のKNTC2結合ドメインを包含する4種のアミノ酸ポリペプチドを合成した。これらのポリアルギニンを連結されたペプチドの肺癌細胞増殖/生存に対する作用を試験するために、4種のCDCA1由来ペプチドのうちの1種で個別にLC319細胞を処理した。11R-CDCA1 398-416のトランスフェクションにより、MTTアッセイ法により測定した細胞生存率は、有意かつ用量依存的に減少した(図5C；対応のないt検定によるP=0.001またはP=0.0021)。11R-CDCA1 398-416処理後72時間目に、いくつかの細胞は細胞周期を経て発達し、有糸分裂で阻止されて、siRNAによるCDCA1またはKNTC2いずれかの抑制の効果に非常に類似した円形の細胞形態を示した(データ示さず)。一方、未処理細胞と非効果的ペプチドで処理したものとで細胞の形態に違いはなく、どちらも広がった形状の間期細胞および丸い形状の有糸分裂細胞の正常な分布を示した。11R-CDCA1 398-416ペプチドによる腫瘍抑制のメカニズムを明らかにするために、これらのペプチドで処理した腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析を実施し、これらの細胞がG2/M停止を引き起こすこと、および処理後72時間目のsub-G1画分が有意に増加した(図6A)ことを開示した。11R-CDCA1 398-416は、ほとんど検出不可能なレベルのCDCA1およびKNTC2しか発現しなかった正常ヒト肺線維芽細胞由来MRC5細胞の細胞生存率には全く影響を与えなかった(図6B)。これらのデータにより、形質導入可能な11R-CDCA1 398-416ペプチドが、CDCA1およびKNTC2の機能的複合体形成を阻害し得ること、ならびにこれらのタンパク質を発現しない正常ヒト細胞に対する毒性作用を有さないことが示唆される。
【０１６６】
(g)ドミナントネガティブなペプチドによるNSCLC細胞のインビボでの増殖阻害：
CDCA1のドミナントネガティブなペプチドのインビボでの腫瘍抑制効果をさらに調査するために、A549細胞を6週齢のBALB/cマウスの右肩に皮下移植し、11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブルペプチド(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)の腫瘍内注射によってマウスを7週間処理した。3つの処理群の間に体重および食餌摂取量の差はなかった(データ示さず)。腫瘍増殖は、11R-CDCA1 398-416ペプチドによって有意に抑制されたが、スクランブルペプチドによってもPBSによっても抑制されなかった(図7A、図7B)。これらのデータにより、CDCA1のドミナントネガティブなペプチドがインビトロおよびインビボで癌細胞に対する増殖抑制効果を有すること、ならびにCDCA1-KNTC2相互作用の阻害が、新規なタイプの抗癌薬物を開発するための有望な標的であり得ることが示唆された。
【０１６７】
考察
肺癌治療のための多くの分子標的が報告されているが、今日まで、有害な副作用を最小限に抑えつつ、臨床状況において癌に対抗する生物活性を発揮することが示される物質はほとんどない。したがって、本発明者らは、肺癌治療のための新規な小型化合物を開発する目的で、上方制御された遺伝子を同定しようと探求した。戦略は以下のとおりであった：1)cDNAマイクロアレイシステムを用いたゲノム全域スクリーニングによってNSCLC中の上方制御された遺伝子を同定し、2)多組織ノーザンブロット解析により、それらの候補遺伝子が正常な器官において最小限の発現を有したことを確認し、3)組織マイクロアレイにより、数百個のNSCLC組織試料における過剰発現および臨床病理学的因子との相関を裏付け、かつ4)siRNAによって、標的とした遺伝子が肺癌細胞の生存または増殖に不可欠であることを確認する。この体系的なアプローチによって、2種の新規な癌精巣抗原であるCDCA1およびKNTC2が、大半のNSCLC臨床試料および細胞株において同時に過剰発現されることが特定された。さらに、これらの遺伝子の産物によって形成される複合体は、NSCLC細胞の増殖および発達に必須であることが判明した。
【０１６８】
CDCA1およびKNTC2は、有糸分裂の調節に関与することが示された(Ciferri, C. et al. J Biol Chem. 280, 29088-95(2005))。有糸分裂を調節するタンパク質の大部分は、正常な対応物と比較した場合、ヒト腫瘍細胞において異常に発現され、そのうち一部は、癌遺伝子として機能することが公知である(Nicholas, K.およびStephen, T.Nat Rev Cancer. 4, 927-36(2004))。そのサブセットもまた、新規な抗癌物質を開発するための標的分子の可能性のある供給源になると予想された。例えば、高度に保存されるオーロラキナーゼは、有糸分裂の調節因子として重要であるそのようなファミリーの1つを代表する(Doggrell, S.A.Expert Opin Investig Drugs. 13, 1199-201(2004))。実際、ZM447439、ヘスペラジン(Hesperadin)、およびVX-680を含むいくつかのオーロラキナーゼ阻害剤が、抗癌薬として最近記載された(Doggrell, S.A.Expert Opin Investig Drugs. 13, 1199-201(2004)；Harrington, E.A. et al. Nat Med. 10, 262-7(2004))。本研究において、本発明者らは、組織マイクロアレイ解析により、CDCA1/KNTC2の大量発現を示すNSCLC患者の腫瘍特異的生存期間がより短いことを見出し、したがってCDCA1がKNTC2と共に、肺癌の進行において重要な役割を果たすことが示唆された。
【０１６９】
新規な分子標的は、推定される様々な影響は最小限であること、ならびに癌に対する強力な生物活性を有することが期待される。CDCA1およびKNTC2は、いずれも細胞周期調節因子であることが公知であり、かつ本発明者らのMTNスクリーニングにより、本発明者らは、これら2種のタンパク質が癌精巣抗原に属することを実証した。本発明者らはまた、CDCA1およびKNTC2がNSCLCにおいて同時に過剰発現されることも実証した。256個または282個のNSCLCから調製した組織マイクロアレイにおける免疫組織化学的解析により、両方のタンパク質の強力な陽性染色を示すNSCLC患者は、より短い腫瘍特異的生存期間を示す可能性があることが明らかになり、これによりCDCA1がKNTC2と共に、肺癌の進行に関する非常に重要な役割を果たすことが示唆された。さらに、内在性のCDCA1またはKNTC2を抑制すると、それらの発現が低減され、かつA549細胞およびLC319細胞の増殖が抑制された。さらに本発明者らは、これらの結合が、ドミナントネガティブ型のCDCA1タンパク質、ならびに膜導入ポリアルギニン配列およびCDCA1由来のアミノ酸19個のペプチド(コドン398〜416)から構成されるアミノ酸33個の合成ポリペプチドによって妨害され、続いて肺癌細胞の増殖が効果的に抑制されることを初めて実証した。最近、いくつかのグループが、これらの分子間の相互作用を阻害すると、複合体の機能喪失が生じることを報告した。例えば、JNK相互作用タンパク質-1(JIP-1)のJNK結合ドメイン由来のアミノ酸20個の配列に細胞透過性の短いペプチドを共有結合させると、糖尿病マウスにおいてインスリン抵抗性が改善し、かつ耐糖能が改善した(Kaneto H, et al., Nat Med. 2004；10：1128-32)。さらに、細胞透過性ペプチド(SN50)は、外部刺激による活性化後のNF-κBの移行をブロックした(Lin YZ, et al., J Biol Chem. 1995；270：14255-8)。NF-κBをブロックすると、IL-1βが誘導するアポトーシスからβ細胞が保護される(Stephens LA, et al., J Autoimmun. 1997；10：293-8)。同様のアプローチが、活性化タンパク質1(AP-1)、活性化T細胞の核因子(NFAT)、ならびにシグナル導入因子および転写活性化因子(STAT)1の核移入を妨害するために成功裡に使用された(Torgerson TR, et al., J Immunol. 1998；161：6084-92；Bonny C, et al., Diabetes. 2001；50：77-82)。これらはすべて、大型タンパク質を小型化合物に変換することが成功につながりやすいことを示した。正常細胞に対する毒性作用がないか、または最小限で腫瘍細胞を選択的に死滅させることは、癌患者の治療において最も望ましい。Chenらは、サイクリンA(CCNA)/サイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)またはサイクリンE(CCNE)/CDK2による基質のリン酸化を阻害するモチーフを含む細胞膜透過性ペプチドは、非形質転換細胞よりも相対的に高いレベルで、癌細胞がアポトーシスを受けるように誘導すると報告した(Chen, Y.N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 4325-9(1999))。p53-MDM2相互作用を妨害する抗MDM2ペプチドが、p53の急速な蓄積、アポトーシス誘導遺伝子の活性化、網膜芽腫細胞の優先的な死滅、および硝子体内注射後の最小限の網膜損傷を誘導することも報告された(Harbour, J.W. et al. Arch.Ophthalmol. 2, 1341-6(2002))。癌細胞を特異的に標的とする細胞透過性ペプチドを用いた本発明者らの結果により、CDCA1-KNTC2複合体の阻害が、抗悪性腫瘍剤としての新規なアンタゴニストを開発するための理論的根拠を提供することが示された。
【０１７０】
要約すれば、本発明者らは、CDCA1-KNTC2癌精巣抗原複合体が、癌細胞の増殖および/または生存において特殊な機能的役割を果たすことを見出した。本発明者らのデータは、肺癌患者を治療するための治療法として、CDCA1およびKNTC2ならびに/またはそれらの複合体の活性を特異的に標的とするために、新規な抗癌ペプチドならびに小型化合物を設計することの実現可能性を示す。
【０１７１】
本明細書において説明した実施例および態様は、説明目的にすぎないこと、ならびにそれらを踏まえた様々な修正および変更が当業者に示唆され、かつそれらが本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれ得ることが理解される。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】肺腫瘍、細胞株、および正常組織におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す。図1Aは、半定量的RT-PCRによって検査した、16個のNSCLC(T)および対応する正常肺組織(N)の臨床試料におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す。本発明者らは、肺癌臨床試料のmRNAから調製した各一本鎖cDNAの適切な希釈物を調製し、β-アクチン(ACTB)発現のレベルを定量的対照とした。図1Bは、半定量的RT-PCRによって検査した、NSCLC細胞株におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す(1：A549、2：LC319、3：PC14、4：PC3、5：PC9、6：A427、7：NCI-H1373、8：EBC-1、9：LU61、10：NCI-H520、11：NCI-H1703、12：NCI-H2170、13：NCI-H226、14：RERF-LC-A1、15：SK-MES-1、16：NCI-H647、17：LX1、18：DMS114、19：DMS273、20：SBC-3、21：SBC-5、22：NCI-H1666、23：NCI-H781)。図1Cは、ノーザンブロット解析によって検出した、正常ヒト組織におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す。
【図２】CDCA1とKNTC2との相互作用、および結果として生じる複合体の細胞内局在を示す。図2Aでは、CDCA1と相互作用するタンパク質としてKNTC2を同定する。IP、免疫沈降法；IB、免疫ブロット。図2Bは、LC319細胞における内在性CDCA1(緑色)および内在性KNTC2(赤色)の共局在化を示す。図2Cおよび図2Dでは、免疫沈降実験により、KNTC2に結合するCDCA1の領域を同定する。CDCA1のC末端のアミノ酸158個を欠いたCDCA1 1-148構築物およびCDCA1 149-306構築物は、LC319細胞中の内在性KNTC2と相互作用する感知可能な能力は全く保持していなかった(C)。CDCA1 368-416のアミノ酸49個を欠いた、CDCA1 277-367構築物およびCDCA1 319-367構築物は、内在性KNTC2と相互作用することができなかった。これにより、CDCA1 368-416のアミノ酸49個のペプチドが、内在性KNTC2と相互作用するのに最も重要な領域であると予想されることが示唆された(D)。
【図３】CDCA1およびKNTC2の過剰発現とNSCLCの転帰不良との関連を示す。図3Aは、組織マイクロアレイ上で抗CDCA1ポリクローナル抗体(上のパネル)および抗KNTC2ポリクローナル抗体(下のパネル)を用いて、外科的に切除されたSCC組織由来の代表試料を免疫組織化学的に評価した結果を示す(倍率100)。図3B〜図3Eは、組織マイクロアレイ上でのCDCA1およびKNTC2発現の共発現(B)、CDCA1発現(C)、KNTC2発現(D)に基づいた、腫瘍特異的な生存期間のカプラン・マイヤー解析の結果を示す。図3Eは、CDCA1およびKNTC2の同時過剰発現とNSCLC患者の予後不良との関連を示す。NSCLCの282症例を3つの群に分けた；群1：CDCA1およびKNTC2の両方に対して強い陽性染色が認められた症例(患者62名)、群2：両方のマーカーに対して陰性染色が認められた症例(患者29名)、群3：他の任意の症例(患者191名、その他として示す)。
【図４】CDCA1およびKNTC2に対するsiRNAによる、NSCLC細胞増殖の阻害を示す。図4Aおよび図4Bの左上のパネルは、半定量的RT-PCRによって解析した、A549細胞における、si-CDCA1、si-KNTC2、または対照siRNAに応答した遺伝子ノックダウン効果を示す。図4Aおよび図4Bの左下および右のパネルは、特異的siRNAまたは対照プラスミド(EGFP、スクランブル、もしくはルシフェラーゼ)をトランスフェクトしたLC319細胞のコロニー形成アッセイ法およびMTTアッセイ法の結果を示す。エラーバーは、三回のアッセイの標準偏差を表す。
【図５】ドミナントネガティブなCDCA1断片およびペプチドによるNSCLC細胞増殖の阻害を示す。図5Aは、CDCA1 1-464(完全長)およびCDCA1 200-464構築物を同時トランスフェクトしたLC319細胞における、外来CDCA1とKNTC2との免疫沈降によって検出される複合体形成の減少を示す(左上のパネル；黒の矢印)。LC319細胞におけるCDCA1 200-464断片と内在性KNTC2との相互作用(左上のパネル；白の矢印)。インプット画分(左の3番目および下のパネル)。LC319細胞におけるCDCA1 200-464および内在性KNTC2の共局在化を、免疫細胞化学によって検出した(右のパネル)。図5Bは、CDCA1 200-464のドミナントネガティブな効果を検出する、LC319細胞のMTTアッセイ法を示す。CDCA1 149-306は対照として機能した。エラーバーは、三回のアッセイの標準偏差を表す。図5Cは、11R-CDCA1 398-416ペプチドの形質導入によるLC319細胞の増殖抑制を検出する、LC319細胞のMTTアッセイ法の結果を示す。エラーバーは、三回のアッセイの標準偏差を表す。
【図６】CDCA1のドミナントネガティブなペプチドによるNSCLC細胞増殖の阻害を示す。図6Aは、11R-CDCA1 398-416ペプチドまたはスクランブルペプチドによる処理後の、LC319細胞の細胞周期解析の結果を示す。図6Bは、ウェスタンブロット解析によって検査した、3種の肺癌細胞株と比較した、正常ヒト肺線維芽細胞由来のMRC5細胞におけるCDCA1タンパク質およびKNTC2タンパク質の発現を示す(左のパネル)。MTTアッセイ法では、CDCA1タンパク質およびKNTC2タンパク質をほとんど発現しなかったMRC5細胞に対する11R-CDCA1 398-416ペプチドのオフターゲット効果は全く示されない(右のパネル)。
【図７】細胞透過性CDCA1ペプチドによる、インビボでのNSCLC細胞の増殖抑制を示す。図7Aは、ヌードマウスに移植されたA549細胞に対する11R-CDCA1 398-416ペプチドの増殖抑制効果を示す。11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブルペプチド(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)で処理したマウス3匹の平均腫瘍体積をプロットした。腫瘍内注射によって、各ペプチドを毎日7週間、動物に投与した。A549細胞由来の移植した腫瘍の増殖は、ドミナントネガティブな細胞透過性11R-CDCA1 398-416ペプチドによって有意に抑制された。図7Bは、11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブルペプチド(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)で7週間処理したマウスに移植した腫瘍の肉眼的外観を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌治療の分野に関する。特に本発明は、CDCA1およびKNTC2の同時活性化ならびにそれらの同族相互作用が、肺癌進行において重要な役割を果たし、かつその複合体を阻害する方法が、非小細胞肺癌を治療するのに使用することができるという観察結果に基づいた、癌の治療に関する。
【０００２】
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、2005年7月29日に出願された米国特許仮出願第60/703,704号の恩典を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は世界で最も一般的な癌の1つであり、かつ非小細胞肺癌(NSCLC)はさらに最も一般的な形態であり、それらの症例のほぼ80％を占める(Greenlee RT., et al., CA Cancer J Clin. 2001；51：15-36)。肺癌の発症および進行に関連した多くの遺伝子的な変化が報告されている。しかしながら、これまでのところ、正確な分子メカニズムは依然として不明である(Sozzi G., Eur J Cancer. 2001；37 Suppl 7：S63-73)。最近10年間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンを含む新しく開発された細胞毒性薬が登場し、NSCLCの進行した患者に対する複数の治療選択が与えられた。しかしながら、これらの治療計画は、シスプラチンに基づいた療法と比較して、中程度の延命効果しか提供しない(Schiller JH, et al., N Engl J Med. 2002；346：92-8；Kelly K, et al., J Clin Oncol. 2001；19：3210-8)。したがって、新しい治療法が切に望まれている。
【０００４】
cDNAマイクロアレイを用いた何千個もの遺伝子の発現レベルの体系的な解析は、発癌の経路に関与する未知の分子を同定するのに効果的なアプローチであり、かつ新規な治療および診断の開発のための候補標的分子を明らかにすることができる。本発明者らは、NSCLCを診断、治療、および/または予防するための標的分子候補を単離するために、レーザーマイクロダイセクションによって精製した腫瘍細胞集団を用いて、23,040個の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイ上でNSCLC細胞のゲノム全域の発現プロファイルを解析した(Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003；22：2192-205；Suzuki C, et al., Cancer Res. 2003；63：7038-41；Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res. 2003；1：485-99；Zembutsu H, et al., Int J Oncol. 2003；23：29-39；Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet. 2004；13：3029-43)。それぞれの遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な重要性を確認するために、本発明者らはまた、肺癌の臨床材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析も実施した(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004；10(24)：8363-70)。この体系的なアプローチにより、cell division associated 1(CDCA1)およびkinetocore associated 2(KNTC2)が高頻度で、原発性NSCLCにおいて同時に過剰発現されることが明らかになった(WO2004/031413も参照されたい)。
【０００５】
細胞周期の調節の変化は、ヒト癌の特徴である。CDCA1およびKNTC2は、紡錘体チェックポイントシグナル伝達に関与するいくつかのタンパク質のメンバーである。具体的には、キネトコアの外層内の結合部位は、染色体移動のための微小管依存的な力を生じさせ、かつキネトコアでの紡錘体チェックポイントタンパク質の集合を調節する。Ndc80(Hec1)、Nuf2、Spc24、およびSpc25から構成されるNdc80複合体は、中期染色体の整列および後期染色体の分離に不可欠である。Ndc80複合体は、出芽酵母において最初に単離され、かつそのホモログが、ぜん虫、カエル、ニワトリ、およびヒトにおいて同定された(Ciferri, C. et al. J Biol Chem. 280, 29088-95(2005)；McCleland, M.L et al. Genes Dev. 17, 101-114(2003)；Desai, A. et al. Genes Dev. 17, 2421-2435(2003)；DeLuca, J.G. et al. Curr Biol. 13, 2103-2109(2003))。キネトコア外層内のCDCA1-KNTC2複合体の結合部位は、染色体移動のための微小管依存的な力を生じさせ、かつキネトコアでの紡錘体チェックポイントタンパク質の集合を調節する。この複合体のメンバーを欠くか、または変異したメンバーを有する酵母細胞は、キネトコア構造の全体的な損失を伴わずに、キネトコア-微小管結合の喪失を示すことが公知であった(Wigge, P.A. et al. J Cell Biol. 152, 349-60(2001))。酵母Nuf2もまた、セントロメアが紡錘極体への結合を失う場合、減数分裂前期の間にセントロメアから消失し、染色体の分離において調節性の役割を果たす(Nabetani, A. et al. Chromosoma. 110, 322-334(2001))。ヒトCDCA1は、CDC2、サイクリン、トポイソメラーゼII、およびothers21を含む、公知の細胞周期遺伝子と共発現される遺伝子のメンバーとして同定され、かつ有糸分裂HeLa細胞のセントロメアに結合することが報告された。このことから、CDCA1が、酵母Nuf2の機能的なホモログであることが見込まれる(Wigge, P.A. et al. J Cell Biol. 152, 349-360(2001))。
【０００６】
これに対して、ヒトKNTC2は、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを用いて、網膜芽細胞腫タンパク質(RB1)のC末端と相互作用するタンパク質として同定され、かつ紡錘体チェックポイントシグナル伝達に関与するいくつかのタンパク質のうちの1つであることが示唆された(Durfee,T. et al. Genes Dev. 7, 555-569(1993)；Chen, Y. et al. Mol.Cell.Biol. 17, 6049-6056(1997))。
【０００７】
KNTC2を含むこの監視メカニズムは、MPS1キナーゼおよびMAD1/MAD2複合体をキネトコアに動員し、かつ整列されていない染色体の検出および染色体の適切な両極への結合が実現されるまで前中期停止を引き起こすことによって、細胞分裂の間の染色体の正確な分離を確実にする(Martin-Lluesma, S. et al. Science 297, 2267-2270(2002))。
【０００８】
これらの進歩にもかかわらず、これまで、ヒト癌の進行におけるCDCA1-KNTC2複合体の同時活性化の重要性ならびに治療標的および予後判定標的としての可能性を記載した報告はなかった。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
非小細胞肺癌(NSCLC)のゲノム全域の遺伝子発現プロファイルの解析により、本発明者らは、cell division associated 1(CDCA1)の過剰発現を検出した。本発明者らはさらに、CDCA1タンパク質が、肺癌において同様に特異的に過剰発現されるタンパク質であるkinetocore associated 2(KNTC2)と物理的に相互作用することを見出した。ノーザンブロット解析により、これら2種の遺伝子が、検査した23種の正常成人組織のうち、精巣でのみ発現されることが明らかになった。肺癌組織マイクロアレイの免疫組織化学的解析により、肺癌患者におけるCDCA1およびKNTC2の同時活性化が、予後不良に関連することが実証された。インビトロで、CDCA1もしくはKNTC2のいずれかの発現をsiRNAで抑制するか、またはドミナントネガティブなCDCA1断片、もしくは膜導入11ポリアルギニン配列およびCDCA1由来の19アミノ酸のペプチド(コドン398〜416)から構成された33アミノ酸の合成ポリペプチドを用いてそれらの結合を阻害すると、NSCLC細胞の増殖が効果的に抑制された。本明細書におけるデータが、CDCA1およびKNTC2が癌-精巣抗原(CTA)のカテゴリーに入ること、ならびにそれらの同時上方制御が肺癌細胞の増殖/生存の頻繁かつ重要な特徴であることを実証するため、CDCA1もしくはKNTC2の活性の選択的抑制、および/またはCDCA1-KNTC2複合体の形成の阻害は、多くの肺癌を治療するための簡便な治療法であると考えられる。
【００１０】
したがって、本発明は、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な方法は、以下の段階を含む：
(1)試験化合物の存在下で、KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物をCDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
(2)段階(1)のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
(3)それらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【００１１】
CDCA1ポリペプチドの機能的等価物は、KNTC2結合ドメインに対応するアミノ酸配列、例えばSEQ ID NO：35のアミノ酸配列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)を有してもよい。同様に、KNTC2ポリペプチドの機能的等価物は、CDCA1結合ドメインに対応するアミノ酸配列を有してもよい。
【００１２】
本発明はまた、前述した本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物を投与することにより、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法も提供する。
【００１３】
本発明はさらに、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキットも提供する。キットは好ましくは、以下の構成要素を含む：
a：KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物、および
b：CDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物。
【００１４】
本発明はまた、KNTC2遺伝子の発現を低減させるsiRNAを含むsiRNA組成物を対象に投与する段階を含み、そのsiRNAがセンス鎖中にSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有する、対象においてNSCLCを治療または予防する方法を提供する。siRNAは、好ましくは以下の一般式を有する：
5'-[A]-[B]-[A']-3'
式中、[A]はSEQ ID NO：9に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから構成されるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。
【００１５】
本発明の方法はまた、ドミナントネガティブな効果を有するCDCA1変異体、またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象においてNSCLCを治療または予防することも提供する。CDCA1変異体は、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を有してよく、かつそのnuf2ドメインを含まない。好ましい態様において、CDCA1変異体は、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有する。CDCA1変異体は、以下の一般式を有し得る：
[R]-[D]、
式中、[R]は膜導入物質であり、かつ[D]はSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。膜導入物質は以下からなる群より選択することができる；
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；
Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49。
【００１６】
本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子を提供し、ここでセンス鎖はKNTC2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列であり、該センス鎖および該アンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子はKNTC2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合、該遺伝子の発現を阻害する。この二本鎖分子は、SEQ ID NO：31のヌクレオチド配列由来の少なくとも約10個の連続的なヌクレオチドから構成されるKNTC2標的配列を含んでもよい。好ましい態様において、KNTC2標的配列は、SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列由来の約19〜約25個の連続的なヌクレオチドを含むか、またはSEQ ID NO：9から完全に構成されていてもよい。
【００１７】
二本鎖分子は、一本鎖リボヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成された単一のリボヌクレオチド転写物でよい。二本鎖分子は典型的に、約100ヌクレオチド長未満、約75ヌクレオチド長未満、約50ヌクレオチド長未満、または約25ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである。二本鎖分子は、約19ヌクレオチド長と約25ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドであり得る。
【００１８】
本発明はまた、前述した本発明の二本鎖分子をコードするベクターも提供する。ベクターは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二次構造を有する転写物をコードし得る。この転写物は、センス鎖およびアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含んでよい。
【００１９】
本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせから構成されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供し、ここでセンス鎖核酸はSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有し、アンチセンス鎖核酸はセンス鎖に相補的な配列を有する。
【００２０】
ポリヌクレオチドは一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有してもよく、式中[A]はSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なヌクレオチド配列である。
【００２１】
本発明は、KNTC2遺伝子に対する薬学的有効量のsiRNAを含む、NSCLCを治療または予防するための組成物を提供する。siRNAは、標的配列としてSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有するセンス鎖を含んでもよい。
【００２２】
本発明はさらに、活性成分として前述した本発明のスクリーニング方法によって選択された薬学的有効量の化合物および薬学的に許容される担体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物を提供する。
【００２３】
本発明はまた、薬学的有効量の本発明のCDCA1変異体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物も提供する。
【００２４】
本発明は、以下の段階を含む、NSCLCの予後を評価する方法を提供する：
(a)NSCLCの予後を評価しようとする対象から採取した試料におけるCDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルを検出する段階、ならびに
(b)CDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルの上昇が検出される場合、予後不良が示唆される段階。
【００２５】
上記の方法は、CDCA1およびKNTC2の両方の発現レベルを検出する段階を含んでもよい。発現レベルは、以下の方法のうちいずれか1つによって検出してもよい：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出する段階、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を検出する段階、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出する段階。
【００２６】
本発明はまた、以下からなる群より選択される任意の1つの構成要素を含む、NSCLCの予後を評価するためのキットも提供する：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAを検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【００２７】
定義
本明細書において使用される語「a」、「an」、および「the」は、別に具体的に指示しない限り「少なくとも1つ」を意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は同義的に使用される。さらに、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、別に具体的に指示しない限り同義的に使用される。
【００２８】
「有効な」という用語は、対象におけるNSCLCのサイズ、罹患率、または転移能の低減をもたらす治療を意味する。ある治療が予防的に適用される場合、「有効な」とは、その治療が、NSCLCの発生を遅延もしくは予防するか、またはNSCLCの臨床症状を緩和することを意味する。NSCLCの評価は、標準的な臨床的プロトコールを用いて実施することができる。さらに、治療の有効性は、NSCLCを診断または治療するための任意の公知の方法と関連して決定してもよい。例えば、NSCLCは、組織病理学的に、または慢性の咳、嗄声、喀血、体重減少、食欲低下、息切れ、喘鳴、気管支炎もしくは肺炎の発作の繰り返し、および胸痛など症候性異常を確認することによって、しばしば診断される。
【００２９】
詳細な説明
NSCLCを治療または予防するための化合物のスクリーニング
前述したように、本発明者らは、CDCA1がNSCLC細胞においてKNTC2と相互作用することを明らかにした。したがって本発明は、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、以下の段階を含む：
(1)試験化合物の存在下で、KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物をCDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
(2)段階(1)のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
(3)それらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【００３０】
本発明の文脈において、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドの機能的等価物は、それぞれ、CDCA1ポリペプチド(SEQ ID NO：34)またはKNTC2ポリペプチド(SEQ ID NO：32)に等価な生物活性を有するポリペプチドである。
【００３１】
所与のタンパク質に機能的に等価なポリペプチドを調製するための方法は当業者に周知であり、タンパク質中に変異を導入する公知の方法も含まれる。例えば当業者は、CDCA1またはKNTC2に機能的に等価なポリペプチドを、部位特異的変異誘発によってこれらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列中に適切な変異を導入することによって調製することができる(Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152：271-5(1995)；ZollerおよびSmith, Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12：9441-9456(1984)；KramerおよびFritz, Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82：488-92(1985)；Kunkel TA, et al., Methods Enzymol. 1991；204：125-39)。アミノ酸変異は、天然にも発生し得る。本発明のポリペプチドには、結果として生じる変異ポリペプチドがそれぞれCDCA1またはKNTC2に機能的に等価であるという条件で、1つまたは複数のアミノ酸が変異している、CDCA1またはKNTC2のアミノ酸配列を有するものが含まれる。このような変異体において変異したアミノ酸の数は、一般に20個またはそれ未満のアミノ酸、より典型的には10個またはそれ未満のアミノ酸、好ましくは5〜6個またはそれ未満のアミノ酸、およびより好ましくは1〜3個のアミノ酸である。
【００３２】
変異または改変されたタンパク質、すなわち特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物活性を保持することが公知である(Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；ZollerおよびSmith, Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。
【００３３】
変異させるアミノ酸残基は、好ましくはアミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異させられる(保存的アミノ酸置換として公知のプロセス)。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、ならびに以下の官能基または特徴を共通に有する側鎖：脂肪族側鎖(G、A、V、L、I、P)；ヒドロキシル基を含む側鎖(S、T、Y)；硫黄原子を含む側鎖(C、M)；カルボン酸およびアミドを含む側鎖(D、N、E、Q)；塩基を含む側鎖(R、K、H)；および芳香族を含む側鎖(H、F、Y、W)である。括弧内の文字はアミノ酸の一文字表記を示すことに留意されたい。
【００３４】
CDCA1またはKNTC2のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸残基を付加したポリペプチドの例は、CDCA1またはKNTC2をそれぞれ含む融合タンパク質である。したがって、融合タンパク質、すなわちCDCA1またはKNTC2および他のペプチドまたはタンパク質の融合物が、本発明に含まれる。当業者に周知の技術によって、例えばCDCA1またはKNTC2をコードするDNAを、フレームが合致するように、他のペプチドもしくはタンパク質をコードするDNAと連結し、その融合DNAを発現ベクター中に挿入し、かつ宿主中でそれを発現させることによって、融合タンパク質を作製することができる。本発明のタンパク質に融合されるペプチドまたはタンパク質に関して制限はない。
【００３５】
機能的に等価なポリペプチドを単離するための当技術分野において公知の代替方法は、例えばハイブリダイゼーション技術を用いた方法である(Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))。当業者は、CDCA1またはKNTC2(すなわち、それぞれSEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：32)と高い相同性を有するDNAを容易に単離することができ、単離したDNAから、CDCA1またはKNTC2に機能的に等価なポリペプチドを単離することができる。本発明のタンパク質には、CDCA1もしくはKNTC2をコードするDNA配列の全体または一部とハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつCDCA1またはKNTC2に機能的に等価であるものが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物のホモログ(例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシの遺伝子よってコードされたポリペプチド)が含まれる。動物由来のCDCA1またはKNTC2をコードするDNAとの相同性が高いcDNAを単離する際、肺癌組織を使用することが特に好ましい。
【００３６】
好ましくは、機能的に等価なポリペプチドは、本明細書において開示される天然のCDCA1またはKNTC2の配列との相同性(配列同一性とも呼ばれる)が少なくとも約80％、より好ましくは相同性が少なくとも約85％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％であるアミノ酸配列を有する。ポリペプチドの相同性は、「WilburおよびLipman、Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。他の態様において、機能的に等価なポリペプチドは、(下記に定義する)ストリンジェントな条件下で、そのような機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００３７】
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)を使用し、CDCA1またはKNTC2の配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いて、CDCA1またはKNTC2に機能的に等価なポリペプチドをコードするDNAを単離することができる。
【００３８】
本発明の文脈において有用なCDCA1またはKNTC2の機能的等価物は、それを作製するために使用する細胞もしくは宿主または使用する精製方法によって、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態における変形を有してもよい。それでもなお、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドいずれかの機能等価物である限り、それは本発明の範囲内である。
【００３９】
いくつかの好ましい態様において、CDCA1ポリペプチドの機能的等価物は、KNTC2結合ドメインに対応するアミノ酸配列、例えばSEQ ID NO：35のアミノ酸配列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)を含み得る。同様に、KNTC2ポリペプチドの機能的等価物は、CDCA1結合ドメインに対応するアミノ酸配列を含み得る。
【００４０】
上述したように、CDCA1とKNTC2との結合を阻害すると、細胞増殖が抑制される。したがって、この結合を阻害する化合物は、NSCLCを治療または予防するための薬剤として役立つ可能性がある。本発明のスクリーニング方法に使用するCDCA1ポリペプチドおよびKNTC2ポリペプチドは、組み換えポリペプチドもしくは天然由来のタンパク質でよく、または完全長タンパク質の結合能力を保持する限り、その部分ペプチドでもよい。結合能力を保持するこのような部分ペプチドは、本明細書において「機能的等価物」と呼ばれる。スクリーニング方法において使用するCDCA1ポリペプチドおよびKNTC2ポリペプチドは、例えば精製したポリペプチド、可溶性タンパク質、担体に結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
【００４１】
CDCA1とKNTC2との結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。例えば、スクリーニングは、細胞系のようなインビトロのアッセイ系として実施することができる。より具体的には、最初にCDCA1またはKNTC2のいずれかを支持体に結合させ、他のタンパク質を試験化合物と共にそこへ添加する。次に、この混合物をインキュベートし、洗浄し、支持体に結合した他のタンパク質を検出および/または測定する。
【００４２】
タンパク質を結合するのに使用され得る支持体の例には、例えばアガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；好ましくは、上記の材料から調製される市販のビーズおよびプレート(例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど)を使用してもよい。ビーズを使用する場合、これらをカラム中に充填してもよい。または、磁性ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより、磁気を介してビーズに結合したタンパク質を容易に単離することが可能になる。
【００４３】
支持体へのタンパク質の結合は、例えば化学的結合および物理的吸着などの常法に従って実施してよい。または、タンパク質は、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合され得る。さらに、支持体へのタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンを用いて実施することもできる。
【００４４】
タンパク質間の結合は、好ましくは緩衝液中で実施され、緩衝液の例には、リン酸緩衝液およびトリス緩衝液が含まれるがこれらに限定されない。しかしながら、選択される緩衝液は、タンパク質間の結合を阻害してはならない。
【００４５】
本発明の文脈において、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、結合したタンパク質を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーを使用する場合、タンパク質間の相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いてCDCA1とKNTC2との結合を評価することが可能である。
【００４６】
または、CDCA1またはKNTC2のいずれかを標識してもよく、結合したタンパク質の標識を使用して、結合したタンパク質を検出または測定してもよい。具体的には、これらのタンパク質のうち1種を前標識した後、標識されたタンパク質を、試験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次いで、洗浄後に、結合したタンパク質を標識に従って検出または測定する。
【００４７】
限定されないが、放射性同位体(例えば、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ)、蛍光性物質(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン)、およびビオチン/アビジンを含む標識物質が、本発明の方法においてタンパク質の標識のために使用され得る。タンパク質が放射性同位体で標識される場合、検出または測定は液体シンチレーションによって実施することができる。または、酵素で標識されたタンパク質は、酵素の基質を添加して、色の生成のような基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、検出または測定することができる。さらに、蛍光物質を標識として使用する場合は、蛍光光度計を用いて結合したタンパク質を検出または測定してもよい。
【００４８】
さらに、CDCA1およびKNTC2の結合は、CDCA1またはKNTC2に対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定されたCDCA1ポリペプチドを試験化合物およびKNTC2と接触させた後、この混合物をインキュベートおよび洗浄し、かつKNTC2に対する抗体を用いて検出および測定を実施することができる。または、KNTC2を支持体上に固定してよく、CDCA1に対する抗体をその抗体として使用してもよい。
【００４９】
本発明のスクリーニングにおいて抗体を使用する場合、好ましくは抗体を、前述の標識物質の1つで標識し、標識物質に基づいて検出または測定する。または、CDCA1もしくはKNTC2に対する抗体を、標識物質で標識した二次抗体で検出される一次抗体として使用してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合する抗体は、プロテインGカラムまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定してもよい。
【００５０】
または、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい(「MATCHMAKER Two-Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one-Hybrid system」(Clontech)；「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(Stratagene)；参考文献：「DaltonおよびTreisman, Cell 68：597-612(1992)」、「FieldsおよびSternglanz, Trends Genet 10：286-92(1994)」)。
【００５１】
ツーハイブリッドシステムでは、例えばCDCA1ポリペプチドは、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合され、酵母細胞において発現される。CDCA1ポリペプチドに結合するKNTC2ポリペプチドを、VP16またはGAL4の転写活性化領域に融合し、同様に試験化合物の存在下で酵母細胞において発現される。または、KNTC2ポリペプチドをSRF結合領域またはGAL4結合領域に融合し、かつCDCA1ポリペプチドをVP16またはGAL4の転写活性化領域に融合してもよい。試験化合物がCDCA1とKNTC2との結合を阻害しない場合、これら2種の結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子として、HIS3遺伝子に加え、適切な例には、Ade2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
任意の試験物質、例えば細胞抽出物、細胞培養上清液、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、および天然化合物が、本発明のスクリーニング方法の文脈において使用することができる。本発明の試験化合物はまた、限定されないが、(1)生物ライブラリ、(2)空間的にアドレス可能なパラレルな固相ライブラリまたは液相ライブラリ、(3)デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法、(4)「1ビーズ1化合物」ライブラリ法、および(5)アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリ法を含む、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物ライブラリ法は、ペプチドライブラリに限定されるが、他の4種のアプローチは、ペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または化合物の小分子ライブラリに適用可能である(Lam, Anticancer Drug Des 12：145-67(1997))。分子ライブラリの合成方法の例は、当技術分野において見出すことができる(DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90：6909(1993)；Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91：11422-6(1994)；Zuckermann et al., J.Med.Chem. 37：2678-85(1994)；Cho et al., Science 261：1303-5(1993)；Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33：2059(1994)；Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33：2061(1994)；Gallop et al., J.Med.Chem. 37：1233-51(1994))。化合物のライブラリは、溶液中(Houghten, Bio/Techniques 13：412-21(1992)を参照されたい)、またはビーズ上(Lam, Nature 354：82-4(1991))、チップ上(Fodor, Nature 364：555-6(1993))、細菌上(米国特許第5,223,409号)、胞子上(米国特許第5,571,698号、第5,403,484号、および第5,223,409号)、プラスミド上(Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1865-9(1992))、もしくはファージ上(ScottおよびSmith, Science 249：386-90(1990)；Devlin, Science 249：404-6(1990)；Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87：6378-82(1990)；Felici, J.Mol.Biol. 222：301-10(1991)；米国特許出願第20020103360号)に提示され得る。本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験化合物は、単一の化合物または化合物の組み合わせでよい。化合物の組み合わせを本発明のスクリーニング方法において使用する場合、これらの化合物を逐次的にまたは同時に接触させてもよい。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法によって単離される化合物は、例えばNSCLCのような細胞増殖性疾患に起因する疾患を治療または予防するための、CDCA1およびKNTC2の活性を阻害する薬物の候補である。本発明の本スクリーニング方法によって得られた化合物の構造の一部分が、付加、欠失、および/または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物に含まれる。過剰発現された遺伝子、すなわちCDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子の発現の抑制に有効な化合物は、臨床的な利益を有するとみなされ、動物モデルもしくは試験対象において癌細胞増殖を低減させるか、または防止する能力についてさらに試験され得る。
【００５４】
本発明はまた、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合してそれらの相互作用を阻害するタンパク質のスクリーニングも含み得る。このために、当業者に周知の多くの方法を使用することができる。このようなスクリーニングは、例えば当技術分野において周知の方法を用いる免疫沈降アッセイ法により実施することができる。本発明のタンパク質は、標準的な方法を用いて組み換えにより作製することができる。例えば、関心対象のポリペプチドをコードする遺伝子を、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、およびpCD8など外来遺伝子用の発現ベクター中にその遺伝子を挿入することによって、動物細胞において発現させてもよい。発現に使用するプロモーターは、一般に使用され得る任意のプロモーターでよく、例えばSV40初期プロモーター(Rigby、Williamson(編), Genetic Engineering, vol. 3.Academic Press, London, 83-141,(1982))、EF-αプロモーター(Kim et al., Gene 91, 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108：193(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen, Methods in Enzymology 152：684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebe et al., Mol Cell Biol 8：466-72(1988))、CMV最初期プロモーター(SeedおよびAruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84：3365-9(1987)))、SV40後期プロモーター(GheysenおよびFiers, J Mol Appl Genet 1：385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufman et al., Mol Cell Biol 9：946-58(1989))、HSV TKプロモーターなどが含まれる。外来遺伝子を発現させるための、動物細胞中への遺伝子の導入は、任意の従来の方法、例えばエレクトロポレーション法(Chu et al., Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))、リン酸カルシウム法(ChenおよびOkayama, Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))、DEAEデキストラン法(Lopata et al., Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；SussmanおよびMilman, Mol Cell Biol 4：1641-3(1984))、リポフェクチン法(Derijard B, Cell 76：1025-37(1994)；Lamb et al., Nature Genetics 5：22-30(1993)：Rabindran et al., Science 259：230-4(1993))などに従って実施することができる。ポリペプチドはまた、特異性が明らかにされているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を含む融合タンパク質としても発現させることができる。市販されているエピトープ-抗体系もまた、使用することができる(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。例えば、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニング部位を用いることにより発現できるベクターが市販されている。
【００５５】
融合によって元のポリペプチドの特性を変更しないように、数個〜数十個のアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することによって調製した融合タンパク質もまた、本明細書において提供される。ポリヒスチジン(His-タグ)、インフルエンザ凝集体HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7-タグ)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSV-タグ)、E-タグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)などのエピトープ、ならびにそれらを認識するモノクローナル抗体が、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ-抗体系として使用され得る(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。
【００５６】
免疫沈降法では、適切な洗浄剤を用いて調製した細胞溶解物にこれらの抗体を添加することにより、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチド、そのポリペプチドに対する結合親和力を有するポリペプチド、および抗体から構成される。免疫沈降法はまた、上記のエピトープに対する抗体に加え、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を用いて実施することもでき、これらの抗体は、従来の方法に従って調製することができ、かつモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態でよく、例えばウサギなどの動物をそのポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびに組み換え抗体(例えばヒト化抗体)が含まれる。
【００５７】
具体的には、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体は、当技術分野において周知の技術を用いて調製することができる。例えば、抗体を得るために抗原として使用するCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドは、任意の動物種に由来してよいが、好ましくはヒト、マウス、ウサギ、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。抗原として使用するポリペプチドは、組み換えによって作製するか、または天然源から単離することができる。本発明の文脈において、免疫抗原として使用するポリペプチドは、完全なタンパク質またはCDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチドの部分ペプチドでよい。
【００５８】
任意の哺乳動物を抗原で免疫してよい。しかしながら好ましくは、細胞融合に使用する親細胞との適合性が考慮される。一般に、げっ歯目(Rodentia)、ウサギ目(Lagomorpha)、または霊長目(Primate)の動物を使用する。げっ歯目の動物には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えば野ウサギ、ナキウサギ、およびウサギが含まれる。霊長目の動物には、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻下目(Catarrhini)のサル(旧世界ザル)が含まれる。
【００５９】
動物を抗原で免疫するための方法は、当技術分野において周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物を免疫するための標準的な方法である。より具体的に、抗原は、適切な量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、生理食塩水などに希釈および懸濁してもよい。所望の場合、抗原懸濁液を、適切な量のフロイント完全アジュバントのような標準的なアジュバントと混合し、エマルジョンにし、次いで哺乳動物に投与してよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を4日〜21日毎に数回投与する。適切な担体もまた、免疫化のために使用され得る。前述の免疫化の後、標準的な方法により、血清を所望の抗体の量の増加に関して検査する。
【００６０】
CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望の抗体の増加に関して検査した免疫化哺乳動物から血液を採取することによって、および任意の従来の方法によりその血液から血清を分離することによって、調製してもよい。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含む血清、ならびに血清から単離されたポリクローナル抗体を含む画分が含まれる。免疫グロブリンGまたは免疫グロブリンMは、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドのみを認識する画分から、例えばそのポリペプチドが結合したアフィニティカラムを用い、さらにプロテインAカラムまたはプロテインGカラムを用いてこの画分を精製して、調製することができる。
【００６１】
モノクローナル抗体を調製するために、前述したように抗原で免疫し、かつ血清中の所望の抗体のレベルの上昇を確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、かつそれらを細胞融合に供する。細胞融合のために使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、例えば哺乳動物の骨髄腫細胞、およびより好ましくは、薬物によって融合された細胞の選択のための獲得された性質を有する骨髄腫細胞が含まれる。
【００６２】
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、公知の方法、例えばMilsteinらの方法(GalfreおよびMilstein, Methods Enzymol 73：3-46(1981))に従って融合することができる。
【００６３】
細胞融合により得られる、結果として生じるハイブリドーマは、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地)のような標準的な選択培地中でそれらを培養することによって選択することができる。典型的に、HAT培地中で数日間〜数週間、所望のハイブリドーマを除く他の細胞(非融合細胞)すべてを死滅させるのに充分な期間、細胞培養を継続する。次いで、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよびクローン化する。
【００６４】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記の方法に加えて、EBウイルスに感染させたものなどのヒトリンパ球を、CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチド、このようなポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物でインビトロで免疫してもよい。次いで、免疫されたリンパ球を、U266のような無制限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合できる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る(特開昭(JP-A)63-17688号)。
【００６５】
続いて、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔中に移植し、腹水を取り出してよい。得られたモノクローナル抗体は、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、プロテインAカラムもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明の標的タンパク質(CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチド)のいずれかが結合したアフィニティカラムによって、精製することができる。この抗体は、本発明のスクリーニング方法においてだけでなく、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドの精製および検出のためにも使用することができる。それらはさらに、関心対象のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補にもなり得る。さらに、アンタゴニストの候補となるこのような抗体は、後述のNSCLCを含むCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに関係した疾患の抗体治療に適用することができる。
【００６６】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組み換えによって調製することもできる(例えば、MacMillan Publishers LTDによって英国で出版されたBorrebaeckおよびLarrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies(1990)を参照されたい)。例えば、ある抗体をコードするDNAを、その抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球などの免疫細胞からクローン化し、適切なベクター中に挿入し、かつ宿主細胞中に導入して、組み換え抗体を調製してよい。このような組み換え抗体は、本発明のスクリーニングの文脈においても使用することができる。
【００６７】
さらに、スクリーニングなどにおいて使用する抗体は、CDCA1およびKNTC2の一方または両方に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結される単鎖Fv(scFv)でよい(Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。より具体的には、抗体断片は、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって作製してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクター中に挿入し、かつ適切な宿主細胞中で発現させてもよい(例えば、Co et al., J Immunol 152：2968-76(1994)；BetterおよびHorwitz, Methods Enzymol 178：476-96(1989)；PluckthunおよびSkerra, Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi, Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux et al., Methods Enzymol 121：663-9(1986)；BirdおよびWalker, Trends Biotechnol 9：132-7(1991)を参照されたい)。
【００６８】
抗体は、ポリエチレングリコール(PEG)のような様々な分子と結合させることによって、修飾してもよい。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得ることができる。これらの修飾方法は、当技術分野において常識である。
【００６９】
または抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とのキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体由来のフレームワーク領域(FR)および定常領域から構成されるヒト化抗体として、得ることもできる。このような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。
【００７０】
ヒト化は、げっ歯動物のCDRまたはCDR配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施することができる(例えば、Verhoeyen et al., Science 239：1534-6(1988)を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的に完全ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されるキメラ抗体である。ヒトのフレームワークおよび定常領域に加えて、ヒト可変領域から構成される完全なヒト抗体もまた使用することができる。このような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロの方法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組み換えライブラリの使用を含む(例えば、HoogenboomおよびWinter, J.Mol.Biol. 227：381-8(1992))。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたマウスに導入することによって、作製することができる。このアプローチは、例えば米国特許第6,150,584号、第5,545,807号、第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号において記載される。
【００７１】
前述のように得られた抗体を、均一になるまで精製してよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般のタンパク質に対して使用する分離方法および精製方法に従って実施することができる。例えば抗体は、適切に選択し組み合わせた、アフィニティクロマトグラフィーのようなカラムクロマトグラフィー、ろ過、限外ろ過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などによって、分離および単離してもよい(Antibodies：A Laboratory Manual. Ed HarlowおよびDavid Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。しかしながら、本発明はこれらに限定されない。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用する例示的なプロテインAカラムには、例えばHyper D、POROS、およびセファロース F.F(Pharmacia)が含まれる。
【００７２】
アフィニティクロマトグラフィーを除き、例示的なクロマトグラフィーには、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R.Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。クロマトグラフィーの方法は、HPLCおよびFPLCなどの液相クロマトグラフィーによって実施することができる。
【００７３】
抗体がマウスIgG抗体である場合、免疫複合体は、例えばプロテインAセファロースまたはプロテインGセファロースを用いて沈殿させることができる。CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドが、GSTのようなエピトープとの融合タンパク質として調製される場合、グルタチオン-セファロース4Bのような、これらのエピトープに特異的に結合する物質を用いて、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同じ様式で、免疫複合体を形成することができる。
【００７４】
免疫沈降法は、例えば文献(HarlowおよびLane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York(1988))中の方法にならって、または従って、実施することができる。
【００７５】
SDS-PAGEは、免疫沈降させたタンパク質の解析に通常使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度のゲルを用いてそのタンパク質の分子量によって解析することができる。CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合するタンパク質は、クーマシー染色または銀染色など従来の染色方法で検出することが困難であるため、このタンパク質に対する検出感度は、放射性同位体である35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培地中で細胞を培養し、細胞中のタンパク質を標識し、これらのタンパク質を検出することによって改善することができる。標的タンパク質は、SDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、そのタンパク質の分子量が明らかにされた場合は、その配列を決定することができる。
【００７６】
CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合する化合物もまた、アフィニティクロマトグラフィーを用いてスクリーニングすることができる。例えば、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドは、アフィニティカラムの担体上に固定してもよく、試験化合物をそのカラムに添加する。本明細書における試験化合物は、例えば細胞抽出物、細胞溶解物などでよい。試験化合物を添加した後、カラムを洗浄し、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。
【００７７】
試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、その配列に基づいてオリゴDNAを合成し、かつそのオリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリをスクリーニングして、そのタンパク質をコードするDNAを得る。
【００７８】
表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーは、本発明において結合した化合物を検出または定量するための手段として使用され得る。このようなバイオセンサーを使用する場合、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドと試験化合物との相互作用は、ごくわずかな量のポリペプチドを用い、かつ標識せずに、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いてCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
【００７９】
固定されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドを、合成化学化合物、または天然物質バンクもしくはランダムペプチドファージディスプレイライブラリに曝露させた場合に結合する分子をスクリーニングする方法、ならびにCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質に結合するタンパク質だけでなく化学化合物(アゴニストおよびアンタゴニストを含む)も単離する、コンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットを用いたスクリーニング方法(Wrighton et al., Science 273：458-64(1996)；Verdine, Nature 384：11-3(1996))は、当業者に周知である。
【００８０】
個体の遺伝子構成の差異が、様々な薬物を代謝する相対的な能力の差をもたらす可能性がある。対象中で代謝されて抗NSCLC物質として作用する化合物は、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの、対象の細胞における遺伝子発現パターンの変化を誘導することによって、顕在化させることができる。したがって、本明細書において開示される、差次的に発現されるCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子により、選択された対象由来の試験細胞(または試験細胞集団)において候補化合物を試験することによって、対象に特異的に適した推定上のNSCLCの治療用または予防用阻害剤を選択することが可能になる。
【００８１】
個々の対象にとって適切な抗NSCLC物質を同定するために、対象由来の試験細胞または試験細胞集団を治療物質に曝露し、かつCDCA1遺伝子もしくはKNTC2遺伝子の1つまたは複数の発現を決定する。
【００８２】
試験細胞がCDCA1遺伝子もしくはKNTC2遺伝子を発現するNSCLC細胞であるか、または試験細胞集団が該NSCLC細胞を含む。好ましくは、試験細胞または試験細胞集団は肺細胞を含む。例えば、試験細胞または試験細胞集団は、候補物質の存在下でインキュベートしてよく、かつ試験細胞または試験細胞集団の遺伝子発現パターンを測定し、1種または複数種の参照プロファイル、例えばNSCLCの参照発現プロファイルまたは非NSCLCの参照発現プロファイルと比較してもよい。
【００８３】
NSCLCを含む参照細胞集団と比較して試験細胞または試験細胞集団におけるCDCA1またはKNTC2の発現が減少する場合、その物質が治療的に有効であることが示唆される。
【００８４】
NSCLCを治療または予防するための方法
本発明はさらに、対象においてNSCLCを治療、緩和、または予防するための方法を提供する。治療的化合物を、NSCLCに罹患するか、またはNSCLCを発症するリスクがある(もしくは発症しやすい)対象に予防的または治療的に投与してもよい。標準的な臨床的方法を用いて、またはCDCA1もしくはKNTC2の遺伝子もしくはポリペプチドの異常な発現レベルもしくは活性を検出することによって、このような対象を特定する。疾患もしくは障害が予防されるか、またはその進行が遅延されるように、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に予防的投与を実施する。
【００８５】
本発明の方法は、NSCLC細胞が由来する同じ組織型の正常細胞と比較して、NSCLC細胞において発現が異常に増大する遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物の発現もしくは機能、または両方を低減させることを含む。発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害してもよい。例えば、対象中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の量を減少させる有効量の化合物で、対象を処置してもよい。化合物の投与は全身的または局所的でよい。このような治療的化合物には、NSCLC細胞中に内因的に存在するこのような遺伝子の発現レベルを低下させる化合物(すなわち、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現を下方制御する化合物)が含まれる。このような治療的化合物の投与は、対象のNSCLC細胞中の異常に過剰発現された遺伝子の影響に対抗し、対象の臨床状態が改善すると予想される。このような化合物は、前述した本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
【００８６】
または、CDCA1もしくはKNTC2の発現は、過剰発現された遺伝子の発現を阻害するか、またはそれに拮抗する核酸を対象に投与することによって阻害することができる。過剰発現された遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはリボザイムを、過剰発現された遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。
【００８７】
上記のように、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかに対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、その遺伝子の発現レベルを低下させることができる。NSCLCにおいて上方制御されるCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、NSCLCの治療または予防において有用である。具体的には、これらの遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、これらの遺伝子によってコードされた対応するポリペプチドのいずれか、もしくはそれに対応するmRNAに結合し、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/またはCDCA1ヌクレオチドもしくはKNTC2ヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を阻害し、最終的にそれらのタンパク質の機能を阻害することによって、作用し得る。本明細書において使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列に完全に相補的であるヌクレオチドおよび1つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するものの両方を包含する。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子のヌクレオチド配列のいずれかの少なくとも15個の連続的ヌクレオチドから最長で完全長配列までの範囲に渡って、少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性(配列同一性とも呼ばれる)を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、相同性を決定することができる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物もまた、本発明においてアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用され得る。このような修飾産物の例には、メチルホスホナート型またはエチルホスホナート型などの低級アルキルホスホナート修飾、ホスホロチオアート修飾、およびホスホロアミダート修飾が含まれる。
【００８８】
本発明のsiRNA分子はまた、本明細書において開示される遺伝子由来のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする能力によって定義することができる。本発明の文脈において、「ハイブリダイズする」および「特異的にハイブリダイズする」という用語は同義的に使用され、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下でハイブリダイズする2つの核酸分子の能力を意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、ある核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中でその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には検出可能な程度にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況においては異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHにおける個々の配列の熱融点(Tm)より約5℃〜10℃低くなるように選択される。Tmは(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的に相補的なプローブの50％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列が過剰に存在するため、Tmでは50％のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって実現してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％SDS、42℃でインキュベーション、または5×SSC、1％SDS、65℃でインキュベーションし、0.2×SSCおよび0.1％SDS中、50℃で洗浄。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子よってコードされるタンパク質を産生する細胞に対して、そのタンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害すことによって作用し、それによってタンパク質機能の阻害がもたらされる。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその誘導体は、その誘導体に対して不活性である適切な基材と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
【００９０】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子よってコードされる少なくとも1種のタンパク質の発現を阻害し、したがってそれぞれのタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。
【００９１】
過剰発現された遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物を阻害するポリヌクレオチドには、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子によってコードされる過剰発現タンパク質をコードするヌクレオチド配列のセンス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせから構成される低分子干渉RNA(siRNA)も含まれる。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を意味する。DNAがRNAの転写元の鋳型であるものを含む、siRNAを細胞中に導入する標準技術は、本発明の治療または予防において使用することができる。siRNAは、単一の転写物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的なアンチセンス配列の両方、例えばヘアピンを有するように構築される。
【００９２】
この方法は、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現が上方制御される細胞の遺伝子発現を抑制するのに使用される。標的細胞中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の転写物にsiRNAが結合すると、細胞によるCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも約10ヌクレオチドであり、天然の転写物と同じくらい長くてよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、約75、約50、または約25ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは、約19〜約25ヌクレオチド未満である。本発明において使用される好ましいsiRNAは、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]はCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は約3個〜約23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。本明細書において、「CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の標的配列」という語句は、NSCLC細胞株中に導入された場合、細胞生存を抑制するのに効果的である配列を意味する。
【００９３】
好ましいsiRNAは、センス鎖中にSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を有し、KNTC2遺伝子の発現を低減させるsiRNAである。siRNAは、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]はSEQ ID NO：9に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから構成されるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']は[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である。
【００９４】
さらにsiRNAのヌクレオチド配列は、Ambion社のウェブサイト(http：//www.ambion.com/techlib/ misc/siRNA_finder.html)から入手可能なsiRNA設計コンピュータプログラムを用いて設計してもよい。siRNAのためのヌクレオチド配列は、以下のプロトコールに基づくコンピュータプログラムによって選択してもよい。
【００９５】
siRNA標的部位の選択：
1．転写物のAUG開始コドンから開始して、下流へとスキャンしてAAジヌクレオチド配列を探す。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschl, et al. Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)では、5'および3'の非翻訳領域(UTR)ならびに開始コドン近傍の領域(75塩基以内)が調節タンパク質結合部位においてより豊富である可能性があり、したがってエンドヌクレアーゼとこれらの領域に対して設計されたsiRNAとの複合体は、UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体の結合を妨害し得ることから、これらの領域に対するsiRNAを設計することを推奨していない。
2.潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、かつ他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を、考慮の対象から排除する。相同性検索は、BLAST(Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997；25：3389-402.；J Mol Biol. 1990；215：403-10)を用いて実施することができ、これはNCBIサーバー上のwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で確認することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。Ambionのウェブサイトでは、評価のためにいくつかの好ましい標的配列を遺伝子の全長に沿って選択することができる。
【００９６】
本発明のsiRNAポリヌクレオチドを発現するベクターのトランスフェクションを用いて、NSCLC細胞の増殖を阻害することができる。したがって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、CDCA1またはKNTC2に対するsiRNAとして機能する二本鎖分子、ならびにその二本鎖分子をコードするベクターを提供することが、本発明の別の局面である。
【００９７】
本発明の二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖はCDCA1標的配列またはKNTC2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列であり、該センス鎖および該アンチセンス鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該二本鎖分子は、CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する。
【００９８】
本発明の二本鎖分子は、その本来の環境(すなわち、それが天然分子である場合、天然の環境)に由来するポリヌクレオチドでよく、その天然の状態から物理的もしくは化学的に改変されてもよく、または化学的に合成されてもよい。本発明によれば、このような二本鎖分子には、DNA、RNA、およびそれらの誘導体から構成されるものが含まれる。DNAは、A、T、C、およびGなどの塩基から適切に構成され、かつTはRNA中ではUに置き換えられる。
【００９９】
本発明のベクターは好ましくは、本発明の二本鎖分子をコードする領域に隣接し、適切な細胞においてその分子の発現を指示する調節配列を含む。例えば本発明の二本鎖分子は、例えば核内低分子RNA(snRNA)U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位またはヒトH1 RNAプロモーターを含むベクター中にそれらのコード配列をクローニングすることにより、細胞内で転写される。
【０１００】
または、その発現(DNA分子の転写)を可能にする様式で、目的の配列がベクターの調節配列に機能的に連結されるように、例えば発現ベクター中に標的配列をクローニングすることによって、本発明のベクターを作製することができる(Lee, N.S. et al., Nature Biotechnology 20：500-5(2002))。例えば、標的配列に対するアンチセンス配列を有するRNA分子の転写は、第1のプロモーター(例えば、クローン化DNAの3'末端に連結されたプロモーター配列)によって駆動され得、かつ標的配列に対するセンス配列を有するものは、第2のプロモーター(例えば、クローン化DNAの5'末端に連結されたプロモーター配列)によって駆動され得る。発現されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は、インビボで互いにハイブリダイズして、標的配列を含む遺伝子をサイレンシングするsiRNA構築物を生じる。さらに、2つの構築物(ベクター)を使用して、siRNA構築物のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ作製してもよい。
【０１０１】
細胞中にベクターを導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。FuGENE6(Roche diagnostice)、Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)、およびNucleofector(Wako pure Chemical)が、トランスフェクション促進剤として有用である。
【０１０２】
過剰発現された遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物を阻害する核酸には、そのような遺伝子に対するリボザイムも含まれる。本発明の文脈において、リボザイムは、過剰発現されるCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の発現を阻害し、それによってそのようなタンパク質の生物活性を抑制するのに有用である。したがって、このようなリボザイムから構成される組成物は、NSCLCを治療または予防するのに有用である。
【０１０３】
一般に、リボザイムは、大型リボザイムおよび小型リボザイムに分類される。大型リボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断する酵素として公知である。大型リボザイムとの反応後、反応した部位は、5'-リン酸基および3'-ヒドロキシル基からなる。大型リボザイムはさらに、(1)グアノシンによる5'-スプライス部位でのエステル転移反応を触媒するグループIイントロンRNA、(2)ラリアット構造を経た2段階反応による自己スプライシングを触媒するグループIIイントロンRNA、および(3)加水分解により、5'部位でtRNA前駆体を切断するリボヌクレアーゼPのRNA構成要素に分類される。これに対して、小型リボザイムは、大型リボザイムと比較してサイズが小さく(約40bp)、RNAを切断して5'-ヒドロキシル基および2'-3'環状リン酸を生じさせる。ハンマーヘッド型リボザイム(Koizumi et al., FEBS Lett. 228：225(1988))およびヘアピン型リボザイム(Buzayan, Nature 323：349(1986)；KikuchiおよびSasaki, Nucleic Acids Res. 19：6751(1991))は、小型リボザイムに含まれる。リボザイムを設計および構築するための方法は当技術分野において公知であり(Koizumi et al., FEBS Lett. 228：225(1988)；Koizumi et al., Nucleic Acids Res. 17：7059-71(1989)；KikuchiおよびSasaki, Nucleic Acids Res. 19：6751-5(1991)を参照されたい)、過剰発現されるNSCタンパク質の発現を阻害するリボザイムは、リボザイムを作製するための従来の方法に従って、CDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質をコードするヌクレオチド配列の配列情報に基づいて構築することができる。
【０１０４】
または、過剰発現される遺伝子の1種または複数種の遺伝子産物の機能は、この遺伝子産物に結合するか、または別の方法でその機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。このような化合物の例は、過剰発現される1種または複数種の遺伝子産物に結合する抗体である。
【０１０５】
本発明は、抗体、特に上方制御された遺伝子CDCA1もしくはKNTC2のいずれかよってコードされるタンパク質に対する抗体、またはそのような抗体の断片の使用に関する。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体を合成するために使用する抗原(すなわち、上方制御された遺伝子産物)を含む分子またはそれに密接に関連した抗原と特異的に相互作用(結合)する、特異的な構造を有する免疫グロブリン分子を意味する。過剰発現されたCDCA1またはKNTC2ヌクレオチドに結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体など任意の形態でよく、ウサギなどの動物をポリペプチドで免疫することによって得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組み換えによって作製されるヒト化抗体が含まれる。さらに、NSCLCを治療または予防する本発明の方法において使用する抗体は、マーカー遺伝子(CDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子)によってコードされる1種または複数種のタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体でもよい。NSCLCを治療または予防する本発明の方法の文脈において使用する抗体および抗体断片は、修飾されてよく、化学的に修飾された抗体およびキメラ抗体が含まれる。このような抗体および抗体断片は、前記の上述した方法に従って得ることができる。
【０１０６】
得られた抗体がヒトの身体に投与される場合(抗体治療)、免疫原性を減少させるために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を、CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチドなどの抗原、そのポリペプチドを発現する細胞、またはそれらの溶解物で免疫してもよい。次いで、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、そこからポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる(WO92-03918、WO94-02602、WO94-25585、WO96-33735、およびWO96-34096を参照されたい)。
【０１０７】
または、免疫されたリンパ球のような、抗体を産生する免疫細胞を癌遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するのに使用してもよい。本発明は、過剰発現されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を用いてNSCLCを治療または予防するための方法を提供する。この方法に従い、CDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する。過剰発現されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体は、CDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の活性を低下させるのに充分な投薬量で投与される。または、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する抗体を薬物送達のためのツールとして使用することもできる。したがって、例えば細胞毒性薬と結合した、過剰発現されたCDCA1ポリペプチドまたはKNTC2ポリペプチドに対する抗体を、腫瘍細胞を損傷するのに充分な投薬量で投与してもよい。
【０１０８】
さらに、本明細書において開示するタンパク質のドミナントネガティブ変異体を使用して、NSCLCを治療または予防することもできる。例えば本発明は、ドミナントネガティブな効果を有するCDCA1変異体、またはそのような変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法を提供する。CDCA1変異体は、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を含んでよく、そのnuf2ドメインは含まない。CDCA1変異体は、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有し得る。
【０１０９】
いくつかの好ましい態様において、CDCA1変異体は膜導入物質に連結している。いくつかのペプチド配列が、生細胞中に移行する能力について特徴付けられており、本発明のこの目的のために使用され得る。このような膜導入物質(典型的にはペプチド)は、内部移行後、生細胞中の細胞質コンパートメントおよび/または核コンパートメントに到達する能力によって定義される。導入物質が由来し得るタンパク質の例には、HIV Tatトランス活性化因子1、2、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)転写因子アンテナペディア3が含まれる。さらに、導入活性を有する非天然ペプチドも使用される。これらのペプチドは典型的に、移行に関して試験される膜相互作用特性が公知である小型ペプチドである。K-線維芽細胞増殖因子(FGF)、ハチ毒素マストパラン(トランスポータン)13、およびBuforin I14(両生類の抗菌ペプチド)の分泌シグナル配列内の疎水性領域が、導入物質として有用であることが示される。本発明において有用な両生類物質の総説については、Joliot et al. Nature Cell Biology 6：189-196(2004)を参照されたい。
【０１１０】
CDCA1変異体は、一般式
[R]-[D]
を有してもよく、式中[R]は膜導入物質であり、[D]はSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一般式において、[R]は[D]と直接結合してよく、またはリンカーを介して間接的に[D]と結合してよい。複数の官能基を有するペプチドまたは化合物がリンカーとして使用され得る。具体的には、アミノ酸配列-GGG-がリンカーとして使用され得る。または、膜導入物質およびSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、微小粒子の表面に結合することができる。本発明において、[R]は[D]の任意の領域と結合してよい。例えば[R]は、[D]のN末端もしくはC末端、または[D]を構成するアミノ酸残基の側鎖と結合してよい。さらに、複数の分子の[R]が、1分子の[D]と結合してもよい。いくつかの態様において、複数の分子の[R]が[D]の異なる部位と結合してよい。別の態様において、[D]は相互に連結されたいくつかの[R]で修飾されてよい。
【０１１１】
膜導入物質は、以下に挙げる群より選択することができる；
[ポリアルギニン]；Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-6007(2003)
[Tat/RKKRRQRRR](SEQ ID NO：37)Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93(1988)
Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88(1988)
[ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK](SEQ ID NO：38)
Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50(1994)
[Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](SEQ ID NO：39)
Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50(2000)
[トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](SEQ ID NO：40)
Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77(1998)
[MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA](SEQ ID NO：41)
Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39(1998)
[K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP](SEQ ID NO：42)
Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258(1995)
[Ku70/VPMLK](SEQ ID NO：43)
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003)
[Ku70/PMLKE](SEQ ID NO：50)
Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7(2003)
[プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](SEQ ID NO：44)
Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90(2002)
[pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK](SEQ ID NO：45)
Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44(2001)
[Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](SEQ ID NO：46)
Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-76(2001)
[SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR](SEQ ID NO：47)
Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86(2000)
[Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY](SEQ ID NO：48)
Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65(2002)
[HN-1/TSPLNIHNGQKL](SEQ ID NO：49)
Hong, F. D. & Clayman, G. L. Cancer Res. 60, 6551-6(2000)。
【０１１２】
本発明において、ポリアルギニンを構成するアルギニン残基の数は限定されていない。いくつかの好ましい態様において、5個〜20個の連続的なアルギニン残基が例示され得る。好ましい態様において、ポリアルギニンのアルギニン残基の数は11個である(SEQ ID NO：36)。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「CDCA1のドミナントネガティブな断片」という語句は、KNTC2と複合体を形成することができるCDCA1の変異型を意味する。したがって、ドミナントネガティブな断片は、完全長CDCA1ポリペプチドに機能的に等価ではないものである。好ましいドミナントネガティブな断片は、KNTC2結合領域を含み、そのnuf2ドメインは含まないものである。
【０１１４】
NSCLCを治療または予防するための薬学的組成物
本発明は、CDCA1遺伝子もしくはKNTC2遺伝子の発現または活性を改変する化合物をスクリーニングする本発明の方法によって選択された化合物を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物を提供する。このような活性成分は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、その遺伝子に対するsiRNAもしくはリボザイム、または発現ベクターのような、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、もしくはリボザイムの誘導体でもよい。
【０１１５】
本発明のスクリーニング方法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患(例えば非小細胞肺癌)を治療するために、ヒト、およびマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、またはチンパンジーなど他の哺乳動物用の薬剤として投与する場合、単離された化合物は直接投与するか、または従来の薬学的調製方法を用いて剤形へ製剤化することもできる。本発明の組成物のこのような薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、経鼻投与、局所投与(頬側および舌下を含む)、膣内投与もしくは非経口投与(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)、または吸入もしくは吹入による投与に適したものが含まれる。製剤は任意で、個別の投薬単位で包装されてもよい。
【０１１６】
経口投与に適した薬学的製剤には、限定されないが、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれ、それぞれ、所定の量の活性成分を含む。例示的な製剤には、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤もさらに含まれる。活性成分は任意で、ボーラス舐剤、またはペースト剤として投与される。経口投与に適した錠剤およびカプセル剤は、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、および/または湿潤剤など従来の賦形剤を含んでよい。錠剤は、任意で1種または複数種の製剤用成分と共に、圧縮または成形することによって製造してもよい。粉末または顆粒など易流動性の形態の活性成分を、任意で結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適切な機械中で圧縮することによって、圧縮錠剤を調製してもよい。不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械中で成形することによって、成形錠剤を製造してもよい。当技術分野において周知の方法によって、錠剤をコーティングしてもよい。経口用液体製剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形態でもよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶剤を用いて溶解するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油を含んでよい)、または保存剤など従来の添加剤を含んでよい。錠剤を任意で、インビボでの活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤のパッケージは、各月に服用されるべき1つの錠剤を含んでよい。これらの製剤中の薬剤の配合および用量により、指定された範囲内の適切な投薬量が取得できるようになる。
【０１１７】
非経口投与用の例示的な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および対象とするレシピエントの血液とその製剤を等張性にする溶質を任意で含む、水性および非水性の無菌注射液剤、ならびに限定されないが懸濁化剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性の滅菌懸濁剤が含まれる。製剤を、単位投与用容器または複数回投与用容器、例えば密閉されたアンプルおよびバイアルに入れて提供してもよく、使用する直前に、無菌の液体担体、例えば生理食塩水、注射用水の添加のみを必要とする、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。用時溶解注射用の液剤および懸濁剤は、先に述べた種類の無菌の散剤、顆粒剤、および錠剤から調製され得る。
【０１１８】
直腸投与用の例示的な製剤には、ココアバターまたはポリエチレングリコールなど標準的な担体を伴う坐剤が含まれる。口に、例えば口腔内または舌下に局所投与するための製剤には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの風味付きの基剤中に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、スクロース、またはアラビアゴムなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻腔内投与する場合、液体スプレーもしくは分散性の散剤、または滴剤の形態で使用され得る。滴剤はまた、1種もしくは複数種の分散剤、可溶化剤、もしくは懸濁化剤もまた含む水性または非水性の基剤と共に製剤化することができる。
【０１１９】
吸入による投与の場合、組成物は、注入器、ネブライザー、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の好都合な手段から都合よく送達してもよい。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体など適切な噴射剤を含み得る。加圧したエアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するバルブを提供することによって決定され得る。
【０１２０】
または、吸入もしくは吹入による投与の場合、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分とラクトースまたはデンプンなど適切な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、単位剤形、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックに入れて提供されてもよく、散剤は、吸入器または注入器の補助によりこれらから投与され得る。
【０１２１】
他の適切な製剤には、治療物質を放出する、埋め込み可能な器具および接着性のパッチが含まれる。
【０１２２】
所望の場合には、前述の製剤は、活性成分の持続放出を提供するように適合され得る。薬学的組成物はまた、限定されないが、抗菌剤、免疫抑制剤、および保存剤を含む他の活性成分も含んでよい。
【０１２３】
具体的に前述した成分に加えて、本発明の製剤は、該当する製剤のタイプを考慮して、当技術分野において慣例的な他の物質を含み得ること、例えば経口投与に適したものは矯味剤を含み得ることが、理解されるべきである。
【０１２４】
好ましい単位投薬製剤は、後述するような有効な用量の活性成分またはその適切な分割量を含むものである。
【０１２５】
前述した各状態に対して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、1日当たり約0.1 mg/kg〜約250 mg/kgの用量で経口的に、または注射によって投与され得る。ヒト成人に対する用量範囲は、一般に約5 mg/日〜約17.5 g/日、好ましくは約5 mg/日〜約10 g/日、および最も好ましくは約100 mg/日〜約3 g/日である。錠剤、または個別の単位で提供される形態の他の単位剤形は、便宜的に、そのような投薬量で、またはその倍数量として効果的である量を含んでよく、例えば各単位は、約5 mg〜約500 mg、通常約100 mg〜約500 mgを含む。
【０１２６】
使用する用量は、対象の年齢および性別、治療される厳密な疾患およびその重症度を含む、いくつかの要因に依存すると考えられる。同様に、投与経路も、状態およびその重症度に応じて異なってよい。
【０１２７】
上記のように、本発明はさらに、過剰発現される遺伝子の発現を阻害する活性成分を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物も提供する。活性成分は、その誘導体に対して不活性である適切な基剤材料と混合することによって、リニメント剤またはパップ剤などの外用製剤に調剤することができる。
【０１２８】
同様に必要に応じて、活性成分は、賦形剤、等張化剤、可溶化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することによって、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤、および凍結乾燥剤に製剤化することができる。これらは、核酸を含む薬剤を調製するための従来の方法に従って調製することができる。
【０１２９】
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、siRNA誘導体、またはリボザイム誘導体は、患部に直接適用することによって、または疾患部位に到達するように血管中に注射することによって、患者に与えられる。封入剤もまた、耐久性および膜透過性を高めるために、組成物中で使用することができる。封入剤の例には、リポソーム、ポリ-L-リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、およびそれらの誘導体が含まれる。
【０１３０】
このような組成物の投薬量を、患者の状態によって適切に調整し、所望の量で使用することができる。例えば、0.1 mg/kg〜100 mg/kg、好ましくは0.1 mg/kg〜50 mg/kgの用量範囲を投与することができる。
【０１３１】
本発明の別の態様は、CDCA1ポリペプチドもしくはKNTC2ポリペプチドに対する抗体、またはそのポリペプチドに結合する抗体の断片から構成される、NSCLCを治療または予防するための組成物である。
【０１３２】
投薬量は症状によって変動し得るが、NSCLCを治療または予防するための抗体またはその断片の例示的な用量は、通常の成人(体重60 kg)に経口投与する場合、1日当たり約0.1 mg〜約100 mg、好ましくは1日当たり約1.0 mg〜約50 mg、およびより好ましくは1日当たり約1.0 mg〜約20 mgである。
【０１３３】
通常の成人(体重60 kg)への注射の形態で非経口的に投与する場合、患者の状態、疾患の症状、および投与方法によっていくらかの違いはあるが、1日当たり約0.01 mg〜約30 mg、好ましくは1日当たり約0.1 mg〜約20 mg、およびより好ましくは1日当たり約0.1 mg〜約10 mgの用量を静脈内注射することが好都合である。同様に、他の動物の場合も、体重60 kgに変換した量を投与することが可能である。
【０１３４】
本明細書において同定される差次的に発現されるCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子はまた、NSCLCの治療の経過を予測またはモニターすることを可能にし得る。この方法では、試験生物試料は、NSCLCの治療を受けている対象から提供される。所望の場合は、複数の試験生物試料が、様々な時点、例えば治療前、治療中、または治療後に対象から採取される。次いで、試料中の1つまたは複数のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現レベルを決定し、かつ治療を受けていないNSCLCの公知の状態を有する参照試料と比較する。本発明のいくつかの好ましい態様において、CDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子の両方の発現レベルが検出してもよい。
【０１３５】
参照試料がNSCLC細胞を含まない場合、試験生物試料および参照試料中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現レベルが類似するならば、治療の有効性が示唆される。しかしながら、試験中のCDCA1遺伝子またはKNTC2遺伝子の発現レベルが参照試料と比較して異なるならば、臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示唆される。本発明の文脈において、予後の好ましい患者から得たNSCLC細胞を、参照試料として使用してもよい。例えば一般に、患者が手術後5年より長く生存できた場合、患者の予後は良好であった。より具体的には、長期生存者(すなわち予後良好)群および短期生存者(すなわち予後不良)群は、腫瘍特異的5年生存率の平均がそれぞれ69％超および45％未満であった患者を含む。したがって、このような短期生存者に由来し、かつ強い染色を示す試料は、予後不良の陽性対照として使用することができる。または、患者由来の試料の代わりに、患者由来の試料と同様の強い染色を示す試料または肺癌細胞株も、陽性対照として使用することができる。さらに、いくつかの態様において、CDCA1およびKNTC2を発現していない正常な肺細胞、肺癌細胞、または他の細胞を、予後不良の陰性対照として使用することができる。
【０１３６】
本発明はまた、以下からなる群より選択される1つまたは複数の構成要素を含む、NSCLCの予後を予測するためのキットも含む：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の存在を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を有するタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【０１３７】
いくつかの好ましい態様において、(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出するための試薬は、CDCA1核酸またはKNTC2核酸に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、CDCA1核酸もしくはKNTC2核酸に特異的に結合するか、またはそれを特定する核酸でよい。具体的には、SEQ ID NO：34(CDCA1)およびSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列は、SEQ ID NO：33 およびSEQ ID NO：31のヌクレオチド配列によってコードされる。したがって、SEQ ID NO：33およびSEQ ID NO：31のヌクレオチド配列より選択されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドは、本発明の好ましいプライマーまたはプローブとして使用され得る。または、本発明において、(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出するための試薬は、CDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質に結合する抗体でよい。さらに、(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬も、本発明のキットのために使用され得る。これらの検出試薬は、キットの形態で一緒に包装してもよい。これらの試薬、例えば(固体マトリックスに結合するか、もしくはマトリックスにそれらを結合させるための試薬と共に別々に包装される)核酸もしくは抗体、対照試薬(陽性および/もしくは陰性)、ならびに/または検出可能な標識は、好ましくは、別々の容器に包装される。アッセイ法を実施するための取扱い説明書(例えば、文書、テープ、VCR、CD-ROMなど)もキットに含まれてよい。キットのアッセイ形式は、ノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAでよく、いずれも当技術分野において公知である。
【０１３８】
例えば検出試薬を、多孔質ストリップのような固体マトリックス上に固定して、少なくとも1つのNSCLC検出部位を形成させてもよい。多孔質ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸を含む複数の部位を含んでよい。テストストリップは、陰性対照および/または陽性対照用の部位も含んでよい。または対照部位を、テストストリップとは別のストリップ上に配置してもよい。任意で異なる検出部位が、異なる量の固定された核酸を含んでもよく、すなわち第1の検出部位により多くの量を含み、次の部位により少ない量を含んでもよい。試験試料を添加した際、検出可能なシグナルを提示する部位の数が、試料の予後の定量的な指標を提供する。検出部位は、適切に検出することができる任意の形状で構成されてよく、典型的には、テストストリップの幅にわたる棒または点の形状である。
【０１３９】
以下の実施例は、本発明を例示し、かつ当業者がそれらを作製および使用するのを補助するために提供される。これらの実施例は、本発明の範囲を他の方法で限定することを決して意図しない。他に規定しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと同様または等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を後述する。本明細書において引用される任意の特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により組み入れられる。
【０１４０】
実施例
以下の実施例は、特許請求される本発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【０１４１】
材料および方法
(a)肺癌細胞株および組織試料：
以下のプロトコールにおいて使用したヒト肺癌細胞株は、以下のとおりであった：肺腺癌(ADC)A427、A549、LC319、PC3、PC9、PC14、NCI-H23、NCI-H522、およびNCI-H1373；細気管支肺胞上皮細胞癌(BAC)NCI-H1666およびNCI-H1781；肺腺扁平上皮癌(ASC)NCI-H226およびNCI-H647；肺扁平上皮癌(SCC)RERF-LC-AI、SK-MES-1、EBC-1、LC176、LU61、NCI-H520、NCI-H1703、およびNCI-H2170；肺大細胞癌(LCC)LX1；ならびに小細胞肺癌(SCLC)DMS114、DMS273、SBC-3、およびSBC-5。細胞はすべて、10％ウシ胎児血清(FCS)を添加した適切な培地中で単層で増殖させ、かつ5％CO2を含む加湿大気雰囲気中、37℃で維持した。ヒト小気道上皮細胞(SAEC)を、Cambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)から購入した、最適化された培地(SAGM)中で増殖させた。22個はADCに、14個はSCCに、1個はASCに分類された原発性NSCLC試料は、以前に記載されたように(Kikuchi T, et al., Oncogene. 2003；22(14)：2192-205)、インフォームドコンセントを書面で得た患者37名から得られた。さらに、8個のADCおよび8個のSCCを含む、独立した16個の原発性NSCLCを、外科手術を受けている患者から、隣接した正常肺組織試料と共に得た。合計256個のNSCLC試料および隣接した正常肺組織試料もまた、組織マイクロアレイ上での免疫染色およびさらなる統計学的解析のために、外科手術を受けた患者から採取した。本研究およびすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会(Ethical Committee)によって承認された。
【０１４２】
(b)半定量的RT-PCR：
製造業者のプロトコールに従ってTrizol試薬(Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)を用いて、培養細胞および臨床組織から全RNAを抽出した。抽出したRNAおよび正常ヒト組織のポリ(A)RNAをDNase I(Nippon Gene、東京、日本)で処理し、かつオリゴ(dT)プライマーおよびSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて逆転写した。半定量的RT-PCR実験は、以下の合成されたCDCA1特異的プライマー、KNTC2特異的プライマーを用いて、または内部対照としてのACTB特異的プライマーを用いて実施した：
CDCA1、5'-GAGAAACTGAAGTCCCAGGAAAT-3'(SEQ ID NO：1)および5'-CTGATACTTCCATTCGCTTCAAC-3'(SEQ ID NO：2)；
KNTC2、5'-AAAAGAACCGAATCGTCTAGAGTC-3'(SEQ ID NO：29)および5'-CCGAGAGATCTTCTGACATGC-3'(SEQ ID NO：30)；
ACTB、5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3'(SEQ ID NO：3)および5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3'(SEQ ID NO：4)。
PCR反応は、増幅の対数期の範囲内で産物の強度を確保するように、サイクル数を最適化した。
【０１４３】
(c)ノーザンブロット解析：
ヒト多組織ブロット(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を、CDCA1またはKNTC2の32P標識したPCR産物とハイブリダイズさせた。CDCA1およびKNTC2のcDNAプローブは、前述のプライマーを用いてRT-PCRによって調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を実施した。増感BASスクリーン(BIO-RAD, Hercules, CA)を用いて、室温で30時間、ブロットをオートラジオグラフ撮影した。
【０１４４】
(d)抗体：
抗CDCA1抗体を得るために、本発明者らは、pET28ベクター(Novagen, Madison, WI)を用いて、NH2末端にHisタグ付加エピトープを含むCDCA1の部分断片(コドン15〜338)を発現するプラスミドを調製した。組み換えペプチドを大腸菌(Escherichia coli)のBL21コドンプラス株(Stratagene, LaJolla, CA)において発現させ、かつ供給業者のプロトコールに従ってTALON樹脂(BD Bioscience)を用いて精製した。SDS-PAGEゲルで抽出したタンパク質をウサギに接種し；免疫血清を、標準的な方法論に従ってアフィニティカラムで精製した。アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗CDCA1抗体を、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、および免疫染色のために使用した。ヤギポリクローナル抗KNTC2抗体は、abcam Inc.(Cambridge, MA)から購入した。ウェスタンブロットにおいて、本発明者らは、CDCA1およびKNTC2を内因的に発現するか、もしくは発現しないNSCLC細胞株、またはCDCA1もしくはKNTC2発現ベクターをトランスフェクトした細胞由来の溶解物を用いて、この抗体がCDCA1またはKNTC2に特異的であることを確認した。
【０１４５】
(e)ウェスタンブロット法：
細胞を溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、0.5％ NP-40、0.5％デオキシコール酸Na、0.1％SDS、およびプロテアーゼインヒビター(Protease Inhibitor Cocktail Set III；Calbiochem Darmstadt, Germany))中に溶解した。本発明者らは、以前に記載されるように(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004；10(24)：8363-70)、ECLウェスタンブロット解析システム(GE Healthcare/Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ)を使用した。
【０１４６】
(f)CDCA1関連タンパク質の同定：
肺癌細胞株LC319由来の細胞抽出物を、プロテイナーゼインヒビターの存在下、最終容量2 mlの免疫沈降用緩衝液(0.5％ NP-40、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl)中で、プロテインAおよびプロテインGアガロースビーズ50μlと共に4℃で1時間インキュベーションすることによって前清浄した。1,000rpm、4℃で5分間遠心分離した後、上清を、抗CDCA1ポリクローナル抗体、抗KNTC2ポリクローナル抗体、または正常なウサギIgGと共に4℃で2時間インキュベートした。プロテインAおよびプロテインGアガロースビーズ50μlと共に4℃で1時間インキュベーションした後、これらのビーズを5,000rpmで2分間の遠心分離によって各試料から回収し、免疫沈降用緩衝液1 mlで6回洗浄し、洗浄したビーズをLaemmli試料用緩衝液50μl中に再懸濁し、5分間煮沸した後、5％〜10％SDS PAGEゲル(BIO RAD)上でタンパク質を分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。抗CDCA1ポリクローナル抗体と共にインキュベートした抽出物中で特異的に発見されたタンパク質バンドを切り出して、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS；AXIMA-CFR plus, SHIMADZU BIOTECH、京都、日本)によって解析するために使用した。CDCA1とKNTC2の相互作用を確認するために、本発明者らは、免疫沈降実験を実施した。pCAGGSn3Fc-CDCA1を得るために、本発明者らは、pCAGGSn3Fc-CDCA1プラスミドベクターの適切な部位中に完全なコード配列をクローニングした。各cDNAクローンのヌクレオチド配列は、製造業者の取扱い説明書に従い、T3プライマー、T7プライマー、または合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ABI Prism 3700 DNAシークエンサー(Applied Biosystems, Foster City, CA)によって決定した。pCAGGSn3Fc-CDCA1をトランスフェクトしたLC319細胞由来の抽出物を、KNTC2ポリクローナル抗体(Abcom, Inc.)および正常なウサギIgGでそれぞれ免疫沈降させた。抗FLAG M2モノクローナル抗体(Sigma-Aldrich Co.)を用いて、免疫ブロットを実施した。
【０１４７】
(g)CDCA1中のKNTC2結合領域の同定：
CDCA1の11種の欠失構築物(CDCA1 200-464、CDCA1 149-464、CDCA1 1-348、CDCA1 1-148、CDCA1 149-306、CDCA1 306-464、CDCA1 319-464、CDCA1 277-416、CDCA1 277-367、CDCA1 319-416、およびCDCA1 319-367)を、C末端をFLAGでタグ付加したpCAGGSベクターの適切な部位にクローニングした。CDCA1の11種の欠失構築物を発現するプラスミドをトランスフェクトした肺癌細胞株LC319由来の細胞抽出物を、プロテイナーゼインヒビターの存在下、最終容量2 mlの免疫沈降用緩衝液(0.5％ NP-40、50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl)中で、プロテインGアガロースビーズ100μlと共に4℃で1時間インキュベーションすることによって前清浄した。1,000rpm、4℃で5分間遠心分離した後、上清を抗FLAG M2アガロースと共に4℃で2時間インキュベートした。これらのビーズを5,000rpmで2分間の遠心分離によって各試料から回収し、免疫沈降用緩衝液1 mlで6回洗浄した後、洗浄したビーズをLaemmli試料用緩衝液50μl中に再懸濁し、5分間煮沸した後、10％SDS PAGEゲル上でタンパク質を分離した。KNTC2ポリクローナル抗体(Abcom, Inc.)および抗FLAGM2モノクローナル抗体(Sigma-Aldrich Co.)をそれぞれ用いて、免疫ブロットを実施した。
【０１４８】
(h)免疫細胞化学：
培養細胞をPBS(-)で2回洗浄し、室温で60分間、4％ホルムアルデヒド溶液中で固定し、かつ0.1％ Triton X-100を含むPBS(-)で1.5分間処理することによって透過性にした。一次抗体反応の前に、細胞をPBS(-)中3％BSAで60分間覆って、非特異的結合をブロックした。次いで細胞を、ヒトCDCA1タンパク質またはヒトKNTC2タンパク質に対する抗体と共にインキュベートした。免疫複合体を、Alexa488(Molecular Probes, Eugene, OR)に結合させたヤギ抗ウサギ二次抗体およびAlexa594(Molecular Probes)に結合させたロバ抗ヤギ二次抗体で染色し、レーザー共焦点顕微鏡(TCS SP2 AOBS：Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)で観察した。
【０１４９】
(i)免疫組織化学および組織マイクロアレイ解析：
以前に公開されたように、ホルマリン固定したNSCLCを用いて腫瘍組織マイクロアレイを構築した(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res. 2004；10(24)：8363-70)。試料採取するための組織領域は、スライド上の対応するHE染色切片との視覚的な整合に基づいて選択した。ドナーの腫瘍塊から採取した3つ、4つ、または5つの組織コア(直径0.6 mm；高さ3〜4 mm)を、組織マイクロアレイヤー(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI)を用いてレシピエントパラフィンブロック中に配置した。正常組織のコアを各例からパンチした。結果として生じるマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学的解析のために使用した。CDCA1およびKNTC2に対する陽性を、臨床的なフォローアップデータの事前知識を持たない独立した研究者3名によって半定量的に評価した。各研究者は、染色強度を、無し(0として記録)、弱い(1+)、または強い陽性(2+)として記録した。肺癌は、検査者すべてがそれらをそのように定義した場合にのみ、強い陽性(2+)と記録された。臨床材料中のCDCA1/KNTC2タンパク質の存在を調査するために、本発明者らは、ENVISION+ Kit/HRP(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)を用いて組織切片を染色した。内在性のペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロッキングした後、アフィニティ精製した抗CDCA1抗体または抗KNTC2抗体を添加し、各切片を二次抗体としてのHRP標識抗ウサギIgGまたはHRP標識抗ヤギIgGと共にインキュベートした。基質-色素原を添加し、かつヘマトキシリンで試料を対比染色した。
【０１５０】
(j)統計学的解析：
本発明者らは、年齢、性別、および病理学的なTNM病期などの臨床病理学的変動要素と、組織マイクロアレイ解析によって決定されたCDCA1および/またはKNTC2タンパク質の発現レベルとを相関させようと試みた。腫瘍特異的生存曲線を、手術日からNSCLCに関連した死亡時まで、または最後のフォローアップ観察時まで算出した。カプラン・マイヤー曲線を、関連する各変動要素およびCDCA1/KNTC2発現に関して算出し；患者サブグループ間の生存期間の差異をログ・ランク検定によって解析した。コックス比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を実施して、臨床病理学的変動要素と癌に関連する死亡率との関連を決定した。最初に、本発明者らは、死亡と、年齢、性別、pT-分類、およびpN-分類を含む考え得る予後因子との関連を、一度に一因子を考慮して解析した。次に、多変量コックス解析を、p値0.05未満のエントリーレベルを満たした任意およびすべての変動要素と共に、CDCA1/KNTC2発現を常にモデルに強制する後ろ向き(段階的)の方法に適用した。モデルが因子を加え続けた場合、独立した因子はP＜0.05のエクジットレベルを超えなかった。
【０１５１】
(k)RNA干渉アッセイ法：
本発明者らは以前、哺乳動物細胞中でsiRNAを合成するように設計した、ベクターに基づくRMA干渉(RNAi)系、psiH1BX3.0を確立した(Shimokawa T, et al., Cancer Res. 2003；63(19)：6116-20)。CDCA1に対するsiRNA発現ベクター(si-CDCA1)およびKNTC2に対するsiRNA発現ベクター(si-KNTC2)を、表1の2本鎖オリゴヌクレオチドをpsiH1BXベクターのBbsI部位中にクローニングすることによって調製した。Lipofectamine 2000(Invitrogen)30μlを用いて、NSCLC細胞株のA549およびLC319にsiRNA発現ベクター10μgをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、適切な濃度のジェネテシン(G418)の存在下で7日間培養し、コロニーの数をギムザ染色によって計数し、かつ処理後7日目にMTTアッセイ法によって細胞生存率を評価した；簡潔には、細胞計数キット8溶液(DOJINDO、熊本、日本)を1/10体積の濃度で各ディッシュに添加し、かつ37℃でさらに4時間、プレートをインキュベートした。次いで、490nmおよび参照として630nmでの吸光度をMicroplate Reader 550(BIO-RAD)で測定した。CDCA1またはKNTC2のmRNA発現の抑制を確認するために、半定量的RT-PCR実験を、以下の合成したCDCA1特異的プライマーおよびKNTC2特異的プライマーを用い、標準プロトコールに従って実施した。RNAiのための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下のとおりであった：(EGFP：強化緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea victoria)GFPの変異体)、5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(SEQ ID NO：5)；対照2(スクランブル：5Sおよび16SのrRNAをコードするユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)葉緑体遺伝子)、5'-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3'(SEQ ID NO：6)；対照3(ルシフェラーゼ：キタアメリカホタル(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子), 5'-CGTACGCGGAATACTTCGA-3'(SEQ ID NO：7)；siRNA-CDCA1-#2, 5'-AAGATGCTGCTGAAAGGGAGA-3'(SEQ ID NO：8)；siRNA-KNTC2-#1, 5'-GCTGGATGATCTTTACCAA-3'(SEQ ID NO：9)。
【０１５２】
（表１）siRNA発現ベクター中に挿入された特異的2本鎖オリゴヌクレオチドの配列および各siRNAの標的配列
【０１５３】
(l)合成されたドミナントネガティブなペプチド：
CDCA1のKNTC2結合ドメイン由来のドミナントネガティブな20個または19個のアミノ酸配列のN末端を、膜導入11ポリアルギニン配列(11R)に共有結合させた。4種のドミナントネガティブなペプチドを合成した：11R-CDCA1 368-387, RRRRRRRRRRR-GGG-QYKRTVIEDCNKVQEKRGAV(SEQ ID NO：10)；11R-CDCA1 378-397, RRRRRRRRRRR-GGG-NKVQEKRGAVYERVTTINQE(SEQ ID NO：11), 11R-CDCA1 388-407, RRRRRRRRRRR-GGG-YERVTTINQEIQKIKLGIQQ(SEQ ID NO：12)；11R-CDCA1 398-416 RRRRRRRRRRR-GGG-IQKIKLGIQQLKDAAEREK(SEQ ID NO：13)。ペプチドは分取逆相HPLCによって精製され、95％を超える純度であった。
【０１５４】
(m)肺癌細胞増殖に対する11R-ペプチドの作用：
LC319およびA546、ならびに正常ヒト肺線維芽細胞由来のMRC5細胞を、濃度5μM、10μM、および20μMの11R-ペプチドと共に7日間インキュベートした。各ペプチドの適切な濃度で1日おきに培地を交換し、処理後7日目にMTTアッセイ法によって細胞生存率を評価した；簡潔には、細胞計数キット8溶液(DOJINDO、熊本、日本)を1/10体積の濃度で各ディッシュに添加し、かつ37℃でさらに4時間プレートをインキュベートした。次いで、490nmおよび参照として630nmでの吸光度をMicroplate Reader 550(BIO-RAD)で測定した。以前に記載されたように(Suzuki, C. et al. Cancer Res. 65, 11314-11325(2005))、フローサイトメトリー解析を実施した。
【０１５５】
(n)マウスモデル：
動物実験は、実験動物の管理と使用に関する施設および国の指針に従って実施し、かつ施設内動物使用委員会によって承認された。A549細胞1×106個を6週齢のオスのBALB/cヌードマウス(nu/nu)の右肩に皮下移植した。注射後2週間目に、腫瘍(平均体積30 mm3)を有するマウスを無作為に3群に分け、腫瘍内に11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブル(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)を7週間投与した。カリパスを用いて腫瘍体積を1日1回測定し、そのデータを式(体積=0.52×[幅]2×[長さ])に適用してスフェロイドの体積を算出した。
【０１５６】
結果
(a)CDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子の同時活性化：
23,040遺伝子に相当するcDNAマイクロアレイを用いて、大部分のNSCLCにおいて高度にトランス活性化されたエレメントをスクリーニングし、CDCA1(アクセッション番号hCT1957725(Celera)SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34)を優良な候補として同定した。この遺伝子は、検査したNSCLC症例の大多数において、3倍またはそれより高い発現レベルを示した。続いてそのトランス活性化を、さらに16のNSCLC症例のうち10例(ADC8個のうち4個、SCC8個のうち6個)における半定量的RT-PCR実験によって確認した(図1A)。CDCA1の上方制御は、検査した23個のNSCLC細胞株およびSCLC細胞株のすべてにおいて観察されたが、転写物は正常気管支上皮由来のSAEC細胞においてはほとんど検出可能ではなかった(図1B)。CDCA1タンパク質の内在性発現を、12個の肺癌細胞株において、抗CDCA1抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した(データ示さず)。CDCA1 cDNAをプローブとして用いたノーザンブロット解析により、精巣においてのみ独占的かつ大量に観察される2.4 kbの転写物を同定し、これはCDCA1が典型的な癌精巣抗原であることを示唆した(図1C)。
【０１５７】
(b)CDCA1と相互作用するタンパク質としてのKNTC2の同定：
肺癌細胞中のCDCA1の機能を解明するため、本発明者らはまず、CDCA1と相互作用すると考えられるタンパク質を探した。LC319細胞の溶解物を抽出し、抗CDCA1抗体を用いて免疫沈降させた。タンパク質複合体を、SDS-PAGEゲル上でSilverQuest(Invitrogen)で染色した。抗CDCA1で免疫沈降されたが正常なウサギIgGでは免疫沈降されなかった細胞溶解物中で認められた75 kDaのバンドを切り出し、そのペプチド配列をMALDI-TOF質量分析法によって決定した。この方法により、KNTC2(GenBankアクセッション番号NM_006101, SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32)が、CDCA1と相互作用するタンパク質の候補として同定された。外来CDCA1と内在性KNTC2の同族相互作用が、免疫沈降実験によって確認された(図2A)。
【０１５８】
肺癌細胞における内在性のCDCA1およびKNTC2の細胞内局在を決定するために、ウサギポリクローナル抗CDCA1抗体およびヤギポリクローナル抗KNTC2抗体を用いて、免疫細胞化学的解析を実施した；G1/S期では主に中心体および核、ならびにG2/Mでは中心体およびセントロメアでの両方のタンパク質の共局在化が検出された(図2B)。
【０１５９】
原発性NSCLC組織および肺癌細胞株を続いて再検査し、NSCLC臨床試料16個中9個(ADC8個中3個、SCC8個中6個)におけるKNTC2発現の増大を半定量的RT-PCR実験によって確認し、同様に肺癌細胞株23個すべてにおいても確認した(図1A、図1B)。ACTB遺伝子に比べて高い、CDCA1遺伝子およびKNTC2遺伝子のmRNA発現パターンは、臨床試料において有意に相関していた(X2検定によりP＜0.001)。これら2種の遺伝子は、検査した肺癌細胞株のほぼすべてにおいても同時活性化されていた(X2検定によりP＜0.001)。KNTC2cDNAをプローブとして用いたノーザンブロットにより、精巣において独占的かつ大量に2.5 kbの転写物が同定され、これによりKNTC2が癌精巣抗原の部類に属することが示唆された(図1C)。肺癌および正常組織におけるKNTC2の発現分布パターンは、CDCA1のものに非常に類似していた。
【０１６０】
(c)CDCA1中のKNTC2結合領域の同定：
KNTC2との相互作用に必要とされるCDCA1の特異的ドメインを決定するために、COOH(C)末端FLAG配列を有するCDCA1の6種の欠失構築物(CDCA1 200-464、CDCA1 149-464、CDCA1 1-348、CDCA1 1-148、CDCA1 149-306、およびCDCA1 306-464)のうち1種をLC319細胞中にトランスフェクトした。モノクローナル抗Flagを用いた免疫沈降法により、C末端のアミノ酸158個を欠いた、CDCA1 1-148構築物およびCDCA1 149-306構築物が、内在性KNTC2と相互作用できないことが示唆された(図2C)。CDCA1の最小限のKNTC2結合ドメインをさらに決定するために、C末端FLAG配列を有するCDCA1のさらに5種の欠失構築物(CDCA1 319-464、CDCA1 277-416、CDCA1 277-367、CDCA1 319-416、およびCDCA1 319-367)のうち1種をLC319細胞中にトランスフェクトした。モノクローナル抗Flag抗体を用いた免疫沈降法により、CDCA1 368-416のアミノ酸49個を欠いたCDCA1 277-367構築物およびCDCA1 319-367構築物が、内在性KNTC2と相互作用できないことが示唆された(図2D)。
【０１６１】
(d)CDCA1およびKNTC2の過剰発現と予後不良との関連：
256個のNSCLCから調製した組織マイクロアレイを使用して、アフィニティ精製した抗CDCA1およびKNTC2ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的解析を実施し、それぞれ225例(88％)および225例(88％)において陽性染色を確認した。これらのうち、CDCA1染色は、ADC腫瘍138例中117例(85％)において陽性であり、80例中72例はSCCであり(90％)、21例中19例はLCCであり(90％)、BAC10例のすべて(100％)およびASC7例のすべて(100％)で陽性であった。一方、KNTC2染色は、ADC腫瘍138例中113例(82％)において陽性であり、80例中75例はSCCであり(94％)、21例中20例はLCCであり(95％)、BAC10例のすべて(100％)およびASC7例のすべて(100％)で陽性であった。これらの腫瘍はすべて外科的に切除されたNSCLCであり、それらに隣接したいかなる正常肺組織においても染色は観察されなかった(図3A)。CDCA1タンパク質の発現パターンは、これらの腫瘍におけるKNTC2タンパク質発現と有意に一致し(X2検定によりP＜0.001)、これによりRT-PCRおよびウェスタンブロット法による結果が裏付けられた。CDCA1/KNTC2発現のパターンを無し/弱い(0〜1+として記録)または強い(2+として記録)に分類した。CDCA1およびKNTC2の両方に関して強い陽性を示す腫瘍を伴う症例は、予後不良となる可能性があった(ログ・ランク検定によりP=0.146、図3B)。CDCA1/KNTC2免疫染色試験における長期生存者および短期生存者の定義は、以下のとおりである：
長期生存者：5年生存率の平均が少なくとも69％であった患者群に属する患者、および
短期生存者：5年生存率の平均が45％を超えなかった患者群に属する患者。
【０１６２】
さらに、282個のパラフィン包埋NSCLCから調製した組織マイクロアレイを使用して、アフィニティ精製した抗CDCA1および抗KNTC2ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的解析を実施した。CDCA1/KNTC2発現のパターンを無し/弱い(0〜1+として記録)または強い(2+として記録)に分類した。検査したNSCLC282例のうち、95例(33.7％)は強いCDCA1染色(スコア2+)を示し、113例(40.1％)は弱く染色され(スコア1+)、かつ74例(26.2％)では染色は観察されなかった(スコア0)。KNTC2については、強い染色(スコア2+)が112例(39.7％)において観察され、弱い染色(スコア1+)が122例(43.3％)において観察され、かつ48例(17％)では染色は観察されなかった(スコア0)。これらの腫瘍はすべて外科的に切除されたNSCLC症例であり、それらに隣接したいかなる正常肺組織においても染色は観察されなかった(図1c)。腫瘍282個のうち189個は、CDCA1およびKNTC2の両方に関して陽性(1+〜2+として記録)であり、29個は両方のタンパク質に関して陰性であった。282例のうち19例はCDCA1に関してのみ陽性であり、45例はKNTC2に関してのみ陽性であった。CDCA1タンパク質の発現パターンが、これらの腫瘍におけるKNTC2タンパク質発現と有意に一致した(X2検定によりP＜0.0001)ことにより、RT-PCRおよびウェスタンブロット法による結果がさらに裏付けられ、CDCA1およびKNTC2に対する共通の転写調節因子がある可能性が示唆された。NSCLCにおけるCDCA1の強い発現は、pT因子の状態(X2=5.473、P=0.019)および腫瘍特異的5年生存率(ログ・ランク検定によりP=0.0233)と有意に関連していた(図3C)。NSCLCにおけるKNTC2の強い発現は、pT因子(X2=11.664、P=0.0006)および5年生存率(ログ・ランク検定によりP=0.0384)と有意に関連していた(図3D)。腫瘍がCDCA1もKNTC2も発現しなかったNSCLC患者は、最良の延命効果を受けたが、両方のマーカーに関して強い陽性の値を示した患者は、最も短期間の腫瘍特異的生存を被った(ログ・ランク検定によりP=0.0250、図3E)。単変量解析を用いて、本発明者らは、節の状態(N0対N1、N2：P＜0.0001；スコアテスト)、腫瘍サイズ(T1対T2、T3、T4：P＜0.001；スコアテスト)、および高いCDCA1/KNTC2発現(それぞれP=0.0233、P=0.0384；スコアテスト)が、NSCLC患者の予後不良に関して重要な相関関係にある特徴であることを見出した。
【０１６３】
(e)CDCA1およびKNTC2に対する特異的siRNAによるNSCLC細胞増殖の阻害：
CDCA1およびKNTC2が肺癌細胞の増殖または生存に不可欠であるかどうかを評価するために、EGFP、ルシフェラーゼ、およびスクランブルに対するsiRNAを対照として用いて、CDCA1に対するsiRNA(si-CDCA1)またはKNTC2に対するsiRNA(si-KNTC2)を発現するようにプラスミドを構築した。A549細胞またはLC319細胞中にプラスミド(si-CDCA1-#2またはsi-KNTC2#1)のいずれかをトランスフェクトした場合、対照と比較して内在性のCDCA1タンパク質またはKNTC2タンパク質の発現は有意に抑制され、かつMTTアッセイ法(対応のないt検定によりそれぞれP=0.0008およびP=0.0005)およびコロニー形成アッセイ法によって測定した細胞生存率およびコロニー数は有意に減少した(A549の代表的なデータを図4Aおよび図4Bに示した)。
【０１６４】
(f)CDCA1のドミナントネガティブなペプチドによるNSCLC細胞増殖の阻害：
肺癌細胞の増殖または生存に対する、CDCA1-KNTC2相互作用の機能的重要性を調査するために、CDCA1のN末端部分を欠くが、他の欠失変異体と比較して内在性KNTC2に対して最大の親和性を示したCDCA1の欠失断片(CDCA1 200-464；図2Cを参照されたい)を、CDCA1とKNTC2の直接的な相互作用を抑制するドミナントネガティブな機能に関して検査した。抗CDCA1/KNTC2抗体で免疫沈降させた内在性CDCA1のバンドは、IgG重鎖のバンドと重なったため、内在性のCDCA1とKNTC2との相互作用を検出することは困難であった。したがって、CDCA1 200-464構築物による、CDCA1とKNTC2の直接的な相互作用の抑制を確認するために、プラスミドの2通りの組み合わせ；CDCA1 1-464(完全長)およびCDCA1 200-464またはCDCA1 1-464(完全長)およびCDCA1 149-306(対照)(内在性KNTC2と相互作用することができない)(図5A、左から2番目の上のパネル)を、LC319細胞中に同時トランスフェクトした。CDCA1 1-464(完全長)またはCDCA1 200-464のみと内在性KNTC2との相互作用が、抗KNTC2ポリクローナル抗体を用いた免疫沈降法によって検出された(図5A；左上のパネル；黒および白の矢印)。CDCA1 200-464の過剰発現により、外来CDCA1(CDCA1 1-464；完全長)と内在性KNTC2との複合体形成が減少することがさらに確認された(図5A；左上のパネル；黒の矢印)。LC319細胞におけるCDCA1 200-464および内在性KNTC2の共局在化もまた、免疫細胞化学によって確認された(図5A；右のパネル)。次に、CDCA1 200-464をコードするプラスミドをLC319細胞中にトランスフェクトして、この構築物のドミナントネガティブな効果を検出した。予想通り、CDCA1 200-464のドミナントネガティブな断片のトランスフェクションは、MTTアッセイ法によって測定した細胞生存率を有意に減少させた(対応のないt検定によるP=0.0026、CDCA1 200-464対CDCA1 149-306；図5B)。
【０１６５】
図2Dに示したように、CDCA1 368-416のアミノ酸49個のペプチドが、内在性KNTC2と相互作用する最も重要な領域であると予想された。CDCA1-KNTC2複合体形成をインビボで阻害することができる生物活性細胞透過性化合物を開発するために、膜導入11ポリアルギニン配列(11R)にN末端で共有結合したCDCA1 368-416のKNTC2結合ドメインを包含する4種のアミノ酸ポリペプチドを合成した。これらのポリアルギニンを連結されたペプチドの肺癌細胞増殖/生存に対する作用を試験するために、4種のCDCA1由来ペプチドのうちの1種で個別にLC319細胞を処理した。11R-CDCA1 398-416のトランスフェクションにより、MTTアッセイ法により測定した細胞生存率は、有意かつ用量依存的に減少した(図5C；対応のないt検定によるP=0.001またはP=0.0021)。11R-CDCA1 398-416処理後72時間目に、いくつかの細胞は細胞周期を経て発達し、有糸分裂で阻止されて、siRNAによるCDCA1またはKNTC2いずれかの抑制の効果に非常に類似した円形の細胞形態を示した(データ示さず)。一方、未処理細胞と非効果的ペプチドで処理したものとで細胞の形態に違いはなく、どちらも広がった形状の間期細胞および丸い形状の有糸分裂細胞の正常な分布を示した。11R-CDCA1 398-416ペプチドによる腫瘍抑制のメカニズムを明らかにするために、これらのペプチドで処理した腫瘍細胞のフローサイトメトリー解析を実施し、これらの細胞がG2/M停止を引き起こすこと、および処理後72時間目のsub-G1画分が有意に増加した(図6A)ことを開示した。11R-CDCA1 398-416は、ほとんど検出不可能なレベルのCDCA1およびKNTC2しか発現しなかった正常ヒト肺線維芽細胞由来MRC5細胞の細胞生存率には全く影響を与えなかった(図6B)。これらのデータにより、形質導入可能な11R-CDCA1 398-416ペプチドが、CDCA1およびKNTC2の機能的複合体形成を阻害し得ること、ならびにこれらのタンパク質を発現しない正常ヒト細胞に対する毒性作用を有さないことが示唆される。
【０１６６】
(g)ドミナントネガティブなペプチドによるNSCLC細胞のインビボでの増殖阻害：
CDCA1のドミナントネガティブなペプチドのインビボでの腫瘍抑制効果をさらに調査するために、A549細胞を6週齢のBALB/cマウスの右肩に皮下移植し、11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブルペプチド(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)の腫瘍内注射によってマウスを7週間処理した。3つの処理群の間に体重および食餌摂取量の差はなかった(データ示さず)。腫瘍増殖は、11R-CDCA1 398-416ペプチドによって有意に抑制されたが、スクランブルペプチドによってもPBSによっても抑制されなかった(図7A、図7B)。これらのデータにより、CDCA1のドミナントネガティブなペプチドがインビトロおよびインビボで癌細胞に対する増殖抑制効果を有すること、ならびにCDCA1-KNTC2相互作用の阻害が、新規なタイプの抗癌薬物を開発するための有望な標的であり得ることが示唆された。
【０１６７】
考察
肺癌治療のための多くの分子標的が報告されているが、今日まで、有害な副作用を最小限に抑えつつ、臨床状況において癌に対抗する生物活性を発揮することが示される物質はほとんどない。したがって、本発明者らは、肺癌治療のための新規な小型化合物を開発する目的で、上方制御された遺伝子を同定しようと探求した。戦略は以下のとおりであった：1)cDNAマイクロアレイシステムを用いたゲノム全域スクリーニングによってNSCLC中の上方制御された遺伝子を同定し、2)多組織ノーザンブロット解析により、それらの候補遺伝子が正常な器官において最小限の発現を有したことを確認し、3)組織マイクロアレイにより、数百個のNSCLC組織試料における過剰発現および臨床病理学的因子との相関を裏付け、かつ4)siRNAによって、標的とした遺伝子が肺癌細胞の生存または増殖に不可欠であることを確認する。この体系的なアプローチによって、2種の新規な癌精巣抗原であるCDCA1およびKNTC2が、大半のNSCLC臨床試料および細胞株において同時に過剰発現されることが特定された。さらに、これらの遺伝子の産物によって形成される複合体は、NSCLC細胞の増殖および発達に必須であることが判明した。
【０１６８】
CDCA1およびKNTC2は、有糸分裂の調節に関与することが示された(Ciferri, C. et al. J Biol Chem. 280, 29088-95(2005))。有糸分裂を調節するタンパク質の大部分は、正常な対応物と比較した場合、ヒト腫瘍細胞において異常に発現され、そのうち一部は、癌遺伝子として機能することが公知である(Nicholas, K.およびStephen, T.Nat Rev Cancer. 4, 927-36(2004))。そのサブセットもまた、新規な抗癌物質を開発するための標的分子の可能性のある供給源になると予想された。例えば、高度に保存されるオーロラキナーゼは、有糸分裂の調節因子として重要であるそのようなファミリーの1つを代表する(Doggrell, S.A.Expert Opin Investig Drugs. 13, 1199-201(2004))。実際、ZM447439、ヘスペラジン(Hesperadin)、およびVX-680を含むいくつかのオーロラキナーゼ阻害剤が、抗癌薬として最近記載された(Doggrell, S.A.Expert Opin Investig Drugs. 13, 1199-201(2004)；Harrington, E.A. et al. Nat Med. 10, 262-7(2004))。本研究において、本発明者らは、組織マイクロアレイ解析により、CDCA1/KNTC2の大量発現を示すNSCLC患者の腫瘍特異的生存期間がより短いことを見出し、したがってCDCA1がKNTC2と共に、肺癌の進行において重要な役割を果たすことが示唆された。
【０１６９】
新規な分子標的は、推定される様々な影響は最小限であること、ならびに癌に対する強力な生物活性を有することが期待される。CDCA1およびKNTC2は、いずれも細胞周期調節因子であることが公知であり、かつ本発明者らのMTNスクリーニングにより、本発明者らは、これら2種のタンパク質が癌精巣抗原に属することを実証した。本発明者らはまた、CDCA1およびKNTC2がNSCLCにおいて同時に過剰発現されることも実証した。256個または282個のNSCLCから調製した組織マイクロアレイにおける免疫組織化学的解析により、両方のタンパク質の強力な陽性染色を示すNSCLC患者は、より短い腫瘍特異的生存期間を示す可能性があることが明らかになり、これによりCDCA1がKNTC2と共に、肺癌の進行に関する非常に重要な役割を果たすことが示唆された。さらに、内在性のCDCA1またはKNTC2を抑制すると、それらの発現が低減され、かつA549細胞およびLC319細胞の増殖が抑制された。さらに本発明者らは、これらの結合が、ドミナントネガティブ型のCDCA1タンパク質、ならびに膜導入ポリアルギニン配列およびCDCA1由来のアミノ酸19個のペプチド(コドン398〜416)から構成されるアミノ酸33個の合成ポリペプチドによって妨害され、続いて肺癌細胞の増殖が効果的に抑制されることを初めて実証した。最近、いくつかのグループが、これらの分子間の相互作用を阻害すると、複合体の機能喪失が生じることを報告した。例えば、JNK相互作用タンパク質-1(JIP-1)のJNK結合ドメイン由来のアミノ酸20個の配列に細胞透過性の短いペプチドを共有結合させると、糖尿病マウスにおいてインスリン抵抗性が改善し、かつ耐糖能が改善した(Kaneto H, et al., Nat Med. 2004；10：1128-32)。さらに、細胞透過性ペプチド(SN50)は、外部刺激による活性化後のNF-κBの移行をブロックした(Lin YZ, et al., J Biol Chem. 1995；270：14255-8)。NF-κBをブロックすると、IL-1βが誘導するアポトーシスからβ細胞が保護される(Stephens LA, et al., J Autoimmun. 1997；10：293-8)。同様のアプローチが、活性化タンパク質1(AP-1)、活性化T細胞の核因子(NFAT)、ならびにシグナル導入因子および転写活性化因子(STAT)1の核移入を妨害するために成功裡に使用された(Torgerson TR, et al., J Immunol. 1998；161：6084-92；Bonny C, et al., Diabetes. 2001；50：77-82)。これらはすべて、大型タンパク質を小型化合物に変換することが成功につながりやすいことを示した。正常細胞に対する毒性作用がないか、または最小限で腫瘍細胞を選択的に死滅させることは、癌患者の治療において最も望ましい。Chenらは、サイクリンA(CCNA)/サイクリン依存性キナーゼ2(CDK2)またはサイクリンE(CCNE)/CDK2による基質のリン酸化を阻害するモチーフを含む細胞膜透過性ペプチドは、非形質転換細胞よりも相対的に高いレベルで、癌細胞がアポトーシスを受けるように誘導すると報告した(Chen, Y.N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 4325-9(1999))。p53-MDM2相互作用を妨害する抗MDM2ペプチドが、p53の急速な蓄積、アポトーシス誘導遺伝子の活性化、網膜芽腫細胞の優先的な死滅、および硝子体内注射後の最小限の網膜損傷を誘導することも報告された(Harbour, J.W. et al. Arch.Ophthalmol. 2, 1341-6(2002))。癌細胞を特異的に標的とする細胞透過性ペプチドを用いた本発明者らの結果により、CDCA1-KNTC2複合体の阻害が、抗悪性腫瘍剤としての新規なアンタゴニストを開発するための理論的根拠を提供することが示された。
【０１７０】
要約すれば、本発明者らは、CDCA1-KNTC2癌精巣抗原複合体が、癌細胞の増殖および/または生存において特殊な機能的役割を果たすことを見出した。本発明者らのデータは、肺癌患者を治療するための治療法として、CDCA1およびKNTC2ならびに/またはそれらの複合体の活性を特異的に標的とするために、新規な抗癌ペプチドならびに小型化合物を設計することの実現可能性を示す。
【０１７１】
本明細書において説明した実施例および態様は、説明目的にすぎないこと、ならびにそれらを踏まえた様々な修正および変更が当業者に示唆され、かつそれらが本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれ得ることが理解される。本明細書に引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】肺腫瘍、細胞株、および正常組織におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す。図1Aは、半定量的RT-PCRによって検査した、16個のNSCLC(T)および対応する正常肺組織(N)の臨床試料におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す。本発明者らは、肺癌臨床試料のmRNAから調製した各一本鎖cDNAの適切な希釈物を調製し、β-アクチン(ACTB)発現のレベルを定量的対照とした。図1Bは、半定量的RT-PCRによって検査した、NSCLC細胞株におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す(1：A549、2：LC319、3：PC14、4：PC3、5：PC9、6：A427、7：NCI-H1373、8：EBC-1、9：LU61、10：NCI-H520、11：NCI-H1703、12：NCI-H2170、13：NCI-H226、14：RERF-LC-A1、15：SK-MES-1、16：NCI-H647、17：LX1、18：DMS114、19：DMS273、20：SBC-3、21：SBC-5、22：NCI-H1666、23：NCI-H781)。図1Cは、ノーザンブロット解析によって検出した、正常ヒト組織におけるCDCA1およびKNTC2の発現を示す。
【図２】CDCA1とKNTC2との相互作用、および結果として生じる複合体の細胞内局在を示す。図2Aでは、CDCA1と相互作用するタンパク質としてKNTC2を同定する。IP、免疫沈降法；IB、免疫ブロット。図2Bは、LC319細胞における内在性CDCA1(緑色)および内在性KNTC2(赤色)の共局在化を示す。図2Cおよび図2Dでは、免疫沈降実験により、KNTC2に結合するCDCA1の領域を同定する。CDCA1のC末端のアミノ酸158個を欠いたCDCA1 1-148構築物およびCDCA1 149-306構築物は、LC319細胞中の内在性KNTC2と相互作用する感知可能な能力は全く保持していなかった(C)。CDCA1 368-416のアミノ酸49個を欠いた、CDCA1 277-367構築物およびCDCA1 319-367構築物は、内在性KNTC2と相互作用することができなかった。これにより、CDCA1 368-416のアミノ酸49個のペプチドが、内在性KNTC2と相互作用するのに最も重要な領域であると予想されることが示唆された(D)。
【図３】CDCA1およびKNTC2の過剰発現とNSCLCの転帰不良との関連を示す。図3Aは、組織マイクロアレイ上で抗CDCA1ポリクローナル抗体(上のパネル)および抗KNTC2ポリクローナル抗体(下のパネル)を用いて、外科的に切除されたSCC組織由来の代表試料を免疫組織化学的に評価した結果を示す(倍率100)。図3B〜図3Eは、組織マイクロアレイ上でのCDCA1およびKNTC2発現の共発現(B)、CDCA1発現(C)、KNTC2発現(D)に基づいた、腫瘍特異的な生存期間のカプラン・マイヤー解析の結果を示す。図3Eは、CDCA1およびKNTC2の同時過剰発現とNSCLC患者の予後不良との関連を示す。NSCLCの282症例を3つの群に分けた；群1：CDCA1およびKNTC2の両方に対して強い陽性染色が認められた症例(患者62名)、群2：両方のマーカーに対して陰性染色が認められた症例(患者29名)、群3：他の任意の症例(患者191名、その他として示す)。
【図４】CDCA1およびKNTC2に対するsiRNAによる、NSCLC細胞増殖の阻害を示す。図4Aおよび図4Bの左上のパネルは、半定量的RT-PCRによって解析した、A549細胞における、si-CDCA1、si-KNTC2、または対照siRNAに応答した遺伝子ノックダウン効果を示す。図4Aおよび図4Bの左下および右のパネルは、特異的siRNAまたは対照プラスミド(EGFP、スクランブル、もしくはルシフェラーゼ)をトランスフェクトしたLC319細胞のコロニー形成アッセイ法およびMTTアッセイ法の結果を示す。エラーバーは、三回のアッセイの標準偏差を表す。
【図５】ドミナントネガティブなCDCA1断片およびペプチドによるNSCLC細胞増殖の阻害を示す。図5Aは、CDCA1 1-464(完全長)およびCDCA1 200-464構築物を同時トランスフェクトしたLC319細胞における、外来CDCA1とKNTC2との免疫沈降によって検出される複合体形成の減少を示す(左上のパネル；黒の矢印)。LC319細胞におけるCDCA1 200-464断片と内在性KNTC2との相互作用(左上のパネル；白の矢印)。インプット画分(左の3番目および下のパネル)。LC319細胞におけるCDCA1 200-464および内在性KNTC2の共局在化を、免疫細胞化学によって検出した(右のパネル)。図5Bは、CDCA1 200-464のドミナントネガティブな効果を検出する、LC319細胞のMTTアッセイ法を示す。CDCA1 149-306は対照として機能した。エラーバーは、三回のアッセイの標準偏差を表す。図5Cは、11R-CDCA1 398-416ペプチドの形質導入によるLC319細胞の増殖抑制を検出する、LC319細胞のMTTアッセイ法の結果を示す。エラーバーは、三回のアッセイの標準偏差を表す。
【図６】CDCA1のドミナントネガティブなペプチドによるNSCLC細胞増殖の阻害を示す。図6Aは、11R-CDCA1 398-416ペプチドまたはスクランブルペプチドによる処理後の、LC319細胞の細胞周期解析の結果を示す。図6Bは、ウェスタンブロット解析によって検査した、3種の肺癌細胞株と比較した、正常ヒト肺線維芽細胞由来のMRC5細胞におけるCDCA1タンパク質およびKNTC2タンパク質の発現を示す(左のパネル)。MTTアッセイ法では、CDCA1タンパク質およびKNTC2タンパク質をほとんど発現しなかったMRC5細胞に対する11R-CDCA1 398-416ペプチドのオフターゲット効果は全く示されない(右のパネル)。
【図７】細胞透過性CDCA1ペプチドによる、インビボでのNSCLC細胞の増殖抑制を示す。図7Aは、ヌードマウスに移植されたA549細胞に対する11R-CDCA1 398-416ペプチドの増殖抑制効果を示す。11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブルペプチド(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)で処理したマウス3匹の平均腫瘍体積をプロットした。腫瘍内注射によって、各ペプチドを毎日7週間、動物に投与した。A549細胞由来の移植した腫瘍の増殖は、ドミナントネガティブな細胞透過性11R-CDCA1 398-416ペプチドによって有意に抑制された。図7Bは、11R-CDCA1 398-416ペプチド(0.15μmol/体/日)、スクランブルペプチド(0.15μmol/体/日)、またはPBS(対照)で7週間処理したマウスに移植した腫瘍の肉眼的外観を示す。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
(a)試験化合物の存在下で、KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物をCDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
(b)段階(1)のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
(c)KNTC2ポリペプチドとCDAC1ポリペプチドの結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【請求項２】
CDCA1ポリペプチドの機能的等価物が、KNTC2結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
CDCA1ポリペプチドの機能的等価物が、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
KNTC2ポリペプチドの機能的等価物が、CDCA1結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
以下の構成要素を含む、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
(a)KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物、および
(b)CDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物。
【請求項６】
KNTC2遺伝子の発現を低減させるsiRNAを含むsiRNA組成物を該対象に投与する段階を含み、該siRNAがセンス鎖中にSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含む、対象においてNSCLCを治療または予防する方法。
【請求項７】
siRNAが、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]がSEQ ID NO：9に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]が3個〜23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']が[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
請求項1記載の方法によって得られる化合物を投与する段階を含む、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法。
【請求項９】
ドミナントネガティブな効果を有するCDCA1変異体、または該変異体をコードするポリヌクレオチドを投与する段階を含む、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法。
【請求項１０】
CDCA1変異体が、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を含み、かつそのnuf2ドメインを含まない、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
CDCA1変異体が、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
CDCA1変異体が、一般式：
[R]-[D]
を有し、式中[R]が膜導入物質であり、かつ[D]がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
膜導入物質が、以下からなる群より選択される、請求項12記載の方法；
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；
Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49。
【請求項１４】
SEQ ID NO：35のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１５】
一般式：
[R]-[D]
を有し、式中[R]が膜導入物質であり、かつ[D]がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列である、ポリペプチド。
【請求項１６】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、KNTC2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖が、該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列を含み、さらに該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、かつ該二本鎖分子が、KNTC2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
【請求項１７】
KNTC2標的配列が、SEQ ID NO：31のヌクレオチド配列由来の少なくとも約10個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項16記載の二本鎖分子。
【請求項１８】
KNTC2標的配列が、SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列由来の約19個〜約25個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項17記載の二本鎖分子。
【請求項１９】
KNTC2標的配列がSEQ ID NO：9からなる、請求項18記載の二本鎖分子。
【請求項２０】
一本鎖リボヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のリボヌクレオチド転写物である、請求項16記載の二本鎖分子。
【請求項２１】
約100ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項16記載の二本鎖分子。
【請求項２２】
約75ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項21記載の二本鎖分子。
【請求項２３】
約50ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項22記載の二本鎖分子。
【請求項２４】
約25ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項23記載の二本鎖分子。
【請求項２５】
二本鎖分子が、約19ヌクレオチド長と約25ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドである、請求項24記載の二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項16記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項２７】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二次構造を有する転写物をコードする、請求項26記載のベクター。
【請求項２８】
転写物が、センス鎖およびアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項27記載のベクター。
【請求項２９】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、該センス鎖核酸がSEQ ID NO：9からなるヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖核酸が、該センス鎖に相補的な配列からなる、ベクター。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドが、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]がSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列であり、[B]が3個〜23個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、かつ[A']が[A]に相補的なヌクレオチド配列である、請求項29記載のベクター。
【請求項３１】
KNTC2遺伝子に対する薬学的有効量のsiRNAを含む、NSCLCを治療または予防するための組成物。
【請求項３２】
siRNAが、SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を標的配列として含む、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
活性成分として請求項1記載の方法によって選択された薬学的有効量の化合物および薬学的に許容される担体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物。
【請求項３４】
活性成分として、ドミナントネガティブな効果を有する薬学的有効量のCDCA1変異体または該変異体をコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物。
【請求項３５】
CDCA1変異体が、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を含み、かつそのnuf2ドメインを含まない、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
CDCA1変異体がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含む、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
CDCA1変異体が、一般式：
[R]-[D]
を有し、式中[R]が膜導入物質であり、かつ[B]がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
膜導入物質が、以下からなる群より選択される、請求項37記載の組成物；
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；
Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49。
【請求項３９】
以下の段階を含む、NSCLCの予後を評価する方法：
(a)NSCLCの予後が評価される対象から採取された試料におけるCDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルを検出する段階、ならびに
(b)CDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルの上昇が検出される場合、予後不良が示唆される段階。
【請求項４０】
CDCA1およびKNTC2の両方の発現レベルを検出する段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
発現レベルが、以下からなる群より選択される方法のいずれか1つによって検出される、請求項39記載の方法：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出する段階、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出する段階、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出する段階。
【請求項４２】
以下からなる群より選択される任意の1つの構成要素を含む、NSCLCの予後を評価するためのキット：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【請求項１】
以下の段階を含む、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
(a)試験化合物の存在下で、KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物をCDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる段階；
(b)段階(1)のポリペプチド間の結合を検出する段階；および
(c)KNTC2ポリペプチドとCDAC1ポリペプチドの結合を阻害する試験化合物を選択する段階。
【請求項２】
CDCA1ポリペプチドの機能的等価物が、KNTC2結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
CDCA1ポリペプチドの機能的等価物が、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列(IQKIKLGIQQLKDAAEREK)を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
KNTC2ポリペプチドの機能的等価物が、CDCA1結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
以下の構成要素を含む、NSCLCを治療または予防するための化合物をスクリーニングするためのキット：
(a)KNTC2ポリペプチドまたはその機能的等価物、および
(b)CDCA1ポリペプチドまたはその機能的等価物。
【請求項６】
KNTC2遺伝子の発現を低減させるsiRNAを含むsiRNA組成物を該対象に投与する段階を含み、該siRNAがセンス鎖中にSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含む、対象においてNSCLCを治療または予防する方法。
【請求項７】
siRNAが、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]がSEQ ID NO：9に対応するリボヌクレオチド配列であり、[B]が3個〜23個のヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ[A']が[A]に相補的なリボヌクレオチド配列である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
請求項1記載の方法によって得られる化合物を投与する段階を含む、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法。
【請求項９】
ドミナントネガティブな効果を有するCDCA1変異体、または該変異体をコードするポリヌクレオチドを投与する段階を含む、対象においてNSCLCを治療または予防するための方法。
【請求項１０】
CDCA1変異体が、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を含み、かつそのnuf2ドメインを含まない、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
CDCA1変異体が、SEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
CDCA1変異体が、一般式：
[R]-[D]
を有し、式中[R]が膜導入物質であり、かつ[D]がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
膜導入物質が、以下からなる群より選択される、請求項12記載の方法；
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；
Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49。
【請求項１４】
SEQ ID NO：35のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１５】
一般式：
[R]-[D]
を有し、式中[R]が膜導入物質であり、かつ[D]がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列である、ポリペプチド。
【請求項１６】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、KNTC2標的配列に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖が、該センス鎖に相補的であるリボヌクレオチド配列を含み、さらに該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、かつ該二本鎖分子が、KNTC2遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
【請求項１７】
KNTC2標的配列が、SEQ ID NO：31のヌクレオチド配列由来の少なくとも約10個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項16記載の二本鎖分子。
【請求項１８】
KNTC2標的配列が、SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列由来の約19個〜約25個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項17記載の二本鎖分子。
【請求項１９】
KNTC2標的配列がSEQ ID NO：9からなる、請求項18記載の二本鎖分子。
【請求項２０】
一本鎖リボヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一のリボヌクレオチド転写物である、請求項16記載の二本鎖分子。
【請求項２１】
約100ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項16記載の二本鎖分子。
【請求項２２】
約75ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項21記載の二本鎖分子。
【請求項２３】
約50ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項22記載の二本鎖分子。
【請求項２４】
約25ヌクレオチド長未満のオリゴヌクレオチドである、請求項23記載の二本鎖分子。
【請求項２５】
二本鎖分子が、約19ヌクレオチド長と約25ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドである、請求項24記載の二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項16記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項２７】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二次構造を有する転写物をコードする、請求項26記載のベクター。
【請求項２８】
転写物が、センス鎖およびアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項27記載のベクター。
【請求項２９】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸の組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、該センス鎖核酸がSEQ ID NO：9からなるヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖核酸が、該センス鎖に相補的な配列からなる、ベクター。
【請求項３０】
ポリヌクレオチドが、一般式
5'-[A]-[B]-[A']-3'
を有し、式中[A]がSEQ ID NO：9のヌクレオチド配列であり、[B]が3個〜23個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、かつ[A']が[A]に相補的なヌクレオチド配列である、請求項29記載のベクター。
【請求項３１】
KNTC2遺伝子に対する薬学的有効量のsiRNAを含む、NSCLCを治療または予防するための組成物。
【請求項３２】
siRNAが、SEQ ID NO：9のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を標的配列として含む、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
活性成分として請求項1記載の方法によって選択された薬学的有効量の化合物および薬学的に許容される担体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物。
【請求項３４】
活性成分として、ドミナントネガティブな効果を有する薬学的有効量のCDCA1変異体または該変異体をコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体を含む、NSCLCを治療または予防するための組成物。
【請求項３５】
CDCA1変異体が、KNTC2結合領域を含むアミノ酸配列を含み、かつそのnuf2ドメインを含まない、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
CDCA1変異体がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含む、請求項35記載の組成物。
【請求項３７】
CDCA1変異体が、一般式：
[R]-[D]
を有し、式中[R]が膜導入物質であり、かつ[B]がSEQ ID NO：35のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
膜導入物質が、以下からなる群より選択される、請求項37記載の組成物；
ポリアルギニン；
Tat/RKKRRQRRR/SEQ ID NO：37；
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/SEQ ID NO：38；
Buforin II/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/SEQ ID NO：39；
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/SEQ ID NO：40；
MAP(両親媒性ペプチドモデル)/KLALKLALKALKAALKLA/SEQ ID NO：41；
K-FGF/AAVALLPAVLLALLAP/SEQ ID NO：42；
Ku70/VPMLK/SEQ ID NO：43；
Ku70/PMLKE/SEQ ID NO：50；
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/SEQ ID NO：44；
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/SEQ ID NO：45；
Pep-1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/SEQ ID NO：46；
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/SEQ ID NO：47；
Pep-7/SDLWEMMMVSLACQY/SEQ ID NO：48；および
HN-1/TSPLNIHNGQKL/SEQ ID NO：49。
【請求項３９】
以下の段階を含む、NSCLCの予後を評価する方法：
(a)NSCLCの予後が評価される対象から採取された試料におけるCDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルを検出する段階、ならびに
(b)CDCA1およびKNTC2のいずれかまたは両方の発現レベルの上昇が検出される場合、予後不良が示唆される段階。
【請求項４０】
CDCA1およびKNTC2の両方の発現レベルを検出する段階を含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
発現レベルが、以下からなる群より選択される方法のいずれか1つによって検出される、請求項39記載の方法：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出する段階、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出する段階、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出する段階。
【請求項４２】
以下からなる群より選択される任意の1つの構成要素を含む、NSCLCの予後を評価するためのキット：
(a)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列をコードするmRNAの存在を検出するための試薬、
(b)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の存在を検出するための試薬、および
(c)SEQ ID NO：34(CDCA1)またはSEQ ID NO：32(KNTC2)のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出するための試薬。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００９−５０５６３３（Ｐ２００９−５０５６３３Ａ）
【公表日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０３２９９（Ｐ２００８−５０３２９９）
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１４７１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１３４８０
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１２日（２００９．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１９日（２００６．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３１４７１５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１３４８０
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５０２２４０１１３）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (142)
【Ｆターム（参考）】
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